Vous êtes sur la page 1sur 31

Universit Catholique dAfrique Centrale

Centre Suprieur des Sciences de la Sant

COURS DE CYTOMETRIE

Par:

Dr. LEOPOLD GUSTAVE LEHMAN ImmunoImmuno-parasitologue MSc, Dr. Rer. Nat.

Site Web: www.ured-douala.com www.uredE-mail: lblehman@yahoo.fr


Avril 2011
1

I.

HISTORIQUE En 1934 Moldavan, Montral, conut le premier appareil avec lequel il ralisait

des numrations cellulaires en faisant dfiler les cellules dans un fin capillaire o elles taient vues par un capteur photo lectrique. En 1949, W. Coulter met au point un appareil permettant de compter des cellules et de mesurer leur taille par variation de rsistivit du courant liquidien. En 1953, Crosland-Taylor utilise un systme d'injection de l'chantillon dans un flux laminaire (systme dcrits par Reynolds en 1883). En 1965, Kamentsky permet une avance supplmentaire en permettant lanalyse des constituants cellulaires. Dan villa en 1969 utilise le laser comme source lumineuse car il permet une meilleure focalisation du faisceau, une grande puissance dexcitation, et une stabilit du chromatisme. Dans les annes 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford

associaient des mthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entranes par un flux avec des mthodes lectrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales. La diffusion de la lumire complta rapidement la liste des proprits capables de discriminer plusieurs types cellulaires. Le dveloppement simultan dappareillages commercialiss polyvalents et lapparition des hybridomes pour la production danticorps monoclonaux a conduit une explosion des activits impliquant la cytomtrie en Flux (CMF). Lutilisation des proprits cellulaires intrinsques (diffusion, auto fluorescence) et le dveloppement permanent de fluorochromes capables de traduire de nombreuses proprits et fonctions cellulaires ont conduit la mise en uvre de mthodes de plus en plus fines pour lanalyse de populations de cellules htrognes. Ainsi, cette technique permet de faire simultanment lanalyse quantitative de plusieurs paramtres sur des lments en suspension : cellules, levures, bactries ou constituant cellulaires (noyaux, mitochondries, chloroplastes, chromosome). Un grand nombre dlments peuvent tre analyss ce qui apporte prcision et reprsentativit aux rsultats.
2

II.

LA FLUORESCENCE

II.1. DEFINITION La fluorescence est une proprit de certaines molcules, capables d'absorber une radiation de longueur d'onde donne et de r-mettre, aprs un bref intervalle de temps, une radiation de longueur d'onde plus leve. Cest autrement dit un phnomne chimique, mettant en jeu des transitions lectroniques entre deux niveaux d'nergie superficiels, et dclenche par autre chose que la simple chaleur, ce qui la diffrencie de l'incandescence. Elle se droule en 3 tapes successives dcrivant des niveaux dnergie diffrents (figure1): Etape 1: absorption de lnergie lumineuse par les atomes de la molcule. On a

alors passage de ltat fondamental ltat excit. Etape 2: ltat excit (de courte priode) est suivit de la relaxation au cours de

laquelle une partie de lnergie est dissipe sous forme de chaleur et de transfert dnergie entre molcules. Etape 3: retour ltat fondamental par mission lumineuse de longueur donde

plus leve (moins nergtique) que la longueur d'onde d'excitation.

Figure 1: Niveaux dnergie au cours de la fluorescence.

II.2. PRINCIPE DE LA FLUORESCENCE De nombreuses molcules (fluorophores ou fluorochromes) sont capables d'absorber des photons, et d'augmenter leur nergie d'agitation: la lumire est alors convertie en chaleur. Voir (tableau 1).
3

II.3. LES FLUOROCHROMES II.3.1. DEFINITION Ce sont des molcules ont la proprit d'absorber de l'nergie lumineuse et de la restituer, gnralement avec une nergie plus basse (une longueur d'onde plus grande). Ces molcules fluorescentes sont de taille et de nature chimiques diverse ; certaines sont suffisamment petites pour tre conjugues d'autre molcules (comme dans le cas des anticorps coupls un fluorochromes); d'autres ne sont fluorescentes que dans certains tats de chlation (marqueurs fluorescents vitaux, qui ne sont fluorescent que complex l'ADN). On cite : Alexa. - les protines: PE (Phycoerythrine), APC, PerCP - les tandems: PE-Cy5, PE-Cy5.5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC-Cy7 - les quantum dot II.3.2. REGLES POUR CHOISIR LES FLUOROCHROMES Pour slectionner un fluorochrome, il faut sassurer que * le spectre dexcitation est compatible avec lquipement laser du cytomtre ; * les spectres dmission sont non chevauchants ; * associer le fluorochrome le plus fort au marqueur antignique le plus faiblement exprim.
Tableau 1 : Caractristiques des principaux fluorochromes utiliss en cytomtrie

