Vous êtes sur la page 1sur 1683

13-000-K-10

Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes


L. Lod, H. Avet-Loiseau
Lanalyse chromosomique est devenue un examen indispensable dans de nombreuses hmopathies malignes, faisant partie intgrante du bilan diagnostique de la plupart de ces hmopathies. Dans de nombreuses hmopathies, la cytogntique est devenue un facteur pronostique majeur, permettant une action thrapeutique adapte au pronostic individuel ainsi dni. De plus, lanalyse chromosomique peut galement avoir un intrt diagnostique par la mise en vidence danomalies spciques. Depuis la dernire mise jour de cet article, la cytogntique hmatologique a grandement volu, bnciant des progrs technologiques (avnement de linformatique dans lanalyse), mais aussi techniques, avec le dveloppement de lhybridation in situ en uorescence et des techniques molculaires. De nouvelles anomalies rcurrentes ont t dcouvertes, beaucoup des gnes remanis sont maintenant clons. Une rvision de cet article tait donc devenue ncessaire, en intgrant les innovations technologiques utilises aujourdhui en routine hospitalire, incluant les techniques de biologie molculaire.
2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs.

Mots cls : Cytogntique ; Biologie molculaire

Plan
Introduction. Buts Aspects techniques. Nomenclature Cytogntique Hybridation in situ en uorescence (FISH) Techniques molculaires Avantages. Limites Principales indications au diagnostic Syndromes myloprolifratifs Leucmies aigus lymphoblastiques Leucmies aigus mylodes (LAM) Syndromes mylodysplasiques (SMD) Lymphomes malins non hodgkiniens (LMNH) Leucmie lymphode chronique. Mylome multiple Suivi de la maladie et de la rponse au traitement Conclusion et perspectives 1 2 2 2 2 4 4 4 7 8 9 9 10 10 11

Tableau 1. Principales anomalies cytogntiques valeur diagnostique.


Anomalie cytogntique t(9;22)(q34;q11) t(8;14)(q24;q32) et variantes t(11;14)(q13;q32) t(14;18)(q32;q21) t(2;5)(p23;q35) et variantes Maladie correspondante Leucmie mylode chronique Lymphome de Burkitt Lymphome du manteau Lymphome folliculaire Lymphome anaplasique Valeur diagnostique +++ +++ +++ +++ +++

Introduction. Buts
Par dfinition, la cytogntique des hmopathies a pour but de rechercher dventuelles anomalies chromosomiques prsentes au sein des cellules hmatopotiques malignes. Contrairement la cytogntique constitutionnelle pr- et postnatale, les anomalies observes sont ici des anomalies acquises, restreintes aux cellules du clone tumoral. Depuis la dcouverte du chromosome Philadelphie dans la leucmie mylode chronique (LMC) en 1960 [1], de trs nombreuses anomalies rcurrentes ont t dcrites, dans la quasi-totalit des hmopathies. De plus, le dveloppement des techniques molculaires a permis lidentification danomalies ponctuelles permettant des amliorations notoires dans le diagnostic ou le pronostic de ces pathologies. Devant une telle diversit danomalies, comment essayer dapprhender limpact et le rle de la cytogntique et de la
Hmatologie

biologie molculaire en hmatologie ? Schmatiquement, ltude des anomalies gntiques dans les hmopathies peut apporter quatre types dinformations. Tout dabord, la mise en vidence de certaines anomalies rpertories peut avoir une implication diagnostique (Tableau 1). Ainsi, la dcouverte dune translocation t(9;22)(q34;q11) au cours dun syndrome myloprolifratif signe la LMC. Dautres translocations, dans les lymphomes malins en particulier, peuvent tre une aide prcieuse au diagnostic prcis du type tumoral. Ensuite, et peut-tre surtout, ces analyses ont un but pronostique (Tableau 2). En effet, lanalyse de grandes cohortes de patients a permis de dfinir des groupes pronostiques au sein de chaque hmopathie en fonction des anomalies chromosomiques et/ou molculaires dtectes, permettant ainsi une adaptation de lintensit thrapeutique pour chaque patient. Lexemple le plus dmonstratif est celui des leucmies aigus lymphoblastiques (LAL) de lenfant [2]. En troisime lieu, la gntique hmatologique peut avoir une place dans lvaluation de la rponse au traitement. Lexemple le plus vident est l encore celui de la LMC, o la disparition progressive des mtaphases Philadelphie-positives et des transcrits chimriques BCR-ABL signent la bonne rponse au traitement [3, 4]. Enfin, la gntique a jou et continue de jouer un rle majeur dans lidentification de trs nombreux gnes

13-000-K-10 Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes

Tableau 2. Principales anomalies cytogntiques ayant une valeur pronostique.


Anomalie cytogntique t(9;22)(q34;q11) Anomalie 11q23 (MLL) Hyperdiplodie t(12;21)(p13;q22) Anomalie du chromosome 7 Caryotype complexe Monosomie 13 Maladie correspondante LAL LAL et LAM LAL de lenfant LAL de lenfant LAM LAM Mylome Valeur pronostique Pjorative Pjorative Favorable Favorable Pjorative Pjorative Pjorative

LAL : leucmie aigu lymphode ; LAM : leucmie aigu mylode.

impliqus dans les remaniements chromosomiques, et a donc de ce fait un rle scientifique. De trs nombreux exemples sont fournis lors de lanalyse de chaque hmopathie.

Aspects techniques. Nomenclature


Cytogntique
Par dfinition, lanalyse du caryotype ncessite lobtention de mtaphases au sein du clone tumoral. Le premier corollaire de cette vidence est la ncessit absolue de travailler sur un prlvement tumoral viable, rapidement mis en culture. Comme tout dogme, celui-ci a t infirm, et des caryotypes obtenus partir de cellules congeles ont t rapports. Nanmoins, la mise en culture rapide du prlvement est lune des cls de lobtention de mtaphases. Diffrents types de prlvements peuvent tre analyss : moelle osseuse, sang, liquides dpanchement, ganglions, voire masses tumorales extraganglionnaires. La nature des prlvements varie selon le type de pathologie. La moelle osseuse est le prlvement de choix dans les leucmies aigus, les syndromes myloprolifratifs et les localisations mdullaires exclusives de certaines pathologies lymphoprolifratives. Le sang priphrique est principalement utilis dans les syndromes lymphoprolifratifs de type leucmie lymphode chronique (LLC), mais peut galement tre utilis dans les leucmies aigus avec blastose sanguine. Enfin, les prlvements ganglionnaires reprsentent le tissu de choix dans les lymphomes malins. Lanalyse comporte dans tous les cas une tape initiale de culture in vitro variant de quelques heures 3-4 jours (Fig. 1A). Dans le cas des hmopathies liquides (prlvement sanguin, mdullaire ou de liquide dpanchement), le prlvement est directement mis en culture dans un milieu supplment en srum. Dans le cas des ganglions ou des masses tumorales, une dissociation pralable est ncessaire afin dobtenir une suspension cellulaire. Cette dissociation est gnralement mcanique, mais peut galement tre enzymatique (collagnase par exemple). La culture peut tre stimule par adjonction de diverses cytokines, variables selon les pathologies... et les habitudes de chacun. Aprs des temps de culture l aussi variables selon les pathologies, on ajoute de la colchicine dans le milieu de culture. Celle-ci tant un poison du fuseau mitotique, elle a pour effet de bloquer les cellules au stade mtaphasique de la mitose. Les temps dincubation en prsence de colchicine sont galement variables, allant de 30 minutes plusieurs heures. Aprs centrifugation et limination du surnageant, les cellules sont remises en suspension dans un milieu hypotonique (srum dilu ou chlorure de potassium dilu, le plus souvent). Celui-ci a pour effet de faire gonfler la cellule par flux hydrique. Cette tape est ncessaire lobtention dune dispersion des chromosomes lors de ltalement. Enfin, les cellules sont fixes, gnralement dans un fixateur base de mthanol et dacide actique, puis tales sur lames. Les cellules sont ensuite dnatures et colores afin de faire apparatre une succession de bandes, caractristiques de chacun

des 24 chromosomes. Il existe deux grands types de dnaturation : une dnaturation enzymatique par la trypsine et une dnaturation thermique. La premire fait apparatre les bandes G en noir et est appele G-banding [5]. La seconde, linverse, ne colore pas les bandes G mais les bandes R, et est donc appele R-banding [6] . Cette dernire mthode est trs largement rpandue en France, alors que les autres pays utilisent volontiers la technique de bandes G. Si chacune des techniques a ses avantages et inconvnients, lutilisation prfrentielle de lune ou lautre technique est essentiellement lie aux habitudes de chacun. Dans tous les cas, la coloration par le Giemsa fait apparatre une succession de bandes claires et sombres permettant lidentification et le classement des chromosomes (Fig. 1B). Ltablissement du caryotype a longtemps repos sur le dcoupage de chromosomes pralablement photographis. Maintenant, la plupart des laboratoires disposent de matriel informatique permettant lacquisition dimages numriques via une camra, et surtout lanalyse et le classement directement sur lcran de lordinateur. Lanalyse dun certain nombre de mtaphases (idalement au moins 20 par patient) permet dtablir la formule chromosomique du patient. Celle-ci est tablie selon une nomenclature internationale rgulirement actualise [7] (Tableau 3). Il est important davoir en mmoire que lon travaille gnralement sur une population cellulaire mixte, normale et tumorale. Il est donc frquent dobtenir une mosaque correspondant ces deux populations cellulaires. lextrme, il est donc possible dobtenir un seul clone, soit normal, soit anormal. Dans le premier cas, deux types dinterprtation peuvent tre proposs : soit les cellules tumorales ont un caryotype ne mettant pas en vidence danomalie clonale visible, soit seules les cellules normales se sont divises lors de la culture, et le caryotype nest alors pas reprsentatif du clone tumoral. Il faut donc rester prudent dans lanalyse des caryotypes normaux. Dans le second cas, toutes les mtaphases sont anormales. Il est alors probable que les cellules tumorales ont eu un net avantage prolifratif. Il faut toutefois garder en mmoire lhypothse dune possible anomalie constitutionnelle mconnue, surtout en cas de caryotype simple, de type translocation rciproque isole.

Hybridation in situ en uorescence (FISH)


Cette technique est la frontire entre la cytogntique et les techniques molculaires. Elle repose en effet sur le principe de lhybridation molculaire de squences complmentaires, la sonde tant pralablement marque par un fluorochrome (Fig. 2). En thorie, cette technologie permet danalyser lensemble des anomalies chromosomiques. En effet, le dveloppement de banques de clones de squences gnomiques humaines (principalement de type PAC et BAC) permet denvisager la couverture de lensemble du gnome. Cependant, cette approche ncessite une infrastructure importante pour la culture et le stockage de ces banques de clones, mais galement pour le marquage et le contrle de ces clones pour les utiliser en routine hospitalire. Lintrt de cette technologie a conduit plusieurs socits proposer tout un panel de sondes commerciales, aujourdhui utilises en routine hospitalire.

Techniques molculaires
Cette mise au point na pas vocation dtailler lensemble des techniques molculaires utilisables pour la mise en vidence des diffrentes anomalies. Nous nous limiterons donc volontairement une description succincte des techniques utilises en routine hospitalire dhmatologie. Les analyses de biologie molculaire requirent dextraire des acides nucliques (acide dsoxyribonuclique [ADN] et/ou acide ribonuclique [ARN]) partir des chantillons tumoraux (Fig. 3). La technique de base est la polymerase chain reaction (PCR), et ses drives, RT-PCR (reverse transcription) et RQ-PCR (real-time quantitative). La RT-PCR est principalement utilise dans les indications de
Hmatologie

Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes 13-000-K-10

Sang Moelle Liquides

Ganglions Tumeurs 1 Mise en culture directe ou aprs dissociation mcanique (ou enzymatique) 2 Culture in vitro en prsence de srum +/- cytokines 3 Blocage en mtaphase

Ajout de colchicine (30 min quelques heures)

Quelques heures quelques jours

Centrifugation et limination du surnageant + KCl

4 Obtention dun culot cellulaire puis choc hypotonique (KCl) 5 Fixation et talement sur lame

+ Fixateur

6
6 7 8 9 10 11 12

Dnaturation et coloration puis classement des chromosomes

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

Figure 1. A. tapes de lanalyse en cytogntique. KCl : chlorure de potassium. B. Exemple du caryotype dun patient porteur dune translocation t(9;22) ou chromosome Philadelphie (leucmie mylode chronique).

Tableau 3. Nomenclature cytogntique.


Nomenclature p q q2 q23 11q23 t inv Signification Bras court Bras long Deuxime rgion du bras long Troisime bande de la deuxime rgion du bras long Troisime bande de la deuxime rgion du bras long du chromosome 11 Translocation : change de matriel entre deux chromosomes Inversion : remaniement impliquant une double cassure sur un chromosome et recollement aprs inversion Dltion : perte dun segment chromosomique Marqueur chromosomique non identifi Ring : chromosome en anneau Driv : marqueur partiellement identifi portant le centromre du chromosome reconnu

del mar r der

recherche de transcrits chimriques induits par les translocations chromosomiques formant un gne de fusion. En effet,
Hmatologie

dans la majorit de ces cas, les points de cassure sur lADN sont trs variables, rendant lanalyse par PCR impossible. La RQ-PCR est principalement indique dans les cas de suivi de la maladie rsiduelle minime (minimal residual disease [MRD]), qui ncessitent une quantification prcise de cette MRD. La technique de RQ-PCR est base sur lutilisation dun oligonuclotide marqu par deux fluorophores qui interagissent entre eux ( reporter et quencher ) en plus des deux amorces utilises habituellement en PCR classique. Cette sonde dite d hydrolyse est clive chaque synthse dun nouveau brin et met un signal fluorescent qui est analys en temps rel. La fluorescence est dtecte dautant plus rapidement au cours de la PCR quil y avait beaucoup de matrice au dpart dans le tube. Lutilisation dune gamme de calibration (ligne contrle ou plasmides) et la normalisation du rsultat en fonction de la qualit de lARN (value par la quantification du nombre de copies dun gne de mnage, par exemple, Abelson) permettent de quantifier le nombre de copies du gne cible prsent au dpart dans lchantillon analys. La sensibilit de la RQ-PCR est denviron une copie sur 100 000 (105) (Fig. 4). Enfin, la description rcente de mutations ponctuelles ou de rarrangements molculaires non dcelables par caryotype ou par FISH a conduit au dveloppement des techniques de squenage.

13-000-K-10 Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes

22

Points de cassure 9 9 et 22 normaux 9 et 22 anormaux

mtaphases, et donc la ncessit quasi absolue de travailler sur un chantillon frachement prlev. Enfin, une troisime limitation majeure concerne la rsolution de la technique. En effet, lanalyse repose sur la microscopie optique, et sur le dcodage de la succession de bandes claires et sombres obtenues par le marquage. Cette rsolution varie de plus selon la qualit des chromosomes obtenus (longueur, talement...) et lon admet que la rsolution est de lordre de 10 millions de paires de bases (Mb). Ainsi, toute anomalie chromosomique portant sur un fragment dont la taille est infrieure ce seuil est mconnue par la cytogntique conventionnelle. Certaines anomalies peuvent galement passer inaperues, les fragments changs tant similaires en termes de taille et de coloration, comme dans le cas de la translocation t(12;21) des LAL. Ce foss existant entre la rsolution de la cytogntique et celle de la biologie molculaire (de lordre de la base dans les meilleurs cas) est peu peu combl par une technique hybride : la cytogntique molculaire ou FISH. Outre son niveau de rsolution, la FISH prsente de nombreux avantages par rapport la cytogntique classique. Elle peut tre utilise sur cellules congeles, voire fixes et incluses en paraffine. En cas dchec du caryotype (absence de mtaphases clonales), le culot de cellules fixes peut tre utilis pour analyse par FISH interphasique. Toutefois, comme pour la biologie molculaire, la FISH nest informative que pour la sonde utilise. Ainsi, ces diffrentes techniques sont toutes complmentaires les unes des autres et il faut tre parfaitement conscient des avantages, mais galement des limites de chacune lors de la prescription de tel ou tel examen.

Principales indications au diagnostic


ce jour, lanalyse des chromosomes reste un examen incontournable lors du diagnostic de la majorit des hmopathies malignes. En effet, si son rle diagnostique est somme toute modeste (tout au plus permet-elle dasseoir le diagnostic de LMC ou de prciser le type de certains lymphomes), la cytogntique a une place dterminante dans lvaluation pronostique de la pathologie. Ainsi, la mise en vidence dun profil caryotypique particulier ou danomalies molculaires spcifiques va permettre dentrevoir lvolution de la maladie et donc, dans lidal, dadapter le traitement au patient. Nous allons envisager successivement les principales pathologies et dfinir pour chacune dentre elles la place de la cytogntique dans le bilan diagnostique.

Figure 2. A. Sondes uorescentes utilises pour la recherche de la translocation t(9;22) par hybridation in situ en uorescence (FISH). B. Mise en vidence de la translocation t(9;22) par FISH. 1. Chromosome 9 anormal ; 2. chromosome 9 normal ; 3. chromosome 22 normal ; 4. chromosome Philadelphie.

Avantages. Limites
Lexplosion rcente des techniques de biologie molculaire peut rendre caduque dans lesprit de certains la ralisation du caryotype, technique longue, coteuse et relativement peu sensible. Il parat important ce stade de dfinir les avantages mais aussi les limites de la cytogntique conventionnelle par rapport aux techniques molculaires. Lavantage le plus vident de la cytogntique est la vision globale quelle donne des anomalies gntiques prsentes au sein du clone tumoral. En effet, alors que les techniques de biologie molculaire ciblent une anomalie et une seule (celle correspondant la sonde utilise), le caryotype permet la dtection de toute anomalie, sans prjuger de sa nature, pour peu quelle ait une taille suffisante pour tre dtecte par la microscopie optique et que des mtaphases aient pu tre gnres au sein du clone tumoral. Ainsi, en un seul examen, il est possible de mettre en vidence des anomalies de nombre de chromosomes (trisomie 8 ou monosomie 7, par exemple) ou de structure chromosomique (translocations, dltions, inversions, duplications), ainsi que de prciser le caractre complexe ou non du caryotype. Enfin, il est possible de mettre en vidence des sous-clones, signe de lvolutivit tumorale. Il faut toutefois tre conscient des limites de la technique. La premire limite dj aborde est labsence de mtaphases correspondant au clone tumoral, cest--dire la dtection de mtaphases normales correspondant en fait aux cellules normales rsiduelles. La seconde limite est la ncessaire gnration de

Syndromes myloprolifratifs
Au sein de ce groupe, la LMC dtient indiscutablement une place part, plus dun titre : tout dabord, par lhistoire, le classique chromosome Philadelphie tant la premire anomalie cytogntique acquise observe en pathologie humaine en 1960 par Nowell et Hungerford [1] ; ensuite par lassociation virtuellement diagnostique entre lanomalie chromosomique, la translocation t(9;22)(q34;q11) et le diagnostic de LMC ; de plus, par sa disparition progressive en cas de rponse au traitement, lment dtaill par ailleurs ; enfin, la LMC est devenue le modle de choix pour le dveloppement de thrapies cibles, spcifiques dune anomalie molculaire, pargnant ainsi les cellules normales. Cest en 1960, soit avant la dcouverte des mthodes de banding , que Nowell et Hungerford dcrivent dans la revue Science a minute chromosome in a human chronic granulocytic leukemia [1]. Ce nest que 13 ans plus tard que Rowley dmontre que ce chromosome minute est en fait un chromosome 22 remani, produit de la translocation t(9;22)(q34;q11) [8]. Pour la premire fois, une anomalie chromosomique acquise tait relie une pathologie et, de plus, de manire virtuellement constante. Le clonage des points de cassure a ensuite permis didentifier les gnes impliqus, ABL et BCR, et de montrer que le remaniement conduisait la formation dun gne chimrique fonctionnel [9, 10].
Hmatologie

Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes 13-000-K-10

Sang Moelle Liquides

Ganglions Tumeurs

Figure 3. tapes de lanalyse en biologie molculaire. ADN : acide dsoxyribonuclique ; ARN : acide ribonuclique ; BET : bromure dthidium ; PCR : polymerase chain reaction ; RT : reverse transcription ; UV : ultraviolets.

1 Lavage des cellules et obtention dun culot cellulaire

C G A A T

T G

T G

A G C

CACTG

AAAAA

GG

ACT

AAAAA

2 Extraction dacides nucliques (ADN ou ARN)

CCG TA G

AAAAA

CTT AA T

ADN double brin

Hybride double brin ARN-ADNc 4 Duplication de lADN par PCR (PCR)

PCR

Analyse sous UV (gel dagarose color au BET)

lectrophorse capillaire et dtection en fluorescence

La cytogntique a une place prpondrante dans cette pathologie pour diffrentes raisons. Tout dabord, elle signe le diagnostic de LMC, par rapport aux autres syndromes myloprolifratifs. Ceci a une importance capitale au plan thrapeutique. En effet, le principal traitement de la LMC est actuellement limatinib (Glivec), molcule qui inhibe spcifiquement lactivit tyrosine kinase de quelques protines, dont la protine ABL. Il faut toutefois garder en mmoire que ce rarrangement chromosomique nest pas visible dans environ 5 % des cas de LMC typique, soit parce que le rarrangement est cryptique (prsent dun point de vue molculaire, mais non
Hmatologie

TTTTT

GAACC

T G

AAAAA

A C A

C GT

ARN messagers RT 3
AGG TTC AAAAA

Synthse dADN complmentaire des ARN messagers (RT)

5 Analyse du produit de PCR

visible en cytogntique conventionnelle), soit plus rarement par absence de remaniement des gnes ABL et BCR. Dans ces cas, il faut savoir avoir recours dautres techniques, de type FISH ou RT-PCR. La seconde raison est la possible dcouverte danomalies chromosomiques associes. En effet, celles-ci surviennent frquemment lors de lacclration et/ou de la transformation de la maladie, mais peuvent tre prsentes demble, tmoins alors dune phase plus avance de la maladie. Ces anomalies sont volontiers rcurrentes : duplication du chromosome Philadelphie ; isochromosome 17q ; trisomie 8 ou trisomie 19.

13-000-K-10 Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes

Sonde d'hydrolyse R = reporter Q = quencher Taq polymrase

CAGGT A

1
C G

ACAGGT T GGT A ACA

Prparation du mix (ou utilisation de mastermix)

Figure 4. A. tapes de la polymerase chain reaction quantitative (RQ-PCR) avec sonde dhydrolyse. ADN : acide dsoxyribonuclique ; ARN : acide ribonuclique.

Nuclotides Amorces sens et antisens


AGG TTC AAAAA

C G A A T

T G

T G

A G C

2 ou
TTTTT GAACC T Q T TGT AACA

Ajout de la matrice

ADN double brin Squence cible

C TGA ACAGGT T AC T CAGGT AGACC TGT T ACA AGT T T C

Leur apparition pouvant survenir en dehors de toute modification clinique, il est important de savoir les rechercher au cours de lvolution de la maladie. Enfin, la cytogntique au cours du traitement permet dapprcier la rponse aux diffrentes thrapeutiques entreprises. En effet, la chimiosensibilit sassocie une diminution progressive du pourcentage de mtaphases prsentant la translocation t(9;22). Les rponses cytogntiques compltes (toutes les mtaphases sont alors normales) sont associes avec une survie prolonge [4, 11-13]. Lobtention dune rponse cytogntique complte est maintenant la rgle depuis lemploi systmatique de limatinib en premire ligne, rendant indispensable le recours rapide aux techniques molculaires, et tout particulirement la RQ-PCR quantifiant les transcrits chimriques BCR-ABL.

GA A AC T TGT A ACAGGT C T ACC TGAGT A ACC TGT T CAG

5'
ACAGGT T AC T CAGGT AGACC TGT T ACA A

ACAGGT T

CAGGT A

5'
ACAGGT T AC T CAG T A

T TGT A ACAGGT C T ACC TGAGT A ACC TGT

R C

T TGT A ACAGGT C T ACC TGAGT A ACC TGT

T G A G Q

A C A

C GT

Hybride double brin ARN-ADNc

95 C 3 Dnaturation

3'

~60 C 4 Hybridation

~60 C 5 longation Clivage de la sonde mission de fluorescence

3'

A
Les autres syndromes myloprolifratifs sont moins volontiers associs des anomalies chromosomiques rcurrentes. Tout au plus peut-on signaler les dltions du bras long du chromosome 20 dans les polycytmies et la trisomie 9 dans les thrombocytmies essentielles. Mais ces anomalies nont que peu de valeur en pratique courante, tant diagnostique que pronostique. Plusieurs tudes rcentes ont simultanment mis en vidence une mutation spcifique du gne JAK2 dans un nombre trs significatif de cas de polyglobulies de Vaquez, de thrombocytmies essentielles et de splnomgalies mylodes [14-17]. Cette mutation V617F conduit une activation constitutive de lactivit tyrosine kinase de JAK2 en inactivant le domaine inhibiteur de la protine. Le rle exact de cette mutation dans loncogense de ces syndromes reste inconnu, lanomalie tant trs probablement un vnement secondaire. Nanmoins,
Hmatologie

Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes 13-000-K-10

Figure 4 (suite). B. Courbes de calibration de RQ-PCR, exemple de la calibration du gne Abelson laide dune gamme de plasmides.

compte tenu de sa frquence (prs de 100 % des cas de polyglobulies de Vaquez, 50 75 % dans les thrombocytmies essentielles et splnomgalies mylodes), la recherche de cette mutation est un argument diagnostique fort qui modifie totalement la dmarche diagnostique dans ces syndromes. En pratique, la mutation est gnralement recherche par PCR allle-spcifique partir du sang priphrique. Limpact pronostique du pourcentage de cellules clonales mutes nest pas dmontr ce jour.

Leucmies aigus lymphoblastiques


Les LAL de lenfant reprsentent le prototype dhmopathie maligne pour laquelle la valeur pronostique de la cytogntique est clairement dmontre. En effet, probablement en raison des progrs raliss dans le traitement de ce type de leucmies chez lenfant, il a t possible de dmontrer la valeur prdictive de survie long terme de plusieurs types danomalies chromosomiques. Il a ainsi t montr depuis de nombreuses annes que lhyperdiplodie plus de 50 chromosomes tait corrle un excellent pronostic, alors que dautres anomalies, comme la translocation t(9;22)(q34;q11) ou les anomalies de la rgion 11q23, taient associes un trs haut risque de rechute prcoce [2, 18, 19]. Dans les annes 1990, Romana et al. [20] ont
Hmatologie

mis en vidence une nouvelle translocation quilibre, invisible par cytogntique classique (les fragments changs ayant une taille et une morphologie semblables) : la t(12;21)(p13;q22), prsente dans prs dun quart des LAL pr-B de lenfant en utilisant les techniques de FISH ou de RT-PCR. Plusieurs groupes ont depuis montr limpact favorable de cette anomalie sur la survie des patients [21, 22]. linverse, chez ladulte, les anomalies confrant un pronostic favorable sont rares, alors que lon constate une trs nette augmentation de lincidence des cas avec t(9;22) [23], ces deux raisons expliquant probablement (au moins en partie) le sombre pronostic des LAL de ladulte. La mise en vidence de ces diffrentes anomalies a ainsi un intrt direct pour le thrapeute, lintensit (et donc la toxicit) du traitement pouvant tre adapte en fonction du risque prvisible dchec du traitement [24]. Lidentification de ces anomalies a galement permis le clonage des points de cassure et donc des gnes impliqus. Si la t(9;22) conduit bien un rarrangement des gnes ABL et BCR comme dans la LMC, il a t montr que la protine chimrique forme tait en gnral de plus petite taille que dans le cas de la LMC, avec une plus forte activit tyrosine kinase [25] . Le clonage de plusieurs translocations impliquant la rgion 11q23 a permis didentifier un seul et mme gne dsign MLL (pour mixed lineage leukemia,

13-000-K-10 Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes

les leucmies tant volontiers immatures, voire rellement biphnotypiques) [13, 26]. Ce gne est trs frquemment remani (sous forme de gne chimrique produisant un transcrit de fusion) dans les LAL du petit nourrisson (mais galement dans certains types de LAM) [27], et ces remaniements confrent dune manire gnrale un assombrissement du pronostic [28]. Enfin, le gne remani en 12p13 dans la t(12;21), ETV6 (ETS variant gene 6 ou TEL), a depuis t impliqu dans de trs nombreuses autres translocations retrouves dans un large ventail dhmopathies [29]. Le gne partenaire sur le chromosome 21 CBFA2 (core binding factor subunit A2 ou AML1) [30] tait un gne dj connu des hmatologues, car impliqu dans la classique t(8;21) des LAM2. Enfin, de trs nombreuses autres translocations rcurrentes ont t dcrites dans les LAL, mais avec une frquence moindre. Certaines sont spcifiques dun sous-type tumoral particulier, comme les translocations impliquant les gnes des rcepteurs T dans les LAL de type T. Il faut tout de mme mettre part la translocation t(8;14)(q24;q32) et ses variantes, t(2;8)(p12;q24) et t(8;22)(q24;q11). En effet, ces translocations sont fortement vocatrices dun type tumoral particulier : les lymphomes et LAL de Burkitt, ou B-matures. Ces trois translocations juxtaposent le proto-oncogne MYC avec lun des gnes qui codent les chanes dimmunoglobulines, conduisant la drgulation de lexpression de MYC [31]. Ces translocations ont un intrt diagnostique et pronostique important, puisque, en signant le diagnostic de LAL de Burkitt, elles conduisent mettre en uvre un traitement intensif adapt, qui a beaucoup contribu en amliorer le pronostic. Lhyperdiplodie et la t(9;22) sont gnralement facilement identifiables sur le caryotype, linverse de la t(12;21), qui requiert lutilisation de techniques de FISH ou de RT-PCR pour sa mise en vidence. Les anomalies de MLL ont une place intermdiaire, certaines comme la t(4;11) tant facilement identifiables sur le caryotype, dautres comme la t(11;19) pouvant ncessiter le recours des techniques molculaires. Dune manire gnrale, la FISH a ici une place de choix, permettant didentifier lensemble des anomalies de MLL, quel que soit le gne partenaire impliqu dans la translocation. Plus rcemment, la rponse au traitement a t montre comme tant un facteur pronostique dterminant, tout particulirement chez lenfant. Lvaluation de cette rponse ncessite le recours des techniques quantitatives de type RQ-PCR ou cytomtrie en flux. Pour que les techniques molculaires puissent sappliquer, il faut que les rarrangements molculaires des gnes IGH (codant les chanes lourdes dimmunoglobulines) et TCR (codant les diffrentes chanes du rcepteur T) aient t identifis ds le diagnostic. La spcificit de ces rarrangements permet ensuite de quantifier le nombre de cellules tumorales rsiduelles en cours de traitement grce lutilisation de sondes patient-spcifiques. Lvaluation de la maladie rsiduelle a pris une place capitale dans la prise en charge thrapeutique des patients [32]. La technique de cytomtrie en flux permet une quantification de la maladie rsiduelle avec une sensibilit quivalente, en ciblant les combinaisons dantignes anormalement exprimes par les cellules blastiques [33].

Leucmies aigus mylodes (LAM)


Comme dans les LAL, la cytogntique revt une importance de plus en plus importante dans les LAM, essentiellement au plan pronostique [34, 35]. Ainsi, la plupart des essais thrapeutiques actuels intgrent cette donne dans la stratgie propose, les patients avec anomalie pjorative tant inclus dans des schmas de traitement lourd, incluant si possible une allogreffe mdullaire (y compris avec un donneur extrafamilial), alors que les patients prsentant des anomalies cytogntiques de bon pronostic sont traits de manire moins agressive. De plus, certaines anomalies sont fortement corrles un type cytologique particulier. Nous allons voir les principales anomalies dont la mise en vidence interfre directement avec le traitement propos. Celle le plus anciennement associe un type cytologique particulier, et probablement la plus importante reconnatre en urgence pour une prise en charge thrapeutique adapte, est la

t(15;17)(q25;q22) [36]. Cette translocation est pathognomonique de la LAM3 de la classification French-American-British (FAB), et conduit la formation dun gne chimrique impliquant des gnes PML (promyelocytic leukemia) et RARA (retinoic acid receptor alpha) [37-40]. Outre sa spcificit cytologique, cette translocation est importante reconnatre puisquelle confre une sensibilit un agent diffrenciant : lacide tout-trans rtinoque (ATRA). Il existe plusieurs translocations variantes, impliquant systmatiquement RARA fusionn un partenaire variable (PLZF [41], NPM [42] , NuMA [43] , STAT5b [44] ). Or, la t(11;17)(q13;q22), formant un gne chimrique RARA-PLZF, est gnralement associe une rsistance intrinsque lATRA. Il est important de diagnostiquer ce type (certes rare) de translocation, afin de ne pas retarder le traitement par chimiothrapie cytotoxique et de ne pas traiter inutilement ces patients par ATRA. Le recours la FISH interphasique reconnaissant la fusion PML-RARA peut savrer trs utile dans ce cas, compte tenu de la rapidit de ralisation de cet examen (rponse possible en quelques heures). La translocation t(8;21)(q22;q22) est essentiellement associe aux LAM2 et est observe dans 5 10 % des LAM [35]. Cette translocation confre galement un pronostic favorable (avec notamment un taux de rmission complte lev), et beaucoup dessais thrapeutiques excluent les patients prsentant cette anomalie des programmes dallogreffe mdullaire en premire rmission complte. Cette translocation conduit galement la formation dun gne chimrique impliquant les gnes MTG8 (myeloid translocation gene on chromosome 8 ou ETO, pour eight twenty-one) et CBFA2 (ou AML1) [45]. Cette translocation est aisment identifiable sur le caryotype. En cas dchec, elle peut tre recherche par RT-PCR. Certains essais thrapeutiques testent actuellement limportance du taux de transcrit chimrique mesur au diagnostic par RQ-PCR. La troisime anomalie caractristique est linversion du chromosome 16, inv(16)(p13;q22), ou la t(16;16)(p13;q22), retrouves dans la grande majorit des LAM4Eo, et dans 5 10 % des LAM en gnral [35]. Cette anomalie est difficile identifier en cytogntique, et la FISH ou la RT-PCR peuvent tre une aide prcieuse. Comme la t(8;21), linv(16) est associe un pronostic favorable et nest plus retenue comme une indication lallogreffe mdullaire en premire rmission complte [35]. Les gnes impliqus ont t identifis : MYH11 (myosin heavy chain 11) en 16q13 et CBFB (core binding factor b subunit) en 16q22 [46]. Ces trois anomalies, spcifiques des LAM, confrent toutes trois un pronostic favorable. Dautres anomalies spcifiques des LAM, mais beaucoup plus rares, sont rpertories comme la t(6;9)(p21;q34) ou la t(8;16)(p11;p13) souvent associe une rythrophagocytose. Toutes ces translocations conduisent la formation de gnes chimriques fonctionnels (cest--dire transcrits), le cadre de lecture tant respect. linverse, dautres anomalies entranent la perte de matriel chromosomique. Il sagit soit de monosomies 5 ou/et 7, soit de dltions interstitielles affectant les bras longs de ces chromosomes. Les gnes cibles de ces pertes de matriel ne sont pas identifis ce jour. Ces anomalies sont volontiers retrouves chez des patients prsentant un pass de mylodysplasie, ou chez des patients gs, ou chez des patients prsentant une LAM secondaire des traitements alkylants. De plus, le caryotype est volontiers complexe. Le point commun de ces anomalies est leur impact sur le pronostic. Les patients sont alors frquemment rsistants au traitement et la survie est gnralement courte [34, 35]. Enfin, il existe des anomalies qui ne sont pas associes un sous-type cytologique particulier et dont limpact pronostique est neutre ou encore mal dfini. On retrouve dans ce groupe la trisomie 8 et les rarrangements de la rgion 11q23. Ces derniers impliquent le gne MLL et sont observs sous la forme de translocations dont les plus frquentes sont les t(9;11)(p22;q23), t(11;19)(q23;p13), t(6;11)(q27;q23) et t(10;11)(p11;q23) [47]. Ces anomalies de MLL tant pour certaines associes un pronostic pjoratif, il est important de noter que des rarrangements molculaires, non visibles par cytogntique ou FISH (duplication des exons 2 6), ont t dcrits chez des patients prsentant une trisomie 11 ou un caryotype normal [48] . Des
Hmatologie

Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes 13-000-K-10

techniques molculaires pourraient tre ainsi indiques si la valeur pjorative de ces anomalies tait confirme. Enfin, ce gne est frquemment rarrang dans les cas de LAM secondaires des traitements comportant des inhibiteurs de topoisomrases II, comme les pipodophyllotoxines [49]. Ainsi, aprs les LAL, la cytogntique est devenue un lment dterminant de lvaluation pronostique des LAM. Il est donc essentiel de se donner les moyens dobtenir un prlvement mdullaire (ou sanguin en cas de blastose priphrique) de qualit avant dentreprendre la mise en route du traitement. Plus rcemment, certaines anomalies molculaires ont t dcrites et associes un pronostic particulier. La premire correspond aux anomalies du gne FLT3 (FMS-related tyrosine kinase 3). Ce gne code un rcepteur membranaire activit tyrosine kinase. Lactivation de ce rcepteur ncessite la fixation de son ligand (FLT3-ligand). En cas danomalie molculaire (duplication interne ou mutation ponctuelle), le rcepteur est constitutivement activ. Ces anomalies sont observes dans 25 30 % des LAM et confreraient un pronostic dfavorable [50]. Trs rcemment, les mutations du gne NPM1 (codant la nuclophosmine) ont t dcrites dans prs de 30 % des LAM, tout particulirement dans les formes caryotype normal. Ces mutations conduisent une localisation cytoplasmique exclusive de la protine. Ces mutations sont associes un pronostic favorable [51, 52]. Enfin, des mutations du gne CEBPA (CCAAT/ enhancer binding protein a) ont t galement dcrites chez 10 % des patients prsentant une LAM et seraient associes un pronostic favorable [53] . Lidentification de ces diffrentes anomalies ncessite le recours diffrentes techniques molculaires, incluant la PCR et le squenage. Il est probable quun nombre croissant danomalies molculaires seront dcrites lavenir, ncessitant sans aucun doute le dveloppement de stratgies permettant lvaluation simultane de plusieurs anomalies.

Syndromes mylodysplasiques (SMD)


Cet ensemble syndromique regroupe, selon la classification FAB, les anmies rfractaires simples ou avec excs de blastes, les leucmies mylomonocytaires chroniques et les anmies sidroblastiques. Aucune anomalie cytogntique nest spcifique de lun de ces syndromes, et toutes peuvent se voir dans chacun dentre eux. Les anomalies rencontres sont le plus souvent des anomalies de nombre et des pertes de matriel chromosomique. Les plus frquentes touchent les chromosomes 5 et 7, soit sous forme de monosomie, soit sous forme de dltions interstitielles affectant le bras long comme dans les LAM. Il faut toutefois isoler le classique syndrome 5q- [54], qui associe une dltion de taille variable du bras long du chromosome 5 isole, associe une anmie souvent isole, des mgacaryocytes souvent unilobuls, touchant le plus souvent la femme ge, avec un risque de transformation trs faible. La reconnaissance de ces anomalies 5q a un intrt thrapeutique potentiel, ces patients tant sensibles au lnalidomide (Revlimid) [55]. Parmi les autres anomalies rencontres dans les SMD, et par ordre dcroissant de frquence, on retrouve ensuite la trisomie 8, les dltions du bras long du chromosome 20, les pertes du chromosome Y chez lhomme, puis plus rarement des pertes affectant le 11q, le 13q et le 12p. Une tude internationale retient des anomalies associes un pronostic favorable : del(5q) isole, del(20q) isole ou perte du chromosome Y isole [56]. linverse, les pertes affectant le chromosome 7 et les caryotypes complexes confrent un pronostic pjoratif, tant en termes de risque de transformation en LAM secondaire quen termes de survie. Ainsi, comme dans les leucmies aigus, la cytogntique a un rle important dans la dtermination du pronostic. Il ny a pas aujourdhui danomalie gnique identifie qui pourrait conduire des analyses molculaires.

Lymphomes malins non hodgkiniens (LMNH)


Les LMNH sont classs en diffrents sous-groupes immunomorphologiques, classifications priodiquement ractualises. La dernire en date (classification de lOrganisation mondiale de la
Hmatologie

sant en 2001) prend galement en compte les anomalies cytogntiques [57]. La majorit des anomalies spcifiques de sous-types immunomorphologiques impliquent les gnes codant les chanes dimmunoglobulines. Plus rcemment, ltude du profil de mutations somatiques affectant le gne des chanes lourdes dimmunoglobulines a permis de mieux prciser lontognie des lymphomes B [58], qui reprsentent la majorit des LMNH. Les lymphomes T sont beaucoup plus rares et de nombreuses translocations impliquant lun des gnes codant les rcepteurs T ont t dcrites. Compte tenu de leur raret, ces anomalies ne sont pas abordes ici [59]. Lassociation de la t(8;14)(q24;q32) au lymphome de Burkitt est connue depuis 1976 [31] . Tous les cas de lymphome de Burkitt sont associs une translocation affectant le gne MYC et lun des gnes codant les chanes dimmunoglobulines (cf. supra) (linverse ntant pas forcment vrai, ces translocations ayant t dcrites dans le mylome multiple ou dans certains cas de lymphome B de haut grade). Dans tous les cas, et dans tous les types de translocation, le gne MYC est drgul. Des diffrences semblent toutefois exister au plan molculaire entre les lymphomes dits endmiques (touchant essentiellement lenfant africain et relis au virus Epstein-Barr), et les lymphomes dits sporadiques rencontrs en Europe et en Amrique du Nord. Les premiers semblent impliquer des anomalies survenues lors des recombinaisons VDJ, alors que les seconds seraient plutt la consquence danomalies survenues lors des phnomnes de mutations somatiques ou de commutation isotypique [60]. Cependant, la translocation signe dans tous les cas le lymphome de Burkitt qui, moyennant une thrapeutique intensive adapte, permet desprer un fort taux de gurison. Sa mise en vidence est donc essentielle pour la stratgie thrapeutique proposer. De manire tout aussi spcifique, lassociation de la translocation t(14;18)(q32;q21) au lymphome folliculaire a t identifie ds 1979 [61]. Le clonage des points de cassure a permis didentifier le premier reprsentant dune nouvelle famille : celle des gnes rgulant lapoptose [62]. Ce gne a t dnomm BCL2 (B cell leukemia/lymphoma 2). Sur le chromosome 14, la translocation implique galement le gne IGH (immunoglobulin heavy chain) et semble tre la consquence danomalies survenues lors des rarrangements VDJ [63]. La consquence molculaire de la translocation est une hyperexpression du gne BCL2, dont la protine a pour fonction dinhiber lapoptose. Certains cas de lymphomes folliculaires (de 10 15 %) ne prsentent pas de t(14;18) sur le caryotype. Il est toutefois possible que ces patients prsentent un rarrangement molculaire invisible par cytogntique, comme rcemment rapport [64] . Dautres anomalies chromosomiques sont frquemment associes, refltant probablement le caractre multitapes de la lymphomagense, la t(14;18) ntant pas oncognique elle-seule. La troisime translocation spcifique de type tumoral est la t(11;14)(q13;q32) [65]. Si elle nest retrouve par cytogntique que dans 75 80 % des cas, le recours la FISH interphasique permet une dtection dans 100 % des cas de lymphomes du manteau [66]. L encore, linverse nest pas vrai, puisque la translocation a t dcrite dans des cas de mylome multiple et de LLC. moins que cette constatation ne remette en cause les classifications nosologiques, ces LLC ntant en fait que des formes particulires de lymphome du manteau. Quoi quil en soit, cette translocation conduit systmatiquement une hyperexpression du gne qui code la cycline D1 (CCND1) [67]. L encore, la mise en vidence de la translocation est importante dans les cas de diagnostic difficile, le pronostic pjoratif du lymphome du manteau ncessitant une thrapeutique approprie. Comme pour le lymphome folliculaire, la translocation nest pas suffisante pour induire le lymphome, dautres vnements oncogniques tant probablement ncessaires la tumorogense [68, 69]. Il faut toutefois noter que de rares cas de lymphomes du manteau ne prsentent pas la t(11;14) [70]. Dautres anomalies chromosomiques plus ou moins spcifiques ont t dcrites. Ainsi, les lymphomes lymphoplasmocytaires semblent tre associs la t(9;14)(p13;q32) impliquant le gne PAX5 [71], alors que les lymphomes B grandes cellules

13-000-K-10 Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes

sont frquemment associs des anomalies du gne BCL6, situ en 3q27, sous la forme de translocations varies ou de mutations activatrices du gne [72] . Les lymphomes de la zone marginale sont frquemment associs une trisomie 3, sans que cette anomalie ne soit en aucune manire spcifique. Enfin, plus rcemment ont t dcrites de nouvelles translocations spcifiques de sous-types tumoraux. La premire est la translocation t(2;5)(p23;q35), associe de manire spcifique avec les lymphomes anaplasiques. Cette translocation implique les gnes ALK (anaplastic lymphoma kinase) en 2p23 et NPM (nucleophosmin) en 5q35 [73] . Dautres translocations variantes ont depuis t dcrites, toutes impliquant ALK, dfinissant pour certains une entit dfinie sous le nom d alkomes [74]. La seconde est la translocation t(11;18)(q21;q21), associe de manire spcifique aux lymphomes dits du mucosal-associated lymphoid tissue (MALT), cest--dire essentiellement des lymphomes extranodaux, surtout digestifs, mais aussi parotidiens, pulmonaires... Les gnes impliqus dans cette translocation ont t rcemment identifis : le gne API2 (apoptosis inhibitor 2) en 11q21 et le gne MALT-1 (MALT lymphoma associated translocation) en 18q21 [75]. La translocation aurait pour effet de potentialiser leffet inhibiteur de lapoptose, et ainsi de confrer un avantage de survie aux cellules porteuses de la translocation. Plus rcemment, une translocation t(14;18)(q32;q21), impliquant les gnes IGH et MALT1, a galement t dcrite dans certains cas de lymphomes du MALT [76]. La valeur pronostique de ces diffrentes anomalies reste ce jour inconnue. En effet, seules des tudes cytogntiques systmatiques partir de prlvements ganglionnaires permettraient de corrler les anomalies rcurrentes au devenir des patients. Deux raisons expliquent ce retard par rapport aux leucmies aigus : dune part, la moins bonne accessibilit au contingent tumoral (prlvement ganglionnaire chirurgical ncessaire), dautre part la plus grande complexit du caryotype (rendant difficile lextraction danomalies particulires). Lamlioration de la prise en charge thrapeutique des patients devrait toutefois dans lavenir inciter les thrapeutes un bilan pronostique plus prcis, incluant la cytogntique.

rcepteur T a/d en 14q11 et le gne TCL1 (T-cell leukemia 1) en 14q32, suivies des pertes du bras court du chromosome 8 [80]. noter enfin des translocations spcifiques entre le gne TCRA/D et la rgion Xq28 touchant le gne MTCP1 (mature T-cell proliferation) [81]. Compte tenu de la raret de cette pathologie, peu dtudes systmatiques ont tudi limpact pronostique de ces anomalies. Dans le cas du mylome, des anomalies clonales ne sont retrouves que dans 20 30 % des cas, reflet du faible index prolifratif des plasmocytes tumoraux. Toutefois, deux anomalies chromosomiques semblent plus particulirement observes : des anomalies de structure de la rgion 14q32, sous la forme de translocations variables impliquant toutes le gne IGH, et les dltions plus ou moins tendues du bras long du chromosome 13, centres sur la rgion 13q14. Par FISH interphasique, les premires sont retrouves dans 60 % des cas, alors que la rgion 13q14 est perdue dans 50 % des cas [82]. Cette dernire anomalie semble confrer un pronostic particulirement dfavorable [83], tout particulirement en cas dassociation la translocation t(4;14)(p16;q32) (spcifique du mylome) ou une dltion de la rgion 17p13 [84].

Suivi de la maladie et de la rponse au traitement


Lexemple le plus frappant reste celui de la LMC. Depuis lutilisation systmatique de limatinib comme traitement de base de la LMC, des rmissions cytogntiques compltes sont observes chez la majorit des patients. Ltude de plusieurs cohortes de patients a ainsi montr que les patients pour lesquels on assiste une disparition complte du chromosome Philadelphie ont une survie trs significativement prolonge par rapport ceux qui gardent des mtaphases Philadelphiepositives. Dans tous les cas, la cytogntique reste un examen de choix pour le suivi prcoce de la rponse au traitement, ainsi que pour le diagnostic de survenue dventuelles anomalies secondaires, signe dacclration de la maladie. Lexamen reste toutefois long et fastidieux, lamlioration de lefficacit des traitements tant corrle une diminution de lindex mitotique. Rcemment, lutilisation de la FISH a permis dvaluer la rponse directement sur cellules interphasiques du sang circulant jusqu un seuil de 1 %, vitant ainsi le recours rpt aux aspirations mdullaires et la ncessit dobtention de mtaphases [85]. La cytogntique peut galement tre utilise dans le suivi de la maladie, surtout en cas de doute sur une ventuelle rechute. Les anomalies constates au diagnostic sont gnralement galement prsentes lors de la rechute, souvent accompagnes dautres anomalies, tmoin de lvolutivit du clone tumoral. La technique est toutefois relativement peu sensible (de lordre de 5 %), et les techniques molculaires bases sur la PCR quantitative doivent tre privilgies (permettant de dtecter et de quantifier la maladie rsiduelle jusqu un seuil de 104105). Ce type danalyse par RQ-PCR est ainsi devenu lactivit majeure des laboratoires dhmatologie [86, 87]. Enfin, la cytogntique peut galement tre utile pour le suivi des allogreffes mdullaires en cas de diffrence de sexe entre donneur et receveur. Mais l encore, il faut prfrer la FISH interphasique avec des sondes spcifiques des chromosomes X et Y, permettant une apprciation fine dun ventuel chimrisme incomplet, avec une sensibilit nettement suprieure celle de la cytogntique (< 0,1 %). Dans les cas sans diffrence de sexe entre le donneur et le receveur, le suivi du chimrisme sanguin se fait par techniques molculaires quantitatives, tout particulirement la RQ-PCR de marqueurs polymorphes [88]. Le suivi de la maladie rsiduelle est galement important dans cette pathologie (cf. supra) [32, 89]. ce jour, il ny a pas dindication claire de suivi dans les LAM, faute de marqueur universel qui pourrait servir de cible [90, 91].
Hmatologie

Leucmie lymphode chronique. Mylome multiple


Ces deux pathologies se caractrisent par un faible index prolifratif, ce qui rend lexamen cytogntique extrmement difficile. On ne dispose ainsi daucune donne fiable sur les anomalies cytogntiques de la maladie de Waldenstrm. Dans les LLC de type B, la lymphocytose sanguine est par dfinition augmente et le caryotype est gnralement obtenu partir dun prlvement de sang circulant. Ladjonction de mitognes B, voire T, permet daccrotre lindex mitotique et dobtenir des mtaphases clonales dans environ un cas sur deux. Dautres types dagents mitognes semblent trs prometteurs [77]. Lanomalie la plus frquemment retrouve est la dltion du bras long du chromosome 13, et principalement de la bande 13q14 [78]. Lincidence de cette dltion dpasse un cas sur deux si on la recherche par technique molculaire. Le gne cible de la dltion nest pas connu avec certitude, mais pourrait appartenir la famille des micro-ARN. De manire moins frquente, on retrouve ensuite la trisomie 12, les dltions de la rgion 11q23 et, plus rarement, de la rgion 17p13. Il convient de souligner que le gne cible des dltions 11q23 a t rcemment identifi. Il sagit du gne ATM (ataxia-telangiectasia mutated gene), gne mut dans lataxie-tlangiectasie [79]. Ces deux dernires anomalies (dltions 11q23 et 17p13) semblent corrles une survie significativement plus courte. La dcouverte rcente de deux types de LLC, en fonction du statut mut ou non mut des rgions variables du gne IGH [11], devrait conduire une rvaluation de ces diffrentes anomalies en fonction de ces deux sous-types, les LLC non mutes tant associes un pronostic dfavorable. Les LLC de type T sont essentiellement des leucmies prolymphocytes. Une tude rcente a montr de frquentes anomalies cytogntiques, les plus frquentes tant les inversions du chromosome 14, impliquant le gne codant du

10

Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes 13-000-K-10

Conclusion et perspectives
Mme si nous navons fait que survoler les principales anomalies cytogntiques et gniques rencontres au cours des hmopathies malignes, nous pouvons dgager trois conclusions gnrales. La premire est le rle essentiel de la cytogntique dans ltablissement du pronostic du patient. Si cette notion tait parfaitement connue des pdiatres en ce qui concerne les LAL de lenfant, lamlioration des rsultats des traitements a permis de montrer quelle se vrifiait galement dans les LAM de ladulte, mais aussi dans la LLC ou le mylome. Tout porte croire que cette valeur pronostique devrait peu peu stendre aux autres hmopathies, pour peu que les tudes cytogntiques systmatiques soient tendues lensemble des hmopathies, et mme de manire provocante aujourdhui, lensemble des tumeurs malignes. La dfinition de groupes pronostiques permet ainsi la dfinition de traitements adapts en fonction du risque prvisible dchec ou de rechute, vitant ainsi de surtraiter certains patients au risque de voir apparatre des effets toxiques potentiellement ltaux. De plus, lidentification prcoce (ds le diagnostic) des maladies les plus graves devrait permettre llaboration de programmes thrapeutiques (ventuellement exprimentaux) adapts, voire ventuellement purement palliatifs pour les patients les plus gs. La seconde conclusion est le rle diagnostique de la cytogntique. Celui-ci reste actuellement limit, mais il devrait peuttre permettre de mieux dfinir les limites nosologiques de certaines entits proches, principalement au sein des lymphomes B. Ainsi, on pourrait imaginer de voir dmembrer le groupe des lymphomes dits Burkitt-like ou Burkitt atypiques en fonction danomalies de la rgion 8q24, les cas prsentant un rarrangement de MYC tant alors regroups avec les lymphomes de Burkitt vrais . Un autre exemple est celui des rares LLC avec t(11;14). Leur identification systmatique permettrait la dtermination de leur pronostic propre et ventuellement de les rapprocher des lymphomes du manteau. Enfin, la (cyto-)gntique a eu, a, et devrait avoir dans lavenir un rle dterminant sur le plan fondamental. En effet, le clonage systmatique des points de cassure des diffrentes translocations ou inversions a permis lidentification de trs nombreux gnes, permettant des avances capitales pour la comprhension de lhomostasie cellulaire ou la rgulation de lhmatopose. La poursuite dtudes systmatiques, principalement dans les pathologies encore peu explores, devrait permettre de perptuer la qute de nouveaux gnes. Enfin, lavenir de la cytogntique est probablement dans une interrelation la plus troite possible avec les techniques molculaires, incluant la FISH. Celle-ci, tout en restant une technique drive de la cytogntique, permet de faire un lien avec la biologie molculaire, en comblant peu peu le foss (de lordre de la dizaine de mgabases) existant entre les deux techniques. Cest seulement en intgrant ces diffrentes techniques dans la stratgie diagnostique et pronostique que lon pourra esprer des progrs thrapeutiques, en adaptant la thrapeutique aux caractristiques individuelles de la tumeur et du patient.

[7] [8] [9]

[10] [11] [12] [13] [14] [15]

[16]

[17] [18] [19] [20] [21]

[22]

[23]

[24]

Rfrences
[1] [2] [3] Nowell PC, Hungerford DA.Aminute chromosome in a human chronic granulocytic leukemia. Science 1960;132:1497-501. Pui CH. Childhood leukemia. N Engl J Med 1995;332:1618-30. Kantarjian HM, OBrien S, Smith TL, Rios MB, Cortes J, Beran M, et al. Treatment of Philadelphia chromosome-positive early chronic phase chronic myelogenous leukemia with daily doses of interferon alpha and low-dose cytarabine. J Clin Oncol 1999;17:284-92. Kantarjian HM, Smith TL, OBrien S, Beran M, Pierce S, Talpaz M. Prolonged survival in chronic myelogenous leukemia after cytogenetic response to interferon-alpha therapy. The Leukemia Service. Ann Intern Med 1995;122:254-61. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 1971;2:971-2. Dutrillaux B, Lejeune J. A new technique of analysis of the human karyotype. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D 1971;272:2638-40.

[25] [26] [27] [28]

[4]

[5] [6]

[29]

An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN). Report of the standing committee on human cytogenetic nomenclature. Cytogenet Cell Genet 1995;31:1-14. Rowley JD. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identied by quinacrine uorescence and Giemsa staining. Nature 1973;243:290-3. de Klein A, van Kessel AG, Grosveld G, Bartram CR, Hagemeijer A, Bootsma D, et al.Acellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature 1982;300: 765-7. Groffen J, Stephenson JR, Heisterkamp N, de Klein A, Bartram CR, Grosveld G. Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22. Cell 1984;36:93-9. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999;94:1848-54. Kuppers R, Klein U, Hansmann ML, Rajewsky K. Cellular origin of human B-cell lymphomas. N Engl J Med 1999;341:1520-9. Tkachuk DC, Kohler S, Cleary ML. Involvement of a homolog of Drosophila trithorax by 11q23 chromosomal translocations in acute leukemias. Cell 1992;71:691-700. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Lacout C, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature 2005;434:1144-8. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, Wheatley K, East CL, Marsden JT, et al. Denition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: a prospective study. Lancet 2005;366:1945-53. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, Ebert BL, Wernig G, Huntly BJ, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelobrosis. Cancer Cell 2005;7:387-97. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo SS, Tiedt R, Passweg JR, et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005;352:1779-90. Pui CH, Crist WM, Look AT. Biology and clinical signicance of cytogenetic abnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1990;76:1449-63. Raimondi SC. Current status of cytogenetic research in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1993;82:2237-51. Romana SP, Le Coniat M, Berger R. t(12;21): a new recurrent translocation in acute lymphoblastic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1994;9:186-91. Borkhardt A, Cazzaniga G, Viehmann S, Valsecchi MG, Ludwig WD, Burci L, et al. Incidence and clinical relevance of TEL/AML1 fusion genes in children with acute lymphoblastic leukemia enrolled in the German and Italian multicenter therapy trials. Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica and the Berlin-Frankfurt-Munster Study Group. Blood 1997;90:571-7. Rubnitz JE, Downing JR, Pui CH, Shurtleff SA, Raimondi SC, Evans WE, et al. TEL gene rearrangement in acute lymphoblastic leukemia: a new genetic marker with prognostic signicance. J Clin Oncol 1997;15:1150-7. A Collaborative Study of the Group Franais de Cytogntique Hmatologique. Cytogenetic abnormalities in adult acute lymphoblastic leukemia: correlations with hematologic ndings outcome. Blood 1996;87:3135-42. Cave H, Suciu S, Preudhomme C, Poppe B, Robert A, Uyttebroeck A, et al. Clinical signicance of HOX11L2 expression linked to t(5; 14)(q35;q32), of HOX11 expression, and of SIL-TAL fusion in childhood T-cell malignancies: results of EORTC studies 58881 and 58951. Blood 2004;103:442-50. Lugo TG, Pendergast AM, Muller AJ, Witte ON. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products. Science 1990;247:1079-82. Djabali M, Selleri L, Parry P, Bower M, Young BD, Evans GA. A trithorax-like gene is interrupted by chromosome 11q23 translocations in acute leukaemias. Nat Genet 1992;2:113-8. Cimino G, Lo Coco F, Biondi A, Elia L, Luciano A, Croce CM, et al. ALL-1 gene at chromosome 11q23 is consistently altered in acute leukemia of early infancy. Blood 1993;82:544-6. Behm FG, Raimondi SC, Frestedt JL, Liu Q, Crist WM, Downing JR, et al. Rearrangement of the MLL gene confers a poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia, regardless of presenting age. Blood 1996;87:2870-7. Romana SP, Mauchauffe M, Le Coniat M, Chumakov I, Le Paslier D, Berger R, et al. The t(12;21) of acute lymphoblastic leukemia results in a tel-AML1 gene fusion. Blood 1995;85:3662-70.

Hmatologie

11

13-000-K-10 Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes

[30] Miyoshi H, Kozu T, Shimizu K, Enomoto K, Maseki N, Kaneko Y, et al. The t(8;21) translocation in acute myeloid leukemia results in production of an AML1-MTG8 fusion transcript. EMBO J 1993;12:2715-21. [31] Dalla-Favera R, Martinotti S, Gallo RC, Erikson J, Croce CM. Translocation and rearrangements of the c-myc oncogene locus in human undifferentiated B-cell lymphomas. Science 1983;219:963-7. [32] Cave H, van der Werff ten Bosch J, Suciu S, Guidal C, Waterkeyn C, Otten J, et al. Clinical signicance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. European Organization for Research and Treatment of Cancer--Childhood Leukemia Cooperative Group. N Engl J Med 1998;339:591-8. [33] Robillard N, Cave H, Mechinaud F, Guidal C, Garnache-Ottou F, Rohrlich PS, et al. Four-color ow cytometry bypasses limitations of IG/TCR polymerase chain reaction for minimal residual disease detection in certain subsets of children with acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2005;90:1516-23. [34] Dastugue N, Payen C, Lafage-Pochitaloff M, Bernard P, Leroux D, Huguet-Rigal F, et al. Prognostic signicance of karyotype in de novo adult acute myeloid leukemia. The BGMT group. Leukemia 1995;9: 1491-8. [35] Grimwade D, Walker H, Oliver F, Wheatley K, Harrison C, Harrison G, et al. The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML: analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial. The Medical Research Council Adult and Childrens Leukaemia Working Parties. Blood 1998;92:2322-33. [36] Rowley JD, Golomb HM, Dougherty C. 15/17 translocation, a consistent chromosomal change in acute promyelocytic leukaemia. Lancet 1977;1:549-50. [37] Borrow J, Goddard AD, Sheer D, Solomon E. Molecular analysis of acute promyelocytic leukemia breakpoint cluster region on chromosome 17. Science 1990;249:1577-80. [38] de The H, Chomienne C, Lanotte M, Degos L, Dejean A. The t(15;17) translocation of acute promyelocytic leukaemia fuses the retinoic acid receptor alpha gene to a novel transcribed locus. Nature 1990;347: 558-61. [39] Lemons RS, Eilender D, Waldmann RA, Rebentisch M, Frej AK, Ledbetter DH, et al. Cloning and characterization of the t(15;17) translocation breakpoint region in acute promyelocytic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1990;2:79-87. [40] Longo L, Pandol PP, Biondi A, Rambaldi A, Mencarelli A, Lo Coco F, et al. Rearrangements and aberrant expression of the retinoic acid receptor alpha gene in acute promyelocytic leukemias. J Exp Med 1990; 172:1571-5. [41] Chen Z, Brand NJ, Chen A, Chen SJ, Tong JH, Wang ZY, et al. Fusion between a novel Kruppel-like zinc nger gene and the retinoic acid receptor-alpha locus due to a variant t(11;17) translocation associated with acute promyelocytic leukaemia. EMBO J 1993;12:1161-7. [42] Redner RL, Rush EA, Faas S, Rudert WA, Corey SJ. The t(5;17) variant of acute promyelocytic leukemia expresses a nucleophosmin-retinoic acid receptor fusion. Blood 1996;87:882-6. [43] Wells RA, Catzavelos C, Kamel-Reid S. Fusion of retinoic acid receptor alpha to NuMA, the nuclear mitotic apparatus protein, by a variant translocation in acute promyelocytic leukaemia. Nat Genet 1997;17:109-13. [44] Arnould C, Philippe C, Bourdon V, Grgoire MJ, Berger R, Jonveaux P. The signal transducer and activator of transcription STAT5b gene is a new partner of retinoic acid receptor alpha in acute promyelocytic-like leukaemia. Hum Mol Genet 1999;8:1741-9. [45] Miyoshi H, Shimizu K, Kozu T, Maseki N, Kaneko Y, Ohki M. t(8;21) breakpoints on chromosome 21 in acute myeloid leukemia are clustered within a limited region of a single gene,AML1. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:10431-4. [46] Liu P, Tarle SA, Hajra A, Claxton DF, Marlton P, Freedman M, et al. Fusion between transcription factor CBF beta/PEBP2 beta and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia. Science 1993;261: 1041-4. [47] Bernard OA, Busson-LeConiat M, Ballerini P, Mauchauffe M, Della Valle V, Monni R, et al. A new recurrent and specic cryptic translocation, t(5;14)(q35;q32), is associated with expression of the Hox11L2 gene in T acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2001;15: 1495-504. [48] Caligiuri MA, Strout MP, Lawrence D,Arthur DC, Baer MR, Yu F, et al. Rearrangement ofALL1 (MLL) in acute myeloid leukemia with normal cytogenetics. Cancer Res 1998;58:55-9.

[49] Broeker PL, Super HG, Thirman MJ, Pomykala H, Yonebayashi Y, Tanabe S, et al. Distribution of 11q23 breakpoints within the MLL breakpoint cluster region in de novo acute leukemia and in treatmentrelated acute myeloid leukemia: correlation with scaffold attachment regions and topoisomerase II consensus binding sites. Blood 1996;87: 1912-22. [50] Meshinchi S, Alonzo TA, Stirewalt DL, Zwaan M, Zimmerman M, Reinhardt D, et al. Clinical implications of FLT3 mutations in pediatric AML. Blood 2006;108:3654-61. [51] Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, et al. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. N Engl J Med 2005;352:254-66. [52] Schnittger S, Schoch C, Kern W, Mecucci C, Tschulik C, Martelli MF, et al. Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. Blood 2005;106:3733-9. [53] Preudhomme C, Sagot C, Boissel N, Cayuela JM, Tigaud I, de Botton S, et al. Favorable prognostic signicance of CEBPAmutations in patients with de novo acute myeloid leukemia: a study from theAcute Leukemia French Association (ALFA). Blood 2002;100:2717-23. [54] Van den Berghe H, Cassiman JJ, David G, Fryns JP, Michaux JL, Sokal G. Distinct haematological disorder with deletion of long arm of no. 5 chromosome. Nature 1974;251:437-8. [55] List A, Dewald G, Bennett J, Giagounidis A, Raza A, Feldman E, et al. Lenalidomide in the myelodysplastic syndrome with chromosome 5q deletion. N Engl J Med 2006;355:1456-65. [56] Greenberg P, Cox C, LeBeau MM, Fenaux P, Morel P, Sanz G, et al. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood 1997;89:2079-88. [57] Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK, Vardiman J, et al. World Health Organization classication of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory Committee meeting-Airlie House, Virginia, November 1997. J Clin Oncol 1999;17:3835-49. [58] Stevenson F, Sahota S, Zhu D, Ottensmeier C, Chapman C, Oscier D, et al. Insight into the origin and clonal history of B-cell tumors as revealed by analysis of immunoglobulin variable region genes. Immunol Rev 1998;162:247-59. [59] van Dongen JJ, Langerak AW, Bruggemann M, Evans PA, Hummel M, Lavender FL, et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003;17: 2257-317. [60] Goossens T, Klein U, Kuppers R. Frequent occurrence of deletions and duplications during somatic hypermutation: implications for oncogene translocations and heavy chain disease. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:2463-8. [61] Fukuhara S, Rowley JD, Variakojis D, Golomb HM. Chromosome abnormalities in poorly differentiated lymphocytic lymphoma. Cancer Res 1979;39:3119-28. [62] Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, Nowell PC, Croce CM. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Science 1984;226:1097-9. [63] Kuppers R. Mechanisms of B-cell lymphoma pathogenesis. Nat Rev Cancer 2005;5:251-62. [64] Vaandrager JW, Schuuring E, Raap T, Philippo K, Kleiverda K, Kluin P. Interphase FISH detection of BCL2 rearrangement in follicular lymphoma using breakpoint-anking probes. Genes Chromosomes Cancer 2000;27:85-94. [65] Tsujimoto Y, Yunis J, Onorato-Showe L, Erikson J, Nowell PC, Croce CM. Molecular cloning of the chromosomal breakpoint of B-cell lymphomas and leukemias with the t(11;14) chromosome translocation. Science 1984;224:1403-6. [66] Avet-Loiseau H, Garand R, Gaillard F, Daviet A, Mellerin MP, Robillard N, et al. Detection of t(11;14) using interphase molecular cytogenetics in mantle cell lymphoma and atypical chronic lymphocytic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1998;23:175-82. [67] de Boer CJ, van Krieken JH, Kluin-Nelemans HC, Kluin PM, Schuuring E. Cyclin D1 messenger RNA overexpression as a marker for mantle cell lymphoma. Oncogene 1995;10:1833-40. [68] Bodrug SE, Warner BJ, Bath ML, Lindeman GJ, HarrisAW,Adams JM. Cyclin D1 transgene impedes lymphocyte maturation and collaborates in lymphomagenesis with the myc gene. EMBO J 1994;13:2124-30. [69] Lovec H, Grzeschiczek A, Kowalski MB, Moroy T. Cyclin D1/bcl-1 cooperates with myc genes in the generation of B-cell lymphoma in transgenic mice. EMBO J 1994;13:3487-95.
Hmatologie

12

Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes 13-000-K-10

[70] Fu K, Weisenburger DD, Greiner TC, Dave S, Wright G, Rosenwald A, et al. Cyclin D1-negative mantle cell lymphoma: a clinicopathologic study based on gene expression proling. Blood 2005;106:4315-21. [71] Iida S, Rao PH, Nallasivam P, Hibshoosh H, Butler M, Louie DC, et al. The t(9;14)(p13;q32) chromosomal translocation associated with lymphoplasmacytoid lymphoma involves the PAX-5 gene. Blood 1996; 88:4110-7. [72] Bastard C, Deweindt C, Kerckaert JP, Lenormand B, Rossi A, Pezzella F, et al. LAZ3 rearrangements in non-Hodgkins lymphoma: correlation with histology, immunophenotype, karyotype, and clinical outcome in 217 patients. Blood 1994;83:2423-7. [73] Morris SW, Kirstein MN, Valentine MB, Dittmer KG, Shapiro DN, Saltman DL, et al. Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkins lymphoma. Science 1994;263:1281-4. [74] Falini B, Pulford K, Pucciarini A, Carbone A, De Wolf-Peeters C, Cordell J, et al. Lymphomas expressing ALK fusion protein(s) other than NPM-ALK. Blood 1999;94:3509-15. [75] Dierlamm J, Baens M, Wlodarska I, Stefanova-Ouzounova M, Hernandez JM, Hossfeld DK, et al. The apoptosis inhibitor gene API2 and a novel 18q gene, MLT, are recurrently rearranged in the t(11; 18)(q21;q21) associated with mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas. Blood 1999;93:3601-9. [76] Cook JR, Sherer M, Craig FE, Shekhter-Levin S, Swerdlow SHT. (14; 18)(q32;q21) involving MALT1 and IGH genes in an extranodal diffuse large B-cell lymphoma. Hum Pathol 2003;34:1212-5. [77] Dicker F, Schnittger S, Haferlach T, Kern W, Schoch C. Immunostimulatory oligonucleotide-induced metaphase cytogenetics detect chromosomal aberrations in 80% of CLL patients:Astudy of 132 CLL cases with correlation to FISH, IgVH status, and CD38 expression. Blood 2006;108:3152-60. [78] Dohner H, Stilgenbauer S, Dohner K, Bentz M, Lichter P. Chromosome aberrations in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular cytogenetic analysis. J Mol Med 1999;77:266-81. [79] Schaffner C, Stilgenbauer S, Rappold GA, Dohner H, Lichter P. Somatic ATM mutations indicate a pathogenic role of ATM in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999;94:748-53. [80] Garand R, Goasguen J, Brizard A, Buisine J, Charpentier A, Claisse JF, et al. Indolent course as a relatively frequent presentation in T-prolymphocytic leukaemia. Groupe Franais dHmatologie Cellulaire. Br J Haematol 1998;103:488-94. [81] Madani A, Choukroun V, Soulier J, Cacheux V, Claisse JF, Valensi F, et al. Expression of p13MTCP1 is restricted to mature T-cell proliferations with t(X;14) translocations. Blood 1996;87:1923-7.

[82] Avet-Loiseau H, Li JY, Morineau N, Facon T, Brigaudeau C, Harousseau JL, et al. Monosomy 13 is associated with the transition of monoclonal gammopathy of undetermined signicance to multiple myeloma. Intergroupe Francophone du Mylome. Blood 1999;94: 2583-9. [83] Zojer N, Konigsberg R, Ackermann J, Fritz E, Dallinger S, Kromer E, et al. Deletion of 13q14 remains an independent adverse prognostic variable in multiple myeloma despite its frequent detection by interphase uorescence in situ hybridization. Blood 2000;95:1925-30. [84] Avet-Loiseau H, Attal M, Moreau P, Charbonnel C, Garban F, Hulin C, et al. Genetic abnormalities and survival in multiple myeloma: the experience of the Intergroupe Francophone du Mylome. Blood 2007 [Jan5; Epub ahead of print]. [85] Le Gouill S, Talmant P, Milpied N, Daviet A, Ancelot M, Moreau P, et al. Fluorescence in situ hybridization on peripheral-blood specimens is a reliable method to evaluate cytogenetic response in chronic myeloid leukemia. J Clin Oncol 2000;18:1533-8. [86] Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, et al. Standardization and quality control studies of realtime quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003;17:2318-57. [87] Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simonsson B, Appelbaum F, et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 2006;108:1809-20. [88] Alizadeh M, Bernard M, Danic B, Dauriac C, Birebent B, Lapart C, et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002;99:4618-25. [89] Raff T, Gokbuget N, Luschen S, Reutzel R, Ritgen M, Irmer S, et al. Molecular relapse in adult standard risk ALL patients detected by prospective MRD-monitoring during and after maintenance treatment - data from the GMALL 06/99 and 07/03 trials. Blood 2007;109:910-5. [90] Schnittger S, Weisser M, Schoch C, Hiddemann W, Haferlach T, Kern W. New score predicting for prognosis in PML-RARA+, AML1ETO+, or CBFBMYH11+ acute myeloid leukemia based on quantication of fusion transcripts. Blood 2003;102:2746-55. [91] Leroy H, de Botton S, Grardel-Duos N, Darre S, Leleu X, Roumier C, et al. Prognostic value of real-time quantitative PCR (RQ-PCR) inAML with t(8;21). Leukemia 2005;19:367-72.

L. Lod, Praticien hospitalier. H. Avet-Loiseau, Professeur, Chef de service (herve.avetloiseau@chu-nantes.fr). Laboratoire dhmatologie, Centre hospitalier universitaire, 9, quai Moncousu, 44093 Nantes cedex 1, France. Toute rfrence cet article doit porter la mention : Lod L., Avet-Loiseau H. Anomalies chromosomiques et gniques dans les hmopathies malignes. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Hmatologie, 13-000-K-10, 2007.

Disponibles sur www.emc-consulte.com


Arbres dcisionnels Iconographies supplmentaires Vidos / Animations Documents lgaux Information au patient Informations supplmentaires Autovaluations

Hmatologie

13

Encyclopdie Mdico-Chirurgicale 13-000-K-30

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire


E Delabesse V Asna E Macintyre

Rsum. Les hmopathies malignes constituent un groupe htrogne dans leur pronostic et leur oncogense, mais reprsentent un modle privilgi des mcanismes de cancrogense chez lhomme, par la prsence rcurrente danomalies gntiques impliques dans leur processus oncognique, et la disponibilit de matriel tumoral. Le diagnostic et la prise en charge thrapeutique de ces maladies font aujourdhui une large place aux techniques de biologie molculaire. Ces techniques ont transform notre capacit caractriser les hmopathies malignes et comprendre les processus qui les induisent. Grce aux dveloppements technologiques, la biologie molculaire, dabord cantonne la recherche, sapplique de plus en plus lvaluation biologique de malades atteints dhmopathie maligne. Ces techniques aident au diagnostic, lvaluation du pronostic et au suivi du malade aprs traitement. Sur un plan plus fondamental, lanalyse structurale et fonctionnelle des gnes drguls dans les leucmies et les lymphomes a beaucoup amlior notre comprhension des mcanismes, la fois oncogniques et physiologiques.
2003 Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Mots-cls : hmopathie maligne, biologie molculaire, clonalit lymphode, translocation chromosomique, maladie rsiduelle.

Introduction
Depuis la dcouverte de la structure en double hlice de lacide dsoxyribonuclique (ADN), il y a 40 ans, la biologie molculaire a transform notre capacit caractriser les hmopathies malignes et comprendre les processus qui les induisent. Grce aux dveloppements technologiques, la biologie molculaire, dabord cantonne la recherche, sapplique de plus en plus lvaluation biologique de malades atteints dhmopathie maligne. Ces techniques aident au diagnostic, lvaluation du pronostic et au suivi du malade aprs traitement. Sur un plan plus fondamental, lanalyse structurale et fonctionnelle des gnes drguls dans les leucmies et les lymphomes a beaucoup amlior notre comprhension des mcanismes, la fois oncognique et physiologique.

lacide ribonuclique (ARN), lien entre le gnotype (lADN) et le phnotype (la protine). Ces deux acides, mme sils ne diffrent que par labsence dun oxygne au niveau dun sucre de lADN par rapport lARN, nont pas les mmes caractristiques physicochimiques et ne donneront pas les mmes informations en biologie molculaire. LADN et lARN sont extraits des cellules nucles : un millilitre de sang contient en moyenne 30 50 g dADN. LADN est relativement rsistant, la diffrence de lARN. La qualit de lextraction est importante pour la mthode de Southern (analyse de lADN gnomique) et pour lanalyse de lARN.
ANALYSE DE LACIDE DSOXYRIBONUCLIQUE

Lanalyse de lADN en hmatologie sert principalement caractriser : soit des mutations ponctuelles ; soit des anomalies de structure : remaniements (translocations, rarrangements des gnes dimmunoglobulines ou du rcepteur des cellules T) ou dltion ; soit des polymorphismes permettant lanalyse de la clonalit soit mylode, soit lymphode.

Techniques de base de la biologie molculaire


PRLVEMENTS

Les acides nucliques dans la cellule sont de deux types : lacide dsoxyribonuclique (ADN), enchanement de 3 milliards de nuclotides chez lhomme rpartis sur 46 chromosomes, appel ADN gnomique ;

Mthode de Southern
Quand une solution dADN est expose un pH ou une temprature leve (90 C), les deux brins complmentaires qui constituent lADN se sparent. Ce phnomne, appel dnaturation, est rversible, et la rassociation peut avoir lieu entre nimporte quel acide nuclique (ARN ou ADN) tant que les squences sont complmentaires. Ceci est la base de la mthode dcrite initialement par Edwin Southern en 1975 (g 1) [91]. LADN chromosomique est dabord digr par des enzymes de restriction qui coupent des sites prcis (comme EcoRI qui coupe entre le G et le A aprs avoir

Eric Delabesse : Pharmacien, matre de confrences des Universits, praticien hospitalier, EMI 02-10. Elizabeth Macintyre : Professeur des universits, praticien hospitalier. Vahid Asna : Assistant hospitalo-universitaire, EMI 02-10. Laboratoire dhmatologie, hpital Necker-Enfants Malades, 149, rue de Svres, 75743 Paris cedex 15, France.

Toute rfrence cet article doit porter la mention : Delabesse E, Asna V et Macintyre E. Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire. Encycl Md Chir (Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS, Paris, tous droits rservs), Hmatologie, 13-000-K-30, 2003, 14 p.

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

Hmatologie

* B

* A
1
Mthode de Southern. A. Thorie. Voir texte pour dtails (pour simplier la comprhension, nous navons dessin quun allle, mais les cellules eucaryotes tant diplodes, il faut tenir compte de ltat des deux allles). Le rarrangement dun segment V (V1) un segment J (J1) dun gne hypothtique dIg ou du rcepteurs des cellules T est illustr titre dexemple. B. Exemple de Southern o G correspond une bande germinale, R correspond une bande rarrange et D correspond une bande dlte.

reconnu la squence GAATTC) an de diminuer la taille des fragments analyser. Ces fragments sont ensuite spars selon leur taille par lectrophorse en gel dagarose. Les fragments dADN ainsi spars sont transfrs sur un support solide (nylon ou nitrocellulose) aprs une tape de dnaturation. Une fois transfres, les squences tudies sont mises en vidence par hybridation dune sonde pralablement marque, radioactivement (phosphore 32) ou non (avec une perte de sensibilit dans ce dernier cas). Aprs lavage, la membrane est mise au contact dun lm radiographique pour faire apparatre le signal de radioactivit. Le fragment dtect est : soit de mme taille et de mme intensit que le tmoin (par exemple ADN de placenta) : on parle de bande germinale (bande 1 de la gure 1), et comme lADN est diplode (2n chromosomes), les deux allles du mme gne sont tous les deux sous forme germinale ; soit de mme taille mais dintensit rduite de moiti par rapport au tmoin : dans ce cas, un des deux allles est dlt tandis que lautre est toujours sous forme germinale ; soit de taille diffrente : on parle alors de bande rarrange (bande 2 de la gure 1) ; soit absence de bande en autoradiographie : les deux allles du gne tudi sont dlts (bande 3 de la gure 1). Cette mthode permet de connatre la structure des gnes. Sa sensibilit est de lordre de 5 %, cest--dire quelle peut dtecter parmi la population cellulaire analyse des cellules ayant une modication gnotypique prsente dans au moins une cellule sur 20. Cependant, elle ne permet pas de reconnatre les mutations ponctuelles, lexception des mutations affectant le site reconnu par lenzyme de restriction ncessaire la digestion de lADN.

1993 [64]. Elle est base sur lamplication de fragments dADN dlimits par deux courtes squences reconnues par deux oligonuclotides, dites amorces, grce une ADN polymrase rsistante haute temprature (95 C). Il existe trois phases distinctes lors de lamplication en chane par la polymrase (le sigle amricain de cette mthode, PCR pour polymerase chain reaction, universellement connu, est utilis dans le texte) (g 2) : dnaturation : lADN est dnatur par chauffage haute temprature (95 C), temprature laquelle lADN polymrase rsiste la dgradation : les deux brins se sparent ; hybridation : la temprature de la solution est ramene une temprature de lordre de 50 60 C, pour permettre deux petits fragments dADN simple brin dune vingtaine de bases (amorces), complmentaires de la rgion amplier et lencadrant, de sapparier lADN gnomique dnatur (la distance entre les deux amorces peut varier entre une centaine de paires de bases et environ 2 kb en routine). Ces amorces se xent prfrentiellement la rgion amplier. Elles sont ncessaires au fonctionnement du systme car la polymrase ne peut initier delle-mme la rplication, et apportent aussi la spcicit de la raction ; longation : la temprature est remonte 72 C, temprature optimale dactivit de lADN polymrase, enzyme extraite dune bactrie thermophile isole au niveau de geysers, Thermus aquaticus, laquelle elle doit son nom : Taq polymrase. Cette enzyme nest pas dgrade par ltape de dnaturation de 95 C, la diffrence des ADN polymrases qui avaient t pralablement utiliss. La Taq polymrase copie lADN simple brin partir des deux amorces. Le fragment dADN compris entre les deux amorces sest alors dupliqu. Puis ces trois tapes (un cycle) sont rptes. Aprs n cycles, le nombre de copies de la rgion amplie est thoriquement de 2n. Ces cycles tant rpts habituellement 30 fois, on obtient en thorie 230 copies du gne initial, soit une amplication de lordre du milliard ! Le produit de lamplication est ensuite

Amplication en chane par une ADN polymrase thermostable (PCR)


Cette mthode a rvolutionn la biologie molculaire des annes 1990 et a t couronne par lattribution du prix Nobel de chimie en
2

Hmatologie

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire


2

13-000-K-30

Amplication gnomique par polymrisation en chane (PCR). A. Thorie. Voir texte pour description dtaille. B. Exemple de PCR. 1. Marqueur de poids molculaire ; 2. contrle damplication sans acide dsoxyribonuclique (ADN) ; 3. produit damplication.

* A
visualis sur un gel soit dagarose, soit dacrylamide (selon la taille du fragment ampli), qui permet la rsolution des fragments en fonction de la taille. Plus rcemment, lutilisation damorces uorescentes a permis damliorer la rsolution de lanalyse du produit de PCR [38, 58]. Lune des amorces (gnralement lantisens) est rendue uorescente par la xation, son extrmit 5, dune molcule capable dmettre une uorescence de longueur donde dtermine aprs une excitation laser. Par cette approche, le produit de PCR obtenu aprs amplication est dtectable par la uorescence mise lors du passage devant la fentre de lecture au cours dune migration capillaire lectrophortique sur un analyseur de fragments. Ceci permet de lui attribuer une taille prcise, et amliore la sensibilit de dtection du signal. Plus gnralement, la PCR apporte un norme gain de sensibilit : le minimum ncessaire pour la mthode de Southern est de 5 g, soit environ 750 000 cellules, tandis quavec la PCR on peut aller jusqu lanalyse dune seule cellule. Elle est donc particulirement indique pour la dtection de squences trs peu reprsentes, ou quand on dispose de peu de matriel pathologique. Cette mthode possde de nombreux avantages par rapport la mthode de Southern, do son utilisation plus frquente en routine : rapidit (1 jour contre 1 semaine), sensibilit, possibilit danalyser du matriel partiellement dgrad (ADN x) et absence de produits radioactifs. Mais la sensibilit trs leve de cette mthode reprsente cependant un inconvnient majeur, le risque de faux positifs par amplication dADN prsent comme arosol dans le laboratoire, ou contaminant les chantillons analyser, do la ncessit de travailler dans des conditions trs rigoureuses permettant de rendre des rsultats ables.

* B

suivante lors de llongation car le radical hydroxyl ncessaire a t remplac par un simple atome dhydrogne. En modiant le ddNTP incorpor (par exemple ddATP au lieu de dATP) et en faisant migrer les quatre ractions dlongation sur un gel de polyacrylamide permettant la rsolution une base prs, on peut dnir prcisment lenchanement des nuclotides dans le gne tudi. Polymorphisme conformationnel des structures simple brin Cette mthode met prot les diffrences de rappariement des molcules dADN simple brin sur elles-mmes, aboutissant une structure en pingle cheveu [76], cette structure variant en fonction de la composition en nuclotides de lADN. Ainsi, lors dune lectrophorse sur un gel de polyacrylamide non dnaturant, aprs dnaturation des deux brins de lADN tudier, on observe une diffrence de migration non seulement selon leur taille mais aussi selon leur squence, ce qui permet de distinguer un fragment dADN simple brin mut dun fragment tmoin, non mut. lectrophorse en gel de gradient dnaturant Une des premires mthodes dveloppes pour rechercher des mutations dans des rgions tendues de lADN fut llectrophorse en gel de gradient dnaturant [28]. Cette technique est base sur le fait que lADN simple brin migre beaucoup moins vite que lADN double brin. Un ADN double brin contenant un dfaut dappariement (htroduplex ralis in vitro entre un ADN simple brin mut et un ADN simple brin tmoin) sera dnatur plus rapidement quun ADN double brin parfaitement appari. En prsence dun gradient dagent dnaturant (ure), lADN mal appari se dissocie plus rapidement, do un arrt de sa migration plus prcoce par rapport lADN double brin tmoin. Une diffrence dune seule base entre lADN mut et lADN tmoin est suffisante pour provoquer des prols de migration diffrents.

Analyse des mutations


Pour tudier les mutations ponctuelles pouvant affecter le fonctionnement des gnes, plusieurs mthodes peuvent tre utilises : ltablissement de la squence des nuclotides constituant ce gne, mthode relativement lourde mais able ; deux autres mthodes indirectes de recherche de mutations ponctuelles, llectrophorse en gel de gradient dnaturant, et le polymorphisme conformationnel des structures simple brin. Squenage La mthode dcrite par Sanger [87] est base sur larrt de llongation lors de la rplication par une ADN polymrase. Cet arrt est ralis par la prsence de didsoxynuclotides (ddNTP) qui, la diffrence des dsoxynuclotides (dNTP ou N signie une des quatres bases ; cf gure 1) constituant lADN, ne permettent pas lajout de la base

tude du polymorphisme
Dans un certain nombre de cas, il est utile de distinguer les deux allles dun mme chromosome, par exemple pour analyser la clonalit mylode, ou pour effectuer une tude de chimrisme postallogreffe. Le polymorphisme tudi peut tre de diffrents types : prsence sur un allle et absence sur lautre dun site de restriction. En utilisant dune part cette enzyme de restriction lors de lanalyse par la mthode de Southern, et dautre part une sonde spcique de cette rgion, il est possible de distinguer les deux allles. Cest le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP en anglais pour restriction fragment length polymorphism) ; le polymorphisme tudi peut provenir galement dune squence rpte dune manire diffrente sur chaque allle (par exemple,
3

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

Hmatologie

lARN et non lADN, prsentes de manire ubiquitaire (mains) et elles-mmes rsistantes la dgradation, implique un soin particulier lors de sa manipulation.

Northern-blot
Cette mthode permet dtudier les produits de transcription, mais ncessite une trop grande quantit dARN pour tre utilise en routine. Elle est fonde sur le mme principe que celle dveloppe par Edwin Southern, et elle fut dnomme par jeu de mots la mthode du Northern [3]. LARN est migr dans un gel dagarose dnaturant (pour maintenir sa forme simple brin linaire), puis il est transfr sur une membrane de nylon et hybrid avec une sonde radioactive, comme pour le Southern. Un ARN de fusion naura pas la mme taille que lARN messager sauvage. Cette mthode permet une quantication de lARN messager dune manire plus able que la RT-PCR (PCR aprs transcription inverse), mais avec une sensibilit moindre.

* A

Dot-blot
Cette mthode est une simplication de la mthode du Northern, qui permet la quantication des ARN messagers sans valuer leur taille. Elle ne distingue pas un ARN de fusion dun ARN normal. Une goutte dARN est directement dpose sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose (formant un petit disque sur cette membrane, do le nom anglais : dot = point). La membrane est ensuite mise au contact de la sonde marque, puis lhybridation spcique est rvle par autoradiographie.