les petites molcules chimiques: FITC (Fluoresceine isothiocyanate) , Cy5, Cy7,

Duperray et al. (1993) Acta endoscopica Vol 23, No 4 Page 285-294

II.3.3. PRINCIPE DE COMPENSATION DE FLUORESCENCE Les chevauchements des spectres dmission des divers fluorochromes utiliss simultanment en cytomtrie ncessitent lemploi de compensations lectroniques de fluorescence afin de soustraire la superposition des 2 signaux de fluorescence. Sans compensation de fluorescence, une population cellulaire marque en fluorescence verte (FITC) mais pas en orange (PE), est positionne sur la bissectrice de lhistogramme biparamtrique des 2 fluorescences. Le systme de compensation permet de soustraire artificiellement et lectroniquement la fluorescence orange parasite qui rsulte de la fuite de fluorescence du FITC ou les fluorescences artfactuelles sur les autres PMT.

Figure 3: Phnomne de compensation des fluorochromes.

III.

LA CYTOMETRIE DE FLUX

III.1. DEFINITION La cytomtrie en flux dcrit une technique danalyse de routine des cellules ou particules biologiques en suspension qui traversent une cellule de mesure les unes aprs
5

les autres. Un ou plusieurs lasers excitent chaque particule ainsi injectes. Si les particules ont t marques avec une ou plusieurs fluorochromes, la source lumineuse excite ceux-ci et nous informe sur certains aspects biologiques supplmentaires Le cytomtre mesure la lumire de fluorescence et la lumire diffus. Grce des phnomnes de diffusion lumineuse, il caractrise les cellules selon : - la taille (dans laxe du laser) - la granularit ( 90du laser) - la fluorescence III.2. LES PRINCIPES TECHNIQUES DE LA CYTOMETRIE DE FLUX Pour fonctionner un cytomtre de flux ncessite une combinaison de : fluidique pour introduire, canaliser les cellules et les amener au niveau du laser; optique qui se compose du ou des lasers et d`un systme de filtres pour exciter, rcuprer et amplifier les diffrents signaux mis ; lectronique pour convertir les signaux optiques en des signaux lectroniques proportionnels et les numriser ; informatique pour visualiser ces signaux. Les chantillons cellulaires doivent tre mis en suspension pour pouvoir tre analyss. Lanalyse du sang ne pose aucun problme les cellules tant dj en suspension. Par contre les tissus cellulaires doivent tre dissocis et les agrgats limins afin de pouvoir tre analyss. III.2.1. Le systme fluidique (figure 6) Les cellules sont amenes au centre de la buse de mesure (figure 4) ou un troit flux laminaire et alignes les unes derrire les autres (au moyen du systme de centrage hydrodynamique de lchantillon) afin dtre excites par un ou plusieurs faisceau lumineux : cest le centrage hydrodynamique (figure 5). Il utilise un rgulateur de pression dair qui assure la stabilit des oprations, lalimentation en liquide de gaine et linjection de lchantillon dans la cellule de mesure. Cet ensemble permet de cibler les particules sur le point dimpact du laser.

Figure 4 : la cellule de mesure, lment principal du cytomtre de flux.

Liquide Entraineur

Suspension Entraine

Jet contenant la suspension centre

Figure 5:

Principe du centrage hydrodynamique.

Figure 6: Schma dun systme fluidique de cytomtre en flux.

III.2.2. Le systme optique (figure 7) a) Source dnergie Il est ncessaire de focaliser une source lumineuse sur les cellules qui doit permettre une illumination des colorants une longueur donde proche de leur maximum dexcitation. Deux types de sources sont actuellement utiliss: Les lasers. Chacun permettra d'mettre une lumire monochromatique, capable

d'exciter une srie de fluorochromes. Les lasers ont des spectres dmission discontinus. Il existe diffrents lasers : par exemple, les lasers ions dargon permettent dexciter entre autres la fluorescine, la phycorythrine, liodure de propidium 488 nm ainsi que dans lU.V Les lampes vapeur de mercure ou au xnon sont aussi utilises. La focalisation

est moindre que dans le cas du laser, mais le spectre est assez large et leur cot est limit.
8

b) Canaux ou paramtres optiques Les diffrents signaux optiques mis par la cellule doivent tre focaliss, spars, puis achemins vers des systmes de dtection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour cela, slectionns par diffrents circuits optiques composs dune alternance de miroirs dichroques et de filtres (figure 8). Il existe trois types de canaux : - canal taille (FSC Foward Scatter Channel ) - canal structure (SSC Side Scatter Channel ) - canal fluorescence (FL1, FL2, FL3...)