* B
3
A. Synthse de lacide ribonuclique (ARN) messager. LARN pr-messager est synthtis partir du promoteur par lARN polymrase. Il est ensuite polyadnyl et les introns sont pisss, produisant ainsi lARN messager mature. B. Synthse de lacide dsoxyribonuclique (ADN) complmentaire. En prsence dune amorce (soit oligo-d(T) qui se xe sur la rgion polyadnyle [illustr ici], soit hexamres de squence alatoire qui se xent partout sur lARN, soit amorce spcique), la transcriptase inverse (ADN-polymrase ARN-dpendante) copie le brin dARN messager en brin dADN complmentaire. Lors du premier cycle de PCR, le brin dARN messager est limin, et les amorces de PCR se xent sur le brin dADN complmentaire.

RT-PCR
Ltude des ARN de fusion est devenue trs aise avec lapport de la PCR. Cette mthode avait t initialement dcrite pour lADN, mais une simple modication permet de lutiliser aussi pour lARN [29]. Elle utilise une enzyme caractristique des rtrovirus, la transcriptase inverse, une ADN polymrase ARN-dpendante, qui permet de copier, en prsence dune amorce, une molcule dARN simple brin en une molcule dADN simple brin complmentaire de la squence de lARN messager (g 3B). Une fois cette molcule dADN complmentaire (ADNc ou cDNA) obtenue, la raction classique de PCR peut tre effectue avec deux amorces spciques du gne tudier.
MTHODES QUANTITATIVES : PCR EN TEMPS REL

10 rptitions sur un allle et 15 sur lautre) analys soit par la mthode de Southern, soit par PCR. Ces squences sont plus ou moins longues : de 11 60 nuclotides pour les minisatellites ou VNTR (variable number of tandem repeats), utilises pour lanalyse du chimrisme postallogreffe ; de une quatre bases pour les microsatellites ou STR (short tandem repeats), rptitions de 12 40 copies (application la clonalit associe linactivation alatoire du chromosome, par exemple avec le gne du rcepteur aux andrognes dont le microsatellite est reprsent par la squence CAG rpte de 12 26 fois). Linformativit relative de ces polymorphismes est nettement plus importante pour les microsatellites et les minisatellites que pour les RFLP.
ANALYSE DE LACIDE RIBONUCLIQUE

Cette technique rcente mesure la cintique de formation du produit damplication au cours de la raction de PCR, sans linterrompre, et en dduit une quantication de la cible dans lchantillon analys. Elle peut sappliquer aussi bien lanalyse en RT-PCR qu lanalyse gnomique sur matrice dADN [31, 34, 38]. Cette approche ncessite un marqueur uorescent, dont le signal augmente de manire spcique avec lamplication au cours de la raction de PCR, et un systme de mesure externe de la uorescence en temps rel. Le module de dtection fait appel une excitation par laser ou diode de tungstne par des bres optiques et la mesure de la uorescence rmise par une camra CDD des intervalles trs rapprochs au cours de la raction de PCR. Deux systmes uorescents sont disponibles : Sybr Green : agent intercalant qui met une uorescence lorsquil se xe lADN double brin. Il prsente lavantage dtre utilisable sans restriction avec tous les systmes de dtection, mais nassure quune spcicit relative qui peut ncessiter une vrication ; Sonde spcique : ce systme utilise soit une sonde doublement marque ses deux extrmits, soit deux sondes se xant en tandem sur la squence cible. La particularit de cette dernire technologie (systme Taqman) est dajouter aux deux amorces une sonde uorescente qui possde deux uorophores diffrents : un Reporter (FAM) en 5 et un Quencher (TAMRA) en 3. Lorsque la sonde est intacte, la proximit

Ltude des produits de transcription permet la dtection des ARN messagers normaux, ainsi que des ARN messagers de fusion rsultant de translocations chromosomiques telle que bcr-abl, caractristique de la leucmie mylode chronique. Ltude de ces translocations est pratiquement impossible au niveau de lADN, car leurs points de cassure sont parpills sur les introns. Lors de lpissage des ARN messagers aprs transcription de lADN, les exons sont rabouts les uns aux autres (g 3A), gnrant ainsi des ARN et des protines de fusion uniformes (cf g 7). La grande sensibilit de lARN vis--vis des ribonuclases, enzymes dgradant
4

Hmatologie

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

13-000-K-30

4 Principe de la polymrisation en chane (PCR) en temps rel (systme avec sonde spcique). La sonde est dgrade au cours de llongation par lactivit exonuclasique de la polymrase, entranant une libration de lmission de uorescence par le reporter (R). Laccumulation de cette uorescence est dtecte par lappareil sans interruption de la raction de PCR. La cintique de laccumulation de la uorescence mise est proportionnelle la quantit de cible prsente dans lchantillon. Lutilisation dune gamme de calibration permet de quantier le prlvement.
du Reporter et du Quencher induit la suppression de la uorescence du Reporter par le phnomne de tranfert dnergie appel FRET (uorescent resonance energy transfert). Lors de la PCR, la Taq polymrase commence llongation et dgrade la sonde par son activit 5exonuclasique, et donc spare le Reporter du Quencher qui ne pourra alors plus empcher lmission uorescente du Reporter. La uorescence mise par le Reporter est ainsi proportionnelle la quantit de sonde dgrade et donc de produit de PCR accumul (g 4). Les avantages de lapproche sonde spcique sont, dune part la grande spcicit apporte par la sonde, et dautre part, pour certaines applications, la possibilit de coamplier plusieurs squences cibles dans la mme raction en utilisant des sondes marques par des uochromes diffrents. Son cot est cependant nettement plus lev. La quantication de la squence cible se fait grce ltablissement dune courbe de calibration avec des dilutions dune ligne positive ou des plasmides. Pour chaque point de la gamme, on dnit le seuil de dtection galement appel cycle threshold (Ct) partir duquel la uorescence dtecte dpasse le seuil de positivit (threshold), ce qui permet dtablir une courbe dtalonnage. Il suffit alors de reporter le Ct obtenu pour lchantillon analyser dans cette courbe et den dduire une quantication de la cible. Lefficacit et la spcicit de la PCR sont valuables par la pente de cette courbe (slope) qui doit tre proche de 3,3, ce qui correspond une efficacit de 100 % (g 4). Le rsultat est corrig grce lamplication sur le mme chantillon dun gne domestique dexpression ubiquitaire qui permet la normalisation quantitative et qualitative de lchantillon analys. Le choix de ce gne est crucial, en effet il doit tre dexpression constante quels que soient les tissus ou les pathologies en cause. De plus, son niveau dexpression et sa cintique de dgradation doivent tre proches de ceux du gne cible analys. Diffrents modes de calcul sont proposs. Leur description dpasse le cadre de cet article. Il faut enn signaler que cette technologie permet galement la mise en vidence de mutations ponctuelles grce des courbes de fusion , dont les applications, trs larges en gntique, nont pas t encore dnies en hmatologie. En conclusion, cette technologie apporte, au-del de son aspect quantitatif, une dnition de la qualit du matriel tudi, grce lutilisation dun gne domestique, trs nettement suprieure aux approches qualitatives. Sa facilit dutilisation et les avantages quelle apporte en font certainement une approche dont les applications seront de plus en plus larges.

Applications lhmatologie maligne


VALUATION INITIALE

Dtection dune population clonale


La mise en vidence dune population clonale est un argument important de la nature maligne dune prolifration hmatopotique, bien que la corrlation ne soit pas parfaite (cf infra). Les techniques les plus rpandues permettant de dtecter une population cellulaire
5

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire


5

Hmatologie

Structure des gnes codant les rcepteurs lantigne (immunoglobuline [Ig] ou T cell receptor [TCR]). Le locus IgH est illustr titre dexemple. Voir texte pour dtails. E = enhancer (lment rgulateur induisant la transcription des IgH) ; S = squence de switch important pour la commutation de classe des Ig.

clonale sont soit lexamen cytogntique montrant une anomalie caryotypique, soit ltude du rarrangement des gnes dimmunoglobulines (Ig) ou du rcepteur des cellules T (TCR pour T cell receptor) dans une prolifration lymphode, soit ltude de linactivation dun seul chromosome X chez une femme pour ltude dune prolifration mylode. Clonalit lymphode Bien que la dtection dune population lymphode B mature clonale soit possible depuis longtemps par une analyse de lexpression des chanes lgres dIg (j ou k) par immunophnotypage ou par dtection dune paraprotine monoclonale, une analyse quivalente des populations lymphodes pr-B ou T ntait pas possible. Lidentication et la caractrisation des gnes codant des molcules de surface (Ig pour les lymphocytes B, TCR pour les lymphocytes T) ont permis la mise en vidence de clones lymphodes par dtection des rarrangements soit des gnes dIg, soit ceux du TCR, initialement par hybridation par la mthode de Southern puis par PCR.

locus TCR a, entre les segments Va et Ja. La production dune Ig ou dun TCR fonctionnel ncessite la juxtaposition, dans une mme unit de transcription et dans le mme cadre de lecture, des segments V, D et J. Si le rarrangement V-(D)-J du premier allle savre fonctionnel, le processus dit dexclusion alllique empche le rarrangement du deuxime allle. Sinon un deuxime rarrangement a lieu sur lautre allle, augmentant ainsi la possibilit de produire un rcepteur fonctionnel. Le rarrangement de segments V, D et J est ralis par lintermdiaire de signaux de recombinaison (RSS pour recognition signal sequences) situs en aval des segments V, en amont des segments J et de part et dautre des segments D. Ces RSS, qui sont similaires dans tous les gnes dIg et du TCR, comportent un heptamre (cest--dire une squence de sept nuclotides) hautement conserv et un nonamre (une squence de neuf nuclotides) riche en bases A et T, spars par une squence non conserve soit de 12, soit de 23 paires de bases. Ces RSS servent diriger le systme de recombinaison, encore mal compris mais partiellement mdi par deux gnes, RAG-1 et 2 (recombinase activating gene) [30, 75], vers les segments V, D et J. Trois mcanismes concourent la gnration de la diversit des gnes des Ig et du TCR : rarrangement combinatoire. La diversit des gnes des Ig et du TCR, qui peut tre gnre par la recombinaison V(D)J, est dtermine par le nombre de segments V, D et J de chaque locus. Comme le montre le tableau I, cette diversit combinatoire varie beaucoup selon les gnes ; diversit jonctionnelle. Lors du rarrangement, les squences situes la jonction des segments V, D ou J, peuvent tre modies soit par la dltion des nuclotides situs en aval des segments V, en amont des segments J, et de part et dautre des segments D, soit par laddition de courtes squences non codes ltat germinal, et ajoutes grce lactivit de la terminal-dsoxynuclotidyltransfrase (TdT), crant ainsi les rgions N ou CDR3 (complementarity determining region) de squences et de longueurs hautement variables (g 6). Dans la majorit des cas (deux tiers en thorie), ces processus de recombinaison crent une squence dont le cadre de lecture nest pas conserv : elle peut tre transcrite en ARN mais ne peut tre traduite en protine (rarrangement non fonctionnel). Lors de la diffrenciation lymphode, seuls les lymphocytes capables dexprimer un rcepteur lantigne fonctionnel sont slectionns. Il en dcoule que les rarrangements retrouvs dans une cellule ou dans un clone lymphode immature peuvent tre non fonctionnels, mais quau moins un des deux rarrangements des populations lymphodes matures est fonctionnel ;

Rarrangements des gnes dIg et du TCR


Les Ig sont composes de deux chanes lourdes et de deux chanes lgres, tandis que le complexe du TCR comporte soit une chane a et une chane b, soit une chane c et une chane d (pour revues : [47, 56] ). La structure et les mcanismes de rarrangement des gnes codant les chanes lourdes (IgH, chromosome 14q32), les chanes lgres (Ig j, chromosome 2p12 et Ig k, chromosome 22q11), le locus des TCR a/d (chromosome 14q11), le TCR b (chromosome 7q35) et le TCR c (chromosome 7p15) sont similaires. Dans leur conguration non rarrange (appele germinale), elles consistent en de nombreux segments discontinus dnomms : variable (V), de jonction (J) et, pour les gnes des IgH, du TCR b et du TCR d uniquement, de diversit (D). Il existe aussi en aval de ces segments, un ou deux segments constants (C). Au cours de la diffrenciation lymphode, la diversit des gnes dIg et du TCR est gnre par un processus de recombinaison entre ces segments V, (D) et J (g 5). Dans le systme IgH, par exemple, un des deux allles IgH subit dabord une recombinaison gnique entre un des segments DH et un des segments JH, entranant lexcision de lADN les sparant. Dans un deuxime temps, un des segments V H se recombine au rarrangement D HJH, crant ainsi une unit de transcription VHDHJH. Ce gne rarrang est dabord transcrit en pr-messager puis, aprs pissage des introns sparant le segment JH du segment CH, lARN messager (ARNm) VHDHJHCH est traduit en protine IgH mature (g 5). Lordre de rarrangement des gnes dIg est IgH puis Ig j et enn Ig k tandis que celui des gnes des TCR est : TCR d puis TCR c et TCR b et nalement TCR a avec dltion du TCR d sur le mme allle puique le locus du TCR d est lintrieur du
6

Hmatologie

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

13-000-K-30

Tableau I. Rpertoire des gnes rarrangeants.


Immunoglobulines (Ig)
IgH Igj Igk TCR a Diversit germinale Segments V Familles de segments V Segments D Segments J 100-200 (7) > 20 6 40-80 (4) 5 > 40 (7) >4 60 (29) 75 Diversit jonctionnelle Additions N
TCR : T cell receptor.

TCR ab
TCR b TCR c

TCR cd
TCR d

70 (24) 2 13

8 (4) 5

8 (?) 3 3

+++

++

++

+++

* A

* B
6 Dtection dune population lymphode clonale par amplication de la rgion N des V-(D)-J des IgH ou TCR (T cell receptor) partir de lacide dsoxyribonuclique (ADN) par polymrisation en chane (PCR) classique et dpt sur gel (A) et par PCR uorescente et analyse de fragment (B). A. 1. Population clonale : rarrangement monoalllique ; 2. population clonale : rarrangement bialllique ; 3. population lymphode polyclonale ; 4. population non lymphode. B. Analyse des fragments : haut : taille des fragments en paires de bases. Courbes verte, noire et bleue : PCR spcique du TCR ou des IgH. Courbe rouge : marqueur de poids molculaire (voir le texte pour les dtails).
mutation somatique. La squence des gnes dIg rarrangs (mais pas celle des gnes du TCR) peut tre modie par mutation ponctuelle des nuclotides avoisinant les rgions codant les squences protiques qui reconnaissent lantigne. Ce mcanisme sert augmenter laffinit de la molcule dIg vis--vis de son antigne (maturation daffinit). rarrangement produit un fragment dADN de taille diffrente selon les segments V et D utiliss ; en raison de cette htrognit, chaque rarrangement reste en dessous du seuil de dtection par la mthode de Southern (sensibilit denviron 5 10 %). Dans une population clonale, en revanche, tous les rarrangements sur un allle sont de taille identique et produisent une bande rarrange (g 2). Comme le locus IgH se rarrange en premier, la dtection dune population lymphode B clonale se fait surtout par analyse de ce locus [59, 90]. Dans les prolifrations plus matures, le rarrangement des chanes lgres peut tre utile pour conrmer leur caractre clonal. Cependant, le locus Ig j est parfois dlt, et lanalyse du locus Ig k par Southern est rendue plus complexe par la prsence de plusieurs gnes Ck. Les rarrangements des TCR b, c et d ont lieu la fois
7

Dtection dun rarrangement dIg ou du TCR


Hybridation par la mthode de Southern. Le processus de rarrangement des gnes dIg ou du TCR entrane une modication des positions relatives des sites de restriction, et donc de la taille des fragments dADN reconnus par une sonde IgH, par exemple. Dans une prolifration lymphode polyclonale, chaque

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

Hmatologie

dans les prcurseurs T ab et cd, et leur mise en vidence ne permet donc pas de distinguer entre les prolifrations des deux lignes. Un rarrangement du TCR a indique une diffrenciation vers la ligne TCR ab mais comme le nombre important de segments Ja rend difficile lanalyse directe de ce locus par la technique de Southern, cest souvent la prsence dune dltion bialllique du TCR d qui fournit une vidence indirecte du rarrangement du TCR a. La dtection dune population T clonale par la mthode de Southern se fait le plus souvent avec une sonde du TCR b, ce locus tant rarrang un stade relativement prcoce de la diffrenciation T [15, 81, 93] . Un rarrangement majoritaire des TCR c ou d indique la prsence dune population clonale, et peut tre utile dans les prolifrations trs prcoces. En revanche, le nombre limit de combinaisons de segments V, D et J des TCR c et d, et lutilisation prfrentielle de certains segments dans certains tissus [77, 92] signient que la prsence dune bande minoritaire rarrange peut reprsenter soit une sous-population clonale, soit des lymphocytes T ractionnels qui utilisent tous les mmes segments V et J, limitant ainsi lintrt de ces loci pour la dtection des clones minoritaires [59]. PCR. La technique de Southern, malgr lamlioration quelle a apporte dans notre comprhension des prolifrations lymphodes, prsente certains dsavantages (cf supra). La dtection des rarrangements clonaux des Ig ou du TCR par PCR reprsente une stratgie alternative plus rapide, non radioactive et au moins aussi sensible, qui en outre peut tre effectue avec beaucoup moins dADN (g 6). Lamplication partir de lADN avec des amorces spciques des segments V et J, permet lamplication de la rgion hypervariable V(D)J, dite rgion N ou CDR3. Dans une population lymphode clonale, la jonction V-(D)-J est identique dans toutes les cellules, tandis que dans une prolifration polyclonale, la taille des jonctions est variable. Lanalyse des produits damplication aprs lectrophorse sur gel dacrylamide, de meilleur rsolution que celle sur gel dagarose, permet la distinction entre population clonale (bande discrte) et polyclonale (trane dADN) (g 6A). Lutilisation de ces techniques pour la dtection de la clonalit a t applique lanalyse des rarrangements des gnes du TCR c et des IgH [95]. Le rpertoire restreint (tableau I) du locus du TCR c permet lutilisation dun mlange doligonuclotides spciques de chaque segment V et J, tandis que la complexit du locus des IgH ncessite lutilisation doligonuclotides consensus qui reconnaissent des squences conserves entre les diffrents segments V et J, soit de toutes les familles V H [ 2 5 , 1 0 2 ] , soit spciques de chaque famille [ 1 9 ] . Linconvnient majeur de lutilisation du TCR c pour lanalyse par PCR est la prsence dans le sang de jonctions V-J canoniques ayant peu de diversit jonctionnelle pouvant donner des rsultats faussement positifs par PCR avec certains segments (Vc9 et JP par exemple) si leur prsence nest pas suspecte [23]. La qualit de lanalyse du produit de PCR peut tre amliore grce lutilisation damorces uorescentes. Par cette approche, on peut dnir de manire prcise la taille du rarrangement ampli, ce qui peut tre dune aide prcieuse lors de lanalyse de prlvements de suivi, ou pour dnir un envahissement a minima (bilan dextension) de prlvements priphriques. Par ailleurs, lutilisation damorces marques par des uochromes diffrents, permet dans une PCR multiplex, didentier les diffrents segments V ou J impliqus dans le rarrangement. Ceci apporte une meilleure comprhension des rpertoires utiliss dans diffrentes pathologies, et peut galement savrer utile pour lanalyse de prlvements de suivi (g 6B). On peut par ailleurs identier les rarrangements dits canoniques (cf supra), et liminer ainsi le risque de faux positifs li leur prsence au sein dun rpertoire trs restreint. Cette approche prsente par ailleurs lavantage dtre trs reproductible et facile mettre en uvre [22]. Il faut cependant signaler le risque de dtection de faux positifs par la PCR uorescente, notamment lorsque le rpertoire tudi est restreint ou peu utilis, comme par exemple dans lanalyse des rarrangements du TCR gamma ou delta. En conclusion, si cette mthologie prsente dindiscutables avantages, son utilisation
8

suppose une bonne exprience et une interprtation ici plus quailleurs, en fonction de la pathologie sous-jacente.

Apport de lanalyse des rarrangements des gnes des Ig et du TCR


La mise en vidence dun rarrangement clonal des gnes des Ig et du TCR reprsente un argument dcisif de la nature clonale dune prolifration lymphode [54]. Ceci est particulirement important lorsque laspect morphologique ou histologique est polymorphe, ce qui est parfois le cas dans certains lymphomes. Il faut cependant signaler que, bien que dans la plupart des cas la prsence dune population clonale signie une population maligne, ceci nest pas toujours vrai [59, 90]. Dune part, il existe certaines prolifrations lymphodes clonales dont lvolution clinique ne correspond pas celle dun processus malin, telles les populations lymphodes B associes une gammapathie monoclonale bnigne, la papulose lymphomatode et certaines prolifrations grands lymphocytes grains (LGL pour large granular lymphocytes). Dautre part, le dveloppement de techniques de plus en plus sensibles permet de mettre en vidence la prsence de populations ractionnelles, qui reprsentent en fait lexpansion dune population clonale lymphode stimule par lantigne [8, 101]. Ces populations ractionnelles clonales sont dtectes surtout si le rpertoire de rarrangements des TCR est restreint, comme dans les lymphocytes T cd du sang et les lymphocytes T ab de lintestin [77, 85]. Malgr ces limitations, la mise en vidence dune population lymphode clonale a beaucoup aid notre capacit distinguer les prolifrations bnignes des prolifrations malignes. Lanalyse des rarrangements des Ig et du TCR permet aussi de dterminer la nature lymphode de certaines prolifrations. Historiquement, avant le dveloppement des anticorps monoclonaux spciques des sous-populations lymphodes, cest la mise en vidence des rarrangements des gnes dIgH qui a permis la dmonstration de lappartenance la ligne B de la plupart des LAL de lenfant. De la mme manire, la dtection des rarrangements des gnes des Ig a fourni la preuve que les leucmies tricholeucocytes taient des tumeurs lymphodes B. La dmonstration dune population T clonale, mme minoritaire, dans certaines prolifrations polymorphes, telles que la lymphadnopathie angio-immunoblastique, a permis de les classer dans le cadre des lymphomes T priphriques. Lanalyse des rarrangements des gnes dIg et du TCR dans une population lymphode, dont la nature T ou B nest pas clairement tablie par limmunophnotypage, permet parfois de dterminer la ligne lymphode implique (T ou B), surtout dans les prolifrations matures. Il existe cependant une incidence non ngligeable de rarrangements dits illgitimes dans les prolifrations lymphodes immatures, surtout dans les LAL. Le TCR c, par exemple, est rarrang dans 40 70 % des LAL de la ligne B [12]. Lexplication de ces rarrangements illgitimes dans les LAL est probablement lie au fait que les lymphocytes T et B utilisent le mme systme de recombinaison des gnes des Ig ou du TCR. Il en dcoule que lutilisation des rarrangements des gnes du TCR ou des Ig pour faire la distinction entre prolifration T ou B est plus able pour lanalyse des populations matures dans la mesure o ces rarrangements illgitimes sont beaucoup plus rares, mais, dans tous les cas, ces rsultats doivent tre interprts en fonction des donnes cliniques, morphologiques et immunologiques. Clonalit associe linactivation alatoire du chromosome X Quand ltude du rarrangement des gnes dIg et du TCR nest pas possible, la dtermination de la prsence dune population clonale est plus dlicate. Lanalyse de la clonalit associe linactivation alatoire du chromosome X est base sur deux principes : lexistence de polymorphismes sur les deux chromosomes X, permettant la distinction des deux allles ; linactivation alatoire dun des deux chromosomes X chez la femme au cours de lembryogense (habituellement au stade huit 16 cellules) [52]. Linactivation du chromosome X peut tre tudie de deux manires :

Hmatologie

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

13-000-K-30

Tableau II. Anomalies chromosomiques accessibles la polymerase chain reaction (PCR).


Anomalie
t(12;21) t(1;19) t(4;11) tald t(9;22)

Gnes
TEL (12p13) AML 1 (21q22) PBX (1q23) E2A (19p13) AF4/FEL (4q21) MLL/HRX/ALL-1 (11q23) SIL (1p32) tal-1/SCL (1p32) abl (9q34) bcr (22q11) ETO (8q22) AML-1/CBF (21q22) PML (15q22) RAR (17q11) MYH11 (16p) CBFb (16q) IgH (14q32) Bcl-2 (18q21) CCND-1/PRAD-1/bcl-1 (11p13) IgH (14q32) ALK (2p23) NPM (5q35)

Famille
ETS Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription ? Facteur de transcription Tyrosine kinase Transduction des signaux dactivation ? Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription Myosine Facteur de transcription Rcepteur des antignes Apoptose Cycline Rcepteur des antignes Tyrosine kinase Transport intracellulaire

Incidence
LAL-ligne B enfant LAL-ligne B LAL pr-B Ig Cyto. + LAL LAL < 1 an LAL-T LMC LAL de ladulte LAL de lenfant LAM LAM-2 LAM LAM-3 LAM LAM-4 LAM-4 osino. LNH folliculaires LNH de haut grade : LNH du manteau : LNH anaplasiques 25 % 5% 25 % 5% 70 % 10 25 % 98 % 25 % <5% 10 % 20-40 % 10 % > 95 % 6% 20 % 95 % 60 % 20 % 50 % (T > B)

PCR2
ARN ARN ARN ADN

Rf
[86]

[5, 8]

[1, 58]

[34, 81]

ARN

[9, 11]

t(8;21) t(15;17) inv(16)

ARN ARN

[36, 50]

[7, 23]

ARN

[20, 22]

t(14;18)3

ADN ADN ARN

[13, 17, 43, 45]

t(11;14) t(2;5)

[31, 37, 60, 77]

[40]

LAL(M) : leucmie aigu lymphoblastique (myloblastique) ; LMC : leucmie mylode chronique ; LNH : lymphome non hodgkinien ; Ig cyto : immunoglobulines cytoplasmiques. (1) Seules les anomalies frquentes (> 5 %) ou associes un sous-type particulier, et donc dimportance diagnostique et/ou pronostique sont dtailles ici. (2) Les anomalies dtectes partir de lARN correspondent aux anomalies qualitatives (voir texte pour dtails), et celles dtectes partir de lADN aux anomalies quantitatives. (3) Seules les translocations impliquant les gnes codant les IgH sont dcrites ici. Il existe aussi de rares formes variantes impliquant les gnes codant les chanes lgres sur les chromosomes 2p12 et 22q11.

au niveau de lexpression (soit des protines [glucose 6-phosphate dshydrognase], soit des ARN messagers, le chromosome inactif ntant pas transcrit) ; par tude de la mthylation, en utilisant des enzymes sensibles la mthylation comme HpaII ou HhaI, qui ne coupent pas quand le site de restriction est mthyl. En effet, le chromosome inactif est hypermthyl [98]. En pratique, trois gnes sont tudis pour lanalyse de la clonalit : le gne de la phosphoglycrate kinase (PGK), celui de lhypoxanthine phosphoribosyl transfrase (HPRT), et celui du rcepteur des andrognes (AR) [13]. Combines, ces trois mthodes permettent danalyser la clonalit chez la quasi-totalit des femmes, mais elles sont limites aux femmes ayant des prolifrations majoritaires (> 25 % de la population cellulaire analyse) et leurs analyses sont dinterprtation dlicate.

Dtection molculaire des anomalies chromosomiques.


Lvaluation du pronostic des leucmies et notre comprhension des mcanismes doncogense se sont amliores grce lidentication danomalies caryotypiques associes certains types de tumeurs et lanalyse molculaire des gnes impliqus, expliquant ainsi limportance croissante de la cytogntique en hmatologie. Il existe cependant certaines situations o la cytogntique classique ne permet pas de mettre en vidence ces anomalies. Ainsi, il est parfois difficile dobtenir des mtaphases de qualit acceptable, comme par exemple lorsquun prlvement est effectu aprs chimiothrapie, ou dans les prolifrations matures o lindex mitotique est moins important, ou encore quand la population maligne est minoritaire. De plus, lanalyse des mtaphases nest pas possible sur du matriel congel ou x en paraffine. Certaines anomalies chromosomiques sont difficiles dtecter par une analyse classique, comme linversion du chromosome 16 des leucmies aigus mylodes (LAM) M4 avec osinophiles anormaux [33]. Il existe aussi un nombre croissant danomalies dtectes par biologie molculaire qui ne sont

pas visibles par caryotype classique. La rsolution maximale possible par analyse des chromosomes marqus en bandes R ou G est de lordre de 1 10 mgabases dADN (cest--dire 1 10 millions de paires de bases). La dltion tald, par exemple, anomalie chromosomique la plus frquente dans les LAL-T (environ 25 % des cas), consistant en une dltion spcique de 90 kilobases dADN en amont du gne tal-1, nest pas visible par caryotype classique, mais peut tre dtecte facilement soit par la mthode de Southern, soit par PCR [21]. La frquence leve de la dltion de CDK4I, gne important dans la rgulation du cycle cellulaire, observe dans plusieurs tumeurs, y compris les leucmies, suggre que les microdltions peuvent reprsenter un mcanisme important doncogense [70, 88]. En revanche, les techniques molculaires de dtection ne permettent pas lanalyse globale du caryotype et la dtection danomalies nouvelles ou inattendues. Pour toutes ces raisons, lanalyse des hmopathies malignes ncessite de plus en plus une approche complmentaire la fois par la cytogntique classique et par la cytogntique molculaire.

Dtection des anomalies chromosomiques par PCR La dtection des anomalies chromosomiques (translocation ou inversion) par PCR est fonde sur la juxtaposition anormale de deux squences nuclotidiques bien dnies. Il est donc vident que seules les anomalies bien caractrises sur le plan molculaire, associes des points de cassure conservs, soit au niveau de lADN, soit de lARN, peuvent tre dtectes par cette technique. Les anomalies chromosomiques accessibles la PCR sont dtailles dans le tableau II. Seules les caractristiques gnrales des anomalies frquentes (> 5 %) ou associes un sous-type particulier, donc dimportance diagnostique et/ou pronostique, sont incluses dans cet article [96]. Il existe deux catgories majeures danomalies chromosomiques (g 7).
9

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire


Anomalies quantitatives

Hmatologie

7 Deux catgories danomalies chromosomiques. Ig : immunoglobulines ; TCR : T cell receptor ; PCR : polymrisation en chane. Anomalies qualitatives
Il sagit de translocations conduisant lexpression dun transcrit de fusion rsultant en la juxtaposition des parties codantes de deux gnes (g 7). Elles sont dtects par RT-PCR partir de lARN. Ces anomalies se retrouvent dans les tumeurs lymphodes et mylodes. Les transcrits de fusion et donc les produits de PCR sont identiques chez tous les malades atteints du mme type de translocation et impliquant les mmes introns. Cette uniformit rend possible la dtection de la quasi-totalit des translocations avec une ou deux paires damorces damplication mais, du fait de cette uniformit, cette analyse est trs sensible aux contaminations de la PCR. titre dexemple, les translocations t(9 ; 22)(q34 ; q11) des LMC et des LAL sont identiques sur le plan caryotypique mais diffrent sur le plan molculaire, bien que toutes les deux impliquent les gnes bcr et abl (pour revue [1]). Dans les deux cas, le point de cassure du chromosome 9 se produit au sein de lintron 1 du gne abl, qui stend sur environ 200 kb. En revanche, les points de cassure sont plus parpills sur le chromosome 22. Dans la grande majorit des LMC, la translocation se trouve dans la partie centrale du gne bcr (major breakpoint cluster region ou M-BCR), soit entre les exons 13 et b3, soit entre les exons 14 et 15. Cette htrognit gnomique produit deux types de transcrits de fusion, qui peuvent tre distingus selon la taille des fragments gnrs par RT-PCR avec une paire damorces spciques des exons 13 de bcr et 2 de abl. Ces transcrits de fusion sont traduits en protine anormale dite p210. Dans les LAL possdant une translocation t(9 ; 22), la majorit des cas est caractrise par un point de cassure bien plus en amont du gne bcr, dans lintron 1 (minor breakpoint cluster region ou m-BCR), et sont dtects par RT-PCR avec des amorces spciques de lexon 1 de bcr et de lexon 2 de abl. Le produit protique de ce gne sappelle p190.
10

Il sagit de translocations conduisant lexpression aberrante dun proto-oncogne qualitativement normal, suite sa juxtaposition une squence rgulatrice inhabituelle, souvent un gne des Ig ou du TCR (g 7). Les points de cassure du ct du proto-oncogne se trouvent en dehors de la partie codante du gne, parfois une distance considrable (une centaine de kb pour les t(11 ; 14)(q13 ; q32) des lymphomes du manteau par exemple) [82, 89] et la protine reste donc intacte. Le rsultat nal de ces anomalies est une drgulation de lexpression du proto-oncogne, soit un stade inhabituel de la diffrenciation ou du cycle cellulaire, soit au niveau dun tissu nexprimant pas ce produit physiologiquement. Ces anomalies chromosomiques reprsentent souvent des erreurs de la recombinase lors des rarrangements des gnes codant les Ig ou le TCR (cf supra) et se retrouvent, par consquent, dans les tumeurs lymphodes. Les points de cassure sont situs au niveau dun RSS rel du ct des Ig ou du TCR, le plus souvent du type heptamrenonamre, et dune squence qui lui ressemble du ct du protooncogne. Laccessibilit de cette squence de type RSS la recombinase est probablement dtermine par la conguration chromatinienne ouverte du gne due son activit transcriptionnelle ; ceci suggre que ces proto-oncognes sont actifs lors du rarrangement des gnes dIg ou du TCR. La jonction nuclotidique entre les deux chromosomes est soumise aux mmes modications que les rarrangements physiologiques des Ig ou du TCR, crant ainsi une rgion N spcique de chaque malade. Lamplication de ce type de translocation par PCR se fait partir de lADN (mme partir de matriel x [49]) et gnre des produits de PCR de taille variable, ce qui rend plus facile lidentication de la translocation de chaque malade et donc leur distinction dventuels produits contaminants. En revanche, seuls les points de cassure qui sont regroups dans la rgion avoisinant les amorces damplication sont dtects. Lamplication par PCR de la rgion principale de cassure (MBR pour major breakpoint cluster) de la translocation t(14 ; 18) des lymphomes folliculaires, par exemple, ne dtecte que les 70 % des cas caractriss par une translocation t(14 ; 18) caryotypique dont le point de cassure est situ dans MBR, ou les 5 % des cas dont le point de cassure est situ dans mcr (minor cluster region) [46, 68]. De mme, la dtection par PCR de la translocation t(11 ; 14) des lymphomes du manteau est positive seulement dans la moiti des cas [61, 83], quand le point de cassure implique la rgion prfrentielle de translocation MTC (major translocated cluster) en amont du gne drgul, CCND-1 ou PRAD-1. La plupart des translocations de ce type analyses en routine impliquent le gne IgH (tableau II). La dltion tald, en revanche, nimplique pas les gnes des Ig ou du TCR, mais est apparente dans la mesure o elle est mdie par la recombinase, et o la juxtaposition de la partie 5 non codante du gne SIL, en amont de la dltion, la partie codante de tal-1, conduit une expression aberrante de la protine Tal-1. Limites de dtection des translocations

Points de cassure trop tendus


Il existe une autre catgorie de translocations non alatoires qui ne se prte pas facilement une analyse par PCR ou par RT-PCR. Les translocations affectant le gne c-myc sur le chromosome 8q24 se trouvent dune manire prfrentielle dans le lymphome de Burkitt ou son quivalent leucmique, les LAL-L3. Elles impliquent soit le chromosome 14 (gnes IgH) soit, plus rarement, les chromosomes 2 ou 22 (gnes Ig j ou Ig k respectivement) [55]. Mme si le rsultat nal de toutes ces anomalies est la drgulation de lexpression du gne c-myc, les points de cassure sont trs htrognes, la fois sur le chromosome 8, o elles stendent sur environ 350 kb en amont ou en aval du gne c-myc, et du ct IgH o elles peuvent impliquer les segments JH ou les squences de switch des rgions C H (squences dADN intervenant dans le phnomne de commutation de classe des Ig). Il est vident quune telle htrognit rend difficile la dtection de ces translocations par PCR ou mme par Southern.

Hmatologie

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

13-000-K-30

Partenaires variables
Il existe aussi des anomalies o un gne situ sur un chromosome donn est constamment impliqu, alors que le partenaire chromosomique est variable. Les translocations touchant le segment 11q23, par exemple, impliquent les chromosomes : 4, 9, 19, 1, 2, 5, 6, 10, 15, 17 et X, les trois premiers chromosomes tant les plus frquemment touchs. Les anomalies du 11q23 se trouvent dans environ 5 10 % des LAL et des LAM en gnral, et dune manire prfrentielle dans les leucmies aigus des enfants gs de moins de 1 an (70 %) et dans certaines leucmies secondaires [104]. Du ct du chromosome 11, toutes ces translocations impliquent le mme gne, MLL, et la grande majorit des points de cassure sont regroups dans une rgion denviron 10 kb, favorisant leur dtection par hybridation selon la mthode de Southern avec une sonde MLL [62]. De nombreux partenaires de MLL ont t clons [32, 65, 79] et il est possible de dtecter la translocation t(4 ; 11) par RT-PCR [9]. On peut donc envisager la possibilit de dtecter la grande majorit de ces translocations par RT-PCR, mais du fait de la grande variabilit des partenaires, un bilan molculaire par hybridation par la mthode de Southern reprsente probablement un meilleur choix. Une autre stratgie prometteuse est de dtecter ces translocations par FISH avec une sonde MLL sur mtaphase ou sur noyau interphasique. Les translocations impliquant le gne LAZ-3/bcl-6 sur le chromosome 3q27 [43, 103] , retrouves dans environ 25 % des lymphomes B de haut grade, sont similaires dans la mesure o seulement 50 % des translocations impliquent un gne des Ig, les autres partenaires tant htrognes [7]. Une comparaison de lintrt des diffrentes stratgies danalyse molculaire (Southern, FISH et PCR) permettrait de dnir la meilleure mthode de dtection de ce type danomalie. Apport de lanalyse molculaire des anomalies chromosomiques la diffrence des rarrangements des Ig ou du TCR qui reprsentent des marqueurs indirects de malignit dans les tumeurs lymphodes, les anomalies chromosomiques sont plus ou moins directement impliques dans le processus malin. Leur dtection aide donc non seulement au diagnostic mais aussi lvaluation du pronostic. Lintrt de lanalyse de chaque anomalie dpend de sa frquence, de son importance pronostique et de leur facilit et abilit de dtection.

pronostic [48, 104]. Dans un nombre croissant de protocoles cliniques, leur mise en vidence, notamment pour bcr-abl, indique un changement de traitement vers un protocole plus agressif, voire une greffe de moelle allognique. Un bilan molculaire systmatique des gnes impliqus (bcr-abl, E2A-PBX-1 et AF-4-MLL et tel-aml1 respectivement) montre que ces anomalies peuvent ne pas tre dtectes par caryotype classique [14, 39]. Cependant, les techniques de cytogntique molculaire, notamment FISH, ont une sensibilit proche des techniques de biologie molculaire (en situation diagnostique) et la cytogntique classique offre la possibilit dune analyse globale susceptible dorienter vers de nouvelles cibles molculaires impliques dans loncogense et susceptibles davoir un impact pronostique. Ces diffrentes techniques sont donc certainement complmentaires. Au total, sil est maintenant admis que la mise en vidence dun rarrangement molculaire de bcr-abl ou de MLL-AF4 est associe avec un pronostic dfavorable dans les LAL-B, limpact pronostique dautres rarrangements comme TEL-AML1 ou E2A-PBX reste encore dbattu et des tudes molculaires systmatiques dans le cadre de protocoles thrapeutiques homognes devraient prochainement y rpondre. En ce qui concerne les LAM, les anomalies dtectables par RT-PCR, telles que les transcrits de fusion PML-RAR a des LAM M3 [51], AML1-ETO des LAM M2 [73] et CBF b-MYH-11 des LAM M4 osinophiles [18] sont plutt associes un pronostic relativement favorable. Il est envisageable que ces anomalies, linstar des anomalies des LAL, soient prises en compte lors de la stratication thrapeutique initiale de malades atteints de LAM. Plus rcemment, la dtection dune anomalie qualitative du gne FLT3, dont le couple ligand-rcepteur joue un rle central dans les tapes prcoces de lhmatopose, sest rvle associe un mauvais pronostic dans les LAM. Cette anomalie consiste en une duplication en tandem dune partie du gne FLT3. Il sagit dun facteur pronostique dfavorable et indpendant prsent dans environ 20 % des LAM. Il est probable que les futurs protocoles de chimiothrapie des LAM proposeront une stratication thrapeutique diffrente en fonction de la prsence ou non de cette anomalie, dont la mise en vidence est essentiellement accessible par les mthodes molculaires (PCR) [44, 66].
SUIVI DES MALADES APRS TRAITEMENT

Intrt diagnostique
Certaines anomalies sont pathognomoniques dune maladie et leur mise en vidence devient ncessaire pour tablir le diagnostic, notamment dans tous les cas ayant une prsentation clinique atypique. Entre 5 et 10 % des LMC nont pas de chromosome de Philadelphie (Ph1) correspondant la translocation t(9 ; 22) [94]. La dtection dun rarrangement impliquant les gnes bcr et abl, dabord par Southern et plus rcemment par RT-PCR, a montr que la majorit de ces cas prsentait la mme anomalie molculaire que les LMC Ph 1 + . Il devient maintenant difficile de porter un diagnostic de LMC en labsence soit de la translocation t(9 ; 22), soit dun rarrangement bcr-abl, et il est fort possible que les LMC atypiques nayant pas de rarrangement bcr-abl reprsentent une entit diffrente. De la mme manire, le diagnostic de LAM M3 [99] en labsence dune translocation t(15 ; 17)(q22 ; q11) et/ou dun transcrit de fusion PML-RAR a [ 4 0 ] ncessite la mise en vidence dune forme molculaire variante telle que la translocation t(11 ; 17)(q23 ; q21) ou de son transcrit de fusion, PLZF-RAR a [16]. Du ct lymphode, la mise en vidence soit par caryotype classique, soit par analyse molculaire de la translocation t(14 ; 18)(q32 ; q21) [IgH ; bcl-2] ou de la t(11 ; 14)(q13 ; q32) [bcl-1/CCND-1 ; IgH] aide au diagnostic diffrentiel entre un lymphome folliculaire et un lymphome du manteau.

Lidentication de marqueurs molculaires clonospciques permet la surveillance du clone tumoral aprs traitement et donc la dtection de la maladie rsiduelle, voire lmergence de sous-clones rsistants. Cette valuation a dsormais une place importante et croissante dans la prise en charge des hmopathies malignes [26, 35, 80].

Dtection de la maladie rsiduelle


La maladie rsiduelle est dnie par la persistance des cellules tumorales qui ont survcu la chimiothrapie, prsentes en nombre infrieur au seuil de dtection des mthodes morphologiques classiques (moins de 5 % de blastes). Il a t estim que la masse tumorale totale au moment du diagnostic dune leucmie est de lordre de 1012 cellules, et que linduction la rduit dau moins deux logs dcimaux. Il en rsulte que la rmission complte peut reprsenter entre 0 et 1010 cellules tumorales. La sensibilit de la dtection des cellules tumorales rares par PCR dpasse de plusieurs logs dcimaux celle dautres techniques (tableau III) (g 8) [78]. Dtection molculaire des anomalies chromosomiques

Leucmie mylode chronique


Lanomalie chromosomique la plus recherche par PCR pour le suivi des malades est bcr-abl dans les LMC [74]. Cette recherche doit dsormais se faire par PCR quantitative, et il est probable quune cintique croissante de lvolution du taux de transcrit peut avoir une incidence thrapeutique directe pour les patients, quil sagisse
11

Intrt pronostique
Dans les LAL de la ligne B, les translocations t(9 ; 22)(q34 ; q11), et t(4 ; 11)(q21 ; q23) reprsentent des marqueurs de mauvais

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire


Dtection des rarrangements des Ig et du TCR

Hmatologie

Tableau III. Sensibilit comparative des mthodes de dtection de la maladie rsiduelle.


Sensibilit
Morphologie Southern-blot Caryotype Immunophnotype Double marquage PCR
PCR : polymerase chain reaction.

5% 5% 5% 1% 0,1 % 0,001 %

5 10-2 5 10-2 5 10-2 10-2 10-3 10-5

Pour prs de 90 % des malades atteints de LAL, les rarrangements des gnes des Ig et/ou du TCR peuvent reprsenter des marqueurs molculaires permettant lanalyse de la maladie rsiduelle. Ces stratgies sont de deux types : distinguer la population clonale rsiduelle de la population ractionnelle par la taille des fragments gnrs par PCR [10, 20] ; dtecter dune manire spcique la rgion N du rarrangement V-(D)-J du clone de dpart. Cette deuxime stratgie ncessite soit le squenage de la rgion N et la fabrication dun oligonuclotide spcique [53, 102], soit lutilisation du produit damplication de la rgion N comme sonde spcique [69]. Plus rcemment ont t mises au point des techniques semi-quantitatives par comptition utilisant un standard interne, ou quantitatives par PCR quantitative dont la place dans la stratication thrapeutique des leucmies aigus reste prciser [27]. Il faut juste signaler que la stratgie spcique de la rgion CDR3, soit par hybridation, soit par PCR quantitative, est plus spcique et plus sensible (de lordre de 10-4 10-5 soit une cellule maligne pour 10 000 100 000 cellules normales par rapport 10-3) mais a linconvnient de dtecter seulement le clone de dpart.

volution clonale
La comparaison par la mthode de Southern et/ou par PCR des rarrangements des gnes dIg ou du TCR dans les tumeurs lymphodes lors du diagnostic et de la rechute, peut permettre de dterminer si la rechute reprsente la rapparition du mme clone ou son remplacement par un autre clone. Lapparition dun nouveau rarrangement des gnes dIg ou du TCR peut reprsenter soit une modication du rarrangement majoritaire, soit lmergence dun sous-clone minoritaire pouvant tre slectionn par une rsistance la chimiothrapie. La mise en vidence de certaines anomalies molculaires, telles que les mutations ponctuelles de lanti-oncogne p53 [36] lors dune rechute, permet de caractriser lapparition de clones plus agressifs. Ces anomalies molculaires sont souvent corrles avec une aggravation clinique ou lacquisition de nouvelles anomalies caryotypiques.

8 Reprsentation schmatique des possibilits de lvolution de la maladie rsiduelle dans les leucmies aigus et niveaux de sensibilit requis pour sa dtection.
dadapter la posologie des traitements mdicamenteux (comme limatinib ou linterfron) ou de moduler limmunosuppression et/ou de rinjecter des lymphocytes du donneur pour induire un effet greffon contre leucmie (GVL) chez les patients ayant bnci dune allogreffe de moelle. Lutilisation de la PCR quantitative est par ailleurs un atout indispensable dans lvaluation de nouvelles approches thrapeutiques comme les inhibiteurs de la tyrosine kinase dans cette pathologie.

Dtection de la rsistance aux drogues


Lanalyse des mcanismes de rsistance la chimiothrapie reste pour linstant conne aux laboratoires de recherche. Certains gnes responsables de lefflux des agents cytotoxiques des cellules hmatopotiques, comme mdr-1 (pour multidrug resistance), ont t identis [71]. Lexpression de mdr-1 peut tre dtecte par des techniques dimmunohistochimie au niveau protique ; par hybridation in situ ; par dot-blot ou par RT-PCR au niveau de lARN messager ; et par mesure de la vitesse defflux dun uorochrome au niveau de lanalyse fonctionnelle [11] . Une hyperexpression est observe frquemment lors de la rechute des LAM, des mylomes et des lymphomes. Au diagnostic des LAM, lhyperexpression de mdr-1 reprsente un facteur de mauvais pronostic qui prdit une rsistance la chimiothrapie. Il reste donc dterminer quelle technique sera la plus able pour lanalyse en routine des malades.

Leucmies aigus
De nombreuses donnes rcentes de la littrature ont apport la preuve de la pertinence du monitorage de la maladie rsiduelle minime (MRM) dans les LAL pour lidentication de groupe haut risque de rechute dont le pronostic pourrait tre amlior par un traitement intensif. Les protocoles thrapeutiques des LAL notamment, sont dsormais stratis en fonction du niveau de dtection de la MRM, aprs les premires cures de chimiothrapie. Cette valuation initialement ralise par des mthodes semiquantitatives ou comptitives sera, terme, ralise en PCR quantitative. Les cibles utilisables sont de deux types : soit des remaniements chromosomiques (30 % environ des LAM et des LAL), soit des rarrangements VDJ clonospciques (90 % des LAL). Les premiers prsentent lavantage dtre stables au cours de lvolution de la maladie, mais ne concernent quun tiers des patients. Les rarrangements VDJ permettent une informativit de plus de 90 % dans les LAL, mais ont linconvnient dtre instables, notamment par volution clonale ou mergence dun sous-clone avec un rarrangement diffrent.
12

valuation molculaire postallogreffe


Il est parfois important de dterminer si la reconstitution hmatopotique aprs allogreffe est celle du receveur ou du donneur. Sil existe une diffrence de sexe entre le receveur et le donneur, cette analyse peut se faire par dtection du chromosome Y, soit par marquage la quinacrine sur mtaphase, soit par FISH sur noyau interphasique avec une sonde Y [24]. Quand il ny a pas de diffrence de sexe, la distinction entre lhmatopose de type receveur ou de type donneur se faisait historiquement laide des minisatellites (VNTR), mais de plus en plus elle se fait par tude des microsatellites (STR) [57].

Perspectives davenir
Lanalyse molculaire des gnes impliqus dans loncogense hmatopotique a permis didentier des anomalies diffrents niveaux de la fonction cellulaire :

Hmatologie

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire

13-000-K-30

anomalies de lexpression des rcepteurs de surface ; anomalies de la transmission des signaux dactivation ; anomalies de localisation intranuclaire des protines ; anomalies impliquant les facteurs de transcription ; drgulation du cycle cellulaire ; inhibition de lapoptose. Lidentication de ces anomalies, plus ou moins spciques des tumeurs, permettra le dveloppement de stratgies thrapeutiques adaptes. Ainsi la dmonstration dans les LAM M3, caractrises par une translocation impliquant le rcepteur a de lacide rtinoque (RAR a), quil est possible de traiter les malades par de lacide rtinoque tout-trans, et dinduire ainsi une diffrenciation des blastes promylocytaires vers des formes granulocytaires plus matures, illustre une application thrapeutique des observations

plus fondamentales. Des dveloppements dans le domaine de la thrapie gnique ont dj permis le remplacement dun gne dcitaire dans un syndrome dimmunodcience congnitale (dcit en adnosine dsaminase), et il est esprer que cette stratgie puisse ventuellement tre applique au remplacement des antioncognes dcitaires dans les tumeurs hmatopotiques. De la mme manire, lutilisation de constructions antisens, soit par linjection doligonuclotides, soit par lexpression de vecteurs antisens, permettra peut-tre une inhibition de lexpression ou des effets des oncognes.

Remerciements. Nous tenons remercier Hlne Poirel, Xavier Troussard et Frdric Davi pour leurs commentaires constructifs et Agns Fox, Martine Netter et Monique Lillier pour leur aide dans la prparation de cet article.

Rfrences
[1] Allen PB, Morgan GJ, Wiedemann LM. Philadelphia chromosome positive leukaemia: the translocated genes and their gene products. Baillieres Clin Haematol 1992 ; 5 : 897-930 [2] Allen RC, Zoghbi HY, Moseley AB, Rosenblatt HM, Belmont JW. Methylation of Hpa II and Hha I sites near the polymorphic CAG repeat in the human androgen-receptor gene correlates with X chromosome inactivation. Am J Hum Genet 1992 ; 51 : 1229-1239 [3] Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specic RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl paper and hybridization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA 1977 ; 74 : 5350-5354 [4] Aplan PD, Lombardi DP, Ginsberg AM, Cossman J, Bertness VL, Kirsch I. Disruption of the human SCL locus by illegitimate V-(D)-J recombinase activity. Science 1990 ; 250 : 1426-1429 [5] Athan E, Foitl DR, Knowles DM. bcl-1 rearrangement: frequency and clinical signicance among B-cell chronic lymphocytic leukemia and non-Hodgkins lymphoma. Am J Pathol 1991 ; 138 : 591-599 [6] Bakhshi A, Jensen JP, Goldman P. Cloning the chromosomal breakpoint of t (14; 18) human lymphomas: clustering around JH on chromosome 14 and near a transcriptional unit on 18. Cell 1985 ; 41 : 899-906 [7] Bastard C, Deweindt C, Kerckaert JP, Lenormand B, Rossi A, Pezzella F et al. LAZ-3 rearrangements in non-Hodgkins lymphoma: correlation with histology, immunophenotype, karyotype, and clinical outcome in 217 patients. Blood 1994 ; 83 : 2423-2427 [8] Beldjord K, Beldjord C, Macintyre EA, Even P, Sigaux F. Peripheral selection of Vd1+ cells with restricted T cell receptor d gene junctional repertoire in the peripheral blood of healthy donors. J Exp Med 1993 ; 178 : 121-127 [9] Biondi A, Rambaldi A, Rossi V, Elia L, Caslini C, Basso G et al. Detection of ALL-1/AF-4 fusion transcript by reverse transcription-polymerase chain reaction for diagnosis and monitoring of acute leukemias with the t (4; 11) translocation. Blood 1993 ; 82 : 2943-2947 [10] Bourguin A, Tung R, Galili N, Skar J. Rapid, non radioactive, detection of clonal T-cell receptor gene rearrangements in lymphoid neoplasms. Proc Natl Acad Sci USA 1990 ; 87 : 8536-8540 [11] Brophy NA, Marie JP, Rojas VA, Warnke RA, McFall PJ, Smith SD et al. Mdr-1 gene expression in childhood acute lymphoblastic leukemias and lymphomas: a critical evaluation by four techniques. Leukemia 1994 ; 8 : 327-335 [12] Brumpt C, Delabesse E, Beldjord K, Davi F, Gayuela JM, Millien C et al. The incidence of clonal T-cell receptor rearrangements in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia varies with age and genotype. Blood 2000 ; 96 : 2254-2261 [13] Busque L, Gilliland DG. Clonal evolution in acute myeloid leukemia. Blood 1993 ; 82 : 337-342 [14] Caligiuri MA, Schichman SA, Strout MP, Mrozek K, Baer MR, Frankel SR et al. Molecular rearrangement of the ALL-1 gene in acute myeloid leukemia without cytogenetic evidence of 11q23 chromosomal translocations. Cancer Res 1994 ; 54 : 370-373 [15] Capone M, Hockett RD Jr, Zlotnik A. Kinetics of T cell receptor beta, gamma, and delta rearrangements during adult thymic development : T cell receptor rearrangements are present in CD44 (+) CD25 (+) Pro-T thymocytes. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : 12522-12527 [16] Chen Z, Brand NJ, Chen A, Chen SJ, Tong JH, Wang ZY et al. Fusion between a novel Kruppel-Like zinc nger gene and the retinoic acid receptor-alpha locus due to a variant t (11; 17) translocation associated with acute promyelocytic leukaemia. EMBO J 1993 ; 12 : 1161-1167 [17] Chiang PW, Song WJ, Wu KY, Korenberg JR, Fogel EJ, Van Keuren ML et al. Use of a uorescent-PCR reaction to detect genomic sequence copy number and transcriptional abundance. Genome Res 1996 ; 6 : 1013-1026 [18] Claxton DF, Liu P, Hsu HB, Marlton P, Hester J, Collins F et al. Detection of fusion transcripts generated by the inversion 16 chromosome in acute myelogeneous leukemia. Blood 1994 ; 83 : 1750-1756 [19] Deane M, McCarthy KP, Wiedemann LM, Norton JD. An improved method for detection of B-lymphoid clonality by polymerase chain reaction. Leukemia 1991 ; 5 : 726-730 [20] Deane M, Norton JD. Immunoglobulin gene ngerprinting: an approach to analysis of B lymphoid clonality in lymphoproliferative disorders. Br J Haematol 1991 ; 77 : 274-281 [21] Delabesse E, Bernard M, Landman-Parker J, Davi F, Leboeuf D, Varet B et al. Simultaneous SIL-TAL1 RT-PCR detection of all tal (d) deletions and identication of novel tal (d) variants. Br J Haematol 1997 ; 99 : 901-907 [22] Delabesse E, Burtin ML, Millien C, Madonik A, Arnulf B, Beldjord K et al. Rapid, multiuorescent TCRG Vgamma and Jgamma typing: application to T cell acute lymphoblastic leukemia and to the detection of minor clonal populations. Leukemia 2000 ; 14 : 1143-1152 [23] Delfau MH, Hance AJ, Lecossier D, Vilmer E, Grandchamp B. Restricted diversity of Vg9-JP rearrangements in unstimulated human g/d T lymphocytes. Eur J Immunol 1992 ; 22 : 2437-2443 [24] Dewald GW, Schad CR, Christensen ER, Law ME, Zinsmeister AR, Stalboerger PG et al. Fluorescent in situ hybridization with X-chromosome and Y-chromosome probes for cytogenetic studies on bone marrow cells after opposite sex transplantation. Bone Marrow Transplant 1993 ; 12 : 149-154 [25] Diss TC, Peng H, Wotherspoon AC, Isaacson PG, Pan L. Detection of monoclonality in low-grade B-cell lymphomas using the polymerase chain reaction is dependent on primer selection and lymphoma type. J Pathol 1993 ; 169 : 291-295 [26] Dolken G. Detection of minimal residual disease. Adv Cancer Res 2001 ; 82 : 133-185 [27] Donovan JW, Ladetto M, Zou G, Neuberg D, Poor C, Bowers D et al. Immunoglobulin heavy-chain consensus probes for real-time PCR quantication of residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000 ; 95 : 2651-2658 [28] Fischer SG, Lerman LS. DNA fragments differing by single base pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondance with melting theory. Proc Natl Acad Sci USA 1983 ; 80 : 1579-1583 [29] Frohman MA, Dush MK, Martin GR. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplication using a single gene-specic oligonucleotide primer. Proc Natl Acad Sci USA 1988 ; 85 : 8998-9002 [30] Fugmann SD. RAG1 and RAG2 in V (D) J recombination and transposition. Immunol Res 2001 ; 23 : 23-39 [31] Gibson UE, Heid CA, Williams PM. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res 1996 ; 6 : 995-1001 [32] Gu Y, Nakamura T, Alder H, Prasad R, Canaani O, Cimino G et al. The t (4; 11) chromosome translocation of human acute leukemias fuses the ALL-1 gene, related to drosophila trithorax, to the AF-4 gene. Cell 1992 ; 71 : 701-708 [33] Harth H, Pees H, Zank IH. Acute myelomonocytic leukemia (M4) with eosinophilia: problemes concerning chromosome 16 abnormality. Cancer Genet Cytogenet 1986 ; 23 : 127-133 [34] Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res 1996 ; 6 : 986-994 [35] Hokland P, Pallisgaard N. Integration of molecular methods for detection of balanced translocations in the diagnosis and follow-up of patients with leukemia. Semin Hematol 2000 ; 37 : 358-367 [36] Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. p53 mutations in human cancers. Science 1991 ; 253 : 49-53 [37] Hunger SP, Galili N, Carroll AJ, Crist WM, Link MP, Cleary ML. The t (1; 19)(q23; p13) results in consistent fusion of E2A and PBX-1 coding sequences in acute lymphoblastic leukemias. Blood 1991 ; 77 : 687-693 [38] Iwahana H, Fujimura M, Takahashi Y, Iwabuchi T, Yoshimoto K, Itakura M. Multiple uorescence-based PCR-SSCP analysis using internal uorescent labeling of PCR products. Biotechniques 1996 ; 21 : 510-514, 516-519 [39] Izraeli S, Janssen JW, Haas OA, Harbott J, Brok-Simoni F, Walther JU et al. Detection and clinical relevance of genetic abnormalities in pediatric acute lymphoblastic leukemia: a comparison between cytogenetic and polymerase chain reaction analysis. Leukemia 1993 ; 7 : 671-678 [40] Kakizuka A, Miller WH Jr, Umesono K, Warrell RP Jr, Frankel SR, Murty VV et al. Chromosomal translocation t (15; 17) in human acute promyelocytic leukemia fuses RAR a with a novel putative transcription factor, PML. Cell 1991 ; 66 : 663-674 [41] Kamps MP, Murre C, Sun XH, Baltimore D. A new homeobox gene contributes to the DNA binding domain of the t (1; 19) translocation protein in pre-B ALL. Cell 1990 ; 60 : 547-555 [42] Kawasaki ES, Clark SS, Coyne MY. Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specic mRNA sequences amplied in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1988 ; 85 : 5698-5702 [43] Kerckaert JP, Deweindt C, Tilly H, Quief S, Lecocq G, Bastard C. LAZ-3, a novel zinc nger encoding gene, is disrupted by recurring chromosme 3q27 translocations in human lymphomas. Nat Genet 1993 ; 5 : 66-69 [44] Kondo M, Horibe K, Takahashi Y, Matsumoto K, Fukuda M, Inaba J et al. Prognostic value of internal tandem duplication of the FLT3 gene in childhood acute myelogenous leukemia. Med Pediatr Oncol 1999 ; 33 : 525-529 [45] Konopka JB, Watanabe SM, Singer JW, Collins SJ, Witte ON. Cell lines and isolates derived fron Ph1-positive chronic myelogenous leukemia patients express c-Abl proteins with a common structural alteration. Proc Natl Acad Sci USA 1985 ; 82 : 1810-1814 [46] Lee MS, Chang KS, Cabanillas F, Freireich EJ, Trujillo JM, Stass SA. Detection of minimal residual cells carrying the t (14; 18) by DNA sequence amplication. Science 1987 ; 227 : 175-178 [47] Lefranc MP, Lefranc G. Les immunoglobulines humaines. In : Hmatologie. Paris : Flammarion, 1992 : 197-253 [48] Lestingi TM, Hooberman AL. Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia. Manag Acute Leuk 1993 ; 7 : 161-175 [49] Limpens J, Beelen M, Stad R, Haverkort M, van Krieken JH, van Ommen GJ et al. Detection of the t (14; 18) translocation in frozen and formalin-xed tissue. Diagn Mol Pathol 1993 ; 2 : 99-107 [50] Liu P, Tarle SA, Hajra A, Claxton DF, Marlton P, Freedman M et al. Fusion between transcription factor CBF-b/PEBP-2-b and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia. Science 1993 ; 261 : 1041-1044 [51] Lo Coco F, Diverio D, Pandol PP, Biondi A, Rossi V, Avvisati G et al. Molecular evaluation of residual disease as a predictor of relapse in acute promyelocytic leukaemia. Lancet 1992 ; 340 : 1437-1438 [52] Lyon MF. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.). Nature 1961 ; 190 : 372-374

13

13-000-K-30

Application lhmatologie maligne des techniques de biologie molculaire


[69] Nizet Y, VanDaele S, Lewalle P, Vaerman JL, Philippe M, Vermylen C et al. Long-term follow-up of residual disease in acute lymphoblastic leukemia patients in complete remission using clonogeneic IgH probes and the polymerase chain reaction. Blood 1993 ; 82 : 1618-1625 [70] Nobori T, Miura K, Wu DJ, Lois A, Takabayashi K, Carson DA. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature 1994 ; 368 : 753-756 [71] Nooter K, Sonneveld P. Clinical relevance of P-glycoproteins expression in haematological malignancies. Leuk Res 1994 ; 18 : 233-243 [72] Nourse J, Mellentin JD, Galili N, Wilkinson J, Stanbridge E, Smith SD et al. Chromosomal translocation t (1; 19) results in a synthesis of a homeobox fusion mRNA that codes for a potential chimeric transcription factor. Cell 1990 ; 60 : 535-545 [73] Nucifora G, Larson RA, Rowley JD. Persistence of the 8; 21 translocation in patients with acute myeloid leukemia type M2 in long-term remission. Blood 1993 ; 82 : 715-715 [74] Ogawa H. Minimal residual disease in chronic myelogenous leukemia. Nippon Rinsho 2001 ; 59 : 2348-2352 [75] Oltz EM. Regulation of antigen receptor gene assembly in lymphocytes. Immunol Res 2001 ; 23 : 121-133 [76] Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 1989 ; 5 : 874-879 [77] Porcelli S, Brenner MB, Band H. Biology of the human gd T-cell receptor. Immunol Rev 1991 ; 120 : 137-183 [78] Potter MN. The detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia. Blood Rev 1992 ; 6 : 68-82 [79] Prasad R, Gu Y, Alder H, Nakamura T, Canaani O, Saito H et al. Cloning of the ALL-1 fusion partner, the AF-6 gene, involved in acute myeloid leukemias with the t (6; 11) chromosome translocation. Cancer Res 1993 ; 53 : 5624-5628 [80] Radich JP. The use of PCR technology for detecting minimal residual disease in patients with leukemia. Rev Immunogenet 1999 ; 1 : 265-278 [81] Res P, Spits H. Developmental stages in the human thymus. Semin Immunol 1999 ; 11 : 39-46 [82] Rimokh R, Berger F, Delsol G, Charrin C, Bertheas MF, French M et al. Rearrangement and overexpression of the bcl-1/PRAD-1 gene in intermediate lymphocytic lymphomas and in t (11q13)-bearing leukemias. Blood 1993 ; 81 : 3063-3067 [83] Rimokh R, Berger F, Delsol G, Digonnet I, Rouault JP, Tigaud JD et al. Detection of the chromosomal translocation t (11; 14) by polymerase chain reaction in mantle cell lymphomas. Blood 1994 ; 83 : 1871-1875 [84] Rivera GK, Raimondi SC, Hancock ML, Behm FG, Pui CH, Abromowitch M et al. Improved outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia with reinforced early treatment and rotational combination chemotherapy. Lancet 1991 ; 337 : 61-66 [85] Rocha B, Vassili P, Guy-Grand D. The extrathymic T-cell development pathway. Immunol Today 1992 ; 13 : 449-454 [86] Romana SP, LeConiat M, Berger R. t (12; 21): a new recurrent translocation in acute lymphoblastic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1994 ; 9 : 186-191 [87] Sanger F, Nickler S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977 ; 74 : 5463-5467

Hmatologie

[53] MacIntyre EA, DAuriol L, Duparc N, Leverger G, Galibert F, Sigaux F. Use of oligonucleotide probes directed against T-cell antigen receptor gd V-(D)-J junctional sequences as a general method for detecting minimal residual disease in ALL. J Clin Invest 1990 ; 86 : 2125-2135 [54] MacIntyre EA, Delabesse E. Molecular approaches to the diagnosis and evaluation of lymphoid malignancies. Semin Hematol 1999 ; 36 : 373-389 [55] Magrath I. The pathogenesis of Burkitts lymphoma. Adv Cancer Res 1990 ; 55 : 133-270 [56] Malissen B, Malissen M. Rcepteurs pour lantigne des lymphocytes T. In : Trait dimmunologie. Paris : Flammarion, 1993 : 43-76 [57] Martinelli G, Trabetti E, Zaccaria A, Farabegoli P, Buzzi M, Testoni N et al. In vitro amplication of hypervariable DNA regions for the evaluation of chimerism after allogeneic BMT. Bone Marrow Transplant 1993 ; 12 : 115-120 [58] McEvoy CR, Seshadri R, Firgaira FA. Large DNA fragment sizing using native acrylamide gels on an automated DNA sequencer and GENESCAN software. Biotechniques 1998 ; 25 : 464-470 [59] Medeiros LJ, Bagga T, Cossman J. Application of molecular genetics to the diagnosis of hematopoietic neoplasms. In : Neoplastic hematopathology. Baltimore : Williams and Wilkins, 1992 : 263-298 [60] Miyoshi H, Shimizu K, Kozu T, Maseki N, Kaneko Y, Ohki M. Breakpoint on chromosome 21 in acute myeloid leukemia are clustered within a limited region of a single gene, AML1. Proc Natl Acad Sci USA 1991 ; 88 : 10431-10434 [61] Molot RJ, Meeker TC, Wittwer CT, Perkins SL, Segal GH, Masih AS et al. Antigen expression and polymerase chain reaction amplication of mantle cell lymphomas. Blood 1994 ; 83 : 1626-1631 [62] Morgan GJ, Cotter F, Katz FE, Ridge SA, Domer P, Korsmeyer S et al. Breakpoints at 11q23 in infant leukemias with the t (11; 19)(q23; p13) are clustered. Blood 1992 ; 80 : 2172-2175 [63] Morris SW, Kirstein MN, Valentine MB, Dittmer KG, Shapiro DN, Saltman DN et al. Fusion of a kinase gene, alk, to a nucleolar protein gene, npm, in non-Hodgkins lymphoma. Science 1994 ; 263 : 1281-1284 [64] Mullis KB, Faloona F. Specic synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalysed chain reaction. Methods Enzymol 1987 ; 155 : 335-350 [65] Nakamura T, Alder H, Gu Y, Prasad R, Canaani O, Kamada N et al. Genes on chromosome-4, chromosome-9, and chromosome-19 involved in 11q23 abnormalities in acute leukemia share sequence homology and/or common motifs. Proc Natl Acad Sci USA 1993 ; 90 : 4631-4635 [66] Nakao M, Yokota S, Iwai T, Kaneko H, Horiike S, Kashima K et al. Internal tandem duplication of the t3 gene found in acute myeloid leukemia. Leukemia 1996 ; 10 : 1911-1918 [67] Ngan BY, Chen-Levy Z, Weiss LM, Warnke RA, Cleary ML. Expression in non-Hodgkins lymphoma of the Bcl-2 protein associated with the t (14; 18) chromosomal translocation. N Engl J Med 1988 ; 318 : 1638-1644 [68] Ngan BY, Nourse J, Cleary ML. Detection of chromosomal translocation t (14; 18) within the minor cluster region of bcl-2 by polymerase chain reaction and direct genomic sequencing of the enzymatically amplied DNA in follicular lymphomas. Blood 1989 ; 73 : 1759-1762

[88] Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specic inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 1993 ; 366 : 704-707 [89] Shivdasani RA, Hess JL, Skarin AT, Pinkus GS. Intermediate lymphocytic lymphoma: clinical and pathologic features of a recently characterized subtype of non-Hodgkins lymphoma. J Clin Oncol 1993 ; 11 : 802-811 [90] Sklar J. Antigen receptor genes: structure function and techniques for analysis of their rearrangements. In : Neoplastic hematopathology. Baltimore : Williams and Wilkins, 1992 : 215-244 [91] Southern EM. Detection of specic sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975 ; 98 : 503-517 [92] Spencer J, Isaacson PG, Diss TC, Macdonald TT. Expression of a disulphide linked and non sulphide linked forms of the T cell receptor g/d heterodimer in human intestinal intraepithelial lymphocytes. Eur J Immunol 1989 ; 19 : 1335-1338 [93] Spits H, Blom B, Jaleco AC, Weijer K, Verschuren MC, van Dongen JJ et al. Early stages in the development of human T, natural killer and thymic dendritic cells. Immunol Rev 1998 ; 165 : 75-86 [94] Tanzer J, Guilhot F. Leucmie mylode chronique. In : Hmatologie. Paris : Flammarion, 1992 : 619-650 [95] Trainor KJ, Brisco MJ, Wan JH, Neoh S, Grist S, Morley AA. Gene rearrangement in B- and T-lymphoproliferative disease detected by the polymerase chain reaction. Blood 1991 ; 78 : 192-196 [96] vanDongen JJ, MacIntyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 concerted action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999 ; 13 : 1901-1928 [97] Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Feinberg AP. Use of restriction fragment length polymorphisms to determine the clonal origin of human tumors. Science 1985 ; 227 : 642-645 [98] Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Preisinger AC, Willard HF, Michelson AM et al. Clonal analysis using recombinant DNA probes from the X-chromosome. Cancer Res 1987 ; 47 : 4806-4813 [99] Warrel RP, DeTh H, Wang ZY, Degos L. Acute promyelocytic leukemia. N Engl J Med 1993 ; 329 : 177-189 [100] Williams ME, Meeker TC, Swerdlow SH. Rearrangement of the chromosome 11 bcl-1 locus in centrocytic lymphoma: analysis with multiple breakpoint probes. Blood 1991 ; 78 : 493-498 [101] Wucherpfennig KW, Newcombe J, Li H, Keddy C, Cuzner ML, Haer DA. T cell receptor Va-Vb repertoire and cytokine gene expression in active multiple sclerosis lesions. J Exp Med 1992 ; 175 : 993-1002 [102] Yamada M, Hudson S, Tournay O, Rovera G. Detection of minimal disease in hematopoietic malignancies of the B-cell lineage by using third-complementary-determinity region (CDR-III)-specic probes. Proc Natl Acad Sci USA 1989 ; 86 : 5123-5127 [103] Ye BH, Lista F, LoCoco F, Knowles DM, Offit K, Chaganti RS et al. Alterations of a zinc nger encoding gene, bcl-6, in diffuse large-cell lymphoma. Science 1993 ; 262 : 747-750 [104] Young BD. Cytogenetic and molecular analysis of chromosome 11q23 abnormalities in leukaemia. Baillieres Clin Haematol 1992 ; 5 : 881-895

14

Encyclopdie Mdico-Chirurgicale 13-000-A-30

13-000-A-30

Cytologie et histologie mdullaires normales


G Sbahoun N Horschowski

Rsum. Lexamen de la moelle hmatopotique est important dans le diagnostic, le bilan, la surveillance de nombreuses affections hmatologiques, et un chantillon peut tre aisment obtenu par ponction ou biopsie. La composition cellulaire de la moelle osseuse est analyse par le mylogramme, ralis aprs ponction-aspiration de suc mdullaire. Ses indications sont prcises et son interprtation est dautant mieux adapte au problme pos quelle intgre une bonne connaissance du contexte clinique et biologique. Les frottis mdullaires permettent dapprcier la cellularit mdullaire globale, la richesse en mgacaryocytes, de faire un dcompte diffrentiel des cellules, den tudier la morphologie, dvaluer les rserves mdullaires en fer, de rechercher une inltration cellulaire anormale. La ponction mdullaire est aussi loccasion de prlever des cellules mdullaires en vue dtudes complmentaires, notamment immunologiques, cytogntiques ou molculaires. Dans certains cas ou lorsque le prlvement mdullaire par aspiration nest pas optimal, une analyse de la structure histologique du tissu mdullaire peut tre ncessaire et est ralise aprs biopsie dun fragment ostomdullaire. La biopsie mdullaire donne une meilleure apprciation de la richesse vritable de la moelle et a une meilleure sensibilit pour la dtection dun inltrat tumoral. Cest aussi le seul moyen dvaluation du stroma rticulinique, du collagne et dune brose.
2002 Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Mots-cls : moelle osseuse, mylogramme, cytologie mdullaire, biopsie mdullaire, histologie mdullaire.

Mylogramme et cytologie mdullaire normale


PONCTION MDULLAIRE

La ponction-aspiration (mylogramme) est la technique de choix pour valuer la cellularit globale de la moelle osseuse, raliser une analyse cytologique des cellules mdullaires, en apprcier la rpartition des diffrentes lignes hmatopotiques et la maturation cellulaire au sein de chaque ligne (dcompte diffrentiel).

Sige de la ponction
Chez ladulte, on ponctionne le manubrium sternal, lpine iliaque antrosuprieure ou de prfrence postrosuprieure, los y tant moins rsistant. Chez lenfant, on prfre lpine iliaque postrosuprieure ; chez le plus jeune, la ponction peut aussi intresser lapophyse pineuse dune vertbre lombaire ou, exceptionnellement (chez le nourrisson), la tubrosit tibiale antrieure. Lpine iliaque postrosuprieure est en gnral le lieu de choix pour le prlvement. Le lieu de ponction doit tre adapt certaines circonstances particulires : viter le sternum chez un sujet ayant un antcdent de sternotomie, viter les territoires ayant t irradis.

Aiguille ponction mdullaire (Illinois).

Technique de ponction
Le mylogramme est habituellement un examen sans danger. An de le mettre en conance, il est essentiel que quelques mots dexplication soient donns au patient sur la procdure utilise et sur ce quon attend de cet examen. Le classique trocart de Mallarm a laiss la place des aiguilles usage unique type aiguille dIllinois (g 1), de diamtre variable en fonction de lge du patient (15 gauge pour un adulte, 18 gauge pour un enfant). Cette aiguille ponction mdullaire est ajustable en longueur (de 10 48 mm) grce une bute vis qui permet de contrler la pntration osseuse. Cette bute est retire lorsquon ponctionne lpine iliaque postrosuprieure dun patient ayant un pannicule adipeux dune certaine paisseur. Une anesthsie locale est en principe inutile, car elle ne supprime pas le moment douloureux de laspiration et prolonge lacte. Une analgsie cutane peut tre ralise par lapplication dune crme lidocane-prilocane. La crme doit tre applique en couche paisse,

Grard Sbahoun : Professeur dhmatologie. Nicole Horschowski : Matre de confrences dhmatologie. Centre hospitalier universitaire de Marseille, hpital Nord, chemin des Bourrellys, 13915 Marseille cedex 20, France.

Toute rfrence cet article doit porter la mention : Sbahoun G et Horschowski N. Cytologie et histologie mdullaires normales. Encycl Md Chir (Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS, Paris, tous droits rservs), Hmatologie, 13-000-A-30, 2002, 8 p.

13-000-A-30

Cytologie et histologie mdullaires normales

Hmatologie

sans masser, et recouverte dun pansement occlusif (Emlatcrme 5 %, Emlapatcht). Lanesthsie obtenue est strictement supercielle et dure en moyenne 2 heures. Une analgsie au protoxyde dazote peut tre utilise chez lenfant. Aprs une large dsinfection cutane et aprs avoir revtu des gants striles, loprateur traverse perpendiculairement les plans cutans et la corticale osseuse. Le mandrin du trocart est retir et avec une seringue tanche sche de 20 mL on ralise une aspiration brve mais nergique, qui provoque souvent chez le patient une sensation d arrachement . Lensemble trocart-seringue est retir ds quune goutte de suc mdullaire apparat dans la seringue. Il est inutile de prlever plus de 1 mL de moelle, sous peine dhmodilution. Sil est ncessaire de faire un prlvement plus important pour dautres examens que le mylogramme, on prlve plusieurs seringues (dautant quelles doivent alors tre hparines), le premier chantillon, le moins abondant, tant rserv la confection des talements.

Raspiration du sang diluant le suc mdullaire.

Problmes techniques et incidents


La ponction peut tre blanche : aprs stre assur de la bonne position du trocart, on le dplace lgrement et on renouvelle laspiration. En cas de nouvel chec et si le malade a ressenti une impression darrachement au cours de laspiration, on retire lensemble et on effectue un ou deux frottis avec la goutte de suc mdullaire prsent dans le trocart. Souvent cet chec correspond une moelle dsertique, breuse ou envahie par des mtastases. Chez les sujets gs ostoporotiques et surtout dans des cas de mylome, la friabilit de los peut entraner une incertitude sur la pntration dans la cavit mdullaire. Le traitement anticoagulant ou antiagrgant, les troubles de lhmostase ou la thrombopnie ne sont pas une contre-indication au mylogramme. Le saignement qui peut se produire est minimis par une pression directe sur le site de ponction. Le risque de blessure des vaisseaux rtrosternaux au cours dune ponction sternale est naturellement prvenu si on ne ponctionne que le manubrium et non le corps du sternum.

Confection des frottis mdullaires.

Confection des frottis


Le suc mdullaire coagule vite et les talements doivent tre raliss rapidement. Le suc prlev est expuls sur une ou plusieurs lames de verre. Les grumeaux mdullaires sont isols par inclinaison de la lame ou raspiration du sang le diluant (g 2). Les talements sont effectus partir des grumeaux mdullaires transfrs sur le bord dune lame rode, en poussant (et non en tirant) la petite quantit de suc mdullaire prlev avec le bord de la lame, le long dune autre lame parfaitement propre et dgraisse (g 3). Les frottis doivent tre ns (couche monocellulaire) et nombreux (une dizaine), permettant si ncessaire la ralisation de techniques cytochimiques ou immunocytochimiques. Ils sont schs lair. Une partie dentre eux (quatre ou cinq) est colore au May Grnwald-Giemsa. La coloration de Wright, utilise dans les pays anglo-saxons, donne des rsultats semblables. Les lames non colores peuvent tre utilises pour des ractions cytochimiques, colores dans un second temps (recherche de mtastases, lymphocytose htrogne...), ou congeles pour des ractions immunocytochimiques. Si les techniques immunocytochimiques peuvent tre directement effectues sur les frottis non colors rcents, ou aprs conglation, il est cependant prfrable davoir recours un autre prlvement, anticoagul, de manire pouvoir lenrichir en cellules tester, par centrifugation ou par sparation sur gradient de sdimentation. On effectue alors secondairement des frottis en nombre adapt au nombre danticorps tester. Certains utilisent la technique du grumeau cras . Aprs prlvement dun grumeau mdullaire laide dun coin de lame, celui-ci est cras entre deux lames qui sont ensuite spares par traction dlicate en sens opposs. Cette technique donne une meilleure ide de la cellularit mdullaire et permet plus facilement le dpistage de cellules anormales, mais rend lanalyse de la morphologie cellulaire plus difficile.
2

MYLOGRAMME NORMAL

Mthode dobservation
Toutes les lames colores dun mme mylogramme doivent tre examines. Examen au faible grossissement Lobservation est dabord effectue un faible grossissement de manire dpister des lments cellulaires anormaux et apprcier la richesse cellulaire. Ce temps dtude quantitative est important, car cest en fonction de la richesse mdullaire globale que sont interprts les pourcentages respectifs de chaque ligne. La moelle est normalement riche (normocellulaire) lorsque les frottis montrent une surface dhmaties peu prs gale celle recouverte par les cellules nucles. Cette richesse peut tre augmente en cas dhyperplasie mdullaire globale ou prdominant sur une ligne, ou trs augmente dans les prolifrations mdullaires, ralisant alors une nappe de cellules nucles entre lesquelles il ny a pas de place pour les hmaties. Inversement, les frottis peuvent tre hypocellulaires, un dcompte devenant alors impossible tablir lorsquils sont trop pauvres, voire dsertiques. Dans ces derniers cas dhypocellularit, le cytologiste doit liminer la cause derreur la plus importante de lapprciation de la richesse mdullaire que reprsente la dilution du suc mdullaire par des lments dorigine sanguine (cellularit constitue par une majorit de polynuclaires et de lymphocytes).

Hmatologie

Cytologie et histologie mdullaires normales

13-000-A-30

est tabli aprs dcompte de 100 300 lments distribus dans des champs contigus, en liminant les cellules en mitose, les cellules crases, mal ou non identiables. Ce dcompte de chaque catgorie cellulaire permet dapprcier une maturation harmonieuse normale caractrise par une distribution pyramidale avec peu de cellules jeunes et davantage de cellules matures. Le pourcentage global de chaque ligne permet de mettre en vidence un ventuel dsquilibre dans leur rpartition (hyper- ou hypoplasie rythroblastique ou granuleuse). Une conclusion synthtique est donne par le cytologiste, en fonction des donnes quantitatives et qualitatives, aprs avoir pris connaissance de lge du sujet et de sa prsentation clinique et biologique.

Artefacts

Mgacaryocyte granuleux.

Certaines cellules, sans tre crases, peuvent tre aplaties : leur cytoplasme est dform, dplac un ple de la cellule, constituant des appendices, et leur noyau comporte une chromatine un peu vermicule . Certaines cellules peuvent tre rduites un aspect de noyaux nus avec la prsence de quelques mottes basophiles correspondant des fragments de cytoplasme. Les lymphocytes sont des cellules trs fragiles : leur cytoplasme et leur noyau peuvent tre lss, rduits ltat dombre nuclaire. Une paisseur excessive des frottis entrane une rduction de la taille des cellules qui sont alors trs ramasses ; leur identication peut tre errone et ces zones paisses sont viter. La superposition de certains lments peut donner de fausses images de phagocytose. Cependant, la prsence dlments cellulaires dans le cytoplasme dun mgacaryocyte peut correspondre une image dynamique (phnomne dempripolse). La prsence de ponts intercellulaires ou interchromatiniens dus un rinage trop nergique des frottis est un artefact limin par les colorateurs automatiques.

Mgacaryocyte plaquettogne.

Cellules extrahmatopotiques
Toujours au faible grossissement, on apprcie la richesse des frottis en mgacaryocytes, en les recherchant prfrentiellement en queue de frottis. On en dnombre ltat normal de 8 20 par lame. Ils peuvent tre, selon lactivit de cette ligne, plus ou moins nombreux, voire absents. Ici encore, leur rarfaction nest interprtable quen labsence dhmodilution. Les mgacaryocytes habituellement identis sont des mgacaryocytes granuleux (grandes cellules de 40-60 m noyau multilob et cytoplasme acidophile granulaire) (g 4) et des mgacaryocytes plaquettognes (noyau pycnotique et cytoplasme intensment acidophile librant des plaquettes) (g 5). Occasionnellement, on peut identier quelques mgacaryocytes basophiles, voire des mgacaryoblastes. Cette apprciation de la richesse en mgacaryocytes est semiquantitative et ceux-ci qualis de nombreux ou trs nombreux , ou au contraire de peu nombreux, rares ou trs rares . Le faible grossissement permet aussi de dpister des lments normaux mais prsents en petit nombre et de grande taille : ostoblastes, ostoclastes, histiocytes-macrophages. En pathologie, cest au faible grossissement que sont dcels des groupements de cellules mtastatiques ou de volumineuses cellules de surcharge. Enn, le faible grossissement permet de choisir les zones les plus riches et les mieux tales pour lobservation au fort grossissement. Examen au fort grossissement Le fort grossissement ( 40 100 immersion) permet dabord une analyse cytologique, la recherche danomalies morphologiques. La suite de lexamen tablit le pourcentage des diffrents lments de chaque ligne mylode ( lexception de la ligne mgacaryocytaire) et de la ligne lymphode. Le pourcentage Il est possible de rencontrer sur des frottis de moelle normale des cellules appartenant aux plans cutans et sous-cutans : cellules pidermiques, cellules pithliales des glandes sbaces et sudoripares, cellules graisseuses. Les cellules vasculaires endothliales ralisent des axes ou des amas de cellules aplaties, fusiformes, ne pas confondre avec des cellules trangres tumorales ayant envahi la moelle. Des cellules de grande taille de lpithlium buccal contenant des bactries peuvent souiller les frottis la suite de projection de salive sur les lames. Des cellules proprement osseuses peuvent se rencontrer sur un mylogramme, surtout chez lenfant ou chez les sujets porteurs de remaniements osseux pathologiques. Les ostoblastes (g 6) sont des cellules ovodes, au cytoplasme abondant, basophile, comportant une zone claire loigne du noyau, qui est excentr, chromatine ne et nuclole. Ils sont souvent groups en petits lots et sont diffrencier des plasmocytes (g 7) et damas de cellules mtastatiques. Les ostoclastes (g 8), cellules gantes multinucles, au cytoplasme tendu contenant des granulations, sont diffrencier des mgacaryocytes.

Dcompte dun mylogramme normal


Aprs valuation de la richesse mdullaire et de la richesse en mgacaryocytes, les valeurs relatives de chaque ligne sont dtermines (tableau I). Chez ladulte, la ligne granuleuse reprsente entre 60 et 70 % des lments nucls, la ligne rythroblastique de 15 30 %, les lymphocytes de 5 15 %, les plasmocytes de 0 3 % et les monocytes de 0 2 %.
3

13-000-A-30

Cytologie et histologie mdullaires normales


Tableau I. Mylogramme normal.
Richesse Mgacaryocytes Ligne granuleuse Myloblastes Promylocytes Mylocytes neutrophiles Mylocytes osinophiles Mtamylocytes neutrophiles Mtamylocytes osinophiles Polynuclaires neutrophiles Polynuclaires osinophiles Polynuclaires basophiles Ligne rythroblastique Prorythroblastes rythroblastes basophiles rythroblastes polychromatophiles rythroblastes acidophiles Autres cellules Lymphocytes Plasmocytes Monocytes frottis riches normalement prsents 60 70 % 02% 14% 10 15 % 01% 10 20 % 01% 15 25 % 01% 01% 15 30 % 02% 13% 5 15 % 5 10 %

Hmatologie

Groupe dostoblastes.

Plasmocyte.

5 20 % 03% 02%

Myloblaste (MB), promylocyte (PM).

Ostoclaste.

10

Mylocyte (M), mtamylocyte (MM), polynuclaire (PN).

La maturation des prcurseurs granuleux permet didentier quatre stades morphologiques (g 9, 10) : le myloblaste (10 m) a un volumineux noyau chromatine ne et nuclole, un cytoplasme rduit, basophile, avec quelques granulations azurophiles ; le promylocyte (de 15 20 m) a un noyau excentr, chromatine ne mais sans nuclole, un cytoplasme tendu, basophile, contenant de nombreuses granulations azurophiles et une zone claire juxtanuclaire ; le mylocyte est plus petit, chromatine lgrement acidophile contenant quelques granulations azurophiles et surtout des granulations neutrophiles ;
4

le mtamylocyte a un noyau incurv en fer cheval et une chromatine plus condense ; ce noyau se segmente en plusieurs lobes au stade de polynuclaire ; quelques osinophiles peuvent tre identis partir du stade mylocyte. La maturation des prcurseurs rythroblastiques permet de reconnatre quatre stades morphologiques (g 11, 12, 13) : le prorythroblaste (de 20 25 m) est une cellule arrondie noyau volumineux et chromatine ne, perle , comportant un

Hmatologie

Cytologie et histologie mdullaires normales


11
Prorythroblaste (PE).

13-000-A-30

lrythroblaste polychromatophile (de 12 15 m) a un noyau plus petit et une chromatique paisse ; le cytoplasme est violac ; lrythroblaste acidophile (de 9 10 m) a un petit noyau trs dense et un cytoplasme proche de celui du globule rouge.

Variations physiologiques
La richesse de la moelle et les pourcentages des diffrentes lignes varient entre la naissance et lge adulte. la naissance, la moelle est trs riche. Cette richesse diminue ds le septime jour pour se normaliser entre le premier et le troisime mois. la naissance, il existe une hyperplasie physiologique de la ligne rythroblastique (de 30 45 %), suivie au huitime jour par une rythroblastopnie (de 8 12 %). La valeur adulte est atteinte vers 2 3 mois. Le pourcentage des lymphocytes mdullaires est nettement augment chez le jeune enfant : de 20 30 % ds le septime jour et jusquau sixime mois. Cette lymphocytose saccompagne de prcurseurs lymphodes (hmatogones), en gnral infrieurs 10 % et variant selon les territoires mdullaires examins.

12

rythroblaste phile (EB).

baso-

Rserves mdullaires en fer


Une coloration de Perls (au bleu de Prusse) met en vidence de 20 40 % de sidroblastes de type 1 sous forme drythroblastes contenant, disperss dans leur cytoplasme, de un cinq grains de fer (ferritine et micelles dhmosidrine), la limite de la visibilit. Quelques grains de fer sont aussi visibles dans les macrophages. La prsence de sidroblastes de type 2 (nombreux grains de fer trs visibles) ou a fortiori de type 3 (sidroblastes en couronnes) traduit une surcharge pathologique en fer des rythroblastes.

Valeur diagnostique du mylogramme


Ce sont les anomalies de lhmogramme qui conditionnent en premier lieu les indications du mylogramme et donc les rsultats que lon peut en attendre. En dehors de la prsence dans la moelle de cellules anormales, le mylogramme peut montrer des anomalies quantitatives dans la rpartition des diffrentes lignes, ou des altrations qualitatives des lments cellulaires, globales ou portant lectivement sur une ligne mylode. Devant une cytopnie, le mylogramme permet dliminer une origine centrale et il est de ce fait normal dans les cytopnies de cause priphrique. En dehors de toute anomalie de lhmogramme, le mylogramme est aussi pratiqu au cours du bilan dextension de certaines affections malignes : lymphome, maladie de Hodgkin, cancers. Il est souvent normal dans ces cas ; il peut mme tre normal en prsence dune localisation hodgkinienne ou dune mtastase de cancer lorsque celles-ci sont entoures de brose et ne sont pas aspires la ponction. Elles ne sont alors dtectables quen histologie et la biopsie mdullaire est plus approprie que le mylogramme dans cette indication.

13

rythroblaste polychromatophile (EP), rythroblaste acidophile (EA).

Biopsie mdullaire et histologie mdullaire normale


BIOPSIE MDULLAIRE

ou deux nucloles ; le cytoplasme, trs basophile et dpourvu de granulations, entoure compltement le noyau ; lrythroblaste basophile (de 15 18 m) est aussi arrondi, mais son noyau est moins volumineux et sans nuclole ; le cytoplasme est toujours basophile, un peu plus tendu ;

En permettant lanalyse de 10 20 espaces mdullaires, la biopsie mdullaire fournit des donnes quantitatives plus prcises que le mylogramme qui peut sous-estimer la richesse mdullaire. Elle permet ltude du stroma mdullaire, inaccessible la ponction. Elle a une meilleure sensibilit que le mylogramme pour la dtection de cellules tumorales. Ainsi, la biopsie mdullaire trouve son indication lorsque la ponction-aspiration ramne une moelle peu cellulaire et quil faille soit conrmer une hypoplasie, soit dmontrer une brose. Elle est aussi ralise dans le cadre du bilan dextension dun lymphome, dune maladie de Hodgkin, dune tumeur solide.
5

13-000-A-30

Cytologie et histologie mdullaires normales


MTHODE DOBSERVATION

Hmatologie

Une biopsie mdullaire reprsentative doit tre suffisamment profonde, et lchantillon doit comporter au moins dix espaces mdullaires et tre dpourvu dartefacts. un faible grossissement, on apprcie le caractre reprsentatif de la biopsie en nombre despaces mdullaires analysables. On value la richesse cellulaire et le caractre homogne ou htrogne de la rpartition des cellules mylodes. un plus fort grossissement, on apprcie le nombre des mgacaryocytes par espace mdullaire, le pourcentage appoximatif des cellules granuleuses et rythroblastiques. Lanalyse cytologique se fait conjointement avec ltude du mylogramme, plus riche en dtails cellulaires, et linterprtation nale est donne en tenant compte du contexte clinicobiologique.

14

Trocart biopsie mdullaire (Jamshidi). ARTEFACTS

Lidentication des populations cellulaires est cependant plus difficile sur coupes histologiques que sur les frottis dun mylogramme.
TECHNIQUE DE PRLVEMENT

On utilise habituellement un trocart de Jamshidi (g 14) usage unique de diamtre 11 gauge. Le trocart snarecoil de Goldenberg est semi-automatique, vitant les mouvements de rotation et rduisant le traumatisme du fragment mdullaire. Son cot est cependant beaucoup plus lev. La biopsie est ralise en pine iliaque antrosuprieure ou le plus souvent postrosuprieure. Un territoire prcdemment irradi est vit. Le sujet est en dcubitus ventral ou latral. Aprs dsinfection locale large avec un antiseptique iod, la zone ponctionner centre par un champ trou, les mains de loprateur protges par des gants striles, loprateur ralise une anesthsie locale allant jusquau prioste avec (selon lpaisseur des tissus) de 10 20 mL de lidocane 1 % ou mieux 2 %. Le trocart est introduit par voie percutane. Aprs contact osseux, il est introduit perpendiculairement los sur 5 mm, jusqu traverse de la corticale. Le trocart reste alors ch dans los ; le mandrin est retir et le trocart est enfonc sur 2 cm environ dans la cavit mdullaire par des mouvements de rotation alternatifs du poignet. Lattache infrieure du cylindre biopsi est rompue en effectuant des rotations dans un sens puis dans lautre. Le trocart est retir en tournant dans un seul sens et la carotte est chasse dans le liquide de xation avec un stylet introduit par la partie distale du trocart. Un pansement compressif est mis en place et laiss 48 heures. Lorsquune tude cytologique est ncessaire en mme temps que ltude histologique mdullaire, un mylogramme doit tre ralis aussitt aprs lanesthsie et avant la biopsie. La technique de l empreinte sur lames de la carotte biopsie est dconseille, car toujours de cellularit rduite et de mdiocre qualit.
PRPARATION DE LA BIOPSIE

Les biopsies tangentielles la crte iliaque ne permettent danalyser que de petits espaces sous-corticaux, qui sont souvent en involution adipeuse chez le sujet g. Une inltration srohmatique du tissu mylode peut soit expulser totalement les cellules, soit les dissocier, rendant impossible lapprciation exacte de la richesse mdullaire. Les logettes mdullaires peuvent tre articiellement vides de leur contenu lorsque le cylindre osseux biopsi est, tort, expuls en force par le stylet introduit par lextrmit proximale du trocart. Des lamelles osseuses, articiellement dplaces par la coupe dun bloc dinclusion, entranent avec elles des bres rticuliniques qui sorientent en faisceaux parallles faussement densis sous la direction du dplacement. La prparation technique doit tre parfaite : des coupes trop paisses et/ou imparfaitement colores ou surcolores peuvent amener des erreurs didentication des cellules.
HISTOLOGIE MDULLAIRE NORMALE

La moelle osseuse est faite de plusieurs compartiments anatomiques et fonctionnels contenus lintrieur dune structure osseuse : un rseau vasculaire, des cellules conjonctives associes des glycoprotines matricielles constituant un tissu de soutien ou stroma, et des cellules hmatopotiques.

Richesse mdullaire
Elle sapprcie semi-quantitativement en tenant compte de la proportion entre cellules hmatopotiques et adipocytes. Chez ladulte entre 20 et 60 ans, la proportion indiquant une richesse cellulaire normale est de 50 % (g 15). Il faut tenir compte des variations de la rpartition des cellules lintrieur dun espace ou dun groupe despaces o peuvent voisiner des zones de cellularits diffrentes. La richesse cellulaire varie avec lge. Linvolution adipeuse physiologique dbute ds lenfance et progresse avec lge. Les vsicules adipeuses reprsentent 20 ans 35 % de la moelle osseuse. Ce pourcentage augmente modrment jusqu 40 ans. partir de 70 ans, les vsicules adipeuses reprsentent 70 % du tissu mdullaire total.

Le fragment mdullaire prlev doit tre x dans du liquide de Bouin ou du B5 (xateur de Dubosq, base de mercure). Le formol est dconseill, sauf sil sagit dun formol en solution isotonique neutralise. La xation optimale est de 5 heures environ, mais peut se prolonger plusieurs jours sans inconvnient. Le prlvement subit ensuite une dcalcication lacide nitrique 5 % pendant 12 heures). Linclusion se fait habituellement en paraffine, permettant de raliser des coupes de 5 m. Linclusion en rsine plastique permet des coupes semi-nes de 2 3 m et une bien meilleure dnition des structures cellulaires. Les colorations utilises sont le May-Grunwald-Giemsa, lhmatineosine-safran et une coloration argentique pour rvler la trame de rticuline.
6

Structure osseuse
Le tissu hmatopotique est contenu dans des espaces mdullaires dlimits par un rseau labyrinthique de lamelles osseuses anastomoses entre elles. Les lamelles osseuses enserrant les ostocytes sont bordes par une lame conjonctive, lendoste, contenant les ostoblastes (dorigine conjonctive) et les ostoclastes (dorigine histiocytaire). Lendoste reprsente une zone dchange entre los et le tissu mylode.

Rseau vasculaire mdullaire


Le rseau vasculaire est reprsent sur les biopsies par des capillaires, prolongs par les sinusodes. Leur lumire est vide ou

Hmatologie

Cytologie et histologie mdullaires normales

13-000-A-30

16 15
Biopsie mdullaire normale.

Stroma rticulinique normal.

Cellules rticulaires broblastiques Ces cellules sont aussi dsignes par les termes de broblastes, myobroblastes, cellules rticulaires stromales, cellules adventicielles. Ces cellules noyau ovalaire prsentent des expansions cytoplasmiques lamenteuses anastomoses en rseaux tridimensionnels. Elles bordent la paroi externe des sinusodes. Elles nexpriment pas les marqueurs endothliaux ni les marqueurs histiocytaires. Elles nont pas dactivit phagocytaire. Elles sont spcialises dans la synthse de bres glycoprotiques (prcollagne ou rticuline) qui constituent le stroma brillaire rticulinique de la moelle. Macrophages Ils sont abondants dans la moelle et se situent en position adventicielle autour des sinusodes ou au centre des lots rythroblastiques. Ils phagocytent les noyaux des rythroblastes mrs et les cellules apoptotiques. Adipocytes Les adipocytes sont des cellules cytoplasme pratiquement vide, noyau refoul en priphrie. Ils forment de grandes vacuoles arrondies. Leur nombre est inversement proportionnel la richesse en cellules hmatopotiques. Ces cellules forment un tissu de remplissage qui entre dans la constitution du stroma mdullaire. Leur abondance est inversement proportionnelle la densit cellulaire mylode, disparaissant quand la moelle est hyperplasique ou occupant les espaces mdullaires quand lhmatopose diminue. Ils sont diffrents des adipocytes constituant la graisse dans lorganisme. Ils sont plus petits, riches en acides gras polyinsaturs, indiquant une fonction de rserve lipidique beaucoup moins importante. Ils drivent des cellules rticulaires broblastiques capables daccumuler rapidement des acides gras et dacqurir une activit enzymatique de type lipoprotine lipase. Composant brillaire Le stroma rticulinique est constitu de bres de prcollagne de type III ; il souligne le contour des adipocytes et ralise un rseau de mailles sur lequel reposent les massifs de cellules mylodes. Les membranes basales vasculaires des gros vaisseaux sont constitues de bres de collagne adulte de type I. La proprit argentaffine du prcollagne permet de rvler ce stroma par les colorations argentiques.

contient quelques globules rouges et de rares polynuclaires. Leur basale rticulinique est tapisse de cellules endothliales et sur leur surface externe sobservent des macrophages. La vascularisation est lun des lments essentiels de la microstructure mdullaire. Les artres nourricires de los donnent des ramications satellites, puis des artrioles se divisant en capillaires. Les sinusodes qui les prolongent ralisent un rseau anastomotique de sinus contourns . Ils sont collects dans les sinusodes droits aboutissant aux sinus centraux qui rejoignent les veines mergeant de los. Un rseau de lets nerveux double ce rseau vasculaire ; il est dot de fonctions vasomotrices favorisant les migrations cellulaires. La paroi des sinus est une zone dchange entre le sang circulant et les territoires hmatopotiques extravasculaires. La paroi comporte des cellules endothliales tapissant la face interne des capillaires sinusodes. Le revtement est continu, mince, renforc dans la zone du noyau. Les cellules sont jointives et se recouvrent leurs extrmits par juxtaposition. Cet endothlium permet le passage des cellules souches sanguines vers les niches dhmatopose (homing) et le passage vers le sang circulant des cellules mylodes parvenues maturation (diabase). La basale des sinus a une structure singulire, diffrente des basales des autres vaisseaux dans lorganisme. Elle prsente un aspect de condensation brillaire discontinue. Le passage des cellules est transendothlial, au travers dorices temporaires se crant dans le cytoplasme des cellules endothliales, au contact des cellules prtes la migration. Ces orices sont situs distance du noyau, proximit des jonctions interendothliales.

Stroma mdullaire
Le stroma conjonctif est rvl par la coloration argentique (g 16). Il se prsente sous laspect dun rseau grillag de courtes bres colores en noir, sous-tendant les massifs cellulaires, entourant les cellules adipeuses et renforant les basales des vaisseaux. Celles-ci sont renforces par du collagne adulte color par le trichrome de Masson. Ce stroma est constitu de cellules, de brilles de collagne et de macromolcules glycoprotiques. Les cellules du stroma sont dorigine conjonctive. Elles drivent dune cellule souche colony forming unit-broblastic, diffrente de la cellule souche hmatopotique. Elle a la capacit de se diffrencier en divers types cellulaires : cellules rticulaires broblastiques, cellules endothliales, adipocytes, ostoblastes. Le contact entre ces lments et les cellules mylodes est direct, mettant en jeu des molcules dadhsion dont les rcepteurs homologues sont ports par les cellules mylodes.

Compartiment cellulaire
lintrieur des espaces mdullaires limits par les lamelles osseuses, les cellules mylodes sont regroupes en massifs
7

13-000-B-10
Encyclopdie Mdico-Chirurgicale 13-000-B-10

Cytoponction ganglionnaire
F Valensi P Lemaire

Technique, analyse des frottis, valeur diagnostique


Rsum. La ponction ganglionnaire est une technique simple mais linterprtation des frottis est dlicate et pour tre performante doit tre parfaitement intgre lensemble des donnes clinicobiologiques du patient. Lors de la dcouverte dune adnopathie supercielle, la cytologie permet dviter une biopsie sil sagit dun ganglion ractionnel une affection bactrienne ou virale. Dans les pathologies tumorales, lorientation diagnostique donne par la cytologie permet dorganiser le reste du bilan diagnostique. La biopsie reste cependant ncessaire pour dautres investigations : histologie, marqueurs cellulaires, tude cytogntique et molculaire.
2000 Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Introduction
La pratique de la ponction de ganglions superciels et ltude des frottis obtenus aprs coloration du type May-Grnwald-Giemsa est peu rpandue en dehors de centres spcialiss. En effet, son interprtation na de valeur que si elle est parfaitement intgre dans le contexte clinicobiologique du patient. Il sagit dun geste simple, indolore lorsquil est pratiqu laiguille ne, permettant dans certains cas dviter une biopsie ganglionnaire [4]. Ces avantages sont indniables, mais linterprtation doit tre prudente et tenir compte de la taille du ganglion, de sa consistance, de sa localisation et du contexte clinique dans lequel est pratique la cytoponction. Il faut ajouter des rserves dordre technique lies au fait que la ponction explore une partie inme du ganglion qui, par nature, est htrogne. Il existe donc un risque dchantillonnage qui peut induire des erreurs dinterprtation. Un ganglion priphrique accessible la ponction est un ganglion hypertrophi. Cette augmentation de volume peut tre ractionnelle une pathologie infectieuse ou une maladie systmique. Selon laffection, lhyperplasie du ganglion peut concerner plus particulirement les zones B ou T du ganglion. Dans les pathologies tumorales (mtastase ou lymphome), le ganglion est le sige dune inltration diffuse ou partielle aux dpens des structures normales.

Lymphocyte

Centrocyte

Lymphoblaste

Centroblaste

Immunoblaste Cellule lymphoplasmocytaire Plasmocyte Reprsentation schmatique des cellules lymphodes normales identiables sur un frottis ganglionnaire.

Catgories cellulaires identiables


Le classement des cellules lymphodes identiables par catgories facilite le descriptif cellulaire (g 1) (tableau I) [1]. Il ne rete pas toutes les formes de passage entre une cellule et une autre et donc le polymorphisme que lon observe sur les frottis ganglionnaires. De

plus la nature B ou T des cellules, hormis les plasmocytes, ne peut pas tre dtermine formellement sur leur seul aspect morphologique. Il faut en effet souligner que des cellules T actives ne sont pas trs diffrentes des cellules B transformes. Ladnogramme ou expression en pourcentage de chacune des catgories cellulaires ne prsente donc pas dintrt diagnostique.

Technique de ponction
Franoise Valensi : Matre de confrences des Universits, praticien hospitalier, laboratoire dhmatologie, hpital Necker-Enfants Malades, 149, rue de Svres 75743 Paris cedex 15, France. Pierre Lemaire : Attach au laboratoire dhmatologie, hpital Laennec, 42, rue de Svres, 75007 Paris, France.

Le ganglion est immobilis entre deux doigts pour permettre la ralisation de la ponction. Celle-ci est effectue avec une aiguille ne

Toute rfrence cet article doit porter la mention : Valensi F et Lemaire P. Cytoponction ganglionnaire. Technique, analyse des frottis, valeur diagnostique. Encycl Md Chir (Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS, Paris, tous droits rservs), Hmatologie, 13-000-B-10, 2000, 11 p.

13-000-B-10

Cytoponction ganglionnaire

Hmatologie

Tableau I. Caractristiques morphologiques principales des cellules lymphodes normales identiables sur un frottis ganglionnaire.
Taille
Lymphocyte Centrocyte Lymphoblaste Centroblaste Immunoblaste Plasmocyte Cellule lymphoplasmocytaire petite petite moyenne grande grande grande petite clair clair clair clair basophile basophile basophile

Cytoplasme

Noyau
rgulier encoch irrgulier rgulier rond rond excentr rgulier

Chromatine
dense dense ne ne intermdiaire dense intermdiaire absent absent

Nuclole
lev lev lev lev bas bas bas

N/C

prsent prsent prsent absent absent

N/C : rapport nuclocytoplasmique.

et courte [2], en faisant plusieurs aller et retour dans le ganglion, accompagns dune rotation de laiguille pour dcoller le suc cellulaire. Puis laiguille est retire sans aspiration an de ne pas altrer la morphologie des cellules. Le contenu de laiguille est ensuite projet sur une ou deux lames et tal. Lopration peut tre reproduite une deuxime fois dans une autre zone du ganglion si celui-ci est volumineux. Laspiration cellulaire est conseille en cas de ncrose an de retirer suffisamment de matriel pour un examen bactriologique. De mme, si le ganglion parat de constitution breuse et la ponction blanche , laspiration permet dobtenir du matriel cellulaire qui, bien qualtr, peut orienter le diagnostic. Nature de la tumfaction ponctionner : la topographie des adnopathies permet en gnral dassurer que la tumfaction est de nature ganglionnaire. Dans certains cas, il savre que la tumfaction est dorigine glandulaire (salivaire, thyrodienne) ou dune autre nature (lipome, kyste, hernie). La seule contre-indication la ponction est celle de la nature vasculaire de la tumfaction suspecte la palpation ou alors celle dune localisation juxtavasculaire du ganglion.

Analyse des frottis et valeur diagnostique


[5]

Adnite infectieuse : frottis polymorphe.

GANGLIONS RACTIONNELS ET PATHOLOGIES NON MALIGNES

Situations o la cytologie est vocatrice du diagnostic


Hyperplasie folliculaire Cest la situation la plus frquente. Laiguille pntre dans cette structure organise mais polymorphe, compose de cellules lymphodes B toutes les tapes de leur transformation, de lymphocytes T, de cellules dendritiques et de macrophages. Morphologiquement, on peut identier des lymphocytes, des lymphoblastes, des centroblastes, des immunoblastes, des plasmocytes, des cellules daspect lymphoplasmocytaire, quelques polynuclaires (neutrophiles ou osinophiles), des histiocytes, des macrophages (g 2). Ces aspects vocateurs dhyperplasie folliculaire sont observs au cours daffections bactriennes ou virales. Ils nont pas de relle spcicit mais la ractivit ganglionnaire particulire certains agents pathognes permet de donner une orientation diagnostique. Toxoplasmose (g 3) : lapparition dadnopathies est un des signes dappel de la maladie. La cytoponction montre un tableau dhyperplasie folliculaire avec parfois une composante immunoblastique importante et des cellules pithliodes isoles ou en petits amas. Les parasites ne sont pas prsents. Mononuclose infectieuse (g 4) : la prsence dadnopathies fait partie du tableau clinique et biologique de la maladie. Sur le frottis,
2

on observe une population trs polymorphe o se mlent des lymphocytes banals, des lymphoblastes, des immunoblastes, des cellules lymphoplasmocytaires et parfois des plasmocytes. Lobservation du frottis sanguin permet de retrouver le mme polymorphisme cellulaire et de conrmer le diagnostic de syndrome de type mononuclosique. Infection par le virus de limmunodcience humaine (VIH) : la survenue dadnopathies au cours dune infection VIH est frquente. Elles sont lies une pathologie ractionnelle, une infection opportuniste ou une pathologie tumorale (lymphome ou sarcome de Kaposi). La cytoponction a un rle important dorientation diagnostique dans ce cadre. Adnites granulomateuses galement vocatrices, elles sont caractrises par une hyperplasie de cellules pithliodes : cellules histiocytaires de grande taille avec cytoplasme tendu, clair, bien limit, le noyau est allong ou ovalaire, la chromatine rgulire, avec un ou deux petits nucloles. Tuberculose ganglionnaire (g 5) : le diagnostic peut tre pos par la ponction si toutes les composantes de la lsion sont prsentes sur le frottis : ncrose caseuse avec des dbris cellulaires mais aussi des lymphocytes, des cellules pithliodes en amas et parfois des cellules gantes. Sarcodose (g 6) : les ganglions priphriques sont trs souvent atteints. Bien que la preuve histologique soit ncessaire au diagnostic, laspect cytologique du ganglion constitue une bonne orientation. Elle pose cependant un problme de diagnostic

Hmatologie

Cytoponction ganglionnaire

13-000-B-10

* A
9
Mtastase de carcinome. A. Amas de cellules cohsives ( 10). B. Amas de cellules cohsives ( 40).

* B

* A
10
Adnocarcinome. A. Amas de cellules ( 40). B. Autre exemple ( 40).

* B

Glandes sudoripares : on peut observer des cellules sudoripares soit mles du tissu lymphode lors de la ponction dun ganglion axillaire, soit isoles, si la tumfaction ponctionne est une glande sudoripare hypertrophie. Les cellules sont souvent regroupes, de grande taille, avec un noyau excentr et un cytoplasme tendu, de coloration variable, contenant de grosses granulations violaces. Lhypothse de mtastase de carcinome qui peut tre voque au petit grossissement sur la prsence damas de cellules, est ensuite carte en raison de la rgularit des cellules et de leurs granulations caractristiques. Sac herniaire : la ponction dune tumfaction inguinale peut rapporter une substance liquidienne qui, aprs centrifugation, montre un mlange de macrophages, de lymphocytes et de cellules msothliales comparable celui dun liquide dpanchement ractionnel.
PATHOLOGIES TUMORALES

Mtastases ganglionnaires
La cytologie ganglionnaire peut tre le premier examen rvlateur dune mtastase de carcinome. La cytoponction peut tre aussi pratique dans le cadre dun bilan dextension ou au cours de lvolution dun carcinome avr lors de la rapparition dune adnopathie. Aspects cytologiques vocateurs Adnocarcinome : la localisation du ganglion varie selon la tumeur dorigine. Le diagnostic de mtastase est voqu sur la prsence damas cohsifs de cellules de grande taille prsentant une variabilit de taille nuclaire (anisocaryose) et de forme, avec des noyaux arrondis, ovalaires ou de forme beaucoup plus irrgulire (g 9). La nature glandulaire est prsume sur lextension du cytoplasme et son contenu : granulations, vacuoles, inclusions mucoscrtantes (g 10) qui peuvent tre volumineuses et raliser laspect en bague chaton caractristique des adnocarcinomes dorigine gastrique (ganglion de Troisier, sus-claviculaire gauche) ou colique mais aussi qui peuvent se voir dans les mtastases de cancer du sein (localisation axillaire). Carcinome pidermode (g 11) : la localisation du ganglion se situe le plus souvent dans la rgion cervicale en raison de lorigine otorhino-laryngologique ou digestive haute de la tumeur. Le frottis
5

Lors du diagnostic initial, une cytoponction mme diagnostique ne permettra pas dviter la biopsie ; elle peut cependant orienter les examens pratiquer sur le ganglion biopsi : marqueurs cellulaires, examen cytogntique, analyse molculaire, ainsi que le bilan dextension de la maladie. Au cours de lvolution, une cytoponction ganglionnaire dinterprtation non ambigu peut tre suffisante.

13-000-B-10

Cytoponction ganglionnaire

Hmatologie

mtastase ganglionnaire peut parfois prcder la dcouverte de la lsion cutane. Cest une prolifration de cellules de grande taille, peu cohsives, avec un noyau plutt arrondi ou ovale et un cytoplasme tendu. Le diagnostic est vident si certaines de ces cellules contiennent de nombreuses granulations nes de coloration verdtre ou des granulations de la mme couleur, plus volumineuses, masquant parfois le noyau. Le diagnostic est plus difficile si les cellules granulaires sont rares. Si elles sont absentes (mlanome achromique), le diagnostic de prolifration tumorale est fait, il est vocateur dune mtastase de carcinome indiffrenci grandes cellules mais labsence de regroupements cellulaires trs cohsifs ne permet pas dexclure un lymphome grandes cellules. Cytologie non diagnostique Dans de nombreuses autres situations, le diagnostic de mtastase ganglionnaire est port, lorigine de la tumeur suspecte sur certaines particularits morphologiques mais ne peut tre affirme : neuroblastome, adnocarcinome papillaire thyrodien, adnocarcinome rnal cellules claires, sminome, rhabdomyosarcome, etc. Enn, dans dautres cas, lorigine de la tumeur est impossible dterminer.

11

Carcinome pidermode : amas de cellules cohsives sur fond de ncrose ( 40).

ganglionnaire montre, dans un contexte de ncrose, des regroupements de cellules noyaux de taille variable associs des cellules isoles dont la nature malpighienne est plus vidente que sur les amas. Il sagit de cellules de grande taille, de forme globalement arrondie ou fusiforme avec un petit noyau hyperchromatique et un cytoplasme tendu. La nature malpighienne bien diffrencie est voque sur la coloration du cytoplasme qui va du gris bleut un bleu presque turquoise Carcinome bronchique indiffrenci petites cellules (g 12) : la forme typique est caractrise par la prsence damas de cellules noyau plus ou moins irrgulier, au cytoplasme peu tendu. Le diagnostic de lymphome peut tre discut en raison de laspect pseudohmatopotique des cellules (taille, rapport nuclocytoplasmique lev, chromatine ne), mais les arguments suivants doivent faire exclure ce diagnostic de faon formelle : la cohsion des amas cellulaires avec une bonne conservation des cellules au sein de lamas et une fragilit des cellules ds quelles sont en bordure avec une modication nette de laspect chromatinien qui devient plus lche ; un contexte de ncrose comportant des images caractristiques dinclusions arrondies intracellulaires de coloration bleute. Mlanome (g 13) : lextension dun mlanome cutan des ganglions satellites de la lsion est frquente. Le diagnostic dune

Lymphomes
Les circonstances de dcouverte dun lymphome hodgkinien ou non hodgkinien se font le plus souvent devant une adnopathie isole, une polyadnopathie. La ponction ganglionnaire constitue lun des premiers examens dorientation diagnostique. Lors du diagnostic initial, mme si le diagnostic cytologique est trs vocateur, la biopsie sera de toute faon effectue pour caractriser histologiquement le lymphome, raliser limmunophnotype qui est indispensable au diagnostic et rserver un fragment pour une tude cytogntique et une analyse molculaire [3]. Aspects cytologiques vocateurs Maladie de Hodgkin (g 14) : le diagnostic de maladie de Hodgkin repose sur lidentication des cellules de Sternberg dans un environnement fait de petits lymphocytes, de plasmocytes, de cellules histiocytaires et pithliodes, de polynuclaires osinophiles. La cellule de Sternberg typique est une cellule de grande taille noyau volumineux et irrgulier avec une chromatine lche et un ou plusieurs nucloles prominents de coloration basophile. Le cytoplasme est tendu, plutt clair, avec un contour mal limit. Si tous ces lments sont runis, le diagnostic de maladie de Hodgkin peut tre affirm. Ltude histologique prcisera le stade histologique et conrmera le diagnostic par ltude des marqueurs

* A
12
Carcinome bronchique petites cellules. A. Amas de cellules peu cohsives ( 40). B. Cellules indiffrencies daspect pseudohmatopotique ( 100).

* B

Hmatologie

Cytoponction ganglionnaire

13-000-B-10

* A
13
Mlanome. A. Amas de cellules dont certaines sont pigmentes ( 40). B. Cellule tumorale pigmente ( 100).

* B

* A
14
Maladie de Hodgkin. A. Lymphocytes, polynuclaire osinophile, cellule de Sternberg ( 40). B. Cellule de Sternberg ( 100).

* B

cellulaires (CD30, CD15). Bien quil existe dautres cellules de grande taille dans un ganglion de maladie de Hodgkin, seule la cellule de Sternberg a une valeur diagnostique. Les autres grandes cellules ont un noyau arrondi, un cytoplasme basophile, un nuclole moins volumineux, et peuvent tre rencontres dans des lymphomes non hodgkiniens grandes cellules ou anaplasiques, ainsi que dans des ganglions ractionnels avec hyperplasie folliculaire importante. Lymphome de Burkitt ( cellules B) (g 15) : la cytologie ganglionnaire des lymphomes de Burkitt, dans leur forme typique, prsente des caractristiques qui permettent de poser un diagnostic sr. Il existe une inltration assez monomorphe de cellules lymphodes de taille moyenne avec un cytoplasme trs basophile souvent vacuolis, le noyau est arrondi, la chromatine bien dessine mais pas trop dense, la prsence de nucloles est variable. La prsence de nombreuses mitoses et de macrophages ractionnels chargs de corps tingibles, bien que nayant aucun caractre de spcicit, est frquente. Dans dautres formes, les cellules de grande taille sont nombreuses et le noyau prsente des irrgularits nuclaires assez nettes ; la forte basophilie du cytoplasme reste le caractre le plus constant. Dans tous les cas, le diagnostic est conrm par ltude histologique et immunohistochimique, ainsi que par la mise en vidence des anomalies chromosomiques caractristiques du lymphome de Burkitt, principalement la t(8 ; 14).

Lymphome lymphoblastique : ils sont souvent de type T et saccompagnent alors datteinte mdiastinale. Ils atteignent galement frquemment la moelle osseuse. Dans ces cas, la distinction avec une leucmie aigu lymphoblastique est smantique. Lymphome B grandes cellules : il existe une assez grande variabilit dans la prsentation cytologique de ces lymphomes, dans la taille des cellules, dans la basophilie du cytoplasme qui peut tre plus ou moins marque, et dans la forme nuclaire qui peut tre arrondie ou trs irrgulire (g 16). Dans de rares cas, on peut voir une diffrenciation plasmocytaire sur une partie des cellules. Lymphome folliculaire (g 17) : le lymphome folliculaire est dni par son architecture faite de nodules rpartis sur toute ltendue du ganglion. Il sagit donc dune dnition histologique. Cependant, les caractristiques cytologiques de certains lymphomes folliculaires, en particulier les lymphomes prdominance de petites cellules, sont suffisamment nettes pour faire voquer ce diagnostic. Il sagit dun inltrat o prdominent des cellules lymphodes de petite taille (dorigine centrocytique), avec un cytoplasme clair trs peu tendu, un noyau arrondi travers par une encoche profonde ou dform par de petites indentations ; la chromatine est assez dense. Il existe
7

13-000-B-10

Cytoponction ganglionnaire

Hmatologie

* A
15
Lymphome de Burkitt ( 100).

* B

* A
16
Lymphome grandes cellules. A, B. Type immunoblastique ( 40 et 100). C. Grandes cellules noyau irrgulier ( 40).

* B

* C
par ailleurs, et en quantit variable, des cellules lymphodes de plus grande taille (dorigine centroblastique), dont la chromatine est plus ne. Les cellules dendritiques sont frquentes et reconnaissables en raison de leur binuclarit. Lymphome du manteau (g 18) : dans sa forme typique, il sagit dune prolifration assez monomorphe de cellules lymphodes de taille moyenne, avec un cytoplasme peu tendu et clair, un noyau
8

aux contours irrguliers, une chromatine de densit variable ; le nuclole est visible dans certaines cellules. Dans les formes leucmiques, laspect polymorphe des cellules circulantes peut aider au diagnostic. Le lymphome du manteau se distingue des localisations ganglionnaires des leucmies lymphodes chroniques (LLC) qui, malgr une population lymphocytaire sanguine monomorphe (g 19), prsentent sur les frottis de cytoponction,

Hmatologie

Cytoponction ganglionnaire

13-000-B-10

* A
17
Lymphome folliculaire. A. Petites cellules lymphodes ( 40). B. Sang : lymphocytes clivs ( 100).

* B

* A
18
Lymphome du manteau. A. Cellules lymphodes de tailles petite et moyenne ( 100). B. Sang : frottis polymorphe ( 100).

* B

Syndrome de Richter au cours dune LLC : au cours de lvolution dune LLC, la rapparition de ganglions incite vrier, par la cytoponction, une ventuelle progression ou transformation de la maladie. Le syndrome de Richter est dni par une transformation en lymphome B grandes cellules. Lymphome T associ au virus HTLV1 (human T-cell lymphoma virus 1) (g 20) : ce type de lymphome est particulier par sa distribution gographique (sud-est du Japon, Carabes, Afrique) et par sa liaison au rtrovirus HTLV1 qui est intgr de faon clonale dans les noyaux des cellules tumorales. La prsentation clinique est variable. Dans la forme lymphomateuse, lapparition dadnopathies est le premier point dappel clinique. La cytoponction montre une inltration polymorphe faite dune majorit de grandes cellules cytoplasme trs basophile et noyau souvent irrgulier. Le diagnostic est plus ais dans les formes leucmises en raison de la prsence dans le sang, au sein de la population tumorale, des cellules caractristiques cytoplasme basophile et noyau irrgulier daspect foli.

19

Leucmie lymphode chronique : sang ( 100), frottis monomorphe.

Cytologie non diagnostique Dans dautres cas, le diagnostic de lymphome est fait mais le type du lymphome ne peut pas tre prcis : lymphome T priphrique : la prolifration comporte des cellules lymphodes de taille moyenne grande, noyau parfois irrgulier.
9

outre les lymphocytes similaires ceux du sang, un excs de cellules lymphodes nucloles (prolymphocytes) et dimmunoblastes.

13-000-B-10

Cytoponction ganglionnaire

Hmatologie

* A
20
Leucmie/lymphome T de ladulte (ATL) li au virus HTLV1. A. Grandes cellules ( 40). B. Grandes cellules ( 100). C. Sang : cellule noyau foli ( 100).

* B

* C

* A
21
Histiocytose langerhansienne : A. Lymphocytes et cellules de Langerhans ( 100).

* B
B. Marquage par le CD1 (immunoperoxydase) : cellules histiocytaires positives ( 100).

Cest la composante de grandes cellules qui permet daffirmer le caractre tumoral de la population. La nature T des cellules sera conrme par ltude immunohistochimique ; lymphome anaplasique grandes cellules CD30+ : il sagit dune prolifration plomorphe avec de nombreuses cellules de grande
10

taille noyau irrgulier parfois nuclol. Sur le plan cytologique, ce lymphome pose un problme de diagnostic diffrentiel avec une mtastase ou une maladie de Hodgkin. Enn, dans certaines prolifrations daspect polymorphe, lhypothse de lymphome nest pas sre car les caractristiques

Hmatologie

Cytoponction ganglionnaire

13-000-B-10

morphologiques des cellules tumorales ne sont pas suffisantes pour les distinguer de cellules lymphodes actives : lymphome B lymphoplasmocytaire : la prolifration est constitue de petites cellules et de cellules diffrenciation lymphoplasmocytaire ; lymphome T de type lymphadnite angio-immunoblastique : la prolifration est constitue de lymphocytes, de lymphoblastes et dimmunoblastes.
HISTIOCYTOSE LANGERHANSIENNE (g 21)

inltrat de cellules non cohsives de grande taille. Leur cytoplasme est abondant et clair, le noyau est excentr, arrondi, caractris par la prsence de replis ou dincisures profondes qui naltrent pas toujours la forme nuclaire ; la chromatine est nement dessine. Le diagnostic de certitude est port sur limmunomarquage des cellules par lanticorps CD1a qui signe la nature langerhansienne de la prolifration.

Rfrences
[1] Brousse N. La biopsie ganglionnaire. Ann Pathol 1996 ; 16 : 219-224 [2] Buley ID. Fine needle aspiration of lymph nodes. JClin Pathol 1998 ; 51 : 881-885 [3] De Wolf-Peeters C, Delabie J. Anatomy and histopathology of lymphod tissue. Semin Oncol 1993 ; 20 : 555-569 [4] Felman P, Gentilhomme O. Atlas de cytopathologie ganglionnaire. Paris : Arnette, 1997 [5] Solal-Cligny P, Brousse N, Ferm C, Gisselbrecht C, Reyes F, Coiffier B. Lymphomes. Paris : Frison-Roche, 1997

Le spectre clinique de lhistiocytose langerhansienne est vaste allant de formes localises des atteintes multiviscrales. Cest la raison pour laquelle cette maladie nest pas classe parmi les pathologies malignes bien que la clonalit des cellules ait t dmontre. Les adnopathies sont prsentes au cours de la forme diffuse de lenfant. Le frottis ganglionnaire montre au sein des cellules lymphodes un

11

Encyclopdie Mdico-Chirurgicale Fa 13-000-M-10

Fa 13-000-M-10

Fiche additive : Utilisation des mthodes isotopiques en hmatologie


JD Rain

Scintigraphie au 18-uorodsoxy-glucose en hmatologie


Rsum. Les lymphomes sont une des meilleures indications de la tomographie par mission de positons (TEP) grce au 18-uoro-dsoxy-glucose (18-FDG) qui a la proprit de se concentrer dans les cellules malignes. La scintigraphie au 18-FDG a un rle important tous les stades de lvolution des lymphomes : bilan dextension au dpart ou lors des rechutes, caractrisation des masses rsiduelles, valuation des rponses thrapeutiques, tablissement du pronostic. Le dveloppement de cette nouvelle technique dimagerie est pour linstant trs limite en France o il nexiste que deux installations ddies la clinique et o lexamen nest pas rembours par la Scurit sociale.
2000 Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Introduction
Lutilisation clinique de la technologie PET (positron emission tomography), TEP en franais (tomographie par mission de positons) marque une nouvelle tape dans les progrs de limagerie mdicale. En effet, le 18-uoro-dsoxy-glucose (18-FDG) donne une image des lsions malignes en fonction de laugmentation du mtabolisme glucidique de la tumeur et non pas de ses modications anatomiques. La TEP au 18-FDG permet de raliser une imagerie fonctionnelle des cancers, ce qui entrane un gain considrable de spcicit par rapport limagerie anatomique classique chographie, tomodensitomtrie (TDM), rsonance magntique nuclaire qui ne dispose, pour affirmer le caractre pathologique dune image, que de la notion daugmentation de taille ou de modication de la structure, critres peu spciques, et en retard sur les modications biologiques. La technologie TEP date des annes 1970, mais cest depuis moins de dix ans que son utilisation en clinique cancrologique sest rpandue dans les pays industrialiss (100 camras TEP sont installes aux tats-Unis, 55 en Allemagne, 15 en Belgique, 15 en Italie, 20 en Grande-Bretagne). En France, il existe quatre centres TEP vocation de recherche exclusive ou trs prdominante. Deux installations ddies la clinique ont t ouvertes Paris en 1999, deux autres vont ouvrir en lan 2000, lune Rennes, lautre Nantes. Les obstacles au dveloppement de cette technologie sont nombreux du fait des cots dinvestissement (6 14 millions de francs) et surtout de fonctionnement (un examen revient 6 000 F). Lacquisition de cet appareil ncessite une autorisation ministrielle en fonction de la carte sanitaire des gammacamras, qui est dj sature. Lexamen nest pas codi par la Scurit sociale et nest donc pas rembours en France, ce qui nest pas le cas ltranger o la majorit des assurances publiques ou prives le rembourse dans

le cadre des indications cancrologiques actuellement bien reconnues. La difficult dobtenir rgulirement et en quantit suffisante le 18-FDG est un autre obstacle de taille.

Caractristiques biologiques du 18-FDG


Parmi les metteurs de positons (11C, 13N, 15O, 18F), le uor 18 tient une place privilgie. Sa priode de 110 minutes permet de le transporter distance du lieu de production, ce qui nest pas le cas des trois autres metteurs dont la priode est trs courte. Surtout le 18 F, marqueur du dsoxyglucose, a la proprit de se concentrer dans les cellules malignes dont le mtabolisme glucidique est augment. Un taux augment de glycolyse arobie dans les tumeurs a t observ par Warburg [33] ds 1931. Ce phnomne est li une augmentation du nombre de transporteurs membranaires du glucose [9] et une augmentation de lactivit des principales enzymes contrlant le mtabolisme du glucose. La transformation maligne dune cellule saccompagne dune lvation des capacits fonctionnelles des cinq transporteurs connus du glucose (GLUT 1 5), en particulier de GLUT1 [7]. Lincorporation du 18-FDG dans une tumeur dpend du dbit sanguin rgional, de linammation pritumorale, du pH, de loxygnation tissulaire [32]. Aprs pntration dans la cellule par diffusion, le 18-FDG est le substrat de lhexokinase, premire enzyme de la glycolyse. Il est phosphoryl en FDG-6-phosphate. La seconde enzyme, glucose-6-phosphate isomrase, qui transforme le glucose-6-phosphate en fructose-6-phosphate ne ragit pas avec le FDG-6-phosphate. Ainsi, le FDG-6-phosphate saccumule dans la cellule tumorale. La concentration en 18F de la cellule est troitement corrle la quantit de FDG-6-phosphate accumule et lactivit glycolytique du glucose exogne [8]. De nombreuses tudes ont tabli des relations entre la xation de FDG dans la cellule tumorale et les proprits biologiques de la tumeur en ce qui concerne le grade histologique [27], lactivit prolifrative [23], le temps de doublement, le nombre de cellules tumorales viables [17]. La xation du 18-FDG peut donc tre considre comme un indicateur de la malignit dune tumeur. Toutefois, certaines affections non malignes entranent

Jean-Didier Rain : Professeur des Universits, praticien hospitalier, service de mdecine nuclaire, hpital Saint-Louis, 1, avenue Claude-Vellefaux, 75010 Paris, France.

Toute rfrence cet article doit porter la mention : Rain JD. Scintigraphie au 18-uoro-dsoxy-glucose en hmatologie. Encycl Md Chir (Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS, Paris, tous droits rservs), Hmatologie, Fa 13-000-M-10, 2000, 6 p.

Fa 13-000-M-10

Scintigraphie au 18-uoro-dsoxy-glucose en hmatologie

Hmatologie

Tableau I. Performances des diffrents systmes de dtection de positons.


Sensibilit relative
Camra CDET TEP moyenne performance TEP haute performance 1 3-5 20-30

Taux de comptage (concidences maximales) (kcps)


20-40 100-150 500-600

Index qualit (kcps)


1-5 30-50 100-150

Concentration radioactive maximale (kBq/mL)


1-10 10-20 20-40

CDET : coincidence detection emission tomographie ; TEP : tomographie par mission de positons.

aussi une augmentation de la consommation locale de glucose, en particulier les lsions inammatoires et granulomateuses, ce qui peut tre cause de faux positifs du 18-FDG dans la dtection des tumeurs malignes. Le 18-FDG se localise prfrentiellement dans les organes mtabolisme glycolytique lev, en particulier le cortex crbral et, un moindre degr, le foie. La xation myocardique est fonction des conditions mtaboliques et de ltat nutritionnel du patient (xation faible jeun). Les reins concentrent le traceur, qui slimine vite dans la vessie. La xation musculaire peut tre diminue par le repos complet du patient lors de linjection. Le 18-FDG a obtenu en France lautorisation de mise sur le march (AMM) la n de lanne1998 pour des indications cancrologiques prcises et restrictives, parmi lesquelles les lymphomes ont une place de choix. Lindication reconnue est le bilan dextension initial, le suivi thrapeutique prcoce, la recherche de masse rsiduelle.

moins 4 heures. La scintigraphie est ralise 1 heure aprs linjection pour augmenter le contraste entre la tumeur et le bruit de fond. Une diurse provoque par absorption hydrique suffisante ou par furosmide intraveineuse et une miction juste avant lexamen sont ncessaires. Lacquisition des images dure 1 heure environ et varie suivant le mode dacquisition (2D, 3D, corps entier) et le type dappareil. Si une tomographie crbrale est effectue, 30 minutes supplmentaires sont ncessaires.

Intrt clinique du 18-FDG en hmatologie


Nous limitons ce travail lintrt du 18-FDG dans les lymphomes, seule indication reconnue dans lAMM. Les autres publications portant sur le 18-FDG en hmatologie sont exceptionnelles et leur apport na pas encore t conrm.
DTECTION DES SITES TUMORAUX

Appareillage
La description dtaille de lappareillage sort des limites du prsent ouvrage. La TEP repose sur lutilisation dune camra scintillations qui dtecte et localise, grce un systme de circuit en concidence, les rayonnements gamma de 511 keV mis par les metteurs de positons (uor 18) lors de leur annihilation. Deux types dappareil peuvent tre utiliss : les TEP ddies et les camras conventionnelles. Les TEP ddies se prsentent comme un scanographe form dun statif avec un trou central dans lequel avance le lit du patient. Ce trou est entour dun anneau de dtecteurs faits de petits cristaux coupls des photomultiplicateurs. Les caractristiques des diffrents appareils sont laffaire des spcialistes. La camra peut fonctionner en mode 2D ou 3D et faire des acquisitions corps entier. Les camras conventionnelles peuvent tre modies pour la dtection de positons. Elles sappellent alors camras CDET (coincidence detection emission tomography). Leur valuation clinique est en cours. Ces camras ont lavantage, par rapport la TEP ddie, dun cot bien moindre (proche de celui dune gammacamra ordinaire) et dune utilisation possible dans une large gamme de radiotraceurs. Lvaluation des performances de ces deux types dappareil tient compte de la rsolution spatiale, de lordre de 5 mm, de la sensibilit et du taux de comptage. Le tableau I rsume les performances des diffrents systmes. Malgr des performances thoriques bien moindres, les camras CDET semblent dj donner, pour la routine clinique, des renseignements dun grand intrt. Le choix entre ces deux types dappareil dpendra surtout de limportance du centre de soins et de son budget. Les mthodes dimagerie conventionnelle pour faire le bilan dextension dune maladie de Hodgkin ou dun lymphome non hodgkinien (LNH) ont volu avec le temps. la radiographie thoracique et la lymphographie ont succd lchographie, la TDM, limagerie par rsonance magntique (IRM), la scintigraphie au 67Ga. Lidentication dun potentiel envahissement ganglionnaire par TDM ou IRM est essentiellement fonde sur la taille du ganglion. Toutefois, mme de petits ganglions peuvent tre envahis et, linverse, de gros ganglions peuvent tre bnins [1]. Pour mettre en vidence les performances du 18-FDG, les rsultats de la TEP doivent tre compars ceux des autres modes dimagerie. Si les faits sont concordants entre TDM et TEP au niveau dun site, celui-ci est considr comme vrai positif ou vrai ngatif. Les rsultats discordants entre les deux techniques sont vris par biopsie ou jugs daprs lvolution. Dans quelques cas cependant, aucune preuve histopathologique ne peut tre obtenue, en raison de considrations thiques, du refus de consentement du patient, de labsence de consquence thrapeutique de la prsence ou non de telle localisation. Ces limitations diagnostiques expliquent que, dans les lymphomes, beaucoup de publications ne donnent pas les performances du 18-FDG en termes de sensibilit et de spcicit.

Dtection des lsions ganglionnaires


Les premiers travaux sont dus Paul [24] en 1987, Leskinen-Kallio [16] en 1991 et Okada [23] en 1992. Paul [24], dans une tude portant sur cinq patients atteints de LNH, dtecte par le 18-FDG des lsions chez quatre patients sur cinq, tandis que le 67Ga nen dtecte que chez deux sur cinq. LeskinenKallio [16] constate que la xation de 18-FDG est proportionnelle au grade histologique du lymphome : les tumeurs les plus agressives xent plus de 18-FDG. Quelques tumeurs de bas grade ne sont pas dtectes. Comparant chez 14 patients la TEP avec la 11C-mthionine et avec le 18-FDG, il constate que la 11C-mthionine est meilleure pour la dtection tandis que le 18-FDG est meilleur pour prciser le grade de la tumeur. Okada [23] a explor 19 LNH de la tte et du cou et deux maladies de Hodgkin laide du 18-FDG. La majorit des LNH tait de grade intermdiaire, sauf un cas de bas grade et un de

Droulement pratique de lexamen


Lexamen dure au total environ 2 heures. Ds son arrive, le traceur est inject par voie intraveineuse au patient plac au repos (si besoin sous diazpam) et en dcubitus. Lactivit moyenne injecte se situe entre 200 et 400 MBq de 18-FDG. Le patient est jeun depuis au
2

Hmatologie

Scintigraphie au 18-uoro-dsoxy-glucose en hmatologie

Fa 13-000-M-10

Tableau II. Rsultats de ltude par tomographie par mission de positons (TEP) au 18-uoro-dsoxy-glucose (18-FDG) et tomodensitomtrie (TDM) de 60 lymphomes explors (daprs Moog [18]).
TEP et TDM
Ganglions dtects Vrais positifs Faux positifs Non rsolus 160 160 0 0

TEP seule
25 7 2 16

TDM seule
6 0 3 3

sensibilit du 18-FDG est de 86 % dans la maladie de Hodgkin, 89 % dans les LNH et la spcicit respectivement de 96 % et 100 %. Pour la TDM, la sensibilit nest pas signicativement diffrente mais la spcicit est nettement moins bonne, 41 % et 67 % respectivement. Dans ltude de Jrusalem et Rigo [14] portant sur 60 patients, lapport du 18-FDG pour la dtection des localisations ganglionnaires est certain, mais pas trs important par rapport la clinique et la TDM. Des ganglions supplmentaires sont reprs, grce au 18FDG chez 15 patients, par lexamen clinique et la TDM chez 11 patients. Au total, la TEP a modi le stade de la maladie dans deux cas.

Dtection des lsions extraganglionnaires


haut grade. Une captation anormale du 18-FDG a t retrouve chez tous les patients tandis que le 67Ga ntait positif que chez 20 patients sur 21. Le LNH de bas grade xait moins le 18-FDG. Une corrlation est signale entre la xation du 18-FDG et le taux de prolifration tumorale. Plus la xation du 18-FDG est leve, moins le pronostic est bon. Newman [22] a compar les rsultats de la TEP avec ceux de la TDM dans 16 cas de LNH dhistologie varie. Le 18-FDG a mis en vidence 54 anomalies chez 13 patients, la TDM nen a trouv que 49. Aucun faux ngatif na t constat avec le 18-FDG. Rodriguez [27] a mesur dans 23 cas de LNH de grades diffrents (11 de haut grade, 9 de bas grade, 3 de bas grade transform) les paramtres de xation sur les tumeurs du 18-FDG. Ces paramtres de xation sont trs diffrents suivant les grades du lymphome. Les premiers travaux sur la dtection des localisations lymphomateuses par le 18-FDG font apparatre deux faits importants : la dtection des sites tumoraux est trs bonne, meilleure quavec la TDM ou le 67Ga ; la xation du 18-FDG dans les LNH et donc les possibilits de dtection varient avec le grade du lymphome, expliquant les xations faibles ou nulles de certaines catgories de lymphomes, en particulier les lymphomes du tissu lymphode associ aux muqueuses (MALT) [4, 15]. Hoffman [11] conrme que le staging et la surveillance dun lymphome type MALT ne doivent pas tre pratiqus laide du 18-FDG. Les sries plus importantes et plus rcentes de TEP au 18-FDG dans la dtection des localisations ganglionnaires de LNH, dune part, cumulent les rsultats du bilan initial et du bilan lors des rechutes, dautre part, expriment souvent les performances du 18-FDG en termes de vrais positifs et vrais ngatifs, et non en termes de sensibilit et de spcicit pour les raisons cites (cf supra). Limportant travail de Moog [18] concernant 60 cas de lymphomes non traits (33 LNH et 27 maladies de Hodgkin) examins par 18FDG et TDM fait apparatre la supriorit de la TEP. Sur 740 sites examins, 160 ont t identis comme pathologiques la fois par TDM et 18-FDG. Sur 25 sites supplmentaires vus par la TEP, sept taient de vrais positifs, deux de faux positifs, 16 cas sont rests non rsolus. La TDM a mis en vidence six sites supplmentaires, trois taient des faux positifs et trois cas sont rests non rsolus. Ces rsultats peuvent se rsumer dans le tableau II. Lamlioration du bilan initial grce au 18-FDG a permis de modier, chez cinq patients (8 %), le stade de la maladie. Un patient de stade I a t reclass en classe II, et trois patients de stade II ont t reclasss en stade III, ce qui a modi lindication thrapeutique, chez le dernier patient, un stade II a t rduit un stade I. Ltude de Bangerter [2] value lintrt du 18-FDG pour la dtection des ganglions hilaires et mdiastinaux dans les LNH lors du bilan initial et de la surveillance. Cent-quarante-sept TEP ont t faites chez 89 patients et compares avec la TDM. Cinquante-huit patients (40 %) xaient le 18-FDG. Dans 52 cas, il existait une anomalie la TDM. Les six cas positifs au 18-FDG et ngatifs la TDM ont t considrs comme des faux positifs. Deux de ces faux positifs aprs traitement taient causs par une hyperplasie thymique. La sensibilit du 18-FDG est de 96 %, la spcicit de 94 %, la valeur prdictive positive de 90 % ; la valeur prdictive ngative de 98 %. Stumpe [30] sur 50 patients (35 maladie de Hodgkin, 15 LNH) souligne galement lavantage du 18-FDG par rapport la TDM. La Cest dans le dpistage des lsions extraganglionnaires que limagerie par le 18-FDG est la plus intressante, en particulier pour ltude de la moelle osseuse [ 4 , 2 0 ] . Moog [ 1 9 ] rapporte, chez 81 lymphomes non traits, les rsultats de lexploration par le 18FDG. Quarante-deux lsions extraganglionnaires taient identies la fois par la TEP et la TDM ; 24 lsions ont t vues par la TEP seule, dont 15 ont pu tre vries. Quatorze fois sur 15, les lsions de la TEP ont t conrmes (moelle neuf fois, rate trois fois, foie une fois, msentre une fois). Sept lsions non vues au 18-FDG taient identies par la TDM. Six de ces lsions ont t vries : cinq fois il sagissait dune erreur de la TDM. Sur 58 lsions vries histologiquement, la sensibilit du 18-FDG est de 96 %, celle de la TDM de 63 % et la spcicit est respectivement de 100 % et 93 %. La supriorit essentielle de la TEP sur la TDM est la dtection des localisations mdullaires. Chez 13 patients (16 %), le stade du lymphome a t modi par les rsultats du 18-FDG. Rate et foie Dans lexprience de Jrusalem et Rigo [14], latteinte splnique tait dcele de faon concordante par la TEP et la TDM dans 11 cas. Le 18-FDG a montr un envahissement splnique mconnu par la clinique et la TDM. Chez trois patients, la TDM a mis en vidence une splnomgalie sans xation anormale du 18-FDG. Latteinte hpatique a t dtecte dans trois cas par la TEP et la TDM. Dans ltude de Moog [19], le 18-FDG apparat galement suprieur la TDM pour la dtection des localisations hpatiques et splniques. Tube digestif Sur quatre inltrations digestives prouves histologiquement, Jrusalem [14] en a mis en vidence trois par le 18-FDG. Une xation physiologique diffuse du 18-FDG dans le tube digestif sobserve chez quelques patients. Laspect tubulaire de la xation physiologique permet de la diffrencier de linltration tumorale. Rodriguez [26] trouve une xation du 18-FDG dans sept localisations gastriques de lymphome sur huit. Le seul faux ngatif est observ dans un LNH de type MALT. Moelle osseuse La dtection dune localisation mdullaire revt, au cours du lymphome, une importance cruciale car elle peut modier le pronostic et la conduite thrapeutique. Une mthode dimagerie able vitant la ou les biopsies serait dun grand intrt. Il existe des limites la fois au 18-FDG et la biopsie mdullaire. Le 18-FDG sera ngatif et inutile si les autres sites du lymphome naccumulent pas le 18-FDG. La biopsie sera ngative si linltration est seulement focale, distance du site de biopsie. Le 18-FDG permet de diriger la biopsie au niveau dun foyer de xation. Les faux positifs de la TEP sont dus des ractions mdullaires reconnues tort comme un envahissement. Les faux ngatifs de la biopsie sont dus des localisations mdullaires focales manques par une seule biopsie. Les rsultats de Carr [4] obtenus chez 50 patients (12 maladies de Hodgkin, 38 LNH) comparant la TEP et la biopsie unilatrale de la crte iliaque sont intressants. Le 18-FDG et lhistologie mdullaire sont concordants chez 39 patients (78 %), 13 positifs et 26 ngatifs. Chez huit patients, le 18-FDG est positif et la biopsie ngative. Quatre des huit patients ont une xation de 18-FDG
3

Fa 13-000-M-10

Scintigraphie au 18-uoro-dsoxy-glucose en hmatologie

Hmatologie

Tableau III. volution de 54 cas de lymphomes selon les rsultats de la tomodensitomtrie (TDM) et de la tomographie par mission de positons (TEP) aprs le traitement (daprs Jrusalem [13]).
TDM 18-FDG
Oui Positive (n = 24) Ngative (n = 30) positive (n = 5) ngatif (n = 19) positive (n = 1) ngatif (n = 29) 5 5 1 3

Progression
Non 0 14 0 26

18-FDG : 18-uoro-dsoxy-glucose.

normale au niveau du site biopsi. Chez trois patients, lexamen histologique tait positif et la TEP normale. Deux de ces trois patients ne xaient pas le 18-FDG au niveau des sites ganglionnaires de leur lymphome. Chez cinq patients (10 %) seulement, la discordance entre 18-FDG et biopsie mdullaire nest pas explique. Carr [4] conclut que la TEP peut prciser ltat de la moelle dans un grand nombre de lymphomes et rduire ainsi le besoin de biopsie mdullaire dans le bilan. Les rsultats de Moog [20] portant sur 78 patients (39 maladies de Hodgkin, 39 LNH) vont dans le mme sens. Deux biopsies mdullaires ont t faites chez 70 patients, une seule chez huit patients. Les discordances ont t analyses avec laide dune nouvelle biopsie et de lIRM. Dans 64 cas, les rsultats sont concordants (sept fois positif, 57 fois ngatif). Il y a quatre faux ngatifs du 18-FDG (5,1 %), dix faux ngatifs (12,8 %) de la biopsie mdullaire. Chez huit malades (10,3 %), la TEP augmente le stade dextension de la maladie. Dans sa srie de 60 patients, Jrusalem [14] dtecte 18 inltrations mdullaires par la TEP. Il y a quatre faux positifs du 18-FDG et huit faux ngatifs. Chez cinq patients (8 %), le 18-FDG augmente le stade de la maladie. Os Moog [21] a compar, chez 56 patients, le 18-FDG et la scintigraphie osseuse dans la dtection de latteinte squelettique des lymphomes. Douze lsions osseuses nont t dpistes quau 18-FDG. Il conclut que la TEP est sensible et plus spcique que la scintigraphie osseuse dans cette indication. Cerveau Chez les immunodprims, le diagnostic peut tre difficile entre une localisation crbrale du lymphome et une toxoplasmose ou une autre atteinte opportuniste. La TEP a une trs bonne spcicit pour diffrencier ces lsions. Elle est positive en cas de lymphome et ngative dans la toxoplasmose [25, 31].
MASSE RSIDUELLE

valeur prdictive ngative est de 83 % pour le 18-FDG et 87 % pour la TDM. Les rsultats de Stumpe [30] conrment dans les masses rsiduelles la trs bonne spcicit de la TEP (96 %) compare celle de la TDM (38 % ; p < 0,00005). Bangerter [3] a montr le rle de la TEP au 18-FDG pour prvoir la rechute des masses rsiduelles. Sur 36 patients surveills pour leur masse rsiduelle, la scintigraphie au 18-FDG tait 27 fois ngative et neuf fois positive. Parmi les 27 cas ngatifs, 25 patients sont en rmission complte avec une mdiane de suivi de 25 mois, deux ont rechut 2 et 15 mois. Sur les neuf cas positifs, cinq ont rechut (en moyenne 5 mois), quatre sont en rmission complte (36 56 mois plus tard). La sensibilit du 18-FDG pour prdire la rechute est de 71 %, sa spcicit de 86 %, la valeur prdictive ngative (VPN) de 93 %, la valeur prdictive positive (VPP) de 56 %. Labsence de rechute ultrieure est prdite de faon signicative (p = 0,0057) par une TEP ngative. Cest actuellement la mthode dimagerie la plus able pour prvoir la rmission complte chez les patients atteints de lymphomes avec masse rsiduelle. Zinzani [ 3 4 ] a obtenu des rsultats trs dmonstratifs grce la recherche de masses rsiduelles abdominales chez 44 patients. Sur sept patients avec TEP et TDM ngatives, aucune rechute na t observe. Sur les 37 patients avec TDM positive, les 13 qui avaient aussi un 18-FDG positif ont tous rechut (100 %), contre un seul sur les 24 patients avec 18-FDG ngatif (4 %). La probabilit de survie actuarielle 2 ans est de 95 % si la TEP est ngative, et de 0 % si la TEP est positive. Ces rsultats ont dautant plus de valeur que les masses rsiduelles abdominales sont difficiles examiner et que la scintigraphie au gallium, able pour les masses rsiduelles thoraciques, est peu performante pour les masses rsiduelles abdominales [29].
VALUATION DES RECHUTES

En cas de rechute conrme, la TEP permet de faire de nouveau le bilan des lsions pour tablir le stade de la maladie et dcider dune nouvelle ligne de traitement. La gure 1 met en vidence les diffrentes localisations de la rechute dune maladie de Hodgkin. Les performances du 18-FDG que nous avons vues lors du bilan initial sont identiques lors de la rechute. Beaucoup dauteurs ne font dailleurs pas la distinction, dans le bilan dextension, entre bilan initial et bilan de rechute [25, 30].
EFFICACIT THRAPEUTIQUE. PRONOSTIC

Lapprciation de la nature des masses rsiduelles est dune grande importance dans les lymphomes. Il sagit de distinguer une brose ou une ncrose ne ncessitant pas de traitement supplmentaire et des lsions comportant encore des cellules malignes et justiant un nouveau traitement. Plusieurs quipes [2, 5, 13, 30, 34] ont montr lintrt trs grand du 18-FDG dans cette indication et ont signal la forte valeur pronostique de la prsence ou de labsence de xation du 18-FDG au niveau de ces masses rsiduelles. Sur 32 masses rsiduelles explores par le 18-FDG, Dewit [5] ne trouve aucun faux ngatif mais trois faux positifs au niveau de la masse rsiduelle et deux en dehors de la masse rsiduelle. Dans sa srie de 54 patients, Jrusalem [13] constate 24 masses rsiduelles la TDM. Le 18-FDG tait positif chez cinq patients et ngatif chez 19. Sur les 30 patients avec TDM ngative, le 18-FDG tait aussi ngatif 29 fois. La comparaison de ces rsultats avec la progression de la maladie met en vidence lintrt pronostique du 18-FDG (tableau III). Le taux de survie sans progression 1 an passe de 0 % si la TEP est positive, 86 5 % (p < 0,0001) si elle est ngative [13]. La valeur prdictive positive du 18-FDG est de 100 %, de la TDM de 42 %, la
4

Il est bien tabli que lefficacit de la chimiothrapie peut tre apprci trs utilement par le 18-FDG. Cet examen a un grand intrt pronostique et thrapeutique, comme nous lavons dj montr dans ltude des masses rsiduelles. La chimiothrapie rduit trs rapidement (quelques jours) lactivit mtabolique des cellules tumorales [10]. Il sensuit une diminution ou une disparition de la captation de 18-FDG par la tumeur qui traduit lefficacit thrapeutique. linverse, la persistance dune xation anormale indique un chec du traitement. Les modications mtaboliques prcdent de plusieurs semaines la diminution de volume de la tumeur. Romer [28] a quanti, dans 11 cas de LNH, la captation du 18-FDG, avant la chimiothrapie, puis 7 jours et 42 jours aprs le dbut du traitement. La valeur standardise de captation (SUV) et le taux mtabolique dutilisation du 18-FDG (MRFDG) sont levs au dpart puis diminuent signicativement ds le septime jour (la SUV dcrot de 60 %). Une nouvelle diminution de ces paramtres de 42 % est observe au 42e jour. Au total, il existe une diminution de la xation de 79 % entre le point de dpart et j42. Six patients sur 11 sont rests en rmission avec un suivi de 16 4,2 mois. Ces six patients avaient des paramtres de xation au septime jour signicativement plus bas que les cinq patients qui ont rechut. Les paramtres de xation du 18-FDG au 42e jour ont une valeur prdictive plus grande pour lvolution long terme que ceux de j7. Ltude de Dimitrakopoulou-Strauss [6] montre aussi lintrt des paramtres de xation du 18-FDG (SIU : captation intgrale standardis) au cours du temps pour prvoir lvolution long terme. Dans ce travail, la TEP a t associe une scintigraphie au 99m Tc-Sestamibi, qui rete la rsistance multiple des cellules la

Hmatologie

Scintigraphie au 18-uoro-dsoxy-glucose en hmatologie


1

Fa 13-000-M-10

valuation de la rcidive dune maladie de Hodgkin aprs autogreffe. Rechute tendue au thorax : poumons, pricarde, plvre, hile gauche, paroi, creux axillaires et labdomen : hile de la rate, foie gauche, ganglions cliaques. (Document fourni par le docteur JF Gaillard, service de mdecine nuclaire, hpital dinstruction des Armes du Val de Grce).

chimiothrapie (MDR). Une accumulation de Sestamibi tmoignant de labsence du gne MDR, a t trouve chez les patients qui sont entrs en rmission complte ou partielle et chez une partie de ceux qui ont eu une maladie stabilise. Aucune accumulation de Sestamibi na en revanche t observe chez les patients avec une maladie progressive traduisant linefficacit de la chimiothrapie en rapport avec la prsence du gne MDR. Il est intressant de constater une bonne corrlation entre les paramtres de xation du 18-FDG, laccumulation de Sestamibi et lefficacit thrapeutique dont dpend le pronostic. La surveillance des lymphomes par le 18-FDG peut permettre darrter prcocement une chimiothrapie potentiellement toxique et inefficace pour la remplacer par une autre chimiothrapie. La TEP pourrait aussi tre utilise pour slectionner les rpondeurs des traitements agressifs et coteux, et amliorer ainsi le rapport cot/efficacit et la qualit de vie des patients [25].

des examens Los Angeles sont diffrents des cots des examens en France. Sur 18 patients atteints de lymphome, cette tude prospective a compar la abilit de dtection lors du bilan initial avec le cot des examens dimagerie suivant deux protocoles : lun utilisant la TEP corps entier et lautre limagerie conventionnelle. Les deux protocoles ont dtect un mme nombre de sites pathologiques. Lalgorithme TEP augmente correctement le stade chez trois patients et le diminue chez un patient. Le cot de la procdure par imagerie conventionnelle dpasse de 80 % celui de la procdure TEP. Ce rsultat a besoin dtre conrm par dautres quipes et valid en France, en fonction du prix des examens.

Conclusion
La TEP par 18-FDG est une mthode dimagerie mtabolique de trs grand intrt dans les cancers, en particulier les lymphomes. La TEP est plus able, plus rapide, moins agressive, et peut-tre plus conomique que les techniques dimagerie conventionnelle quelle devrait progressivement remplacer. Dans les lymphomes, cest actuellement la mthode dimagerie la plus performante pour faire le bilan initial ou celui des rechutes, pour caractriser la nature dune masse rsiduelle, pour apprcier lefficacit thrapeutique, pour formuler le pronostic. Son utilisation en France est encore trs rduite pour des raisons administratives et conomiques.

Rapport cot-efficacit de la TEP au 18-FDG


Il existe trs peu dtudes sur le rapport cot-efficacit de la TEP au 18-FDG dans les lymphomes. La publication de Hoh [12] de luniversit de Californie-Los Angeles (UCLA) est la plus connue et la plus dmonstrative de lintrt de la TEP dans les lymphomes. Toutefois, ces rsultats sont prendre avec prcaution car les cots

Rfrences

Fa 13-000-M-10

Scintigraphie au 18-uoro-dsoxy-glucose en hmatologie

Hmatologie

Rfrences
[1] Arita T, Kuramitsu T, Kawamura M, Matsumoto T, Matsunaga N, Sugi K et al. Bronchogenic carcinoma: incidence of metastases to normal sized lymph nodes. Thorax 1995 ; 50 : 1267-1269 [2] Bangerter M, Kotzerke J, Griesshammer M et al. Positron emission tomography with 18-uorodeoxyglucose in the staging and follow-up of lymphoma in the chest. Acta Oncol 1999 ; 38 : 799-804 [3] Bangerter M, Kotzerke J, Griesshammer M, Reske SN, Bergmann L. Role of whole-body FDG-PET in predicting relapse in residual masses after treatment of lymphoma. Proc Am Soc Hematol 1998 ; [abstract 987] [4] Carr R, Barrington SF, Madan B, ODoherty MJ, Saunders CA, Van der Walt J et al. Detection of lymphoma in bone marrow by whole-body positron emisson tomography. Blood 1998 ; 91 : 3340-3346 [5] de Wit M, Bumann D, Beyer W, Herbst K, Glausen M, Hossfeld DK et al. Whole-body positron emission tomography (PET) for diagnosis of residual mass in patients with lymphoma. Ann Oncol 1997 ; 8 (suppl 1) : 57-60 [6] Dimitrakopoulou-Strauss A, Strauss LS, Goldschmidt H, Lorenz WJ, Maier-Borst W, van Kaick G. Evaluation of tumor metabolism and multidrug resistance in patients with treated malignant lymphomas. Eur J Nucl Med 1995 ; 22 : 434-442 [7] Flier JS, Mueckler MM, Usher P, Lodish HF. Elevated levels of glucose transport and transporter messenger RNA are induced by ras and sarc oncogenes. Science 1987 ; 235 : 1492-1495 [8] Gallagher BM, Fowler JS, Gutterson NI et al. Metabolic trapping as a principle of radiopharmaceutical design: some factors responsible for the biodistribution of F-18-2deoxy-2-uoro-D-glucose. J Nucl Med 1989 ; 19 : 1154-1161 [9] Hatanaka M. Transport of sugar in tumor cell membranes. Biochem Biophys Acta 1974 ; 355 : 77-104 [10] Hoekstra OS, Ossenkoppele GJ, Golding R et al. Early treatment response in malignant lymphoma, as determined by planar uorine-18-uorodeoxyglucose scintigraphy. J Nucl Med 1993 ; 34 : 1706-1710 [11] Hoffmann M, Kletter K, Diemling M et al. Positron emission tomography with uorine-18-2-uoro-2-deoxy-D-glucose (F18-FDG) does not visualize extranodal B-cell lymphoma of the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT)-type. Ann Oncol 1999 ; 10 : 1185-1189 [12] Hoh CK, Glaspy J, Rosen P, Dahlbom M, Lee SJ, Kunkel L et al. Whole-body FDG-PET imaging for staging of Hodgkins disease and lymphoma. J Nucl Med 1997 ; 38 : 343-348 [13] Jerusalem G, Beguin Y, Fassotte MF et al. Whole-body 18 Fpositron emission tomography using uorodeoxyglucose for posttreatment evaluation in Hodgkins disease and non-Hodgkins lymphoma has higher diagnostic and prognostic value than classical computed tomography scan imaging. Blood 1999 ; 94 : 429-433 [14] Jerusalem G, Warland V, Najjar F et al. Whole-body 18FFDG PET for the evaluation of patients with Hodgkins disease and non-Hodgkins lymphoma. Nucl Med Com 1999 ; 20 : 13-20 [15] Lapela M, Leskinen S, Minn HR, Lindholm P, Klemi PJ, Sderstrm KO et al. Increased glucose metabolism in untreated non-Hodgkins lymphoma: a study with positron emission tomography and uorine-18-uorodeoxyglucose. Blood 1995 ; 86 : 3522-3527 [16] Leskinen-Kallio S, Ruotsalainen U, Ngren K, Ters M, Joensuu H. Uptake of carbon-11-methionine and uorodeoxyglucose in non-Hodgkins lymphoma: a PET study. J Nucl Med 1991 ; 32 : 1211-1218 [17] Minn H, Joensuu H, Ahonen A. Fluorodeoxyglucose imaging: a method to assess the proliferative activity of human cancer in vivo. Comparison with DNA ow cytometry in head and neck tumors. Cancer 1988 ; 61 : 1776-1781 [18] Moog F, Bangerter M, Diederichs CG, Guhlmann A, Kotzerke J, Merkle E et al. Lymphoma: role of whole-body 2-deoxy-2-[F-18]uoro-D-glucose (FDG) PET in nodal staging. Radiology 1997 ; 203 : 795-800 [19] Moog F, Bangerter M, Diederichs CG, Guhlmann A, Merkle E, Frickhofen N et al. Extranodal malignant lymphoma: detection with FDG PET versus CT. Radiology 1998 ; 206 : 475-481 [20] Moog F, Bangerter M, Kotzerke J, Guhlmann A, Frickhofen N, Reske SN. 18 F-Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography as a new approach to detect lymphomatous bone marrow. J Clin Oncol 1998 ; 16 : 603-609 [21] Moog F, Kotzerke J, Reske SN. FDG PET can replace bone scintigraphy in primary staging of malignant lymphoma. J Nucl Med 1999 ; 40 : 1407-1413 [22] Newman JS, Francis IR, Kaminski MS, Wahl RL. Imaging of lymphoma with PET with 2-[F-18]-uoro-2-deoxy-Dglucose: correlation with CT. Radiology 1994 ; 190 : 111-116 [23] Okada J, Yoshikawa K, Itami M. Positron emission tomography using uorine-18-uorodeoxyglucose in malignant lymphoma: a comparison with proliferative activity. J Nucl Med 1992 ; 33 : 325-329 [24] Paul R. Comparison of F-18-2-FDG and Gallium-67 citrate: imaging for detection of lymphoma. J Nucl Med 1987 ; 28 : 288-292 [25] Rigo P, Paulus P, Kaschten BJ, Hustinx R, Bury T, Jerusalem G et al. Oncological applications of positron emission tomography with uorine-18 uorodeoxyglucose. Eur J Nucl Med 1996 ; 23 : 1641-1674 [26] Rodriguez M, Ahlstrom H, Sundin A, Rehn S, Sundstrm C, Hagberg H et al. [F-18] FDG PET in gastric non-Hodgkins lymphoma. Acta Oncol 1997 ; 36 : 577-584 [27] Rodriguez M, Rehn S, Ahlstrom H, Sundstrm C, Glimelius B. Predicting malignancy grade with PET in non-Hodgkins lymphoma. J Nucl Med 1995 ; 36 : 1790-1796 [28] Romer W, Hanauske AR, Ziegler S, Thdtmann R, Weber W, Fuchs C et al. Positron emission tomography in nonHodgkins lymphoma: assessment of chemotherapy with uorodeoxyglucose. Blood 1998 ; 91 : 4464-4471 [29] Salloum E, Brandt DS, , Caride VJ, Cornelius E, Zelterman D, Schubert W et al. Gallium scans in the management of patients with Hodgkins disease: a study of 101 patients. J Clin Oncol 1997 ; 15 : 518-527 [30] Stumpe KD, Urbinelli M, Steinert HC, Glanzmann C, Buck A, von Schulthess GK. Whole-body positron emission tomography using uorodeoxyglucose for staging of lymphoma: effectiveness and comparison with computed tomography. Eur J Nucl Med 1998 ; 25 : 721-728 [31] Villringer K, Jager H, Dichgans M, Ziegler S, Poppinger J, Herz M et al. Differential diagnosis of CNS lesions in AIDS patients by FDG-PET. J Comput Ass Tomogr 1995 ; 19 : 532-536 [32] Wahl RL, Clavo AC. Effects of hypoxia on cultured human tumor cell uptake of thymidine, L-methionine and FDG. J Nucl Med 1993 ; 34 : 73 [33] Warburg O. The metabolism of tumors. New York : Smith RR1931 : 129-169 [34] Zinzani PL, Magagnoli M, Chierichetti F et al. The role of positron emission tomography (PET) in the management of lymphoma patients. Ann Oncol 1999 ; 10 : 1181-1184

Encyclopdie Mdico-Chirurgicale 13-000-M-56

13-000-M-56

Hmatologie et populations
F Bauduer

Rsum. Lhmatologie des populations peut tre scinde en deux approches : gntique et pristasique selon que les spcicits tudies au niveau des caractres physiologiques ou pathologiques du sang sont de nature constitutionnelle ou acquise (en relation avec des facteurs gographiques locaux : environnementaux, alimentaires ou culturels). Bon nombre dexemples appartenant ces deux catgories sont passs en revue ici. Les groupes sanguins sont des tmoins intressants des processus anciens de peuplement. La plupart des pathologies constitutionnelles du globule rouge (thalassmies, drpanocytose, dcit en G6PD), prdominant dans les rgions dendmie palustre actuelle ou passe, constituent le tmoignage dun processus de slection vis--vis du Plasmodium. Dautres anomalies, comme certaines maladies constitutionnelles de lhmostase, ont des rpartitions populationnelles en rapport avec des effets fondateurs. Les agents microbiens (virus, parasites et bactries) constituent les principaux responsables des hmopathies acquises de rpartition gographique. Ce type dapproche est obligatoirement multidisciplinaire et doit impliquer la plupart des spcialits des sciences de lhomme et de lenvironnement.
2003 Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Mots-cls : hmatologie gographique, hmotypologie, anthropologie, gntique des populations.

Introduction
Le but de cet article est de prsenter de faon synthtique au travers de bon nombre dexemples, lintrt dune approche hmatologique au sein de lanthropologie biologique, et linverse, de souligner pour lhmatologiste les bnces retirer des concepts de gntique des populations vis--vis de certaines maladies du sang. La facilit de prlvement, la multitude de paramtres pouvant tre recherchs, la possibilit de conserver indniment les chantillons (et dailleurs de les prlever au-del de la mort des individus) font que le sang constitue un outil extrmement intressant pour ltude des populations humaines et de leurs relations avec leurs milieux respectifs. Lhmatologie des populations ou gographique permet de reconstituer lhistoire des peuplements humains et de lendmie palustre au travers des marqueurs rythrocytaires. Le polymorphisme HLA (human leucocyte antigen) relevant directement de limmunogntique et qui mriterait un article lui seul, ne sera pas abord ici. Nous avons prfr intituler cet article Hmatologie et populations plutt qu hmatologie gographique eu gard aux grands phnomnes migratoires rcents qui ont relativis la notion de lieu gographique au prot de celle dorigine ethnique. Les praticiens des pays dits dvelopps se trouvent de plus en plus souvent confronts des pathologies constitutionnelles de migrants du tiers-monde. linverse, on ne doit pas non plus ignorer, du fait du dveloppement du tourisme vers les pays exotiques, la possibilit de pathologies acquises importes (lhyperosinophilie parasitaire en tant le meilleur exemple). Il va sans dire que les donnes rapportes ici sur un sujet aussi vaste et en perptuelle volution sont forcment incompltes, donc arbitraires et approximatives et parfois sujettes caution.

Donnes prliminaires
LMENTS HISTORIQUES

Frdric Bauduer : Praticien hospitalier, mdecin des Hpitaux, service des maladies du sang, centre hospitalier de la Cte-Basque, 13, avenue interne Jacques-Loeb, 64100 Bayonne, France.

Jean Bernard, outre ses nombreuses contributions dans la nosologie et la thrapeutique des maladies du sang, a le premier dni le concept dhmatologie gographique au sein de lhmatologie moderne au dbut des annes 1960 : Les pathologies du sang dpendent pour une large part des peuples et des races, du sol, de lair, des climats, des coutumes alimentaires, des infections, des parasitoses particulires certaines rgions. [7] Il est lorigine, avec Jacques Ruffi, du seul ouvrage en langue franaise crit ce jour sur ce thme [8]. Avant lui, plusieurs auteurs (en premier lieu Arthur Mourant) avaient soulign en particulier les diffrences de rpartition des groupes sanguins entre les populations humaines [59]. Selon la dnition de Jean Bernard, lhmatologie gographique comprend deux branches principales : lhmatologie gntique, qui tudie les diffrences des caractres constitutionnels du sang entre les groupes humains, et lhmatologie pristasique qui considre les facteurs gographiques locaux (environnementaux, alimentaires, culturels) jouant un rle dans la survenue de caractristiques hmatologiques [7]. Ces particularits innes ou acquises peuvent engendrer ou non une pathologie. Il va sans dire que cette approche nest concevable quen associant lhmatologie plusieurs disciplines qui sont entre autres lanthropologie, la gntique, lpidmiologie, larchologie, la sociologie, la gographie, lhistoire, la linguistique Aux techniques pionnires du dbut du XXe sicle (microscopie optique, srologie, lectrophorse des protines) ont succd des approches beaucoup plus performantes, en premier lieu la gntique molculaire, associes un solide outil statistique. Cavalli-Sforza a t lun des acteurs essentiels du dveloppement de la gntique des populations, dans laquelle lhmatologie a pris une place majeure. Par ailleurs, le terme de race utilis dans les vieux articles et traits doit tre dnitivement banni car il ne recouvre aucune ralit sur le plan anthropologique ou gntique.

Toute rfrence cet article doit porter la mention : Bauduer F. Hmatologie et populations. Encycl Md Chir (Elsevier SAS, Paris, tous droits rservs), Hmatologie, 13-000-M-56, 2003, 11 p.

13-000-M-56

Hmatologie et populations

Hmatologie

NOTIONS FONDAMENTALES DE GNTIQUE DES POPULATIONS

Les polymorphismes gntiques dans les populations humaines sont fondamentalement lis plusieurs phnomnes venant modier le prol gnique ancestral : les mouvements de population, introduisant un ux gnique ou un mtissage ; le hasard, jouant surtout un rle dans des groupes de petits effectifs, par le biais des mutations avec effet fondateur et du phnomne de drive gntique ; et le processus de slection naturelle, dont la consquence est une meilleure adaptation des individus leur milieu et une amlioration des capacits de reproduction au sein du groupe [17, 70]. Les lments lorigine du processus de slection naturelle au sein des populations humaines sont les facteurs goclimatiques, les paramtres nutritionnels et les agressions infectieuses virales, bactriennes ou parasitaires [70]. Lorsquun gne entrane certaines consquences pathologiques sur les individus, il est ncessaire quil confre par ailleurs un avantage sur la reproduction ou la survie. Cet tat gntique, combinant simultanment effet avantageux et effet dfavorable, est dnomm polymorphisme balanc. Plusieurs exemples seront prsents plus loin, en particulier les pathologies du globule rouge conduisant une meilleure dfense contre le paludisme. Cette parasitose, qui frappe le plus grand nombre dtres humains, tue environ un million dindividus tous les ans, principalement des enfants. Par ailleurs, comme dj prcis plus haut, les anomalies gntiques tendent de plus en plus perdre leurs spcicits gographiques, compte tenu des larges mouvements migratoires rcents lchelle de la plante.

Polymorphismes des groupes sanguins


Les groupes sanguins tant extrmement nombreux, on nabordera ici que les exemples les plus dmonstratifs sur le plan anthropologique et intressant les polymorphismes les plus anciennement connus.
GROUPE ABO

supplmentaires Cw (frquence maximale au nord de lAsie, do il semble originaire) et Du (prsence importante en Afrique et en Asie du Sud-Est). Lhaplotype originel semble tre cDe, qui a la plus grande frquence en Afrique, o lon situe actuellement le berceau de lhumanit. partir de cDe sont apparus par mutations trois haplotypes supplmentaires : Cde, peut-tre contemporain de lexpansion de lhomme vers lAsie, est cosmopolite mais relativement plus rare en Afrique (9 %) ; cde (RH ngatif), est apparu lors du peuplement du nord-ouest de lAsie et de lEurope ; cDE est trs frquent au nord-est de lAsie, do il est probablement originaire, et sur le continent amricain, o il sest propag suite la traverse du dtroit de Behring par les groupes humains. Ensuite, partir de ces quatre haplotypes sont apparus par recombinaison (crossing over) trois spcicits nouvelles : Cde, relativement rare, ayant un maximum de frquence au nord de lAsie et trs souvent rencontr en Europe et en Asie de lOuest (o se trouve son origine suppose) ; cdE, rare dans la plupart des zones gographiques, surtout prsent dans lest de lAsie et possiblement apparu dans louest ou le nord de ce continent, tant donn ses frquences actuelles ; CDE, galement rare, connaissant un pic de prsence au nord-est de lAsie (qui pourrait tre son lieu dclosion) et sur le continent amricain. Le huitime haplotype, CdE, le plus rare de tous, est le produit de la recombinaison de deux haplotypes qui avaient dj subi une recombinaison [17]. Actuellement, chez les Caucasiens, les frquences antigniques sont les suivantes : D (RH positif) : 85 % (15 % sont donc d, RH ngatifs), C : 70 %, c : 80 %, E : 30 % et e : 98 %. Les Basques reprsentent une des rares populations de la plante o le d avoisine, voire dpasse les 50 % [8, 59, 70].
SYSTME DUFFY

Un des premiers exemples de variabilit gntique a t mis en vidence par Landsteiner au dbut du XXe sicle, qui a dni par mthode immunologique les groupes sanguins ABO. Cest L. et H. Hirszfeld qui, les premiers, en pleine Premire Guerre mondiale, mirent en vidence des diffrences de rpartition des groupes ABO selon les origines ethniques dun groupe de soldats [17] . Le polymorphisme ABO est retrouv partout dans le monde, lexception des populations natives dAmrique centrale et du Sud o seul le groupe O est prsent. Au nord-ouest de lAmrique du Nord, on retrouve la plus haute frquence mondiale du groupe A chez les Indiens Blackfoot et Blood. Cest lest de lAsie que la prvalence du groupe B est la plus forte. Le groupe B a, semble-t-il, pntr lEurope en provenance de lAsie au cours des diffrentes vagues dinvasions, ce qui explique que sa frquence diminue selon un gradient est/sud-ouest, de la Russie au Pays Basque [17]. Il est inexistant dans les populations amrindiennes et aborignes dAustralie [8]. La frquence maximale du A est retrouve dans les pays Scandinaves [8]. En Europe, la population basque, cense reprsenter le groupe humain le plus ancien de ce continent et ayant gard au l des ges un fort taux dendogamie, prsente des caractres bien particuliers, avec la plus forte frquence de O et la plus faible de B [8, 17, 59]. Il a t dcrit des associations entre certains groupes ABO et diverses pathologies malignes, infectieuses ou thrombotiques ce qui peut laisser penser un phnomne de slection naturelle [8, 17, 59]. Ainsi, on a dmontr chez les individus de groupe non O une augmentation signicative du risque de maladie thrombotique la fois artrielle et veineuse. Cela pourrait tre en relation avec un taux moyen plus bas du complexe circulant facteur VIII facteur Willebrand (denviron 25 %) chez les individus O [31].
GROUPE RHSUS

Le systme de groupe sanguin Duffy nest prsent que sur les rythrocytes et comprend six antignes diffrents, dont deux majeurs Fya et Fyb. Les antisrums anti- Fya et anti- Fyb dnissent quatre phnotypes : Fy (a+ b-), Fy (a+b+), Fy (a-b+) et Fy (a-b-) (aucune agglutination dans ce dernier cas). Le gne Duffy, situ en 1q22-23, code une glycoprotine membranaire qui joue le rle de rcepteur pour certains hmatozoaires du paludisme. Fya et Fyb sont frquents chez les Caucasiens alors que Fya sexprime chez pratiquement tous les sujets asiatiques. Les trois allles majeurs : FY*A, FY*B (qui sont codominants) et FY*O (dni par labsence la fois de FY*A et FY*B) prsentent clairement une distribution gographique qui pourrait reter un tat de pression de slection. Les allles FY*A et FY*B, dont les produits ne diffrent que dun seul acide amin, prdominent lest de lAsie et dans le Pacique pour le premier et louest de lAsie, en Europe et en Amrique pour le second [22]. FY*X est un allle supplmentaire plus rare retrouv essentiellement chez les individus dascendance europenne (frquence : 2,5 %) et corrl avec une faible expression de Fyb [85]. FY*O reprsente lallle prdominant chez les Noirs africains et est extrmement rare dans les autres populations ; il rend les hmaties impntrables au parasite Plasmodium vivax (phnotype Fy [a-b-]) et correspond un phnomne slectif dans les rgions dendmie [22]. En Europe, FY*A dmontre nettement un gradient est/ouest [17]. Sa frquence chez les Basques est la plus basse du continent.
GROUPE DIEGO

Le polymorphisme Rhsus (RH) sexprime au niveau de trois loci du chromosome 1 : C, D et E correspondant chacun deux allles : C ou c, D ou d, E ou e. Il existe par ailleurs deux allles
2

Il reprsente un systme de neuf antignes, avec en particulier la paire antithtique Dia/Dib qui est intressante tudier en anthropologie. En effet, pratiquement toutes les populations caucasiennes ou africaines sont Dia ngatives alors que les tribus aborignes amrindiennes et les populations dascendance mongolode sont porteuses de cet antigne [17]. Ce caractre avait t mis en vidence au Venezuela en 1955 chez les Indiens Diegos vivant dans ce pays.