Figure 7: Banc optique dun cytomtre de flux. (3 paramtres + laser vert)

VERT (FITC) 530 nm

1
ORANGE (Phycoerythrine) 575 nm DIFFUSIO A 90 DU LASER 488 nm

ROUGE (Cyanine) >630 nm

DIFFUSION DANS LAXE DU LASER 488 nm

SOURCE LUMINEUSE 488 nm

1: passe bas 560 2: passe bas 610 3: passe haut 500

Figure 8 : Exemple de trajet optique dans un cytomtre en flux.


9

c) Dtecteurs Aprs avoir travers cette succession de miroirs et de filtres, la lumire est recueillie et transforme en signal lectrique par un photomultiplicateur PMT (plus sensible et utilis pour les signaux faibles) ou une photodiode PD (sensibilit plus faible, utilis pour les signaux forts : taille). Les signaux optiques recueillis ont une intensit corrle avec des proprits cellulaires.

III.2.3. Le systme lectronique (figure 9) Les signaux optiques sont convertis en signaux lectriques par les

photomultiplicateurs (PMT). Les PMT sont des capteurs optiques capables de dceler de trs petites quantits de lumire et de le retranscrire en signal lectrique, numrique ou analogique selon le cytomtre. Ils vont donc traduire l'intensit de la lumire qui leur parvient.

Figure 9: Carte lectronique.

III.2.4. Le systme informatique Les valeurs numriques issues des convertisseurs sont stockes par linformatique dans des supports divers (figures 10 et 11) et prsentes sur les crans des cytomtres sous forme dhistogrammes (1 paramtre) o laxe des abscisses reprsente lintensit du signal analys et laxe des ordonnes le nombre de cellules ou de cytogrammes (2 paramtres).

10

Figure 11 : Support de mmoire: disque dur.

Figure 10 : Support de linformatique.

III.3. LES SIGNAUX RECUEILLIS Les signaux optiques recueillis ont une intensit corrle avec des proprits cellulaires (tableau 2). III.3.1. La lumire diffuse La lumire diffuse renseigne sur la morphologie et la structure de la cellule. Si la diffusion de la lumire est mesure dans laxe du rayon incident, lintensit du signal peut tre corrle avec la taille et la viabilit cellulaire. Sous un angle de 90, la mesure correspond la structure intracellulaire de la cellule (rfringence du cytoplasme, morphologie, rapport nuclo-cytoplasmique). Lutilisation simultane de ces deux paramtres permet de distinguer, dans un sang priphrique par exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynuclaires. III.3. 2. La lumire absorbe Cette mesure volue proportionnellement au diamtre de la cellule (suppose sphrique) et lindice dabsorption des constituants cellulaires. III.3. 3. La fluorescence mise Cette fluorescence peut tre spontane, mais le plus souvent, elle est apporte la cellule par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe lnergie du LASER et remet lnergie absorbe par vibration et dissipation de chaleur, mission de photons dune longueur donde plus leve.

11

Tableau 2 : Signification des principaux signaux obtenus en cytomtrie en flux

PARAMETRE Diffusion de la lumire aux petits angles Diffusion de la lumire angle droit Fluorescences

SIGNIFICATION Proportionnel au diamtre cellulaire Proportionnel au contenu cellulaire Proportionnelles lintensit de marquage

UTILISATION Identification morphologique des cellules Identification morphologique des cellules Marqueurs cellulaires, ADN, ARN, fonctions cellulaires...

III.4. PRINCIPE DE LA CYTOMETRIE La CMF consiste analyser les signaux optiques ou physiques mis par une particule coupant le faisceau lumineux dun laser ou dune lampe. Les signaux spars par des filtres optiques sont collects par des photomultiplicateurs, amplifis, numriss, traits et stocks par un ordinateur. Ce procd danalyse cellule par cellule est multiparamtrique et peut seffectuer la vitesse de plusieurs milliers dvnements par seconde (figure 12).

12

Lumire refracte : SSC

Fluorescence : FL

Analyse quantitative des signaux lumineux

Informatique Analyse des donnes

Comptage Injection des particules dans un flux laminaire Dcision de tri Mesure au Cytomtre de flux

Incubation et arrt de la raction

Contact du substrat (chantillon ou ses extraits) au marqueur (Ac + conjugu)

Echantillons : Sang total, Cytokine, Biopsies ou rsections chirurgicales, Bactries, Produits vgtaux, Solutions

Figure 12: Schma gnral de lanalyse en Cytomtrie de flux.


13

III.5. PRESENTATION DES RESULTATS (figure 13) Les valeurs numriques issues des convertisseurs sont stockes par linformatique et prsentes sur les crans des cytomtres sous deux formes : des histogrammes monoparamtriques o laxe des abscisses reprsente

lintensit du signal analys et laxe des ordonnes le nombre de cellules (figure 10). des histogrammes biparamtriques ou cytogrammes prsentant deux signaux simultanment.

Figure 13 : Prsentation des rsultats.

III.5.1. La reprsentation graphique (figure 14). Elle reprsente la fluorescence relative par rapport au nombre dvnements

Figure 14 : Reprsentation graphique dun histogramme.


14

III.5.2. La reprsentation de la taille et de la granulosit Dot Plot (figure 15) Pour chaque cellule qui passe, sa taille est analyse par rapport sa granulosit. Cest un bon moyen de dtecter un petit nombre dvnements dont les populations sont clairement spares.

MONOCYTES

GRANULOCYTES

LYMPHOCYTES

Figure 15: Reprsentation de la taille et de la granulosit. III.5.3 La reprsentation de la densit relative des vnements Density Plot (figure 16) Cette reprsentation simule une reprsentation en 3D o le troisime paramtre est le nombre dvnements. Cela permet lutilisateur, de mettre en vidence une population discrte.

Figure 16 : Reprsentation de la densit relative des vnements.

15

III.5.4. La reprsentation des contours Contour Plot (figure 17) Il sagit l dune autre reprsentation en 2 dimensions de populations dont le nombre dvnements est similaire.

Figure 17 : Reprsentation des contours. III.5.5. Lhistogramme tridimensionnel (figure 18) Il est obtenu partir dun biparamtrique auquel on ajoute une troisime dimension reprsentant le nombre de cellules. Il permet d'avoir une ide de la proportion des diffrentes catgories de cellules les unes par rapport aux autres.

Figure 18 : Reprsentation des rsultats en 3 dimensions.


16

III.5. LOGICIELS Il existe plusieurs logiciels dacquisition et danalyse en cytomtrie en flux. On cite par exemple le Cyview, le Cellquest, le Flomax. Les logiciels permettent donc lacquisition (rglages des compensations), lanalyse (pourcentages des populations et comparaison des rsultats) et la mise en forme des informations obtenues (date, heure, informations relatives lchantillon). Ils permettent de faire apparatre des fentres dont la forme est propre chacun (figure 19).

Figure 19 : Exemples de fentres danalyse des rsultats.

IV. APPLICATIONS ET METHODOLOGIES DE LA CYTOMETRIE DE FLUX Applications en routine - Immunophnotypage : (hmatologie, immunologie) - Expression quantitative dantignes de surface ou intracellulaire ; - Quantification de lADN (cancrologie, cytogntique) ; - Etude du cycle cellulaire ; Applications en recherche - Caryotype en flux ; - Flux calcique ; - pH intracellulaire ; - Fluidit membranaire ; - Mesure du stress oxidatif
17

IV.1. IMMUNOPHENOTYPAGE IV.1.2. Hmatologie Les cellules du sang diffrent par leur taille et structure. Certaines applications sont maintenant utilises pour le diagnostic ou le suivi thrapeutique de diffrentes affections et concernent aussi bien ltude fonctionnelle de cellules saines que la mise en vidence du caractre pathologique des cellules analyses. La numration rticulocytaire : cest le reflet de l'activit rythropotique de la moelle osseuse. Elle est une tape fondamentale du diagnostic tiologique des anmies, de l'valuation de la rponse aux traitements et du suivi des patients aplasiques ou aprs greffe de moelle osseuse. Ici, l'ARN ribosomal des rticulocytes est mis en vidence par un fluorochrome, le thiazole orange, qui traverse les membranes cellulaires et se fixe sur les bases des acides nucliques. La population de globules rouges est identifie grce aux mesures de la lumire diffuse 0 (forward scatter) et 90 (side scatter). La fluorescence mise par l'ARN ribosomal est dtecte et quantifie par l'appareil sur le canal de lecture FL1, correspondant la dtection d'une fluorescence verte. Leucmie : lanalyse de la population de lymphocytes du sang priphrique chez des patients atteints de leucmie. On va dfinir le rapport CD4/CD8 chez ces patients pour avoir une indication de la gravit de la leucmie. On effectue un marquage des cellules avec des anticorps anti-CD4 et anti-CD8. Hmostase : la CMF permet galement un monitoring biologique des traitements antiplaquettaires, avec l'avantage comparativement l'agrgomtrie d'tre spcifique d'une molcule (anti-GPIlbIlla ou thinopyridine), alors mme que les patients sont traits par des associations d'antiplaquettaires. La cytomtrie a d'autres applications, dont l'tude des plaquettes rticules, le diagnostic des thrombopathies de scrtion, le diagnostic des thrombopnies induites par l'hparine et l'tude des voies de signalisation. IV.1.3. Immunologie Limmunologie utilise la CMF pour la dtection ou l'identification des sous-types des cellules impliques dans l'immunit. En effet, lutilisation des anticorps monoclonaux (AcM), dirigs contre des composants membranaires spcifiques, permet de distinguer des sous-populations lymphocytaires. Ces dernires annes, lidentification et la caractrisation des antignes (Ag) de surface des lymphocytes a progress trs
18