Hmatologie

Hmatologie et populations
Thalassmies

13-000-M-56

Pathologies rythrocytaires
ANOMALIES MEMBRANAIRES

Elles se traduisent par une fragilit de la membrane dbouchant sur des modications de forme des hmaties et un degr variable dhmolyse. La sphrocytose hrditaire (maladie de Minkowski-Chauffard) se caractrise par une anmie hmolytique avec des globules rouges partiellement sphriques, denses et fragiles qui sont dtruits par la rate. Cette maladie est universellement rpandue mais est plus particulirement retrouve dans les populations nord-europennes, o sa prvalence est estime entre 1/2 000 et 1/5 000. La forme autosomique dominante est la plus frquente (dans trois quarts des cas), les cas restants tant de nature sporadique et composs pour moiti de formes de transmission autosomique rcessive et de nouvelles mutations spontanes [27]. Parmi les nombreuses mutations dcrites (qui dbouchent toutes sur des dfauts dinteraction horizontale de certaines protines composant larchitecture membranaire), celles touchant les gnes de la protine bande-3 et de la protine 4.2 (en particulier la protine 4.2 Nippon Ala 142 Thr) sont plus frquentes au Japon quen Europe alors que cest linverse pour le gne de lankyrine [12]. Lelliptocytose hrditaire est une anomalie frquente, avec environ 1 cas sur 2 500 personnes chez les populations nord-europennes et jusqu 1 sur 150 dans certaines rgions dAfrique. Elle prsente une grande htrognit dans lexpression clinicobiologique et dans le mode de transmission (autosomique dominant ou rcessif) et constitue la traduction de dfauts dorganisation horizontale des protines de la membrane. La plupart des mutations causales dbouchent sur des anomalies de liaison de la spectrine (en particulier au niveau de sa chane a). Chez lAfricain, la mutation a Leu 154 LeuLeu est la plus frquente et dexpression bnigne [51]. Lelliptocytose sphrocytique est un dsordre rare, autosomique dominant, partageant les caractristiques des deux prcdentes pathologies. Tous les patients dcrits sont des Europens [51]. Lovalocytose du Sud-Est asiatique est une affection autosomique dominante trs frquente (jusqu 30 %) chez les populations aborignes mlansiennes, dIndonsie, de Malaisie et des Philippines alors que les cas provenant des autres rgions du globe sont exceptionnels. La dcience molculaire concerne essentiellement la protine bande 3. Lhomozygotie est probablement incompatible avec la vie. Chez les sujets htrozygotes, les globules rouges prsentent une importante rigidit, ce qui ne cause pas de problmes pathologiques majeurs mais qui a lavantage de rendre rsistant lindividu vis--vis de linfestation par lagent du paludisme [ 4 4 ] . La distribution gographique de cette anomalie rythrocytaire est dailleurs calque sur celle de cette parasitose.
PATHOLOGIES GNTIQUES DE LHMOGLOBINE

Tous les premiers cas de ces affections ayant t rapports chez des enfants dorigine mditerranenne, leur dnomination fut calque sur le mot grec dsignant la mer : thalassa. Les thalassmies sont divises en a0- (ou b0-) et a+ - (ou b+ -) selon que la mutation responsable abolit ou rduit la production de la chane de globine en question. Thalassmies a Les a thalassmies constituent les maladies monogniques les plus frquentes au monde. La frquence des a + - thalassmies est rarement infrieure 10 % dans les rgions impaludes et dpasse mme 80 % dans certaines zones (Npal, province dAndhra Pradesh en Inde, cte Nord de la Papouasie-Nouvelle-Guine). Quatre mutations (dltions) principales ont t dcrites et manifestent chacune des pics de frquence dans des rgions propres : - a4.2 (Sud-Est asiatique et rgions du Pacique (dans ce dernier cas, il ny a pas partout du paludisme) ; - a 3.7I (trs cosmopolite mais surtout dans les populations mditerranennes et africaines) ; - a3.7II (Italie) ; - a3.7III (certaines parties de lOcanie). On retrouve des cas sporadiques da + - thalassmies dans toutes les rgions du monde. Cest la forme homozygote a+ - qui, parmi toutes les thalassmies, confre le meilleur avantage slectif. Dans les rgions du Pacique, la distribution du gne de la thalassmie-a+ est corrle celle du paludisme selon deux variables : laltitude (en dessous de 2 500 m par exemple en Papouasie-Nouvelle Guine) et la latitude [30]. Les thalassmies non dltionnelles (dont lHb Constant Spring, qui se rencontre dans le Sud-Est asiatique, est la forme la plus rpandue) et - a0 (- -SEA dans le Sud-Est de lAsie et - -MED dans le Bassin mditerranen) sont principalement prsentes dans des rgions impaludes. La thalassmie -a 0 nest viable qu ltat htrozygote [30]. Thalassmies b Les b-thalassmies sont largement rpandues travers les aires gographiques o svit le paludisme, savoir : le Bassin mditerranen, lAfrique, le Moyen-Orient, lInde et la Birmanie, la Chine, la Malaisie et lIndonsie. On estime que les frquences gniques oscillent entre 3 et 10 % selon les rgions. Chaque groupe ethnique a sa propre anomalie gntique et par consquent le nombre des mutations (en gnral ponctuelles) est trs important (suprieur 150 actuellement) et continue crotre rgulirement [30]. Certaines mutations sont observables dans plusieurs groupes humains situs dans des rgions voisines de mme culture (par exemple la mutation IVS1 110 G-A dans le Bassin mditerranen) (g 1).

Les hmoglobinopathies communes comprennent les thalassmies (dcience de synthse des chanes de globine) a et b et trois anomalies qualitatives lies des mutations sur la chane b de la globine qui sont les hmoglobinoses S (anmie falciforme ou drpanocytose, b6 Glu Val), C (b6 Glu Lys) et E (b26 Glu Lys). Elles confrent une protection vis--vis du paludisme et leurs plus hautes frquences de distribution gographique concident avec la prsence de cette maladie (quelle soit actuelle ou passe), cela tant en rapport avec un phnomne de slection naturelle. Les mutations responsables dmontrent une spcicit rgionale et toutes ont augment de frquence au cours des 5 000 dernires annes [30]. Labsence de corrlation de ces hmoglobinopathies avec le paludisme observe dans certaines aires (Polynsie par exemple) peut tre rapporte la drive gntique, aux migrations et aux modications dmographiques survenues durant les derniers 10 000 ans. Il va sans dire que lon peut rencontrer assez frquemment des individus issus des zones impaludes porteurs de plusieurs de ces anomalies la fois [30].

Hmoglobinoses
La frquence gnique de lHbS est plus de 20 % au Cameroun, Guine, ex-Zare, Ouganda et Kenya ; jusqu 20 % dans des parties de lest de lArabie saoudite et de lInde et de moins de 5 % dans le Bassin mditerranen et au Moyen-Orient. Les cas rencontrs sur le continent amricain (tats-Unis, Brsil, Carabes) correspondent au ux gnique de la traite des esclaves, car des cas dHbS nont jamais t rapports chez les Amrindiens. En Inde, la distribution actuelle de lHbS est la consquence de phnomnes migratoires survenus durant les 5 000 dernires annes partir dune population fondatrice probablement originaire de la valle de lIndus. En Afrique, dans sa partie sud, lHbS proviendrait des populations bantoues il y a environ 2 000 ans, alors que le Nigeria serait le berceau des formes nord-africaines et mme mditerranennes. LHbS dans sa forme htrozygote confre une protection contre le paludisme, ce qui contrebalance la surmortalit des homozygotes
3

13-000-M-56

Hmatologie et populations

Hmatologie

cd 8-AA cd 39 C-T IVS I-1 G-A IVS I-6 C-T IVS I-1 10 G-A IVS II-1 G-A autres

1 Exemples de distribu-28 tion gographique des mutacd 8/9 +G tions responsables de cd 15 G-A b-thalassmies [15]. cd 17 A-T cd 41/42-TCTT IVS I-1 G-T IVS I-5 G-T IVS II-654 C-T -619 bp del autres
Italie talie Chine

Inde

de Thalande

Indonsie d se

(esprance de vie autour de 2 ans en labsence de prise en charge). Cela reprsente un exemple de polymorphisme quilibr et permet dexpliquer le maintien de cette anomalie dans ces populations [30, 48] . LHbE se retrouve en Asie, du Nord de lInde la Chine, avec un taux record dans le nord-est de la Thalande, o la frquence du gne atteint 74 %. On rencontre des cas sporadiques en Europe alors quen Turquie, rgion fortement impalude dans les temps plus anciens, la frquence est entre 0,5 et 1 % [48]. LHbC apparat principalement en Afrique de lOuest, avec une frquence maximale en Cte dIvoire (jusqu 50 %) et une distribution qui est superposable celle de la drpanocytose [48].
ENZYMOPATHIES RYTHROCYTAIRES

Dcit en glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PD)


Il sagit de la plus frquente enzymopathie rythrocytaire touchant lhomme (plus de 400 millions de cas mondiaux) [43]. Lorganisation mondiale de la sant (OMS) estime 2,9 % la proportion dindividus porteurs de ce dcit travers le monde [37] (g 2). Largement plus de 400 variants de cette enzyme ont t rapports. Bien que la majorit des individus dcitaires soient asymptomatiques, certains peuvent dvelopper une anmie hmolytique prcipite par un stress oxydatif. En effet, le rle de la G6PD est de protger le globule rouge vis--vis de loxydation via la production de NADPH [43]. Cette affection a t dcrite pour la premire fois en 1956 chez un individu ayant reu de la primaquine [16]. Le gne de lenzyme normale situ en Xq28 a t clon en 1986 [54]. Compte tenu du trs grand nombre de sujets atteints de ce dcit, celui-ci ne semble pas inchir signicativement la capacit reproductive ni lesprance de vie (surtout par rapport au risque ltal en liaison avec linfection par Plasmodium falciparum) [11]. Avant lavnement des techniques de biologie molculaire, cest grce au prol de migration lectrophortique que les variants ont t caractriss. On a dmontr chez la majorit des patients dAfrique noire une mobilit accrue (forme G6PD A (-)) par rapport aux Africains non dcitaires (G6PD A (+)). Le type G6PD A (+) constitue probablement un modle ancestral, mais qui semble plus rcent que le type G6PD B [89]. G6PD A (-) a une distribution gographique large incluant lAfrique, lEurope du Sud et les rgions du Nouveau Monde o ont
4

t conduits les Noirs africains par le biais du commerce des esclaves. Les populations mditerranennes, qui se caractrisent par un dcit svre, prsentent une migration normale et le variant en question a t baptis G6PD Mditerrane [ 11 ] . Son aire de distribution couvre le sud de lEurope, le Moyen-Orient et lInde. Avec la possibilit de dnir les diffrentes mutations sous-jacentes, la classication simpliste initiale sest considrablement complexie. Une exception au modle de rpartition gographique est apparue avec la mutation Union 1360T, initialement dcrite aux Philippines, et retrouve ensuite dans des lieux aussi diffrents que lEspagne, lItalie et les les Vanuatu en plein Pacique [11]. Sagit-il du rsultat dun phnomne migratoire non document ou de lapparition indpendante de mutations sur un mme endroit du gne parmi diffrentes populations par le biais du hasard ? Il convient de distinguer les cas survenant dans des rgions dendmie palustre (prsente ou passe), des cas sporadiques pouvant se manifester dans tous les endroits du globe. Dans le premier groupe, les diffrents types dallles responsables du dcit ont atteint des frquences leves et dbouchent cliniquement sur un tat basal normal mais sur un risque daccs hmolytique aigu loccasion dun stress oxydatif comme une infection ou lingestion de certains mdicaments ou de fves (favisme). La frquence de cette enzymopathie est de 1 7 % dans un district du sud de lItalie [13], de 2 16 % en Chine du Sud et Tawan [18], et atteint jusqu 26 % en Afrique [53]. Ce chiffre atteint un impressionnant 70 % chez les Juifs kurdes porteurs du variant Mditerrane, ce qui constitue probablement la plus forte proportion parmi toutes les populations [ 2 0 ] . En Grce, une enqute effectue chez 1 286 000 nouveau-ns a retrouv une frquence gnique de 0,045 [58]. Chaque population possde ses propres variants. Clairement, lanomalie confre un avantage slectif vis--vis du paludisme [52], bien que toutes les mutations ne dbouchent pas sur une protection aussi nette que la mutation 376G [11]. Initialement, on pensait que les femmes htrozygotes taient davantage protges que les hommes hmizygotes [87], en fait, il ny a pas de diffrence signicative, et dans les deux cas la forme A (-) est associe une rduction grossirement de moiti du risque dinfection svre par P. falciparum [73] . Les lments biologiques justiant cet effet protecteur sont multiples [36] : dveloppement parasitaire ralenti et moindre rsistance de Plasmodium au contexte oxydatif dans les rythrocytes dcitaires, parasitmie plus faible chez les sujets avec dcit enzymatique et prsence lective du parasite dans les

Hmatologie

Hmatologie et populations

13-000-M-56

< 0,5 % 0,5 - 2,9 % 3 - 6,9 %

7 - 9,9 % 10 - 14,9 % 15 - 26 %

Frquence travers le monde du dcit en glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PD) (pourcentage de la population masculine hmizygote) [37].

hmaties non dcitaires chez les patients htrozygotes. De plus, le parasite est capable de fabriquer sa propre enzyme, ce qui constitue un phnomne adaptatif intressant [87]. Les plus fortes frquences gniques se rencontrent dans les rgions o lincidence du paludisme est la plus leve [52], que ce soit actuellement ou par le pass (Europe du Sud). Dans les populations africaines, il sagit quasi exclusivement de formes A (-) (68 Val Met, 126 Asn Asp [38]). Sur le pourtour mditerranen ou au Moyen Orient, on rencontre lectivement la mutation (188 Ser Phe) [46] ; au nord de lInde cest le variant Orissa (44 Ala Gly) [45] et en Chine le type G6PD Canton (459 Arg Leu) [80] qui prdominent. Concernant les cas sporadiques cosmopolites, ils surviennent trs faible frquence et correspondent des formes cliniques plus svres, le plus souvent une anmie hmolytique chronique. Ils ne sont pas associs avec les mutations polymorphes habituelles [11] . Lanomalie est le plus souvent lie, sur le plan biochimique, des substitutions touchant un seul, voire deux acides amins (plus quelques trs rares dltions), sous-entendant le caractre ltal dimportantes modications de lenzyme [11]. Un ictre nonatal, qui nest dailleurs pas le rsultat de lhmolyse mais dun dcit hpatique en G6PD, a t dcrit chez des nourrissons en Asie et sur le pourtour mditerranen [11]. En gnral, les mmes mutations correspondent des rgions gographiques contigus ou peuples dindividus ayant une origine similaire [11]. Les mutations les plus rpandues sont numres sur le tableau I.

Tableau I. Distribution au sein des populations des mutations les plus communes concernant la glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PD) [11].
Mutations*
A (-) 202A/376G A (-) 376G/968C Mditerrane 563T Canton 1376T Gaohe 95G, Gaozhou 95G Chine-3 493G Chine-4 392T Chine-5 1024T Aures 143C Ube 241T, Konan 241T Mahidol 487A Santa-Maria 376G/542T Seattle 844C Viangchan 871A Kalyan 949A Chatham 1003A Kaiping 1388G Union 1360T

Populations
Afrique, Italie, Espagne, les Canaries, Mexique Afrique, Espagne, les Canaries Italie, Sardaigne, Grce, Arabie saoudite, Iran, Irak, Isral, gypte, Juifs Ashknazes et Kurdes Chine Chine Philippines Chine Chine et Tawan Algrie, Arabie saoudite, Espagne Japon Asie du Sud-Est, Chine et Tawan Costa Rica, les Canaries, Italie Italie, Sardaigne, Espagnes, les Canaries Inde, Chine, Laos, Philippines Inde Philippines Chine, Laos Philippines, Laos, Chine, Japon, Espagne, Italie, les Vanuatu

NB : *Sont indiqus le numro dordre nuclotidique et la nouvelle base lorigine de la mutation.

Dcit en pyruvate kinase


Il sagit, par sa frquence, de la premire cause gntique danmie hmolytique non sphrocytaire. Depuis sa description en 1961, plus de 500 cas ont t rapports. La transmission est autosomique rcessive. La distribution gographique est mondiale, avec une frquence gnique stendant de 0,1 6 %, les taux les plus levs correspondant aux populations du nord de lEurope. La rpartition des principaux variants dcrits en Europe de lOuest est schmatise dans la gure 3, sachant quen tout, plus de 130 mutations diffrentes ont t retrouves [91].

Dcit en glucose phosphate isomrase


Il constitue la troisime cause gntique en frquence danmie hmolytique non sphrocytaire. Cest une anomalie autosomique rcessive dont la frquence gnique est plus importante chez les Noirs (0,269) que chez les Caucasiens (0,013). Vingt-quatre mutations diffrentes ont t dcrites. La traduction biochimique de ce dcit est une augmentation du taux de G6PD, ralentissant le processus de glycolyse [43].
5

13-000-M-56

Hmatologie et populations

Hmatologie

Rpartition en Europe de lOuest des principaux variants de la pyruvate kinase [91]. Symboles noirs : mutations ltat homozygote, symboles blancs : mutations ltat htrozygote ; cercle : 1529A, toile : 1456T, losange : 721T, diabolo : 514C, triangle : 994A.

Dcit en triose-phosphate isomrase


Cest un dcit frquent chez les Caucasiens (0,1-0,4 %) et surtout chez les Noirs africains (4,6 %). Des avortements rpts peuvent faire dcouvrir cette affection, rarement dcrite en clinique. Parmi les 12 mutations rapportes, celle touchant le codon 104 est la plus frquente chez les Caucasiens alors quelle nest pas retrouve dans les autres groupes ethniques [43].

veineuses. Elle est lie dans 85-90 % des cas une mutation au niveau du facteur V, avec substitution dune arginine par une glutamine en position 506, dite facteur V Leiden [9]. La transmission est autosomique dominante. Le facteur V Leiden reprsente actuellement, par sa frquence, la premire cause de thrombophilie constitutionnelle. Le risque relatif de thrombose veineuse est multipli par 5 10 chez les htrozygotes et par 50 100 chez les homozygotes [81]. La distribution de cette anomalie varie largement selon les zones gographiques (tableau II). Elle est frquente au sein de la population caucasienne (3 7 %) mais trs rare chez les Africains ou les Asiatiques. Une tude a retrouv un effet fondateur, estimant que la mutation est survenue il y a entre 21 000 et 34 000 ans, aprs la divergence des peuples non africains par rapport aux Africains et aprs la sparation plus rcente des Caucasodes et des Mongolodes [93] . En Europe, il existe un gradient dcroissant nord/sud. La frquence de lallle est de 0,075 dans le sud de la Sude [21] et de 0,014 en Italie [84]. Nanmoins, cest chez les Grecs que lon observe la frquence la plus leve de porteurs de cette anomalie [66]. En France, la frquence alllique a t chiffre chez des donneurs de sang 2,59 % en rgion parisienne (597 individus) et 1,72 % dans le sud de la France (492 individus) [50]. Les tudes effectues en Amrique du Nord donnent divers rsultats retant lhtrognit de la population du fait des vagues migratoires rcentes [66]. En ce qui concerne le sud de ce continent, aucun cas de facteur V Leiden na t mis en vidence chez les populations indignes, ce qui est bien en accord avec leur origine asiatique [17]. Le facteur V Leiden nest pas associ aux cas de RPCa rencontrs chez les Chinois [78] ou au Mexique [72]. Des travaux ont suggr que la prvalence du facteur V Leiden tait de 0 % chez les Basques [5, 66]. Dans ces variations, il faut tenir compte de la taille des populations tudies et des critres pour slectionner les individus. Le diagnostic de RPCa est fait par des tests fonctionnels dhmostase et la mise en vidence du facteur V Leiden seffectue par analyse de lacide dsoxyribonuclique (ADN) par polymerase chain reaction (PCR).

Pathologies de lhmostase
DFICITS EN FACTEURS DE LA COAGULATION

Mutation du facteur II (variant G20210A)


Cette anomalie gntique, correspondant la substitution dune guanine par une adnine au niveau du nuclotide 20210 de la rgion 3 de la prothrombine (ou facteur II), se traduit par une lvation des taux plasmatiques de ce facteur [65]. Elle constitue en frquence le second polymorphisme en tant que facteur de risque de thrombose veineuse. On dnombre de 1 5 % dhtrozygotes dans la population caucasienne (prvalence comparativement plus grande au sud quau nord de lEurope) [ 6 9 ] . Dans une population hollandaise, ce variant a pu tre mis en vidence chez 18 % des patients ayant prsent une thrombose [65]. Cette mutation est exceptionnelle chez les Africains et les Asiatiques. Le tableau III reprsente la distribution du variant PT20210A travers le monde partir de lanalyse de plus de 1 800 individus non apparents provenant de 22 pays non europens. Parmi eux, un seul cas a t retrouv, en Inde. On peut y ajouter labsence de la mutation chez les Inuits du Groenland [23]. Cette distribution, semblable celle du facteur V Leiden, a pu suggrer une origine unique, apparue probablement au dbut de la colonisation moderne de lEurope et disperse par les migrations du nolithique loccasion de la diffusion de lagriculture il y a 10 000 ans [68]. Il semble que cet effet fondateur se situerait plutt aprs les divergences des Africains davec les non-Africains et des sous-groupes Caucasodes davec les Mongolodes [94]. Il a t montr combien la distribution du facteur V Leiden et du variant PT20210A tait conne lEurope, expliquant la plus grande propension des Europens prsenter des thromboses veineuses [67]. Y aurait-il un avantage slectif de cet tat biologique prothrombotique en Europe mais pas ailleurs ?
POLYMORPHISMES GNTIQUES DES FACTEURS DE LA COAGULATION : LEXEMPLE DU FACTEUR XIII

Le nombre des patients atteints de dcits autosomiques rcessifs des facteurs de la coagulation (II, V, VII, X, XI, XIII et brinogne) est signicativement augment parmi les groupes humains fort degr de consanguinit. Il est en augmentation dans nos socits occidentales (incidence habituelle entre 1/500 000 et 1/2 000 000) en raison par exemple des mouvements dimmigration de populations islamiques, chez lesquelles lincidence est dix fois suprieure, du fait des coutumes incitant aux mariages consanguins [64]. Le dcit en facteur XI, dcrit pour la premire fois par Rosenthal en 1953 (syndrome de Rosenthal ou hmophilie C), a une incidence estime 1/10 6 et il est intressant tudier sur le plan anthropologique. Les manifestations de cette coagulopathie varient entre la complte absence de symptmes et la survenue dhmorragies la suite de traumatismes ou dactes chirurgicaux [76]. La prvalence la plus leve de dcit en facteur XI est constate chez les Ashknazes (environ 8 %) alors que ce dsordre ne se rencontre que de faon sporadique dans dautres populations [75]. Une relative forte frquence de ce dcit a galement t dcrite dans la population basque [6], o lon observe une mutation spcique [92]. Les dcits combins en facteurs V et VIII (dsordre autosomique rcessif), que lon peut retrouver de faon rare dans bon nombre de populations du globe, semblent plus frquents autour de la Mditerrane et plus particulirement chez les Juifs spharades et du Moyen-Orient [32].
ANOMALIES GNTIQUES PRDISPOSANT LA THROMBOSE

Rsistance la protine C active lie au facteur V

Leiden
La rsistance la protine C active (RPCa) constitue un facteur biologique majeur prdisposant aux manifestations thrombotiques
6

Le polymorphisme Val34Leu de la sous-unit A du facteur XIII, qui est situ proximit du site dactivation par la thrombine, serait protecteur vis--vis de linfarctus du myocarde chez les coronariens,

Hmatologie

Hmatologie et populations

13-000-M-56

Tableau II. Prvalence du facteur V Leiden travers le monde [66].


Pays
Europe Grce Sude Allemagne Royaume-Uni Islande Autriche Espagne France Hollande Finlande Italie Groenland Basques Afrique Sngal Zambie Kenya Amrique du Nord Blancs Noirs Ashknazes Jamacains Amrique du Sud Indiens du Prou Indiens du Brsil Noirs du Brsil Asie et Moyen-Orient Russie Inde Arabie saoudite Chine Indonsie Japon Core Mongolie Sri Lanka Ocanie Australie Australie Papouasie-Nouvelle-Guine

Individus tests
187 101 1 043 381 96 104 50 51 474 137 1 207 133 28 96 95 308 704 307 91 91 19 83 137 156 203 255 254 105 270 93 36 47 73 126 95

Htrozygotes
24 10 72 26 3 5 2 2 14 4 33 0 0 0 0 0 42 4 2 0 0 0 1 10 5 5 0 0 0 0 0 0 0 5 0

Homozygotes
1 1 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Frquence dallle (%)


7,0 5,9 3,6 3,4 2,6 2,4 2,0 2,0 1,5 1,5 1,4 0 0 0 0 0 3,0 0,65 1,1 0 0 0 0,4 4,5 1,2 0,98 0 0 0 0 0 0 0 2,0 0

des accidents vasculaires crbraux ischmiques, de lembolie pulmonaire et des thromboses veineuses profondes. La frquence de cet allle varie selon les ethnies : 0,25 chez les Caucasiens, 0,13 chez les Indiens dAsie et 0,40 chez les Indiens Pimas [1].

Adaptation du systme rythropotique chez les populations vivant en altitude


La principale limitation du transport de loxygne haute altitude est constitue par la baisse de la capacit de transport de loxygne sur lhmoglobine en raison de lhypoxie alvolaire. Ladaptation logique serait un abaissement de la P50 (pression en oxygne en millimtres de mercure laquelle les sites de xation sur lhmoglobine sont occups 50 %). des altitudes modrment leves (3 100 m), il existe pourtant une rponse physiologique paradoxale se traduisant par une augmentation du taux de 2-3 DPG (diphosphoglycrate) intrarythrocytaire majorant la P50. Il y a une corrlation inverse nette entre la valeur de la P50 et le taux dhmoglobine. Les sujets porteurs de variants de lhmoglobine avec affinit accrue pour loxygne ont une meilleure tolrance physique et une meilleure capacit dadaptation haute altitude mais prsentent souvent une rythrocytose secondaire. Les individus avec une hmoglobine Andrew-Minneapolis (P50 : 17 mmHg) arrivent maintenir 3 100 m une saturation normale en oxygne et ne prsentent pas dlvation du taux drythropotine. On les surnomme les lamas humains par analogie ces animaux vivant

dans les hauts massifs montagneux du globe (Andes et Himalaya) et qui prsentent les mmes caractres physiologiques adaptatifs. Il nest pas prouv que les populations humaines vivant haute altitude prsentent ces processus biologiques. Dans lHimalaya par exemple, les Sherpas ont moins dhypoxie et un plus faible gradient de tension en oxygne alvoloartriel que les sujets vivant en plaine, ce qui pourrait reter plutt une meilleure capacit de diffusion pulmonaire quune affinit accrue de lhmoglobine pour loxygne. altitude gale de lieux de vie, les Tibtains (du fait probablement dune histoire plus longue de rsidence haute altitude) ont des taux dhmoglobine plus bas et un volume globulaire moyen plus faible que les populations andines [39] . Chez tout sujet non autochtone, un sjour en altitude va se traduire par une synthse drythropotine en raction la baisse de la PO2 qui va conduire une polyglobulie dadaptation.

Anomalies de lhmogramme
LEUCONEUTROPNIE ETHNIQUE

Une leuconeutropnie hrditaire bnigne est observable chez les sujets peau noire provenant de divers groupes humains : Africains, Indiens, Arabes de Jordanie, Juifs ymnites et Falashahs, bdouins. Elle semble sexpliquer par un dfaut de libration des leucocytes de la moelle hmatopotique vers le sang circulant. Cette particularit nentrane pas de consquences particulires sur le plan infectieux [74].
7

13-000-M-56

Hmatologie et populations

Hmatologie

Tableau III. Distribution du variant PT20210A travers le monde [67].


N*
Europe du Nord Europe du Sud Moyen Orient Ymen Afrique Cte-dIvoire Rpublique Centrafricaine Madagascar Kenya Mali Total Asie du Sud Inde Asie centrale et du Sud-Est Indonsie Birmanie Cambodge Thalande Tawan Vietnam Hong Kong Mongolie Total Asie Australe Papouasie-Nouvelle-Guine Vanuatu Tonga Micronsie Total Amrique centrale et du Sud Indiens du Brsil Nuu-Chah-Nulth Huicholes du Mexique Total

Htrozygotes

Homozygotes

Frquence dallle
0,0085 0,015

95

143 39 99 45 63 389

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0**

158 272 83 54 85 34 24 32 20 604

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,003 0 0 0 0 0 0 0 0 0**

174 81 82 28 365

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0**

122 35 43 200

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0**

*Nombre dindividus tudis ; **diffrence signicative de frquence de la mutation en comparaison avec les rsultats europens selon le test exact de Fisher (valeurs du p : Afrique : 0,001, Asie Centrale et du Sud-Est : < 0,0001, Asie Australe : 0,002, Amrique : 0,03).

HYPEROSINOPHILIES PARASITAIRES

Ces perturbations hmatologiques sont extrmement frquentes sur la plante et retent linfestation par des helminthes, souvent en rapport avec le mode de vie des individus, le manque dhygine, et dpendant sur le plan goclimatique de la prsence des vecteurs adquats. Les principales tiologies des hyperosinophilies dans les zones tropicales sont les larioses, les schistosomiases, lankylostomiase et languillulose. Sous nos climats europens, cest la grande douve du foie Fasciola hepatica qui est le plus souvent en cause en liaison avec la consommation de cresson porteur de kystes. Lascaridiose, qui se contracte par lingestion dufs contaminant la nourriture, est prsente chez environ un milliard dtres humains et habituellement asymptomatique. La lariose lymphatique, transmise par la piqre dun moustique, est due Wuchereria bancrofti (Amrique latine, Asie, les du Pacique et Afrique sub-saharienne), Brugia malayi (Asie du Sud-Est) ou Brugia timori (Indonsie). La loase Filaria loa loa, qui svit en Afrique du Centre-Ouest, se transmet par la piqre dune mouche de type chrysops. Lonchocercose Onchocerca volvulus (dont le vecteur est un moucheron) est trs prvalente autour des rivires dAfrique quatoriale et dAmrique centrale o elle reprsente la cause majeure de ccit. La trichinose se contracte en consommant de la viande de porc insuffisamment cuite. Elle est frquente en Asie du Sud-Est et inconnue chez les peuples smites du fait du tabou religieux. La mningite osinophilique Angiostrongylus cantonensis se rencontre en Asie du Sud-Est et dans le Pacique et est en rapport avec la consommation de mollusques deau douce. Les schistosomiases Schistosoma (ou bilharzioses) sont transmises par le contact cutan avec leau douce infecte par des larves. Trois espces principales infectent lhomme : S. haematobium (Afrique et
8

Moyen-Orient, vritable problme de sant publique depuis des millnaires sur les bords du Nil), S. mansoni (Moyen-Orient, Carabes et Amrique du Sud) et S. japonicum (Chine, Japon et Asie du Sud-Est) [47].
POLYGLOBULIE DES CHUVASHS

Les polycytmies primaires ou secondaires sont des entits rares qui ont t rapportes sans spcicit gographique particulire jusqu ce que soit publie par des auteurs russes une forme de polycytmie congnitale familiale atteignant une population particulire, les Chuvashs, vivant au bord de la rgion moyenne de la Volga. Il sagit dune affection autosomique rcessive. Le taux moyen dhmoglobine est suprieur 22 g/dL alors que les taux de leucocytes et de plaquettes demeurent strictement normaux. Du fait des consquences rhologiques induites par cette affection, se traduisant par des accidents thrombotiques ou hmorragiques, les porteurs de cette anomalie dpassent rarement le cap des 40 ans [77]. Cette anomalie est associe une mutation dans le gne lorigine du syndrome de von Hippel-Lindau (VHL) sous la forme dune substitution CT qui provoque lapparition dun rsidu tryptophane la place dune arginine en position 200. La protine mute VHL ne remplit plus son rle habituel dans la dgradation dun facteur inductible par lhypoxie (HIF1) do la prsence dun tat dhyperactivation de certains gnes stimulant lrythropose, en particulier le gne codant pour lrythropotine [3]. Le taux drythropotine endogne est signicativement major mais il ny a pas de modications au niveau de son rcepteur [77]. Plus de 100 cas parmi 81 familles avaient t rpertoris ds 1977. Il existe plusieurs milliers de porteurs htrozygotes de laffection dans cette

Hmatologie

Hmatologie et populations

13-000-M-56

population. Quelques cas ont t dcrits rcemment dans des familles originaires dAsie ou dEurope de lOuest.

Tableau IV. Rpartition des mutations du gne de lhmochromatose au sein de diverses populations [57].
Population
Basques Irlandais Italiens Grecs Turcs Allemands Sngalais Kenyans Sri Lankais Mexicains Jamacains Colombiens

Anomalies du mtabolisme martial


HMOCHROMATOSE HRDITAIRE CLASSIQUE EUROPENNE

Total
28 45 91 139 31 53 130 78 109 54 90 47

Frquence allle H63D (%)


30,4 18,9 12,6 11,9 17,7 18,9 0 1,3 9,2 6,5 2,2 0

Frquence allle C282Y (%)


3,6 10 0,5 1,4 0 1,9 0 0 0 0 1,1 0

Lhmochromatose gntique est responsable dune accumulation excessive de fer dans certains viscres (foie, pancras, cur) du fait dune absorption intestinale anormalement accrue [2] . Le syndrome clinique incluant un diabte, une cirrhose et un accroissement de la pigmentation cutane a t dcrit initialement par Trousseau en 1865. Presque un quart de sicle plus tard, le terme hmochromatose est attribu ce syndrome et lexcs de fer tissulaire est mis en vidence par von Recklinghausen. En 1935, Joseph Sheldon, un grontologue britannique, conclut la nature gntique de la maladie et limplication dun trouble du mtabolisme martial. La preuve de ce substratum gntique a t apporte en 1976 quand une quipe rennaise a dmontr la relation troite avec la spcicit HLA-A3 [79]. La principale mutation (C282Y) lorigine de ce dsordre mtabolique a t rapporte en 1996 au niveau du gne HFE, situ sur le bras court du chromosome 6, qui correspond au niveau protique au remplacement en position 282 dune cystine par une tyrosine [29]. Des tudes ont abouti dater cette mutation environ 104 gnrations, avec une anciennet chiffre environ 2 000 ans (intervalle de conance 90 % : 7503 400 ans) [49]. partir de ltude des dsquilibres de liaison, dautres auteurs pensent que la mutation originelle semblerait tre survenue il y a environ 2 800 ans, de faon contemporaine des massives migrations des populations celtes puis secondairement sous leffet des invasions des Vikings [90]. Dautres hypothses sont envisageables. Les hommes du palolithique jouissaient dun rgime alimentaire riche en viande, ce qui leur fournissait une grande quantit de fer directement absorbable [26]. Avec le dveloppement de lagriculture et la diminution de consommation des produits dorigine animale, le dcit dapport en fer t son apparition. Lhmochromatose gntique a pu ainsi confrer un avantage slectif dans les endroits o les apports alimentaires en fer taient limits [4]. De nos jours, cette maladie constitue une des affections de transmission gntique les plus rpandues dans les populations nord-europennes (notamment chez les Celtes) [57]. Sur la base des donnes obtenues chez plus de 11 000 donneurs de sang, on estime quau moins un allle de ce type est port par un Amricain dorigine europenne sur dix [28]. La mutation accessoire H63D correspond la substitution en position 63 dune histidine par un acide aspartique. Lhomozygotie C282Y ou lhtrozygotie composite C282Y et H63D constituent les prsentations gntiques les plus communes de cette maladie. Quelques quipes ont tudi la rpartition de ces mutations selon les aires gographiques. Ainsi, lunit dhmatologie molculaire dOxford a examin 5 956 chromosomes issus de 2 978 personnes originaires des cinq continents, la recherche de ces deux mutations par PCR suivie dune analyse par restriction enzymatique. La prvalence globale dans la population mondiale est de 1,9 % pour lallle C282Y et de 8,1 % pour H63D. La distribution de lallle C282Y est maximale chez les Irlandais (10 %) et de 0 sur 1 042 chromosomes africains, 484 chromosomes asiatiques et 644 chromosomes dAustralie. Les Basques ont la plus haute frquence de lallle H63D (30,4 %) [57] (tableau IV). Environ 15 % des cas europens dhmochromatose gntique ne sont pas relis ces deux mutations. Lquipe de Brest a dcrit en 1999 une mutation S65C du gne HFE pouvant tre implique dans les formes modres de la maladie [60]. La protine HFE mute est lorigine du phnomne dhyperabsorption digestive du fer. Des mutations au niveau du gne TFR2 (transferrin receptor 2) ont galement t rapportes [14, 55]. Des effets fondateurs secondaires ont t individualiss chez des Australiens et des Sud-Africains.

SURCHARGE MARTIALE AFRICAINE

La surcharge martiale constitue dans certaines rgions dAfrique Noire un problme de sant publique qui est sous-estim et dont lanomalie gntique causale nest pas encore isole, puisque la mutation HFE nest pas retrouve et quil ny a pas de lien avec le locus HLA [33, 35]. Cette entit a t dcrite pour la premire fois en 1929 par lEcossais Strachan dans sa thse de doctorat en mdecine, propos de plus de 500 cas autopsiques tudis Johannesburg [34]. En Afrique sub-saharienne (Ouganda, Kenya, Tanzanie, Mozambique, Malawi, Zambie, Zimbabwe, Lesotho, Botswana, Afrique du Sud, Swaziland, Angola, ex-Zare), on estime que la prvalence de cette anomalie associe une atteinte hpatique est de lordre de 10 % [33, 35]. Il sagit de populations descendant de peuples parlant le dialecte bantou (do lancienne appellation de laffection sidrose des Bantous ). Il y aurait un facteur nutritionnel par le fait dun rgime trop riche en fer. La boisson fermente traditionnelle (bire) est en effet fabrique dans les familles lintrieur de rcipients en acier non-galvanis, do lautre nom donn de surcharge martiale nutritionnelle [35]. Cette pathologie a tendance devenir plus rare en zone urbaine mais elle se maintient dans les campagnes o cette tradition alimentaire se perptue. Il ne sagit pas dune forme dhpatopathie alcoolique avec surcharge ferrique et les dpts de fer dans le foie ont une rpartition cellulaire distincte des hmochromatoses gntiques HFE. Cette surcharge en fer sassocie un risque accru de mortalit par tuberculose et carcinome hpatocellulaire [34]. Outre lhypothse purement alimentaire, il semble que laffection ait galement un support gntique. Le phnotype pathologique apparat en fait rsulter dune interaction entre une surcharge dapport en fer et lexpression dun gne favorisant laccumulation de ce mtal dans lorganisme et qui na pas t encore caractris. Il sagit l dune intressante combinaison entre les phnomnes gntiques et pristasiques. Une surcharge signicative en fer peut tre galement rencontre chez les Afro-Amricains descendants desclaves, mais son pidmiologie est beaucoup moins connue.

Hmopathies malignes
DONNES PIDMIOLOGIQUES GNRALES

Il existe normment de littrature concernant lpidmiologie et la recherche des facteurs de risque pour les leucmies et les lymphomes. De faon gnrale, leur frquence semble plus faible en Asie quen Amrique du Nord ou en Europe [63]. Pour les leucmies lymphodes, les frquences sont quatre cinq fois plus leves lOuest ; ce ratio passe 10 pour la leucmie lymphode chronique, qui est une maladie rare en Orient. Les Asiatiques migrs aux tatsUnis conservent cette caractristique, cela suggrant lintervention dun facteur gntique plutt quenvironnemental. Lincidence du mylome multiple est peu prs double chez les Afro-Amricains par rapport aux Caucasiens. Parmi les leucmies aigus mylodes (LAM), la forme promylocytaire (M3) semble trs signicativement
9

13-000-M-56

Hmatologie et populations

Hmatologie

plus frquente chez les Latino-Amricains et les Espagnols. Cela a t retrouv dans des tudes effectues au Mexique [71], au Prou [62], en Espagne [82] et chez les immigrs dorigine hispanique vivant en Californie. Chez ces derniers, la forme M3 reprsentait 38 % des cas de LAM par rapport 7 % pour les patients dautres origines [25]. Le phnomne dallongement de la dure de vie des populations de nos socits dites dveloppes conduit une augmentation de frquence de plusieurs types dhmopathies malignes, en particulier les LAM et les mylodysplasies. Les expositions des produits toxiques ne sont ventuellement pourvoyeuses que de cas isols dhmopathies lexception probablement des grandes catastrophes (attaques atomiques de Nagasaki et Hiroshima, accident de la centrale nuclaire de Tchernobyl ?) dont les rpercussions relles sur les populations en termes de morbidit et de mortalit nont jamais t divulgues avec prcision. Les lymphomes non hodgkiniens ont une incidence qui a considrablement augment ces dernires annes dans les pays industrialiss, sans quaucune explication claire ne soit avance.
LYMPHOME DE BURKITT ET VIRUS DEPSTEIN-BARR

entre 15 et 20 millions le nombre dindividus porteurs de ce virus travers le monde, avec une incidence augmentant avec lge, cela tant associ avec une fraction croissante de femmes. Les voies de transmission de linfection sont lallaitement (aprs que les IgG maternelles transmises ont disparu), les relations sexuelles (plus frquemment dans le sens homme femme), linoculation de sang infect (transfusions de drivs cellulaires, toxicomanie intraveineuse). Lincidence de lATL est rare chez les porteurs du virus (< 5 %). Le virus HTLV I nintervient que de faon tardive et selon des modalits encore imparfaitement connues dans la leucmogense. Ce virus est galement en cause dans des maladies extrahmatologiques, neurologiques ou inammatoires [86].
HMOPATHIES MALIGNES ET VIRUS DE LHPATITE C

Cette maladie maligne a t dcrite en 1958 par Dennis Burkitt qui, bien quignorant initialement sa composante infectieuse, est aussi lorigine des tudes pidmiologiques effectues en Afrique sur cette tumeur. On la rencontre avec les frquences les plus leves en Afrique quatoriale et en Nouvelle-Guine, qui sont des rgions aux conditions goclimatiques particulires concernant laltitude, la temprature, la pluviomtrie et la prsence du paludisme Plasmodium falciparum. Pratiquement tous les cas africains sont associs une positivit srologique concernant le virus dEpsteinBarr (EBV). Cest dailleurs galement le cas dans un fort pourcentage de ceux constats dans les pays en voie de dveloppement, alors que limplication de ce virus dans le lymphome de Burkitt est rare au sein des pays industrialiss (autour de 20 % des cas). Les cas africains se situent en outre dans des rgions dendmie palustre. Le paludisme et lEBV sont tous deux de puissants inducteurs mitognes vis--vis des lymphocytes B, le premier nomm ayant en plus un effet immunosuppresseur [61, 83]. On doit donc considrer deux sous-groupes, les cas endmiques et les non-endmiques. Les premiers se caractrisent par un pic de survenue plus prcoce (5-7 ans contre 15 ans dans nos contres) et une localisation prfrentielle la mchoire alors que les ganglions msentriques sont les plus frquemment touchs dans les zones non endmiques [61]. LEBV est galement impliqu dans la maladie de Hodgkin, dont lpidmiologie est clairement diffrente entre les populations des pays pauvres et celles des pays riches.
LEUCMIES/LYMPHOMES CELLULES T LIES L HUMAN T-CELL LYMPHOTROPIC VIRUS TYPE-I

La prvalence du virus de lhpatite C (VHC) varie selon les pays avec en Europe un gradient nord/sud, lItalie tant lun des pays les plus touchs (2 3 %). Le VHC est associ aux cryoglobulinmies mixtes, qui voluent parfois vers des lymphomes de bas grade. Lassociation entre VHC et lymphomes non hodgkiniens na t tablie pratiquement quen Italie (parfois aux tats-Unis et au Japon) et concernant des types histologiques particuliers de phnotype B (immunocytomes, lymphomes lymphoplasmocytaires, lymphomes de la zone marginale) [10] . La prsence dun ou de plusieurs cofacteur(s) encore inconnu(s) explique(nt) vraisemblablement cette particularit gographique. Trs rcemment, le mme virus a t retrouv avec des frquences signicativement plus leves dans les mylomes en Italie.
LYMPHOMES GASTRIQUES DU MUCOSA-ASSOCIATED LYMPHOID TISSUE ET INFECTION HELICOBACTER PYLORI

Le dveloppement du lymphome gastrique du mucosa-associated lymphoid tissue (MALT), reprsentant entre 1 et 5 % des tumeurs malignes de lestomac, est dpendant de linfection par Helicobacter pylori. Une incidence particulirement forte de cette entit a t rapporte dans le nord-est de lItalie en association avec une frquence leve de gastrites Helicobacter pylori [24].
APLASIES MDULLAIRES IDIOPATHIQUES

Il existe une liaison tiologique entre le virus HTLV I (Human T-cell lymphotropic virus type-I) et les leucmies/lymphomes cellules T (ATL). On retrouve une intgration monoclonale de lADN proviral dans les cellules tumorales. Ce virus est endmique surtout dans le sud du Japon mais aussi dans les Carabes et certaines rgions dAfrique, dAmrique latine, du Moyen-Orient et du Pacique (ou bien sr chez les immigrants provenant de ces rgions). On estime

La frquence de cette pathologie est estime environ 2/1 000 000/an. Il a t retrouv une incidence peu prs double en Thalande (et mme triple dans la province de Khonkaen) [42]. Une vaste tude effectue sur 21 provinces chinoises a dbouch sur une incidence de 7,4/1 000 000 [19]. Dans tous les cas, les zones rurales sont plus touches que les villes. Laplasie dite posthpatitique est plus rare en Asie que dans les populations europennes ou nordamricaines. En Thalande, de mauvaises conditions socioconomiques [40] et un antcdent dexposition certains virus [41] sont considrs comme des facteurs de risque. Il est noter que cette forte incidence daplasie mdullaire semble galement retrouve chez les populations originaires de lest et du sud de lAsie migres au Canada, ce qui laisse supposer une implication importante des facteurs gntiques [56]. Par ailleurs, outre lExtrmeOrient, laplasie mdullaire semble surreprsente en Inde, en Amrique latine et peut-tre en Afrique, qui constituent galement des pays de bas niveaux socio-conomiques.

Rfrences
[1] Alhenc-Gelas M. Le facteur XIII, polymorphismes gntiques et consquences fonctionnelles. Hmatologie 2000 ; 6 : 131-135 [2] Andrews NC, Levy JE. Iron is hot: an update on the pathophysiology of hemochromatosis. Blood 1998 ; 92 : 1845-1851 [3] Ang SO, Chen H, Hirota K, Gordeuk VR, Jelinek J, Guan Y, Liu E et al. Disruption of oxygen homeostasis underlies congenital Chuvash polycythemia. Nat Genet 2002 ; 32 : 614-621 [4] Barton JC, Bertoli LF. Hemochromatosis: the genetic disorder of the twenty-rst century. Nat Med 1996 ; 2 : 394-395 [5] Bauduer F, Ducout L, Guerre C, Freyburger G. Activated Protein C (APC) resistance : does it exist in the Basques? Br J Haematol 1997 ; 99 : 712-713 [6] Bauduer F, Dupreuilh F, Ducout L, Marti B. Factor XI deciency in the french Basque country. Haemophilia 1999 ; 5 : 187-190 [7] Bernard J. Esquisse dune hmatologie gographique. Nouv Rev Fr Hematol 1963 ; 3 : 51-55 [8] Bernard J, Ruffi J. cologie humaine - Caractres hrditaires du sang. In : Hmatologie gographique (tome I). Paris : Masson, 1966 : 1-436 [9] Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, Rosendaal FR, Dirven RJ, De Ronde H et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994 ; 369 : 64-67 [10] Besson C, Pialoux G, Mariette X, Lefrre F, Brechot C, Hermine O. Lymphomes non hodgkiniens et virus de lhpatite C. Hmatologie 2000 ; 6 : 156-163 [11] Beutler E. G6PD deciency. Blood 1994 ; 84 : 3613-3636

10

Hmatologie
[12] Bouhassira EE, Schwartz RS, Yawata Y, Ata K, Kanzaki A, Qiu JJ et al. An alanine to threonine substitution in protein 4. 2 cDNA is associated with a Japanese form of hereditary haemolytic anemia (protein 4. 2 Nippon). Blood 1992 ; 79 : 1846-1854 [13] Calabro V, Giacobbe A, Vallone D, Montanaro V, Cascone A, Filosa S et al. Genetic heterogeneity at the glucose-6phosphate dehydrogenase locus in southern Italy: a study on a population from the Matera district. Hum Genet 1990 ; 86 : 49-53 [14] Camaschella C, Roetto A, Cali A, De Gobbi M, Garozzo G, Carella M et al. The gene TFR2 is mutated in a new type of haemochromatosis mapping to 7q22. Nat Genet 2000 ; 25 : 14-15 [15] Cao A, Galanello R, Rosatelli MC. Prenatal diagnosis and screening of the haemoglobinopathies. Baillires Clin Haematol 1998 ; 11 : 215-238 [16] Carson PE, Flanagan CL, Ickes CE, Alving AS. Enzymatic deciency in primaquine sensitive erythrocytes. Science 1956 ; 124 : 484-485 [17] Cavalli-Sforza LL, Menozzi P, Piazza A. The history and geography of human genes. Princeton : Princeton University Press, 1994 [18] Chiu D, Zuo L, Chao L, Chen E, Louie E, Lubin B et al. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deciency in patients of chinese descent and identication of new base substitutions in the human G6PD. Blood 1993 ; 81 : 2150-2154 [19] Chongli Y, Xiaobo Z. Incidence survey of aplastic anemia in China. Chin Med SciJ 1991 ; 6 : 203-210 [20] Cohen T. Genetic markers in migrants to Israel. Isr J Med Sci 1971 ; 7 : 1509-1514 [21] Dahlbck B. Are we ready for factor V Leiden screening? Lancet 1996 ; 347 : 1346-1347 [22] Daniels G. Human blood groups. Oxford : Blackwell Science, 1995 [23] De Maat MP, Bladbjerg EM, Johansen LG, Gram J, Jespersen J. Absence of prothrombin mutation in the Inuit. Thromb Haemost 1998 ; 79 : 882 [24] Doglioni C, Wotherspoon AC, Moschini A, De Boni M, Isaacson PG. High-incidence of primary gastric lymphoma in northeastern Italy. Lancet 1992 ; 339 : 834-835 [25] Douer D, Preston-Martin S, Chang E, Nichols PW, Watkins KJ, Levine AM. High-frequency of acute promyelocytic leukemia among Latinos with acute myeloid leukemia. Blood 1996 ; 87: 308-313 [26] Eaton SB, Konner M. Paleolithic nutrition: a consideration of its nature and current implications. N Engl J Med 1985 ; 312 : 283-289 [27] Eber SW, Armbrust R, Schrter W. Variable clinical severity of hereditary spherocytosis: relation to erythrocyte spectrin concentration, osmotic fragility and autohemolysis. J Pediatr 1990 ; 117: 409-416 [28] Edwards CQ, Griffen LM, Goldgar D, Drummond C, Skolnick MH, Kushner JP. Prevalence of hemochromatosis among 11065 presumably healthy blood donors. N Engl J Med 1988 ; 318 : 1355-1362 [29] Feder JN, Gnirke A, Thomas W, Ruddy DA, Basava A, Dormishian F et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet 1996 ; 13 : 399-408 [30] Flint J, Harding RM, Boyce AJ, Clegg JB. The population genetics of haemoglobinopathies. Bailleres Clin Haematol 1998 ; 11 : 1-51 [31] Gill JC, Endres-Brooks J, Bauer PJ, Marks WJ Jr, Montgomery RR. The effect of ABO blood group on the diagnosis of von Willebrand disease. Blood 1987 ; 69 : 1691-1695 [32] Ginsburg D, Nichols WC, Zivelin A, Kaufman RJ, Seligsohn U. Combined factors V and VIII deciency, the solution. Haemophilia 1998 ; 4 : 677-682 [33] Gordeuk VR. Hereditary and nutritional iron overload. Bailleres Clin Haematol 1992 ; 5 : 169-186 [34] Gordeuk VR, McLaren CE, McPhail AP, Deichsel G, Bothwell TH. Associations of iron overload in Africa with hepatocellular carcinoma and tuberculosis: Strachans1929 thesis revisited. Blood 1996 ; 87 : 3470-3476 [35] Gordeuk VR, Mukiibi J, Hasstedt SJ. Iron overload in Africa: interaction between a gene and dietary iron content. N Engl J Med 1992 ; 326 : 95-100 [36] Greene LS. G6PD deciency as protection against Falciparum malaria. An epidemiologic critique of population and experimental studies. Yearbook Phys Anthropol 1993 ; 17 (suppl 36) : 153-163 [37] Groupe de travail de lOMS. Dcit en glucose-6phosphate dshydrognase. Bull OMS 1990 ; 68 : 13-24 [38] Hirono A, Beutler E. Molecular cloning and cDNA sequence for human glucose-6-phosphate dehydrogenase variant A (-). Proc Natl Acad Sci USA 1988 ; 85 : 3951-3954 [39] Hsia CC. Respiratory function of haemoglobin. N Engl J Med 1998 ; 338 : 239-247 [40] Issaragrisil S, Kaufman D, Anderson T, Chansung K, Thamprasit T, Sirijirachai J et al. An association of aplastic anemia in Thailand with low socioeconomic status. Br J Haematol 1995 ; 91 : 80-84

Hmatologie et populations
[41] Issaragrisil S, Kaufman D, Thongput A, Chansung K, Thamprasit T, Piankijagum A et al. Association of seropositivity for hepatitis viruses and aplastic anemia in Thailand. Hepatology 1997 ; 25 : 1255-1257 [42] Issaragrisil S, Leaverton PE, Chansung K, Thamprasit T, Porapakham Y, Vannasaeng S et al. Regional patterns in the incidence of aplastic anemia in Thailand. Am J Hematol 1999 ; 61 : 164-168 [43] Jacobasch G. Biochemical and genetic basis of red cell enzyme deciencies. Best Pract Res Clin Haematol 2000 ; 13 : 1-20 [44] Jarolim P, Palek J, Amato D, Hassan K, Sapak P, Nurse GT et al. Deletion in the band 3 gene in malaria resistant Southeast Asian ovalocytosis. Proc Natl Acad Sci USA 1991 ; 88 : 11022-11026 [45] Kaeda JS, Chotray GP, Ranjit MR, Bautista JM, Reddy PH, Stevens D et al. A new glucose-6-phosphate dehydrogenase variant, G6PD Orissa (44 Ala Gly), is the major polymorphic variant in tribal populations in India. Am J Hum Genet 1995 ; 57 : 1335-1341 [46] Kurdihaidar B, Mason PJ, Berrebi A, Ankrabadu G, Alali A, Oppenheimer A et al. Origin and spread of the glucose-6phosphate dehydrogenase variant (G6PD-Mediterranean) in the Middle East. Am J Hum Genet 1990 ; 47 : 1013-1019 [47] Leder K, Weller PF. Eosinophilia and helminthic infections. Baillieres Clin Haematol 2000 ; 13 : 301-317 [48] Livingstone FB. Frequency of haemoglobin variants. Oxford : Oxford University Press, 1985 [49] Lonjou C, Collins A, Ajioka RS, Jorde LB, Kushner JP, Morton NE. Allelic association under map error and recombinational heterogeneity: a tale of two sites. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95: 11366-11370 [50] Lucotte G, Mercier G. Frequency of factor V Leiden (Arg506Gln). Br J Haematol 1997 ; 99 : 237-241 [51] Lux SE, Palek J. Disorders of the red cell membrane. In : Handin RI, Lux SE, Stossel TP eds. Blood: principles and practice of haematology. Philadelphia : JB Lippincott, 1995 : 1701-1818 [52] Luzzatto L. Genetics of red cells and susceptibility to malaria. Blood 1979 ; 54 : 961-976 [53] Luzzatto L, Battistuzzi G. Glucose-6-phosphate dehydrogenase. In : Harris H, Hirschhorn K eds. Advances in human genetics. New York : Plenum Press, 1985 : 217-329 [54] Martini G, Toniolo D, Vulliamy TJ, Luzzatto L, Dono R, Viglietto G et al. Structural analysis of the X-linked gene encoding human glucose-6-phosphate dehydrogenase. Eur Mol Biol Org J 1986 ; 5 : 1849-1855 [55] Mattman A, Huntsman D, Lockitch G. Transferrin receptor 2 (TfR2) and HFE mutational analysis in non-C282Y iron overload: identication of a novel TfR2 mutation. Blood 2002 ; 100 : 1075-1077 [56] McMahon E, Tang K, Rogers PC, McBride ML, Schultz KR. The impact of Asian descent on the incidence of acquired severe anaemia in children. Br J Haematol 2003 ; 121 : 170-172 [57] Merryweather-Clarke AT, Pointon JJ, Shearman JD, Robson KJ. Global putative haemochromatosis mutations. J Med Genet 1997 ; 34 : 275-278 [58] Missiou-Tsagaraki S. Screening for glucose-6-phosphate dehydrogenase deciency as a preventive measure: prevalence among 1286000 Greek newborn infants. J Pediatr 1991 ; 119 : 293-299 [59] Mourant AE, Kopec AC, Domaniewska-Sobczak K. The distribution of human blood groups and other polymorphisms. London : Oxford University Press, 1976 [60] Mura C, Raguenes O, Ferec C. HFE mutations analysis in 711 hemochromatosis probands: evidence for S65C implication in a mild form of hemochromatosis. Blood 1999 ; 93 : 2502-2505 [61] Okano M. Haematological associations of Epstein-Barr virus infection. Best Pract Res Clin Haematol 2000 ; 13 : 199-214 [62] Otero JC, Santillana S, Fereyros G. High-frequency of acute promyelocytic leukaemia among Latinos with acute myeloid leukaemia. Blood 1996 ; 88 : 377 [63] Parkin DM, Whelan SL, Ferlay J, Raymond L, Young J. Cancer incidence in ve continents. Vol VII. Lyon : IARC scientic publications, 1997 [64] Peyvandi F, Duga S, Akahvan S, Mannucci PM. Rare coagulation deciencies. Haemophilia 2002 ; 8 : 308-321 [65] Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996 ; 88 : 3698-3703 [66] Rees DC. The population genetics of factor V Leiden (Arg506Gln). Br J Haematol 1996 ; 95 : 579-586 [67] Rees DC, Chapman NH, Webster MT, Guerreiro JF, Rochette J, Clegg JB. Born to clot: the European burden. Br J Haematol 1999 ; 105: 564-566 [68] Rees DC, Cox M, Clegg JB. World distribution of factor V Leiden. Lancet 1995 ; 346 : 1133-1134

13-000-M-56
[69] Rosendaal FR, Doggen CJ, Zivelin A, Arruda VR, Aiach M, Siscovick DS et al. Geographic distribution of the 20210 G to A prothrombin variant. Thromb Haemost 1998 ; 79 : 706-708 [70] Ruffi J, Bernard J. Hmatologie gographique et dynamique des populations. Nouv Rev Fr Hmatol 1979 ; 21 : 321-346 [71] Ruiz-Argelles GJ. Promyelocytic leukaemia in Mexican Mestizos. Blood 1997 ; 89 : 348 [72] Ruiz-Argelles GJ, Gonzalez-Estrada S, Garcs-Eisele J, RuizArgelles A. Primary thrombophilia in Mexico: a prospective study. Am J Hematol 1999 ; 60 : 1-5 [73] Ruwende C, Khoo SC, Snow RW, Yates SN, Kwiatkewski D, Gupta S, Warn P et al. Natural selection of hemi- and heterozygotes for G6PD deciency in Africa by resistance to severe malaria. Nature 1995 ; 376 : 246-249 [74] Schoenfeld Y, Alkan ML, Asaly A, Carmeli Y, Katz M. Benign familial leukopenia and neutropenia in different ethnic groups. Eur J Haematol 1988 ; 41 : 273-277 [75] Seligsohn U. High gene frequency of factor XI (PTA) deciency in Ashkenazi Jews. Blood 1978 ; 51 : 1223-1228 [76] Seligsohn U. Factor XI deciency. Thromb Haemost 1993 ; 70 : 68-71 [77] Sergeyeva A, Gordeuk VR, Tokarev YN, Prchal JF, Sokol L, Prchal JT. Congenital polycythemia in Chuvashia. Blood 1997 ; 89 : 2148-2154 [78] Shen MC, Lin JS, Tsay W. High-prevalence of antithrombin III, protein C and protein S deciency, but no factor V Leiden mutation in venous thrombophilic Chinese patients in Taiwan. Thromb Res 1997 ; 87 : 377-385 [79] Simon M, Bourel M, Fauchet R, Genetet B. Association of HLA-A3 and B14 antigens with idiopathic hemochromatosis. Gut 1976 ; 17 : 332-334 [80] Stevens DJ, Wanachiwanawin W, Mason PJ, Vulliamy TJ, Luzzatto L. G6PD Canton, a common decient variant in South-East Asia caused by a 459 arg ? leu mutation. Nucleic Acids Res 1990 ; 18 : 7190 [81] Svensson P, Dahlbck B. Resistance to activated protein C as a basis for venous thrombosis. N Engl J Med 1994 ; 330 : 517-521 [82] Tomas JF, Fernadez-Ranada JM. About the increased frequency of acute promyelocytic leukaemia among Latinos: the experience from a center in Spain. Blood 1996 ; 88 : 2357-2358 [83] Tosato G, Taga K, Angiolillo AL, Sgadari C. Epstein-Barr virus as an agent of haematological disease. Baillires Clin Haematol 1995 ; 8 : 165-199 [84] Tosetto A, Gatto E, Rodeghiero F. APC resistance (FV Leiden) has a higher prevalence in females. Preliminary results from the Vicenza thrombophilia and arteriosclerosis (VITA) project. [abstract]. Thromb Haemost 1995 ; 73 : 1124a [85] Tournamille C, Le Van Kim C, Gane P, LePennec PY, Roubinet F, Babinet J et al. Arg89Cys substitution results in very low membrane expression of the Duffy antigen/receptor for chemokines in Fy (x) individuals. Blood 1998 ; 92 : 2147-2156 [86] Tsukasaki K, Koeffler P, Tomonaga M. Human T-lymphotropic virus type I infection. Best Pract Res Clin Haematol 2000 ; 13 : 231-243 [87] Usanga EA, Luzzatto L. Adaptation of Plasmodium falciparum to glucose-6-phosphate dehydrogenase decient host red cells by production of parasite-encoded enzyme. Nature 1985 ; 313 : 793-795 [88] Vulliamy TJ, DUrso M, Battistuzzi G, Estrada M, Foulkes NS, Martini G et al. Diverse point mutations in the human glucose-6-phosphate dehydrogenase gene cause enzyme deciency and mild or severe haemolytic anemia. Proc Natl Acad Sci USA 1988 ; 85 : 5171-5175 [89] Vulliamy TJ, Othman A, Town M, Nathwani A, Falusi AG, Mason PJ et al. Polymorphic sites in the African population detected by sequence analysis of the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene outline the evolution of the variants A and A-. Proc Natl Acad Sci USA 1991 ; 88 : 8568-8571 [90] Worwood M. Haemochromatosis. Clin Lab Haematol 1998 ; 20 : 65-75 [91] Zanella A, Bianchi P. Red cell pyruvate kinase deciency: from genetics to clinical manifestations. Best Pract Res Clin Haematol 2000 ; 13 : 57-81 [92] Zivelin A, Bauduer F, Ducout L, Peretz H, Rosenberg N, Yatuv R et al. Factor XI deciency in Basques is predominantly caused by an ancestral C38R mutation in the factor XI gene. Blood 2002 ; 99 : 2448-2454 [93] Zivelin A, Griffin JH, Xu X, Pabinger I, Samama M, Conard J et al. A single genetic origin for a common caucasian risk factor for venous thrombosis. Blood 1997 ; 89 : 397-402 [94] Zivelin A, Rosenberg N, Faier S, Kornbrot N, Peretz H, Mannhalter C et al. A single genetic origin for the common prothrombotic G20210A polymorphism in the prothrombin gene. Blood 1998 ; 92 : 1119-1124

11

Hmatopose et facteurs de croissance

Hmatologie [13-000-M-85] (1997)

Frdric Fger : Docteur en pharmacie, matre de confrences des Universits Laboratoire d'hmatologie molculaire et cellulaire, facult de pharmacie, 4, avenue de l'Observatoire, 75006 Paris France William Vainchenker : Directeur de recherche 1 Inserm U 362, Institut Gustave Roussy, PR1, 39, rue Camille-Desmoulins, 94805 Villejuif cedex France

Rsum
L'hmatopose peut tre dfinie comme l'ensemble des mcanismes qui assurent le remplacement continu et rgul des diffrentes cellules sanguines. Il s'agit d'un systme cellulaire complexe qui aboutit ajuster trs prcisment la production cellulaire aux conditions de base et aux agressions extrieures l'organisme (infections, hmorragies, etc). Ce systme cellulaire est un systme hirarchis compos de trois compartiments : les cellules souches pluripotentes, les progniteurs et les cellules en cours de maturation terminale. Les cellules les plus primitives avec une potentialit mylode et lymphode sont capables de reconstituer l'hmatopose long terme d'animaux irradis tandis que d'autres moins immatures sont des cellules capables de reconstituer l'hmatopose court terme. Les progniteurs hmatopotiques sont pour la plupart dtermins vers une seule ligne et sont capables aprs quelques mitoses (3 20) de donner des cellules matures. La rgulation de l'hmatopose est assure en grande partie par des facteurs de croissance appartenant la superfamille des cytokines. Ils agissent soit sur les diffrentes tapes de la diffrenciation, soit des stades prcis, en particulier prcocement. La spcificit d'action des cytokines est lie la restriction d'expression de leurs rcepteurs. Une minorit de facteurs de croissance rgule l'hmatopose l'tat de base (homostasie), la plupart sont des mdiateurs d'une raction de dfense de l'organisme. La rgulation des cellules souches est assez mal connue, en particulier le rle prcis des divers facteurs de croissance sur leur mise en cycle, leur dtermination ou orientation de leur diffrenciation, et leur hypothtique proprit d'autorenouvellement. En revanche, ces facteurs de croissance ont une action majeure sur la survie, la prolifration et la diffrenciation des progniteurs hmatopotiques et sur les cellules en cours de maturation. 1997 Elsevier Masson SAS - Tous droits rservs

Haut de page

INTRODUCTION
Les cellules du sang (globules rouges, polynuclaires neutrophiles, osinophiles, et basophiles, monocytes, plaquettes et enfin lymphocytes B et T) appartiennent au moins huit lignages diffrents. Elles sont, soit les lments cellulaires terminaux, soit des lments de transition, comme les lymphocytes ou les monocytes, vers des cellules plus diffrencies tissulaires. Leur nombre reste constant malgr des capacits de prolifration nulles ou trs faibles (monocytes, osinophiles) et une dure de vie limite (globules rouges : 120 jours, plaquettes : 7 jours, polynuclaires : 24 heures chez l'homme), ceci grce un remplacement continu avec une dynamique exceptionnelle pour un tissu adulte (chaque heure, 1.1010 hmaties et 4.108 leucocytes sont produits). L'hmatopose est le systme cellulaire complexe qui aboutit la production des cellules du sang et l'ajustement trs prcis de leur production aux conditions de base et aux diverses agressions extrieures l'organisme. Dans ce chapitre, nous tudierons essentiellement la rgulation des lignes mylodes et nous exclurons partiellement de cette tude les lignes lymphodes.

Haut de page

CELLULES H MATOPO TIQUES


L'hmatopose chez l'homme adulte a lieu dans la moelle osseuse au niveau des cavits des os comme le sternum, les ctes, les vertbres, le sacrum et les os longs. Chez les rongeurs, la rate est galement un organe hmatopotique. Contrairement aux autres tissus haut pouvoir de production cellulaire, il n'y a pas d'organisation stratifie vidente au sein de la moelle osseuse ; il n'y a sgrgation ni entre lignes cellulaires ni entre stades de maturation. L'hypothse la plus probable pour assurer une production cellulaire aussi importante tait l'existence d'un compartiment trs minoritaire de cellules souches hmatopotiques, cellules capables la fois de se diffrencier vers toutes les lignes et de s'autorenouveler. En fait, les techniques d'hmatologie exprimentale ont permis de montrer que l'hmatopose tait beaucoup plus complexe, avec une hirarchie cellulaire comprenant schmatiquement trois compartiments (fig 1).

Un compartiment de cellules souches pluripotentes de dure de vie longue, capables de se diffrencier vers toutes les lignes hmatopotiques y compris les lignes lymphodes T et B, et de reconstituer l'hmatopose dans des expriences de greffe. Il existe actuellement un nombre croissant d'arguments exprimentaux montrant que ces cellules, d'une part ne sont pas capables d'un autorenouvellement extensif, d'autre part ont des capacits de prolifration trs importantes mais limites qui pourraient tre responsables de leur htrognit. Un compartiment de progniteurs clonogniques, cellules capables de

prolifrer in vitro en se diffrenciant sous l'effet de facteurs de croissance. Ces cellules sont habituellement dtermines vers un seul lignage cellulaire, mais certaines peuvent avoir encore plusieurs potentialits. Il est habituel de diffrencier les progniteurs matures dtermins vers une seule ligne, qui rpondent un seul facteur de croissance, des progniteurs plus primitifs pluripotents, qui rpondent des combinaisons de facteurs de croissance ou des molcules d'origine stromale. Les frontires entre progniteurs primitifs et les cellules souches qui reconstituent l'hmatopose sont actuellement floues, ce qui entrane une confusion dans le terme de cellules souches hmatopotiques. Ces deux compartiments de cellules (cellules souches et progniteurs) correspondent des cellules non morphologiquement reconnaissables et rares parmi les cellules hmatopotiques (autour de 0,3 % des cellules mdullaires pour les progniteurs matures, de 0,03 % pour les progniteurs primitifs et vraisemblablement dix fois moins pour les cellules pluripotentes lymphodes/mylodes). Cette raret explique les efforts mens pour purifier, essentiellement sur des antignes de diffrenciation, les cellules souches hmatopotiques et les progniteurs. Enfin, un compartiment de maturation o les cellules sont morphologiquement reconnaissables et ont commenc synthtiser les principales protines spcifiques de ligne. A la fin de ce processus de maturation, les cellules hmatopotiques passent travers la barrire endothliale pour circuler dans le sang. Ce phnomne est probablement rgul par des molcules spcialises. Les avantages de cette hirarchie cellulaire, construite sur un modle pyramidal, sont de permettre : o une amplification norme mais modulable de la production car chaque compartiment cellulaire comprend un nombre important de mitoses (fig 1) ; o une rgulation fine de la production qui peut avoir lieu diffrents niveaux cellulaires.

Existence d'une cellule souche pluripotente


Historiquement, la technique des colonies splniques chez la souris [86] a t le premier moyen de mettre en vidence des cellules appartenant au compartiment des cellules souches hmatopotiques.

CFU-S, cellule primitive commune aux lignes mylodes


Une souris est irradie 1 000 rads, dose suffisante pour dtruire son systme hmatopotique. Des cellules hmatopotiques sont injectes par voie veineuse. Lorsque l'animal est sacrifi vers le 12e jour, des colonies cellulaires macroscopiques pouvant atteindre 2 106 cellules matures sont visibles dans la rate, d'o le terme de CFU-S (colony forming unit in the spleen). La majorit des colonies est mixte, c'est--dire compose de cellules de plusieurs lignes cellulaires. En revanche, si l'animal est sacrifi plus tt vers le 7e jour, la majorit des colonies est compose d'un seul type cellulaire. Chaque colonie est d'origine clonale (elle drive de la prolifration d'une seule cellule). Les cellules donnant naissance aux colonies splniques ont t longtemps considres comme de vritables cellules souches hmatopotiques. En fait, il est apparu que cette population cellulaire est trs htrogne. Une partie seulement des cellules capables de donner des colonies splniques 12 jours et rsistantes des drogues tuant les cellules en cycle, comme le 5-FU (5-fluorouracile), est capable de reconstituer l'hmatopose chez la souris irradie.

Existence d'une cellule souche commune aux lignes lymphodes et mylodes


L'existence d'une cellule avec une potentialit lymphode et mylode, capable de reconstituer l'hmatopose long terme, a t dmontre par des expriences de greffe associes l'tude de marqueurs de clonalit. Il s'agissait initialement d'un marqueur cytogntique, puis le site d'intgration d'un rtrovirus non rplicatif, s'intgrant de manire alatoire dans le gnome, a t utilis. Au-del de 3 mois aprs la greffe, le mme marqueur de clonalit est retrouv dans tous les lignages hmatopotiques, signifiant que la reconstitution hmatopotique long terme est assure par une cellule potentialit lymphode et mylode . Cette reconstitution est oligoclonale et une mme cellule est capable pendant une vie entire (> 1 an) d'assurer toute l'hmatopose. Au contraire, la reconstitution court terme est polyclonale et lie la diffrenciation de cellules ayant des potentialits restreintes, soit mylodes, soit lymphodes.

Htrognit des cellules souches murines


Ces expriences de greffe chez la souris ont permis de caractriser les long-term reconstituting cells (LTRC), responsables de la reconstitution hmatopotique long terme , et qui sont considres par la plupart des auteurs comme les seules vraies cellules souches. Cependant, lorsque des animaux sont greffs avec un faible nombre de cellules purifies, les LTRC ne sont pas capables d'assurer l'hmatopose court terme et l'animal meurt dans les premires semaines suivant la greffe. ct de ces LTRC, il existe des cellules capables de reconstituer l'hmatopose court terme (moins de 3 mois) et de protger l'animal d'une cytopnie induite par des agents ionisants ou une chimiothrapie. Ces cellules ne semblent pas avoir de potentialit lymphode et mylode, du moins sur le critre de clonalit. Pour arriver quantifier prcisment les LTRC, il a fallu dfinir de nouveaux tests de reconstitution (tests de reconstitution comptitifs) [83] dans lesquels deux types cellulaires sont utiliss simultanment : des cellules qui, aprs diverses manipulations, n'ont que des capacits de reconstitution court terme et permettent la survie des animaux dans les premires semaines de la greffe, et les cellules que l'on veut tester pour leurs capacits reconstituer l'hmatopose long terme (fig 2). Pour certains auteurs, une petite partie des CFU-S du 12e jour serait des LTRC ; pour d'autres, les LTRC et les CFU-S sont deux entits totalement diffrentes [41]. Les LTRC seraient donc une population de pr-CFU-S [34]. Des expriences rcentes suggrent que les LTRC sont capables de cloner directement in vitro dans des conditions particulires.

Existence d'une cellule souche pluripotente chez l'homme


Jusqu' ces dernires annes, les arguments en faveur de l'existence chez l'homme d'une cellule souche pluripotente reposaient sur la pathologie. En particulier, la leucmie mylode chronique (LMC) se caractrise par une translocation t(9 ; 22) qui aboutit au chromosome Philadelphie et au rarrangement des gnes bcr et abl ; or celle-ci est retrouve dans les rythroblastes, les granulocytes, les macrophages, les mgacaryocytes, les lymphocytes B et une partie des lymphocytes T [23]. Plus rcemment, utilisant divers marqueurs lis au chromosome X, il a pu tre dmontr que la reconstitution hmatopotique aprs-

greffe pouvait tre clonale et tre assure par une seule cellule avec une potentialit mylode et lymphode [87].

Tests biologiques permettant d'tudier les cellules souches humaines


Des efforts importants ont t consacrs ces dernires annes dfinir des tests biologiques simples in vivo et in vitro (cruciaux chez l'homme) permettant de mettre en vidence et de quantifier les cellules souches hmatopotiques (fig 2 et 3). Thoriquement, une cellule souche doit tre capable :

d'autorenouvellement (donner au moins une cellule fille identique la cellule initiale) ; de se diffrencier vers tous les lignages hmatopotiques, y compris les lignes lymphodes.

Nous reviendrons plus loin dans cet expos sur la notion d'autorenouvellement, qui est difficile dfinir. Pour des raisons pratiques, chez la souris, une cellule souche hmatopotique a t dfinie comme une cellule capable de reconstituer l'hmatopose long terme. Cette dfinition, inoprante chez l'homme, explique le dveloppement des tests in vitro et l'utilisation de tests xnogniques de reconstitution de l'hmatopose.

Tests in vitro
Deux types de tests in vitro ont t dvelopps, dont les rapports exacts avec les tests in vivo chez la souris restent actuellement imprcis. Les uns, clonaux, sont effectus en milieu semi-solide et sont directement inspirs des tests utiliss pour caractriser les progniteurs hmatopotiques clonogniques dtermins (cf infra). Les autres sont bass sur le concept que les cellules les plus primitives ne clonent pas directement et sont des pr-CFU. Ils comprennent une incubation initiale en milieu liquide en prsence d'un stroma comptent (selon le principe des cultures de Dexter [19] ou de Whitlock Witte [95]) ou encore de facteurs de croissance qui permettent la diffrenciation de ces cellules en progniteurs, puis une deuxime phase de clonage en milieu semi-solide.

Tests clonaux Les tests clonaux caractrisent un progniteur primitif par sa pluripotence (CFUGEMM [colony forming unit granulo-erythro-mono-megakaryocyte]), ses capacits de prolifration leves et sa pluripotence (HPP-CFC [high proliferative potentialcolony forming cell], CFU-A [A pour agar]) ou par ses capacits d' autorenouvellement (CFU-bl [colony forming unit-blast]).

Les CFU-GEMM ou CFU mix, sont des progniteurs capables de donner des colonies pluripotentes in vitro, en particulier de tous les types mylodes, habituellement vers le 14e jour de culture chez l'homme [21]. L'existence d'une potentialit lymphode B de certaines CFU-GEMM reste un problme actuellement discut. Cependant, ces CFU-GEMM ont des proprits de prolifration limites et ne peuvent tre considres comme des cellules souches. Les HPP-CFC [7] et les CFU-A [74]. Ces progniteurs clonogniques ont des capacits de prolifration trs leves et donnent des colonies macroscopiques (> 100 000 cellules). La limite de ce type d'essai est lie au fait que l'identification de ces cellules n'est base que sur la taille des

colonies, constitues essentiellement de macrophages. La taille et la composition cellulaire de ces colonies dpendent en fait troitement des conditions de stimulation. Une partie de ces colonies drive d'un progniteur pluripotent. Dans le modle murin, les progniteurs de type HPP-CFC ou CFU-A semblent tre trs proches des CFU-S du 12e jour. Les CFU-bl sont des cellules capables de donner in vitro des colonies de blastes entre le 18e et le 32e jour de culture la fois chez l'homme et la souris [9]. Lorsque les cellules de ces colonies sont remises en culture, elles donnent de nouveau des colonies de cellules hmatopotiques de diffrents types : granuleux, rythroblastiques, mixtes, voire de nouveau blastiques. Sur ce dernier argument, les CFU-bl sont considres comme capables d'autorenouvellement.

Cultures long terme en milieu liquide Elles conduisent dfinir les LTC-IC (long-term culture-initiating cell). Ce test indirect est bas sur deux notions :

dans des cultures en prsence d'un stroma, les progniteurs clonogniques ont une dure de vie courte (2 3 semaines) ; les cellules plus primitives, en prsence de molcules d'origine stromale, peuvent se diviser et produire des progniteurs clonogniques partir de la 4e -5e semaine de culture [19]. La prsence tardive de progniteurs est donc le reflet de l'existence d'une cellule plus primitive qu'un progniteur clonognique qui est appele LTC-IC. La technique consiste tablir d'abord un stroma, habituellement allognique chez l'homme, mais de plus en plus frquemment xnognique, en utilisant des lignes stromales murines tablies [39], puis ajouter ce stroma des cellules humaines, le plus souvent purifies [81]. Aprs 5 10 semaines, les cellules sont reclones en milieu semi-solide et les progniteurs sont quantifis. En ralisant ces expriences des concentrations cellulaires proches de la dilution limite, il est possible de quantifier trs prcisment le nombre de LTC-IC dans l'chantillon utilis. Chez l'homme, on considre qu'une LTC-IC donne en moyenne quatre progniteurs, mais avec une grande variabilit suivant l'origine des cellules tester et les conditions de culture [81].

Ce test long (au total 10 semaines) et techniquement lourd est actuellement considr comme la rfrence pour les explorations in vitro des temps prcoces de l'hmatopose. Chez l'homme, il existe des arguments montrant qu'une partie des LTC-IC a non seulement des capacits de diffrenciation mylode mais galement lymphode B. Les LTC-IC reprsentent une population encore htrogne, mais certaines d'entre elles, soit du fait de leur potentialit lymphode et mylode, soit en raison de leurs capacits donner des progniteurs trs long terme (vers la 10e semaine de culture) sont proches des cellules qui reconstituent l'hmatopose.

Tests de reconstitution hmatopotique xnognique


Le test considr chez la souris comme la rfrence pour caractriser la nature souche d'une cellule hmatopotique est la reconstitution hmatopotique long terme. Il tait donc ncessaire de dvelopper des tests quivalents utilisant des cellules humaines. Des tentatives de reconstitution d'une hmatopose humaine chez l'animal, en particulier chez la souris immunodficiente, ont donc t effectues. Deux protocoles ont t dvelopps. Dans le premier, des organes hmatopotiques humains foetaux dplts en cellules hmatopotiques (fragment d'os, thymus) sont implants dans la souris SCID (severe combined immune deficiency) et les cellules hmatopotiques tester y sont ensuite directement implantes [59]. Ce test, relativement proche d'un test in vitro, permet d'tudier les diffrenciations mylodes, lymphocytaires B et T (lorsque les

injections sont faites dans un thymus) [70]. Dans le second type, les cellules hmatopotiques humaines sont directement injectes par voie intraveineuse, initialement chez des souris SCID irradies [48], et depuis peu chez des souris NOD-SCID (non obese diabetic), souris qui prsentent un dficit immunitaire plus profond que les souris SCID, ou encore chez d'autres souris immunodficientes. Aprs un temps variable (3 semaines 8 mois), l'hmatopose humaine est tudie dans la moelle et la rate des animaux. Ce test met en vidence une diffrenciation mylode, lymphode B et peut-tre T. Il permet galement d'tudier les capacits d'adressage des cellules hmatopotiques dans les divers organes hmatopotiques. Ces modles de souris immunodficientes humanises connaissent un dveloppement important et devraient permettre de mieux dfinir le compartiment des cellules hmatopotiques primitives chez l'homme. Cependant, pour devenir compltement oprationnel, il ncessitera, comme dans les expriences effectues sur l'hmatopose de souris, de disposer de marqueurs de clonalit [69]. D'autres auteurs utilisent la reconstitution hmatopotique chez le mouton en injectant des cellules hmatopotiques au foetus in utero.

Ontogense du tissu hmatopotique et sites de l'hmatopose


A la suite des travaux de Moore [67], il avait t considr que l'hmatopose initiale, dite primitive, dbutait au niveau du sac vitellin. Ensuite, les cellules migraient par voie sanguine dans les futurs organes hmatopotiques du foetus, le foie, la rate et la moelle pour donner l'hmatopose dfinitive intraembryonnaire. Plus rcemment chez l'oiseau, il a pu tre dmontr que l'hmatopose du sac vitellin et intraembryonnaire taient indpendantes avant mme l'existence d'une vascularisation [55]. Il existe en effet une formation de novo de cellules souches intraembryonnaires dans la rgion para-aortique (splanchnopleure para-aortique puis rgion aortique, gonade, msonphros). Ces donnes ont pu tre rcemment tendues aux mammifres, en particulier la souris . Chez l'homme galement, les cellules souches hmatopotiques semblent tre d'origine intraembryonnaire et prennent naissance dans une rgion trs localise de l'aorte [84]. Au cours du dveloppement, le foie devient l'organe hmatopotique essentiel du foetus avant qu'il ne soit suppl par la moelle terme. Chez l'adulte, la moelle est le seul organe hmatopotique, mais il existe un compartiment de cellules souches et de progniteurs circulants dans le sang. La signification de ce compartiment dans la rgulation de l'hmatopose est mal comprise. Les cellules souches du sang circulant semblent avoir des proprits diffrentes de celles de la moelle, avec des capacits de reconstitution hmatopotique suprieures court terme mais infrieures long terme [4]. Ce compartiment de cellules souches circulantes est augment aprs traitement par des facteurs de croissance comme le G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) ou encore aprs certaines chimiothrapies, lors de la correction de la cytopnie. Les mcanismes de cette mobilisation par les facteurs de croissance sont inconnus mais ces cellules mobilises sont actuellement utilises de manire croissante dans les autogreffes.

Ontogense du tissu hmatopotique et proprits des cellules souches

La proprit thoriquement la plus importante pour une cellule souche est sa capacit d'autorenouvellement, ce qui thoriquement signifie qu'elle a des proprits infinies de prolifration. Cette proprit permet une cellule souche, d'une part de maintenir son compartiment constant, et d'autre part de permettre l'hmatopose. La dmonstration d'un autorenouvellement peut tre faite en utilisant des techniques de transplantations itratives [32]. Chez la souris adulte, les capacits de prolifration des cellules souches ne sont pas infinies et sont restreintes au maximum quatre six transplantations successives. En revanche, ces proprits sont plus leves en utilisant des cellules foetales [32]. De mme, dans les techniques de culture in vitro, il est possible d'obtenir, du moins avec certains facteurs de croissance, une large expansion du compartiment de progniteurs hmatopotiques primitifs partir du foie foetal et du sang de cordon, mais moindre partir de moelle adulte [47]. A partir de ces donnes, plusieurs auteurs ont suggr l'hypothse que les cellules souches hmatopotiques de l'adulte ont des capacits de prolifration limite et, comme pour la snescence des fibroblastes, la base molculaire en serait la perte d'un fragment d'ADN (acide dsoxyribonuclique) tlomrique chaque mitose, jusqu' un point critique, qui entrane obligatoirement l'entre de cellules primitives dans la diffrenciation terminale [46]. En revanche, les cellules foetales pourraient maintenir leurs extrmits tlomriques constantes et avoir de vraies proprits d'autorenouvellement. Cette thorie implique donc que, chez l'adulte, il n'y aurait plus de cellules souches au sens thorique du terme, mais un compartiment de cellules pluripotentes trs htrognes, puisque les proprits intrinsques de chacune d'entre elles seraient lies au nombre de mitoses qu'elles ont effectues antrieurement. Cependant, les capacits de prolifration de ces cellules primitives sont trs largement excdentaires par rapport la vie de l'individu, expliquant qu'il n'y a pas d'puisement de l'hmatopose au cours du vieillissement et que les greffes de moelle restent possibles. Le dernier point signaler est que, tt chez l'embryon, les cellules souches hmatopotiques, alors qu'elles ont des capacits de prolifration importante, sont incapables de reconstituer l'hmatopose d'un animal adulte ou mme d'un foetus , suggrant que la dfinition d'une cellule souche comme tant une cellule capable de reconstituer l'hmatopose peut avoir galement certaines limites exprimentales.

Purification des cellules hmatopotiques primitives


Les progniteurs et surtout les cellules souches (<1/100 000 cellules mdullaires) tant extrmement minoritaires, il tait important de les purifier pour comprendre leur htrognit et tudier leur rgulation avec prcision. Depuis une dizaine d'annes, la caractrisation de nombreux antignes de diffrenciation, aussi bien chez l'homme que chez la souris, a permis d'utiliser des techniques de purification trs reproductibles (fig 4). Chez la souris, le travail de Spangrude dans l'quipe de Weissman a permis d'isoler une population enrichie en cellules primitives [77]. Ces cellules sont ngatives pour des marqueurs prsums spcifiques de lignes (Lin- [B220, Mac 1, Gr1, CD4, et CD8]), faiblement positives pour Thy-1 (Thy-1faible) et positives avec l'anticorps Sca reconnaissant l'antigne Ly6A/E (Sca+). Ces cellules Thyfaible Sca+ Lin- reprsentent une population cellulaire trs enrichie, voire quasiment pure en cellules multipotentes avec des potentialits mylode, lymphode T et B (cultures de Whitlock-Witte ou injection in vivo). En fait, les cellules Thyfaible Sca+ Lin- sont htrognes ; un tiers d'entre elles sont capables de maintenir l'hmatopose au-del de 9 semaines avec la fois une

reconstitution mylode et lymphode [78]. La Rh-123 qui se fixe aux membranes mitochondriales a t utilise pour essayer de sous-fractionner cette population Thyfaible Sca+ Lin- car la coloration des cellules primitives est plus faible que celle des autres cellules [72]. L'intensit de la coloration par la Rh-123 est indirectement corrle l'existence d'une ou plusieurs pompes membranaires capables d'exclure activement les colorants vitaux. La principale pompe responsable de cette exclusion est la glycoprotine P(P-GP) (MDR[multi drug resistant]-1) prsente la membrane cellulaire des cellules hmatopotiques primitives [12]. Les cellules les plus primitives sont faiblement colores par la rhodamine (Rh-123faible) et ont des proprits fonctionnelles d'exclusion trs importantes. Les deux fractions cellulaires Thyfaible Sca+ Lin- Rh-123faible et Thyfaible Sca+ Lin- Rh-123fort sont multipotentes avec les mmes capacits de diffrenciation thymique et de formation de colonies de cellules hmatopotiques in vitro [52]. En revanche, les cellules Thyfaible Sca+ LinRh-123faible donnent des colonies splniques avec une trs faible efficacit de clonage, mais elles ont des capacits leves reconstituer l'hmatopose long terme et redonner des CFU-S lorsqu'elles sont injectes l'animal. Cette population reprsente donc une population de cellules plus forte capacit de prolifration que les cellules Thyfaible Sca+ Lin- Rh-123fort qui sont une population homogne de CFU-S avec des capacits faibles de reconstitution long terme [78]. Cette proprit fonctionnelle des cellules hmatopotiques primitives vacuer les colorants vitaux comme le Hoechst est utilise par certains auteurs pour les purifier en une seule tape sans se servir de marqueurs immunologiques [27]. L'antigne CD34 est l'antigne de rfrence pour purifier les cellules primitives de la moelle humaine ou simienne. Le CD34 est un antigne exprim sur 1 - 4 % des cellules mdullaires humaines. La fraction cellulaire CD34+ contient la presque totalit des progniteurs [13] et des LTC-IC. L'injection de cellules CD34 permet la reconstitution hmatopotique chez le babouin et chez l'homme, mais sans preuve dfinitive que l'hmatopose long terme provient des cellules rinjectes. Cependant, la population CD34 est htrogne. Son efficacit de clonage en progniteurs hmatopotiques est de 10 20 %. Elle contient galement des prcurseurs B et T [70], des cellules stromales et des prcurseurs mylodes, en particulier une sous-fraction majoritaire de promonocytes. Des tentatives de sousfractionnement de cette population ont t effectues en s'inspirant des expriences ralises chez la souris. Les antignes les plus utiliss sont HLA (human leukocyte antigen)-DR, CD33, Thy1, CD38 [85] et CD71 et CD45RA. Les fractions CD34+ HLA-DR- ou HLA-DRfaible, CD34+ CD33-, CD34+ Thy1faible, CD34+ CD38-, CD34+ CD71faible CD45RA- sont toutes enrichies en cellules primitives multipotentes doues d'une potentialit lymphode B, et sont plus ou moins dpltes en progniteurs matures suivant le choix des marqueurs utiliss. Toutes ces fractions en fait se recoupent largement, avec une proportion de LTC-IC de 5 15 %. Les cellules CD34+ Thyfaible et CD34+ CD38- sont capables de reconstituer l'hmatopose humaine chez la souris immunodficiente. Cependant, rcemment chez la souris, il a t dmontr que la majorit des cellules Thyfaible Sca+ Lin- tait positive pour le CD34 mais que les cellules Thyfaible Sca+ Lin- CD34sont seules capables de reconstituer l'hmatopose long terme, mme l'chelle d'une seule cellule. Ces rsultats soulignent les difficults dans l'identification immunologique des cellules souches. On ne peut donc exclure qu'une partie des cellules hmatopotiques primitives soit CD34- chez l'homme.