rapidement. Il s'agit en routine des antignes CD3 (lymphocytes T), CD4 (T Helper), CD8 (T Supressor), CD57 (Natural Killer), HLA DR (complexe majeur

d'histocompatibit) et CD25 (rcepteur de IL2). Les cellules de limmunit peuvent tre diffrencies par certains marqueurs de surface identifiables par fixation danticorps coupl un fluorochrome. Pneumopathie alvolo-interstitielles : le lavage broncho-alvolaire (LBA) est une mthode largement utilise pour identifier l'alvolite dans diverses affections respiratoires et principalement dans les maladies interstitielles pulmonaires (figure 20). La CMF permet le phnotypage immunologique des sous-groupes de lymphocytes et de monocytes et l'identification de microorganismes ainsi que l'valuation quantitative du contenu en ADN des cellules tumorales. Cette technique demande tre valide mais constitue un complment utile de l'analyse des liquides de LBA et prsente un intrt particulier en immunopathologie pulmonaire et dans le suivi des manifestations respiratoires aprs greffe de poumon.

Figure 20 :

Pathologies infectieuses - Infection VIH/SIDA : le SIDA (syndrome d'immunodficience acquise) est une maladie transmissible cause par le rtrovirus HIV = human immunodeficiency virus. La
19

maladie progresse durant une priode variant de 6 mois plus de 5 ans. La progression de la maladie est caractrise par l'accentuation d'un syndrome immunodficitaire. Le phnomne central de la maladie est l'atteinte slective des cellules TH CD4+ (lymphocytes T Helper qui porte le marqueur de surface CD4). Le virus a un tropisme pour ces cellules et son effet cytopathogne entrane la mort cellulaire. La CMF permet l'analyse quantitative des sous-populations de lymphocytes T : les CD4+ et les CD8+ l'aide d'anticorps monoclonaux. (figure 21).

Population htrogne dans lchantillon sanguin

Marquage par lAnticorps

Incubation
15 min

Ajout de Tampon + Comptage des cellules CD3, CD8, CD4 ou CD4% en 2 min

Affichage des rsultats lcran

Figure 21: Exemple dun typage lymphocytaire sur cytomtre de flux.

- Infection cytomgalovirus : la mise en vidence de l'antigne prcoce du germe dans les liquides de lavage broncho-alvolaire par CMF est possible trs tt aprs l'infection (in vitro, la cytomtrie dtecte cet antigne sur culture de fibroblastes 30 mn
20

aprs l'adsorption virale) et avec une sensibilit meilleure que l'immunofluorescence microscopique ou que la culture cellulaire (recherche de l'effet cytopathogne qui ncessite une production virale). - Infection Pneumocystis Carinii : la CMF permet non seulement lidentification des kystes et trophozoites mais aussi leur quantification et l'apprciation de leur viabilit (les organismes intacts ne laissent pas pntrer l'iodure de propidium et l'intgrit membranaire et bien corrle la viabilit cellulaire). - Physiopathologie de lAsthme : le phnotype des lymphocytes alvolaires semble diffrent chez l'asthmatique par rapport au sujet normal : augmentation du nombre de lymphocytes T CD3+ exprimant les antignes CD25 et HLA-DR (antignes tmoignant d'une activation cellulaire). De plus cette activation parat tendue aux lymphocytes T CD4 et T CD8 dans l'asthme non allergique alors qu'elle serait limite aux T CD4 dans l'asthme allergique.

IV.2. QUANTIFICATION DE LADN IV.2.1. Cancrologie Cette dtection repose essentiellement sur la mesure dun contenu anormal dADN dans le noyau de la cellule tumorale. Jusquaux annes 70, les principaux lments utiliss pour tablir un pronostic de lvolution des cancers du sein taient dordre clinique (essentiellement la taille de la tumeur) et histologique (le type et le grade de Scarff, Bloom et Richardson). Depuis lors, les nombreuses tudes menes sur la biologie du cancer ont permis la mise en vidence de nombreux facteurs permettant daffiner le diagnostic et le pronostic. Au cours des dernires annes, beaucoup de travaux ont t consacrs la CMF. Ils ont fait tat de plusieurs constatations; parmi les plus importantes nous citerons la corrlation entre le taux de la prolifration de la tumeur (mesur par le pourcentage des cellules en phase S) et lagressivit de la tumeur. Il est important de caractriser la cellule carcinomateuse laide de la cytomtrie en dfinissant chacune des quatre catgories danomalies du contenu en ADN : Diplode, Aneuplode, Ttraplode et Multiplode (figure 22). Ce qui facilitera par la mme occasion linterprtation, et lexploitation des rsultats par le clinicien. Comme la frquence des anomalies de lADN peut atteindre 90 % dans les tumeurs du sein, elle permet donc le diagnostic de la
21

majorit des cancers. En illustration: quand la tumeur est diplode, elle se distingue en gnral par une phase de prolifration plus leve (gnralement suprieure 5%).

Figure 22: Profils cytomtriques typiques obtenus aprs analyse des tumeurs de sein. Le premier pic en partant de la gauche des profils II, III et IV correspond au standard interne (globules rouges de poulets).

22

IV.2. 2. Hybridation gnomique comparative (CGH) On peut obtenir un caryotype par cytomtrie de flux partir de lADN dun tissu (figure 23). LADN analyser est extrait et marqu par un fluorochrome vert par exemple (fluoresceine). De lADN normal de rfrence est marqu par un fluorochrome rouge (rhodamine). Les 2 ADN sont hybrids avec des chromosomes en mtaphase normaux colors par le DAPI. Les chromosomes sont slectionns et analyss lun aprs lautre. La fluorescence rouge est enregistre puis la fluorescence verte avec les mmes paramtres. Un programme informatique fait lanalyse comparative des 2 intensits et donne un rsultat graphique. Les dviations significatives permettent de dtecter des dltions et des amplifications dune zone dun chromosome donn.

Figure 23 : Caryotype.

IV.3. LETUDE DU CYCLE CELLULAIRE Le cycle cellulaire reprsente lintgralit de la priode de division, cest--dire lensemble des vnements biochimiques et morphologiques qui sont responsables de la prolifration cellulaire. La mesure du cycle cellulaire par des mthodes classiques de cytomtrie de flux divise le cycle en 3 phases : - G0/G1 = phase dactivation des cellules, - S = phase de synthse de lADN, - G2/M phase de mitose. La CMF permet de dterminer la distribution des cellules dans le cycle cellulaire: les cellules contenant 2N chromosomes dADN sont les cellules en G1 et les cellules non prolifrantes. Les cellules contenant 4N chromosomes dADN sont en G2 ou en mitose. Entre ces 2 valeurs, on trouve les cellules en phase S. on a pu classer les tissus normaux en 3 catgories:
23

- les tissus prolifration rapide (moelle osseuse, muqueuse gastrique, ovaire, testicule, peau) -les tissus prolifration lente (poumon, foie, rein, glandes endocrines, endothlium) - les tissus qui ne prolifrent pas (muscle, os, cartilage, nerf). Cette classification a un intrt clinique important : les effets toxiques de la chimiothrapie et de la radiothrapie sont beaucoup plus marqus sur les tissus prolifration rapide.La plupart des applications qui concernent le cycle cellulaire nutilisent quun seul paramtre, le contenu en ADN (figure). Des programmes mathmatiques calculent les diffrentes phases.
3500 3000 ASCII.2

C e l l N u m b e r

2500 2000 1500 1000 500 0 0 3500 3000 32 64 96 128 160 ASCII.2 Content DNA 192 224 256 CELL CYCLE DATA Mean G1= 96.4 CV G1 = 3.2 2500 2000 1500 1000 500 0 0 32 64 96 128 160 192 224 256 Chi Sq.= 2.4 % G1 = 63.0

C e l l N u m b e r

Mean G2=190.0 CV G2 % G2 % S = = 3.9 7.8

= 29.0 =1.970

G2/G1

DNA Content

Figure 24: Analyse du cycle cellulaire dune ligne tumorale.

Les principales applications concernent la pharmacologie : Elle permet de suivre la distribution des cellules dans les diffrentes phases du cycle, en fonction de divers stimuli ou de lajout de certaines drogues (drogues antimitotiques, immunothrapie).

24

IV.4. OCEANOGRAPHIE La CMF est une mthode de routine pour compter les diffrents populations du picoplancton photosynthtique sur la base de la fluorescence des pigments tels que la chlorophylle. Aprs marquage des chantillons avec des marqueurs de l'ADN tels que le SYBR-Green, on peut aussi numrer bactries et virus

IV.5. PHYSIOLOGIE ANIMALE ET VEGETALE Certains cytomtres sont conus pour mesurer le contenu en ADN des noyaux cellulaires intacts, extraits de plantes ou danimaux, par marquage fluorescent de lADN laide de fluorochromes tels que liodure de propidium ou le DAPI. Cest le cas du CyFlow Ploidy Analyser est un cytomtre en flux compact (Partec GmbH, Allemagne). Les applications principales concernent lanalyse de plodie elle-mme: haplodie / dihaplodie (plantes), hybrides (plantes, poissons, coquillages), ttraplodie (plantes), triplodes (plantes, hutres, crevettes), anisoplodie (plantes), polysomatie, ex. endopolyplodie ou endorduplication (plantes), allopolyplodie, aneuplodie ex. addition
25