Progniteurs clonogniques
L'existence de cellules intermdiaires entre les cellules souches et les cellules matures qui soient identifiables morphologiquement a t rvle essentiellement par l'introduction des techniques de culture en milieu semi-solide . Ces techniques relativement simples consistent immobiliser des cellules hmatopotiques dans un milieu semi-solide. En prsence d'un stimulant et au bout d'un temps variable,

se forment des colonies faites de cellules matures. La plupart des colonies est compose d'un seul type cellulaire, parfois de deux comme pour la ligne granulomacrophagique, plus rarement de plusieurs types cellulaires. Les techniques de culture d'abord effectues chez la souris ont pu tre ensuite appliques l'homme. Il a t possible de dmontrer les points suivants.

Chaque colonie est clonale et drive d'une seule cellule appele CFU ou CFC (colony forming cell) sigle auquel sont ajoutes les initiales de la ligne, ou encore sous le terme gnral de progniteurs clonogniques. Les progniteurs sont appels, pour la ligne granulomonocytaire CFU-GM, pour la ligne osinophile CFU-Eo, pour les lignes mastocytaires et basophiles CFU-mast. Pour les lignes rythroblastiques et mgacaryocytaires, deux types de progniteurs ont t dfinis, l'un primitif appel BFU-E (burst forming unit-erythroid) ou BFU-MK (burst forming unit-megakaryocyte), car les colonies sont composes de sous-colonies clates, et un progniteur plus mature appel CFU-E [29] et CFU-MK. Les progniteurs dtermins de chaque ligne cellulaire sont une population cellulaire trs htrogne allant d'une cellule proche du compartiment des cellules souches jusqu' des cellules situes une mitose en amont des cellules morphologiquement reconnaissables. En gnral, plus la colonie apparat aprs un long dlai de culture, plus elle drive d'une cellule primitive. La taille de la colonie est aussi le reflet du stade de diffrenciation du progniteur. Les progniteurs ne sont pas morphologiquement reconnaissables ; aprs purification, ils ont l'aspect morphologique d'une cellule lymphode de taille moyenne. Comme pour les compartiments de cellules souches, ces cellules sont enrichies et purifies l'aide d'anticorps dirigs contre des marqueurs de diffrenciation. Jusqu' prsent, il n'existe aucun antigne qui permette de distinguer un progniteur clonognique primitif d'une cellule pluripotente mylode/lymphode. En revanche, les progniteurs matures appartiennent des sous-fractions de cellules CD34 diffrentes de celles des progniteurs primitifs. Par exemple, les progniteurs primitifs sont CD34+ CD38- ou CD34+ Thy1faible alors que les progniteurs matures sont CD34+ CD38+ ou Thy1-. Habituellement, les progniteurs mylodes dtermins expriment certains antignes comme le HLA-DR, le CD109 ou le CD33. Les cellules CD34+ les plus matures peuvent exprimer des marqueurs spcifiques de ligne, comme par exemple le CD19 pour la ligne B, le CD41 pour la ligne mgacaryocytaire ou la myloperoxydase pour la ligne granulomonocytaire. La ligne rythroblastique est caractrise par la disparition du CD34 et du HLA-DR dans la transition entre BFU-E et CFU-E, avec l'apparition concomitante du CD36. Le rcepteur la transferrine (CD71) est fortement exprim sur les progniteurs rythroblastiques ds le stade BFU-E. Les progniteurs matures, pour former des colonies en culture, ont besoin de facteurs de croissance relativement spcifiques de l'hmatopose appels initialement CSF (colony stimulating factor) [63] et actuellement facteurs de croissance hmatopotiques. En revanche, les progniteurs primitifs rpondent non pas un seul facteur de croissance mais une combinaison de facteurs de croissance ncessaires pour assurer leur survie, leur prolifration et enfin la diffrenciation terminale.

L'intrt majeur du systme de culture in vitro est d'avoir procur un test biologique relativement simple pour identifier puis purifier les facteurs de croissance hmatopotiques, cloner leurs gnes afin d'obtenir les protines en grande quantit par gnie gntique et ainsi dmontrer que ces facteurs taient impliqus dans la rgulation de l'hmatopose in vivo.

Progniteurs des neutrophiles et des macrophages (CFU-GM, CFU-G, CFU-Macro)


Les CFU-GM sont les progniteurs de la ligne granulomonocytaire. Parmi les CFUGM, certains distinguent un progniteur bipotent donnant des colonies comprenant des neutrophiles et des monocytes, et des progniteurs unipotents donnant des colonies composes uniquement, soit de granulocytes neutrophiles (CFU-G), soit de monocytes et de macrophages (CFU-Macro). Le stade de diffrenciation suivant correspondrait une cellule proche du myloblaste ou du monoblaste (nomenclature morphologique) donnant in vitro des clusters (colonies de moins de 50 cellules). Chez l'homme, il est d'usage, par analogie avec la ligne rythroblastique, de classer les CFU-GM en pr-CFU-GM, CFU-GM du 14e jour, CFU-GM du 7e jour et ventuellement en cellules donnant des clusters.

Progniteurs des osinophiles (CFU-Eo), des basophiles et des mastocytes (CFU-mast)


Des colonies d'osinophiles peuvent tre obtenues aussi bien chez l'homme que chez la souris. Ces colonies chez l'homme surviennent un peu plus tardivement en culture que les colonies de neutrophiles ou de monocytes. Il existe des colonies d'osinophiles pures, mais galement des colonies mixtes contenant des osinophiles mlangs des neutrophiles, des monocytes et ventuellement d'autres types cellulaires. Des colonies de basophiles/mastocytes ont pu tre galement obtenues.

Progniteurs des rythroblastes (BFU-E, CFU-E)


Les cultures d'rythroblastes ont apport des lments nouveaux pour la comprhension de l'htrognit du compartiment de progniteurs. L'rythropotine (Epo), hormone de l'rythropose, tait connue avant les techniques de clonage in vitro. En se servant de prparations enrichies en Epo comme milieu stimulant, des colonies d'rythroblastes ont t obtenues in vitro. Un premier type de progniteur appel CFU-E (colony forming unit-erythroid) a d'abord t mis en vidence ; ce progniteur donne de petites colonies en 2 3 jours chez la souris et en 5 8 jours chez l'homme, composes de 8 100 rythroblastes regroups en un seul amas. Un second type de colonies a pu tre ultrieurement obtenu en culture. Ces colonies sont trs htrognes, composes d'un grand nombre d'rythroblastes (jusqu' plusieurs dizaines de milliers), rpartis en sous-colonies d'o leur nom de bursts. Les progniteurs dont elles drivent sont appels BFU-E. Elles se diffrencient en 3 14 jours chez la souris et en 10 18 jours chez l'homme. La CFU-E est un prcurseur tardif, proche du prorythroblaste, qui est la premire cellule rythroblastique tre identifie morphologiquement alors que les BFU-E correspondent des cellules plus primitives. Alors que la diffrenciation et la survie des CFU-E est pratiquement uniquement dpendante de l'Epo, aussi bien in vitro qu'in vivo, la diffrenciation initiale des BFU-E dpend d'autres facteurs. L'activit capable d'induire la diffrenciation initiale des BFU-E et la transition vers des CFU-E a t appele BPA (burst promoting activity). Cette activit correspond plusieurs facteurs de croissance qui ne sont pas spcifiques de lignes mais agissent sur la plupart des progniteurs primitifs. Ces rsultats ont donc dmontr la prsence d'une hirarchie cellulaire l'intrieur

du compartiment des progniteurs et ont amen certains auteurs classer les progniteurs de la ligne rythroblastique en trois stades de diffrenciation [29]. Les BFU-E primitives chez la souris et chez l'homme ne sont pas toutes des progniteurs unipotents, les colonies comprenant souvent des mgacaryocytes ou des cellules d'autres lignes. Elles peuvent ventuellement donner des colonies secondaires. Cette nomenclature recoupe donc partiellement celle des CFU-GEMM, voire des CFU-S chez la souris. Les BFU-E matures forment de plus petites colonies, composes d'un faible nombre de sous-units, ne comprenant que des rythroblastes, maximales au 11e-12e jour chez l'homme, alors que les prcdentes sont leur maximum entre le 16e et 18e jour. Ces cellules sont sensibles l'Epo. Enfin les CFU-E. Chez l'homme adulte, alors que dans la moelle les trois stades de progniteurs sont retrouvs, seul un nombre important des deux types de BFU-E, plus particulirement les primitives, circule dans le sang.

Progniteurs des mgacaryocytes (CFU-Meg, CFU-MK)


Les progniteurs des mgacaryocytes peuvent tre clons chez la souris et chez l'homme par diffrentes techniques. Ces colonies sont trs htrognes par leur taille (de deux plusieurs centaines de cellules) et leur aspect (soit serres, soit au contraire tales, voire composes comme les BFU-E de plusieurs sous-units). Cependant, dans l'ensemble, elles sont difficiles identifier surtout lorsqu'elles sont de petite taille. Leur identification a t facilite chez la souris par l'existence d'un marqueur cytochimique spcifique de la ligne mgacaryocytaire, les actylcholinestrases ; chez l'homme, des anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant des protines plaquettaires sont utiliss pour identifier les colonies mgacaryocytaires qui peuvent poser des problmes de reconnaissance difficiles en pathologie. Il existe deux trois mgacaryocytaires [35] : grands types de colonies et de progniteurs

des colonies de grande taille ressemblant un peu aux colonies rythroblastiques drives des BFU-E, faites de plusieurs sous-units et issues de cellules appeles BFU-MK ; des colonies de taille intermdiaire, faites de 10 50 cellules maximum chez l'homme vers le 12e jour de culture, correspondant aux CFU-MK ; des colonies composes d'un nombre faible de mgacaryocytes, voire d'un seul mgacaryocyte, maximal au 7e jour chez l'homme, dont l'origine pourrait tre l'quivalent des CFU-E pour la ligne mgacaryocytaire.

Par ailleurs, il semble exister des liens troits entre la diffrenciation rythroblastique et mgacaryocytaire puisque l'on a montr l'existence d'un progniteur bipotent rythromgacaryocytaire dont l'existence ne semble pas alatoire. Actuellement, partir de cellules CD34+ purifies mais dans des cultures en milieu liquide, il est galement possible dans certaines conditions de stimulation (facteurs de croissance ou cellules stromales) d'obtenir des cellules appartenant au systme immunitaire : cellules NK (natural killers), cellules dendritiques et plus rcemment lymphocytes B. Des cellules T ont t galement obtenues partir de cellules CD34+, soit in vitro en prsence de cellules stromales d'origine thymique, soit dans des cultures organotypiques aprs micro-injection dans des thymus.

Haut de page

R GULATION DE L'H MATOPOSE ET FACTEURS DE CROISSANCE


Les tudes sur la rgulation de l'hmatopose et en particulier les tests clonogniques ont abouti la caractrisation de nombreux facteurs de croissance hmatopotiques. Ces facteurs jouent un rle primordial dans le contrle de l'hmatopose non seulement in vitro mais galement in vivo, soit dans l'homostasie, soit dans la rponse des conditions pathologiques. L'importance de ces facteurs de croissance hmatopotiques dans la rgulation de la production de cellules hmatopotiques explique leur utilisation actuelle en thrapeutique. Cependant, la rgulation de l'hmatopose ne peut tre explique uniquement par l'action de facteurs de croissance hmatopotiques. Il existe, d'une part des facteurs de croissance d'origine stromale, non rellement hmatopotiques, avec des activits trs pliotropes et d'autre part des rgulateurs ngatifs de l'hmatopose qui pourraient rguler le compartiment des cellules primitives. En dehors des facteurs de croissance, les molcules d'adhsion pourraient jouer un double rle :

en permettant le contact direct entre les cellules hmatopotiques et les cellules stromales ou la matrice extracellulaire, elles faciliteraient l'effet des facteurs de croissance produits localement (rgulation paracrine) ; elles pourraient rguler directement la prolifration et la diffrenciation des cellules hmatopotiques.

Les cellules du stroma mdullaire et les protines de la matrice constituent le microenvironnement qui joue un rle important aux diffrentes tapes de l'hmatopose en permettant l'adressage (homing) des cellules hmatopotiques dans la moelle osseuse, en synthtisant les diffrents composants ncessaires la survie, la prolifration et la diffrenciation (facteurs de croissance, inhibiteurs et substrats) des cellules souches et des progniteurs, et en rgulant le passage des cellules hmatopotiques matures travers la barrire endothliale. Avant les techniques de culture, un seul facteur de croissance hmatopotique, l'Epo, tait connu. Ce facteur ayant t purifi, son activit plasmatique pouvait tre mise en vidence par des tests biologiques sensibles effectus, soit sur l'animal entier, soit sur des cultures d'rythroblastes foetaux. Les diffrentes techniques de culture ont procur les tests biologiques ncessaires la caractrisation des facteurs de croissance hmatopotiques. Contrairement aux hypothses initiales, il s'est avr qu'un trs grand nombre de facteurs de croissance agissait sur l'hmatopose, ceci tant li d'une part la redondance entre facteurs de croissance et d'autre part leur synergie. Actuellement, plus de 20 facteurs de croissance hmatopotiques ont t isols mais plusieurs facteurs de croissance considrs comme non hmatopotiques agissent galement sur l'hmatopose. Cependant, le nombre de facteurs de croissance qui rgulent l'hmatopose l'quilibre (homostasie) est faible. Inversement, les facteurs de croissance ne sont pas seulement des facteurs de prolifration mais des modulateurs de la survie cellulaire et des fonctions des cellules matures.

Gnralits sur les facteurs de croissance Isolement des facteurs de croissance

Les techniques de culture en milieu semi-solide et l'obtention de lignes continues hmatopotiques dpendantes de facteurs de croissance ont fourni des outils simples et trs sensibles pour caractriser les divers facteurs de croissance hmatopotiques. Ces facteurs ont t initialement appels colony-stimulating factor (CSF) car leur principale proprit est d'induire in vitro la formation des colonies de cellules hmatopotiques. En fait, un nombre encore plus lev de facteurs de croissance n'induit pas la formation de colonies in vitro lorsqu'ils sont utiliss seuls mais augmente de manire synergique l'effet des CSF. Pour ces raisons, ils sont appels facteurs de croissance synergiques. La presque totalit des facteurs de croissance hmatopotiques appartient la famille des cytokines, molcules synthtises par un grand nombre de cellules, lymphocytes (lymphokines), monocytes (monokines) et cellules du stroma, et agissant par un mode de stimulation paracrine. Les expriences in vitro sur les progniteurs hmatopotiques avaient montr qu'il existait plusieurs types de CSF. En effet, suivant le type de milieu conditionn utilis en culture, des colonies hmatopotiques de lignage diffrent se dveloppaient. partir de ces donnes, plusieurs laboratoires ont purifi des facteurs de croissance hmatopotiques pour ensuite cloner leurs ADN complmentaires (ADNc) et leurs gnes. Cet abord a consist purifier jusqu' l'homognit les facteurs de croissance, contenus dans des milieux conditionns ou des liquides biologiques (urine, plasma), puis squencer une partie de la molcule. Des oligonuclotides dgnrs, dduits partir de cette squence, ont t alors synthtiss qui ont servi cloner l'ADNc du facteur de croissance. En utilisant cet abord, l'ADNc du G-CSF, du M-CSF et de l'Epo ont t clons. Ensuite, du fait des difficults purifier des protines prsentes des concentrations infinitsimales (de l'ordre du pg/mL dans des surnageants), certains ADNc de facteurs de croissance comme ceux du GM-CSF et de l'IL3 (interleukine 3) ont t directement clons par des techniques d'expression. Enfin, plus rcemment, une autre technique utilisant le pigeage du facteur de croissance par un rcepteur orphelin s'est dveloppe. En effet, si les facteurs de croissance hmatopotiques n'ont aucune ou pratiquement aucune homologie au niveau de leur structure primaire, leurs rcepteurs, comme nous le verrons, appartiennent deux grandes familles caractrises par d'importantes homologies structurales entre les divers membres de chaque famille. Il est donc relativement facile de cloner de nouveaux rcepteurs de facteurs de croissance sur la base d'homologies de structure. Cet abord a un intrt majeur pour isoler les facteurs de croissance qui sont difficiles, soit purifier pour des raisons biochimiques, soit tudier in vitro car leurs cellules cibles sont rares.

Structure des facteurs de croissance hmatopotiques


Les facteurs de croissance hmatopotiques sont tous des glycoprotines de poids molculaire variant entre 24 et 90 kDa, dont le contenu en hydrates de carbone reprsente entre le tiers et la moiti de la masse molculaire (MM). Le rle des carbohydrates dans la fonction des facteurs de croissance est minime in vitro, tmoignant qu'ils n'exercent aucune fonction capitale dans l'effet biologique ; en revanche, ils jouent un rle important in vivo en stabilisant la molcule et en modifiant sa clairance. Tous ces facteurs, l'exception du M-CSF, de l'IL5 et de FLT3-L (fetal liver tyrosine kinase 3) (ligand de FLT3), sont des monomres avec des ponts disulfures intracatnaires dont l'intgrit est capitale pour conserver l'activit biologique. Il existe peu d'homologie dans la structure primaire des facteurs de croissance, l'exception de l'Epo et de la thrombopotine (TPO) qui drivent probablement d'un gne ancestral commun. Il existe une certaine homologie entre le G-CSF et les facteurs de croissance de la famille de l'IL6.

Les gnes des facteurs de croissance hmatopotiques sont rpartis sur plusieurs chromosomes. Les gnes de cytokines qui appartiennent une mme famille peuvent tre situs sur des chromosomes diffrents. Cependant, il faut noter que quatre gnes de facteurs de croissance hmatopotiques sont rpartis en tandem sur le bras long du chromosome 5, d'une part IL3 et GM-CSF, et d'autre part IL5 et IL4. De nombreux gnes de cytokines (IL9, IL12) ou de rcepteurs (gp130, c-fms) sont situs sur le bras long du chromosome 5.

Classification des facteurs de croissance hmatopotiques


La classification des facteurs de croissance est actuellement base sur leur fonction. Elle a t initialement dtermine sur des tests in vitro, puis in vivo par l'tude des effets, soit de l'injection de la molcule recombinante, soit de la drgulation de leur synthse. Celle-ci peut tre explore par deux approches : l'une consiste inactiver le gne du facteur de croissance ou encore de son rcepteur (souris knock out), l'autre entraner une scrtion non rgule (souris transgniques ou transfert du gne dans des cellules somatiques du facteur de croissance ou encore de son rcepteur). La premire approche permet de comprendre le rle prcis du facteur de croissance en physiologie ou en rponse un stimulus prcis, la seconde les effets toxiques ou pathologiques d'un taux lev d'un facteur de croissance. Trois classifications peuvent tre proposes suivant la fonction et les cellules cibles des facteurs de croissance hmatopotiques. Dans la premire, les facteurs de croissance sont classs en deux groupes : les CSF et les facteurs synergiques suivant la capacit des facteurs de croissance donner des colonies in vitro (tableau I). La deuxime classification recoupe la premire et classe les facteurs de croissance en trois grandes catgories :

Les facteurs de croissance hmatopotiques qui agissent sur les temps prcoces de l'hmatopose : ce groupe, qui inclut les SCF (stem cell factor), FLT3-L, les cytokines de la famille de l'IL6 (IL6, LIF, IL11, oncostatine-M, cardiotrophine-1), l'IL12, l'IL1 et l'IL4, correspond aux facteurs synergiques de la premire classification. Les CSF non spcifiques de ligne, comme le GM-CSF et l'IL3 agissent sur plusieurs lignes, y compris sur les temps prcoces de l'hmatopose. Le dernier groupe comprend cinq facteurs de croissance (G-CSF, M-CSF, IL5, Epo et TPO) qui ont une activit restreinte un lignage hmatopotique et qui avant tout agissent tardivement au cours de la diffrenciation. Cette classification a certaines limites. Des facteurs comme le G-CSF et la TPO, classs dans le dernier groupe oprent galement sur les temps prcoces de la diffrenciation. Inversement, des facteurs synergiques peuvent agir tardivement sur une ligne comme l'IL6 sur la ligne mgacaryocytaire ou le SCF sur la ligne mastocytaire.

La dernire classification spare les facteurs de croissance en deux groupes : ceux impliqus dans l'homostasie, qui en fait inclut le SCF, le G-CSF, le M-CSF, l'Epo, la TPO et probablement FLT3-L, et ceux responsables de la rponse un stress hmatopotique (GM-CSF, IL3, IL5 et IL6). On pourrait trs bien substituer cette classification purement fonctionnelle une classification base sur le type de rcepteur du facteur de croissance.

Effets biologiques des facteurs de croissance hmatopotiques

Les facteurs de croissance hmatopotiques jouent un rle beaucoup plus important que prvu.

Les facteurs de croissance ne sont pas que des facteurs de survie ou de prolifration des progniteurs hmatopotiques. Ils agissent galement au niveau des cellules matures en augmentant leurs fonctions et leur survie. Leurs effets ne sont pas restreints aux cellules du systme hmatopotique et immunitaire. Certains d'entre eux, comme le M-CSF, pourraient tre impliqus dans l'embryogense et le dveloppement du trophoblaste, d'autres agissent sur d'autres tissus. Ces facteurs de croissance, caractriss d'aprs des tests in vitro, ont des actions similaires in vivo. Certains sont des rgulateurs physiologiques de la production de cellules hmatopotiques ; d'autres sont des mdiateurs de certaines ractions de dfense de l'organisme (inflammation, allergie, dfense anti-infectieuse). Ce sont potentiellement des agents thrapeutiques. Une drgulation ou une anomalie de leur rcepteur peut conduire des tats pathologiques. En particulier, des mutations ou des dltions des rcepteurs des facteurs de croissance peuvent donner lieu des vnements oncogniques lorsqu'elles sont associes un gain de fonction, ou des cytopnies lorsqu'elles sont associes des pertes de fonction. Certaines cytopnies auto-immunes pourraient tre lies la prsence d'anticorps dirigs contre des facteurs de croissance ou leurs rcepteurs. Les facteurs de croissance hmatopotiques ont deux grandes fonctions biologiques bien documentes correspondant la dfinition thorique d'un facteur de croissance. Ils inhibent l'apoptose. La premire dmonstration de cette fonction antiapoptique a t apporte sur des lignes dpendantes de facteurs de croissance, mais ces rsultats ont pu tre tendus aux progniteurs normaux primitifs ou matures et aux cellules en cours de maturation [45]. Les facteurs de croissance hmatopotiques agissent sur la prolifration essentiellement en raccourcissant la phase G1 et en favorisant le passage de G1 en S. Les mcanismes molculaires responsables de ces deux effets sont encore mal connus mais, pour la prolifration, pourraient tre mdis par une diminution de la synthse de la p27 (inhibiteur des diffrents Cdk [cyclines dpendantes kinases]). L'un des points sujets controverse concerne l'effet diffrenciant des facteurs de croissance. En effet, pour certains auteurs, l'action des facteurs de croissance sur la diffrenciation cellulaire serait uniquement lie l'effet antiapoptotique, qui permettrait la ralisation d'un programme gnique prtabli dans la cellule. Cependant, des rsultats obtenus sur des lignes continues leucmiques suggrent que les facteurs de croissance pourraient induire ou modifier des programmes de diffrenciation. Au niveau des cellules matures du sang, les facteurs de croissance sont capables de modifier l'expression de certains gnes comme les intgrines de la famille 1, dans les polynuclaires, ou d'activer certaines fonctions (augmentation de la sensibilit aux agonistes de l'activation plaquettaire pour la TPO ou production de myloperoxydase, de phosphatase alcaline ou de superoxydes par les polynuclaires pour le G-CSF).

Principaux facteurs de croissance hmatopotiques Multi-CSF ou IL3, GM-CSF

commune de transduction.

Caractrisation
Interleukine 3. Le gne de l'IL3 murin a pu tre clon par expression partir de la ligne WEHI 3 (ligne leucmique mylomonocytaire prsentant un rarrangement au niveau du gne de l'IL3) et de lymphocytes T. Ce gne, localis sur le chromosome 11 comme celui du GM-CSF, a cinq exons, et le polypeptide natif contenant 140 acides amins avec un PM de 15 kDa. L'existence de l'IL3 a t conteste chez l'homme pendant quelques annes, car le GM-CSF obtenu par gnie gntique avait une activit multiCSF. Le gne de ce facteur de croissance a finalement t clon par expression partir d'une ligne de lymphocytes T en utilisant des anticorps anti-GM-CSF pour distinguer l'activit propre de l'IL3 de celle du GM-CSF. Ce gne est localis sur le chromosome 5, adjacent celui du GM-CSF (9 kb entre les deux gnes) ; il a galement cinq exons mais a peu d'homologie avec celui de la souris sauf au niveau des parties non codantes. La molcule contenant un pont disulfure a une masse molculaire variant de 14 30 kDa (tableau I). Ces variations sont lies des diffrences dans les O-glycosylations. GM-CSF ou CSF-. Chez la souris, cette glycoprotine a t purifie jusqu' l'homognit, partir de milieu conditionn de tissu pulmonaire, et partiellement squence. L'ADNc a pu tre isol, soit par expression, soit en utilisant des oligonuclotides de synthse partir de banques d'acides ribonucliques (ARN) messagers (ARNm) de cellules pulmonaires ou de lymphocytes T. Le GM-CSF humain (CSF-) a t purifi jusqu' l'homognit partir de la ligne Mo (ligne lymphode infecte par HTLV-2 [human T-cell lymphona virus-2]) ou de lymphocytes T normaux et son gne clon (tableau I). Il s'agit d'une glycoprotine de poids molculaire 22 kDa, (14 kDa pour la partie peptidique). Les deux facteurs humain et murin ont une homologie de 54 % mais il n'y a pas de ractivit biologique croise entre les deux espces.

Actions biologiques
Ces deux facteurs ont une action extrmement polymorphe. Ceci tait tout fait attendu pour l'IL3, appele encore multi-CSF, mais inattendu pour le GM-CSF qui tait considr comme un facteur stimulant uniquement la formation des colonies de neutrophiles et de macrophages. L'IL3 et le GM-CSF ont une action sur la plupart des progniteurs primitifs, y compris les CFU-S chez la souris ainsi que sur les CFU-GEMM et les progniteurs dtermins prcoces de tous les lignages (fig 5 A, B). En gnral, pour les diffrentes lignes, la sensibilit l'IL3 et au GM-CSF diminue lorsque les progniteurs se diffrencient. Ce sont des CSF car l'IL3 et le GM-CSF agissent galement tardivement au cours de la diffrenciation granulomonocytaire et osinophile, entranant la formation de colonies drives de CFU-GM ou de CFU-Eo. Le GM-CSF et l'IL3 sont plus actifs sur la ligne monocytaire que sur la ligne granulocytaire neutrophile. Pour certains auteurs, ces deux facteurs, en l'absence de G-CSF, ne pourraient induire la diffrenciation granulocytaire terminale. Il existe cependant des diffrences entre les actions biologiques de l'IL3 et du GM-CSF.

L'IL3 a une action plus large que celle du GM-CSF. Elle agit plus prcocement au cours de la diffrenciation, a une action plus marque sur les lignes rythroblastiques et mgacaryocytaires que le GM-CSF et pourrait inhiber la diffrenciation lymphocytaire chez la souris. L'IL3 agit sur les lignes basophiles et mastocytaires, alors que le GM-CSF

est inactif sur ces lignages. Le GM-CSF a une activit trs importante sur la ligne monocytaire et active les monocytes. Ces deux facteurs de croissance sont trs actifs sur la ligne osinophile et cette activit est comparable celle de l'IL5. L'IL3 est essentiellement synthtise par les lymphocytes T et accessoirement par les monocytes. Au contraire, le GM-CSF est synthtis par un trs grand nombre de cellules (monocytes, lymphocytes T, cellules stromales).

Aucun de ces deux facteurs ne semble impliqu dans l'homostasie du systme hmatopotique. Les souris ayant le gne du GM-CSF inactiv n'ont aucune anomalie de l'hmatopose, ni des cellules matures, ni des progniteurs. En revanche, elles prsentent une maladie pulmonaire proche d'une protinose alvolaire caractrise, par l'accumulation du surfactant pulmonaire. Ces rsultats suggrent que le GM-CSF rgule la fonction des macrophages pulmonaires. L'inactivation partielle du rcepteur de l'IL3 (chane ou de transduction) n'a pas de consquence sur l'hmatopose, de mme que son inactivation par une stratgie antisens. Les souris transgniques pour le GM-CSF prsentent une maladie mortelle, lie l'infiltration musculaire par des monocytes/macrophages activs, qui aboutit une lyse musculaire. Le transfert du gne du GM-CSF ou de l'IL3 dans les cellules souches murines entrane un syndrome myloprolifratif polyclonal ltal.

Facteurs de croissance restreints une ligne


Nous regrouperons, dans ce paragraphe, cinq facteurs de croissance (G-CSF, Epo, TPO, IL5 et M-CSF). Ces cinq facteurs de croissance ont des actions biologiques prdominant nettement sur un seul lignage (fig 5 C, D). Trois d'entre eux (le GCSF, l'Epo, et la TPO) sont trs proches et ont des actions trs parallles sur les lignes granulocytaire, rythrocytaire et mgacaryocytaire.

G-CSF ou CSF-
Il s'agit d'un facteur essentiellement actif sur la ligne granuleuse neutrophile. C'est une glycoprotine monomrique de PM 19 kDa dans sa forme non glycosyle, et de 25 kDa dans sa forme O-glycosyle, avec deux ponts disulfures, qui a t purifie l'homognit, initialement chez la souris. Le gne du G-CSF humain a t clon et se situe sur le chromosome 17 . Il comprend cinq exons. Deux ARNm de taille diffrente provenant d'un pissage alternatif sont transcrits puis traduits en deux protines diffrentes ; celle de plus haut PM a une activit biologique plus faible mais n'a t dtecte que dans des lignes malignes. Plusieurs points sont souligner sur les proprits du G-CSF.

Il existe une grande homologie entre les facteurs murin et humain. Le G-CSF apparat comme un facteur de diffrenciation de certaines lignes leucmiques murines (WEHI 3) ou humaines (HL 60) ainsi que des blastes leucmiques, plus particulirement les promylocytes. Le G-CSF est relativement spcifique de la ligne granuleuse. Il agit depuis le progniteur jusqu'au polynuclaire mature, augmentant leur fonction et leur survie. Par rapport au GM-CSF et l'IL3, le G-CSF a une activit moins prolifrative, prdominant plus nettement sur la diffrenciation terminale.

Cependant, le G-CSF pourrait avoir une action plus large. Il agit comme facteur synergique au niveau des progniteurs primitifs, voire des cellules souches.

Rcemment, il a t rapport que le G-CSF agissait sur les plaquettes en augmentant leur pouvoir d'agrgation. Le G-CSF agit galement sur des cellules non hmatopotiques comme les cellules endothliales. Il est capable de stimuler la prolifration de lignes drives de cancers petites cellules du poumon ou d'induire la prolifration de blastes leucmiques. Cependant, le G-CSF inject in vivo, lors de cytopnies chimioinduites, n'a jamais t impliqu de faon claire dans la prolifration de cellules malignes ou la rechute de la leucmie. Le G-CSF joue un rle important dans la production granulocytaire l'tat de base et dans les infections. Les souris homozygotes pour la dltion du gne du G-CSF (G-CSF-/-) ont une neutropnie (20 30 % de la normale) [3]. Les souris htrozygotes ont un chiffre intermdiaire de polynuclaires neutrophiles. Les rsultats sont tout fait parallles ceux obtenus aprs l'inactivation du gne de la TPO pour la ligne plaquettaire [18]. Les souris G-CSF-/- gardent un nombre rduit de polynuclaires neutrophiles et de monocytes aprs infection bactrienne, par rapport des souris tmoins. Le G-CSF inject augmente trs rapidement et slectivement le nombre de polynuclaires neutrophiles avec un retour la normale, dans les jours suivant l'arrt des injections. De manire surprenante, le G-CSF augmente jusqu' 100 fois le nombre de progniteurs circulants de toutes les lignes. Il est utilis au cours des procdures de recueil de cellules souches dans le sang pour raliser des autogreffes.

Erythropotine
Cette molcule tait connue ds 1906 la suite des travaux de Carnot et Deflandre [11] et a t purifie l'homognit partir d'urine humaine avant mme les techniques de culture in vitro [66]. Le taux srique est d'environ 20 mU/mL et peut augmenter 100 fois lors d'une anmie. C'est une glycoprotine de PM 33 kDa correspondant 166 acides amins (PM : 18 kDa non glycosyle) avec une activit spcifique suprieure 80 000 U/ mg de protine. Le gne a t clon chez la souris, le singe et l'homme ; il contient cinq exons et code la protine mature associe un peptide signal de 27 acides amins. Il existe environ 80 % d'homologie entre le facteur murin et humain avec une activit biologique passant la barrire d'espce. Le gne humain de l'Epo est situ sur le chromosome 7 dans la rgion q 21. L'Epo obtenue par gnie gntique en transfectant des cellules CHO (chinese hamster ovary) et la protine isole des urines ont les mmes proprits biologiques aussi bien in vitro qu'in vivo. Rcemment, des peptides d'une vingtaine d'acides amins ont t synthtiss ; ils sont capables de mimer les effets de l'Epo. L'Epo est un facteur spcifique de la ligne rythrocytaire, actif la fois in vitro et in vivo, bien qu'in vitro une activit sur la formation des colonies mgacaryocytaires et la maturation terminale mgacaryocytaire ait t dcrite chez l'homme et la souris. Les rsultats rcents montrent que la TPO et l'Epo agissent en synergie sur la diffrenciation mgacaryocytaire et rythroblastique. L'Epo se comporte in vitro comme un facteur de croissance agissant apparemment tardivement au cours de la diffrenciation rythroblastique ; son activit s'exerce au niveau des CFU-E et d'une partie des BFU-E les plus diffrencies. Cependant, le stade prcis o les cellules commencent rpondre l'Epo restait mal prcis. Rcemment, plusieurs quipes ont inactiv le gne de l'Epo ou de son rcepteur. L'inactivation des deux allles (souris Epo-/-) donne un phnotype ltal chez le foetus au moment o l'hmatopose se localise dans le foie foetal [96]. Ces souris ont cependant un nombre de BFU-E et mme de CFU-E normal. Ceci implique que l'Epo, au contraire du G-CSF et de la TPO, ne peut tre remplace par un autre facteur de croissance au cours de la diffrenciation terminale. En revanche, sa

prsence n'est pas ncessaire la transition BFU-E/CFU-E qui pourrait tre assure par le SCF. Les souris htrozygotes (souris Epo-/-) ont un phnotype strictement normal. L'Epo injecte in vivo augmente lectivement le nombre des globules rouges. Des souris transgniques pour l'Epo ou des souris dont l'hmatopose a t reconstitue aprs transfert du gne de l'Epo dans des cellules souches, prsentent une polyglobulie ltale.

TPO ou ligand de Mpl (Mpl-L)


L'existence de la TPO (facteur humoral rgulant la mgacaryocytopose) avait t suggre sur la prsence, chez des animaux thrombocytopniques, d'une activit plasmatique qui augmentait la production plaquettaire [60]. Malgr prs de 30 ans de travail, ce facteur n'avait pu tre isol et son existence avait t mise en cause [60] . La dcouverte de la TPO est venue de l'identification fortuite de son rcepteur, c-mpl. En effet, il avait t dcouvert qu'un oncogne, appel v-mpl, transduit par une forme auxiliaire du virus de Friend, induisait un syndrome myloprolifratif aigu (myeloproliferative leukemia, mpl) [76]. L'analyse de sa structure a montr qu'il appartenait la superfamille des rcepteurs de cytokines. Son proto-oncogne c-mpl a t clon [92] et tait donc un rcepteur orphelin exprim essentiellement dans les cellules CD34+ et au cours de la diffrenciation mgacaryocytaire. Pour caractriser le Mpl-L, quatre quipes diffrentes ont utilis une technologie identique, en partant de l'hypothse que Mpl, au mme titre que le rcepteur du GCSF et de l'Epo, tait capable la fois de lier un ligand et de transduire un signal . Trois quipes ont dmontr la prsence du ligand de Mpl dans le srum d'animaux rendus aplasiques par irradiation. Mpl-La t purifi en utilisant le rcepteur soluble. La molcule a alors t partiellement squence dans sa partie N-terminale de faon obtenir des oligonuclotides dgnrs. L'ADNc a ensuite t clon partir de banques d'ADN de foie foetal. Une autre quipe a choisi un abord original et lgant, mais haut risque, en obtenant par mutagense, partir d'une ligne dpendante de facteurs de croissance transfecte avec c-mpl, des clones indpendants de facteurs de croissance [53]. Il s'est avr que l'un de ces clones avait acquis cette indpendance la suite de l'apparition d'un systme de stimulation autocrine par Mpl-L. L'ADNc a t ensuite clon par expression partir de ce clone. Deux autres quipes ont galement russi isoler directement la TPO partir de srum d'animaux thrombocytopniques, sans se servir de c-mpl. Le squenage de ces deux molcules a rvl qu'il s'agissait du Mpl-L. Suivant les quipes, cette mme molcule est appele soit Mpl-L, soit TPO, soit MGDF (megakaryocyte growth and development factor), soit mgapotine. Il s'agit d'une protine de 353 acides amins chez l'homme, de PM de 75 80 kDa. La protine mature contient deux domaines distincts. Un premier domaine Nterminal de 153 acides amins contient l'activit biologique. Ce domaine a une homologie importante avec l'Epo. Le second domaine, de 179 acides amins, n'a aucune homologie avec une autre cytokine et contient six sites potentiels de Nglycosylation. Le gne de la TPO est situ sur le chromosome 3 chez l'homme en 3q26-27. Il comprend sept exons s'tendant sur 8 kb. La TPO agit la fois sur les temps prcoces et tardifs de la mgacaryocytopose. La TPO est capable d'induire la formation de colonies de mgacaryocytes. Sa cible lective est un progniteur mgacaryocytaire tardif. Sur les progniteurs plus prcoces, elle agit en synergie avec le SCF, l'IL3 et l'IL6. La TPO induit galement la diffrenciation en induisant la polyplodisation des mgacaryocytes et leur maturation cytoplasmique. Ce processus aboutit la formation de plaquettes in vitro. Cependant, la TPO n'induit pas directement la formation de plaquettes mais la favorise, en amliorant le processus de maturation cytoplasmique des

mgacaryocytes. La TPO joue un rle crucial dans la mgacaryocytopose et la thrombopose, mais n'est pas indispensable la production plaquettaire comme l'atteste le phnotype des souris dont le gne de c-mpl (c-mpl-/-) ou de la TPO (TPO -/) est inactiv. Les souris homozygotes prsentent une thrombocytopnie importante (10 % de la normale) mais non ltale . Les souris htrozygotes pour l'inactivation du gne de la TPO (souris TPO+/-) ont un chiffre intermdiaire de plaquettes alors que celui des souris c-mpl+/- est normal. Il faut souligner que la TPO agit in vitro sur les plaquettes en les rendant plus activables par certains agonistes comme la thrombine. En revanche, aucun effet de la TPO sur les fonctions plaquettaires n'a t observ lors d'injections rptes in vivo. Nonobstant son action majeure sur la ligne mgacaryocytaire, la TPO n'est pas spcifique de la ligne mgacaryocytaire. En effet, elle a un effet synergique avec de nombreuses cytokines pour mettre en cycle les progniteurs hmatopotiques les plus primitifs chez la souris et chez l'homme. Comme le G-CSF, la TPO est capable d'induire la prolifration de blastes leucmiques et de certaines lignes leucmiques.

M-CSF (CSF-1)
Le M-CSF est un homodimre polypeptidique fortement N-glycosyl. Le PM de chaque chane est de 14 kDa ou de 26 kDa, et entre 45 kDa et 70 kDa pour les formes glycosyles. Ce facteur a t purifi jusqu' l'homognit chez la souris et chez l'homme partir d'urine. Les gnes humains et murins ont t clons [79]. Il existe une trs grande homologie entre les deux facteurs d'origine humaine et murine. La biosynthse du M-CSF est particulirement complexe, avec au moins quatre ARN diffrents issus du mme gne par pissage alternatif. Les deux formes longues donnent le mme prcurseur qui se dimrise. La forme dimrise est transporte la membrane o elle est clive en une forme soluble et une forme lie un protoglycane. Les deux autres ARN codent une protine plus courte transmembranaire. Le gne du CSF-1 prsente dix exons et se situe sur le chromosome 1 en 1p13-21. Le M-CSF stimule trs prfrentiellement la formation des colonies de monocytes/macrophages chez la souris. Chez l'homme, le M-CSF agit sur les progniteurs granulomacrophagiques en entranant une prolifration et une diffrenciation monocytaire. Il n'agit ni sur les progniteurs primitifs ni sur les progniteurs rythroblastiques. Le M-CSF est galement un facteur de survie ou d'activation des monocytes et des macrophages. Le M-CSF est en fait le facteur de rgulation de tout le systme des phagocytes mononucls ; il est dtruit par les monocytes et les macrophages qui contrlent ainsi leur propre production. Il existe des souris dont le gne du M-CSF est inactiv (souris op) [79]. Les souris homozygotes (op/op) ont un dficit modr en macrophages mais prsentent essentiellement une ostoptrose due l'absence de rsorption osseuse par les ostoclastes. Du fait de cette ostoptrose, il existe une hmatopose extramdullaire. Les anomalies des souris op/op se corrigent progressivement, suggrant que, chez la souris adulte, d'autres cytokines peuvent remplacer le MCSF dans la transition macrophage/ostoclaste.

Interleukine 5
Un facteur murin entranant spcifiquement la diffrenciation des osinophiles

osinophiles matures, dont il augmente la survie et les fonctions. Le gne de ce facteur a d'abord t clon chez la souris puis chez l'homme o il est situ sur le chromosome 5, prs des gnes du GM-CSF et de l'IL3 (tableau I). La protine mature a 115 acides amins et un PM de 14 kDa non glycosyle, mais sa forme mature est un dimre. L'IL5 a une activit BCGF (facteur de croissance des cellules B) indniable chez la souris alors que son activit semble restreinte la ligne osinophile chez l'homme. Les actions de l'IL5, du GM-CSF et de l'IL3 sur la ligne osinophile (progniteurs et cellules matures) sont trs proches, l'IL5 diffrant du GM-CSF et de l'IL3 par cette action restreinte la ligne osinophile. Les rcepteurs de ces trois facteurs de croissance ont la mme chane de transduction. Les souris transgniques pour l'IL5 ont une hyperosinophilie et une augmentation de la production d'anticorps. L'augmentation des osinophiles dans certaines parasitoses est lie la synthse d'IL5 par les lymphocytes T.

Membres de la famille de l'IL6


Caractrisation
Il s'agit d'une famille de facteurs de croissance ayant des effets proches, souvent redondants. Cette famille est caractrise, d'une part par une chane de transduction commune tous les rcepteurs, la gp 130, d'autre part par leur rle de mdiateurs de la raction inflammatoire. Leurs activits sont trs larges et leurs actions sur les cellules non hmatopotiques sont certainement plus importantes que sur les cellules hmatopotiques, comme l'attestent les expriences d'inactivation gnique. L'action spcifique de chacun d'entre eux est une consquence de l'expression de leurs rcepteurs et non de diffrences dans la signalisation.

Interleukine 6 L'IL6 est un facteur avec une activit biologique extrmement large. Il a t isol et son gne clon par diffrentes quipes qui s'intressaient des activits biologiques apparemment totalement diffrentes :

activit antivirale (interfron 2) ; facteur de maturation des lymphocytes B (BSF2) [33] ; facteur de croissance des hybridomes et des plasmocytomes murins facteur stimulant des hpatocytes (HSF) ; facteur de diffrenciation des lymphocytes T cytotoxiques ; facteur diffrenciant de certaines lignes leucmiques (MGI-2A) ; CSF de la ligne granuleuse.

[89]

Ce facteur a d'abord t caractris chez l'homme, mais la molcule est active chez la souris. Il s'agit d'une glycoprotine de 21-26 kDa contenant 184 acides amins et deux sites de N-glycosylation [33]. Le gne humain situ sur le chromosome 7 a cinq exons et plusieurs sites d'initiation (tableau I). Il existe 65 % d'homologies entre le gne humain et murin et une homologie faible avec celui du G-CSF [33].

LIF ou HILDA Un facteur appel leukemia inhibitory factor (LIF) avait t mis en vidence pour

prolifration de la ligne DA2. La purification de ces deux facteurs et le clonage de leurs gnes ont montr qu'il s'agissait de la mme molcule [62]. Leur gne, situ sur le chromosome 22, a deux exons et code une protine de 179 acides amins avec 78 % d'homologie entre la protine humaine et murine.

Interleukine 11 L'IL11 a t initialement isole comme une cytokine d'origine stromale stimulant la prolifration d'un plasmocytome murin dpendant de l'IL6 [97]. Il s'agit d'une protine de 178 acides amins de PM 24 kDa, sans rsidus cystine et riche en proline et leucine. La molcule n'a pas de N-glycosylation. Le gne est situ sur le chromosome 19 chez l'homme et le chromosome 7 chez la souris. La synthse d'IL11 est induite dans de nombreux tissus par l'IL1 ou le LPS (lipopolysaccharide) [97] .

Oncostatine-M L'oncostatine-M est une glycoprotine de PM 28 kDa, essentiellement synthtise par les monocytes et les lymphocytes T. Son gne est localis sur le chromosome 22.

Cardiotrophine-1
La cardiotrophine-1 une protine de 21,5 kDa qui induit l'hypertrophie des myocytes cardiaques [71]. Cette protine a une homologie structurale avec les autres membres de la famille de l'IL6. Des rsultats prliminaires suggrent qu'elle est galement active sur les cellules hmatopotiques. Dans la mme famille, le ciliary neurotrophic factor (CNTF) n'a pas d'effets sur l'hmatopose.

Actions biologiques
Dans l'ensemble, ces quatre facteurs de croissance ont des actions proches sur les cellules hmatopotiques. Les premiers effets dcrits sur l'hmatopose, pour l'IL6 et surtout pour LIF, concernaient l'induction de la diffrenciation d'une ligne leucmique M1, d'o le terme de leukemia inhibitory factor pour LIF [62]. Cette proprit de diffrenciation a galement t retrouve pour l'oncostatine-M et la cardiotrophine-1, mais elle ne concerne ni les autres lignes leucmiques, ni les cultures primaires de cellules leucmiques.

Sur les progniteurs primitifs, ces facteurs ont une activit synergique avec l'IL3, le GM-CSF et le SCF [38]. Ce sont des facteurs de maturation terminale de la mgacaryocytopose, capables d'induire l'augmentation de taille des mgacaryocytes et leur polyplodisation. Ils induisent la synthse de facteurs de croissance comme le GM-CSF ou le G-CSF par les cellules stromales, les cellules endothliales et les cellules hmatopotiques elles-mmes [89].

Il existe cependant quelques diffrences entre les diffrents membres de cette famille. L'IL11 a un effet plus important que les autres cytokines sur la maturation

de la ligne mgacaryocytaire et elle est considre par certains comme un rgulateur physiologique de la thrombocytopose. L'IL11 agirait galement sur les temps tardifs de la diffrenciation rythroblastique, mme en l'absence d'Epo. Au niveau des progniteurs primitifs, LIF, IL6 et IL11 ont des activits proches mais l'oncostatine-M ne semble pas active [43]. Aprs inactivation des gnes de LIF ou de l'IL6, il n'existe pas d'anomalies majeures de l'hmatopose. Cependant, le nombre de CFU-S et de progniteurs est diminu, essentiellement dans la rate dans le cas de LIF [20]. Du fait de l'activit redondante de ces diffrents facteurs de croissance, les expriences d'inactivation gnique sous-estiment le rle de la famille de ces facteurs de croissance sur l'hmatopose. L'inactivation du gne de la gp 130 (chane commune tous les rcepteurs des cytokines de cette famille) entrane chez la souris homozygote (souris gp 130-/-) un phnotype ltal in utero, li des malformations cardiaques. Cependant, l'ensemble des progniteurs hmatopotiques du foie foetal est trs abaiss, dmontrant le rle important des cytokines de la famille de l'IL6 sur l'hmatopose [98]. Une synthse leve d'IL6 ou d'IL11 induit un syndrome myloprolifratif avec une augmentation des neutrophiles associe une anmie. Les effets de ces facteurs de croissance sont trs importants en dehors du systme hmatopotique, en particulier sur les ostoblastes et les cellules souches embryonnaires pour LIF, sur l'inhibition de la diffrenciation adipocytaire, les ostoblastes et les cellules pithliales intestinales pour l'IL11 et la rgnration hpatocytaire pour l'IL6.

Stem cell factor et ligand de FLT3 : facteurs synergiques


Caractrisation
SCF ou facteur Steel (SLF) ou ligand de c-kit (Kit-L) ou mast cell growth factor (MGF) Deux types de souris, l'une avec une mutation sur le locus Steel et l'autre sur le locus W ont le mme phnotype. A l'tat homozygote, elles ont des dfauts de la pigmentation, de la fertilit et des troubles de l'hmatopose majeurs, souvent non viables, prdominant sur la ligne rythroblastique. Des expriences de transplantation ont montr que les anomalies des souris W pouvaient tre corriges par des greffes mdullaires de souris normales ou de souris steel alors que celles des souris steel ne pouvaient tre corriges par une greffe de moelle [58]. Ceci suggrait que l'anomalie des souris W sigeait au niveau des cellules hmatopotiques, en particulier des cellules souches et que celle des souris steel portait sur le microenvironnement. Il a pu tre dmontr dans un premier temps que l'anomalie W correspondait une dltion ou une mutation du gne c-kit, possdant la structure d'un rcepteur tyrosine kinase [75]. Il a ds lors t suggr que le produit du gne steel devait tre le ligand de c-kit. Trois quipes ont russi simultanment caractriser ce nouveau facteur de croissance en utilisant des approches diffrentes . Une premire approche a consist utiliser le rcepteur KIT, une seconde et une troisime purifier une molcule active sur les HPP-CFC et/ou les mastocytes. Le gne SLF ou SCF code une protine ayant des domaines extracellulaire (185 acides amins), intramembranaire (27 acides amins) et cytoplasmique (36 acides amins). Le gne est situ sur le chromosome 10 chez la souris et sur le bras long du chromosome 12 chez l'homme. Il existe deux formes diffrentes provenant d'un pissage alternatif : l'une est une forme purement membranaire et l'autre une forme soluble, produit du clivage d'une forme transmembranaire par une protase non encore identifie. Du point de vue biologique, la forme transmembranaire est la plus importante car les souris Sld dont la mutation conserve uniquement la forme soluble [24] ont des anomalies hmatologiques, cependant d'une gravit moindre que les souris avec un dficit total. De mme, les lignes stromales

drives de souris steel, transfectes avec l'ADNc codant la forme transmembranaire, soutiennent l'hmatopose in vitro mieux que les lignes transfectes avec la forme soluble. Le SCF est essentiellement synthtis par les cellules du stroma (fibroblastes, cellules endothliales). Il a t rapport rcemment que les cellules CD34 pouvaient synthtiser le SCF.

FLT3-L Le rcepteur tyrosine kinase FLT3 avait t caractris antrieurement mais son ligand tait inconnu. Il a t isol par deux quipes en se servant du rcepteur pour piger la molcule partir du surnageant, soit d'une ligne de lymphocytes T [54] , soit de cellules stromales thymiques [31]. Il existe plusieurs formes de FLT3-L dont une forme membranaire qui ensuite est clive en une forme soluble. La protine est un homodimre de deux sous-units de 30 kDa chacun, dont 12 kDa lis des glycosylations. Le gne est localis sur le chromosome 19 chez l'homme. Ce facteur de croissance est synthtis par de nombreux tissus mais les sources principales sont les cellules stromales et les cellules T [57].

Actions biologiques
Ces deux facteurs de croissance sont les meilleurs exemples de facteurs de croissance synergiques. Au niveau des progniteurs dtermins, ces deux facteurs de croissance ont un effet stimulant majeur lorsqu'ils sont utiliss en combinaison avec les CSF (Epo, G-CSF, TPO, IL3, et GM-SCF). Au niveau des progniteurs primitifs et ventuellement des cellules souches hmatopotiques, ces deux facteurs jouent un rle la fois sur la survie et la mise en cycle, en association avec d'autres facteurs de croissance prcoces, comme l'IL3, ou l'IL6 et l'IL11. SCF et FLT3-L ont des activits redondantes mais il existe des diffrences (fig 5, E).

Au niveau des progniteurs, le SCF a une action synergique majeure avec l'Epo, si bien que le SCF joue un rle capital sur l'rythropose. Le SCF a une action synergique importante avec la TPO sur la mgacaryocytopose. Au contraire, FLT3-La a une action ngligeable sur l'rythropose [88] et faible sur les progniteurs mgacaryocytaires [88]. Son action prdomine sur la ligne granuleuse. FLT3-L joue un rle galement important dans la diffrenciation B et sur les cellules dendritiques. Au niveau des progniteurs primitifs, FLT3-L agit probablement plus prcocement que le SCF en permettant la survie des cellules humaines qui reconstituent l'hmatopose chez les souris immunodficientes et la prolifration des LTC-IC.

Autres facteurs de croissance hmatopotiques


Interleukine 1
L'hmopotine-1 a t dfinie par l'quipe de Stanley par ses capacits faire apparatre le rcepteur du M-CSF (c-fms) sur des cellules hmatopotiques

l'hmatopose de la souris, donc un stade plus prcoce que l'IL3, mais de manire trs transitoire au cours de la diffrenciation. L'hmopotine-1 a t isole et purifie partir d'une ligne de cancer de vessie humaine (ligne 5637) ; elle correspond l'IL1, en particulier l'IL1 . Certains des effets de l'IL1 sont directs, en particulier ceux synergiques avec le M-CSF sur les HPP-CFC ; les autres sont indirects, lis l'induction de cytokines comme le GM-CSF et l'IL6 par les cellules du stroma mdullaire, les cellules endothliales, les monocytes et les lymphocytes T. En effet, le rle essentiel de l'IL 1 sur l'hmatopose est d'induire la synthse d'autres cytokines. L'IL1, surtout associe d'autres cytokines, acclre la reconstitution des neutrophiles et serait capable d'induire une radiorsistance.

Interleukine 4 ou BSF 1
Identifie initialement pour son activit costimulatrice sur la prolifration des lymphocytes B, cette lymphokine a une activit extrmement large la fois sur les cellules T, les cellules mylodes et les cellules endothliales. Le gne de l'IL4 a d'abord t clon chez la souris puis chez l'homme. Il s'agit d'un facteur de PM 14 kDa non glycosyl, avec trois sites potentiels de glycosylation. Sur les progniteurs dtermins, l'IL4 agit en synergie avec le G-CSF pour la formation de colonies de neutrophiles, ou avec l'IL3 pour induire la prolifration des mastocytes ; cependant, il peut galement tre un inhibiteur, en particulier de la formation de colonies de macrophages ou de mgacaryocytes induite par l'IL3. L'IL4 a galement un effet sur les temps prcoces de l'hmatopose et agit sur la formation de colonies de blastes. Son action est la fois directe et indirecte, induisant la synthse de GM-CSF et de G-CSF par les cellules T ou les cellules stromales.

Interleukine 13
L'IL13 a de nombreuses homologies avec l'IL4 et des actions proches sur l'hmatopose. Cependant, l'IL13 a des effets synergiques importants avec le SCF sur les progniteurs primitifs. L'IL13 est galement synergique avec GM-CSF et le G-CSF sur les CFU-GM. Alors que la combinaison de SCF et de G-CSF induit la production de granulocytes, l'addition d'IL13 entrane une production de macrophages aux dpens des neutrophiles.

Interleukine 12 ou natural killer cell stimulating factor (NKSF)


L'IL12 est une cytokine de structure htrodimrique avec deux chanes de PM 35 kDa et 40 kDa, respectivement codes par deux gnes, l'un situ sur le chromosome 3 (3p12) et l'autre sur le chromosome 5 (5q31). Elles ont une homologie avec l'IL6 et la chane de son rcepteur. L'action majeure de l'IL12 concerne ses effets sur les cellules NK et les fonctions des cellules T (Th1). L'IL12 est capable d'induire la synthse de nombreuses cytokines. Sur l'hmatopose, l'IL12 a un rle synergique direct avec l'IL3, le SCF, l'IL6 ou l'IL11 sur les progniteurs primitifs. En revanche, lorsque des cellules accessoires sont prsentes, l'IL12 devient un puissant inhibiteur de l'hmatopose en induisant la synthse d'interfron , de TNF (tumor necrosis factor)- et de TGF-(transforming growth factor). In vivo, l'IL12 a plutt un effet ngatif sur l'hmatopose.

Interleukine 2

habituellement inhibiteurs, sont indirects.

Interleukine 7
L'IL7 est un facteur de croissance impliqu dans la rgulation des temps prcoces de la diffrenciation B et T. L'inactivation de son gne entrane des lymphopnies. L'IL7 a galement un effet synergique avec le SCF, l'IL3 et l'IL6 sur les progniteurs mylodes primitifs. Elle favorise, dans ces systmes de culture, la diffrenciation monocytaire/macrophagique. Chez la souris, l'IL7 est capable de mobiliser dans le sang des cellules souches hmatopotiques qui reconstituent l'hmatopose long terme.

Interleukine 9 ou P 40
L'IL9 a t isole partir de surnageants de cellules T transformes par le virus HTLV-1 [90]. Elle est capable de stimuler une ligne avec un phnotype mgacaryocytaire. En fait son action sur l'hmatopose est assez proche de celle de l'IL3 portant sur les diffrents progniteurs primitifs. Elle prdomine sur l'rythropose, o elle agit assez tardivement jusqu'au stade CFU-E. L'action principale de l'IL9 concerne la ligne T et l'induction de la prolifration de clones T.

Facteurs de croissance non spcifiquement hmatopotiques


Hormones
Un grand nombre de facteurs de croissance ou d'hormones interfre avec la formation des colonies in vitro, plus particulirement avec l'obtention des colonies drives des CFU-E et des BFU-E. Pour la plupart d'entre eux, cette action est une action potentialisatrice et ncessite la prsence d'Epo. La plus importante de ces molcules est l'IGF (insulin-like growth factor) I. Elle serait capable, sur des cellules de foie foetal de souris, d'induire la formation de colonies rythroblastiques, mme en l'absence d'Epo. Le mme effet a t dcrit chez la souris pour l'insuline, la fois sur des cellules de foie foetal et de moelle adulte.

NGF (nerve growth factor), FGF (facteurs msenchymateux[fibroblast growth factor]) et HGF (hepatocyte growth factor)
Il s'agit d'une famille de facteurs de croissance produits par les cellules du stroma mdullaire dont la cible principale n'est pas les cellules hmatopotiques.

NGF Le NGF est un facteur de croissance appartenant la famille des neurotrophines dont la cible principale est la cellule neuronale, mais il a galement des effets sur l'hmatopose. La principale activit du NGF sur l'hmatopose concerne les lignes mastocytaire et basophile o le NGF induit prolifration, survie, diffrenciation et activation. Le NGF agit galement sur les cellules lymphodes. Le NGF ne semble pas avoir d'effets directs sur l'hmatopose primitive mais pourrait induire la synthse de nombreuses cytokines par les macrophages.

FGF

Il s'agit d'une famille complexe de facteurs de croissance qui ont une homologie au niveau de leur structure primaire et de leurs rcepteurs. Dans cette famille, les effets sur l'hmatopose du FGF basique (FGFb ou FGF1), du FGF acide (FGFa ou FGF2), du FGF4 et du FGF9 ont t particulirement tudis. Les diffrents FGF ont des effets sur les progniteurs primitifs mais la plupart des effets semblent indirects, lis, soit dans les cultures long terme leur action trophique sur les cellules stromales, soit l'induction de synthse de cytokines dans les cultures en milieu semi-solide. Le FGFb est capable d'induire les synthses d'IL6 et ventuellement d'IL3. Les diffrents FGF ont une action sur la ligne mgacaryocytaire in vitro et in vivo. Les effets sont la fois directs car les mgacaryocytes expriment diffrents rcepteurs aux FGF et indirects lis la synthse d'IL6.

HGF L'HGF a t dcrit comme un facteur de rgnrescence du foie. Le HGF a des effets synergiques avec l'IL3, le SCF et l'Epo sur les diffrents types de progniteurs. La plupart des effets semblent indirects mais une partie des progniteurs hmatopotiques exprime le rcepteur au HGF (c-met).

Leptine
La leptine a t isole comme un facteur rgulant le tissu adipeux. Son rcepteur, appartenant la famille des rcepteurs de cytokines avec une homologie avec la gp 130, a t identifi sur les cellules hmatopotiques. La leptine ne semble pas agir directement sur les progniteurs hmatopotiques mais est capable d'induire la synthse d'autres cytokines.

Rcepteurs des facteurs de croissance


Les effets biologiques des facteurs de croissance hmatopotiques sont lis la prsence sur les cellules hmatopotiques de rcepteurs spcifiques. L'action restreinte ou non d'un facteur de croissance dpend uniquement de l'expression de son rcepteur. de rares exceptions prs, chaque facteur de croissance hmatopotique possde son propre rcepteur. Les rcepteurs des facteurs de croissance appartiennent deux superfamilles : la premire reprsente des rcepteurs activit tyrosine kinase intrinsque. Cette famille inclut seulement trois rcepteurs de facteurs de croissance hmatopotiques ; en revanche, la majorit des rcepteurs des facteurs de croissance non hmatopotiques appartient cette famille. La seconde reprsente la superfamille des rcepteurs des cytokines hmatopotiques (fig 6). Cette famille compte de nombreux membres et reprsente un ensemble de rcepteurs caractriss la fois par l'absence d'activit tyrosine kinase ou d'activit catalytique intrinsque et par des homologies structurales. Ces homologies concernent l'existence d'un module de 210 acides amins dans la partie extracellulaire, comprenant une squence WSXWS (tryptophane, srine, acide amin quelconque, tryptophane, srine) et quatre rsidus cystine. La structure tertiaire du domaine extracellulaire des rcepteurs des cytokines serait compose de deux domaines d'environ 100 acides amins, et le motif WSXWS serait prsent dans une boucle reliant les bases de ces deux domaines [6]. Le motif WSXWS est indispensable pour la bonne conformation du rcepteur et la fixation du facteur de croissance. Ce module peut tre dupliqu dans certains rcepteurs. Des facteurs de croissance non hmatopotiques possdent des rcepteurs qui appartiennent cette famille comme la prolactine,

facteur de croissance mais d'induire un message. Les deux superfamilles de rcepteurs (rcepteurs activit tyrosine kinase et rcepteurs sans activit catalytique intrinsque) sont en fait l'origine d'une signalisation trs proche qui passe dans les deux cas par des phosphorylations sur tyrosine. Dans le premier cas, l'activit tyrosine kinase est intrinsque au rcepteur, et dans le deuxime cas, elle est lie au recrutement de tyrosine kinases spcifiques prsentes dans le cytoplasme de la cellule. Dans les deux familles, la dimrisation de la chane de transduction joue un rle capital pour induire les phosphorylations.

Famille des rcepteurs activit tyrosine kinase intrinsque


Les rcepteurs du M-CSF (c-fms), du SCF (c-kit) et FLT3, encore appel Flk-2 ou STK-1 chez l'homme, appartiennent cette famille, en particulier la classe III, caractrise par cinq domaines structuraux apparents aux Ig, dans leurs parties extracellulaires. Les rcepteurs du PDGF platelet derived growth factor) ont la mme structure. c-fms et c-kit avaient t historiquement identifis trs tt car des formes dltes ou tronques (v-fms ou v-kit) taient oncogniques. Le gne du rcepteur du M-CSF est situ sur le chromosome 5 (5q31) et prsente 21 exons. Il code une protine de PM 165 kDa dote d'une activit tyrosine kinase ; il est prsent en grand nombre sur certaines lignes malignes de macrophages (50 000 rcepteurs par cellule) et en plus faible nombre sur les monocytes/macrophages normaux (3 000-15 000 rcepteurs par cellule). Il est exprim depuis le progniteur granulomonocytaire jusqu'au monocyte et macrophage. Il est galement exprim sur les cellules du trophoblaste. KIT a un PM chromosome progniteurs primitives. Il des CFU-E. de 145 kDa. Le gne c-kit comprend 21 exons codants situs sur le 4 (4q11-q13). Il est prsent en surface dans tout le compartiment des immatures, avec une expression faible au niveau des cellules disparat au cours de la diffrenciation ; en particulier, il est absent

FLT3 a t isol partir de banques d'ADN de foie foetal. Le gne est situ sur le chromosome 13 (q12) et prsente 12 exons. Il a un PM de 130 150 kDa suivant les cellules. Comme KIT, FLT3 est exprim en dehors du systme hmatopotique et prsent dans le cerveau, le placenta et les testicules. Dans les cellules hmatopotiques, ce rcepteur est exprim essentiellement sur les cellules CD34 y compris les progniteurs primitifs. Dans le foie foetal de souris, il est peu exprim sur les cellules souches en G0.

Famille des rcepteurs des facteurs de croissance hmatopotiques


Cette superfamille comprend environ 20 rcepteurs diffrents. Nous les classerons en quatre groupes.

Rcepteurs du G-CSF, de l'Epo et de la TPO (c-mpl)


Ces trois rcepteurs ont une seule chane qui sert de chane de liaison et de transduction et la signalisation passe par une homodimrisation du rcepteur. Le rcepteur de l'Epo (R-Epo) est une protine de 66 kDa, code par un gne prsentant huit exons et situ sur le chromosome 19 chez l'homme [99]. R-Epo fixe l'Epo et galement la gp55 du virus de Friend et ce sur un site diffrent de celui de l'Epo. Il reste aujourd'hui discut si la p66 est associe d'autres chanes

auxiliaires. R-Epo est essentiellement exprim sur la ligne rythroblastique mais est prsent galement sur les mgacaryocytes, les cellules endothliales et le placenta. Le rcepteur du G-CSF (R-G-CSF) est compos d'une seule protine transmembranaire de 812 acides amins chez la souris et de 813 acides amins chez l'homme. Le PM est de 130 160 kDa. La partie extracellulaire est compose de cinq domaines : un domaine de la superfamille des Ig, un domaine cytokine, et trois domaines fibronectine de type III. Le gne du R-G-CSF comprend 17 exons et il est situ sur le chromosome 1 en p32-35 chez l'homme [3]. R-G-CSF est exprim sur les progniteurs granulomacrophagiques, tout au long de la diffrenciation neutrophile jusqu'au polynuclaire neutrophile qui exprime de 200 1 000 rcepteurs sa surface. Il est prsent galement sur les plaquettes, les cellules endothliales et les cellules du placenta. Mpl est une protine de 82 kDa (607 acides amins) qui, comme nous l'avons vu, est exprime sur les cellules CD34 et les cellules mgacaryocytaires y compris les plaquettes. Le gne est situ sur le chromosome 1 (1p34) et comprend 12 exons. Pour ces diffrents rcepteurs, il a t isol de nombreuses formes issues d'pissage alternatif dont le rle prcis n'est pas encore connu. En particulier chez l'homme, il existe une forme de Mpl profondment dlte dans sa partie intracytoplasmique.

Rcepteurs du GM-CSF, de l'IL3 et de l'IL5


Les rcepteurs du GM-CSF, de l'IL3 et de l'IL5 ont tous les trois une structure htrodimrique avec une chane de fixation spcifique pour chacun de ces facteurs de croissance et une chane de transduction commune c [65]. L'association de la chane et de la chane c donne un rcepteur de haute affinit alors que la chane seule a une faible affinit pour le ligand. Chez la souris, il existe une quatrime chane qui est une chane propre l'IL3. Les chanes prsentent une duplication du domaine cytokine (200 acides amins, bote WSXWS, et quatre rsidus cystine). Il n'est pas exclu que, lors de la signalisation, il y ait dimrisation de la chane c. Cependant, les diffrentes chanes semblent capales de donner une certaine spcificit au message de signalisation. Il y a une comptition entre le GMCSF et l'IL3 dans les cellules o le nombre de chanes c est limitant. Chez la souris, l'effet de l'IL3 est dominant sur celui du GM-CSF car le rcepteur de l'IL3 peut utiliser deux chanes diffrentes. La chane du R-GM-CSF est compose de 400 acides amins avec un PM glycosyl de 80 kDa, la chane du R-IL3 a un PM de 70 kDa. Les deux gnes sont situs en contigut sur la rgion autosomale des chromosomes X et Y. La chane commune est situe sur le chromosome 22 (q12.2-q13.1) et la chane du R-IL5 sur le chromosome 3 en p24-26.

Rcepteurs de la famille de l'IL6


Cette famille de rcepteurs complexes est caractrise par une chane commune de 130 kDa, la gp 130. La gp 130 a t initialement isole comme la chane de transduction du rcepteur de l'IL6. Son gne est situ sur le chromosome 5 (5q11). Diffrentes chanes pour l'IL6, LIF, oncostatine-M, l'IL 11 et le CNTF s'associent la gp 130. En fait, la structure de cette famille de rcepteurs est beaucoup plus complexe. Aprs liaison de l'IL6, le rcepteur forme une structure complexe qui consiste en une homodimrisation de la gp 130 et de la chane (gp80) du

pour une protine transmembranaire, l'autre de 368 acides amins pourrait tre fixe la membrane par une ancre phosphatidyl-inositol. Le gne est localis sur le chromosome 9 (9p13) en contigut avec la chane du rcepteur du CNTF. Les rcepteurs de LIF, du CNTF, de la cardiotrophine-1 et de l'oncostatine-M ont une structure proche dont le modle est le rcepteur de LIF. R-LIF a une chane de 190 kDa qui fixe LIF. Cette chane a une homologie importante avec la gp 130 avec laquelle elle s'associe pour former un htrodimre capable de transduire un signal. L'association de la gp 190 la gp 130 est l'quivalent de l'homodimrisation de la gp 130. Comme la gp 190 fixe galement la cardiotrophine-1 et la gp 130 l'oncostatine-M, ces deux facteurs de croissance ont thoriquement le mme rcepteur que le LIF. Le rcepteur du CNTF prsente les deux mmes chanes que le rcepteur de LIF mais prsente une troisime chane fixant le CNTF (R-CNTF ) avec une haute affinit. R-CNTF est une protine fixe la membrane par une ancre phosphatidyl-inositol. Il est possible que les rcepteurs de LIF, de l'oncostatine-M et de la cardiotrophine-1 aient galement une structure trimrique ; cependant, les chanes ayant une haute affinit pour l'oncostatine-M, LIF et la cardiotrophine-1 n'ont pas encore t isoles.

Rcepteurs de la famille de l'IL2


Cette famille inclut les rcepteurs de l'IL2, de l'IL4, de l'IL7, de l'IL9 et de l'IL15. Elle prsente une chane commune de transduction appele chane c. Le rcepteur de l'IL4 et de l'IL13 sont trs proches avec en plus de la chane c une chane commune. La chane c est localise sur le chromosome X en Xq13. Des mutations de son gne sont responsables des dficits immunitaires lis au chromosome X.

Signalisation du message des facteurs de croissance hmatopotiques


Nous dcrirons la signalisation de ces deux types de rcepteurs de manire trs schmatique. Actuellement, il existe deux voies de signalisation bien caractrises dont l'tape initiale est lie la phosphorylation du rcepteur [44]. Pour les rcepteurs activit kinase intrinsque, le facteur de croissance entrane une homodimrisation du rcepteur suivie de sa phosphorylation, la tyrosine kinase d'une chane phosphoryle la chane controlatrale. Pour les rcepteurs cytokine, la dimrisation ou l'oligomrisation permet, soit de recruter une tyrosine kinase cytoplasmique, soit d'activer une tyrosine kinase dj associe au rcepteur. Ces tyrosine kinases appartiennent la famille des Jak kinases qui comprend quatre membres Jak1, Jak2, Jak3 et Tyk2. Ces Jak kinases se fixent dans la partie proximale de la rgion cytoplasmique dans des domaines homologues des rcepteurs de cytokines appels botes 1 et 2. Les rcepteurs de cytokines ont, dans leur partie intracytoplasmique, des tyrosines qui, aprs phosphorylation, permettent le recrutement de molcules de transduction contenant des domaines SH2 (fig 7). La premire voie de signalisation commune aux deux types de rcepteurs est la voie Ras/MAP kinase. Elle se fait par l'intermdiaire de plusieurs molcules que nous ne dtaillerons pas mais la phase initiale consiste en la fixation de la molcule Grb2, soit directement sur le rcepteur, soit par l'intermdiaire d'une molcule de pontage (Shc). La deuxime voie de transduction plus directe, celle des Stats, a t essentiellement dcrite pour les rcepteurs de cytokine sans activit kinase intrinsque [37]. Les Stats sont une famille de sept protines (Stat1 Stat6) qui

sont la fois des molcules de transduction et des facteurs de transcription. Les Stats contiennent une tyrosine, phosphoryle aprs activation, et diffrents domaines fonctionnels, dont un domaine SH2. Ce domaine permet la fixation des Stats sur un rcepteur phosphoryl sur tyrosine. Ces facteurs Stats sont alors phosphoryls sur tyrosine et se dcrochent du rcepteur. Deux facteurs Stats phosphoryls sur tyrosine se dimrisent par leur domaine SH2 (homodimrisation ou htrodimrisation), ralisant une combinatoire qui est peut tre l'origine molculaire de la diversit de signalisation des cytokines. Le dimre est alors transloqu dans le noyau o il peut directement se lier l'ADN pour activer des gnes. Il existe sur les rcepteurs des sites consensus pour diffrents Stats. Les rcepteurs de l'Epo, du GM-CSF, de l'IL3, de l'IL5 et de la TPO fixent Stat5 qui en fait reprsente plusieurs protines diffrentes. Le rcepteur du G-CSF et ceux incluant la gp 130 fixent Stat1 et Stat3. Mpl, le rcepteur de la TPO, pourrait galement activer Stat1 et Stat3. Les rcepteurs tyrosine kinase intrinsque pourraient galement activer la voie des Stats. Les phosphatases interviennent galement dans la signalisation en entranant une rgulation ngative du signal. La plupart des rcepteurs fixent des phosphatases qui dphosphorylent le rcepteur et empchent ensuite la liaison des molcules de signalisation. La plus importante pour l'hmatopose est la PTP-1C ou SH-PTP-1 ou SHP-1. Une dltion de son gne chez la souris (souris motheaten) entrane des troubles hmatologiques importants, incluant une polyglobulie. Chez l'homme, une mutation du gne de R-Epo entrane une dltion du rcepteur dans sa partie COOH terminale o se situe le site de liaison de la PTP-1C, et est associe une polyglobulie lie un gain de fonction du rcepteur. Les deux voies (Ras/MAP kinases et Stats) sont impliques dans les signaux de survie et de prolifration induits par les facteurs de croissance. La voie des Stats semblait une voie privilgie pour induire un message de diffrenciation. En effet, l'induction des gnes rguls par les interfrons se fait par la voie des Stats. Jusqu' prsent, ceci n'a pas t dmontr dans le modle des principaux rcepteurs de cytokines hmatopotiques. Il semble probable que la signalisation mdie par les rcepteurs de cytokines hmatopotiques n'est pas restreinte ces deux voies.

Rgulateurs ngatifs de l'hmatopose


Le rle de la rgulation ngative de l'hmatopose dans le contrle de la production de cellules hmatopotiques reste encore mal connu. L'exploration de la rgulation ngative et la mise en vidence d'inhibiteurs sont beaucoup plus difficiles que l'tude des facteurs de croissance. Une difficult supplmentaire est de diffrencier les effets ngatifs lis l'induction de l'apoptose, qui sont irrversibles, de ceux induits par une inhibition de la prolifration qui aboutit une mise en quiescence des cellules primitives ou encore l'induction de la diffrenciation. La plupart de ces molcules sont des cytokines, au mme titre que les facteurs de croissance hmatopotiques, et ont des actions complexes pouvant, soit inhiber, soit au contraire stimuler l'hmatopose. Les effets stimulateurs sont souvent indirects, lis l'induction de synthse de facteurs de croissance. Certains facteurs de croissance hmatopotiques comme l'IL4 ou l'IL12 peuvent galement avoir cette dualit d'action en stimulant directement les cellules hmatopotiques et en induisant la synthse d'inhibiteurs par les cellules rgulatrices. Plusieurs facteurs ayant une fonction de rgulateur ngatif ont t caractriss. Le TGF- est la molcule dont les effets biologiques sont les mieux caractriss.

Transforming growth factor-


Cette famille de protines est compose de deux chanes homodimriques de 112 acides amins lies entre elles par des ponts disulfures. Les trois principales molcules sont les TGF-1, 2 et 3. L'action de ce (s) facteur (s) est complexe, elle peut tre inhibitrice ou stimulante suivant le systme cellulaire tudi. Cependant, le TGF- est dans l'ensemble un trs puissant inhibiteur de la prolifration et ses effets sont retrouvs sur la plupart des cellules. Le TGF- est retrouv en forte concentration dans le srum et provient des plaquettes aprs son relargage des granules , lors de l'activation plaquettaire. La plupart du TGF- est sous forme latente dans le srum et est fixe 1'2-macroglobuline (cf infra). Le TGF-1 inhibe la prolifration de tous les types de cellules hmatopotiques primitives (LTC-IC, HPP-CFC, CFU-bl, CFU-GEMM) [49]. Son effet inhibiteur est moins marqu sur les progniteurs plus matures comme les BFU-E, CFU-E et CFUGM du 14e jour. Il stimulerait au contraire la prolifration des CFU-GM du 7e jour. Il a des effets inhibiteurs trs marqus sur la mgacaryocytopose, depuis la CFUMK jusqu' la plodisation des mgacaryocytes, et pourrait tre ainsi un rgulateur ngatif autocrine de cette ligne au mme titre que le facteur 4 plaquettaire. Le TGF-2 a moins d'effets inhibiteurs sur le systme hmatopotique. Le TGF- induit la synthse de collagne au niveau de la matrice extracellulaire et pourrait tre impliqu dans les mylofibroses. Le FGFb a des effets antagonistes du TGF-. L'action molculaire du TGF- commence tre bien connue. Il bloque les cellules en G1 en augmentant la synthse de certains inhibiteurs des Cdk comme p15 et p27. Il inhiberait galement la synthse de Cdk4. En plus de ces actions directes sur le cycle cellulaire, le TGF- module l'expression de rcepteurs de facteurs de croissance [49]. En particulier, il inhibe l'expression de c-kit, de FLT3 et du rcepteur l'IL1 sur les cellules primitives ; en revanche, il rgule positivement le rcepteur du G-CSF. Cependant, les actions du TGF- sont complexes. Il peut induire l'apoptose de cellules matures et des cellules hmatopotiques primitives. En inhibant la prolifration, le TGF- peut induire la diffrenciation. Cet effet a t rcemment dmontr pour la ligne rythroblastique et rappelle le processus d'induction du msoderme par le TGF- et les membres de sa famille au cours de l'embryogense. Le TGF- est synthtis par les lymphocytes, et inhibe leur prolifration, par les monocytes/macrophages et les cellules stromales. Il a t suggr que le TGF- d'origine stromale rgulait la mise en cycle des LTC-IC dans les cultures long terme. Cependant, l'utilisation de stromas, drivs de souris homozygotes pour l'inactivation du gne du TGF-1, ne modifie pas la prolifration des LTC-IC. Il a galement t propos que la mise hors cycle des cellules hmatopotiques primitives tait rgule par la synthse autocrine de TGF-. Les souris TGF-1-/- n'ont pas d'anomalie de l'hmatopose mais meurent prcocement d'une raction inflammatoire avec une infiltration du coeur et des poumons par des lymphocytes et des macrophages. Ces expriences sous-estiment peut-tre l'action du TGF- sur l'hmatopose car seul le TGF-1 a t tudi dans ces expriences et ses effets sont redondants avec ceux du TGF-2 et 3. Les TGF-1 et 2 ont t injects des souris et protgent des souris de dose ltales de 5-FU ou de doxorubicine.

Autres protines de la famille du TGF- : activine et inhibine

caractrises pour leur rle d'activation ou d'inhibition de la synthse de FSH (follicle stimulating hormone). Ces deux molcules ont des effets complexes sur l'hmatopose, dont certains semblent indirects. Le principal effet de l'activine A est d'induire la prolifration et la diffrenciation des progniteurs rythroblastiques. Cet effet direct est retrouv sur des lignes rythroleucmiques comme la ligne K562. L'inhibine a l'effet inverse. L'activine A et l'inhibine ont des effets inhibiteurs sur la prolifration des CFU-GM. Les mmes effets sont retrouvs in vivo.

MIP-1 et chimiokines
MIP-1 est la premire chimiokine dont on a pu montrer le rle sur l'hmatopose. Depuis, il a pu tre dmontr que de nombreuses chimiokines ont un effet inhibiteur sur l'hmatopose. Il est probable que le rle de cette famille dans la rgulation de l'hmatopose se rvle de plus en plus important. Les chimiokines ou protines SIS sont une famille de cytokines intervenant essentiellement dans l'inflammation [64]. Suivant leur squence peptidique d'environ 8 kDa, les chimiokines sont divises en deux groupes : les chimiokines CC (rsidus cystines adjacents) appeles chimiokines et les chimiokines CXC (rsidus cystines spars par un acide amin), appeles chimiokines . Les chimiokines de la famille de MIP-1 (CC), comprennent MIP-1, MIP-1, MCP-1 (monocyte chems attractant protein) (MCAF), MRP-2 et RANTES (regulated on activation, normal T expressed and secreted). Leurs gnes sont localiss sur le chromosome 17 (17q11-12). Les chimiokines CXC comprennent Gro-, MIP-2 (Gro-), MIP-2 (Gro-), PF4, IL8, NAP-2 et SDF-1. Leurs gnes sont localiss sur le chromosome 4 (4 q13/21). De nombreuses chimiokines ont un site de fixation l'hparine. Leurs rcepteurs font partie des rcepteurs sept domaines transmembranaires coupls une protine G. Contrairement aux facteurs de croissance hmatopotiques, la plupart des chimiokines sont capables de s'associer plusieurs rcepteurs. Les chimiokines interviennent essentiellement dans l'inflammation par leur activit chimiotactique attirant et accumulant ainsi les polynuclaires et les monocytes aux sites d'inflammation. Elles interviennent galement dans la prolifration et l'activation de plusieurs types cellulaires. Les chimiokines sont synthtises par un grand nombre de cellules incluant les monocytes, les neutrophiles, les fibroblastes, les cellules endothliales, les lymphocytes B et T. Cette synthse est induite par de nombreux mdiateurs comme le LPS, L'IL1 ou le TNF. Deux d'entre elles, le PF4 et NAP-2 (CTAP-III ou -thromboglobuline) ne sont synthtises que par les mgacaryocytes et les plaquettes.

MIP-1
MIP-1 a t caractris comme un inhibiteur des CFU-S. Il a t purifi partir de milieu conditionn de macrophages sur ses proprits inhiber la croissance des CFU-A in vitro [28]. En utilisant des anticorps, il a pu tre montr que MIP-1 tait le facteur responsable de l'inhibition des CFU-s prsentes dans les cultures primaires de moelle osseuse [28]. Au niveau des progniteurs primitifs mylodes (CFU-GEMM, BFU-E et CFU-GM), MIP-1 inhibe la formation des colonies lorsque les progniteurs sont stimuls par une combinaison de cytokines comme le SCF et le GM-CSF [10]. Cette inhibition est observe des concentrations de l'ordre de 10 ng/mL. Cet effet est probablement direct car il est retrouv sur des populations de progniteurs purifis [10]. En

revanche, MIP-1 pourrait stimuler la croissance de progniteurs mylodes plus matures lorsqu'ils sont stimuls par le GM-CSF ou le M-CSF seuls. Dans les cultures long terme, MIP-1 permet d'viter l'puisement du systme au-del de 8 semaines lorsque les cultures sont stimules par l'IL3 [91]. MIP-1 a t inject in vivo et permet de protger des souris soumises un protocole ltal de chimiothrapie. Les mcanismes molculaires de cet effet inhibiteur de l'hmatopose sont actuellement inconnus. MIP-1 a un site de fixation aux protoglycanes et l'hparine. La dltion de ce site entrane une dissociation entre son activit chimiotactique pour les monocytes et celle d'inhibition de l'hmatopose. L'activit chimiotactique est lie la fixation de MIP-1 sur son rcepteur CCR1 sur les monocytes, ce site de liaison est le mme que celui de la fixation l'hparine. En revanche, au niveau des progniteurs primitifs, MIP-1 se fixerait sur un autre rcepteur. L'inactivation du gne de MIP-1 n'a aucune consquence sur l'hmatopose [14].

Autres chimiokines
Plusieurs autres chimiokines ont les mmes activits que MIP-1 sur l'hmatopose. Ce sont MIP-2, PF4, IL8, MCP-1 et MRP-2. Ces cytokines ont des effets synergiques entre elles. En revanche, MIP-1, MIP-2, Gro-, NAP-2 et RANTES n'ont aucun effet sur l'hmatopose [10]. L'IL8 est capable de mobiliser les cellules souches dans le sang chez la souris. Il existe une controverse concernant le rle du PF4. Pour certains, son action inhibitrice est restreinte la ligne mgacaryocytaire, cette activit tant retrouve haute concentration (20 g/mL) [26]. Pour d'autres, le PF4 inhibe tous les types de progniteurs immatures mais un degr moindre que MIP-1 et des concentrations de l'ordre du ng/mL [10]. Contrairement l'effet de MIP-1 sur les progniteurs primitifs, l'action inhibitrice de PF4 sur la mgacaryocytopose est inhibe par l'hparine.

Stromal cell derived factor-1 (SDF-1)


La plupart des chimiokines ont un effet inhibiteur de l'hmatopose. Cependant, une nouvelle chimiokine du groupe de CXC appele SDF-1 joue apparemment un rle important dans l'hmatopose. L'inactivation de son gne entrane la fois un dficit trs important en progniteurs B mais galement en progniteurs mylodes d'origine mdullaire chez les souris homozygotes [68]. Le rcepteur de SDF-1 est la fusine encore appele LCR1 ou CXCR-4 qui a t rcemment identifie comme le corcepteur du VIH (virus de l'immunodficience humaine)-1 dans les lymphocytes T [22]. Trs rcemment, il a t dmontr qu'un rcepteur orphelin de la famille des chimiokines tait impliqu dans la migration des lymphocytes B et leur adressage dans les organes lymphodes [25]. Ce rsultat souligne le rle capital que pourraient avoir les chimiokines dans l'hmatopose en jouant un rle dans l'adressage des cellules dans les divers organes hmatopotiques ou leur mobilisation.

Interfrons

interfrons , 1, et ont une action inhibitrice sur les CFU-GM, BFU-E, CFU-MK et CFU-GEMM. L'action des interfrons est surtout nette sur les BFU-E et les CFUGEMM sauf pour l'interfron . L'effet des interfrons et est synergique. L'interfron est un puissant inhibiteur de la prolifration de la population CD34+ CD38-. L'action de l'interfron n'est pas seulement une action inhibitrice (rversible) ; il pourrait galement induire une apoptose des cellules hmatopotiques primitives. Les cellules stromales exprimant l'interfron ont un puissant effet inhibiteur de l'hmatopose. Cette action de l'interfron pourrait tre la fois directe et indirecte en induisant Fas au niveau des cellules hmatopotiques. L'action directe apoptotique pourrait tre lie l'induction de la synthse de NO par l'interfron . L'interfron peut induire la synthse de CSF par les monocytes et les lymphocytes T. En revanche, au niveau des cellules stromales, les interfrons inhibent l'activation de la synthse des cytokines par l'IL1.