et dltion et plantes chimres (cultures in-vitro) ; ainsi que la dtermination de taille de gnome en cologie, dtermination de variations spcifiques dADN (plantes), taxonomie, cration de bases de donnes dADN (plantes), tri de chromosomes, effets de substances gnotoxiques (plantes), dtermination de caractristiques physiologiques ou agronomiques, dtermination du sexe (plantes, btail, spermes). Principe de la technique: les mthodes danalyse de la teneur en ADN nuclaire laide de la cytomtrie en flux ont t mises au point lorigine pour les cellules humaines (figure 26). Dans les annes 80, elles ont t adaptes lanalyse des cellules vgtales. Elles reposent sur lutilisation de fluorochromes spcifiques lADN et sur lanalyse de lintensit relative de la fluorescence des noyaux marqus. La teneur en ADN des noyaux tant en relation avec le degr de plodie, la dtermination de la teneur en ADN laide de la CMF peut remplacer le comptage des chromosomes et les autres mthodes traditionnelles de dtermination du degr de plodie.

Figure 26 : Schma de la procdure danalyse du degr de plodie des Musa (bananier) grce la CMF.

26

IV.6. APPLICATIONS EN VIROLOGIE CLINIQUE L'introduction en virologie des techniques de quantification par gntique molculaire, d'adaptation plus aise pour la majorit des laboratoires, explique largement ce manque de dveloppement de la CMF. On assiste toutefois, si l'on en juge par l'accroissement net de publications dans ce domaine, un regain d'intrt pour la cytomtrie en virologie clinique depuis 1997. Dtection d'antignes viraux

La dtection d'antignes viraux reprsente le champ d'application le plus frquent de la cytomtrie en virologie clinique [1]. Ses applications sont, potentiellement au moins, toutes celles o la raction d'immunofluorescence est utilise pour la quantification des antignes viraux en activit de routine. Il est possible de rechercher les antignes viraux dans les prlvements, soit aprs leur mise en culture, soit directement au sein de l'chantillon. Il a ainsi t propos des protocoles visant quantifier l'antigne p24 ou la protine Rev au sein des lymphocytes infects par le VIH ou certains antignes du CMV dans les liquides de lavage broncho-alvolaire. Trs rcemment, la cytomtrie a t applique la quantification d'antignes du rotavirus, aprs mise en culture rapide de prlvements de selles. Enfin, il a t montr qu'elle peut tre utilise pour rechercher certains antignes du CMV directement dans les polynuclaires de sujets prsentant des infections actives. Une comparaison de la dtermination de l'antignmie pp65 par cytomtrie avec la lecture en microscopie optique, traditionnellement utilise pour cette recherche, vient de montrer que les deux approches prsentent un seuil de dtection similaire. L'apprciation du nombre absolu de polynuclaires exprimant l'antigne recherch n'est pas similaire entre les deux mthodes (le seuil de dtection en cytomtrie de flux, dtermin 0,05 %, correspond une antignmie comprise entre 1 et 10 cellules positives sur lame). Cela illustre trs bien les diffrences entre la vision humaine et la lecture par le cytomtre, qui permet une dtection plus sensible des faibles densits antigniques et analyse chaque cellule individuellement. L'utilisation de la CMF pour l'valuation de la rsistance de souches d'Herpesviridae aux antiviraux est une des applications qui fait l'objet d'un nombre croissant de publications, concernant en particulier le CMV, l'herps virus humain 6, le virus varicelle-zona ou Herps simplex virus 1. La cytomtrie apparat comme une alternative
27

intressante l'valuation classique des profils de rsistances phnotypiques par les essais de rductions des plages, permettant une lecture beaucoup moins fastidieuse et plus objective. Ces premires tudes soulignent l'importance du choix de l'antigne cible utilis pour valuer la CI50.

Dtection des acides nucliques viraux

L'utilisation conjointe de la CMF et de techniques de gntique molculaire est assez rcente. Plusieurs formats ont t dvelopps et appliqus la recherche de gnomes viraux, dans lesquels la cytomtrie est utilise pour rvler des hybridations in situ (techniques Fish) ou des PCR in situ. Les donnes publies ce jour dans la littrature concernent essentiellement le VIH [25, 26] ou l'EBV [27], sans application directe un diagnostic de routine. Dosage des anticorps

La quantification d'anticorps dirigs contre des virus par cytomtrie a t dcrite ds la fin des annes 1980, notamment pour les Herpes viridae et pour le VIH Ces mthodes n'ont pas trouv d'applications relles dans les laboratoires de routine, en raison de la facilit d'utilisation des techniques Elisa. - Les virus de locan : ladaptation de la technique de cytomtrie en flux ltude de ces virus a permis dobtenir des comptages prcis de ces particules, aprs marquage de leur contenu en acides nucliques. Les scientifiques ont ainsi mis en vidence deux populations distinctes de virus, qui pourraient affecter lune les eucaryotes, lautre les bactries. Cette technique va ainsi permettre une meilleure connaissance de la rpartition et du rle de ces virus dans les ocans.