TNF-
Le TNF- appartient une famille de protines qui ont une homologie structurale et le mme type de rcepteurs. Le gne du TNF- humain a t clon, il est situ sur le chromosome 6. Le TNF- est synthtis essentiellement par les monocytes/macrophages, les lymphocytes T et les cellules NK sous une forme transmembranaire. Il est alors cliv par une protase et actif sous forme trimrique soluble. Le TNF- a deux rcepteurs diffrents le R-TNF1 (p55) et le R-TNF2 (p75). Les effets du TNF- sur l'hmatopose sont trs complexes et sont de trois ordres. Le TNF- peut directement ou indirectement stimuler l'hmatopose. Comme l'interfron , il peut inhiber la prolifration en agissant sur le cycle cellulaire et induire l'apoptose. Le TNF- est un puissant stimulant de la prolifration des cellules primitives en l'absence de SCF. En effet, il a un effet synergique majeur avec l'IL3 sur les cellules CD34+ CD38- suprieur celui du SCF. Il est capable de prvenir les effets inhibiteurs du TGF- mais non ceux de l'interfron . Ces effets sont retrouvs faible concentration (1ng/mL), forte concentration le TNF- a plutt un effet inhibiteur. Le TNF- inhibe les effets du SCF en inhibant l'expression de son rcepteur c-kit. Cet effet passe apparemment par le R-TNF2 (p75) sur les cellules primitives et par le R-TNF1 sur les progniteurs plus matures et les cellules leucmiques. Le TNF- est capable de moduler l'expression de plusieurs autres rcepteurs. Il entrane la rgulation positive du rcepteur de l'IL3 et du GM-CSF et la rgulation ngative du rcepteur du G-CSF. Cette action sur les rcepteurs pourrait galement expliquer les effets du TNF- sur les progniteurs plus matures o il a un effet synergique important avec l'IL3 et le GM-CSF mais inhibe les effets du G-CSF. Ces effets sont mdis par le R-TNF1 [40]. Le TNF- est galement un puissant inducteur de la diffrenciation des cellules dendritiques partir des cellules CD34+ en prsence de GM-CSF. Cependant, l'action du TNF- est complexe, car outre cette fonction inhibitrice ou stimulante directe :

il est capable d'induire l'apoptose au niveau des progniteurs hmatopotiques ; il est, de manire identique l'IL1, un puissant inducteur de la synthse de GM-CSF et de G-CSF par les cellules fibroblastiques et les cellules endothliales.

Le TNF- apparat globalement comme une cytokine trs spcialise dans la raction inflammatoire et anti-infectieuse en augmentant la synthse de GM-CSF et la rponse des progniteurs au GM-CSF.

Le TNF- a les mmes effets que le TNF-.

Peptides hmorgulateurs
Un pentapeptide a t isol partir des polynuclaires pour ses capacits inhiber la mylopose in vivo ou in vitro et a t synthtis in vitro. Sa structure est la suivante : pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys. Un autre peptide actyl SDKP (AcSDKP) a t plus rcemment purifi sur ses capacits inhiber l'entre en cycle cellulaire des CFU-S [51]. Il protge l'animal de l'effet aplasiant de la radiothrapie et des chimiothrapies. Ce peptide est synthtis dans la moelle mais pourrait tre un produit de protolyse d'une autre molcule. Les effets de AcSDKP sont trs proches de ceux de MIP-1. Pour certains auteurs, son action serait directe, pour d'autres, elle serait lie l'induction de la synthse de MIP-1.

Synthse des facteurs de croissance


Les facteurs de croissance hmatopotiques, l'exception de l'Epo et de la TPO, n'ont pas les caractristiques d'une hormone car, d'une part, ils sont synthtiss par la plupart des tissus et d'autre part la rgulation de l'hmatopose, du moins pour les temps prcoces, se fait par voie paracrine et non humorale.

Cellules synthtisant des facteurs de croissance hmatopotiques


Les cellules capables de les produire sont les cellules monocytaires/macrophagiques, les fibroblastes, les cellules endothliales, les cellules T et les cellules pithliales, cellules rparties dans tous les tissus de l'organisme. La dtection des ARNm des facteurs de croissance a facilit la caractrisation des cellules qui synthtisent les facteurs de croissance hmatopotiques, et a aussi permis d'tudier la rgulation de leur synthse. Le GM-CSF, le G-CSF, le M-CSF, l'IL6, LIF, l'IL7 et FLT3-L sont synthtiss par les fibroblastes, les monocytes/macrophages, les lymphocytes T et les cellules endothliales. La plupart des facteurs de croissance n'est pas synthtise ou scrte l'tat de base mais l'est aprs activation cellulaire. Les stimulants habituels pour les monocytes, les fibroblastes et les cellules endothliales sont l'IL1 et le TNF-. Les endotoxines bactriennes entranent la synthse de TNF- et d'IL1 par les monocytes qui, ensuite, activent la synthse des diffrents CSF au niveau des cellules du stroma mdullaire. Cette rgulation de la synthse de la plupart des facteurs de croissance est essentiellement post-transcriptionnelle, lie la stabilisation de leurs ARNm par l'IL1 ou le TNF-. La synthse d'IL3 a t longtemps considre comme spcifique des lymphocytes T ; en fait les mastocytes, les macrophages et les astrocytes sont capables de synthtiser de l'IL3 dans certaines conditions de stimulation. La synthse de cytokines par les lymphocytes T ou les cellules NK se fait aprs activation soit non spcifique (lectine, TPA) soit spcifique (antigne). Une mme cellule T synthtise plusieurs types de facteurs de croissance et, au cours de l'activation, il peut y avoir commutation de la synthse d'une cytokine par une autre.

Au contraire, le SCF est quasiment uniquement synthtis par les fibrobalstes et les cellules endothliales. Cette synthse ne ncessite aucune activation. Le M-CSF est lui aussi synthtis dans des conditions basales par les fibroblastes. En revanche, sa synthse par les monocytes et les macrophages ncessite une activation.

Rgulation paracrine et rle de la prsentation du facteur de croissance


L'essentiel de la rgulation des temps prcoces de l'hmatopose par ces facteurs de croissance est paracrine et se fait donc localement au niveau du microenvironnement, c'est--dire des cellules stromales et de la matrice. Une stimulation autocrine est galement possible certaines tapes de la diffrenciation. Plusieurs facteurs de croissance M-CSF, SCF, FLT3-L et peut-tre LIF existent la fois sous forme soluble et sous forme transmembranaire. Cette dernire forme sert la fois de molcule d'adhsion et de facteurs de croissance. Pour le SCF, il a t dmontr que la forme transmembranaire est plus active que la forme soluble. Le M-CSF transmembranaire est capable d'induire la prolifration de lignes transfectes avec le rcepteur du M-CSF. De nombreux facteurs de croissance, comme le GM-CSF, le M-CSF, l'IL3, le LIF, le FGFb, le TGF-, MIP-1 ou le PF4 sont capables de se fixer aux protoglycanes de la matrice. Cette liste n'est pas exhaustive et devrait inclure de nombreux autres facteurs de croissance. Cette liaison permet de concentrer le facteur de croissance localement mais, dans certains cas, permet de modifier la fonction du facteur de croissance ou du facteur inhibiteur. La liaison du FGFb un hparan sulfate est ncessaire pour activer le rcepteur du FGFb. La liason de MIP-1 un protoglycane lui fait perdre sa fonction chimiotactique mais conserver sa fonction d'inhibiteur de l'hmatopose. Le TGF- existe sous forme latente. Il y a plusieurs formes latentes qui correspondent soit un prcurseur soit un complexe entre le TGF- et une protine appele LTBP. La thrombospondine, molcule de la matrice extracellulaire, est capable d'activer ces deux formes de TGF-. Inversement, la dcorine, protoglycane de la matrice extracellulaire, est capable de lier le TGF- et de l'inactiver. La matrice extracellulaire n'est donc pas neutre et peut, en modifiant la prsentation, ou l'activit d'un facteur de croissance, modifier la rgulation paracrine.

Modles de rgulation de la production de cellules matures par l'Epo et la TPO


Erythropotine
A l'inverse de la plupart des autres facteurs de croissance hmatopotiques, l'Epo a les caractristiques d'une hormone. Elle est scrte par le rein et accessoirement par le foie chez l'adulte, alors que le foie est le lieu de sa synthse chez le foetus. Dans le rein, les cellules qui synthtisent essentiellement l'Epo sont des cellules pritubulaires d'origine fibroblastique. Cependant, il n'est pas exclu que les cellules tubulaires synthtisent l'Epo. Au niveau du foie, les deux types de cellules qui synthtisent l'Epo sont les hpatocytes et les cellules d'Itoh, d'origine fibroblastique. Certains auteurs ont suggr que l'Epo pouvait tre synthtise au niveau du stroma par les macrophages mdullaires.

L'Epo assure l'homostasie de la production de globules rouges en adaptant sa synthse la demande. Il existe au niveau du promoteur de l'Epo des squences rgulatrices dpendantes de l'hypoxie, si bien qu'une hypoxie au niveau du rein entrane une augmentation de la transcription du gne de l'Epo et de la synthse. Le principal paramtre qui rgule la pression d'O2 au niveau du rein est le taux d'hmoglobine, donc le nombre de globules rouges.

Thrombopotine
La TPO est essentiellement synthtise par le foie et le rein mais galement par les cellules du stroma de la moelle, le cerveau ou les muscles lisses. Le taux plasmatique de la TPO est dpendant de la masse plaquettaire et mgacaryocytaire mais contrairement l'Epo, sans rgulation de sa synthse. La synthse de TPO est constante. Chez les souris dont le gne de la TPO est inactiv, les souris htrozygotes ont une diminution de prs de 50 % du taux de plaquettes, dmontrant qu'il existe un dosage gnique dans la synthse de TPO. La quantit de TPO dans le plasma dpend de sa clairance par fixation sur son rcepteur au niveau des plaquettes et des mgacaryocytes suivie de son internalisation et de sa dgradation. Pour certains auteurs, ce modle pourrait tre extrapol la rgulation de la production de neutrophiles par le G-CSF et de macrophages par le M-CSF.

Facteurs de croissance et rgulation de l'hmatopose


Schmatiquement, il faut distinguer deux tapes dans la rgulation de l'hmatopose : les temps prcoces qui correspondent aux cellules souches et aux progniteurs primitifs (pluripotents ou unipotents), les tapes plus tardives aux progniteurs unipotents plus diffrencis (fig 8). Les temps prcoces sont rguls de manire paracrine par les cellules du microenvironnement mdullaire (fig 9). Les cellules hmatopotiques primitives ont la caractristique d'tre quiescentes et le rle des facteurs de croissance est d'assurer leur survie et leur mise en cycle. A ce stade de diffrenciation, la rgulation de l'hmatopose est assure par une combinaison des facteurs de croissance qui agissent en synergie. Les bases molculaires de cette synergie ne sont pas encore claires. Trois explications peuvent tre avances.

La synergie est lie aux effets diffrents de facteurs de croissance sur les fonctions cellulaires ; les uns inhibent l'apoptose, les autres induisent la prolifration. Les cellules tant quiescentes, leur mise en cycle ncessite l'activation de plusieurs voies de signalisation. Les molcules de la signalisation sont limitantes (rcepteurs ou molcules en aval). L'utilisation de nombreuses cytokines permet de stimuler un nombre maximal de rcepteurs et donc de recruter le maximum de molcules de signalisation.

Les associations de facteurs de croissance qui semblent les plus efficaces sur les cellules primitives contiennent SCF, FLT3-L, IL6 et IL11, TPO, IL3 et G-CSF. Il semble exister des diffrences. FLT3-L et peut-tre la TPO sont des molcules clef pour assurer la survie des cellules primitives. L'IL3 et l'IL6 semblent importantes surtout pour assurer la prolifration des progniteurs clonogniques primitifs. Plusieurs questions concernant les facteurs de croissance hmatopotiques ne sont pas rsolues (fig 10).

Est-ce que ces facteurs de croissance agissent sur les cellules qui reconstituent l'hmatopose long terme ? Existe-t-il encore des facteurs de croissance inconnus agissant sur ces temps prcoces de l'hmatopose ? Est-ce que certains facteurs de croissance agissent sur l' autorenouvellement et d'autres sur la diffrenciation ? Est-ce que les facteurs de croissance peuvent influencer l'engagement d'une cellule (dtermination) vers une ligne ou est-ce que ce phnomne est rgul par d'autres molcules ou alatoire ?

Les temps plus tardifs de l'hmatopose sont rguls par la combinaison de deux facteurs de croissance puis par un seul facteur de croissance. Le meilleur modle est celui de l'rythropose o, au niveau des BFU-E dites matures, la prolifration et la diffrenciation sont assures par l'association de SCF et d'Epo, puis au niveau des CFU-E par l'Epo seule. La rgulation de la ligne neutrophile et mgacaryocytaire avec la synergie SCF ou FLT3-L / G-CSF et SCF / TPO est trs proche. Les autres cytokines qui agissent tardivement comme l'IL6 pour la ligne mgacaryocytaire ou le GM-CSF pour la ligne granulomacrophagique sont des molcules plus spcialises dans la rponse inflammatoire ou anti-infectieuse.

Facteurs de croissance comme agents thrapeutiques : intrts et limites thoriques


Les facteurs de croissance hmatopotiques sont utiliss de manire croissante en hmatologie. Le G-CSF et l'Epo, notamment.

Le G-CSF, du fait de son action trs cible et l'absence d'effets secondaires, est utilis de faon de plus en plus large dans les neutropnies iatrognes (chimiothrapies, irradiations). Il s'agit d'une thrapeutique efficace dans les neutropnies cycliques et certaines neutropnies constitutionnelles, comme le syndrome de Kostmann. Cependant, dans cette pathologie, au cours du traitement chronique, sont apparues des leucmies qui pourraient tre lies l'volution spontane de la maladie. Le G-CSF est largement utilis dans les protocoles de mobilisation des cellules souches. L'indication thrapeutique de l'Epo est essentiellement l'anmie de l'insuffisance rnale o l'Epo permet de corriger l'anmie dans la plupart des cas. D'autres anmies chroniques et les protocoles d'autotransfusions peuvent bnficier d'un traitement par l'Epo. Les autres facteurs de croissance sont actuellement peu utiliss. Le GM-CSF a des indications proches du G-CSF. L'IL3 ou la molcule hybride GMCSF/IL3 (Pixy) ne sont pratiquement plus utiliss en thrapeutique. Le SCF s'est avr trs toxique mais il s'agit du facteur de croissance qui assure une bonne mobilisation. Il pourrait donc garder cette indication.

La TPO injecte chez l'animal entrane un raccourcissement notable de la thrombopnie lie aux chimiothrapies et l'irradiation. Son effet est synergique avec celui du G-CSF. Son utilisation chez l'homme n'est que prliminaire mais les effets jusqu' prsent rapports sur la dure de thrombopnie sont faibles. L'IL11 pourrait avoir des indications dans les thrombopnies. Les limites l'utilisation sont lies au fait que chacun d'eux agit sur une cible cellulaire prcise (CFU-GM pour le G-CSF, CFU-MK pour la TPO) ; si le compartiment de ces cellules est effondr, l'effet du facteur de croissance est limit ou nul. Actuellement, pour permettre des chimiothrapies intensives, la tendance est donc de raliser des autogreffes en rinjectant des cellules souches mobilises prsentes dans le sang priphrique. Ces cellules pourraient tre cultives in vitro, en

prsence de facteurs de croissance, pour augmenter le nombre, soit de progniteurs et raccourcir l'aplasie, soit de cellules qui reconstituent l'hmatopose long terme dans les maladies o il est impossible de disposer d'un greffon adquat. Cependant, on ne sait actuellement si cette dernire approche est ralisable chez l'adulte.

Haut de page

CONCLUSION
Les travaux des 25 dernires annes ont abouti caractriser de nouveaux types de facteurs de croissance qui, contrairement aux hormones classiques, sont scrts par un grand nombre de cellules en rponse divers stimuli. Ces rsultats ont montr que la rgulation des temps prcoces de l'hmatopose n'tait pas fondamentalement diffrente des temps tardifs. Le point encore le plus mal connu concerne la biologie des cellules souches, et tout particulirement leurs capacits de prolifration prcises. Cette connaissance est importante la fois du point de vue fondamental (notion d'autorenouvellement), et du point de vue clinique. En effet, il devient possible de purifier et de cultiver des cellules hmatopotiques primitives ; s'il s'avrait que chaque mitose entranait une perte de potentialit prolifrative des cellules hmatopotiques, les manipulations in vitro avec des facteurs de croissance resteraient trs limites. On peut galement esprer que, dans un avenir proche, l'utilisation des facteurs de croissance naturels sera remplace par l'utilisation de petits peptides permettant un plus large accs et l'utilisation plus simple de combinaisons de facteurs de croissance.

Rfrences
[1] Abramson S, Miller RG, Phillips RA The identification in adult bone marrow of pluripotent and restricted stem cells of the myeloid and lymphoid systems. J Exp Med 1977 ; 145 : 1567-1679 Anderson DM, Lyman SD, Baird A, Wignall JM, Eisenman J, Rauch C , et al. Molecular cloning of mast cell growth factor, a hematopoietin that is active in both membrane bound and soluble forms. Cell 1990 ; 63 : 235-243 Avalos BR Molecular analysis of the granulocyte colony stimulating factor receptor. Blood 1996 ; 88 : 761-777 Barr RD, Whanpeng blood. Science 1975 J, Perry S Hemopoietic stem cells in human peripheral ; 190 : 284-286

[2]

[3] [4] [5]

Bartley TD, Bogenberger J, Hunt P, Li YS Identification and cloning of a megakaryocyte growth and development factor that is a ligand for the cytokine receptor Mpl. Cell 1994 ; 77 : 1117-1124 Bazan JF A novel family of growth factor receptors. Commun 1989 ; 164 : 788-796 Bradley TR, Hodgson GS bone marrow. Blood 1979 Biochem Biophys Res

[6] [7] [8] [9]

Detection of primitive macrophage progenitor cells in ; 54 : 1446-1451 J Exp

Bradley TR, Metcalf D The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Biol Med Sci 1966 ; 44 : 287-300

Brandt J, Baird N, Lu L, Srour E, Hoffman R Characterization of a human hemopoietic progenitor cell capable of forming blast cell containing colonies in vitro. J Clin Invest 1988 ; 82 : 1017-1027 Broxmeyer HE, Sherry B, Cooper S, Lu L, Maze R, Bekmann MP , et al. Comparative analysis of the human macrophage inflammatory protein family of

[10]

cytokines (chemokines) on proliferation of human myeloid progenitor cells. Interacting effects involving suppression, synergistic suppression, and blocking of suppression. J Immunol 1993 ; 150 : 3448-3458 [11] [12] Carnot P, Deflandre rgnration du sang. D Sur l'activit hmatopotique du srum au cours de la CR Acad Sci 1906 ; 143 : 384-386

Chaudhary PM, Roninson IB Expression and activity of P-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells. Cell 1991 ; 66 : 85-94 Civin CI, Banquerigo ML, Strauss LC, Loken MR Antigenic analysis of hematopoiesis VI. Flow cytometric characterization of My-10 positive progenitor cells in normal human bone marrow. Exp Hematol 1987 ; 15 : 10-17 Cook DN, Bek MA, Coffman TM, Kirby SL, Sheridan JF, Pragnell IB , et al. Requirement of MIP-1 alpha for an inflammatory response to viral infection. Science 1995 ; 269 : 1583-1585 Copeland NG, Gilbert GJ, Cho BC, Donovan PJ, Jenkins NA, Cosman D , et al. Mast cell growth factor maps near the SI locus and is structurally altered in a number of steel alleles. Cell 1990 ; 63 : 175-183 Cumano A, Dieterlen-Lievre F, Godin I Lymphoid potential probed before circulation in mouse, is restricted to caudal intraembryonic splanchnopleura. Cell 1996 ; 86 : 907-916 De Sauvage FJ, Hass PE, Spencer SD, Malloy BE, Gurney AL, Spencer SA , et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-MpI ligand. Nature 1994 ; 369 : 533-538 De Sauvage FJ, Luoh SM, Carver-Moore K, Ryan A, Dowd M, Eaton D , et al. Deficiencies in early and late stages of megakaryocytopoiesis in TPO-KO mice. [abstract]. Blood 1995 ; 86 : 1007A Dexter TM, Allen TD, Lajtha LG Conditions controlling the proliferation of hemopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 1977 ; 91 : 335-344 Escary JL, Perreau J, Dumenil D, Ezine S, Brulet P Leukaemia inhibitory factor is necessary for maintenance of haematopoietic stem cells and thymocyte stimulation. Nature 1993 ; 63 : 361-364 Fauser AA, Messner HA Granuloerythropoietic colonies in human bone marrow, peripheral blood and cord blood. Blood 1978 ; 52 : 1243-1248 Feng Y, Broder CC, Kennedy PE, Berger EA HIV-1 entry cofactor : functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein coupled receptor. Science 1996 ; 272 : 872-877 Fialkow PJ, Denman AM, Jacobson RJ, Lowenthal MN Chronic myelocytic leukemia. Origin of some lymphocytes from leukemic stem cells. J Clin Invest 1978 ; 62 : 815-823 Flanagan JG, Chan DC, Leder P Transmembrane form of the kit ligand growth factor is determined by alternate splicing and is missing in the Sld mutant. Cell 1991 ; 64 : 1025-1035 Frster T, Mattis AE, Kremmer E, Wolf E, Brem G, Lipp M A putative chemokine receptor, BRL 1, directs B cell migration to defined lymphoid organs and specific anatomic compartments of the spleen. Cell 1996 ; 87 : 1037-1047 Gewirtz AM, Zhang J, Ratajczak M, Park KS, Li C, Yan Z , et al. Chemokine regulation of human megakaryocytopoiesis. Blood 1995 ; 86 : 2559-2567 Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med 1996 ; 183 : 1797-1806 Graham GJ, Wright EG, Hewick R, Wolpe SD, Wilkie NM, Donaldson D , et al. Identification and characterization of an inhibitor of haemopoietic stem cell proliferation. Nature 1990 ; 344 : 442-444 Gregory CJ, Eaves AC Three stages of erythropoietic progenitor cell differentiation distinguished by a number of physical and biological properties. Blood 1978 ; 51 : 527-537 Gurney AL, Carver-Moore K, De Sauvage FJ, Moore MW Thrombocytopenia in c-mpl-deficient mice. Science 1994 ; 265 : 1445-1447 Hannum C, Culpepper J, Campbell D, Mc Clanaham T, Zurawski S, Bazan JF , et al. Ligand for FLT3/FLK2 receptor tyrosine kinase regulates growth of haematopoietic stem cells and is encoded by variant RNAs. Nature 1994 ; 368 : 643-648

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19] [20]

[21] [22]

[23]

[24]

[25]

[26]

[27]

[28]

[29]

[30] [31]

[32]

Harrison D, Astle C Loss of stem cell repopulating ability upon transplantation. Effects of donor age, number, and transplantation procedure. J Exp Med 1982 ; 156 : 1767-1779 Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, Watanabe Y, Matsuda T , et al. Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature 1986 ; 324 : 73-76 Hodgson GS, Bradley TR Properties of haematopoietic stem cells surviving 5fluorouracil treatment : evidence for a pre CFU-S cell. Nature 1979 ; 281 : 381-382 Hoffman 1212 R Regulation of megakaryocytopoiesis. Blood 1989 ; 74 : 1196-

[33]

[34]

[35] [36]

Huang E, Nocka K, Beier DR, Chu T, Buck J, Lahm H , et al. The hematopoietic growth factor KL is encoded by the steel locus and is the ligand the ckit receptor, the product of the W locus. Cell 1990 ; 63 : 225-233 Ihle JN, Kerr IM Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptor superfamily. Trends Genet 1995 ; 11 : 69-74 [crossref] Ikebuchi K, Wong GG, Clark SC, Ihle JN, Hirai Y, Ogawa M Interleukin 6 enhancement of interleukin 3-dependent proliferation of multipotential hemopoietic progenitors. Proc Natl Acad Sci USA 1987 ; 84 : 9035-9039 Issaad C, Croisille L, Katz A, Vainchenker W, Coulombel L A murine stromal cell line allows the proliferation of very primitive human CD34++/CD38- progenitor cells in long-term cultures and semi-solid assays. Blood 1993 ; 81 : 29162924 Jacobsen SE, Jacobsen FW, Fahlman C, Rusten LS TNF-alpha the great imitator : role of p55 and p75 TNF receptors in hematopoiesis. Stem Cells 1994 ; 12 : 111-126 Jones RJ, Wagner JE, Celano P, Zicha MS, Sharkis SJ Separation of pluripotent haematopoietic stem cells from spleen colony-forming cells. Nature 1990 ; 347 : 188-189 Jordan CT, McKearn JP, Lemischka I Cellular and developmental properties of fetal hematopoietic stem cells. Cell 1990 ; 61 : 953-963 Keller JR, Gooya JM, Ruscetti FW Direct synergistic effects of leukemia inhibitory factor on hematopoietic progenitor cell growth : comparison with other hematopoietins that use the gp 130 receptor subunit. Blood 1996 ; 88 : 863-869 Kishimoto T, Taga : 253-262 T, Akira S Cytokine signal transduction. Cell 1994 ; 76

[37] [38]

[39]

[40]

[41]

[42] [43]

[44] [45] [46] [47] [48]

Koury MJ Programmed cell death (apoptosis) in hematopoiesis. 1992 ; 20 : 391-394

Exp Hematol

Lansdorp P Telomere length and proliferation potential of hematopoietic stem cells. J Cell Sci 1995 ; 108 : 1-6 Lansdorp P, Dragowska W, Mayani H Ontogeny-related changes in proliferative potential of human hematopoietic cells. J Exp Med 1993 ; 178 : 787-791 Lapidot T, Pflumio F, Doedens M, Murdoch B, Williams DE, Dick JE Cytokine stimulation of multilineage hematopoiesis from immature human cells engrafted in SCID mice. Science 1992 ; 255 : 1137-1140 Lawrence DA Transforming growth factor-beta : a general review. Netw 1996 ; 7 : 363-374 Eur Cytokine

[49] [50] [51]

Lemischka IR, Raulet DH, Mulligan RC Developmental potential and dynamic behavior of hematopoietic stem cells. Cell 1986 ; 45 : 917-927 Lenfant M, Wdzieczak-Bakala J, Guittet E, Prome JC, Sotty D, Frindel E Inhibitor of hematopoietic pluripotent stem cell proliferation : purification and determination of its structure. Proc Natl Acad Sci USA 1989 ; 86 : 779-782 Li CL, Johnson GR Rhodamine 123 reveals heterogeneity within murine Lin-, Sca1+ hemopoietic stem cells. J Exp Med 1992 ; 175 : 1443-1447 Lok S, Kaushansky K, Holly RD, Kuijper JL, Lofton-Day CE, Oort PJ , et al. Murine thrombopoietin : expression cloning, cDNA sequence and stimulation of platelet production in vivo. Nature 1994 ; 369 : 565-568 Lyman S, James L, Van den Bos T, Devries P, Basel K, Gliniak B , et al. Molecular cloning of a ligand for the FLT3/FLK-2 tyrosine kinase receptor. Cell 1993 ; 75 : 1157-1167 Martin C, Beaupain D, Dieterlen-Livre F Developmental relationship between

[52] [53]

[54]

[55]

vitelline and intra-embryonic hematopoiesis studied in avian yolk sac chimeras . Cell Differ 1978 ; 7 : 115-130 [56] Martin FH, Suggs S, Langley KE, Lu HS, Ting J, Okino KH , et al. Primary structure and functional expression of rat and human stem cell factor. Cell 1990 ; 63 : 203-211 [crossref] McClanahan T, Culpepper J, Campbell D, Wagner J, Franz-Bacon K, Mattson J , et al. Biochemical and genetic characterization of multiple splice variants of the Flt3 ligand. Blood 1996 ; 88 : 3371-3382 McCulloch EA, Siminovitch L, Till JE, Russell ES, Bernstein S The cellular basis of the genetically determined hemopoietic defect in anemic mice of genotype SI/SId. Blood 1964 ; 26 : 399-410 McCune JM, Namikawa R, Kaneshima H, Shultz LD, Leiberman M, Weissman IL The SCID-hu mouse : murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science 1988 ; 241 : 1632-1639 Mc Donald T Thrombopoietin : its biology, purification, and characterization. Hematol 1988 ; 16 : 201-205 Exp

[57]

[58]

[59]

[60] [61] [62] [63] [64] [65]

Medvinsky A, Dzierzak E Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell 1996 ; 86 : 897-906 Metcalf D 95-104 The leukemia inhibitory factor (LIF). Int J Cell Cloning 1991 ; 9 :

Metcalf D, Morstyn G. Colony-stimulating factors : general biology. 1991 : 417-444 Minty AJ Une nouvelle famille de cytokines inflammatoires. : 578-588 Med/Sci 1991 ; 7

Miyajima A, Liu AL, Ogorochi T, Sakamaki K Receptors for granulocyteBlood macrophage colony-stimulating factors, interleukin 3, and interleukin 5. 1993 ; 82 : 1960-1974 Miyake T, Kung CK, Goldwasser E Chem 1977 ; 252 : 5558-5564 Purification of human erythropoietin. J Biol

[66] [67]

Moore MA, Metcalf D Ontogeny of the hematopoietic system : yolk sac origin of in vivo and in vitro colony forming cells in the developing mouse embryo. Br J Haematol 1970 ; 18 : 279-296 Nagasawa T, Hirota S, Tachibana K, Takakura N, Nishikawa SI, Kitamura Y , et al. Defects of B-cell lymphopoiesis and bone marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1. Nature 1996 ; 382 : 635-638 Nolta JA, Hanley MB, Kohn DB Sustained human hematopoiesis in immunodeficient mice by cotransplantation of marrow stroma expressing human interleukin-3 : analysis of gene transduction of long-lived progenitors. Blood 1994 ; 83 : 3041-3051 Peault B, Weissman IL, Baum C, McCune JM, Tsukamoto Lymphoid reconstitution of the human fetal thymus in SCID mice with CD34+ precursor cells. J Exp Med 1991 ; 174 : 1283-1286 Pennica D, King KL, Shaw KJ, Luis E, Rullamas J, Luoh SM , et al. Expression cloning of cardiotrophin 1, a cytokine that induces cardiac myocyte hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA 1995 ; 92 : 1142-1146 Ploemacher RE, Brons NH Cells with marrow and spleen repopulating ability and forming spleen colonies on day 16, 12, and 8 are sequentially ordered on the basis of increasing rhodamine 123 retention. J Cell Physiol 1988 ; 136 : 531-536 Pluznick DH, Sachs L Cell Comp Physiol 1965 The cloning of normal mast cells in tissue culture. ; 66 : 319-324 J

[68]

[69]

[70]

[71]

[72]

[73] [74]

Pragnell IB, Wright EG, Lorimore SA, Adam J, Rosendaal M, Delamarter JF , et al. The effect of stem cell proliferation regulators demonstrated with an in vitro assay. Blood 1988 ; 72 : 196-201 Qiu F, Ray P, Brown K, Barker PE, Jhanwar S, Ruddle HS, Besmer P Primary structure of c-kit : relationship with the CSF-1/PDGF receptor kinase familyoncogenic activation of v-kit involves delection of extracellular domain and Cterminus. EMBO J 1988 ; 7 : 1003-1011 Souyri M, Vigon I, Penciolelli JF, Heard JM, Tambourin P, Wendling F A putative truncated cytokine receptor gene transduced by the myeloproliferative leukemia virus immortalizes hematopoietic progenitors. Cell 1990 ; 63 : 1137-1147 Sprangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science 1988 ; 241 : 58-62

[75]

[76]

[77]

[78] [79]

Spangrude GJ, Johnson hematopoietic stem cells.

GR Resting and activated subsets of mouse multipotent Proc Natl Acad Sci USA 1990 ; 87 : 7433-7437

Stanley E, Lieschke GJ, Grail D, Metcalf D, Hodgson G, Gall JA , et al. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor-deficient mice show no major perturbation of hematopoiesis but develop a characteristic pulmonary pathology. Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 91 : 5592-5596 Stanley ER, Bartocci A, Patinkin D, Rosendaal M, Bradley TR Regulation of very primitive, multipotent hemopoietic cells by hemopoietin-1. Cell 1986 ; 45 : 667-674 Sutherland HJ, Lansdorp PM, Henkelman DH, Eaves AC, Eaves CJ Functional characterization of individual human hematopoietic stem cells cultured at limiting dilution on supportive marrow stromal layers. Proc Natl Acad Sci USA 1990 ; 87 : 3584-3588 Szilvassy SJ, Fraser CC, Eaves CJ, Lansdorp PM, Eaves AC, Humphries RK Retrovirus-mediated gene transfer to purified hemopoietic stem cells with long-term lympho-myelopoietic repopulating ability. Proc Natl Acad Sci USA 1989 ; 86 : 8798-8802 Szilvassy SJ, Humphries RK, Lansdorp PM, Eaves AC, Eaves CJ Quantitative assay for totipotent reconstituting hematopoietic stem cells by a competitive repopulation strategy. Proc Natl Acad Sci USA 1990 ; 87 : 8736-8740 Tavian M, Coulombel L, Luton D, Clemente San, Dieterlen-Livre F, Pault B Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood 1996 ; 87 : 67-72 Terstappen LW, Huang S, Safford M, Lansdorp PM, Loken MR Sequential generations of hematopoietic colonies derived from single nonlineage-committed CD34+ CD38- progenitor cells. Blood 1991 ; 77 : 1218-1227 Till JE, McCulloch EA A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res 1961 ; 14 : 213-222 Turhan AG, Humphries RK, Phillips GL, Eaves AC, Eaves CJ Clonal hematopoiesis demonstrated by X-linked DNA polymorphisms after allogeneic bone marrow transplantation. N Engl J Med 1989 ; 320 : 1655-1661 Turner AM, Lin NL, Issarachai S, Lyman SD, Broudy VC FLT3 receptor expression on the surface of normal and malignant human hematopoietic cells. Blood 1996 ; 88 : 3383-3390 Van Snick 253-278 J Interleukin-6 : an overview. Annu Rev Immunol 1990 ; 8 :

[80]

[81]

[82]

[83]

[84]

[85]

[86] [87]

[88]

[89] [90]

Van Snick J, Goethals A, Renaud JC, Van Roost E, Uyttenhove C, Rubira MR , et al. Cloning ad characterization of a cDNA for a new mouse T cell growth factor (P40). J Exp Med 1989 ; 169 : 363-369 Verfaillie CM, Catanzarro PM, Li WN Macrophage inflammatory protein 1a, interleukin 3 and diffusible marrow stromal factors maintain human hematopoietic stem cells for at least eight weeks in vitro. J Exp Med 1994 ; 179 : 643-649 Vigon I, Mornon JP, Cocault L, Mitjavila M, Tambourin P, Gisselbrecht S , et al. Molecular cloning and characterization of MPL, the human homolog of the v-MpI oncogene : identification of a member of the hematopoietic growth factor receptor superfamily. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ; 89 : 5640-5644 Welte K, Platzer E, Lu L, Gabrilove J, Levi E, Mertelsmann R, Moore M Purification and biological characterization of human pluripotent hematopoietic colony-stimulating factor. Proc Natl Acad Sci USA 1985 ; 82 : 1526-1530 Wendling F, Maraskovsky E, Debili N, Florindo C, Teepe M, Titeux M , et al. The MpI ligand is a humoral regulator of megakaryocytopoiesis. Nature 1994 ; 369 : 571-574 Whitlock CA, Witte ON Long term cultures of B lymphocytes and their precursors from murine bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA 1982 ; 79 : 3608-3612 Wu H, Liu X, Jaenisch R, Lodish H Generation of committed eythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the erythropoietin receptor. Cell 1995 ; 83 : 59-67 Yang YC Interleukin 11 : an overview. Stem Cell 1993 ; 11 : 474-486 Yoshida K, Taga T, Saito M, Suematsu S, Kumanogoh A, Tanaka T , et al. Targeted disruption of gp 130, a common signal transducer for the interleukin 6 family of cytokines, leads to myocardial and hematological disorders. Proc Natl Acad Sci USA 1996 ; 93 : 407-411 [crossref] Youssoufian H, Longmore G, Neumann D, Yoshimura A, Lodish HF Structure,

[91]

[92]

[93]

[94]

[95] [96]

[97] [98]

[99]

function and activation of the erythropoietin receptor. 2223-2236

Blood

1993

81

[100] Zsebo KM, Williams DA, Geissler EN, Broudy VC, Martin FH, Atkins HL , et al. Stem cell factor is encoded at the SI locus of the mouse and is the ligand for the c-kit tyrosine kinase receptor. Cell 1990 ; 63 : 213-224

1997 Elsevier Masson SAS - Tous droits rservs

Fig 1 :

Fig 1 : Reprsentation schmatique des trois compartiments de cellules hmatopotiques et de l'amplification de la production dans ces compartiments cellulaires. gr : globule rouge ; pnn : polynuclaire neutrophile ; po : polynuclaire osinophile ; baso : polynuclaire basophile ; LyB : lymphocyte B ; LyT : lymphocyte T ; CFU-GEMM : colony forming unit granulo-erythro-mono-megacaryocyte.

Fig 2 :

Fig 2 : Techniques d'tudes de l'hmatopose in vitro et in vivo. A. Test de mise en vidence des progniteurs hmatopotiques. B. Test de mise en vidence des LTC-IC (long-term-culture-initiating-cell). C. Test de reconstitution hmatopotique des souris NOD/SCID (severe-combinedimmune- deficiency) irradies.

Fig 3 :

Fig 3 : Hirarchie des diffrentes cellules souches dans le modle murin et dans le modle humain.

Fig 4 :

Fig 4 : Identification des cellules souches par la prsence d'antignes membranaires marqueurs de diffrenciation. HLA : human leukocyte antigen.

Fig 5 :

Fig 5 : Sensibilit des cellules hmatopotiques diffrents facteurs de croissance. Les cellules sensibles apparaissent sur fond tram. A. Interleukine 3. B. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF). C. Facteurs actifs sur les temps tardifs (rythropotine [Epo], thrombopotine [TPO], interleukine5 [IL5], M-CSF [macrophage-colony stimulating factor], G-CSF [granulocyte-colony stimulating factor). D. Thrombopotine. E. Comparaison des cibles cellulaires de SCF (stem cell factor) et de FLT3-L. BFU-E : burst forming unit erythroid ; Pr : primitive ; int : intermdiaire ; CFU : colony forming unit.

Fig 6 :

Fig 6 : Reprsentation schmatique de la superfamille des rcepteurs de cytokines.

Fig 7 :

Fig 7 : Reprsentation schmatique de l'activation de la voie de transduction du signal Jak/Stat. t1 : rcepteur au repos ; t2 : activation du rcepteur ; t3 : recrutement des molcules de la transduction du signal. C : cytokine ; R : rcepteur ; CT : chane de transduction du signal ; Y : tyrosine ; P : groupement phosphate ; Pase : phosphatase ; X-SH2 : molcule comportant un domaine SH2.

Fig 8 :

Fig 8 : Activits des cytokines et des inhibiteurs au cours de l'hmatopose. Cadre gris : facteurs qui, utiliss seuls, permettent la survie des cellules souches.

Fig 9 :

Fig 9 : Reprsentation schmatique de la rgulation de l'hmatopose. EPO : rythropotine ; TPO : thrombopotine ; NGF : nerve growth factor ; FGF : fibroblast growth factor ; HGF : hepatocyte growth factor ; TNF : tumor necrosis factor ; TGF : transforming growth factor ; MIP : macrophage inflammatory protein ; LIF :

leukemia inhibitory factors ; SCF : stem cell factor ; FLT : fetal liver tyrosine kinase ; CSF : colony stimulating factor ; LPS : lipopolysaccharide. Cadres blancs et flches blanches pour les rgulateurs positifs, cadres gris et flches noires pour les rgulateurs ngatifs. LyT : lymphocyte T ; Mono : monocyte ; Macro : macrophage ; MEC : matrice extracellulaire.

Fig 10 :

Fig 10 : Prsentation de quelques inconnues sur la rgulation de l'hmatopose par les cytokines.

Tableaux
Tableau I.
Tableau I. - Proprits et activits des facteurs de croissance. Ligand SCF Synonyme Steel factor Kit Ligand FLT3-L FLK2-L 30 60 (dim) Syn PM (kDa) 25-35 Activit Syn Cellules sensibles Cellules souches Progniteurs primitifs Cellules souches Progniteurs primitifs

M-CSF

CSF-1 Hmopotine-2

40-70 (dim) 28 (g)

CSF CSF

Ligne macrophagique Progniteurs primitifs

IL 3

Ligne granulo/macro/osino/baso/m IL 4 IL 5 IL 6 BSF-1 BGF-2 B CSF-2 19 (g) 40-45 (g) 21-28 BCGF CSF Syn Progniteurs primitifs Ligne osinophile Progniteurs primitifs Ligne mgacaryocytaire IL 7 Pr-B GF Lymphopotine1 IL 9 IL 11 p40, TGF-II AIF 30-40 23 (ng) Syn Syn 25 (g) CSF Progniteurs primitifs Lignes lymphodes B et T Ligne rythroblastique Progniteurs primitifs Ligne mga/rythroblastique IL 12 OSM NKCSF/CLMK 35 + 40 28 Syn Syn Progniteurs primitifs Progniteurs primitifs Ligne mgacaryocytaire LIF HILDA 18 Syn Progniteurs primitifs Ligne mgacaryocytaire GMCSF CSF15 ou 22 (g) CSF Progniteurs primitifs Ligne granulo/macro/osinophile G-CSF CSF19 ou 25 (g) CSF Cellules souches Ligne granuleuse Epo TPO Mpl-L MGDF 18 ou 34 (g) 30-66 18 CSF CSF Ligne rythroblastique Cellules souches Progniteurs primitifs Ligne mgacaryocytaire MIP-1 8 Inh Progniteurs primitifs

TNF TNF TGF

cachectine lymphotoxine

17 (ng) 25 (g) (oligo) 25 (dim)

Inh ou CSF et Syn Inh (ou CSF)

Progniteurs primitifs et matures

Progniteurs primitifs Ligne mgacaryocytaire

INF INF INF

18-20 20 20-25

Inh

Progniteurs

SCF : stem cell factor ; FLT3-L : ligand de FLT-3 ; IL : interleukine ; OSM : oncostatine M ; LIF : leukemia inhibitory factor ; CSF : colony stat stimulating factor (GM : granuleux-macrophages, G : granuleux) ; TPO : thrombopotin MIP : macrophage inflammatory protein ; TNF : tumor necrosis factor ; TGF : transforming growth factor ; INF : interfron ; HILDA : human interleukine DA ; Syn : de type synergique ; dim : dimre ; g : forme glycosyle Inh : inhibiteur ; PM : poids molculaire.

Tableau II.
Tableau II. - Indications thrapeutiques des facteurs de croissance. Facteurs Indications Anmie de l'insuffisance rnale Epo Anmies chroniques Autotransfusions Neutropnies iatrognes (chimiothrapies, irradiations) G-CSF Neutropnies cycliques Neutropnies de l'enfant (syndrome de Kostmann) Protocoles de mobilisation des cellules souches avant autogreffe GM-CSF SCF TPO IL 11 Indications proches de celles du G-CSF Protocoles de mobilisation des cellules souches avant autogreffe Thrombopnies iatrognes (chimiothrapies, irradiations) ? Thrombopnies iatrognes ?

Epo : rythropotine ; G (GM)-CSF : facteur de croissance des granuleux (granuleuxmacrophages) ; SCF : stem cell factor ; TPO : thrombopotine ; IL : interleukine.

13-000-L-10

Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux


H. Merle-Bral, M. Le Garff-Tavernier
La cytomtrie de ux reprsente une tape essentielle dans le diagnostic et le suivi de la plupart des hmopathies malignes. Les cytomtres de ux actuellement disponibles permettent lobtention de rsultats rapides et ables, avec dune part des paramtres de taille et de structure des cellules, et dautre part des paramtres de uorescence spciques grce lutilisation danticorps monoclonaux coupls des uorochromes. Le diagnostic de leucmie aigu lymphoblastique ou myloblastique repose sur lanalyse morphologique et limmunophnotypage des cellules leucmiques dont certains marqueurs, seuls ou associs des anomalies cytogntiques, sont capables dinuencer le pronostic. Lintrt de la cytomtrie de ux est majeur dans le diagnostic des syndromes lymphoprolifratifs chroniques dissmination sanguine, o limmunophnotypage permet lidentication de la ligne en cause, B ou T, et trs souvent une approche trs prcise du diagnostic. Cette technologie a t plus rcemment applique la classication des gammapathies monoclonales, en particulier le mylome multiple, o elle apporte des arguments intressants pour le diffrencier des gammapathies monoclonales isoles ou de la maladie de Waldenstrm. Si elle reste encore facultative dans les mylodysplasies en dehors dtudes protocolises, elle reprsente en revanche, dans lhmoglobinurie paroxystique nocturne, la seule technique qui permette aujourdhui le diagnostic biologique. Enn, dans la plupart des hmopathies qui peuvent bncier dun traitement radicateur, elle permet la quantication de la maladie rsiduelle minimale et apporte ainsi aux cliniciens des arguments prdictifs de la rechute ou dune longue survie. De plus, grce aux avances technologiques quelle continue dvelopper, elle reprsente un outil de choix pour mieux comprendre la physiopathologie des hmopathies malignes.
2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs.

Mots cls : Cytomtrie de ux ; Hmopathies malignes ; Anticorps monoclonaux ; Immunophnotypage ; Maladie rsiduelle minimale

Plan
Introduction Principes de la cytomtrie de ux Leucmies aigus Leucmies aigus mylodes Leucmies aigus lymphoblastiques Leucmies aigus biphnotypiques valuation de la maladie rsiduelle (MRD) Leucmie lymphode chronique Syndromes lymphoprolifratifs chroniques B Syndromes lymphoprolifratifs chroniques T Mylome ou maladie de Kahler Hmoglobinurie paroxystique nocturne Mylodysplasies et syndromes myloprolifratifs Conclusion 1 1 2 3 4 5 6 6 7 8 8 8 9 10

tape essentielle dans le diagnostic et le suivi de la majorit des hmopathies malignes. Elle permet de caractriser les leucmies aigus lymphodes et mylodes, les leucmies lymphodes chroniques et les autres syndromes lymphoprolifratifs chroniques B et T. Elle est galement utilise pour la classification des gammapathies monoclonales : le mylome multiple, la maladie de Waldenstrm et les dysprotinmies monoclonales de signification indtermine. Dans lhmoglobinurie paroxystique nocturne, la CMF reprsente la seule technique permettant le diagnostic biologique. Enfin, dans les mylodysplasies, son utilisation reste encore limite certains centres spcialiss.

Principes de la cytomtrie de ux
La CMF permet dvaluer simultanment diffrentes caractristiques dune cellule ou dune particule. Les cellules sont pralablement marques par des anticorps monoclonaux (Acm) coupls des fluorochromes. Les mesures sont effectues pendant que ces cellules dfilent une une, dans un flux liquidien, devant une ou plusieurs sources lumineuses dexcitation (laser). Les cytomtres actuellement disponibles permettent danalyser deux paramtres indpendants des Acm, apportant des informations morphologiques : le forward angle scatter (FAS, FW ou FSC), paramtre de taille et le right angle scatter (RAS ou SSC), paramtre de granularit cellulaire (Fig. 1). Ceci permet de raliser un fentrage sur la population cellulaire

Introduction
La cytomtrie de flux (CMF) dtecte et quantifie lexpression dantignes (Ag) la surface et dans le cytoplasme des cellules hmatopotiques normales et pathologiques. Elle constitue une
Hmatologie

13-000-L-10 Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux

Right angle scatter (granularit de la cellule)

Polynuclaires neutrophiles

Source lumineuse excitatrice ( 1 laser)

Forward angle scatter (taille de la cellule)

Right angle scatter (RAS ou SSC)

GR, dbris cellulaires, plaquettes

Forward angle scatter (FAS ou FSC)

Monocytes

Lymphocytes

Figure 1. Informations morphologiques apportes par la CMF. La CMF permet danalyser deux paramtres indpendants des anticorps monoclonaux : le forward angle scatter (FAS) proportionnel la taille de la cellule, qui correspond la lumire mesure dans laxe de la cellule et le right angle scatter (RAS) proportionnel la granularit de la cellule, qui correspond la lumire mesure 90 de laxe de la cellule (A). Ils permettent de raliser un fentrage sur la population leucocytaire tudier : les lymphocytes, monocytes ou polynuclaires neutrophiles (B).

Longueur d'onde d'excitation (laser) FITC CD23 CD5 CD19 CD20 Lymphocyte B APC 660 nm Flux liquidien

Longueur donde dmission 519 nm 578 nm PE

Laser bleu (488 nm)

Laser rouge (633 nm)

PerCP 678 nm

Figure 2. Principe de la cytomtrie de ux. Les uorochromes, xs sur les anticorps monoclonaux, sont capables dabsorber lnergie du laser puis de la librer par mission de photons de longueur donde suprieure (uorescence), ce qui permet de quantier les antignes la surface ou dans le cytoplasme dune cellule. Dans cet exemple est reprsent un lymphocyte B exprimant les molcules CD19, CD20, CD5 et CD23 (adapt daprs Becton Dickinson). FITC : isothiocyanate de uorescine ; PE : R-phycorythrine ; APC : allophycocyanine ; PerCP : peridinine chlorophylle-protine.

dintrt puis danalyser les paramtres de fluorescence spcifiques de chacun des fluorochromes ( couleurs ) coupls aux Acm utiliss. Les fluorochromes sont en effet capables dabsorber lnergie lumineuse provenant du laser puis de librer cette nergie, appele fluorescence, par mission de photons de longueur donde suprieure (Fig. 2). Les fluorochromes les plus utiliss sont dcrits dans le Tableau 1. Pour le diagnostic des hmopathies malignes, la plupart des laboratoires dhmatologie utilisent actuellement des appareils 4 ou 6 couleurs. ct de ces analyseurs utiliss en routine, il existe des cytomtres trieurs permettant de sparer des populations cellulaires et des cytomtres pouvant analyser jusqu 17 paramtres de fluorescence [1], dont lintrt est actuellement rserv la recherche. Les Acm sont le plus souvent dorigine murine et sont dirigs contre des Ag membranaires ou intracellulaires. Depuis 1982 [2], ils sont regroups dans une classification rgulirement mise jour loccasion de Workshops dont le dernier sest tenu

Adelade en dcembre 2004 (http://www.hlda8.org). Ces ateliers permettent dassigner aux diffrents Acm lappartenance un cluster ou classe de diffrenciation (CD), 350 CD tant actuellement rfrencs. La CMF permet ainsi de caractriser les cellules pathologiques sur des prlvements sanguins, mdullaires ou dans des liquides de ponction avec la possibilit de marquer directement les cellules sans ncessit de raliser au pralable une sparation cellulaire. Ceci est particulirement intressant pour le diagnostic et le suivi des hmopathies malignes, la rapidit de cette technique permettant davoir un rsultat fiable en moins dune demi-journe.

Leucmies aigus
Les leucmies aigus (LA) sont des hmopathies malignes dfinies par la prsence dans la moelle osseuse de plus de 20 %
Hmatologie

Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux 13-000-L-10

Tableau 1. Caractristiques des uorochromes les plus utiliss.


Fluorochrome Alexa Fluor 405 Pacific Blue AmCyan Alexa Fluor 488 FITC PE Texas Red APC Alexa Fluor 647 PE-Cy5 PerCP PerCP-Cy5.5 Alexa Fluor 700 PE- Cy7 APC-Cy7 Laser (nm) 360, 405, 407 360, 405, 407 405, 407 488 488 488, 532 595 595, 633, 635, 647 595, 633, 635, 647 488, 532 488, 532 488, 532 633, 635 488, 532 595, 633, 635, 647 mission maximale (nm) 421 455 491 519 519 578 615 615 660 668 667 678 695 719 785 785

Phnotypes
Leucmie aigu mylode peu diffrencie (FAB : LAM-0) La caractrisation immunologique des blastes prend ici un intrt majeur, puisquil sagit de cellules indiffrencies, myloperoxydases (MPO) ngatives en intracytoplasmique, et pour lesquelles ltude cytologique et cytochimique ne permet pas de faire la distinction entre une LAM-0 et une LAL. La mise en vidence la surface des blastes, de molcules appartenant la ligne mylode (CD33, CD13, CD117) associes au marqueur des cellules souches CD34, labsence de marqueurs des cellules matures (CD15, CD16) et surtout labsence de marqueurs de la ligne lymphode, aboutit au diagnostic de LAM-0. Il est galement indispensable de vrifier labsence de marqueurs rythrocytaires (glycophorine A), plaquettaires (CD41, CD42b et CD61), et monocytaires (CD14, CD64, CD11b), pour exclure les autres LAM ngatives pour les MPO. Leucmie aigu mylode sans maturation (FAB : LAM-1) et leucmie aigu mylode avec maturation (FAB : LAM-2) Le phnotype des LAM-1 est comparable celui des LAM-0, avec en outre la positivit des MPO. Les LAM-1 diffrent des LAM-2 par la prsence de marqueurs dimmaturit (forte expression des molcules CD34, HLA-DR et CD117) et labsence de marqueurs retrouvs sur les formes plus matures (CD16, CD15). Leucmie aigu promylocytaire (FAB : LAM-3) Le diagnostic de LAM-3, qui implique une attitude thrapeutique spcifique, est possible grce un phnotype le plus souvent typique : positivit des marqueurs mylodes (CD33, CD13 et intense positivit des MPO intracytoplasmiques) associe la ngativit du CD34 et de la molcule HLA-DR, prsente dans tous les autres types de LAM. Leucmie aigu mylomonocytaire (FAB : LAM-4) et leucmie aigu monoblastique ou monocytaire (FAB : LAM-5) Le diagnostic est port sur la prsence de marqueurs monocytaires (CD14, CD64, CD11b) associs aux marqueurs mylodes (CD33, CD13). De plus, le CD36 non spcifique de la ligne monocytaire, est aussi frquemment exprim. La diffrence entre les LAM-4 et les LAM-5 est fonde, comme pour la cytologie, sur la proportion de blastes monocytaires par rapport aux blastes mylodes. rythroleucmie (FAB : LAM-6) ct de la population blastique de type granuleux exprimant faiblement les marqueurs mylodes, on observe la prsence dune population rythroblastique reprsentant plus de 30 % des lments analyss et qui est positive pour des marqueurs des rythroblastes comme le CD235a (glycophorine A, AGA). Deux marqueurs prsents sur les rythroblastes, mais de faon non spcifique, sont galement trs utiles pour voquer ce diagnostic : le CD36, galement prsent sur les monocytes et les plaquettes et le CD71, rcepteur pour la transferrine, prsent sur toute la ligne rythroblastique mais pouvant tre retrouv sur tout type cellulaire qui prolifre. Dans la forme LAM-6 variante [7], de diagnostic difficile, les blastes peuvent nexprimer aucun Ag mylode et tre CD235a ngatifs. Le diagnostic repose alors sur le CD36 et doit souvent tre confirm par des cultures in vitro ou une tude en microscopie lectronique. Leucmie aigu mgacaryoblastique (FAB : LAM-7) Identifie plus tardivement que les prcdentes grce lapplication des Acm dans la caractrisation des leucmies [8], la LAM-7 est dfinie par la prsence dau moins deux molcules spcifiques de la ligne plaquettaire (CD41, CD42b ou CD61) sur des blastes MPO ngatifs. Caractrisation de sous-groupes de LAM Certains phnotypes de LAM prsentent une forte corrlation avec des anomalies cytogntiques ou molculaires et peuvent orienter le diagnostic vers une LAM du groupe 1 de la classification de lOMS (groupe LAM avec des anomalies gntiques

PE-Texas Red (ECD) 488, 532

FITC : isothiocyanate de fluorescine ; PE : R-phycorythrine ; APC : allophycocyanine ; PE-Cy5 : PE-cyanine 5 ; PerCP : peridinine chlorophylleprotine ; PerCP-Cy5.5 : PerCP- cyanine 5.5 ; PE-Cy7 : PE-cyanine 7 ; APC-Cy7 : APC-cyanine 7 (daprs http://bdbiosciences.com).

Tableau 2. Classication OMS des leucmies aigus mylodes

[3].

Leucmie aigu mylode avec des anomalies gntiques rcurrentes Leucmie aigu mylode avec t(8;21)(q22; q22); (AML1(CBFa)/ETO) Leucmie aigu mylode avec osinophilie inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13; q22); (CBFb/MYH11) Leucmie aigu promylocytaire : LAM avec t(15;17)(q22; q12); (PML/RARa) et variants Leucmie aigu mylode avec11q23 (MLL) Leucmies aigus mylodes avec dysplasie de plusieurs lignes Leucmies aigus mylodes et syndromes mylodysplasiques secondaires la thrapeutique Leucmies aigus mylodes non classes prcdemment Leucmie aigu mylode peu diffrencie Leucmie aigu mylode sans maturation Leucmie aigu mylode avec maturation Leucmie aigu mylomonocytaire Leucmie aigu monoblastique/monocytaire rythroleucmie Leucmie aigu mgacaryoblastique Leucmie aigu basophiles Mylofibrose aigu Sarcome mylode

(classification Organisation mondiale de la Sant [OMS]) [3] ou de 30 % (classification franco-amricano-britannique ou FAB) de blastes [4] . Pour reprer les cellules blastiques au sein dun chantillon, il existe un consensus pour effectuer un fentrage immunologique sur les cellules de phnotype CD45 faible [5, 6], marqueur panleucocytaire plus faiblement exprim sur les blastes que sur les autres leucocytes. La CMF permet de distinguer les leucmies aigus mylodes (LAM lignes granuleuse, mylomonocytaire, mgacaryocytaire ou rythrode) et les leucmies aigus lymphoblastiques (LAL-B ou T).

Leucmies aigus mylodes


Le phnotypage immunologique des cellules blastiques est un des paramtres de la nouvelle classification de lOMS de 2002 (Tableau 2) [3], classification qui intgre dans sa dernire partie lancienne classification cytologique et cytochimique du FAB (M0 M7). Les expressions des marqueurs les plus souvent utiliss sont dcrites dans le Tableau 3.
Hmatologie

13-000-L-10 Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux

Tableau 3. Caractristiques phnotypiques des leucmies aigus mylodes.


CD LAM-0 Cellules souches mylodes Marqueurs dimmaturit CD34 CD117 HLA DR CD13 CD33 MPO cy CD15 et CD16 CD14 CD64 CD11a, b, c CD235a (AGA) CD41a et CD42b CD61 CD36 CD71 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + ++ ++ +++ +++ +++ ++ +/+/+/+++ ++ +++ + + + ++ ++ ++ ++ -/+ ++ ++ ++ +/+ -/+ -/+ +++ ++ ++ +/+ -/+ -/+ +/+/+/+/+/+/+/+/LAM-1 Myloblastes LAM-2 Myloblastes LAM-3 Promylocytes LAM-4 Myloblastes/ monoblastes LAM-5 Monoblastes LAM-6 rythroblastes LAM-7 Mgacaryoblastes

Marqueurs mylodes

Marqueurs de granuleux matures

Marqueurs monocytaires + + ++ + + ++ + -

Marqueurs rythrodes

Marqueurs plaquettaires +/+/+ +/+/+ + ++ + + + -

Marqueurs non spcifiques

LAM-0 : leucmie aigu mylode peu diffrencie ; LAM-1 : leucmie aigu mylode sans maturation ; LAM-2 : leucmie aigu mylode avec maturation ; LAM-3 : leucmie aigu promylocytaire ; LAM-4 : leucmie aigu mylomonocytaire ; LAM-5 : leucmie aigu monoblastique/monocytaire ; LAM-6 : rythroleucmie ; LAM-7 : leucmie aigu mgacaryoblastique ; CD : classe ou cluster de diffrenciation ; MPO cy : myloperoxydases intracytoplasmiques ; AGA : glycophorine A.

rcurrentes, Tableau 2) [9]. Ainsi la coexpression du CD19 et du CD34 (et parfois du CD56) est retrouve dans les LAM avec t(8;21) [10]. La prsence du marqueur CD2 est trs frquente dans les LAM avec participation osinophile et anomalies du chromosome 16q [11]. Les LA promylocytaires avec translocation t(15;17) sont caractrises par labsence dexpression des molcules HLA-DR et CD34 [12]. Enfin, les anomalies inv(16) ou t(16;16) sont souvent associes des leucmies diffrenciation mylomonocytaire avec expression du CD14 ou du CD64 [13].

galement impliques dans les phnomnes de chimiorsistance, mais lintrt clinique de leur dtection reste controvers [25].

Leucmies aigus lymphoblastiques


La classification actuelle de lOMS [27] distingue deux entits diagnostiques : la LAL prcurseur B et la LAL prcurseur T, chacune dentre elles comprenant un large spectre de formes cliniques, morphologiques, immunophnotypiques, cytogntiques et molculaires. Le diagnostic de LAL-B et LAL-T se fait par le phnotypage.

Signication pronostique
Dans les LAM, ce sont surtout les caractristiques cytogntiques qui ont une valeur pronostique. Cependant, les LAM de phnotype rare, telles que les LAM-0, LAM-6 et LAM-7 (en dehors des LAM-7 observes au cours de la trisomie 21 constitutionnelle) sont associes un mauvais pronostic aussi bien en termes dobtention que de dure de la rmission complte [14]. Les LAM-5 sont galement associes un pronostic plus dfavorable. La valeur pronostique de lexpression isole de marqueurs mylodes reste encore trs controverse. On a ainsi attribu un critre pjoratif lexpression du CD34 [15-17] et du CD56 [18]. De plus, le CD11b serait associ un mauvais pronostic [19, 20] et le CD15 un bon pronostic [20, 21] . Le CD7, marqueur prcoce de la ligne T, peut tre prsent et sa signification pronostique est discute [22]. Enfin, les patients dont les blastes expriment un large panel de marqueurs mylodes (CD13, CD33, CD117, CD65, et les MPO) auraient une meilleure survie [23, 24]. Lensemble de ces donnes a t repris par lquipe de Szer [24]. La molcule de rsistance aux chimiothrapies code par le gne MDR1, trs prfrentiellement exprime dans les LAM secondaires ou les LAM du sujet g, est associe un pronostic dfavorable [25, 26]. Dautres protines (MRP, LRP, BCRP) sont

LAL-B
Pour la ligne B (Tableau 4), les marqueurs pan-B sont CD19, cCD22, cCD79a. Les marqueurs de stade de la ligne B tant CD10, c (chane dimmunoglobuline [Ig] cytoplasmique) et sIgM (IgM de surface), le CD20 et le marqueur de maturit FMC7. La molcule HLA-DR et lAg nuclaire TdT (dsoxynuclotidyl transfrase terminale), non spcifiques de la ligne B sont prsents dans presque tous les cas de LAL-B [28] . Les prcurseurs B trs immatures sont caractriss par labsence dIg, que ce soit en surface (sIgM) ou en intracytoplasmique (c) et se divisent en deux catgories, les lymphoblastes pro-B (LAL pro-B ou de type I) nexprimant pas lAg CD10 et les blastes prpr B (LAL pr-pr B ou de type II) qui lexpriment (Fig. 3). Les lymphoblastes pr-B (LAL pr B ou de type III) restent CD10 positifs et acquirent lexpression de la chane lourde intracytoplasmique. Enfin, les cellules B matures (LAL-B matures ou de type IV) sont dfinies par lexpression en surface dune Ig complte. La LAL-3 de type Burkitt (classification FAB) [4] (ou lymphome/leucmie de Burkitt selon la classification OMS [27]) est une entit particulire o le phnotypage ne correspond aucun stade physiologique de la maturation dune cellule B, co-exprimant le CD10 et lIgM de surface.
Hmatologie

Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux 13-000-L-10

Tableau 4. Caractristiques phnotypiques des leucmies aigus lymphodes B.


CD LAL-pro B LAL-B I Marqueurs dimmaturit CD34 CD19 CD22 cCD79a CD10 CD20 CD79b FMC7 HLA DR + + + + -/+ + + + + c+ +/+ + + + + sIgM+ + + -/+ + + + + + sIgM+++ + + -/+ + Marqueurs pan-B + + (cytoplasme) + +/+ + + +/+ + LAL pr-pr B LAL pr B LAL-B commune mature LAL-B II LAL3 de type LAL-B III LAL-B IV Burkitt

Marqueurs de stade de diffrenciation C / sIgM -

Marqueurs non spcifiques

cCD79a : CD79a intracytoplasmique ; c : chane intracytoplasmique ; sIgM : immunoglobuline M exprime en surface.

De mme que pour les LAM, les phnotypes immunologiques des LAL peuvent prsenter de nombreuses infidlits et donner lieu des combinaisons de marqueurs dune apparente incohrence avec la diffrenciation normale. Certains phnotypes sont corrls la prsence danomalies cytogntiques ou molculaires. Le phnotype CD9+, CD10+, CD19+, partiellement CD20+ et CD34 (reprsentant moins de 10 % des cas de LAL-B) est un indicateur de la t(1;19)(q23; p13) [29] . Un phnotype CD10, CD15+, CD19+, CD24/ + partiel, a t dcrit associ aux LAL-B avec t(4;11) [30-32].

LAL-T
Pour les LAL-T (Tableau 5), les marqueurs pan-T utiliss sont les CD2, CD5, CD7 et le CD3 intracytoplasmique. Les molcules rigoureusement spcifiques de la ligne T, le rcepteur T (TCR) et le CD3, dont lapparition la surface des cellules est assez tardive dans la diffrenciation, ne sont le plus souvent pas retrouvs la surface des cellules leucmiques. LAg cortical thymique, CD1a, et les Ag des sous-populations T, CD4 et CD8 peuvent tre utiliss pour classer les diffrents prcurseurs des LAL-T : les cellules blastiques T trs immatures CD34+, CD1a, sCD3, CD4 et CD8 (LAL pro-T ou de type I) ; les cellules immatures de mme phnotype mais CD34 (LAL pr-T ou de type II) ; les thymocytes communs CD1a+, sCD3, CD4+ et CD8+ (LAL-T commune ou de type III) ; et les cellules T matures CD1a, CD3+, CD4+ ou CD8+ (LAL-T mature ou de type IV).

Figure 3. Diagnostic dun cas de leucmie aigu lymphoblastique (LAL). Les cellules blastiques (che rouge), reprsentant 37 % des cellules totales, sont repres par leur faible expression du CD45 (A). Ces blastes sont positifs pour le marqueur dimmaturit CD34 (45 %) (B). Il sagit de lymphoblastes de la ligne B, CD19+ (80 %)(B), CD79a intracytoplasmique + (C), CD10+ (D) et nexprimant pas encore la chane intracytoplasmique (E). Ce phnotype permet de porter le diagnostic de LAL pr-pr B.

Leucmies aigus biphnotypiques


Il est important de bien identifier cette catgorie particulire de leucmies aigus, de pronostic trs dfavorable et plus particulirement retrouves dans les formes dites secondaires. Elles prsentent galement souvent des anomalies cytogntiques, la trs grande majorit des LAM biphnotypiques tant, par exemple, associe soit la prsence du chromosome Philadelphie, soit lexpression du gne MLL [41]. La dfinition des LA biphnotypiques est strictement immunologique. On exige la prsence dun certain nombre de marqueurs spcifiques de deux lignes diffrentes sur les mmes cellules blastiques. La classification europenne de lEuropean group for the immunologic classification of leukaemias (EGIL) [42] ou le systme de score du Groupe pour ltude immunologique des leucmies (GEIL) sont fonds sur la prsence dun certain nombre dAg ayant diffrents niveaux de pondration (Tableau 6). Lassignation une ligne ncessite un score strictement suprieur 2. Lassignation deux lignes sur les mmes cellules blastiques permet ainsi de caractriser les leucmies aigus biphnotypiques.

Signication pronostique
Les LAL-B et T trs immatures sont associes un pronostic moins favorable, tout particulirement les LAL-B avec t(4;11) [31, 33-37] . De plus, les LAL-T ont un meilleur pronostic que les LAL-B chez ladulte alors que linverse est observ chez lenfant de plus de 1 an. Les LAL-T pdiatriques corticales (CD1a+) semblent se caractriser par une meilleure rponse au traitement et une augmentation significative de la dure de survie [38-40]. Lanalyse du cycle cellulaire, avec en particulier la quantification de lADN total par cellule (mesure de la plodie), peut tre applique en CMF aux LA. Celle-ci a une valeur pronostique, en particulier dans les LAL de lenfant o les formes hypodiplodes sont associes un pronostic pjoratif et les formes hyperdiplodes au phnotype pr-pr B un meilleur pronostic. La plodie est ainsi dtermine de faon systmatique dans un certain nombre de protocoles thrapeutiques.
Hmatologie

13-000-L-10 Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux

Tableau 5. Caractristiques phnotypiques des leucmies aigus lymphodes T.


CD LAL-pro T LAL-T I LAL pr-T LAL-T II LAL-T corticale LAL-T III LAL-T commune + + + + (cytoplasme) + (cytoplasme) + + + +/+/LAL-T mature LAL-T IV LAL-T mature + + + + +

LAL-T immature Marqueurs dimmaturit CD34 CD7 CD2 CD5 CD3 TCRab +/+ + + + (cytoplasme) + + + + (cytoplasme) Marqueurs pan-T

quelques tudes de LA de ladulte [60, 61]. La MRD est maintenant value dans tous les protocoles de LAL et peut tre utilise pour adapter les traitements [62]. Si dans les LAL, les rsultats publis semblent relativement faciles reproduire et trs probants sur le plan clinique, il nen est pas de mme dans les LAM [63]. Peu dquipes ont actuellement valid cette approche et seulement avec un nombre limit de patients. Nanmoins, lquipe espagnole dOrfao a dmontr sur une srie de 126 patients que ltude de la MRD tait prdictive de la survie sans rechute [44]. En France, lvaluation de la MRD par CMF dans les LA est pratique au sein de protocoles dans des centres spcialiss. Un immunophnotypage complet permettant le diagnostic et la caractrisation initiale des blastes est effectu avec pour objectif secondaire lvaluation de la MRD. La quantification de la dcroissance des blastes les 5 premiers jours de la chimiothrapie dinduction dans les LAM est un paramtre prometteur en cours dvaluation.

Marqueurs de stade de diffrenciation CD1a CD4 CD8 CD38 HLA DR + + + + soit +/soit -/+ -

Leucmie lymphode chronique


Ltude des marqueurs de membrane par CMF est ncessaire et suffisante pour porter le diagnostic de leucmie lymphode chronique (LLC). En effet, les cellules leucmiques portent les Ag caractristiques de la ligne B, en particulier le CD19 et le CD20, qui est plus faiblement exprim que dans les cellules B normales, ce qui est pathognomonique de cette maladie. La nature monotypique de la prolifration est rvle par lexpression de membrane dune seule chane lgre dIg, kappa ou lambda, avec un nombre de sites trs diminu par rapport aux cellules B normales ou celles des autres syndromes lymphoprolifratifs chroniques B. La molcule CD5, exprime par les cellules de la ligne lymphocytaire T, est retrouve de faon presque constante sur les cellules de LLC. Le CD23, marqueur dactivation des lymphocytes B, est galement prsent alors que le FMC7, ainsi que le CD22, marqueur des cellules B au repos, et la chane accessoire b du rcepteur pour lantigne (CD79b), sont peu exprims ou absents. Ces caractristiques immunologiques permettent de dfinir le score de Matutes [64, 65] en donnant une valeur de 1 chacun des lments suivants : positivit du CD23 et du CD5, ngativit ou faible expression du FMC7 et du CD79b (ou du CD22), faible expression de la chane lgre kappa ou lambda (Tableau 7). La LLC est dfinie par un score de Matutes 4 ou 5. Un score 3 peut correspondre une LLC atypique . Un score infrieur 3 permet dliminer le diagnostic de LLC et de caractriser les autres syndromes lymphoprolifratifs chroniques B. Dautres marqueurs peuvent tre prsents, en particulier le CD25, marqueur dactivation qui correspond au rcepteur de lIL2, le CD43, le CD11c, le CD2 [66-68]. Le CD38, marqueur de prolifration qui correspond au compartiment prolifratif de la maladie et lui confre sa gravit, est un facteur de pronostic et le pourcentage des cellules du clone malin qui expriment ce marqueur doit tre quantifi au cours du bilan initial et au cours du suivi [69, 70]. La CMF permet galement de dtecter la prsence de la molcule ZAP-70. La technologie des puces ADN en 2001 a rvl la prsence de ZAP-70 dans certaines LLC et sa corrlation avec le statut
Tableau 7. Le systme de score de Matutes [64, 65]. La somme des points obtenus donne le score de Matutes qui est 4 dans les leucmies lymphodes chroniques (LLC). Un score de 3 correspond une LLC atypique et un score < 3 exclut le diagnostic de LLC.
Score Chane lgre monotypique de faible intensit CD5 positif CD23 positif CD79b (ou CD22) ngatif ou faible FMC7 ngatif ou faible 1 point 1 point 1 point 1 point 1 point

Marqueurs non spcifiques

TCR : rcepteur T pour lantigne.

Tableau 6. Systme de score de lEuropean Group of Immunologic classication of Leukaemias (EGIL) [42].
Score 2 points Marqueurs B CD79 c cCD22 1 point CD19 CD20 CD10 0,5 point TdT CD24 CD2 CD5 CD8 CD10 TdT CD7 CD1a CD117 CD13 CD33 CD65 CD14 CD15 CD64 Marqueurs T CD3 TCR Marqueurs mylodes MPO (lysozyme)

c : chane intracytoplasmique ; TCR : rcepteur T pour lantigne ; MPO : myloperoxydase ; TdT : terminal doxynuclotidyl transferase.

valuation de la maladie rsiduelle (MRD)


La dtection de la MRD par CMF est une tape importante dans le suivi des LA, cette technique permettant de reprer des populations en trs faible quantit avec des sensibilits le plus souvent infrieures 0,01 % [43-47]. Le principe fondamental sur lequel repose cette dtection est que les cellules leucmiques diffrent de leur contrepartie normale par leur expression qualitative ou quantitative dun ou plusieurs Ag [48-50] . La stratgie de la dtection de la MRD est parfois limite, certaines LA ne prsentant pas de combinaison antignique spcifique permettant de les diffrencier dune sous-population cellulaire normale. De plus, des changements dans le phnotype des cellules leucmiques peuvent apparatre au moment de la rechute, que ce soit dans les LAL [51-53], ou plus frquemment dans les LAM [54-56]. Lapport de lvaluation de la MRD est cependant particulirement important pour les LAL o de nombreuses tudes rapportent que la positivit de la MRD est un facteur prdictif dun plus haut risque de rechute [57-59], indpendamment des autres facteurs de risque et que ce risque est proportionnel au pourcentage dtect [57]. Ces constatations dcrites surtout dans les nombreuses tudes pdiatriques sont retrouves dans les

Hmatologie

Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux 13-000-L-10

Figure 4. Prsence dune maladie rsiduelle dans le sang dun patient atteint de leucmie lymphode chronique (LLC) aprs autogreffe. Les lymphocytes totaux (che verte) sont quantis par rapport aux cellules totales (20 %) grce leur positivit en CD45 et leur structure peu complexe (A). Les lymphocytes B sont quantis par rapport aux lymphocytes totaux (4 %) par leur expression du CD19 (B). Les cellules de LLC, reprsentant 25 % des lymphocytes B et 1 % des cellules totales (che rouge) prsentent ici des caractristiques typiques : monotypie kappa de faible intensit (C), CD5+ (D), CD23+ (E), CD79b faible (D) et FMC7 ngatif (E) (score 5 de Matutes). Elles sont galement CD20 de faible intensit (F). En comparaison, la population B normale est visualise en vert.

mutationnel des gnes qui codent pour la partie variable des chanes lourdes des Ig (IgVH) [70, 71]. Or, le statut mutationnel est un marqueur de pronostic puissant de la maladie. ZAP70 est une tyrosine kinase, habituellement rencontre dans la cascade dactivation des lymphocytes T et des cellules NK, et quon pensait absente des cellules B. Ainsi, la mesure de ZAP70 par CMF permet de complter, et dans certains cas de remplacer, la dtermination du statut mutationnel des gnes IgVH, mthode longue et coteuse base sur le squenage des gnes et qui ne peut pas tre aujourdhui pratique systmatiquement en routine, alors que la mesure de lexpression de ZAP70 par cytomtrie est dun maniement plus facile [72, 73]. Limmunophnotypage est rpt pendant le suivi de la maladie. Il permet de quantifier la variation des cellules leucmiques au cours de lvolution, dvaluer leffet du traitement, de dtecter une rechute ou lapparition dun nouveau clone. Aprs traitement curatif, en cas de rmission complte selon les critres du National Cancer Institute (NCI) [74] , la CMF permet la quantification de la maladie rsiduelle minimale avec une sensibilit de 104 avec 4 Acm jusqu 105 avec 6 Acm apportant au clinicien des informations intressantes, en particulier sur la dure prvisible de la survie (Fig. 4) [75, 76].

Tableau 8. Caractristiques phnotypiques des syndromes lymphoprolifratifs chroniques B.


CD CD19 CD5 CD22 CD23 sIg FMC7 CD79b CD10 CD25 CD11c CD103 LLC + + + + faible LCM + + ++ LF + + -/+ ++ ++ ++ +/-/+ -/+ LZM + + ++ ++ ++ -/+ -/+ LPL-B + +/+ ++ ++ ++ -/+ HCL + ++ +++ +++ +++ + + SLVL + -/+ ++ -/+ +++ +++ +++ + -

-/+ faible +

-/+ faible ++ -/+ faible ++ -/+ -/+ -

+ (- variant) -

LLC : leucmie lymphode chronique ; LCM : lymphome du manteau ; LF : lymphome folliculaire ; LZM : lymphome de la zone marginale ; LPL-B : leucmie prolymphocytaire B ; HCL : Hairy cell leukemia ou leucmie tricholeucocytes ; SLVL : lymphome lymphocytes splniques villeux ; sIg : immunoglobuline exprime en surface.

Syndromes lymphoprolifratifs chroniques B


Lapport de limmunophnotypage est majeur dans le diagnostic des syndromes lymphoprolifratifs B prsentation leucmique (Tableau 8). Lorsque la prolifration a un score de Matutes infrieur ou gal 3, le phnotype permet dorienter le diagnostic vers une autre ventualit que la LLC. La positivit du CD5 fait envisager un lymphome du manteau ou une leucmie prolymphocytaire o son expression est retrouve dans respectivement 90 % et 50 % des cas [77-79]. Les lymphomes de la zone marginale nont pas de marqueur spcifique et
Hmatologie

correspondent, du point de vue de limmunomarquage, un diagnostic dlimination [80] . Les lymphomes folliculaires peuvent tre voqus devant la positivit du CD10, marqueur gnralement prsent dans les cellules de LAL, traduisant lorigine folliculaire de la pathologie [81]. La leucmie tricholeucocytes ou hairy cell leukemia (HCL) est caractrise par lassociation de trois marqueurs particuliers, le CD25, la molcule dadhsion CD11c, et le CD103, marqueur spcifique des tricholeucocytes. Dans la forme HCL variant , plus hyperleucocytaire, le phnotype est identique lexception du CD25 gnralement absent [82]. La maladie de Waldenstrm qui est caractrise par une infiltration lymphoplasmocytaire a fait lobjet de plusieurs publications sur lanalyse phnotypique sans

13-000-L-10 Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux

quun profil spcifique ait t fermement tabli. On peut observer en particulier que les cellules sont trs proches de celles du lymphome de la zone marginale [83].

Mylome ou maladie de Kahler


Bien que les tudes immunophnotypiques en CMF des cellules plasmocytaires mylomateuses aient t effectues depuis plus de 15 ans, la dfinition du phnotype exact de ces cellules reste controverse ainsi que son intrt clinique. Lantigne CD38 est une molcule largement distribue dans le systme hmatopotique. La CMF a permis de montrer que lintensit de cette molcule la surface des plasmocytes est plus importante que celle observe sur nimporte quel autre type cellulaire. Le CD138 est un marqueur spcifique du plasmocyte et nest exprim sur aucune autre cellule hmatopotique. La combinaison de ces deux marqueurs permet de reprer prcisment et de quantifier les cellules plasmocytaires. La plupart des tudes immunophnotypiques pratiques sur les moelles de patients atteints de mylome ont montr que les plasmocytes ont en gnral perdu la plupart des marqueurs associs la ligne B (CD19, CD22), bien quils puissent rester prsents dans prs de 15 % des cas. En outre, la prsence dIg de surface est retrouve chez environ un tiers des patients mylomateux, ce qui traduit un certain degr de capacit de maturation pour les plasmocytes de mylome comme les cellules plasmoblastiques normales [86]. Les plasmocytes mylomateux interagissent avec le microenvironnement mdullaire grce la prsence de nombreuses molcules dadhsion leur surface, en particulier les CD11a, CD18, CD138, CD44, CD56 qui sont exprims dans au moins 60 % des mylomes. Dautres Ag sont frquemment retrouvs : le CD117 ou c-kit dans peu prs un tiers des cas, les marqueurs granuleux CD13 et CD33 dans un quart des cas, et des molcules de coactivation des lymphocytes T et B, tels le CD40 et le CD28, dans respectivement 66 % et 40 % des mylomes. Quelques tudes ont tent de trouver une valeur pronostique lexpression atypique de ces marqueurs, mais les sries sont trop courtes et trop dissemblables pour tre significatives [86, 87]. Un des intrts majeurs de limmunophnotypage des plasmocytes rside dans la possibilit de diffrencier les plasmocytes normaux des mylomateux sur la base de lexpression de quatre marqueurs : les plasmocytes normaux sont CD19+/CD45+ /CD56/CD38+++ , alors que les plasmocytes du mylome sont gnralement CD19/CD45 ou + faible/CD56+++ /CD38++ (Fig. 5). La coexistence dune population de plasmocytes rsiduels polyclonaux normaux et de plasmocytes clonaux de nature maligne est une observation constante dans les gammapathies monoclonales de signification indtermine (MGUS) alors quelle est rare dans les mylomes et reprsente ainsi un argument de diagnostic diffrentiel important. De plus, selon certaines tudes, la proportion de plasmocytes rsiduels parmi les plasmocytes totaux (> ou < 3 %), serait loutil le plus puissant permettant de discriminer les MGUS des mylomes au moment du diagnostic [88, 89] . Les lymphoplasmocytes de maladie de Waldenstrm ont galement un profil diffrent : CD19+/CD38++/CD5+/CD45+/CD56 avec une IgM monotypique [90]. La CMF peut tre galement utile dans le mylome pour quantifier lADN total par cellule et ainsi mesurer la plodie. En effet, plusieurs publications ont montr que laneuplodie existe dans 30 % 80 % des cas. Il a t suggr que lhypodiplodie est associe une plus mauvaise rponse au traitement et une courte survie, alors que lhyperdiplodie serait associe un meilleur pronostic. Dans les MGUS, lincidence de laneuplodie de lADN est moins frquente, variable de 0 % 60 % des cas, et on ne lui attribue pas une valeur pronostique dfinie [91].

Syndromes lymphoprolifratifs chroniques T


La dtermination de lappartenance la ligne T ne pose pas de difficult particulire grce la prsence de marqueurs hautement spcifiques tels que le complexe CD3/TCR. Lassociation aux autres marqueurs pan-T, le CD7, le CD2, le CD5 et dautres Ag T spcifiques dun stade de diffrenciation et dune fonction, permet une classification plus prcise des hmopathies chroniques T. Les lymphoprolifrations T envahissement leucmique, beaucoup moins frquentes que les lymphomes B, correspondent principalement aux leucmies prolymphocytaires T, aux lymphomes/leucmies de ladulte lis au virus HTLV-1, aux syndromes de Szary et aux leucmies LGL (grands lymphocytes avec granulations) et leur phnotypage est visualis sur le Tableau 9 [84, 85]. Les leucmies prolymphocytaires T sont le plus souvent des cellules T matures, CD4+, mais sont parfois CD8+ ou CD4+/ CD8+ exprimant dans ce cas le CD1a. Le syndrome de Szary est caractris par des cellules CD4+ dans presque tous les cas, qui ont perdu le dterminant T le plus prcoce de la ligne, le CD7. Toutefois, dans de rares cas, elles peuvent tre CD8+, ou CD4+/CD8+, et sont toujours associes majoritairement la perte du CD7. Les leucmies/lymphomes T lis au virus HTLV1 sont classiquement CD4+/CD25+, et peuvent tre partiellement CD7. Les leucmies chroniques LGL se subdivisent en deux sous-types : les leucmies cellules suppressives ou cytotoxiques qui correspondent lexpansion clonale de la sous-population T mature CD8+/CD57+ ; les leucmies LGL les plus graves sont celles qui correspondent aux vraies cellules tueuses naturelles (natural killer [NK]) proprement dites : les cellules du clone malin ne possdent pas les antignes de la ligne T et sont principalement CD16+/CD56+, parfois exprimant au moins en partie le CD8 et le CD57. Dans tous les cas, la perte dun marqueur pan-T ou des anomalies dexpression du CD4 et/ou du CD8 peuvent contribuer au diagnostic. Contrairement aux hmopathies B o la dtermination de la monotypie des chanes lgres permet aisment le diagnostic de malignit, le diagnostic de lymphoprolifration T ncessite souvent une recherche de clonalit par biologie molculaire.
Tableau 9. Caractristiques phnotypiques des syndromes lymphoprolifratifs chroniques T.
CD LPL-T ATL/L (HTLV-1) -/+ + + + +/+ -/+ + Syndrome Leucmie Leucmie de Szary LGL LGL (T CD8+) (NK) + + + + + +/+ +/+ +/+ + -/+ + -/+ -/+ + -/+ + +/+/+ + -/+

CD7 CD2 CD5 CD3 TCR ab TCR cd CD4 CD8 CD25 HLA-DR CD56 CD16 CD57

+ + + + + + -/+ +/+/-

Hmoglobinurie paroxystique nocturne


Lhmoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) ou maladie de Marchiafava-Micheli est lie lexpansion clonale dune ou plusieurs cellules souches hmatopotiques qui prsentent une mutation somatique acquise du gne PIG-A. Ce gne est impliqu dans la synthse du glycosyl-phosphatidylinositol ou GPI
Hmatologie

LPL-T : leucmie prolymphocytaire T ; ATL/L (HTLV-1) : leucmie/lymphome T de ladulte associ au virus HTLV-1 ; Leucmie LGL (T CD8+) : leucmie lymphocytes grandes granulations de type lymphocytes T CD8+ ; Leucmie LGL (NK) : leucmie lymphocytes grandes granulations de type cellules tueuses naturelles (natural killer) ; TCR : rcepteur T pour lantigne.

Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux 13-000-L-10

Figure 5. Exemple de diagnostic de mylome. Comme tous les plasmocytes, les cellules mylomateuses sont CD138+ et CD38+ de trs forte intensit (A). Contrairement aux quelques plasmocytes normaux rsiduels (en vert), les plasmocytes mylomateux (en rouge) sont CD19 et CD56+ (B). Les cellules mylomateuses peuvent parfois tre repres sur leur absence dexpression du CD45. Dans ce cas prcis, elles ont galement une structure particulirement complexe (C). Population CD138/CD38+, CD19 et CD56+ correspondant aux plasmocytes mylomateux : 15 % des cellules totales (che rouge).

Figure 6. Mise en vidence dun clone HPN. Le clone HPN reprsente 70 % de la population des polynuclaires neutrophiles slectionns par lexpression du CD45 et par leur structure (A). Ce clone, visualis en rouge, est caractris par une diminution de lexpression des molcules ancres par le GPI : CD55 (B), CD59 (C), CD66b (D) et CD16 (E).

qui lui-mme sert dancrage de nombreuses protines membranaires dont deux, le CD55 et le CD59, sont indispensables la protection des cellules sanguines vis--vis de la lyse par le complment. Il existe dans lHPN un dficit partiel ou total en CD55 et en CD59 la surface des globules blancs, des plaquettes et des globules rouges. La mthode historique biochimique de diagnostic de lHPN par la mesure de lactivit lytique du complment sur les globules rouges en milieu acide a t abandonne du fait de son manque de spcificit et de son intrt limit. La CMF est actuellement la seule mthode de rfrence car elle est la plus sensible et la plus spcifique. Elle utilise des anticorps reconnaissant des Ag ancrs ltat normal par le GPI la surface des cellules hmatopotiques : globules rouges, polynuclaires neutrophiles et monocytes. Le diagnostic est bas sur la dtection dune population de cellules sanguines dficitaires en au moins deux molcules ancres par le GPI. La mesure du pourcentage de cellules anormales permet de dfinir la taille du clone. Il faut que le pourcentage de cellules ngatives soit suprieur 5 % pour voquer le diagnostic [92, 93]. Les anticorps utiliss sont ceux qui reconnaissent des molcules ancres par le GPI : anticorps anti-CD55 et antiCD59 pour les globules rouges, condition que les patients
Hmatologie

naient pas reu de transfusion rcente, associs pour les monocytes avec lanti-CD14 et pour les polynuclaires neutrophiles avec lanti-CD16 et lanti-CD66b (Fig. 6). Un des intrts de la CMF pour les leucocytes de lHPN est que lvaluation des molcules ancres par le GPI nest pas modifie par les transfusions ni par la lyse cellulaire, leur dure de vie restant normale, contrairement aux globules rouges. De plus, le risque des manifestations cliniques majeures inhrentes cette maladie pourrait tre corrl avec limportance du clone des granuleux [94].

Mylodysplasies et syndromes myloprolifratifs


La CMF reste encore dun intrt limit dans ces hmopathies. Toutefois, ce sont des affections dont la frontire avec les LAM est difficile dterminer. Cest lexpression du CD34, marqueur des cellules souches, associ aux marqueurs mylodes qui permet destimer le plus prcisment le nombre de myloblastes et daider au diagnostic. De plus, le CD34 peut avoir une valeur pronostique [95].

13-000-L-10 Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux

Conclusion
Limmunophnotypage des cellules hmatopotiques anormales est utile au diagnostic, la classification, lvaluation pronostique et la dtection de la maladie rsiduelle, chez les patients suivis pour une hmopathie maligne. Plus rcemment, est apparue une nouvelle indication de la CMF : la quantification de lexpression de molcules cibles en immunothrapie, comme par exemple le CD20 et le CD52 pour les syndromes lymphoprolifratifs et le CD33 pour certaines LAM. En raison de son intrt clinique et des informations souvent dterminantes quelle apporte, la CMF a t massivement dveloppe et sest impose comme une mthode de diagnostic utilise en routine hmatologique. Un de ses dfis majeurs est la standardisation des procdures techniques [96] qui permettront lobtention dun rsultat phnotypique identique pour les mmes cellules analyses dans tous les laboratoires. De plus, grce ses perptuels progrs technologiques, la CMF reprsente un outil de choix pour avancer dans la comprhension des processus physiopathologiques en hmatologie.
.

Rfrences
[1] [2] [3] [4] Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Roederer M. Seventeen-colour ow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev 2004;4:648-55. Bernard A, Boumsell L. Human leukocyte differentiation antigens. Presse Med 1984;13:2311-6. Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization (WHO) classication of the myeloid neoplasms. Blood 2002;100:2292-302. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, et al. Proposals for the classication of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 1976;33:451-8. Borowitz MJ, Guenther KL, Shults KE, Stelzer GT. Immunophenotyping of acute leukemia by ow cytometric analysis. Use of CD45 and right-angle light scatter to gate on leukemic blasts in three-color analysis. Am J Clin Pathol 1993;100:534-40. Stelzer GT, Shults KE, Loken MR. CD45 gating for routine ow cytometric analysis of human bone marrow specimens. Ann N Y Acad Sci 1993;677:265-80. Garand R, Duchayne E, Blanchard D, Robillard N, Kuhlein E, Fenneteau O, et al. Minimally differentiated erythroleukaemia (AML M6 variant): a rare subset of AML distinct from AML M6. Groupe Francais dHematologie Cellulaire. Br J Haematol 1995;90:868-75. Matutes E, Buccheri V, Morilla R, Shetty V, Dyer M, Catovsky D. Immunological, ultrastructural and molecular features of unclassiable acute leukaemia. Recent Results Cancer Res 1993;131:41-52. Hrusak O, Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reecting genotype of acute leukemias. Leukemia 2002;16:1233-58. Porwit-MacDonald A, Janossy G, Ivory K, Swirsky D, Peters R, Wheatley K, et al. Leukemia-associated changes identied by quantitative ow cytometry. IV. CD34 overexpression in acute myelogenous leukemia M2 with t(8;21). Blood 1996;87:1162-9. Paietta E, Wiernik PH, Andersen J, Bennett J, Yunis J. Acute myeloid leukemia M4 with inv(16) (p13q22) exhibits a specic immunophenotype with CD2 expression. Blood 1993;82:2595. Orfao A, Chillon MC, Bortoluci AM, Lopez-Berges MC, GarciaSanz R, Gonzalez M, et al. The ow cytometric pattern of CD34, CD15 and CD13 expression in acute myeloblastic leukemia is highly characteristic of the presence of PML-RARalpha gene rearrangements. Haematologica 1999;84:405-12. Krasinskas AM, Wasik MA, Kamoun M, Schretzenmair R, Moore J, Salhany KE. The usefulness of CD64, other monocyte-associated antigens, and CD45 gating in the subclassication of acute myeloid leukemias with monocytic differentiation. Am J Clin Pathol 1998;110: 797-805. Cuneo A, Ferrant A, Michaux JL, Boogaerts M, Demuynck H, Van OrshovenA, et al. Cytogenetic prole of minimally differentiated (FAB M0) acute myeloid leukemia: correlation with clinicobiologic ndings. Blood 1995;85:3688-94. Vaughan WP, Civin CI, Weisenburger DD, Karp JE, Graham ML, Sanger WG, et al. Acute leukemia expressing the normal human hematopoietic stem cell membrane glycoprotein CD34 (MY10). Leukemia 1988;2:661-6.

[5]

[6] [7]

[8] [9] [10]

[11] [12]

[13]

[14]

[15]

[16] Campos L, Guyotat D, Archimbaud E, Devaux Y, Treille D, Larese A, et al. Surface marker expression in adult acute myeloid leukaemia: correlations with initial characteristics, morphology and response to therapy. Br J Haematol 1989;72:161-6. [17] Geller RB, Zahurak M, Hurwitz CA, Burke PJ, Karp JE, Piantadosi S, et al. Prognostic importance of immunophenotyping in adults with acute myelocytic leukaemia: the signicance of the stem-cell glycoprotein CD34 (My10). Br J Haematol 1990;76:340-7. [18] Di Bona E, Sartori R, Zambello R, Guercini N, Madeo D, Rodeghiero F. Prognostic signicance of CD56 antigen expression in acute myeloid leukemia. Haematologica 2002;87:250-6. [19] Bradstock K, Matthews J, Benson E, Page F, Bishop J. Prognostic value of immunophenotyping in acute myeloid leukemia. Australian Leukaemia Study Group. Blood 1994;84:1220-5. [20] Tien HF, Wang CH, Lin MT, Lee FY, Liu MC, Chuang SM, et al. Correlation of cytogenetic results with immunophenotype, genotype, clinical features, and ras mutation in acute myeloid leukemia. A study of 235 Chinese patients in Taiwan. Cancer Genet Cytogenet 1995;84: 60-8. [21] Schwarzinger I, Valent P, Koller U, Marosi C, Schneider B, Haas O, et al. Prognostic signicance of surface marker expression on blasts of patients with de novo acute myeloblastic leukemia. J Clin Oncol 1990; 8:423-30. [22] Chang H, Yeung J, Brandwein J, Yi QL. CD7 expression predicts poor disease free survival and post-remission survival in patients with acute myeloid leukemia and normal karyotype. Leuk Res 2007;31:157-62. [23] Legrand O, Perrot JY, Baudard M, Cordier A, Lautier R, Simonin G, et al. The immunophenotype of 177 adults with acute myeloid leukemia: proposal of a prognostic score. Blood 2000;96:870-7. [24] Mason KD, Juneja SK, Szer J. The immunophenotype of acute myeloid leukemia: is there a relationship with prognosis? Blood Rev 2006;20: 71-82. [25] Broxterman HJ, Sonneveld P, Pieters R, Lankelma J, Eekman CA, Loonen AH, et al. Do P-glycoprotein and major vault protein (MVP/LRP) expression correlate with in vitro daunorubicin resistance in acute myeloid leukemia? Leukemia 1999;13:258-65. [26] Kern W, Haferlach T, Schoch C, Loffler H, Gassmann W, Heinecke A, et al. Early blast clearance by remission induction therapy is a major independent prognostic factor for both achievement of complete remission and long-term outcome in acute myeloid leukemia: data from the German AML Cooperative Group (AMLCG) 1992 Trial. Blood 2003;101:64-70. [27] Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. World Health Organisation Classication of Tumours. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press; 2001. [28] Liu L, McGavran L, Lovell MA, Wei Q, Jamieson BA, Williams SA, et al. Nonpositive terminal deoxynucleotidyl transferase in pediatric precursor B-lymphoblastic leukemia. Am J Clin Pathol 2004;121: 810-5. [29] Borowitz MJ, Hunger SP, Carroll AJ, Shuster JJ, Pullen DJ, Steuber CP, et al. Predictability of the t(1;19)(q23;p13) from surface antigen phenotype: implications for screening cases of childhood acute lymphoblastic leukemia for molecular analysis: a Pediatric Oncology Group study. Blood 1993;82:1086-91. [30] Pui CH, Frankel LS, Carroll AJ, Raimondi SC, Shuster JJ, Head DR, et al. Clinical characteristics and treatment outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia with the t(4;11)(q21;q23): a collaborative study of 40 cases. Blood 1991;77:440-7. [31] Ludwig WD, Rieder H, Bartram CR, Heinze B, Schwartz S, Gassmann W, et al. Immunophenotypic and genotypic features, clinical characteristics, and treatment outcome of adult pro-B acute lymphoblastic leukemia: results of the German multicenter trials GMALL 03/87 and 04/89. Blood 1998;92:1898-909. [32] Schwartz S, Rieder H, Schlager B, Burmeister T, Fischer L, Thiel E. Expression of the human homologue of rat NG2 in adult acute lymphoblastic leukemia: close association with MLL rearrangement and a CD10(-)/CD24(-)/CD65s(+)/CD15(+) B-cell phenotype. Leukemia 2003;17:1589-95. [33] Uckun FM, Gaynon PS, Sensel MG, Nachman J, Trigg ME, Steinherz PG, et al. Clinical features and treatment outcome of childhood T-lineage acute lymphoblastic leukemia according to the apparent maturational stage of T-lineage leukemic blasts: a Childrens Cancer Group study. J Clin Oncol 1997;15:2214-21. [34] Czuczman MS, Dodge RK, Stewart CC, Frankel SR, Davey FR, Powell BL, et al. Value of immunophenotype in intensively treated adult acute lymphoblastic leukemia: cancer and leukemia Group B study 8364. Blood 1999;93:3931-9.
Hmatologie

10

Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux 13-000-L-10

[35] Uckun FM, Sather H, Gaynon P, Arthur D, Nachman J, Sensel M, et al. Prognostic signicance of the CD10+CD19+CD34+ B-progenitor immunophenotype in children with acute lymphoblastic leukemia: a report from the Childrens Cancer Group. Leuk Lymphoma 1997;27: 445-57. [36] Lenormand B, Bene MC, Lesesve JF, Bastard C, Tilly H, Lefranc MP, et al. PreB1 (CD10-) acute lymphoblastic leukemia: immunophenotypic and genomic characteristics, clinical features and outcome in 38 adults and 26 children. The Groupe dEtude Immunologique des Leucmies. Leuk Lymphoma 1998;28:329-42. [37] Consolini R, LegitimoA, Rondelli R, Guguelmi C, Barisone E, LippiA, et al. Clinical relevance of CD10 expression in childhood ALL. The Italian Association for Pediatric Hematology and Oncology (AIEOP). Haematologica 1998;83:967-73. [38] Ludwig WD, Harbott J, Bartram CR, Komischke B, Sperling C, Teichmann JV, et al. Incidence and prognostic signicance of immunophenotypic subgroups in childhood acute lymphoblastic leukemia: experience of the BFM study 86. Recent Results Cancer Res 1993;131:269-82. [39] Niehues T, Kapaun P, Harms DO, Burdach S, Kramm C, Korholz D, et al. A classication based on T cell selection-related phenotypes identies a subgroup of childhood T-ALL with favorable outcome in the COALL studies. Leukemia 1999;13:614-7. [40] Pullen J, Shuster JJ, Link M, Borowitz M, Amylon M, Carroll AJ, et al. Signicance of commonly used prognostic factors differs for children with T cell acute lymphocytic leukemia (ALL), as compared to those with B-precursor ALL. A Pediatric Oncology Group (POG) study. Leukemia 1999;13:1696-707. [41] Casasnovas RO, Slimane FK, Garand R, Faure GC, Campos L, Deneys V, et al. Immunological classication of acute myeloblastic leukemias: relevance to patient outcome. Leukemia 2003;17:515-27. [42] Bene MC, Castoldi G, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfao A, et al. Proposals for the immunological classication of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995;9:1783-6. [43] Kern W, Danhauser-Riedl S, Ratei R, Schnittger S, Schoch C, Kolb HJ, et al. Detection of minimal residual disease in unselected patients with acute myeloid leukemia using multiparameter ow cytometry for denition of leukemia-associated immunophenotypes and determination of their frequencies in normal bone marrow. Haematologica 2003;88:646-53. [44] San Miguel JF, Vidriales MB, Lopez-Berges C, Diaz-Mediavilla J, Gutierrez N, Canizo C, et al. Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia identies different patient risk groups and may contribute to postinduction treatment stratication. Blood 2001;98:1746-51. [45] Kern W, Voskova D, Schoch C, Hiddemann W, Schnittger S, Haferlach T. Determination of relapse risk based on assessment of minimal residual disease during complete remission by multiparameter ow cytometry in unselected patients with acute myeloid leukemia. Blood 2004;104:3078-85. [46] Feller N, van der Pol MA, van Stijn A, Weijers GW, Westra AH, Evertse BW, et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia 2004;18:1380-90. [47] Sievers EL, Lange BJ, Alonzo TA, Gerbing RB, Bernstein ID, Smith FO, et al. Immunophenotypic evidence of leukemia after induction therapy predicts relapse: results from a prospective Childrens Cancer Group study of 252 patients with acute myeloid leukemia. Blood 2003;101:3398-406. [48] Campana D. Determination of minimal residual disease in leukaemia patients. Br J Haematol 2003;121:823-38. [49] Campana D. Minimal residual disease studies in acute leukemia. Am J Clin Pathol 2004;122(suppl):S47-S57. [50] Campana D, Coustan-Smith E. Minimal residual disease studies by ow cytometry in acute leukemia. Acta Haematol 2004;112:8-15. [51] Borowitz MJ, Pullen DJ, Winick N, Martin PL, Bowman WP, Camitta B. Comparison of diagnostic and relapse ow cytometry phenotypes in childhood acute lymphoblastic leukemia: implications for residual disease detection: a report from the childrens oncology group. Cytometry B Clin Cytom 2005;68:18-24. [52] Gaipa G, Basso G, Maglia O, Leoni V, Faini A, Cazzaniga G, et al. Drug-induced immunophenotypic modulation in childhood ALL: implications for minimal residual disease detection. Leukemia 2005; 19:49-56.
Hmatologie

[53] Chen W, Karandikar NJ, McKenna RW, Kroft SH. Stability of leukemia-associated immunophenotypes in precursor B-lymphoblastic leukemia/lymphoma: a single institution experience. Am J Clin Pathol 2007;127:39-46. [54] Langebrake C, Brinkmann I, Teigler-Schlegel A, Creutzig U, Griesinger F, Puhlmann U, et al. Immunophenotypic differences between diagnosis and relapse in childhood AML: implications for MRD monitoring. Cytometry B Clin Cytom 2005;63:1-9. [55] Voskova D, Schoch C, Schnittger S, Hiddemann W, Haferlach T, Kern W. Stability of leukemia-associated aberrant immunophenotypes in patients with acute myeloid leukemia between diagnosis and relapse: comparison with cytomorphologic, cytogenetic, and molecular genetic ndings. Cytometry B Clin Cytom 2004;62:25-38. [56] Baer MR, Stewart CC, Dodge RK, Leget G, Sule N, Mrozek K, et al. High frequency of immunophenotype changes in acute myeloid leukemia at relapse: implications for residual disease detection (Cancer and Leukemia Group B Study 8361). Blood 2001;97:3574-80. [57] Coustan-Smith E, Sancho J, Hancock ML, Boyett JM, Behm FG, Raimondi SC, et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000;96:2691-6. [58] Dworzak MN, Froschl G, Printz D, Mann G, Potschger U, Muhlegger N, et al. Prognostic signicance and modalities of ow cytometric minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002;99:1952-8. [59] Bjorklund E, Mazur J, Soderhall S, Porwit-MacDonald A. Flow cytometric follow-up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in children with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2003;17:138-48. [60] Vidriales MB, Perez JJ, Lopez-Berges MC, Gutierrez N, Ciudad J, Lucio P, et al. Minimal residual disease in adolescent (older than 14 years) and adult acute lymphoblastic leukemias: early immunophenotypic evaluation has high clinical value. Blood 2003;101: 4695-700. [61] Krampera M, Vitale A, Vincenzi C, Perbellini O, Guarini A, Annino L, et al. Outcome prediction by immunophenotypic minimal residual disease detection in adult T-cell acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 2003;120:74-9. [62] Schultz KR, Pullen DJ, Sather HN, Shuster JJ, Devidas M, Borowitz MJ, et al. Risk- and response-based classication of childhood B-precursor acute lymphoblastic leukemia: a combined analysis of prognostic markers from the Pediatric Oncology Group (POG) and Childrens Cancer Group (CCG). Blood 2007;109:926-35. [63] San-Miguel JF, Vidriales MB, Orfao A. Immunological evaluation of minimal residual disease (MRD) in acute myeloid leukaemia (AML). Best Pract Res 2002;15:105-18. [64] Matutes E, Owusu-Ankomah K, Morilla R, Garcia Marco J, Houlihan A, Que TH, et al. The immunological prole of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia 1994;8:1640-5. [65] Moreau EJ, Matutes E, AHern RP, Morilla AM, Morilla RM, OwusuAnkomah KA, et al. Improvement of the chronic lymphocytic leukemia scoring system with the monoclonal antibody SN8 (CD79b). Am J Clin Pathol 1997;108:378-82. [66] Kampalath B, Barcos MP, Stewart C. Phenotypic heterogeneity of B cells in patients with chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma. Am J Clin Pathol 2003;119:824-32. [67] Del Giudice I, Davis Z, Matutes E, Osuji N, Parry-Jones N, Morilla A, et al. IgVH genes mutation and usage, ZAP-70 and CD38 expression provide new insights on B-cell prolymphocytic leukemia (B-PLL). Leukemia 2006;20:1231-7. [68] Delgado J, Matutes E, MorillaAM, Morilla RM, Owusu-Ankomah KA, Raq-Mohammed F, et al. Diagnostic signicance of CD20 and FMC7 expression in B-cell disorders. Am J Clin Pathol 2003;120:754-9. [69] DArena G, Musto P, Cascavilla N, DellOlio M, Di Renzo N, Perla G, et al. CD38 expression correlates with adverse biological features and predicts poor clinical outcome in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma 2001;42:109-14. [70] Schroers R, Griesinger F, Trumper L, Haase D, Kulle B, KleinHitpass L, et al. Combined analysis of ZAP-70 and CD38 expression as a predictor of disease progression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2005;19:750-8. [71] Crespo M, Bosch F, Villamor N, Bellosillo B, Colomer D, Rozman M, et al. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variableregion mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2003; 348:1764-75.

11

13-000-L-10 Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux

[72] Letestu R, Rawstron A, Ghia P, Villamor N, Leuven NB, Boettcher S, et al. Evaluation of ZAP-70 expression by ow cytometry in chronic lymphocytic leukemia: A multicentric international harmonization process. Cytometry B Clin Cytom 2006;70:309-14. [73] Le Garff-Tavernier M, Ticchioni M, Brissard M, Salmon C, Raynaud S, Davi F, et al. National standardization of ZAP-70 determination by ow cytometry: the French experience. Cytometry B Clin Cytom 2007;72: 103-8. [74] Cheson BD, Bennett JM, Grever M, Kay N, Keating MJ, OBrien S, et al. National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996;87:4990-7. [75] Rawstron AC, Villamor N, Ritgen M, Bottcher S, Ghia P, Zehnder JL, et al. International standardized approach for ow cytometric residual disease monitoring in chronic lymphocytic leukaemia. Leukemia 2007; 21:956-64. [76] Rawstron AC, Kennedy B, Evans PA, Davies FE, Richards SJ, Haynes AP, et al. Quantication of minimal disease levels in chronic lymphocytic leukemia using a sensitive ow cytometric assay improves the prediction of outcome and can be used to optimize therapy. Blood 2001;98:29-35. [77] Nguyen-Khac F, Davi F, Receveur A, Maloum K, Morel V, Le GarffTavernier M, et al. Burkitt-type acute leukemia in a patient with B-prolymphocytic leukemia: evidence for a common origin. Cancer Genet Cytogenet 2005;159:74-8. [78] Matutes E, Parry-Jones N, Brito-Babapulle V, Wotherspoon A, Morilla R, Atkinson S, et al. The leukemic presentation of mantle-cell lymphoma: disease features and prognostic factors in 58 patients. Leuk Lymphoma 2004;45:2007-15. [79] Ferrer A, Salaverria I, Bosch F, Villamor N, Rozman M, Bea S, et al. Leukemic involvement is a common feature in mantle cell lymphoma. Cancer 2007;109:2473-80. [80] Maes B, De Wolf-Peeters C. Marginal zone cell lymphoma--an update on recent advances. Histopathology 2002;40:117-26. [81] Iancu D, Hao S, Lin P, Anderson SK, Jorgensen JL, McLaughlin P, et al. Follicular lymphoma in staging bone marrow specimens: correlation of histologic ndings with the results of ow cytometry immunophenotypic analysis. Arch Pathol Lab Med 2007;131:282-7. [82] Matutes E. Immunophenotyping and differential diagnosis of hairy cell leukemia. Hematology/Oncol Clin North Am 2006;20:1051-63. [83] Konoplev S, Medeiros LJ, Bueso-Ramos CE, Jorgensen JL, Lin P. Immunophenotypic prole of lymphoplasmacytic lymphoma/ Waldenstrom macroglobulinemia. Am J Clin Pathol 2005;124:414-20. [84] Ravandi F, Kantarjian H, Jones D, Dearden C, Keating M, OBrien S. Mature T-cell leukemias. Cancer 2005;104:1808-18. [85] Foucar K. Mature T-cell leukemias including T-prolymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia/lymphoma, and Sezary syndrome. Am J Clin Pathol 2007;127:496-510. [86] San Miguel JF, Gutierrez NC, Mateo G, Orfao A. Conventional diagnostics in multiple myeloma. Eur J Cancer 2006;42:1510-9. [87] Seegmiller AC, Xu Y, McKenna RW, Karandikar NJ. Immunophenotypic differentiation between neoplastic plasma cells in mature B-cell lymphoma vs plasma cell myeloma. Am J Clin Pathol 2007;127: 176-81.

[88] Rawstron AC, Davies FE, DasGupta R, Ashcroft AJ, Patmore R, Drayson MT, et al. Flow cytometric disease monitoring in multiple myeloma: the relationship between normal and neoplastic plasma cells predicts outcome after transplantation. Blood 2002;100:3095-100. [89] San Miguel JF, Almeida J, Mateo G, Blade J, Lopez-Berges C, Caballero D, et al. Immunophenotypic evaluation of the plasma cell compartment in multiple myeloma: a tool for comparing the efficacy of different treatment strategies and predicting outcome. Blood 2002;99: 1853-6. [90] San Miguel JF, Vidriales MB, Ocio E, Mateo G, Sanchez-Guijo F, Sanchez ML, et al. Immunophenotypic analysis of Waldenstroms macroglobulinemia. Semin Oncol 2003;30:187-95. [91] Orfao A, Garcia-Sanz R, Lopez-Berges MC, Belen Vidriales M, Gonzalez M, Caballero MD, et al. A new method for the analysis of plasma cell DNA content in multiple myeloma samples using a CD38/propidium iodide double staining technique. Cytometry 1994; 17:332-9. [92] Richards SJ, Hill A, Hillmen P. Recent advances in the diagnosis, monitoring, and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry B Clin Cytom 2007;72:291-8. [93] Hernandez-Campo PM,Almeida J, Sanchez ML, Malvezzi M, OrfaoA. Normal patterns of expression of glycosylphosphatidylinositolanchored proteins on different subsets of peripheral blood cells: a frame of reference for the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry B Clin Cytom 2006;70:71-81. [94] Parker C, Omine M, Richards S, Nishimura J, Bessler M, Ware R, et al. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 2005;106:3699-709. [95] Pagnucco G, Giambanco C, Gervasi F. The role of ow cytometric immunophenotyping in myelodysplastic syndromes. Ann N Y Acad Sci 2006;1089:383-94. [96] Wood BL, Arroz M, Barnett D, DiGiuseppe J, Greig B, Kussick SJ, et al. 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia by ow cytometry: optimal reagents and reporting for the ow cytometric diagnosis of hematopoietic neoplasia. Cytometry B Clin Cytom 2007; 72(suppl1):S14-S22.

Pour en savoir plus


Lees O, Bn MC, et les membres du GEI. Immunophnotypage des leucocytes, clusters de diffrenciation humains, application la caractrisation des hmopathies. Paris: Biotem ditions; 1998. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. World Health Organisation Classication of Tumours. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press; 2001. Ronot X, Grunwald D, Mayol JF, Boutonnat J. La cytomtrie en ux. Paris: ditions Tec et Doc Lavoisier; 2006. GRIHM (Groupe de rexion sur limmunophnotypage des hmopathies malignes). Prise en charge des prlvements LLC et lymphomes matures pour une analyse en cytomtrie en ux. Fichier PDF accessible sur le site du GFHC (Groupe franais dhmatologie cellulaire) : www.hemato.org.

H. Merle-Bral, Professeur des Universits, praticien hospitalier, chef de service (helene.merle-beral@psl.aphp.fr). Service dhmatologie biologique, Pavillon Laveran, Groupe hospitalier Piti-Salptrire, 47-83, boulevard de lHpital, 75013 Paris, France. M. Le Garff-Tavernier, Assistante spcialiste (magali.legarff@psl.aphp.fr). Laboratoire dimmunochimie du Dr Musset, Groupe hospitalier Piti-Salptrire, 47-83, boulevard de lHpital, 75013 Paris, France. Toute rfrence cet article doit porter la mention : Merle-Bral H., Le Garff-Tavernier M. Immunophnotypage des hmopathies malignes par cytomtrie de ux. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Hmatologie, 13-000-L-10, 2008.

Disponibles sur www.em-consulte.com


Arbres dcisionnels Iconographies supplmentaires Vidos / Animations Documents lgaux Information au patient Informations supplmentaires Autovaluations

12

Hmatologie

13-000-A-15

Morphologie des cellules sanguines normales


F. Valensi
La pratique de ltude de la morphologie cellulaire sanguine a beaucoup volu depuis quelques annes grce aux automates modernes dhmatologie qui identient les cellules normales circulantes par une technique de cytomtrie en ux. La microscopie optique demeure cependant toujours indispensable la reconnaissance sur frottis sanguin des cellules pathologiques. Une bonne connaissance de la morphologie des lments normaux du sang, globules rouges, plaquettes et leucocytes, reste un pralable ltude de la pathologie. La pdagogie traditionnelle a galement bnci des progrs de linformatique, et de la tlmdecine, par lintroduction de supports nouveaux de communication qui constituent des outils prcieux daide la formation.
2005 Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Mots cls : Globules rouges ; Plaquettes ; Leucocytes ; Microscopie optique ; Morphologie cellulaire sanguine

Plan
Introduction Frottis Coloration Lecture Globules rouges Rticulocytes Plaquettes Polynuclaires neutrophiles Polynuclaires osinophiles Polynuclaires basophiles Monocytes Lymphocytes Conclusion 1 1 1 2 2 2 3 3 4 5 6 6 7

Place actuelle de lanalyse morphologique des frottis sanguins ? 2

Lobservation des frottis au microscope est aujourdhui rserve aux chantillons pour lesquels lautomate a engendr une alarme qualitative et a pour but didentifier les cellules pathologiques et les cellules normales mal identifies par lautomate. Dans un certain nombre de situations, les cellules pathologiques dont les caractristiques cellulaires sont proches de la normale ne dclenchent pas dalarme et ne sont donc pas dtectes. Leur recherche systmatique au microscope est alors ncessaire, condition dtre oriente par le mdecin clinicien.

Frottis
Le frottis est ralis partir de lchantillon de sang prlev sur anticoagulant pour la numration globulaire. Le frottis traditionnel manuel comporte plusieurs zones : le dbut du frottis qui est une zone paisse, le corps du frottis o se situe la zone de lecture, et les franges o les lments sont sur-tals et dforms. La rpartition des cellules nest pas homogne sur le frottis ; en effet, les cellules de grande taille se trouvent gnralement vers les bords et les franges. Plusieurs types de techniques de confection automatise dtalements sanguins avec un ajustement en fonction de lhmatocrite ont t successivement commercialiss. La technique qui sest gnralise donne un talement proche du frottis manuel avec, comme avantage, une extension de la zone de lecture.

Introduction
Les diffrentes populations de cellules sanguines, globules rouges, plaquettes, polynuclaires, monocytes et lymphocytes ont t individualises sur la base de critres morphologiques et fonctionnels. La microscopie optique sur frottis de sang color a permis de dfinir les caractristiques morphologiques principales de ces diffrentes sous-populations [1] dont la rpartition est objective par une formule leucocytaire sur 100 lments. La gnration actuelle des automates de numration donne, outre les paramtres classiques de la numration globulaire, auxquels sajoute la numration des rythroblastes circulants, une apprciation quantitative des diffrentes populations leucocytaires normales. [2] La prsence de cellules anormales ou de populations cellulaires mal identifies dclenche une alarme dite qualitative.
Hmatologie

Coloration
La coloration des frottis peut tre manuelle ou automatise. La coloration combine de May-Grnwald-Giemsa (MGG), dite coloration panoptique de Pappenheim, et celle de Wright ont succd lancienne coloration aux triacides dEhrlich modifie par Romanovski. Les colorants de ce groupe contiennent du bleu de mthylne (colorant basique) et de losine (colorant acide) en diffrentes proportions. Ils diffrent aussi par la mthode utilise pour activer le bleu de mthylne. Les structures acidophiles de la cellule seront colores en rose, rouge ou orang, les structures basophiles en bleu (bleu clair, bleu fonc, bleu violet, pourpre). Parmi ces colorants, le MGG est celui qui

13-000-A-15 Morphologie des cellules sanguines normales

donne les rsultats les plus complets avec les couleurs les plus brillantes. Lalcool utilis pour dissoudre le colorant de MayGrnwald sert, en outre, de fixateur.

Lecture
La lecture au microscope comporte une analyse de la morphologie des diffrentes populations de cellules, globules rouges, leucocytes, plaquettes, et une recherche de cellules pathologiques oriente par le contexte clinicobiologique et le type dalarme dclenche par lautomate. La formule sanguine consiste tablir un pourcentage des diffrents types de cellules sur 100 lments compts. Cette quantification na bien videmment pas la mme valeur statistique que la formule tablie par lautomate sur un grand nombre de cellules, mais son intrt rside surtout dans la dtection de cellules pathologiques et leur quantification par rapport aux cellules normales.

Place actuelle de lanalyse morphologique des frottis sanguins ?


Lutilisation du microscope pour la lecture des frottis sanguins normaux sest beaucoup rduite dans les laboratoires, au bnfice de la formule sanguine effectue par les automates. Par ailleurs, les progrs techniques rcents ont considrablement modifi les conditions de travail au microscope. En effet, depuis quelques annes, la standardisation de la confection des frottis et des colorations a facilit la lecture au microscope et rendu plus aise linterprtation en cas danomalies. Les nouvelles technologies de numrisation, de stockage et de transmission dimages microscopiques commentes, qui se prtent la constitution de bases de donnes pdagogiques et facilitent les changes et les discussions, ont galement donn lanalyse de la morphologie cellulaire plus dobjectivit et une plus grande facilit dans linterprtation. [3] Le dveloppement de supports modernes de communication a eu pour effet la diffusion de cdroms pdagogiques. [4, 5] et lapparition de sites pdagogiques accessibles sur Internet. [6] En outre, lintrt suscit par certains forums de discussion en ligne autour de la pathologie hmatologique [7] est rvlateur de lintrt persistant de la morphologie comme outil dorientation diagnostique.

Figure 1. Frottis de sang normal color au May-Grnwald-Giemsa (MGG). Grossissement 1 000. Globules rouges normaux par leur taille, leur colorabilit et leur forme. Plaquettes normales par leur taille et leur contenu en grains.

Figure 2. Htrognit macrocytes.

de

taille

(anisocytose),

prsence

de

Globules rouges
Les globules rouges (GR) sur frottis ont une forme circulaire, une taille uniforme avec un diamtre moyen de 8 m (de trs petites variations de taille ou de forme sont observes normalement), une coloration gris ros avec un centre plus clair qui se fond graduellement un anneau priphrique plus color (Fig. 1). Lobservation des globules rouges, corrle aux autres paramtres fournis par lautomate (volume globulaire moyen, concentration corpusculaire moyenne en hmoglobine, teneur corpusculaire moyenne en hmoglobine, indice de distribution des globules rouges), ainsi quau type de lalarme, est particulirement utile lors dune anmie car certaines anomalies peuvent avoir une valeur diagnostique ou aider la comprhension du mcanisme de cette anmie. Les lments danalyse principaux sont la taille, la colorabilit et la forme, complts par la recherche dinclusions intrarythrocytaires (Fig. 212). La prsence dagglutinats de globules rouges ou du phnomne des rouleaux donnent des indications supplmentaires. La dure de sjour des globules rouges dans le sang est de 120 jours en moyenne et le temps de transit mdullaire des rythroblastes est de 5/6 jours.

Figure 3. Htrognit de taille (anisocytose) lie la prsence dhmaties polychromatophiles (rticulocytes).

Rticulocytes
Il sagit de jeunes globules rouges dont la quantification est ncessaire la comprhension du mcanisme dune anmie

et permettra den apprcier le caractre rgnratif ou non. Le rticulocyte est issu dun rythroblaste acidophile qui vient dexpulser son noyau. Il reste 1 2 jours dans la moelle, puis circule 1 2 jours dans le sang avant de devenir un globule rouge mr. Il se distingue de celui-ci par la persistance de diverses organelles, en particulier de lacide ribonuclique (ARN) ribosomique qui nest pas visible au MGG. Certains colorants,
Hmatologie

Morphologie des cellules sanguines normales 13-000-A-15

Figure 4.

Hmaties hypochromes dans le cadre dune carence martiale.

Figure 5.

Hmaties en cible (syndrome thalassmique).

Figure 7. A. Globules rouges de forme ovale. Ovalocytose (ou elliptocytose) constitutionnelle. B. Les hmaties perdent leur forme ovale lextrmit du frottis.

Plaquettes
Elles se prsentent sous la forme dlments arrondis de petite taille, de 1 2 m de diamtre, contours irrguliers, de coloration gris clair, parsems de fines granulations roses (Fig. 1,14). La prsence de quelques plaquettes de taille plus grande (7 m de diamtre) nest pas exceptionnelle, celles-ci correspondent de jeunes plaquettes. Sur un frottis prlev au bout du doigt (sans anticoagulant) les plaquettes ont tendance former des agrgats. Lobservation des plaquettes sur lame a pour but, dune part, la recherche dagrgats sur frottis de sang prlev sur anticoagulant pour dtecter les fausses thrombopnies induites par les anticoagulants et, dautre part, lanalyse de la taille et des anomalies des grains, en particulier la prsence de macroplaquettes, qui ne sont pas toujours comptabilises par les automates. Lobservation des plaquettes au microscope, confronte au taux des plaquettes, au volume plaquettaire moyen (VMP) la courbe de la distribution des plaquettes ainsi quau type de lalarme dclenche par lautomate, permet la dtection ventuelle de thrombopathies constitutionnelles ou acquises (Fig. 1518). La dure de sjour des plaquettes dans le sang est de 8 10 jours et le temps de transit mdullaire des mgacaryocytes est de 8 jours.

Figure 6. Anisocytose, hypochromie et anomalies de forme (pokilocytose) des globules rouges (syndrome thalassmique).

tels le bleu de crsyl brillant ou le bleu de mthylne nouveau, en se fixant sur lARN, forment un prcipit daspect rticul, visible au microscope (Fig. 13). Lors dune hyper-rticulocytose, il est possible, sur un frottis color au MGG, de reprer certains rticulocytes en raison de leur coloration polychromatophile. Aujourdhui, la quantification automatise des rticulocytes sest gnralise et elle peut saccompagner, selon lautomate utilis, de la mesure de la fraction immature des rticulocytes et de ses caractristiques.
Hmatologie

Polynuclaires neutrophiles
Ce sont des cellules arrondies de 12 14 m de diamtre, caractrises par la forme plurilobe de leur noyau (3 5 lobes). Les lobes sont runis par de fins filaments de substance nuclaire qui ne sont pas toujours visibles si les lobes sont

13-000-A-15 Morphologie des cellules sanguines normales

Figure 9. Hmaties fragmentes ou schizocytes au cours dun syndrome hmolytique et urmique de lenfant (SHU).

Figure 10. Ces expansions bords arrondis du contour nuclaire caractrisent les acanthocytes (insuffisance hpatocellulaire).

Figure 8. A. Les sphrocytes apparaissent sur frottis de taille plus petite que des globules rouges normaux, leur coloration est plus fonce et ils ne prsentent pas de halo clair central. Sphrocytose constitutionnelle. B. Sphrocytes et hmaties polychromatophiles. Anmie hmolytique auto-immune. C. Frottis de sang normal. En queue de frottis, les globules rouges perdent le halo clair central.

un peu moins dense et par la segmentation du noyau qui est incomplte. Le noyau est dj incurv et prsente une bauche de lobes spars par dassez larges ponts chromatiniens (Fig. 20). Dans un sang normal, il existe environ 5 % de band cells qui sont assimils aux polynuclaires dans le dcompte de la formule leucocytaire. Dans certains pays, les polynuclaires non segments apparaissent dans la formule sanguine, ils sont dailleurs individualiss par les automates, et llvation de leur pourcentage tmoigne dun syndrome infectieux ou inflammatoire. Lobservation danomalies nuclaires et cytoplasmiques des polynuclaires peut tre rvlatrice daffections constitutionnelles ou acquises (Fig. 2125). La dure de sjour dans le sang des polynuclaires neutrophiles est de 2 jours avant leur passage tissulaire. Le temps de transit mdullaire des prcurseurs granuleux est de 10 14 jours. Il existe un compartiment de rserve mdullaire des polynuclaires neutrophiles.

partiellement superposs. La chromatine est dense, forme de masses sombres spares par de petites bandes plus claires. Le cytoplasme contient dassez nombreuses granulations assez fines, beige ros, qui correspondent aux granulations spcifiques neutrophiles. Les granulations azurophiles ont, ce stade de maturation, modifi leur affinit tinctoriale et ne sont presque plus visibles en optique (Fig. 19). Les band cells ou jeunes polynuclaires noyau non segment, diffrent des prcdents par leur chromatine qui est

Polynuclaires osinophiles
Ce sont des cellules de 12 14 m de diamtre caractrises par un noyau bilob et surtout par laspect des granulations qui sont sphriques (0,5 1,5 m de diamtre), rfringentes, de
Hmatologie

Morphologie des cellules sanguines normales 13-000-A-15

Figure 11. A. Les drpanocytes sont des globules rouges allongs aux extrmits effiles, lgrement incurvs. Drpanocytose homozygote (Hb S/S). B. La prsence de corps de Jolly intrarythrocytaires au cours dune drpanocytose est le tmoin dune asplnie fonctionnelle.

Figure 12. (A, B).

La prsence dhmaties en larmes ou dacryocytes, associes une rythromylmie fait suspecter lexistence dune brose mdullaire

Figure 13. Rticulocytes. La coloration au bleu de crsyl met en vidence lacide ribonuclique (ARN) contenu dans les rticulocytes. Anmie hmolytique.

Figure 14. Anisocytose plaquettaire au cours dune hyperplaquettose ractionnelle.

coloration orange et assez nombreuses lintrieur du cytoplasme (Fig. 26). Ltude ultrastructurale montre que les grains osinophiles les plus mrs contiennent un cristal central, non visible en optique. Leur dure de sjour dans le sang est 12 24 heures avant leur passage tissulaire et le temps de transit mdullaire est comparable celui du polynuclaire neutrophile.
Hmatologie

Polynuclaires basophiles
Ce sont des cellules de 10 14 m de diamtre. Leur noyau bilob est masqu par des granulations spcifiques qui sont assez nombreuses et disperses sur toute la cellule. Elles sont arrondies (0,2 1 m de diamtre) ou plus souvent angulaires, de coloration pourpre (Fig. 27).

13-000-A-15 Morphologie des cellules sanguines normales

Figure 15.

Plaquettes de petite taille. Syndrome de Wiskott-Aldrich.

Figure 17. Htrognit de taille des plaquettes et du contenu en granulations. Syndrome des plaquettes grises par dcit en granules alpha.

Figure 18. Plaquettes de grande taille et partiellement dgranules au cours dune leucmie mylode.

Figure 16. A. Plaquettes de grande taille, contenu en granulations normal. B. Lassociation de grandes plaquettes normalement granuleuses et dinclusions dans les polynuclaires est vocatrice du syndrome de MayHegglin.

Leur dure de sjour dans le sang est de 12 24 heures, sans passage tissulaire connu, le temps de transit mdullaire serait identique celui du polynuclaire neutrophile.

nombreuses qui se fondent souvent avec le fond cytoplasmique. Il nest pas rare dobserver des vacuoles intracytoplasmiques (Fig. 28). Ce sont les monocytes qui posent le plus de problmes didentification sur les frottis, en raison de la variabilit de forme et daspect que ces cellules prsentent et de leur aptitude se dformer. De plus, leur taux est souvent sous-estim lors dune formule au microscope en raison de leur tendance, vu leur taille, se rpartir sur les franges ou la queue du frottis. Pour toutes ces raisons, de nombreuses discordances ont t observes dans cette catgorie de cellules lorsque lon est pass des formules leucocytaires au microscope aux formules automatises. Au cours des monocytoses ractionnelles (0,5 1,5 109 l1) lors dun syndrome infectieux ou dune rgnration mdullaire, on observe sur les frottis des cellules monocytaires plus jeunes avec un cytoplasme un peu plus basophile et un noyau moins rgulier (Fig. 29). La dure de sjour des monocytes dans le sang est de 2 jours avant leur passage tissulaire et le temps de transit mdullaire de 1 2 jours. Il ny a pas de compartiment de rserve mdullaire.

Lymphocytes
Bien quil existe diffrents types morphologiques de lymphocytes (Fig. 30), les tentatives de les sparer en catgories distinctes nont pas dbouch sur une classification significative sur le plan fonctionnel. On continue nanmoins les sparer en deux groupes de taille diffrente : les lymphocytes de petite taille (7 9 m de diamtre) ont un noyau arrondi ou ovalaire, parfois rniforme. La chromatine est dense, de couleur violet fonc, compose de masses
Hmatologie

Monocytes
Ce sont de grandes cellules de taille variable (20 40 m de diamtre). Leur noyau est arrondi ou ovalaire, plus souvent rniforme ou franchement irrgulier, la chromatine est peu dense, non motte, et de structure rgulire. Le cytoplasme est tendu, gris bleut, avec de fines granulations roses assez

Morphologie des cellules sanguines normales 13-000-A-15

Figure 20.

Polynuclaire noyau non segment ou band-cell.

Figure 21. Polynuclaire grains nombreux et visibles (grains toxiques ) au cours dune infection bactrienne.

Figure 19. A et B. polynuclaires neutrophiles normaux. C. Corpuscule de Barr : petit appendice nuclaire sur un polynuclaire neutrophile normal. Il correspond un chromosome X.

chromatiniennes sombres plus ou moins nettes. Le cytoplasme est peu tendu, il stend le plus souvent dun seul ct du noyau, il est clair ou lgrement basophile ; les lymphocytes de taille plus grande (9 15 m de diamtre) ont un noyau central ou lgrement excentr de couleur violet fonc avec des masses chromatiniennes disposes en blocs compacts entrecoups de zones claires mais sans dmarcations nettes. Le cytoplasme est plus tendu que celui des petits lymphocytes, il entoure compltement le noyau, il est clair, hyalin ou lgrement basophile. Un petit nombre dentre eux ont des grains intracytoplasmiques (3 5 granulations de coloration violace de 0,3 0,6 m de diamtre, parfois contenues dans de petites vacuoles). Cette htrognit morphologique nest que relative compare la diversit de leur origine, de leur fonction et de leur
Hmatologie

dure de vie. Des tentatives pour corrler laspect morphologique au caractre fonctionnel T ou B nont pas abouti, hormis pour la catgorie minoritaire de lymphocytes grains cytoplasmiques ou large granular lymphocytes (LGL) qui correspondent sur le plan fonctionnel deux types de population : des lymphocytes T cytotoxiques en majorit et des cellules activit NK ( natural killer ) (Fig. 31). Au cours des lymphocytoses ractionnelles dorigine virale, les modifications morphologiques des lymphocytes, bien que non spcifiques, sont assez caractristiques par lassociation de lymphocytes grains cytoplasme plus ou moins basophile des cellules lymphodes de taille plus grande cytoplasme trs basophile ainsi que de rares plasmocytes (Fig. 32). Parmi les pathologies impliquant la ligne lymphode, la plus frquente chez ladulte est la leucmie lymphode chronique (LLC). Dautres pathologies des cellules lymphodes B, T ou NK, quelles soient aigus ou chroniques, peuvent se manifester avec des cellules circulantes. Dans ce type de situations, lanalyse morphologique doit imprativement tre complte par une tude de limmunophnotype des cellules afin de caractriser la maladie.

Conclusion
Malgr les performances actuelles des automates qui identifient les populations normales et signalent les caractristiques de cellules non identifies, la reconnaissance des cellules pathologiques au microscope reste une tape indispensable pour un rendu optimal de lhmogramme. Le travail dinterprtation au microscope, facilit par la standardisation de la confection des frottis et des colorations, a surtout bnfici des progrs de linformatique et de la tlpathologie qui ont permis le dveloppement de nouveaux outils pdagogiques.

13-000-A-15 Morphologie des cellules sanguines normales

Figure 23. Polynuclaire neutrophile noyau hypersegment au cours dune anmie mgaloblastique.

Figure 24. Polynuclaires neutrophiles noyau hyposegment et granulations cytoplasmiques trs peu visibles (leucmie mylode).

Figure 22. Granuleux immatures circulants ou mylmie A. Mtamylocyte. B. Mylocyte. C. Promylocyte.

Figure 25. Anomalies des granulations dans un polynuclaire neutrophile de maladie de Chediak-Higashi.

Hmatologie

Morphologie des cellules sanguines normales 13-000-A-15

Figure 26. A. Polynuclaire osinophile normal. B. Polynuclaires osinophiles noyau polylob au cours dune hyperosinophilie ractionnelle.

Figure 27. A et B. Polynuclaire basophile normal. C. Polynuclaire basophile dans un sang de leucmie mylode chronique : les granulations sont parfois moins nombreuses et moins volumineuses.

Hmatologie

13-000-A-15 Morphologie des cellules sanguines normales

Figure 28.

Monocytes normaux (A, B, C).

Figure 29. Promonocyte, jeune monocyte au cours dune monocytose ractionnelle.

10

Hmatologie

Morphologie des cellules sanguines normales 13-000-A-15

Figure 30.

Lymphocytes normaux (A, B, C).

Figure 31.

Lymphocyte normal grains.

Hmatologie

11

13-000-A-15 Morphologie des cellules sanguines normales

Figure 32. Cellules lymphodes cytoplasme basophile au cours dune lymphocytose ractionnelle dorigine virale (A, B, C, D).

Rfrences
[1] [2] Hoffbrand AV, Pettit JE. Normal haematopoiesis and blood cells. Sandoz Atlas of Clinical Haematology. St Louis: Mosby-Wolfe; 1994. Van den Bossche J, Devreese K, Malfait R, Van de Vyvere M, Wauters A, Neels H, et al. Reference intervals for a complete blood count determined on different automated haematology analysers: Abx Pentra 120 Retic, Coulter Gen-S, Sysmex SE 9500, Abbott Cell Dyn 4000 and Bayer Advia 120. Clin Chem Lab Med 2002;40:69-73.

[3] [4] [5] [6] [7]

Flandrin G, Benattar L. Tlpathologie, avantages et perspectives, contraintes et limites. Exemple de lhmatologie. Feuillets Biol 2001; XXXXII:5-9. Goasguen JE. Cytologie sanguine et mdullaire normale. CD-ROM Universit de Rennes I. Tribvn (info@tribvn.com) 1999. Fenneteau O. Anmies, Anomalies rythrocytaires. CD-ROM Tutorial on Hematopathology. Tribvn (info@tribvn.com) 2003. http://www.med-univ-angers.fr. http://teleslide.crihan.fr.

F. Valensi (francoise.valensi@nck.ap-hop-paris.fr). Laboratoire dhmatologie, hpital Necker-Enfants Malades, 149-161, rue de Svres, 75743 Paris cedex 15, France.

Disponibles sur www.emc-consulte.com


Arbres dcisionnels Iconographies supplmentaires Vidos / Animations Documents lgaux Information au patient Informations supplmentaires Autovaluations

12

Hmatologie

Encyclopdie Mdico-Chirurgicale 13-000-M-53

13-000-M-53

Systme HLA
JD Bignon

Rsum. Le complexe majeur dhistocompatibilit de lhomme occupe une rgion de 4 5 mgabases (Mb) sur le bras court du chromosome 6, la plus tudie du gnome humain. Cette rgion fut initialement dcouverte en raison de son inuence dans le rejet de greffe et les rponses immunes certains antignes. Les gnes les plus importants impliqus dans ces fonctions codent des molcules dites human leucocyte antigens (HLA) qui sont extrmement polymorphes dans les populations humaines. Le typage HLA de cette diversit structurale est largement utilis en mdecine pour la slection des donneurs et receveurs dorganes ou de moelle, et dans lvaluation du risque vis--vis de certaines maladies telles que la spondylarthrite ankylosante, les maladies auto-immunes, la narcolepsie, la maladie cliaque En effet, les molcules HLA prsentent au systme immunitaire des peptides antigniques drivs de protines intracellulaires (rle des molcules HLA de classe I) ou de protines externes endocytoses (rle des molcules HLA de classe II). Dans les deux cas, cest le complexe peptide-CMH qui reprsente llment reconnu par le rcepteur lantigne des lymphocytes T. De plus, certaines molcules HLA de classe I rgulent la rponse des cellules natural killers , intervenant en particulier dans la surveillance antitumorale.
2000 Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Mots-cls : HLA, polymorphisme, transplantation, prsentation dantigne, lymphocyte T, surveillance antitumorale, cellules NK.

Introduction
Le systme immunogntique human leucocyte antigen (HLA) fait partie dun ensemble gntique complexe, not complexe majeur dhistocompatibilit (CMH), localis chez lhomme sur le bras court du chromosome 6 (bande 6p21.3). La reconnaissance des premires molcules HLA partir de 1952 par Dausset, prix Nobel de mdecine en 1980, reprsente le point de dpart dune extraordinaire pope scientique et mdicale. Ce systme HLA joue, par le biais de nombreuses molcules, un rle capital dans la rponse immune. La diversit structurale, ou polymorphisme, de ces nombreuses molcules et leur spcialisation expliquent la diversit fonctionnelle observe et donc les implications cliniques varies de ce systme HLA [44]. Celui-ci contribue largement la diffrenciation du soi et du non-soi, do son rle en transplantation dorganes et en greffe de moelle, mais aussi dans le dveloppement dune rponse des lments peptidiques (trangers ou autologues) immunognes, et ce dans certaines circonstances. Cest ainsi que les molcules HLA, selon diffrents mcanismes, jouent un rle quelquefois prpondrant de facteur gntique de susceptibilit ou de rsistance de nombreuses maladies. Enn, il apparat plus rcemment que ces molcules HLA jouent aussi un rle dans limmunosurveillance antitumorale [27]. Au plan mthodologique, les techniques danalyse de la diversit HLA et des rponses humorales ou cellulaires ces molcules HLA atteignent des degrs de rsolution et de sensibilit extrmes en utilisant les outils les plus modernes de la biologie. Les donnes obtenues clairent toujours plus le rle immunologique majeur de ce systme HLA, dont lquivalent est retrouv chez tous les vertbrs.

Gnralits sur le systme HLA


HISTORIQUE

Ds 1954, la technique, peu sensible, de leucoagglutination sur lame, a permis Dausset la mise en vidence dun nouveau systme antigne-anticorps de groupes sanguins (groupe leucocytaire). La publication du premier antigne, dsign MAC [21], de ce nouveau systme fut suivie de lidentication de nombreux autres antignes par une nouvelle technique srologique appele la lymphocytotoxicit (LCT) complment-dpendante (1964) [ 6 3 ] . La comprhension de la gntique de ce systme complexe, comprenant plusieurs sries allliques (notamment HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP) ranges en deux classes principales (classe I et classe II), fut le travail de 30 ans defforts collaboratifs internationaux (workshopsHLA) depuis 1965. partir du milieu des annes 1980, lavnement et la matrise progressive des techniques de biologie molculaire du gne, ainsi que la parfaite dnition des structures molculaires ont permis une meilleure comprhension fonctionnelle de ce systme.
CARTOGRAPHIE

Jean-Denis Bignon : Pharmacien biologiste, docteur s-sciences, chef de service, ETS Pays-de-la-Loire, site de Nantes, 34, boulevard Jean-Monnet, 44011 Nantes cedex 1, France.

Les premires cartes chromosomiques du CMH de lhomme ont bnci des travaux faits chez la souris (systme H-2), de lobservation de familles informatives avec recombinaisons chromosomiques, dtude de populations, de techniques de cultures de cellules de mammifres (technique des hybrides cellulaires somatiques). Ainsi furent prcises les notions gntiques essentielles propres ce systme : localisation sur le bras court du chromosome 6 chez lhomme (bande 6p21.3), et ordre des principaux gnes HLA du tlomre vers le centromre (HLA-A,-C, -B, -DR, -DQ et -DP) [19]. Les mthodes plus nes de la biologie molculaire moderne ont conduit des cartes toujours plus dtailles de cette rgion de 4 000 kb correspondant au CMH de lhomme (g 1) [57].

Toute rfrence cet article doit porter la mention : Bignon JD. Systme HLA. Encycl Md Chir (Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS, Paris, tous droits rservs), Hmatologie, 13-000-M-53, 2000, 16 p.

13-000-M-53

Systme HLA
Chromosome 6 humain q. p.

Hmatologie

Extrmit centromrique Classe II


DP DQ

Extrmit tlomrique Classe I BCEA 3 800 kbp Classe I C E A H GF

* DR
DQ

Classe III
21.0H / C4 / Bf / C2

Tableau I. Nomenclature des antignes human leucocyte antigens (1996). Ces antignes sont dnis par des techniques srologiques (sries A, B, C, DR, DQ) ou cellulaires (srie DP).
Sries classe I
A A1 A2 B5 B7 B703 B8 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B21 B22 B27 B2708 B35 B37 B38(16) B39(16) B3901 B3902 B40 B4005 B41 B42 B44(12) B45(12) B46 B47 B48 B B49(21) B50(21) B51(5) B5102 B5103 B52(5) B53 B54(22) B55(22) B56(22) B57(17) B58(17) B59 B60(40) B61(40) B62(15) B63(15) B64(14) B65(14) B67 B70 B71(70) B72(70) B73 B75(15) B76(15) B77(15) B78 B81 Bw4 Bw6 DR53 DR52 DR51 C Cw1 Cw2 Cw3 Cw4 Cw5 Cw6 Cw7 Cw8 Cw9(w3) Cw10(w3) DR DR1 DR103 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 DR7 DR8 DR9 DR10 DR11(5) DR12(5) DR13(6) DR14(6) DR1403 DR1404 DR15(2) DR16(2) DR17(3) DR18(3)

*
B

Srie classe II
DG DQ1 DQ2 DQ3 DQ4 DQ5(1) DQ6(1) DQ7(3) DQ8(3) DQ9(3) DP DPw1 DPw2 DPw3 DPw4 DPw5 DPw6

1 000 Classe II
DP DOA DOB DQ DR

2 000

B2 A2 B1 A1

TAP1, 2 LMP2, 7 B1A1B1 B2 DMA, B

B3/4/5 A

A203

500

1 000

2 000

3 800
7 : Heat Shock Protein (HSP) 8 : Tumor Necrosis Factor 9 : Tumor Necrosis Factor 10 : MICB gnes HLA 11 : MICA apparents classe I

1 : Cytochrome P-21 hydroxylase 2 : Complment C4B 3 : Pseudogne 4 : Complment C4A 5 : Facteur B du complment 6 : Complment C2

Classe III
1 2 3 4 567 8 9 10 11

A210 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9)

1 000 Gne exprim

2 000 Pseudogne (gne non exprim)

Carte physique de la rgion chromosomique HLA.

Schmatiquement, ce CMH comporte trois rgions riches en gnes. Celles-ci sont notes, du tlomre vers le centromre, rgion de classe I (abritant notamment les gnes HLA dits classiques de classe I : HLA-A, -B et -C) stirant sur quelque 2 000 kb ; rgion de classe III (abritant des gnes apparents ou non HLA, mais dont un grand nombre est impliqu dans la rponse immune, tels les gnes codant certaines protines du complment C2, C4, Bf, ou certaines cytokines) couvrant une longueur de 1 000 kb ; enn, la rgion de classe II (abritant des gnes DR, DQ et DP) sur une longueur de 1 000 kb. La premire squence complte et la carte gnique du CMH de lhomme ont t rcemment publies (1999). Au total, 224 gnes ont t identis, mais seulement 128 seraient exprims. Une fonction immunitaire est attribue 40 % de ces gnes exprims [46].

A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36

NOMENCLATURE

A43 A66(10) A68(28) A69(28) A74(19) A80

Devant laccumulation des donnes et en raison de la diversit (polymorphisme) de ce systme, un comit de nomenclature internationale dnit rgulirement des rgles strictes dcriture. Celles-ci permettent de rfrencer clairement les rgions gniques (loci), les allles (ou gnes), les produits (ou antignes) HLA propres ce CMH. Des quivalences avec danciennes dsignations sont galement prcises [10]. Dune faon gnrale, chaque spcicit molculaire HLA est dsigne par une lettre prcisant le locus auquel elle appartient (HLA-A pour locus A) suivie par son numro spcique (par exemple HLA-A2, HLA-B27). Pour le locus C, et an dviter toute ambigut avec les protines du complment, la lettre w (pour workshop) est accole C (par exemple HLA-Cw2). Il est galement encore dusage de mentionner, pour certains antignes, la spcicit large (broad) laquelle elle appartient srologiquement. Ainsi, les deux spcicits antigniques A25 et A26 furent officiellement reconnues en 1972 comme une subdivision de la spcicit broad A10, identie depuis 1970. Cette information est alors prcise de la faon suivante : A25(10) ou A26(10). Ceci est le cas de nombreuses autres spcicits chaque locus. On distingue la nomenclature des antignes (dnis par srologie et/ou technique cellulaire), qui rpond aux rgles ci-dessus, de celle des gnes (allles) codant ces produits antigniques. Dans cette dernire, un allle est rfrenc par le locus auquel il appartient suivi dun astrisque (*), puis de deux chiffres (incluant le 0 quand ncessaire), pour dsigner la spcicit alllique (par exemple HLA-A*03, HLAB*35). Ces deux premiers chiffres sont identiques, sauf rares exceptions, la spcicit antignique correspondante. Enn, pour prciser encore le variant alllique dun allle donn, deux chiffres supplmentaires sont utiliss (par exemple HLA-B*2705) (tableaux I, II).
2

PARTICULARITS DE CE SYSTME

Plusieurs caractristiques rendent ce systme de groupes remarquable. La diversit (ou polymorphisme) qui porte sur le nombre de sries (ou locus) et pour chaque srie sur le nombre de marqueurs spciques est la plus exemplaire. Ainsi, au minimum, six sries allliques HLA (-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP) et 800 marqueurs sont individualiss, qui pourraient conduire rendre unique, en thorie et en dehors des situations familiales, chaque tre humain. Chaque individu hritant, chaque srie, de deux gnes (lun du pre, lautre de la mre), le nombre de combinaisons possibles dpasse les 10 milliards ! La ralit est quelque peu diffrente. Ainsi, dans une population gographique donne, les frquences des marqueurs HLA peuvent tre trs variables. Chez les Caucasodes, le gne HLA-A*02 est prsent chez environ 21,5 % des sujets de la population, contre seulement 0,8 % pour le gne HLAA*34 dans cette mme population. Dautre part, pour un mme gne HLA-A*11, par exemple, la frquence varie de plus de 30 % en Thalande moins de 0,5 % chez les sujets noirs dAfrique. Un autre point caractristique est li la proximit de ces loci dans une mme

Hmatologie

Systme HLA

13-000-M-53

Tableau II. Correspondance des nomenclatures dallles et dantignes HLA-A et B. Quelques exemples.
HLA
Allles A*0101 A*0102 A*0201 A*0202 A*0203 A*0204 A*0205 A*0206 A*0207 A*0208 A*0209 A*0210 A*0211 A*0212 A*0213 A*0214 A*0215N A1 A1 A2 A2 A203 A2 A2 A2 A2 A2 A210 A2 A2 A2 A2 A2 A Blank Antignes Allles B*1502 B*1503 B*1504 B*1505 B*1506 B*1507 B*1508 B*1509 B*1510 B*1511 B*1512 B*1513 B*1514 B*1515 B*1516 B*1517 B*1518 Antignes B75(15) B72(70) B62(15) B62(15) B62(15) B62(15) B62(15) B70 B71(70) B15 B76(15) B77(15) B76(15) B62(15) B63(15) B63(15) B71(70)

Tableau III. Frquences gniques des principales spcicits HLA-A, -B et -DR observes en France (256 sujets typs par technique srologique pour HLA-A et -B et par technique dacide dsoxyribonuclique [ADN] pour HLA-DRB1).
Locus A
Spcicit A1 A2 A3 A11 A23 A24 A25 A26 A29 A30 A31 A32 A33 A34 A66 A68 A74 A80 Frquence gnique (%) 13,62 25,00 15,45 5,21 2,97 10,95 2,17 3,78 5,63 3,38 2,17 2,97 0,78 0,20 0,59 4,39 0,20 0,20

Locus B
Spcicit B7 B8 B13 B64 B65 B62 B63 B18 B27 B35 B37 B38 B39 B60 B61 B41 B44 B45 B47 B49 B50 B51 B52 B55 B56 B57 B58 B72 Frquence gnique (%) 13,17 8,57 1,77 1,18 3,38 5,42 0,98 8,14 3,99 6,88 0,78 0,78 2,37 2,57 2,37 0,59 15,68 0,2 0,2 3,99 1,77 7,51 0,59 1,97 0,59 2,57 0,59 0,2

Locus DRB1
Spcicit DRB1*0103 DRB1*01 DRB1*15 DRB1*16 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*11 DRB1*12 DRB1*13 DRB1*14 DRB1*07 DRB1*08 DRB1*09 DRB1*10 Frquence gnique (%) 1,57 8,57 12,95 2,37 11,39 12,50 14,08 1,57 13,62 3,38 12,05 3,18 1,57 0,59

rgion chromosomique de 4 Mb (4 000 kb). Ce fragment chromosomique, haplotype, est transmis en bloc la descendance. Chaque individu se caractrise ainsi par deux haplotypes HLA, provenant lun du pre et lautre de la mre. Ces deux haplotypes dnissent le gnotype de lindividu. Exemple de gnotype (A, B, DR, DQ) et convention dcriture : HLA-A2, B44, DR1, DQ5/A30, B44, DR4, DQ7 ou encore :
A2 - B44 - DR1 - DQ5 = (haplotype a) = a (haplotype b) b A30 - B44 - DR4 - DQ7

Lexpression codominante de tous ces gnes permet lidentication des molcules correspondantes et ltablissement dun groupage HLA ou phnotype HLA, not ainsi : HLA-A2, 30 ; B44 ; DR1, 4 ; DQ5, 7 Ce phnotype fait apparatre une htrozygotie aux loci A, DR et DQ et une homozygotie B44 au locus B, puisquune seule spcicit est identie. Seule ltude familiale et le gnotype qui en est dduit permettent daffirmer cette homozygotie. La transmission en bloc des haplotypes connat de rares exceptions dues, lors des mioses, des recombinaisons chromosomiques ou crossing-over entre loci, de frquences variables mais dautant plus leves que les loci concerns sont loigns. La frquence de cette recombinaison entre les deux chromosomes 6 (du pre ou de la mre) est de lordre de 0,8 % entre les loci HLA-A et -B et conduit lapparition dun nouvel haplotype dit recombinant . Ce taux de recombinants observs a longtemps reprsent une unit de mesure de distance gnique (exprime en centimorgans [cM]) entre loci. Enn, une dernire particularit gntique de ce systme, due plusieurs causes possibles (effet fondateur, slection au cours de pandmies), se traduit par la surabondance de certaines combinaisons dallles de plusieurs loci conduisant lenrichissement dun haplotype donn dans une population. Ainsi, lhaplotype A1-B8 est observ dans les populations europennes de lOuest avec une frquence de 0,0672, alors que le calcul thorique, prenant en compte les frquences de ces deux allles, donne une valeur attendue de 0,0136, correspondant au produit des frquences A1 et B8 (A1 = 0,142 B8 = 0,096). La diffrence (ou D) est appele

dsquilibre de liaison (linkage). Le tableau III indique les frquences gniques des principales spcicits des trois sries HLA-A, -B et -DR observes en France, et les tableaux IV et V rapportent pour quelques spcicits les frquences gniques dans trois populations ethniquement diffrentes, ainsi que les haplotypes les plus reprsents en France. Ces frquences (gniques et haplotypiques) varient selon les groupes ethniques considrs et sont rgulirement rvalues dans le cadre dtudes collaboratives internationales (workshop-HLA). Le plus souvent, le dsquilibre de liaison est positif, avec un excdent dhaplotypes observs. Il peut tre ngatif lorsque lhaplotype considr et observ est en dfaut par rapport au calcul thorique. Ces dsquilibres de liaison peuvent porter sur lhaplotype complet, entre deux loci extrmes comme HLA-A et -DP. Dans la partie Ouest de la France, lhaplotype associant A29, B44(12), DR7, DQ2 et DP11 en constitue un exemple [6].
TRANSMISSION GNTIQUE

Les gnes HLA sont donc transmis gntiquement en bloc, par haplotypes entiers, des parents aux enfants. Chacun de ces gnes est autosomique dominant. Dans un couple, les deux haplotypes
3

13-000-M-53

Systme HLA
classe I classe II

Hmatologie

Tableau IV. Exemples de frquences gniques (HLA-A, -B, -DR) observes dans trois groupes ethniques diffrents (daprs J Hors in : Dausset J, PLA M eds. HLA complexe majeur dhistocompatibilit de lhomme. Mdecine-Sciences Flammarion, 1989).
Frquence gnique (%) Spcicit
Caucasodes A1 A2 A3 A11 A34 B7 B8 B27 B44 B58 B61 DR1 DR2 DR3 DR4 DR7 14,2 28,9 13,2 6,3 0,1 11,5 9,6 3,4 12,3 1,8 2,1 9,5 15,8 12,0 12,7 12,0 Orientaux 1,0 28,1 1,5 11,7 0,3 4,7 0,2 1,6 6,0 2,5 11,7 5,0 15,1 1,8 21,8 2,9 Ngrodes 8,1 17,5 6,7 1,9 5,1 12,1 5,5 1,9 7,7 10,9 1,5 5,1 15,1 14,9 7,6 13,2

=2

=1 =1

=3

>2m =2

Structure schmatique des molcules HLA de classe de (B) indi>1 I (A) et les classe IIpolymorquant zones phes de variabilit, et la localisation du peptide prsent. A. Classe I. >2 B. Classe II.

sries A,B,Cw peptide zones de variabilit

sries DR,DQ,DP peptide zones de variabilit

* A

* B

deux classes principales (dites classe I et classe II). Celles-ci correspondent des diffrences de structures.
MOLCULES ET GNES HLA DE CLASSE I (g 3A)

Des caractristiques biochimiques et fonctionnelles permettent dindividualiser deux groupes distincts de protines codes par une famille mutignique de 17 squences apparentes [54].

Tableau V. Principaux haplotypes A-B-DR observs en France.


Haplotypes
A1 - B8 - DR3 A29 - B44(12) - DR7 A3 - B7 - DR15(2) A33 - B44(12) - DR13(6)

Molcules et gnes HLA de classe I dits classiques


Ces gnes HLA-A, -B, et -C codent la chane lourde (a) des molcules de classe I (44 kDa), associe de manire non covalente, la surface de la quasi-totalit des cellules, la b2 microglobuline (b2m), chane dite lgre de 11,5 kDa. La chane lourde a compte une partie intracytoplasmique, une partie transmembranaire et une partie extracellulaire compose de trois domaines (a1, a2 et a3). La structure tridimensionnelle de ce type de molcules HLA de classe I classiques est connue depuis 1987 [9] et explique le rle fonctionnel de ces molcules dans la prsentation de peptides aux lymphocytes T (cf infra). Les gnes de classe I classiques se composent de huit parties codantes (exons) spares par sept introns non codants. Lexon 1 correspond la rgion 5 non traduite et au peptide signal, lexon 8 correspond pour partie la rgion 3 non traduite, les exons 2, 3, 4, 5, 6, 7 et une partie de lexon 8 codent chacun une squence de la chane lourde, respectivement de lextrmit NH2 distale a1 la partie intracytoplasmique carboxylique proximale. Ces gnes, et donc les molcules correspondantes, sont extrmement polymorphes pour chacune des trois sries allliques -A, -B et -C. On dnombre ainsi respectivement plus de 120, 250 et 70 squences nuclotidiques diffrentes (allles) pour ces trois sries. Ce polymorphisme de squence est concentr dans trois zones, dites hypervariables , localises dans les exons 2 et 3 et donc dans les parties correspondantes distales a1 et a2 de la molcule.

Pourcentage (%)
3,7 2,3 2,1 2,0

Pre
A1 - B8 - DR3 a A3 - B7 - DR2 b

Mre
A29 - B12 - DR7 c A10 - B38 -DR5 d

E1
A1 - B8 - DR3

E2 a
A1 - B8 - DR3 a A10 - B38 -DR5 d

E3
A3 - B7 - DR2

E4 b
A3 - B7 - DR2

A29 - B12 - DR7 c

A29 - B12 - DR7 c

A10 - B38 -DR5 d

25 %

25 %

25 %
A1 - B8 - DR3 a

25 %

Enfant

E5

Transmission familiale des haplotypes HLA. Lenfant E5 est appel recombinant HLA avec un nouvel haplotype not c/d, dorigine maternelle (vnement rare, environ 1 %).

A29 B38 - DR5 c/d

Molcules et gnes HLA de classe I dits non classiques


Les gnes HLA-E, -F et -G, identis la n des annes 1980, codent des structures molculaires trs proches des prcdentes. La distribution tissulaire restreinte, la rgulation dexpression diffrente et le polymorphisme beaucoup plus limit les diffrencient des molcules classiques [13]. Larchitecture de ces molcules galement associes la b2m est pourtant identique. Au plan fonctionnel, il nest pas exclu que certaines molcules puissent prsenter des antignes (cf infra). Nanmoins, quelques modications dans la structure des gnes E, F et G conduisent quelques diffrences structurales, dont un raccourcissement plus ou moins important de la partie intracytoplasmique de ces trois molcules. De plus, lexistence possible dpissages alternatifs dun ou deux exons conduit la transcription de plusieurs isoformes diffrentes. Ainsi, cinq isoformes membranaires ou solubles sont possibles pour HLA-G [39].

paternels (a, b) et les deux haplotypes maternels (c, d) peuvent se conjuguer en donnant quatre combinaisons haplotypiques diffrentes de frquences statistiques identiques, soit 25 % (ac = ad = bc = bd = 0,25). La gure 2 reprsente un exemple de famille avec transmission haplotypique (en bloc) pour les quatre premiers enfants. Le cinquime enfant correspond un sujet recombinant, avec un haplotype nouveau (not c/d) dorigine maternelle.

Structure biochimique des molcules et gnes HLA


Les molcules exprimes la surface cellulaire sont regroupes en
4

Hmatologie

Systme HLA

13-000-M-53

Molcules et gnes HLA apparents aux classes I


Les gnes MIC identis au voisinage du locus B prsentent une homologie de squence de 20 30 % avec les gnes de classe I classiques [4]. Seuls deux, MICA et MICB, sont exprims, avec une distribution cellulaire limite (cellules pithliales) et un polymorphisme assez lev. MICA ne sassocie pas la b2m et peut sexprimer en labsence de xation de peptide (cf infra). Plus rcemment (1996), un gne candidat de lhmochromatose, not HFE (et non HLA-H comme initialement propos), a t localis plus de 4 Mb de la rgion HLA, en position tlomrique par rapport HLA-A [25]. Ce gne code une chane lourde homologue celle des molcules de classe I, qui sassocie la b2m. Ce gne joue un rle prpondrant dans la rgulation dabsorption du fer. Deux mutations principales de ce gne, et donc de la molcule correspondante (dont C282Y), sont associes 70 90 % des cas dhmochromatose. Il est intressant de noter que la mutation C282Y abolit la liaison de la chane lourde avec la b 2m , rduisant probablement la capacit de xation de cette protine HFE au rcepteur de la transferrine [40].
MOLCULES ET GNES HLA DE CLASSE II (g 3B)

Molcules et gnes HLA apparents aux classes II


Deux molcules HLA-DO et HLA-DM, complmentaires dans leur fonction et rpondant une structure protique htrodimrique sont galement codes par des gnes HLA de classe II, respectivement DOA (anciennement not DNA) et DOB dune part, DMA et DMB dautre part. Ces deux structures molculaires DO et DM ne sont pas exprimes la surface cellulaire mais la membrane des compartiments endosomiques intracellulaires. Elles interviennent toutes deux dans la prsentation des peptides par les molcules HLA de classe II classiques, dont elles partagent environ 25 % dhomologie de squences. HLA-DM participe indirectement la slection des peptides prsents, et HLA-DO rgule lactivit de HLA-DM [33].

Expression tissulaire, rgulation dexpression et molcules HLA solubles


EXPRESSION TISSULAIRE

Au plan structural, les molcules de classe II sont, comme les molcules de classe I, des htrodimres faits de deux chanes protiques notes a et b. Ces deux chanes sont codes par des gnes HLA diffrents (A et B) situs dans la rgion dite de classe II . Il nexiste donc pas dassociation avec la b2m.

Molcules de classe I classiques (HLA-A, -B, -C)


Ces molcules sont exprimes sur la quasi-totalit des cellules nucles de lorganisme. Nanmoins, des variations quantitatives sont notables. Les cellules lymphodes, les lymphocytes T et B, les cellules dendritiques, les macrophages sont parmi les plus riches en molcules de classe I, ainsi que les pithliums et les endothliums vasculaires. Certains tissus expriment peu ces molcules (thyrode, pancras, muscle cardiaque) ou de manire indtectable (corne, neurones) ou trs variable (hpatocytes). Les globules rouges matures nexpriment pas de molcules HLA de classe I ou seulement de trs faibles quantits de certaines spcicits (HLA-A28, -B7 et B17). Les rticulocytes sont HLA de classe I positifs. Les plaquettes sanguines sont riches en molcules de classe I probablement adsorbes partir du plasma, puisque lon trouve des molcules HLA solubles dans le plasma. Dune faon gnrale, les molcules HLA-C sont quantitativement moins exprimes que les produits HLA-A et -B [19].

Molcules et gnes HLA de classe II dits classiques


Ces molcules appartiennent aux trois sries notes HLA-DR, -DQ et -DP. Ainsi lon distingue les molcules DR, DQ et DP constitues de deux chanes (a et b), codes par les gnes correspondants nots DRA et DRB, DQA et DQB, DPA et DPB. La structure tridimensionnelle dune molcule HLA-DR1, dtermine par cristallographie et diffraction aux rayons X [14], est similaire celle dune molcule de classe I [9]. Au niveau gnomique, la ralit est un peu plus complexe car il existe, en raison de duplication gnique, de nombreux gnes ne codant pas (pseudognes) ou codant des chanes b supplmentaires dans le cas de certains haplotypes, particulirement dans la sous-rgion DR. Ainsi, selon les individus, on distingue, au niveau de lexpression membranaire, plusieurs molcules de classe II possibles : molcules DR (DRB1, DRB3 ou DRB4 ou DRB5) : elles correspondent lexpression des gnes DRA (codant une chane a quasiment invariable), DRB1 (gne trs polymorphe), et dans certains cas lexpression des gnes, DRB3, ou DRB4, ou DRB5 (chacun codant une chane b plus ou moins polymorphe, capable de sassocier la chane DRa) ; molcules DQ : elles correspondent lexpression des gnes DQA1 et DQB1 des deux haplotypes ; molcules DP : elles correspondent lexpression des gnes DPA1 et DPB1 des deux haplotypes. Les gnes DQA2, DQB2, DQB3 et DPA2, DPB2 sont des pseudognes, sans produits dexpression. Cette pluralit molculaire est le fruit de combinaison de chanes (a et b) synthtises par des gnes ports par le mme haplotype (molcules normales dites de ciscomplmentation ). Cependant, des molcules dites hybrides , fruits de lassociation de chanes (a et b) synthtises par des gnes ports par les deux haplotypes (molcules hybrides de transcomplmentation), ont t rapportes chez la souris, puis chez lhomme [17]. Ces molcules hybrides ajoutent encore plus de diversit HLA et pourraient expliquer dune part la susceptibilit accrue de certains sujets (htrozygotes) certaines maladies comme le diabte [35], et dautre part lavantage slectif des sujets htrozygotes HLA, hypothse propose ds 1975 [24] et conrme partir de 1991 [49].

Molcules HLA-E, -F, -G


Les gnes codant ces produits sont transcrits en faible quantit, et les produits correspondants ne sont pas toujours exprims ou dtectables la surface cellulaire [13]. HLA-G est bien exprim par les cellules du cytotrophoblaste extravilleux mais pourrait ltre aussi par dautres tissus. Pour HLA-E et -F, de faibles quantits de protines peuvent tre dtectes dans le cytoplasme. Dans le cas particulier dHLA-E, le chargement en peptides particuliers (issus de molcules de classe I classiques) permettrait son expression la surface cellulaire. Cette expression dHLA-E protgerait la cellule dune lyse par des cellules natural killers (NK).

Molcules HLA de classe II


Ces molcules sont exprimes de manire plus restreinte que celles de classe I. Elles sont dcelables principalement la surface des lymphocytes B et des cellules monocytaires, macrophagiques et dendritiques qui sont toutes des cellules capables de prsenter des peptides antigniques aux lymphocytes T (cellules prsentatrices de lantigne ou CPA). Les prcurseurs hmatopotiques des globules rouges et des granulocytes sont de classe II positifs, puis se ngativent. Certains tissus sont galement riches en molcules HLA de classe II (endothliums vasculaires, glomrules rnaux). Enn, il est admis que ce sont les molcules DR qui sont le plus reprsentes la surface cellulaire par rapport aux molcules DQ et DP [19].

Modulation de lexpression tissulaire


Cette expression cellulaire naturelle des molcules HLA de classes I et II peut tre grandement module par les interfrons ou dautres
5

13-000-M-53

Systme HLA

Hmatologie

cytokines de la raction inammatoire. Les interfrons augmentent signicativement lexpression des molcules de classe I, ainsi que le tumor necrosis factor (TNF)a. Ces facteurs peuvent aussi agir sur des cellules de classe II ngatives pour leur permettre une expression de classe II.
RGULATION DEXPRESSION, DFAUTS DEXPRESSION ET DFICITS IMMUNITAIRES

de la dltion dun codon impliqu dans un pont disulfure (A*0303N). Les individus prsentant ces allles nuls sont sains. Ils sont considrer comme ne portant pas lantigne en question. Allles faiblement exprims de classe I La faible expression dun allle HLA de classe I isol chez un individu alors que lexpression des autres allles HLA de classe I est normale, est la consquence dune mutation sur le gne HLA portant cet allle. Ceci est le cas dun allle HLA-A*02 prsentant une substitution dans la rgion promotrice du gne et dun allle A*2402, o une substitution dans lintron 2 amne un pissage anormal. Les individus prsentant ces allles sont sains et sont considrer comme portant lantigne en question.

Les mcanismes de rgulation dexpression et de transcription des gnes sont communs aux deux classes I et II et font intervenir la fois des squences rgulatrices en amont des gnes de structures et des protines spciques dont linteraction conduit la rgulation de la transcription des gnes. Quelques polymorphismes de squence dans ces rgions promotrices de la transcription de gnes HLA expliquent certains dfauts dexpression de molcules HLA [72]. Le dfaut dexpression peut, selon ltiologie, concerner lensemble des antignes de classe I ou II, ou encore un antigne de classe I ou II isolment. Les causes de non-expression sont diverses et peuvent aussi tre le fait dautres gnes dont les produits sont indispensables la conformation tridimensionnelle de la molcule ou codant des facteurs contrlant la transcription des gnes HLA. Ainsi lon peut distinguer plusieurs situations.

Non-expression des molcules HLA de classe II


Dfaut de rgulation de la transcription des gnes de classe II Environ 70 malades ont t dcrits prsentant un dfaut dexpression de lensemble des molcules HLA de classe II (DR, DQ, DP, DM) et de la chane invariante Ii (CD74). Contrairement aux dcits dexpression de classe I, cest le tableau clinique alarmant qui oriente vers le diagnostic (infections gravissimes ds les premiers mois de la vie type de septicmies, infections gastro-intestinales, pulmonaires et urinaires rcurrentes qui voluent inexorablement vers la mort). La majorit des patients ont une agammaglobulinmie et une diminution du nombre absolu des lymphocytes CD4+. La transmission familiale est rcessive et nest pas lie au chromosome 6, les patients dune mme famille tant HLA diffrents. Bien que le tableau clinique soit homogne, ltiologie ne lest pas [56]. Allles nuls de classe II Comme pour la classe I, la non-expression dallles HLA de classe II isols a t note. Le nombre dallles de classe II nuls est moins important que pour la classe I et il sagit dallles cods par les gnes DRB4, DRB5 et DPB1.
MOLCULES HLA SOLUBLES

Non-expression ou faible expression des molcules HLA de classe I


Absence de transporteurs de peptides ou TAP (cf infra) Six cas ont t dcrits o labsence dexpression de lensemble des molcules de classe I est due un dfaut des gnes TAP1 ou TAP2 codant le transporteur de peptides TAP [23]. La transmission est rcessive, les patients issus de mariages consanguins prsentant le dfaut de manire homozygote. Le transporteur des peptides ntant pas fonctionnel, les peptides du cytosol ne peuvent entrer dans le rticulum endoplasmique ni tre chargs par les molcules de classe I. Celles-ci nont pas alors la structure tridimensionnelle attendue, restent bloques entre le rticulum endoplasmique et le cis-Golgi, et seules 1 3 % des molcules de classe I charges par des peptides indpendants du transporteur de peptides sont exprimes la surface cellulaire. Le tableau clinique est vocateur : les patients, sains pendant les premires annes de leur vie, souffrent la n de lenfance dinfections bactriennes pulmonaires trs svres rappelant la mucoviscidose. Certains prsentent en plus des ulcres cutans. Ces patients ont nanmoins une synthse danticorps antiviraux et antibactriens normaux et des lymphocytes T-CD8 sont prsents, bien que leur nombre absolu soit diminu. Absence dun facteur non dni ce jour Trois cas ont t dcrits dans lesquels un dfaut de transcription rduisait de dix fois le nombre de lensemble des molcules HLA de classe I [23]. Le dfaut gntique et le mode de transmission ne sont pas connus. Cependant, le gne nest pas prsent sur le chromosome 6 puisque les membres de la fratrie atteints ne sont pas HLA-identiques. Les individus porteurs de ce dfaut sont sains et la dcouverte du dcit est fortuite. Allles nuls de classe I La non-expression dun seul allle HLA de classe I chez un individu, alors que lexpression des autres allles de classe I est normale, est la consquence dun dfaut du gne HLA portant cet allle [43]. Ces allles sont nots dans la nomenclature officielle par la lettre N (nul). Ils peuvent rsulter : dune substitution dun nuclotide, dans un exon gnrant un codon stop (A*0215N, A*0232N, A*2409N, B*1526N) ; dun dcalage du cadre de lecture conscutif une dltion de nuclotide(s) dans un exon ou un intron (A*0105N, A*6811N, B*0808N, N*1501102N), ou conscutif une insertion de nuclotide(s) (A*0104N, A*2411N, A*2611N, B*5111N) ;
6

La prsence de molcules HLA solubles autologues [45] a t signale ds 1970 dans la fraction des btalipoprotines du srum dindividus normaux. Sa source est triple : relargage des molcules exprimes la surface cellulaire, pissage anormal (sans partie transmembranaire) et scrtion dune forme soluble (sans partie transmembranaire et intracytoplasmique). La quantit dantignes solubles est corrle au phnotype HLA de lindividu. Ainsi, les individus HLA-A23, -A24, -A29 et -A33 ont des quantits de substances solubles plus importantes que les individus ne portant pas ces antignes. linverse, HLA-A2 serait associ une faible scrtion. Les substances solubles de classe I ou II trouves dans le srum sont aussi prsentes dans dautres scrtions de lindividu (urine, sueurs, larmes...). En pathologie, leur prsence est augmente dans les infections et les maladies inammatoires mais diminue dans les cancers. Aprs transplantation dorganes, des molcules HLA solubles du donneur sont rapidement dtectes chez beaucoup de receveurs. Le rle de ces molcules dans la rgulation immune et la tolrogense est conrm. Cependant, selon la source des molcules solubles (relargues ou scrtes), leurs fonctions pourraient tre opposes (antigniques pour les premires, tolrognes pour les secondes).

Mthodes didentication du polymorphisme


Schmatiquement, deux approches didentication de ce polymorphisme HLA sont possibles. La premire consiste identier les molcules la surface des cellules qui les expriment

Hmatologie

Systme HLA

13-000-M-53

200

Classe I

188

Classe II 165

150

100 85 50 25 9 0 Locus A B C DRB1 50 42 20 7 DQB1 27 6 DPB1 73

pralable HLA de classe I. Elle a permis de dnir des variants non dtectables srologiquement, par les diffrences de charges lectriques dacides amins, objets de mutation [76]. De mme, pour les antignes HLA de classe II, en particulier DR et DQ, un radiomarquage, une prcipitation par des anticorps monoclonaux slectionns et une lectrophorse bidimensionnelle ont permis didentier un polymorphisme li la fois au poids molculaire et la charge de ces molcules [36]. Nanmoins, ces techniques lourdes mettre en uvre sont longues et difficiles standardiser et ne peuvent pas tre considres comme de vritables techniques de typage et didentication du polymorphisme HLA.

Techniques cellulaires
La dcouverte de la rgion de classe II et de ses marqueurs, nots dans un premier temps HLA D , est le fait dune technique cellulaire : la culture mixte lymphocytaire (ou MLC) (1964). Lintensit de la raction de prolifration cellulaire observe lors de la culture in vitro dun mlange de populations lymphocytaires, issues de deux sujets non apparents, est fonction de leur disparit HLA de classe II. De nombreux travaux collaboratifs ont permis de standardiser, sur la base de la technique de culture mixte lymphocytaire, une mthode de typage cellulaire de classe II, rserve quelques applications cliniques ou travaux de recherche. Encore faut-il prciser que le typage de classe II obtenu traduit un ensemble de disparits pour les marqueurs DR-DQ principalement [3] et DP accessoirement [16]. De ce fait, il fut not typage de la rgion D , avec une nomenclature spcique de marqueurs HLA-Dw qui nest plus utilise aujourdhui. Lors de cultures mixtes positives (prolifration) en raison des disparits des marqueurs de classe II entre les deux populations cellulaires, il peut tre not, en cas de disparits additionnelles des marqueurs de classe I, la production de cellules T cytotoxiques. Ces clones T de cellules ont pu tre utiliss dans des tests cellulaires complexes dits de cytotoxicit mdiation cellulaire (CML). Ces tests ont permis didentier des variants de spcicits de classe I, comme par exemple pour HLA-A2 ou HLA-B27. De ces techniques didentication des molcules HLA, seules les techniques srologiques de cytotoxicit complment-dpendante sont utilises en routine. Nanmoins, leur niveau de discrimination entre antignes, la ncessit de disposer de srums anti-HLA et de cellules viables en quantit suffisante, expliquent le recours frquent aux techniques de typage par biologie molculaire des gnes.
IDENTIFICATION DU POLYMORPHISME DES GNES HLA

Srologie * = antignes

Biomolculaire = allles

(+ DRA, DRB3, B4, B5; DQA1; DPA1,...) (* DP cellulaire) 4 Polymorphisme HLA classes I et II (1997) selon la technique (srologie ou biologie molculaire) utilise.

dans des tests qui utiliseront ces cellules comme support de lantigne. En pratique, ces techniques sont dites srologiques, cellulaires ou biochimiques. La deuxime approche, plus rcente (milieu des annes 1980), consiste identier les gnes HLA au niveau de lacide dsoxyribonuclique (ADN) gnomique des cellules. Ces techniques sont dites de biologie molculaire des gnes HLA ou techniques ADN, et permettent la description dun polymorphisme quantitativement plus important (g 4).
IDENTIFICATION DU POLYMORPHISME DES PRODUITS HLA EXPRIMS

Techniques srologiques
la technique princeps de leucoagglutination utilise la n des annes 1950, a succd la technique de micro-LCT, publie par Terasaki et McClelland en 1964 [63]. Cest la technique de rfrence, dite LCT complment-dpendante . Elle ncessite des cellules lymphocytaires viables, isoles le plus souvent du sang priphrique par sparation sur gradient de densit (Ficoll). Cette population de lymphocytes (Ly) totaux peut tre utilise telle quelle aprs ajustement en concentration cellulaire pour des typages HLA de classe I. Pour des typages HLA de classe II, une sparation des Ly T et des Ly B est ncessaire et seule cette dernire population est utilise. Ces cellules sont utilises rparties dans les puits de microplaques contenant chacun un anticorps anti-HLA de spcicit connue (ou quelquefois un mlange limit de spcicits). Ces anticorps sont des ractifs de typages slectionns, issus du srum de sujets allo-immuniss (grossesses, transfusions ou greffes). Ces anticorps sont rarement monospciques et plus souvent des mlanges. De plus, du fait des modalits de la gnration du polymorphisme HLA, un anticorps peut reconnatre plusieurs spcicits HLA porteuses dun mme enchanement dacides amins (pitopes). Plus rcemment, sont utiliss des anticorps monoclonaux polymorphiques, qui prsentent lavantage dtre constants en ractivit et spcicit. Ces ractions srologiques cellules-srums (ou antigne-anticorps) sont visualises, aprs addition de complment de lapin (titr et slectionn), par la lyse ou non des Ly et lincorporation en cas de lyse dun colorant vital (bleu trypan, osine) ajout en n de raction. La complexit de linterprtation est lie de nombreux paramtres (richesse et viabilit cellulaires, disponibilit et qualit des anticorps, ractions croises entre pitopes). Elle est plus dlicate encore pour un typage HLA de classe II. Ces techniques restent des actes rservs de biologie mdicale.