28

Figure 27 : Histogrammes de bactries et virus de locan la CMF.

IV.7. APPLICATIONS EN INDUSTRIE AGRO-ALIMENTAIRE Les analyses microbiologiques sont classiquement effectues selon des mthodes consistant incuber un chantillon du produit analyser dans un milieu de culture favorisant le dveloppement des microorganismes prsents dans ce produit. L'tude et le dnombrement des microorganismes qui s'y sont dvelopps aprs plusieurs jours d'incubation en fournissent le rsultat (figure 28). Cette mthode n'est pas adapte pour des produits frais qui doivent tre mis rapidement sur le march en raison d'une dure de vie courte, parfois mme infrieure aux dlais ncessaires ce type d'analyse. Plus gnralement, la demande des industries agroalimentaires pour des mthodes courtes, fiables et peu couteuses est trs forte. L'automatisation de ces procdures permet d'obtenir des rsultats en quelques minutes au lieu des 2 14 jours avec les cultures sur bote de Ptri, et avec une sensibilit largement suprieure.

- Filtration
Marquage Incubation (12 min) Comptage (1 min)

Figure 28 : Cytomtrie de flux applique lagroalimentaire.


29

Cette mthode permet de rechercher, outre la flore totale d'un aliment, les bactries Escherichia coli, Salmonella ou Listeria, avec possibilit d'intervenir aussi bien sur les matires premires que sur des produits finis ou en cours de fabrication. Elle vise dterminer, l'instar d'une microbiologie prdictive, quelle sera la qualit microbiologique dun produit au moment de sa date limite de consommation, partir des analyses effectues juste aprs sa fabrication

IV.8. APPLICATIONS EN INDUSTRIE BRASSICOLE La CMF permet une approche rvolutionnaire du suivi microbiologique des vins tous les stades de la vinification. Les applications dj fonctionnelles et valides par plusieurs laboratoires sont : Le contrle des mots : Le suivi des fermentations alcooliques Le suivi dlevage La prparation la mise en bouteille

V. PRINCIPAUX AVANTAGES DE LA CYTOMETRIE DE FLUX Ce qui distingue la CMF des autres techniques analytiques et prparatives est qu'elle runit les cinq caractristiques essentielles suivantes : analyse quantitative, sensibilit de dtection, rapidit, analyse multiparamtrique cellule par cellule, tri. - L'analyse quantitative : C'est un atout majeur par rapport la microscopie optique courante que de pouvoir quantifier les paramtres observs. En effet, au microscope, il est difficile de classer des cellules en plus de quatre catgories selon leur fluorescence : ngative, faible , moyenne , forte . Un cytomtre avec amplificateur logarithmique permet de quantifier rigoureusement chaque critre optique sur une gamme de 1 10 000 units arbitraires de fluorescence. Mais le nombre de paramtres intervenant dans toute analyse de CMF (rglages optiques, fluorochromes, marqueurs) impose, dans le cadre d'une quantification absolue, l'utilisation de standards calibrs (billes fluorescentes par exemple).

30

- Sensibilit de dtection : En immunofluorescence, il est possible de discerner du bruit de fond une population de cellules lymphodes portant environ 1 000 dterminants antigniques par cellule. - Vitesse daquisition : la vitesse moyenne d'analyse d'un cytomtre est de 1 000 cellules par seconde bien qu'il soit possible, sur les appareils modernes, d'analyser de manire fiable jusqu' 10 000 vnements par seconde sur plusieurs paramtres. En quelques secondes, la signification statistique du comptage est bien suprieure celle obtenue classiquement par un microscope optique, mme pour une souspopulation de cellules trs minoritaires. L'analyse simultane de plusieurs paramtres : la CMF offre la possibilit

de travailler simultanmentsur plusieurs paramtres, ce qui permet de mesurer, par exemple, deux ou trois paramtres simultans sur une population lymphocytaire du sang ou de la moelle [8]. Aucune autre mthode, qu'elle soit physico-chimique (centrifugation en gradient, lutriation) ou immunologique (panning, colonnes, rosettes) n'offre cette polyvalence. Le tri : les cellules peuvent tre isoles avec des taux de puret suprieurs

99 %. Ces cellules peuvent tre remises en culture. La grande puret des populations tries par CMF ne peut donc tre obtenue qu'au prix d'une srieuse limitation du nombre de cellules recueillies et d'une surveillance constante lors de la sparation. III.7. Inconvnients Les cellules doivent tre en suspension ; le nombre de cellules doit tre de l'ordre de quelques centaines de milliers au minimum ; On ne dispose pas d'image des cellules analyses ; l'analyse tant qu' un unique instant donn, on ne peut pas faire de vritable tude cintique portant sur une mme cellule.

31