Historique : approche restriction fragment length polymorphism


Le clonage intensif et progressif des gnes HLA de classe I (1980) et de classe II (1982) a permis lobtention de clones dADN complmentaires et gnomiques pour lutilisation secondaire de sondes HLA. Celles-ci ont pu tre utilises dans des ractions dhybridation avec des ADN gnomiques tudier, permettant une tude de polymorphisme de loci ou dallles. Ces premires techniques de typage HLA par biologie molculaire ADN taient bases sur lanalyse du nombre et de la taille de fragments dADN hybrids la sonde spcique HLA, aprs coupure (digestion) enzymatique slective de lADN cellulaire. Cette technique dite restriction fragment length polymorphism (RFLP) ou polymorphisme de longueur des fragments de restriction, utilise la mthode de transfert sur membrane. Son application au typage HLA fut lobjet principal du workshop-HLA 1987 (Princeton, New York) et permit des progrs importants, notamment dans la dnition et ltude du polymorphisme de classe II [7, 8], appliques la compatibilit HLA en transplantation dorganes [51]. Cette technique RFLP fut aussi la premire permettre une identication du polymorphisme HLA-DP sans le recours des techniques cellulaires et une mesure de limpact des incompatibilits DP dans la culture mixte lymphocytaire [16]. Elle a permis aussi une rvaluation de bon nombre dassociations HLAmaladies, prcisant mme les donnes comme dans le cas de limmunisation antiplaquettaire ftomaternelle [70].
7

Techniques biochimiques
Elles ne sont pas utilises en routine pour les typages HLA. Lisolectrofocalisation (IEF) ncessite un typage srologique

13-000-M-53

Systme HLA

Hmatologie

Cette technique de typage HLA est aujourdhui abandonne, en raison de ses obstacles techniques (radioactivit et dure) et de ses limites dinformativit et de prcision du polymorphisme.

telle prcision, du fait de certaines combinaisons dallles pour les deux haplotypes. Ces ambiguts de typages allliques dues ltendue et la nature du polymorphisme ne peuvent alors tre rsolues que par une technique de squenage dallles.

Technique par raction damplication en chane


Lintroduction et la publication dune technique damplication gnique dlimite ou raction de polymrisation en chane (polymerase chain reaction [PCR]) [61] a rvolutionn toutes les approches dtude de gnes, du clonage au squenage, en passant par ltude du polymorphisme. Cette technique PCR a augment la sensibilit, la spcicit et la simplicit des mthodes dtude des gnes. Elle implique la succession de cycles (une trentaine en gnral) comportant chacun trois tapes : dnaturation de lADN double brin tester en ADN monobrin 94 C ; accolement des amorces ou primers, spciquement slectionnes et dlimitant la zone gnique amplier ; extension partir de ces amorces, cest--dire copiage du brin matrice par action de lenzyme Taq-polymrase thermostable avec incorporation progressive mais rapide des nuclotides mis en excs dans le milieu ractionnel. Au total, aprs 30 cycles, laugmentation exponentielle du nombre de copies conduit lobtention denviron 1 x 106 copies de gnes. Selon le positionnement des amorces, la squence amplie peut tre trs spcique ou non. Ainsi, on dnit habituellement deux types damplications : la PCR dite gnrique : les deux primers de dlimitation de zone amplier sont positionns dans des zones conserves non polymorphes ; la PCR dite spcique : lune des amorces (voire les deux) est slectionne quant sa zone de complmentarit de squence pour ne shybrider quavec une squence dtermine spcique dun allle ou dun groupe dallles (PCR spcique dallle ou PCR spcique de squence [PCR-SSP]). On comprend tout lintrt de cette technique PCR ds lors que sont connues les squences des diffrents allles valuer. La slection des amorces permet lamplication dun fragment dun gne qui est identi dans un second temps. ces variantes opratoires portant sur lamplication elle-mme, sajoutent des variantes portant sur lidentication du produit damplication. Ainsi, on distingue au moins trois groupes de mthodes utilisant : des oligosondes spciques dallles ou de squences (PCR-SSO) marques radioactivement [15] ou par des enzymes [5] ; la digestion du fragment damplication : PCR-RFLP [42] ; llectrophorse pour rvler la prsence ou labsence de produits damplication des ractions de PCR-SSP [50]. Ces techniques de PCR ont permis de remarquables progrs dans lidentication du polymorphisme des gnes HLA de classe II et ont conduit la mise en vidence dune extrme diversit alllique, notamment pour DRB1 et DPB1. Le polymorphisme de classe I reste plus difficile identier par ces techniques PCR en raison de la richesse en pseudognes coampliables dans cette rgion classe I et de la rpartition dans deux, voire trois exons, de ce polymorphisme de squences. Les techniques PCR sont dsormais utilises en routine dans les laboratoires dhistocompatibilit. Elles ncessitent une parfaite connaissance de limmunogntique HLA et de sa nomenclature pour une interprtation rigoureuse des rsultats obtenus. La prcision des typages allliques (quatre digits) est indispensable dans la slection de donneurs de moelle non apparents. Ces techniques de PCR-SSP ou PCR-SSO ne permettent pas toujours une
8

Squenage
Le squenage de gnes donne les informations les plus prcises dans son application au typage HLA. Base sur lanalyse par squenage dun fragment de gne ampli par PCR, la technique dite sequencing based typing (PCR-SBT) utilise galement un logiciel pour comparaison de la squence tudie celles dj connues. Cette technique peut tre ralise rapidement, lunit, en moins de 48 heures, et donne des rsultats sans quivoque si le produit ampli est pur de toute contamination par coamplication. Le choix des amorces damplication est en effet primordial. Le squenage permet de rsoudre les difficults de typage (ambiguts) rencontres avec la technique PCR-SSP chez des sujets htrozygotes porteurs de deux allles de squences voisines. Sur un plan technique, cette technique reste base sur la synthse enzymatique de fragments dADN. Le terme PCR-SBT regroupe des approches mthodologiques varies. Les diffrences portent sur le matriel biologique utilis (ADN gnomique, acide ribonuclique messager [ARNm]), sur la stratgie damplication, sur les gnes (classe I ou classe II) et les rgions (deux ou plusieurs exons) amplis, et enn sur la mthodologie (manuelle ou automatique). Actuellement, plusieurs stratgies automatises existent qui utilisent des ractifs de squenage et des marquages uorescents diffrents. La technique PCR-SBT, recommande dans la slection HLA dnitive de donneurs de moelle apparents, est applique aussi bien aux gnes HLA de classe I quaux gnes de classe II [66]. Elle permet galement didentier de nouvelles squences allliques qui sont par la suite rfrences, et devrait galement tre utile dans la comprhension de certaines associations HLA-maladie, en prcisant les squences nuclotidiques impliques.

Allo-immunisation anti-HLA : origine et mise en vidence


ORIGINE DES ALLO-IMMUNISATIONS

En de trs rares occasions, il a pu tre identi des anticorps antiHLA en labsence de toute stimulation antignique [69]. Ces anticorps naturels, immunoglobulines (Ig)M cytotoxiques, plus actifs 4 C qu 37 C, sont exceptionnels. En effet, les anticorps anti-HLA sont classiquement des alloanticorps dimmunisation, survenant frquemment dans trois situations.

Transfusions sanguines
Les donnes de frquences dimmunisation varient beaucoup selon la nature des produits transfuss et selon les auteurs. Cette alloimmunisation est le fait des leucocytes et de leur concentration rsiduelle dans les concentrs globulaires ou plaquettaires. La dleucocytation systmatique de ces produits avant leur stockage rduit considrablement ces risques dimmunisation, ds lors que le taux rsiduel de ces leucocytes est infrieur 5 x 106.

Grossesses
La dcouverte danticorps anti-HLA chez les multipares [52] a t largement utilise pour la description de nouveaux antignes HLA. Ces anticorps apparaissent ds la premire grossesse et prs de 30 % des femmes possdent de tels anticorps ds la deuxime grossesse. Les srums de ces femmes multipares contiennent le plus souvent des mlanges danticorps IgG anticlasse I et anticlasse II, et reprsentent de bonnes sources de srums-tests anti-HLA pour phnotypage par LCT (cf supra). Ils ne joueraient que trs

Hmatologie

Systme HLA

13-000-M-53

exceptionnellement un rle dltre vis--vis du ftus. La persistance de ces anticorps dans le srum maternel est extrmement variable.

Transplantations dorganes
Elles induisent trs souvent des rponses humorales fortes, se traduisant par lapparition danticorps cytotoxiques de titre lev. Ces immunisations sont trs larges, non exclusivement limites aux spcicits incompatibles de classe I et/ou de classe II du greffon (rein, par exemple), et dtectables sans difficult aprs transplantectomie. Elles deviennent, par leur persistance et leur polyspcicit, un handicap pour la slection de nouveaux donneurs en vue des greffes ultrieures.
MTHODES DIDENTIFICATION

responsables de la rponse humorale. Les molcules HLA de classes I et II sont les initiateurs de la rponse T par leur capacit de prsentation de peptides immunognes aux lymphocytes T qui les reconnatront par leur TcR spcique [22, 28].
MOLCULES HLA PRSENTOIRS DE PEPTIDES

Les sites de prsentation de peptides des molcules de classes I et II possdent une architecture assez superposable, avec toutefois des particularits (g 5).

Molcules de classe I
Elles possdent un site de prsentation de peptides, constitu des deux domaines a1 et a2 de la chane lourde a. Leur disposition complmentaire et symtrique dnit un prsentoir compos de structures de type feuillets b assurant le plancher de ce prsentoir, et de type hlices a dlimitant les bords de ce prsentoir. La fente ainsi mnage est de 2,5 x 1 nm, donc voisine de celle du site anticorps dune Ig. Les deux extrmits de ce site de prsentation sont fermes, ce qui limite la taille des peptides 9 ( 1) acides amins [9, 41]. Les acides amins des parties distales a1 et a2 ainsi engages dans ce prsentoir vont dterminer, par leur nature et leurs caractristiques, une spcicit de liaison peptidique et une spcicit de reconnaissance par le TcR des lymphocytes T [26]. Seuls les TcR des lymphocytes T-CD8+ sont en mesure de reconnatre les peptides prsents dans un environnement de molcules HLA de classe I.

En routine, les mthodes de LCT sont aussi bien utilises pour la mise en vidence et lidentication des anticorps anticlasse I que pour celles des anticorps anticlasse II. Pour ces derniers, il est indispensable dabsorber au pralable, et sur pool de plaquettes de multiples donneurs (environ 400), les anticorps anticlasse I. Les recherches et identications utilisent des panels de lymphocytes de rfrence, slectionns et conservs congels en azote liquide avant utilisation. De nouvelles techniques enzymatiques (enzyme linked immunosorbent assay [Elisa]) ou de uorescence par cytomtrie en ux sont disponibles. Elles visualisent mieux les anticorps IgG quIgM et sont dune grande sensibilit.

Molcules de classe II
Leur site de prsentation de peptides est constitu des domaines distaux a1 et b1 des deux chanes. Ceux-ci sont disposs de faon complmentaire et symtrique et mnagent un prsentoir pouvant accueillir des peptides de 13 19 rsidus. Les deux extrmits de ce prsentoir sont ouvertes [14]. La structure est identique celle observe pour les molcules de classe I, avec un plancher de feuillets b et deux hlices a servant de bords ce prsentoir. Les acides amins des chanes a et b impliqus dans ce prsentoir vont inuencer la spcicit de la liaison entre molcule de classe II et peptide et celle de la reconnaissance de ce complexe par le TcR des lymphocytes T. Seuls les TcR des lymphocytes T-CD4+ sont en mesure de reconnatre les peptides prsents dans un environnement de molcules HLA de classe II [31].

Fonctions des molcules HLA


Le systme immunitaire a pour fonction de reconnatre et dliminer les structures qui lui sont trangres (non-soi). Deux types molculaires particuliers, les anticorps (Ig) solubles ou membranaires des lymphocytes B et le rcepteur lantigne des lymphocytes T (TcR), assurent les fonctions de reconnaissance. Ils ont tous deux la particularit dune extrme diversit dans leur capacit de reconnaissance, lie un mcanisme de rarrangement gnique. Ces deux voies de reconnaissance dites B et T se compltent et peuvent se conjuguer. Ainsi, les lymphocytes T-helper CD4+, une fois activs, cooprent avec les lymphocytes B
= =

A. Reprsentation tridimensionnelle dune molcule HLA de classe I (HLA A2) avec sa chane lourde et ses trois domaines ( 1, 2 et 3) et sa chane lgre b (b2microglobuline). B. Vue du dessus de la gure A avec son prsentoir peptide (en noir) (daprs PJ Bjorkman, Nature, 1987 [9]).

N N

* B

>2m =!

* A
9

13-000-M-53

Systme HLA

Hmatologie

Les peptides prsents proviennent de structures antigniques plus complexes dont lorigine et la dgradation sont diffrentes selon quils sont pris en charge par des molcules de classe I ou II. En effet, selon lorigine cellulaire ou non de ces antignes, les molcules de classe I ou celles de classe II interviennent, dnissant ainsi deux voies de prsentation [31, 74].

INTERVENTION DES MOLCULES HLA DE CLASSE I DANS LA LYSE NATURAL KILLER

La classe I prsente des peptides dorigine endogne aux lymphocytes T-CD8 (ou Ly T cytotoxiques ou CTL)
Les protines endognes (dorigines virale, tumorale) sont dgrades dans et par un complexe molculaire cytoplasmique, le protasome, dont certaines units sont codes par des gnes localiss dans le CMH (gnes LMP). Ces peptides htrognes en taille sont slectivement transports par un transporteur lintrieur du rticulum endoplasmique (RE) de la cellule. Ce transporteur est constitu de deux units, dont les gnes sont galement localiss dans le CMH (gnes TAP). Les peptides, ainsi slectionns quant leur taille (principalement des nonamres), peuvent tre pris en charge par les molcules HLA de classe I synthtises dans le RE. Ils assurent la stabilit de la molcule de classe I, sa migration intracytoplasmique (via lappareil de Golgi) et son expression la surface cellulaire. Toute perturbation dans les mcanismes de dgradation, transport, chargement, peut conduire un dfaut dexpression des molcules HLA de classe I, mme si par ailleurs ces molcules sont correctement synthtises. Les peptides dorigine endogne ainsi prsents par des molcules HLA de classe I sont reconnus par les lymphocytes T-CD8 + (CTL) et leur TcR. Cette reconnaissance conduit la destruction des seules cellules porteuses du CMH du soi (le mme CMH que les lymphocytes T) prsentant un peptide tranger. Ce phnomne dit de double reconnaissance (acquise lors de la maturation thymique des Ly T) est not phnomne de restriction (restriction de classe I). Les diffrences dintensit de rponse immunitaire pourraient tre le fait de diffrences daffinit et de slectivit de prsentation, dpendant des squences des peptides et du polymorphisme des molcules HLA prsentatrices [1].

Les cellules NK sont une sous-population de lymphocytes reprsentant 5 10 % des cellules mononucles du sang priphrique. Provenant de la moelle osseuse, elles partagent un progniteur commun avec les lymphocytes T. Elles se dnissent fonctionnellement par leur capacit induire la lyse spontane de cellules tumorales et de cellules infectes par des virus. Ces cellules NK jouent un rle important dans la rponse immune contre les bactries, parasites et virus, la fois par leur intervention directe dans le processus de cytolyse et en scrtant des cytokines tels que linterfron c et le TNFa. Les mcanismes impliqus sont encore mal connus. Nanmoins, cest de lintervention de multiples rcepteurs, inhibiteurs ou activateurs de lyse, que dpend en nal laction prfrentielle de ces cellules NK (lyse ou inhibition de lyse) [37]. Dans des conditions physiologiques, la fonction des rcepteurs inhibiteurs prdomine, permettant aux cellules NK dpargner les cellules normales. Parmi ces rcepteurs, certains ont pour ligands des molcules HLA de classe I. Ils sont regroups en deux classes : lune correspondant aux rcepteurs appartenant la superfamille des Ig, cest le cas des killer Ig-like receptors (KIR) et des Ig-like transcript (ILT) ou des leucocytes Ig-like receptors (LIR) ; lautre aux rcepteurs de type lectine comme par exemple les htrodimres CD94/NKG2 [71]. Les KIR ont pour ligands des molcules HLA-Cw et HLA-B (pitope Bw4) et peut-tre quelques spcicits HLA-A et mme HLA-G1 (KIR2DL4) ; les CD94/NKG2 se lieraient des molcules HLA-E [12] ou HLA-G [59]. Certains de ces rcepteurs fonctionneraient comme des inhibiteurs (CD94/NKG2A), dautres comme des activateurs (CD94/NKG2C) de lyse NK. Dautre part, la molcule CD94/NKG2D pourrait se lier la molcule MICA. Tout dcit dexpression de molcules HLA de classe I (cellules tumorales ou cellules infectes par des virus) peut conduire un dfaut dengagement des rcepteurs inhibiteurs, favorisant laction de lyse des rcepteurs activateurs par un signal appropri [27].
RLE DES MOLCULES HLA DANS LA DLIMITATION DU RPERTOIRE DE RECONNAISSANCE DES LYMPHOCYTES T

La classe II prsente des peptides dorigine exogne

aux lymphocytes T-CD4 (ou Ly T auxiliaires)


Les cellules spcialises dans ce type de prsentation sont en mesure de capter des antignes trangers (bactries). Ces cellules prsentant lantigne (CPA) sont des macrophages, des cellules dendritiques, des lymphocytes B par exemple. Elles sont capables dinternaliser lantigne pour le dgrader en peptides, dans des lysosomes. Cest aussi dans ces compartiments lysosomiaux intracytoplasmiques spcialiss que ces peptides dits exognes sont pris en charge par des molcules HLA de classe II. Celles-ci, synthtises dans le RE, sont complexes une chane peptidique dite chane invariante , qui aide leur transfert vers le compartiment lysosomial spcialis. Cette chane invariante joue aussi un rle de blocage du site peptidique, vitant tout chargement intempestif (dans le RE) de la molcule de classe II par des peptides endognes [20]. Cest une autre molcule HLA, note HLA-DM, qui va librer le site de xation encombr dun peptide (CLIP) provenant de la chane invariante [29, 58]. Une fois libr, le site peut se charger dun peptide exogne (de taille variant de 13 19 acides amins). De mme, cette xation de peptide stabilise la molcule prsentatrice et facilite son transfert la surface de la cellule prsentatrice (CPA). Ces peptides exognes prsents par des molcules de classe II sont reconnus par les lymphocytes T-CD4+ avec, l encore, une double reconnaissance CMH du soi et du peptide tranger (restriction de classe II). La spcicit peptidique et le polymorphisme HLA de classe II expliquent les diversits de rponses immunes observes, notamment dans le cadre de certaines associations entre HLA de classe II et maladies, ou dans celui de lvolution dinfections virales comme lhpatite C [65].
10

Cest au cours de leur transit dans le thymus que les prothymocytes issus de la moelle osseuse vont subir une maturation particulire, leur donnant un statut de lymphocytes T matures duqus diffrencier le soi du non-soi. Seuls sont slectionns les Ly T dont le TcR ne reconnat que les antignes HLA du soi. Cette slection positive se ralise dans le cortex thymique et les cellules non retenues meurent par apoptose. Dans la rgion mdullaire du thymus, les lymphocytes T prcdemment slectionns vont tre dlts des cellules dont le TcR reconnat les peptides autologues prsents par le CMH du soi (slection dite ngative ). Cette double slection aboutit une population de Ly T dont les TcR reconnatront tous les peptides trangers (non-soi) prsents par des molcules HLA du soi [73]. Cette ducation particulire va de pair avec lacquisition de marqueurs de surface ou clusters de diffrenciation (CD) conduisant deux populations T diffrentes : une population dite CD4-positive reconnaissant les peptides nonsoi prsents par des molcules HLA de classe II du soi (T-helper) et une population dite CD8-positive reconnaissant les peptides nonsoi prsents par des molcules HLA de classe I du soi (T cytotoxique). Ces lymphocytes T matures, dous de reconnaissance avec restriction par les molcules HLA, quittent le thymus pour circuler dans le sang.

Applications cliniques
De par ses fonctions de prsentation slective dantignes peptidiques, la diversit de ses molcules exprimes, son rle dans la dlimitation du rpertoire de reconnaissance des lymphocytes T, le systme HLA joue un rle majeur dans la rponse immunitaire. Ceci explique les implications de ce systme de groupe dans la reconnaissance du non-soi en transplantation dorgane et greffe de

Hmatologie

Systme HLA
Premires greffes / rein apparent 100 et rein de cadavre 90 80 70 60 50 0 0 1
HLA identiques HLA semi-identiques Rein de cadavre

13-000-M-53

Patient = srum

Panel = lymphocytes Ly 1 2 3 4 5 50

Pourcentage de survie du greffon

Ly 1 Ly 2 + srum

Lecture

- taux en pourcentage - spcificit exemple: 60% anti-HLA A2

plaque de Terasaki Ly 1,2,50 lymphocytotoxicit Principe de la recherche danticorps anti-HLA. (Ly : lymphocytes).

2 3 4 5 Annes 6 Rle de lidentit gntique HLA sur le devenir du greffon. Les greffons provenant des germains (frre ou sur) HLA identiques ont une survie bien suprieure ceux provenant de germains HLA semi-identiques ou de donneur cadavre (daprs Opelz et al [51]). Premires greffes / rein de cadavre Incompatibilits HLA A + B + DR

Donneur

Receveur 1

Rsultat

S1

S2

S3

S4 Greffe
non

Pourcentage de survie du greffon

100 90 80 70 60 50 0 0

0 inc 1 inc 2 inc 3 inc 4 inc 5 inc 6 inc

Effets combins des incompatibilits HLA A + B + DR sur le devenir du greffon. La survie de fonction du greffon dpend du degr dincompatibilits HLA cumules (daprs Opelz et al [51]). inc : incompatibilit(s).

Receveur 2 Cellules du donneur (ganglion, rate) S1 Ly totaux, Ly T, Ly B S2 S3 Greffe Slection de srums (srothque)

oui

Principe du cross-match lymphocytaire. (Ly : lymphocytes).

2 3 Annes

moelle, dans la susceptibilit ou la rsistance certaines maladies, dans la surveillance antitumorale, en pratique transfusionnelle et dans la gntique de populations ou en mdecine lgale.
HLA ET TRANSPLANTATION DORGANES

Lapport de cellules, de tissus ou dorganes dun individu un autre non identique gntiquement, conduit un risque de rejet immunologique. Dune faon gnrale, les systmes de groupes ABO et HLA sont les obstacles majeurs au succs de ces transplantations. Trs tt, ces antignes dhistocompatibilit HLA furent dsigns comme antignes de transplantation. Des travaux exprimentaux raliss chez la souris partir de tumeurs ou de greffes de peau montraient trs rapidement la corrlation troite entre lidentit pour le systme H-2 (quivalent HLA murin) entre donneur et receveur et la prise de greffe. Paralllement aux rejets cellulaires de greffes, une rponse humorale avec anticorps anti-H-2 tait dcelable. Les tudes de greffes de peau intrafamiliales chez des volontaires, puis les rsultats de la transplantation rnale ont permis de considrer le systme HLA comme le systme majeur rgissant les lois de la compatibilit tissulaire. La gure 6 montre la grande supriorit des rsultats des greffes rnales lorsque les deux haplotypes HLA sont identiques chez le donneur et le receveur. En situation familiale, le meilleur donneur en termes de survie de fonction du greffon est le germain HLA-identique. La survie des greffes haplo-identiques est moins longue. La survie des reins de donneurs cadavriques a augment rgulirement depuis ces 20 dernires annes. La matrise des traitements de trithrapie immunosuppressive (incluant notamment la ciclosporine A), la qualit des typages HLA de classes I et II avec ventuel recours aux techniques didentication des gnes, ont en effet permis dimportants gains de survie de fonction (g 7). La compatibilit HLA a t diversement apprcie quant son rel impact sur la survie des greffons, et ce en raison notamment de

lhtrognit des pratiques de greffe, de la qualit des typages HLA des donneurs et receveurs, et donc de leur appariement. La grande majorit des tudes rtrospectives montre bien encore leffet bnque dune bonne compatibilit HLA sur la survie du greffon, avec un effet plus marqu de la compatibilit pour les marqueurs classe II [51]. De mme, une limitation du nombre des incompatibilits HLA, en particulier de classe I, rduira le spectre dimmunisation en cas dchec, facilitant les greffes ultrieures. Toutes ces donnes justient la poursuite dchanges dorganes sur la base de la recherche du meilleur receveur compatible HLA [47]. Ltablissement franais des greffes (EFG) nonce, pour chaque type dorgane, et de manire rgulire, les rgles dchanges dorganes. Limmunisation prgreffe vis--vis de marqueurs HLA de classes I et II, due des transfusions, des grossesses et/ou des transplantations antrieures, doit tre rgulirement dtecte et identie par des tests biologiques rpts (g 8). Ces recherches visent identier des anticorps anti-HLA dont la spcicit doit faire refuser toute greffe avec un donneur portant la (ou les) spcicit(s) antignique(s) HLA correspondante(s). De plus, et imprativement, en transplantation rnale, un test ultime de compatibilit HLA (test de cross-match) est ralis entre les cellules lymphocytaires du donneur et les srums reprsentatifs des immunisations du receveur (g 9). Dautres paramtres composantes immunologiques ont t nots comme inuenant la survie des greffes rnales. Cest le cas des transfusions sanguines (concentrs globulaires non dleucocyts) ralises avant la greffe, au moins 3 semaines avant celle-ci. Cet effet bnque not dans les annes 1970 sest cependant attnu. Les risques dallo-immunisation anti-HLA dune part, et de transmission dinfections virales toujours possible dautre part, devraient faire limiter le recours des protocoles de transfusions systmatiques. Enn, bien dautres paramtres inuencent la survie des greffons, dont lge du donneur et du receveur. Les bases molculaires du rejet dallogreffe sont de mieux en mieux connues et individualisent deux voies dalloreconnaissance, dites directe et indirecte [30]. Elles prcisent le rle des diffrents rcepteurs et ligands impliqus dans la rponse allognique et le rejet, initis par la reconnaissance par les lymphocytes T (T4 et T8)
11

13-000-M-53

Systme HLA

Hmatologie

du caractre non-soi des lments greffs. Les diffrents immunosuppresseurs utiliss dans la lutte antirejet (corticostrodes, azathioprine, srum antilymphocytaire, ciclosporine, FK-506, anticorps monoclonaux) sont slectionns pour leurs actions complmentaires sur la rponse du rejet.
HLA ET GREFFE DE MOELLE

Les greffes de moelle osseuse ou de cellules souches hmatopotiques (CSH) allogniques reprsentent une alternative thrapeutique majeure dans le traitement dhmopathies malignes ou de dcits immunitaires svres, notamment. Les premires greffes datent de plus de 40 ans et furent ralises avec succs chez des enfants souffrant de dcits immuns congnitaux. Depuis, le nombre de greffes ralises annuellement crot rgulirement. Ainsi, dans le monde, plus de 16 000 greffes allogniques furent ralises en 1997 (contre 28 000 greffes autologues). Au plan immunologique, la greffe de moelle osseuse allognique, qui met en prsence deux systmes immunitaires gntiquement diffrents, est expose des conits de plusieurs origines : la raction de lhte contre le greffon ou rejet, la raction du greffon contre lhte (GvH). Dans le cas de la raction GvH, des effets bnques lis cette ractivit allognique particulire peuvent tre observs sur la prise du greffon et vis--vis des cellules malignes. Cette activit antitumorale est note greffon contre leucmie (graft versus leukemia [GvL]). Pour ces raisons, seule lutilisation de greffons HLA identiques au receveur a permis les succs de ces greffes. En pratique, seulement 30 % environ des patients en attente de greffe de CSH disposent dun donneur familial HLA identique (greffe familiale dite gno-identique ). Ceci a conduit la constitution de chiers de donneurs de moelle non apparents. Une soixantaine de chiers recensent plus de 6 millions de donneurs volontaires dans le monde. Ces donneurs, dont les groupages HLA sont disponibles, sont utiliss en labsence de donneurs familiaux HLA identiques. Ainsi, en 1997, plus de 3 500 greffes dites chiers furent ralises avec des greffons de donneurs non apparents. Les identits HLA sont primordiales dans ces greffes dites phno-identiques , et ce pour le maximum de loci de classe I (HLA-A, -B et -C) et de classe II (HLA-DR, -DQ et si possible -DP) [62]. Les leucmies restent les indications les plus frquentes des greffes de CSH allogniques non apparentes. Chez les enfants, plus de 60 % de ces greffes sont ralises pour des patients atteints de leucmies aigus. Chez les adultes, plus de 30 % des greffes sont ralises pour des patients atteints de leucmie mylode chronique (donnes France-Greffe de moelle, 1998). Le dveloppement de cette thrapeutique dans les 10 dernires annes permet aujourdhui une meilleure comprhension des mcanismes dacceptation, de rejet de greffe ou de maladie GvH. En termes de rsultats, de nombreux paramtres sont prendre en compte (maladie initiale et son stade dvolution, ge du patient, notamment). Lhistocompatibilit HLA doit tre considre, dans les cas de donneurs non apparents, sous langle de typages raliss en utilisant les techniques de biologie molculaire bases sur des amplications par PCR et si ncessaire sur le squenage. Ainsi, il apparat que : les identits pour les loci HLA-DRB1 et -DQB1 rduisent les risques de maladie GvH et augmentent la survie ; les checs de greffes sont souvent le fait de disparits HLA de classe I ; ces marqueurs doivent tre dsormais valus au niveau alllique ; les risques pour les receveurs hommes qui reoivent un greffon dune donneuse sont plus levs que pour toutes autres combinaisons ; des disparits pour des antignes mineurs dhistocompatibilit (AMH) sont des risques potentiels de maladie GvH. En dehors de ceux lis au chromosome Y (HY), cinq AMH, actuellement rfrencs HA-1, -2, -3, -4 et -5, sont en partie dnissables par des techniques PCR.
12

Les identits immunogntiques HLA paraissent encore indispensables. Nanmoins, certaines greffes ralises, faute de donneurs HLA identiques, apparents ou non (35 % des cas), avec des incompatibilits au niveau alllique, laissent entrevoir quelques possibilits avec des protocoles de conditionnement et ladministration de trs grandes quantits de CSH (CD34+) [2]. Dautre part, il est dmontr quen greffe autologue, les CSH issues du sang priphrique et mobilises par ladministration de facteurs stimulants chez le donneur conduisent une colonisation plus rapide en cellules hmatopotiques par rapport la greffe de CSH de moelle osseuse. Ces rsultats semblent se conrmer galement en situation de greffe allognique avec donneur apparent HLA identique. La reconstitution hmatopotique est plus rapide pour les neutrophiles et les plaquettes, la numration des lymphocytes est plus leve et la dure dhospitalisation moindre, par comparaison la greffe de CSH mdullaires qui, de plus, conduirait une probabilit de rechute plus leve. Nanmoins, la frquence dapparition de maladies GvH aigus ou chroniques, ainsi que le taux de survie, seraient comparables dans ces deux modalits de greffes [55], mais ceci reste conrmer. Enn, une autre alternative repose sur lutilisation du sang de cordon comme une source potentielle de CSH du fait de la richesse en progniteurs CD34+. De plus, limmaturit immunologique des cellules comptentes reprsente un avantage face au risque de maladie GvH. En situation familiale, cette greffe obtient de bons rsultats. Les banques de sang de cordon permettent de raliser des greffes en situation non apparente. Les rsultats obtenus dans une srie de 562 greffes de sang placentaire non apparent font tat dune prise de greffe dans 80 % des cas j42 aprs la greffe, dun faible taux de maladie GvH (23 % de stades III + IV), dont la svrit augmente avec lge du patient et le degr dincompatibilit HLA [60]. Les taux de survie sont voisins de ceux nots avec des greffons mdullaires de donneurs non apparents. Ce type de greffe est encore limit aux indications pdiatriques ou aux receveurs de faible poids.
ASSOCIATIONS HLA ET MALADIES

Considrations gnrales
Lexistence dun systme immunogntique trs polymorphe et aux fonctions immunitaires primordiales dans linitiation et le contrle de la rponse immune a encourag trs tt des travaux de recherche de susceptibilit certaines affections. Lexemple est venu de travaux chez la souris (1964) o la susceptibilit dvelopper une leucmie viro-induite (virus de Gross) dpendait du systme H-2 et de lhaplotype H-2k. Deux publications franaises dmontraient, la n des annes 1960, que des associations maladies et HLA pouvaient tre attendues (maladie de Hodgkin et leucmie aigu lymphoblastique). Le vritable impact dans ce domaine concerne lassociation HLA et spondylarthrite ankylosante, rapporte la mme anne (1973) par deux quipes indpendantes. Les premires vidences de liaison gntique avec des marqueurs du CMH furent dabord dcrites lors dun congrs international HLA-maladies, tenu Paris en 1976, puis rgulirement lors des diffrents workshops-HLA. En 1985, plus de 500 tudes rapportaient, dans des domaines trs varis de la pathologie, des associations HLA-maladies [67]. Pour la plupart, lassociation exprime en termes de risque relatif (RR) restait faible, voire quelquefois inrme par dautres tudes. Pour dautres maladies, beaucoup moins nombreuses, ces associations taient fortes et retrouves dans diffrentes ethnies. Elles ont du reste t conrmes rgulirement lors de nouvelles valuations utilisant les nouveaux outils de typage de la biologie molculaire des gnes HLA. Le tableau VI rapporte les principales associations HLA-maladies, dont le RR est lev et conrm par de nombreux travaux. Ce dernier point est dimportance pour viter les nombreux piges de ce genre dtude. Le principe consiste comparer les frquences des antignes HLA de un ou plusieurs locus (A, B, DR, DQ) observes dans une population de malades, celles observes dans une

Hmatologie

Systme HLA

13-000-M-53

Tableau VI. Principales associations HLA (antignes) et maladies (daprs J Hors, in HLA complexe majeur dhistocompatibilit de lhomme, J Dausset et M Pla eds. Mdecine-Sciences Flammarion, 1989).
Frquences % HLA
A1 A2 A3 A29 B5(51) B14 B27 Maladie de Hodgkin Dcit en IgA Sarcome Hmochromatose idiopathique Rtinopathie Bird Shot Maladie de Behet Dcit en 21-OH (forme tardive) Spondylarthrite ankylosante Syndrome de Reiter Uvite antrieure Thyrode de De Quervain Cancer du nasopharynx Dcit en 21-OH (forme prcoce congnitale) Psoriasis Narcolepsies Caucasode Asiatique (Japon) Sclrose en plaques Nvrite optique Syndrome de Goodpasture Diabte insulinodpendant (type 1) Lupus rythmateux dissmin Thyrodite de Hashimoto Maladie de Basedow Maladie dAddison Myasthnie Syndrome Gougerot-Sjgren Dermatomyosite Dermatite herptiforme Purpura allo-immun Glomrulonphrite extramembraneuse Maladie cliaque Cirrhose biliaire primitive Hpatite chronique active Diabte insulinodpendant (type 1) Maladie cliaque Polyarthrite rhumatode Maladie de Berger Pemphigus Sarcome de Kaposi Sminome Sida Cancer thyrode Syndrome nphrotique de lenfant (corticosensible) Arthrite juvnile Leucmie HTLV1 Maladie de Hodgkin Leucmie aigu lymphoblastique 12 2

Maladies
Mal 40 81 80 76 80 41 72 90 79 52 70 36 9 87 92 100 59 46 88 10 70 64 56 69 50 79 50 85 94 75 79 57 37 32 34 50 49 87 61 46 42 52 75 28 75 T 32 25 40 28 7 10 6 9 9 9 15 23 1 33 10 17 26 26 32 30 28 24 26 26 28 26 21 26 15 20 26 15 21 0 1 19 19 32 26 21 20 23 30 5 44

RR*
2 13 6 8 50 6 40 88 37 10 14 2 16 13 94 943 4 2 16 0,2 6 3 4 6 3 10 4 15 72 12 11 8 2 47 60 4 4 14 4 3 3 4 7 7 7 2 7

B35 B46 B47 Cw6 DR2(15)

DR3

DR3+4 DR3+7 DR4

DR5

DR7 DR8 DQ3 DP3 (DPB1*03) DP5

*RR : risque relatif. Il exprime un facteur multiplicateur du risque dtre atteint de la maladie pour un sujet portant lantigne en question par rapport au risque existant pour un sujet ne portant pas cet antigne ; (Ig : immunoglobuline ; sida : syndrome de limmunodcience acquise).

Calcul du RR =

(frquence fm de l'antigne chez les malades) x (1-ft) (frquence ft de l'antigne chez les tmoins) x (1-fm)

population tmoin. Les critres de slection des malades, des tmoins, de leur recrutement gographique, le choix des tests statistiques appropris et la qualit des techniques de typage retenues sont autant de biais possibles pour des quipes non avises. En nal, lexpression peut se faire laide du test du chi-2, ou mieux en utilisant la mthode de Woolf et lexpression du RR. Celui-ci

exprime simplement combien de fois est plus frquente une maladie chez les individus ayant un antigne donn que chez ceux qui ne lont pas [32]. Lorsque lon tudie non plus des populations mais des familles, on teste en ralit si la frquence de la transmission dun caractre
13

13-000-M-53

Systme HLA

Hmatologie

gntique, en loccurrence un antigne ou un haplotype HLA, en mme temps que la maladie est le fait du hasard ou non. La mthode dite des lod scores est largement utilise dans ce cas, ainsi que les mthodes des haplotypes transmis (transmission disequilibrium test [TDT]) ou des haplotypes partags avec le propositus (identity by descent [IBD]) notamment. Les mthodes danalyse du polymorphisme des gnes ont aussi apport des progrs dcisifs. Les techniques dites RFLP, PCR ou squenage de gnes, et plus rcemment celles utilisant des polymorphismes de rptition (microsatellites), reprsentent des outils dune prodigieuse efficacit. Les maladies associes HLA sont le plus souvent le rsultat dinteraction de plusieurs gnes avec, dans le cas des maladies autoimmunes, lintervention de facteurs environnementaux. Mais il semble bien que les gnes du systme HLA jouent un rle majeur dans ces prdispositions gntiques. Ainsi, dans le diabte insulinodpendant de type 1, le taux de concordance pour des jumeaux monozygotes est de 40-45 %. Pour des frres ou surs HLA identiques, ce taux est de 20 % compar au taux de 1 % dans le cas de non-identit HLA (deux haplotypes diffrents) entre individus dune mme fratrie.

Dans le cas de la polyarthrite rhumatode, la susceptibilit a trs tt t rapporte comme associe lantigne DR4. La biologie molculaire du gne DR4 a t plus prcise en mettant en cause, chez les caucasodes, certains variants DR4 (nots DRB1*0401, *0404, *0405 et *0408), mais aussi du fait didentit de squence de la chane b de la molcule DRB1 avec certains autres variants de molcules DR1 (DRB1*0101) ou DR14 (DRB1*1402), selon lorigine ethnique. L encore, il est dmontr que seules des rgions limites de la molcule de classe II sont engages dans cette susceptibilit [64]. Pour dautres maladies auto-immunes, telles que la sclrose en plaques et larthrite rhumatode juvnile, lassociation avec une molcule HLA donne est aussi tablie, mme si les squences dacides amins impliqus ne sont pas encore clairement spcies. Dans ces associations HLA-maladies, plusieurs mcanismes peuvent tre invoqus o les molcules HLA, prsentatrices de peptides, jouent un rle majeur. Dautres gnes proches des gnes HLA dans le CMH pourraient galement jouer un rle en raison de leur polymorphisme (gnes du TNF par exemple).
HLA ET CANCER

Principaux exemples dassociations HLA-maladies


Avec des marqueurs HLA de classe I Lassociation HLA B27 et spondylarthrite ankylosante est la plus ancienne et lune des plus fortes, puisque plus de 90 % des patients sont B27 positifs. La biologie molculaire, qui permet dindividualiser aujourdhui plus de 13 variants allliques B27, nobjective toutefois pas dallles rsistants, sauf le variant B*2709 semble-t-il. Dautre part, certains allles B27 pourraient exposer un risque moindre (B*2703, B*2706 et B*2708), laissant entrevoir que des changements de squences, mme minimes, dans la molcule B27 (chane lourde), conduiraient des modications de degr de susceptibilit lies des spcicits diffrentes de prsentation peptidique [11]. Deux autres maladies sont fortement associes des antignes HLA de classe I : la maladie de Behet avec lantigne B51 et le psoriasis avec le marqueur HLA-Cw6. Avec des marqueurs HLA classe II Malgr leur modalit de prsentation de peptides exognes, peu de maladies bactriennes montrent dassociation de susceptibilit avec un antigne classe II, except la lpre. Lessentiel des maladies associes aux antignes HLA de classe II appartient aux maladies auto-immunes. Malgr les mcanismes de tolrance aux protines du soi, un petit nombre de peptides est potentiellement en mesure dtre mis en cause. Dans le cas du diabte insulinodpendant (de type I), de trs nombreux travaux, collaboratifs ou non, ont rapport lassociation avec des marqueurs HLA de classe I dabord (A1, B8). En ralit, cette association est plus troite avec des marqueurs de classe II par le jeu de dsquilibre de liaison. Ainsi, les sujets DR3 ou DR4, ou surtout DR3 et DR4, sont-ils trs exposs. L encore, le dsquilibre de liaison DR4 et DQ3 a montr que cette dernire molcule jouait un rle prpondrant. Lhtrognit de la molcule DQ3 a rvl une susceptibilit diffrentielle selon le sous-type DQ3 considr. Le variant DQ8 srologique (ou DQB*0302 en biologie molculaire) est associ trs fortement la susceptibilit, ce qui nest pas le cas du variant DQ7 (DQB*0301). Ds 1987, Todd montrait limportance des squences dacides amins de la chane b de la molcule DQ [68]. Les sujets possdant un acide aspartique en position 57 de cette chane b-DQ sont rsistants. La chane a de cette mme molcule DQ est galement implique dans la susceptibilit au diabte insulinodpendant par la nature de lacide amin en position 52. La prise en compte de la nature de ces deux rsidus amins critiques (AA57-b et AA52-a) permet dexpliquer un trs grand nombre de cas de susceptibilits ou de rsistances, indpendamment de lorigine ethnique [34].
14

Lexpression des molcules HLA de classe I joue un rle crucial dans la rponse antitumorale. Une diminution de cette expression, corrle souvent lexpression de diffrents oncognes, est observable dans de nombreuses cellules tumorales. Cette observation fut note pour la premire fois en 1976 pour des cellules de lymphomes murins, et retrouve ensuite dans des tumeurs solides humaines. Cette baisse dexpression la surface des cellules leur permettrait dchapper la lyse immunologique par les cellules lymphocytaires T cytotoxiques. Lors du dernier workshop-HLA (1996), la slection de techniques visualisant la perte dexpression des molcules HLA de classe I par les cellules tumorales (immunohistomarquage, cytomtrie en ux) a permis, avec lutilisation danticorps monoclonaux, de standardiser ces mesures de quantication. Dans ce travail collaboratif, plusieurs types de tumeurs solides ont t valus. De 40 90 % de ces tumeurs possdaient des altrations dans lexpression des marqueurs de classe I, selon les tissus considrs. Ces altrations se feraient notamment lorsque apparaissent des mtastases. Diffrents mcanismes peuvent conduire ce dfaut partiel ou total dexpression, puisque cette perte peut tre objective des stades diffrents de la synthse, du transport ou de lexpression cellulaire de ces molcules de classe I. Des mutations de gnes (chane lourde a ou b 2m ), des altrations de facteurs de rgulation, de glycosylation ou de transport sont mises en cause. La non-expression de ces molcules, qui sont des lments de restriction de la reconnaissance lymphocytaire T, rend plus difficile la destruction des cellules tumorales par les lymphocytes T. Une slection immunologique de ces clones HLA-dcitaires conduirait une invasion tissulaire de cellules tumorales favorisant leur diffusion. Les cellules NK interviennent dans la destruction de cellules tumorales ou de cellules infectes par des virus. Elles reprsentent 5 10 % des cellules lymphodes de lorganisme et sont actives par labsence ou la modication des molcules de classe I la surface de leur cible. Cette cytotoxicit NK serait, chez lhomme, complmentaire de limmunit T et B. Il faut noter que ces cellules NK ne reconnaissent jamais des cibles cellulaires autologues normales. Les cellules NK, chez lhomme, expriment plusieurs familles de rcepteurs des molcules HLA de classe I. Ces rcepteurs sont cods par des gnes prsents sur le chromosome 19q13.4 et nots KIR et ILT/LIR, ou sur le chromosome 12p12.13 et nots CD94/NKG2 (cf supra). Ces deux groupes apparaissent htrognes fonctionnellement, puisque certains rcepteurs pourraient avoir une action activatrice de lyse. Il a t bien dmontr que les molcules HLA de classe I modulent lactivit NK par interaction avec des rcepteurs inhibiteurs ou activateurs des cellules NK (cf supra).

Hmatologie
HLA EN PRATIQUE TRANSFUSIONNELLE

Systme HLA

13-000-M-53

Les transfusions de sang total induisaient, il y a encore quelques annes, une frquente immunisation anti-HLA en raison de la nondleucocytation systmatique des produits transfuss. Dsormais, lexclusion de certaines indications thrapeutiques (dont les transfusions dnies dans des protocoles de transfusions avant greffe rnale), les concentrs globulaires sont dleucocyts. De mme, lutilisation de plaquettes daphrse avec donneur unique contribue rduire ce risque dimmunisation et ses complications de type frisson-hyperthermie. Ces symptmes sont attribus la libration de substances pyrognes, suite la lyse des polynuclaires transfuss. La dleucocytation se rvle un moyen efficace pour rduire ces allo-immunisations et diminuer la frquence des tats rfractaires aux transfusions de plaquettes. Ainsi, dans une tude rcente, il est montr que le risque dimmunisation anti-HLA avec des produits ltrs (plaquettes et globules rouges) laissant moins de 5 x 106 leucocytes est de moins de 3 % chez des sujets non antrieurement stimuls (par des grossesses et/ou des transfusions antrieures) [48]. Nanmoins, ce risque augmente 36 % chez des sujets pralablement stimuls (notamment par des grossesses antrieures). Dautre part, la transfusion danticorps anti-HLA ventuellement prsents chez le donneur, et surtout danticorps antineutrophiles, peut provoquer un dme pulmonaire non cardiognique avec vre. Enn, la transfusion sanguine peut tre responsable dune GvH aigu, souvent fatale. Ce risque est extrmement rare et serait plus souvent observ en cas dhomozygotie HLA du donneur pour un haplotype, alors que le receveur partage cet haplotype. Une prvention possible de ce risque existe et consiste irradier le sang transfus. Cette attitude est systmatique lorsque le receveur est immunodprim [75].
HLA ET GROSSESSE

polymorphisme et de la transmission en bloc (haplotypique) de lensemble de ses marqueurs prsents sur le chromosome 6. Les techniques dtude du polymorphisme au niveau gnomique permettent lidentication rgulire de nouveaux allles dans chaque srie (A, B, C, DR, DQ et DP) lors dtudes anthropologiques largies (tudes workshop). De mme, lidentication de nouveaux gnes dans cette rgion CMH, mme si leur polymorphisme est plus limit, apporte encore plus dintrt cette rgion chromosomique. Les rares recombinaisons chromosomiques entre marqueurs de cette rgion HLA, le dsquilibre de liaison caractristique de certains haplotypes, les variations de frquences dallles selon les origines ethniques, les rsistances ou susceptibilits aux maladies, reprsentent des lments dtudes et de comprhension de la dynamique des populations. Ltude HLA-Provinces franaises (1981-1985) a permis dtablir des ressemblances gntiques entre des rgions franaises et le Qubec [53]. Enn, le polymorphisme HLA et la raret de certains allles donnent ce systme immunogntique une trs grande valeur informative dans lexpertise mdicolgale applique, par exemple, la recherche ou lexclusion de paternit.

Conclusion
Le complexe majeur dhistocompatibilit de lhomme reprsente une rgion du bras court du chromosome 6, capitale dans la rponse immunitaire. Non seulement la densit en gnes fonctionnels, mais aussi la fonctionnalit des produits correspondants, expliquent lintrt croissant port par les immunologistes cette rgion du gnome. La duplication et la spcialisation de chaque locus pour des fonctions impliques dans la prsentation dantignes peptidiques aux lymphocytes T, dans la surveillance antitumorale, ou encore dans la rponse allognique expliquent la diversit ou polymorphisme des marqueurs de ce systme HLA. Si la description de ces polymorphismes molculaires et gniques est lobjet de performances sans cesse amliores, cest aujourdhui limpact fonctionnel de ce polymorphisme qui attire toutes les attentions en clinique. Ainsi, la transplantation dorgane, et plus encore la greffe de moelle osseuse se sont dveloppes grce une meilleure dnition du polymorphisme HLA. Les tudes des squences des antignes et des gnes HLA impliqus dans la susceptibilit ou la rsistance certaines maladies (essentiellement auto-immunes) expliquent molculairement les mcanismes de prsentation spciques de peptides. Les connaissances biochimiques et structurales des molcules HLA objectivent la localisation de zones fonctionnellement mises en jeu dans laccrochage de peptides et dans la reconnaissance T. Mme si ces marqueurs HLA ne sont pas seuls en cause dans ces susceptibilits, la slection observe de certains allles HLA est remarquable. Elle assure ainsi certaines populations une protection contre des pathognes environnementaux. Enn, plus rcemment, les fonctions des molcules HLA se sont enrichies et diversies. Dans ce contexte, les mcanismes de cytotoxicit NK donnent un rle cl aux molcules HLA. Ainsi, il est dsormais bien tabli que la balance des effets inhibiteurs ou activateurs de lyse NK est sous contrle de lexpression par les cellules cibles potentielles, de molcules HLA de classe I. Des cellules tumorales ou infectes par des virus dont lexpression HLA de classe I est dcitaire seraient ainsi lyses et limines par lactivation des cellules NK. Quels que soient les mcanismes lis cette diminution, il apparat que ces dcits observs sont prdictifs de mauvais pronostic. Des interventions immunothrapeutiques visant restaurer une expression HLA normale pourraient alors se rvler dun grand intrt clinique.

La gestation est une situation physiologique particulire de greffe semi-allognique tolre au moins pendant la grossesse. Sil existe bien une rponse humorale contre des antignes ftaux (exemple de lanmie hmolytique du nouveau-n par immunisation antiRhsus), les rponses cellulaires maternelles par lymphocytes T cytotoxiques sont sans effet. Cette particularit immunologique de lallogreffe ftale avait t note ds 1953 par Medawar. Labsence dexpression des antignes HLA de classe I classiques (HLA-A, -B, -C) par le trophoblaste protgerait le ftus, dont les antignes HLA sont bien exprims, dune rponse allognique cellulaire. Le clonage rcent du gne HLA non classique not HLA-G (1987) a permis de prciser le rle de cette nouvelle molcule exprime transitoirement par le trophoblaste, comme cela a t montr partir de 1990 [38]. HLA-G participerait au maintien dun tat de tolrance entre la mre et lenfant en anergisant la rponse maternelle antipaternelle. Toutefois, lexpression de HLA-G disparat des cellules du cytotrophoblaste extravilleux lors de prclampsies de n de grossesse. Le rle fonctionnel de HLA-G comme lment de tolrance immune pendant la grossesse est encore difficile prciser. Il nest probablement pas univoque, puisque les donnes rcentes montrent que cette molcule HLA non classique est en mesure de prsenter des peptides et quelle est aussi capable dinhiber lactivit NK des grands lymphocytes granulaires dciduaux. Un dfaut dexpression de cette molcule peut-il expliquer une partie des avortements rptition dorigine immunologique ? Dans cette pathologie, dautres mcanismes sont proposs comme des phnomnes auto-immuns ou lis une identit HLA entre poux. Diverses tudes statistiquement signicatives ont conrm cette dernire hypothse et, en particulier, le rle des identits pour les marqueurs HLA de classe II, ainsi que labsence dimmunisation anti-HLA [18].
HLA ET POPULATION

Le systme HLA sest trs vite rvl extrmement prcieux pour les gnticiens de populations, en raison de son trs grand

Remerciements au Docteur MM Tongio (Strasbourg) dont le support, les conseils et la collaboration la rdaction du chapitre Rgulation dexpression... ont t prcieux.

15

13-000-M-53

Systme HLA

Hmatologie

Rfrences
[1] Androlewicz MJ, Orthmann BN, VanEndert PM, Spies T, Cresswell P. Characteristics of peptides and major histocompatibility complex class I/b2 microglobuline to the transporters associated with antigen processing (TAP1 and TAP2). Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 91 : 12716-12720 [2] Aversa F, Tabilio A, Velardi A, Cunninghma, I, Terenzi A, Falzetti F et al. Treatment of high-risk acute leukemia with T-cell-depleted stem cells from related donors with one fully mismateched HLA haplotype. N EnglJ Med 1998 ; 339 : 1186-1193 [3] Bach FH, Reinsmoen N. The role of HLA-DR and HLA-DQ products in T lymphocytes activation and in contributing to Dw specicities . Hum Immunol 1986 ; 16 : 271-275 [4] Bahram S, Bresnahan M, Geraghty DE, Spies T. A second lineage of Mamalian major histocompatibility complex class I genes. Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 91 : 6259-6263 [5] Bignon JD. Contribution ltude du polymorphisme des gnes HLA de classe II en biologie molculaire. [thse], Universit de Nantes, 1992 : 1-230 [6] Bignon JD, Chneau ML, Herry P, Bonneville F, Cesbron A, Muller JY. Strong linkage disequilibrium of HLA DPw11 with the HLA B44-DR7-DQw2 extended haplotype. Tissue Antigens 1992 ; 39 : 35-37 [7] Bignon JD, Fernandez-Via M. Protocols of the 12th international histocompatibility workshop for typing of HLA class II alleles by DNA amplication by the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization with sequence specic oligonucleotide probes (SSOP). In : Charron D ed. HLA1996: genetic diversity of HLA, functional and medical implications. Paris : EDK, 1997 : 584-595 [8] Bignon JD, Semana G, Tiercy JM, Simons M, Lalouel JM, Cohen D. DNA-RFLP analysis: HLA-DR beta Workshop report. In : Dupont B ed. Immunobiology of HLA. New York : Springer-Verlag, 1989 : 851-860 [9] Bjorkman PJ, Saper MA, Samraoui B, Bennett WS, Strominger JL, Wiley DC. Structure of the human class I histocompatibility antigen HLA -A2. Nature 1987 ; 329 : 506-511 [10] Bodmer JG, Marsh SGE, Albert ED, Bodmer WF, Bontrop RE, Dupont B et al. Nomenclature for factors of the HLA system,1998. Tissue Antigens 1999 ; 53 : 407-446 [11] Boisgrault F, Tieng V, Stolzenberg MC, Dulphy N, Khalil I, Tamouza R et al. Differences in endogenous peptides presented by HLA-B*2705 and B*2703 allelic variants. Implications for susceptibility to spondylarthropathies. JClin Invest 1996 ; 98 : 2764-2770 [12] Braud VM, Allan DS, McMichael AJ. Functions of nonclassical MHC and non-MHC-encoded class I molecules. Curr Opin Immunol 1999 ; 11 : 100-108 [13] Braud VM, Allan DS, OCallaghan CA, Sderstrm K, DAndrea A, Ogg GS et al. HLA-E binds to natural-killer cell receptors CD94/NKG2A, B and C. Nature 1998 ; 391 : 795-799 [14] Brown JH, Jardetzky TS, Gorga JC, Stern LJ, Urban RG, Strominger JL et al. Three dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA -DR1. Nature 1993 ; 364 : 33-39 [15] Bugawan TL, Saiki RK, Levenson CH, Watson RM, Erlich HA. The use of non-radioactive oligonucleotide probes to analyse enzymatically amplied DNA for prenatal diagnosis and forensic HLA typing. Biotechnology 1988 ; 6 : 943-947 [16] Cesbron A, Moreau PH, Milpied N, Harousseau JL, Muller JY, Bignon JD. Crucial role of the 3rd and 4th hypervariable regions of HLA-DPB1 allelic sequences in the mixed lymphocyte reaction. Hum Immunol 1992 ; 33 : 202-207 [17] Charron D, Lotteau V, Turmel P. Hybrid HLA-DC antigens provide molecular evidence for gene trans-complementation. Nature 1994 ; 312 : 157-159 [18] Christiansen OB, Andersen HH, Hojbjerre M, Kruse TA, Lauritzen SL, Grunnet N. Maternal HLA class II allogenotypes are markers for the predisposition to fetal losses in families of women with unexplained recurrent fetal loss. Eur J Immunogen 1995 ; 22 : 323-334 [19] Colombani J. HLA : fonctions immunitaires et applications mdicales. Paris : John Libbey Eurotext, 1993 : 23-30, 39-47, 69-77 [20] Cresswell P. Invariant chain structure and MHC class II function. Cell 1996 ; 84 : 505-507 [21] Dausset J. Iso-leuco-anticorps. Acta Haematol 1958 ; 20 : 156-160 [22] Davis MM, Bjorkman PJ. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature 1988 ; 334 : 395-401 [23] De La Salle H, Donato L, Zimmer J, Plebani A, Hanau D, Bonneville M et al. HLA class I deciencies. In : Ochs HD, Smith CI, Puck J eds. Primary immunodeciency diseases. New York : Oxford University Press, 1999 : 181-187 [24] Doherty PC, Zinkernagel RM. Enhanced immunological surveillance in mice heterozigous at the H-2 gene complex. Nature 1975 ; 256 : 50-52 [25] Feder JN, Gnirke A, Thomas W, Tsuchihashi Z, Ruddy DA, Basava A et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet 1996 ; 13 : 399-408 [26] Garcia KC, Degano M, Speir JA, Wilson IA. Emerging principles for T-cell receptor recognition of antigen in cellular immunity. Rev Immunogenet 1999 ; 1 : 75-90 [27] Garrido F, Ruiz-Cabello F, Cabrera T, Prez-Villar JJ, LopezBotet M, Duggan-Keen M et al. Implications for immunosurveillance of altered HLA-class I phenotypes in human tumors. Immunol Today 1997 ; 18 : 89-95 [28] Germain RN, Margulies DH. The biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation. Annu Rev Immunol 1993 ; 11 : 403-450 [29] Ghosh P, Amaya M, Mellins E, Wiley DC. The structure of an intermediate in class II MHC maturation: CLIP bound to HLA-DR3. Nature 1995 ; 378 : 457-462 [30] Gould DS, Auchincloss H. Direct and indirect recognition: the role of MHC antigens in graft rejection. Immunol Today 1999 ; 20 : 77-82 [31] Hmmerling GJ, Vogt AB, Kropshofer H. Antigen processing and presentation-towards the Millenium. Immunol Rev 1999 ; 172 : 5-9 [32] Hors J. HLA et maladies, un anniversaire. Presse Md 1997 ; 26 : 1300-1302 [33] Jensen PE. HLA-DO a hitchhiking inhibitor of HLA-DM. Curr Biol 1998 ; 8 : R128-R131 [34] Khalil I, DAuriol L, Godet M, Morin L, Lepage V, Deschamps I et al. A combination of HLA-DQb Asp57-negative and HLA-DQa a Arg 52 confers susceptibility to insulindependent diabetes mellitus. J Clin Invest 1990 ; 85 : 1315-1319 [35] Khalil I, Deschamps I, Lepage V, Al-Daccak R, Degos L, Hors J. Dose effect of cis and trans-encoded HLA-DQb b heterodimers in IDDM susceptibility. Diabetes 1992 ; 41 : 378-384 [36] Knowles RW. Structural polymorphism of the HLA class II a and b chains: summary of the 10th workshop 2-D gel analysis. In : Dupont B ed. Immunobiology of HLA. New York : Springer-Verlag, 1989 : 365-380 [37] Lanier LL, Corliss B, Philipps JH. Arousal and inhibition of human NK cells. Immunol Rev 1997 ; 155 : 145-154 [38] Le Bouteiller P. HLA-G: on the track of immunological functions. Eur J Immunogen 1997 ; 24 : 397-408 [39] Le Bouteiller P, Lenfant F. Gne HLA-G : le plus classique des non-classiques. Md/Sci 1997 ; 12 : 1436-1444 [40] Lebron JA, Bennet MJ, Vaughn DE, Chirino AJ, Snow PM, Mintier GA et al. Crystal structure of the hemochromatosis protein HFE and characterization of its interaction with transferrin receptor. Cell 1998 ; 93 : 111-123 [41] Madden D, Gorga J, Strominger J, Wiley D. The structure of HLA-B27 reveals nonamer self-peptides bound in an extended conformation. Nature 1991 ; 353 : 321-325 [42] Maeda M, Murayama N, Ishii H, Uryu N, Ota M, Tsuji K et al. A simple and rapid method for HLA-DQA1 genotyping by digestion of PCR-amplied DNA with allele specic restriction endonucleases. Tissue Antigens 1989 ; 34 : 290-298 [43] Magor KE, Taylor EJ, Shen SY, Martinez-Naves E, Valiante NM, Wells RS et al. Natural inactivation of a common HLA allele (A*2402) has occured on at least three separate occasions. J Immunol 1997 ; 158 : 5242-5250 [44] McCluskey J, Peh CA. The human leucocyte antigens and clinical medicine: an overview. Rev Immunogenet 1999 ; 1 : 3-20 [45] McDonald JC, Adamashvili I. Soluble HLA: a review of the literature. Hum Immunol 1998 ; 59 : 387-403 [46] MHC Sequencing Consortium. Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. Nature 1999 ; 401 : 921-923 [47] Morris PJ, Johnson RJ, Fuggle SV, Belger MA, Briggs JD. Analysis of factors that affect outcome of primary cadaveric renal transplantation in the UK. Lancet 1999 ; 354 : 1147-1152 [48] Novotny VM, Van Doorn R, Withvliet MD, Claas FH, Brand A. Occurrence of allogeneic HLA and non-HLA antibodies after transfusion of prestorage ltered platelets and red blood cells: a prospective study. Blood 1995 ; 85 : 1736-1741 [49] Olerup O, Troye-Blomberg M, Schreuder GM, Riley EM. HLA-DR and DQ gene polymorphism in West Africans is twice as extensive as in North European Caucasians: evolutionary implications. Proc Natl Acad Sci USA 1991 ; 88 : 8480-8484 [50] Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplication with sequence-specic primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical pratice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens 1992 ; 39 : 225-235 [51] Opelz G, Wujciak T, Dhler B, Sherer S, Mytilineos J. HLA compatibility and organ transplant survival. Rev Immunogenet 1999 ; 1 : 334-342 [52] Payne R, Rolfs MR. Foeto-maternal leucocyte incompatibility. JClin Invest 1958 ; 37 : 1756-1763 [53] Piazza A. The genetic data from the French provinces: a tentative summary. In : Ohayon E, Cambon-Thomsen A d. Gntique des populations humaines. Paris : dition INSERM, 1996 : 142 : 345-352 [54] Pichon L, Giffon T, Chauvel B, Le Gall JY, David V. La rgion HLA de classe I : une organisation complique par la prsence de nombreuses familles multigniques. Md/Sci 1996 ; 12 : 1209-1218 [55] Powles R, Mehta J, Kulkarni S, Treleaven J, Millar B, Marsden J et al. Allogeneic blood and bone-marrow stem cell transplantation in haematological malignant diseases: a randomized trial. Lancet 2000 ; 355 : 1231-1237 [56] Reith W, Steimle V, Lisowska-Grospierre B, Fischer A, Mach B. Molecular basis of major histocompatibility complex class II deciency. In : Ochs HD, Smith CI, Puck J eds. Primary immunodeciency diseases. New York : Oxford University Press, 1999 : 167-180 [57] Rhodes DA, Trowsdale J. Genetics and molecular genetics of the MHC. Rev Immunogenet 1999 ; 1 : 21-31 [58] Roche PA. HLA-DM: an in vivo facilitator of MHC class II peptide loading. Immunity 1995 ; 3 : 259-262 [59] Rouas-Freiss N, Marchal RE, Kirszenbaum M, Dausset J, Carosella ED. The a1 domain of HLA-G1 and HLA-G2 inhibits cytotoxicity induced by natural killer cells: Is HLA-G the public ligand for natural killer cell inhibitory receptors? Proc Natl Acad Sci USA 1997 ; 94 : 5249-5254 [60] Rubinstein P, Carrier C, Scaradavou A, Kurtzberg J, Adamson J, Migliaccio AR et al. Outcomes among 562 recipients of placental blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med 1998 ; 339 : 1565-1576 [61] Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Analysis of enzymatically amplied b-globin and HLA-DQ a DNA with allele specic oligonucleotide probes. baNature 1986 ; 324 : 163-166 [62] Sasazuki T, Juji T, Morishima Y, Kinukawa N, Kashiwabara H, Inoko H et al. Effects of matching of class I HLA alleles on clinical outcome after transplantation of hematopoietic stem cells from an unrelated donor. N Engl J Med 1998 ; 339 : 1177-1185 [63] Terasaki PI, McClelland JD. Microdroplet assay of human serum cytotoxins. Nature 1964 ; 204 : 998-1000 [64] Thorsby E. HLA - associated disease susceptibility - which genes are primarily involved? Immunologist 1995 ; 3/2 : 51-58 [65] Thursz M, Yallop R, Goldin R, Trepo C, Thomas HC. Inuence of MHC class II genotype on outcome of infection with hepatitis C virus. Lancet 1999 ; 354 : 2119-2124 [66] Tilanus MG, Eliaou JF. HLA sequencing based typing: strategy and overview. In : Charron D ed. HLA 1996 genetic diversity of HLA, functional and medical implications. Paris : EDK, 1997 : 637-638 [67] Tiwari JL, Terasaki PI. HLA and disease associations. New York : Springer-Verlag, 1985 [68] Todd JA, Bell JL, McDevitt HO. HLA-DQ bgene contributes to susceptibility and resistance to insulin-dependent diabetes mellitus. Nature 1987 ; 329 : 599-604 [69] Tongio MM, Falkenrodt A, Mitsuichi Y, Urlacher A, Bergerat JP, North ML et al. Natural HLA antibodies. Tissue Antigens 1985 ; 16 : 271-385 [70] Valentin N, Vergracht A, Bignon JD, Chneau ML, Blanchard D, Kaplan C et al. HLA-DRw52a is involved in alloimmunisation against PL-A1 antigen. Hum Immunol 1990 ; 27 : 73-79 [71] Vals-Gomez M, Reyburn H, Strominger J. Molecular analysis of the interactions between human NK receptors and their HLA ligands. Hum Immunol 2000 ; 61 : 28-38 [72] Van den Elsen PJ, Peijnenburg AD, Van Eggermond MC, Gobin SJP. Shared regulatory elements in the promoters of MHC class I and class II genes. Immunol Today 1998 ; 19 : 308-312 [73] Von Boehmer H, Teh HS, Kisielow P. The thymus selects the useful, neglects the useless and destroys the harmful. Immunol Today 1989; 10 : 57-61 [74] Watts C, Powis S. Pathways of antigen processing and presentation. Rev Immunogenet 1999 ; 1 : 60-74 [75] Williamson LM, Warwick RM. Transfusion-associated graftversus-host disease and its prevention. Blood Rev 1995 ; 9 : 251-261 [76] Yang SY. Population analysis of class I HLA antigens by onedimensional isoelectric focusing gel electrophoresis: Workshop summary report. In : Dupont B ed. Immunobiology of HLA. New York : Springer-Verlag, 1989 : 309-333

16

Tissu de soutien mdullaire

Hmatologie [13-000-M-90] (1995)

Laure Coulombel : Directeur de recherche INSERM U 362, Institut Gustave-Roussy, 39, rue Camille-Desmoulins 94805 Villejuif cedex France

Rsum
Deux populations distinctes par leur origine embryologique, leur phnotype et leur fonction composent la moelle osseuse : les cellules hmatopotiques et les cellules du microenvironnement ou cellules stromales. Dans les lots hmatopotiques extravasculaires dlimits par les cellules endothliales et les lamelles osseuses, la rgulation de l'hmatopose se fait presque exclusivement sous l'influence de molcules synthtises localement par les cellules stromales, les cytokines et les molcules d'adhsion. Malgr des progrs considrables dans l'identification de ces molcules, notre connaissance des interactions molculaires subtiles entre cellules stromales et cellules souches hmatopotiques est encore trs partielle. 1995 Elsevier Masson SAS - Tous droits rservs

Haut de page

COMPOSANTS CELLULAIRES DU TISSU DE SOUTIEN M DULLAIRE

Origine
Les cellules stromales et les cellules hmatopotiques drivent du msenchyme primitif embryonnaire mais les deux lignes divergent ensuite. L'analyse du gnotype des fibroblastes mdullaires de patients receveurs de greffe de moelle allognique a montr qu'il tait toujours identique celui du receveur, contrairement aux lignes lymphodes et mylodes qui proviennent du donneur

. Mme s'il n'existe chez l'homme adulte aucun argument exprimental convaincant en faveur d'une cellule souche commune aux lignes stromales et hmatopotiques, on ne peut toutefois exclure qu'au cours de l'ontogense certains progniteurs puissent exprimer une double potentialit, comme cela a t prouv chez les oiseaux [44]. Si l'hmatopose l'ge adulte est confine au tissu mdullaire, il n'en est pas de mme au cours du dveloppement. Les premiers lots hmatopotiques apparaissent dans la vsicule vitelline extraembryonnaire, puis le relais est pris par le foie aux alentours de la 6e semaine avant que la moelle ne soit colonise vers la 15e semaine de dveloppement [39]. On ignore presque tout du phnotype des cellules stromales de la vsicule vitelline, du foie foetal et de la moelle osseuse embryonnaire. On ignore aussi leur fonction et leur responsabilit dans l'expression des proprits uniques des cellules souches hmatopotiques embryonnaires que sont leur capacit de prolifration importante et la restriction de la diffrenciation terminale la seule ligne rythrode. Une tude rcente chez la souris suggre que les cellules du msoderme et de l'endoderme vitellin stimuleraient la prolifration de cellules hmatopotiques adultes plus efficacement que les cellules stromales mdullaires adultes [73].

[54]

Composants du microenvironnement mdullaire


A l'ge adulte et en situation d'quilibre, le tissu mdullaire assure seul la production des cellules hmatopotiques [20]. Le tissu de soutien mdullaire est compos de fibroblastes, de cellules endothliales, de cellules musculaires lisses, d'adipocytes, ces derniers rsultant en partie de l'accumulation de lipides dans des fibroblastes. Il faut ajouter cette liste les constituants du tissu osseux, et notamment les ostoblastes, qui ont probablement une fonction importante dans la rgulation de l'hmatopose . La cohsion du tissu mdullaire est assure par l'entrelacement fibrillaire des protines de la matrice extracellulaire scrtes par les cellules stromales et constituant le tissu conjonctif [75]. Beaucoup d'incertitudes subsistent sur le phnotype, la rpartition dans le tissu mdullaire et la fonction des cellules stromales. On ne sait pas en particulier s'il existe dans la moelle des sous-populations stromales spcialises ou si toutes les cellules stromales ont la mme comptence intrinsque, comptence (notamment synthse de cytokines) qui peut tre module localement. Ces incertitudes s'expliquent en partie par la raret des tudes histologiques chez l'homme, mais galement par les limitations inhrentes aux techniques de culture in vitro. Hormis les fibroblastes, il est en effet difficile de purifier et cultiver in vitro les autres cellules stromales comme les cellules endothliales mdullaires [23] et les ostoblastes [61] et d'tudier individuellement leur fonction. En outre, contrairement la multiplicit des lignes stromales permanentes drives spontanment de cellules mdullaires murines [20], chez l'homme, l'immortalisation de cellules stromales ncessite le recours une transformation gnralement par l'intermdiaire d'un virus transformant [47]. Aucun modle exprimental cependant ne reproduit in vitro la complexit de l'organisation du tissu mdullaire in vivo. En utilisant des critres morphologiques, Dexter distinguait trois types de cellules stromales dans des cultures de moelle murine [12]. Il est cependant trs difficile d'assigner les cellules stromales un phnotype prcis : ceci s'explique en partie par la modulation trs rapide des proprits de ces cellules en culture et par l'absence de marqueurs spcifiques. Ainsi, toutes les cellules stromales synthtisent les protines de la matrice extracellulaire - fibronectine, thrombospondine, vitronectine, collagnes, et protoglycanes - mais peu d'associations sont spcifiques d'un type cellulaire. Toutes les cellules stromales

expriment l'antigne CD34 mais son expression est perdue trs rapidement en culture [55]. L'origine endothliale d'une cellule stromale est affirme sur l'expression de marqueurs spcifiques : l'expression du facteur von Willebrand intracellulaire et matriciel, l'existence des corps de Weibel-Palade, l'expression de la lectine Ulex Europeaus, ou encore la synthse de collagne IV et de laminine, deux composants de la membrane basale. Cependant, toutes les cellules endothliales n'expriment pas le facteur von Willebrand, et en culture certains fibroblastes synthtisent du collagne IV et de la laminine [7], ce qui souligne la difficult d'un phnotypage rigoureux. Le problme est compliqu par l'htrognit des cellules endothliales : non seulement les cellules endothliales de type capillaire (comme dans la moelle) ont des proprits trs diffrentes des cellules endothliales bordant les vaisseaux de gros calibre, mais elles expriment une spcificit tissulaire : ainsi les cellules de la barrire mninge expriment un phnotype diffrent de celui des cellules postcapillaires du ganglion . Il est intressant de rappeler que dans l'lot hmatopotique, les cellules hmatopotiques ne sont pas directement en contact avec la circulation et que toutes les molcules ncessaires au mtabolisme cellulaire doivent franchir la barrire tanche constitue par les cellules endothliales [17]. Il n'existe pas de marqueur spcifique de fibroblaste, et on classe dans cette catgorie toute cellule de forme allonge, n'exprimant aucun marqueur endothlial ou pithlial, et synthtisant des protines de la matrice extracellulaire, fibronectine et collagnes de types I, III et VI. On ne connat pas vraiment l'origine des fibroblastes mdullaires prsents dans un chantillon de moelle osseuse : paroi des artrioles, compartiment osseux, ou tissu conjonctif lui-mme. Leur probable htrognit sera peut-tre dcrypte grce l'utilisation d'un panel plus large de marqueurs immunologiques. Une spcificit tissulaire des fibroblastes est suggre par deux observations :

l'expression constitutive par les fibroblastes mdullaires de la molcule d'adhsion VCAM ( vascular cell adhesion molecule ) qui n'est pas synthtise par les fibroblastes de peau non activs [51] ; une spcificit fonctionnelle, puisque seules les lignes de fibroblastes mdullaires transformes par SV-40 stimulent l'hmatopose, proprit que n'expriment pas les lignes de fibroblastes extramdullaires [47].

Haut de page

IMPORTANCE DU TISSU DE SOUTIEN DANS LA R GULATION DE LA PROLIF RATION ET DE LA DIFF RENCIATION H MATOPO TIQUES
Dans les annes 1970, l'hypothse d'un rle dcisif du microenvironnement sur la dtermination des cellules souches avait t suggre (thorie inductive ), mais il semble plus probable que l'engagement d'une cellule souche vers une ligne de diffrenciation soit un processus stochastique , ce qui n'exclut pas qu'il puisse tre modul par des interactions troites avec les composants du tissu de soutien [41]. Les premiers arguments exprimentaux suggrant l'importance du stroma dans la rgulation de l'hmatopose sont d'ordre chronologique : ainsi, la reconstitution du tissu de soutien mdullaire prcde toujours la reconstitution hmatopotique aprs irradiation ou dpltion mcanique du tissu mdullaire. In vivo, l'implantation dans la cavit pritonale de souris de membranes d'ester de cellulose recouvertes de cellules stromales [30] ou la greffe sous-

cutane d'extraits de matrice osseuse [2] entranent la reconstitution dans ces structures d'un microenvironnement organis capable de permettre secondairement la colonisation et le dveloppement d'une hmatopose active dans un dlai de quelques semaines quelques mois. De mme que l'tude des hmopathies humaines a facilit l'identification des tapes de la diffrenciation hmatopotique normale, de mme l'analyse des dysfonctionnements du stroma mdullaire a contribu notre connaissance des mcanismes de son action. L'exemple le plus connu est celui des souris steel. On savait depuis longtemps grce des expriences de transplantation croise que les anomalies hmatologiques de ces souris taient dues un dysfonctionnement du stroma mdullaire, mais l'identification du mcanisme molculaire ne date que de 1990. Ces souris sont porteuses d'une mutation ou dltion, au niveau du chromosome 10 (locus steel), dans la squence codante du gne codant pour un facteur de croissance essentiel la prolifration et la diffrenciation des progniteurs hmatopotiques, le facteur steel ou stem cell factor ou ligand de c-kit (le rcepteur de ce facteur est le produit du proto-oncogne c-kit). La molcule steel est synthtise exclusivement par les cellules stromales [8] et son absence entrane une aplasie mdullaire. L'quivalent humain de cette pathologie n'a pas t dcrit. Dans ce cas, il n'y a aucune anomalie ni morphologique, ni quantitative du compartiment des cellules stromales in vitro ou in vivo, ce qui souligne l'importance des tests fonctionnels dans l'identification du dysfonctionnement. Un dysfonctionnement du stroma peut aussi tre expliqu par son immaturit, ce que suggrent les expriences de Zanjani chez le mouton. Ainsi, lorsque des cellules hmatopotiques mdullaires sont transplantes in utero dans la cavit pritonale d'un foetus de mouton, elles migrent dans la moelle et s'y maintiennent, mais n'y prolifrent pas. L'hypothse avance est qu'avant la date de colonisation normale de la moelle par les cellules souches, le microenvironnement de la moelle est incapable d'assurer une diffrenciation complte des cellules souches hmatopotiques [74]. In vitro, l'analyse du phnotype et de la fonction des cellules stromales s'est faite dans le systme dit de culture de moelle long terme, dcrit initialement par Dexter chez la souris puis adapt l'homme . Ce modle reproduit l'organisation du tissu mdullaire in vivo et permet d'obtenir une hmatopose active et prolonge pendant plusieurs semaines. Ces cultures long terme sont tablies en incubant dans un flacon de culture un chantillon de moelle, obtenu par aspiration ou curetage osseux, contenant cellules stromales et hmatopotiques, dans un milieu de culture riche en srum et contenant de l'hydrocortisone. Les cellules stromales de l'chantillon adhrent au fond du flacon et y prolifrent, reconstituant l'quivalent du microenvironnement in vivo. On y trouve en proportion variable des fibroblastes (phnotype prdominant), des cellules endothliales (gnralement moins de 20 %), des cellules musculaires lisses, des cellules osseuses et des macrophages (assimils fonctionnellement au tissu de soutien). Les cellules hmatopotiques les plus immatures (proches des cellules souches) se nichent dans cette fraction adhrente, y prolifrent et s'y diffrencient, et relarguent dans la fraction non adhrente les progniteurs plus matures et les cellules diffrencies de la ligne granuleuse (l'rythropotine n'tant pas synthtise dans la moelle, l'obtention d'une diffrenciation rythrode terminale requiert l'addition d'rythropotine exogne). Dans ce systme o aucune cytokine exogne n'est ajoute, le dveloppement de l'hmatopose requiert la prsence d'un stroma fonctionnel, synthtisant des molcules rgulatrices positives et ngatives [13]. Cette proprit qu'ont les cellules stromales de permettre le dveloppement de l'hmatopose in vitro a t adapte depuis l'identification et la quantification de progniteurs hmatopotiques trs immatures. Ces progniteurs ne reprsentent qu'une fraction infime (moins de 0,05 %) des cellules mdullaires et ne sont pas reconnaissables par les critres habituels d'identification des progniteurs hmatopotiques plus matures (phnotype

immunologique, capacit former des colonies) [68]. Par contre, lorsque ces progniteurs primitifs sont incubs en prsence de cellules stromales pendant 4 6 semaines, ils prolifrent et produisent des progniteurs plus matures facilement identifiables . L'identification de ces cellules souches se fait donc indirectement par la quantification de leur descendance et la prsence de cellules stromales est indispensable ce processus. Malgr son importance pour l'identification de progniteurs primitifs humains proches des cellules souches hmatopotiques humaines, il y a plusieurs limites ce systme de culture in vitro :

l'hmatopose active ne s'y maintient que quelques semaines, probablement par puisement des proprits du stroma et aucun systme in vitro ne reproduit les performances de la moelle in vivo ; il est exceptionnel d'obtenir dans ces cocultures une diffrenciation mylode et lymphode B simultanment, or ce critre est indispensable la dfinition d'une cellule souche.

Haut de page

M CANISMES MOL CULAIRES DE LA R GULATION DE LA PROLIF RATION ET DE LA DIFF RENCIATION H MATOPO TIQUE PAR LES CELLULES STROMALES

Facteurs de croissance
Jusqu' ce jour plus d'une vingtaine de cytokines impliques dans la rgulation positive ou ngative de l'hmatopose ont t identifies et leurs gnes clons. A l'exception de trois cytokines dont la production est extramdullaire, l'rythropotine (cellules pritubulaires du rein), l'interleukine-(IL-)-3 (lymophocytes T activs) et probablement le ligand de mpl, facteur plaquettaire rcemment clon, produit dans le foie et le rein [10], presque tous les autres facteurs de croissance connus agissant au cours de la diffrenciation hmatopotique mylode peuvent tre synthtiss par les cellules stromales mdullaires. Cependant, l'expression constitutive de ces cytokines par les cellules stromales est trs discrte, comme le montre la faible quantit d'ARN messager dtecte par Northern blot ou amplification enzymatique (PCR polymerase chain reaction ) dans les cellules adhrentes des cultures de moelle long terme, ou de protine active identifie par dosage biologique dans le surnageant de ces cultures [29]. Seuls l'IL-6, le ligand de c-kit et le M-CSF ( macrophage colony-stimulating factor ) [24] sont dtects sans ambigut dans les cellules stromales non actives et il en est probablement de mme pour l'IL11 et le ligand de Flt3 rcemment dcrit [22]. La synthse de certaines de ces cytokines, IL-6, ligand de c-kit et M-CSF, ainsi que celle du GM-CSF ( granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ) et du G-CSF ( granulocyte colony-stimulating factor ) est inductible dans les cellules stromales par l'IL-1 et le TNF- ( tumor necrosis factor ) . Le mcanisme en est soit transcriptionnel, soit post-transcriptionnel, notamment par augmentation de la stabilit de l'ARN messager [27]. On ne connat pas l'importance in vivo de cette induction de cytokines, qui pourrait reprsenter un moyen de rgulation trs sensible de l'hmatopose. Une seconde caractristique des cytokines synthtises par les cellules stromales est la multiplicit de leurs formes molculaires, les cytokines pouvant

exister soit sous forme soluble, gnre le plus souvent par clivage protolytique d'un prcurseur ancr dans la membrane, soit sous forme purement transmembranaire. Le gne est unique et transcrit un ARN primitif qui subit un pissage alternatif et produit plusieurs ARN messagers matures. Des formes solubles et transmembranaires de M-CSF [46], d'IL-1 [33], de ligand de c-kit , de TNF- [31] et plus rcemment de G-CSF [61] ont ainsi t dcrites, et ces formes transmembranaires sont biologiquement actives . Il est probable que, pour un mme effet biologique, un trs faible nombre de molcules transmembranaires soit suffisant pour transduire le message, alors qu'une concentration plus importante de molcules solubles est requise en raison de leur dilution dans le tissu environnant. Ceci explique probablement qu' l'tat d'quilibre la synthse active de ces molcules est indtectable. Les cytokines du microenvironnement peuvent aussi tre concentres par leur adsorption sur les protines de la matrice extracellulaire [60] et notamment les protoglycanes [50] . C'est le cas pour le FGF ( fibroblast growth factor ), le TGF- ( transforming-growth factor ), le GM-CSF, l'IL-3 [48], le M-CSF. Les protoglycanes, composs d'un squelette protique sur lequel se fixent des chanes de polysaccharides sulfats, ou glycosaminoglycanes comme l'hparane sulfate ou le chondrotine sulfate, sont synthtiss par les cellules mdullaires [71] et ont un rle majeur dans la rgulation de l'action des cytokines, schmatiquement par quatre mcanismes :

certaines cytokines, le M-CSF par exemple, forment elles-mmes la structure protique sur laquelle se fixe l'hparane sulfate [60] ; certains protoglycanes font partie intgrante de rcepteurs de cytokines (FGF par exemple) ; d'autres jouent un rle dans la prsentation des cytokines ; par exemple, les protoglycanes hparane sulfate prsents la surface des cellules endothliales peuvent immobiliser les cytokines circulantes comme MIP-1 ( macrophage inhibitory protein ) et faciliter ainsi leur action locale [62] ; enfin, les protoglycanes prsents dans la matrice extracellulaire peuvent squestrer des cytokines solubles, jouant ainsi un rle de rservoir [19].

Il est donc probable que l'essentiel de la rgulation par les cytokines dans l'lot hmatopotique mette en jeu des molcules associes soit la cellule, soit la matrice extracellulaire, mais que les formes solubles aient un rle mineur. On ne sait absolument pas toutefois si physiologiquement in vivo toutes les cellules stromales ont le mme potentiel de scrtion de cytokines ou si la rgulation de l'hmatopose fait intervenir des cellules stromales spcialises. En conclusion de ce chapitre il faut souligner plusieurs points :

en 1994 deux nouvelles cytokines ont t identifies, le ligand de Flt-3 [22] et celui de c-Mpl [70], et d'autres cytokines d'origine stromale seront certainement identifies dans les annes venir, en particulier les molcules rgulant la diffrenciation lymphode B [28] et les cellules souches primitives [26] ; il ne faut pas sous-estimer le rle dans l'hmatopose de facteurs de croissance dont le tropisme initial est extrahmatopotique, comme le FGF [16], le PDGF ( platelet derived growth factor ) ou encore le NGF ( nerve growth factor ) [6].

Molcules d'adhrence
Dans le systme hmatopotique, l'adhrence des progniteurs hmatopotiques aux structures environnantes, matrice extracellulaire et cellules stromales intervient au cours de deux processus essentiels : les

phnomnes de migration vers ( homing ) et hors de la moelle travers la barrire endothliale [63], et les interactions avec les cellules stromales et leur matrice extracellulaire dans l'lot hmatopotique. Au cours des dernires annes, l'identification des molcules responsables des processus d'adhrence a progress trs rapidement et plusieurs familles regroupant quelques dizaines de molcules chacune ont t caractrises. Il est important de souligner :

que les mmes molcules rgulent l'adhrence et la migration leucocytaire et lymphocytaire au cours de l'inflammation et de la rponse immune ; que les processus d'adhrence sont plus qu'un phnomne passif et prennent une part active dans l'induction de la prolifration et de la diffrenciation cellulaire .

On distingue schmatiquement plusieurs familles de molcules. La famille des intgrines est compose d'htrodimres dont certaines partagent la mme chane [25]. On trouve dans ce groupe la plupart des rcepteurs des protines adhsives de la matrice extracellulaire. Deux autres familles sont responsables des interactions cellule-cellule. Les slectines sont prsentes sur les cellules stromales (E-slectine, ou ELAM [ endothelial leucocyte cell adhesion molecule CD62E] et P-slectine, ou GMP-140 ou PADGEM [CD62P]) ou sur les cellules [56] hmatopotiques, (L-slectine [CD62L]) . Beaucoup d'arguments exprimentaux soulignent le rle de ces molcules dans les processus de homing des lymphocytes [57] et une isoforme de l'antigne CD34 est un ligand de la L-slectine [1]. La dernire famille, qui regroupe des molcules comme VCAM (CD106), ICAM ( intercellular adhesion molecule )-1 (CD54), ICAM-2 (CD102), ICAM-3 (CD50), ou PECAM ( platelet endothelial cell adhesion molecule , CD31) a une parent structurale avec les immunoglobulines. Ces molcules sont exprimes soit exclusivement la surface des cellules stromales (VCAM), soit la fois par les cellules stromales [53] et hmatopotiques (ICAM). Beaucoup de molcules d'adhrence sont exprimes la surface des progniteurs hmatopotiques : intgrines de la famille 1 encore appeles VLA ( very late antigens ), en particulier VLA-4 (41, CD29/CD49d) et VLA-5 (51, CD29/CD49e) [49], LFA-1 (L2, CD11a/CD18) [42], ICAM-1, L-slectine, PECAM. VLA-5 et VLA-4 sont fonctionnels et permettent l'adhsion des progniteurs hmatopotiques, surtout rythrodes, la fibronectine (domaines RGD [arginine-glycine-Ac aspartique] ou CS1 [connecting segment 1] respectivement) ou la molcule VCAM (ligand de VLA-4) exprime par les cellules stromales . Certains rsultats exprimentaux dans le systme murin suggrent que cette interaction entre VLA-4 et les cellules stromales serait une tape essentielle la prolifration/diffrenciation dans les cultures long terme [40] . Chez l'homme cependant il ne semble pas qu'une adhrence prolonge entre cellules souches primitives et cellules stromales soit requise pour le maintien de l'hmatopose in vitro [66]. Le rle fonctionnel d'autres rcepteurs d'adhrence reste dmontrer : ainsi, la liaison du complexe CD11a/CD18 (LFA-1), exprim sur les progniteurs, son ligand naturel ICAM-1 n'est pas dmontre, alors que cette interaction joue un rle essentiel au stade de granuleux mature. Une hypothse est que la chane 2 ne soit pas sous forme active ce stade prcoce de la diffrenciation [57]. Contrairement aux processus de homing des lymphocytes [57], les mcanismes molculaires rgulant le trafic des cellules souches travers la barrire endothliale sont beaucoup moins bien connus : au cours de l'ontogense, on admet classiquement que les cellules hmatopotiques migrent du sac vitellin, premier site hmatopotique, jusqu'au foie foetal vers la 6e semaine de dveloppement, puis colonisent la moelle partir de la 15e

semaine. A l'ge adulte, les processus de hmatopotiques interviennent deux niveaux :

migration

des

cellules

dans l'espace mdullaire lui-mme o les progniteurs ne sont pas distribus au hasard ; lors des phnomnes de migration travers la barrire endothliale : l'hmatopose chez l'homme est un processus extravasculaire et les cellules matures de toutes les lignes, rticulocytes, polynuclaires, monocytes, mgacaryocytes passent dans la circulation en traversant la barrire endothliale [63].

Cette migration est un processus transendothlial, contrairement la diapdse des polynuclaires et des monocytes circulants vers le tissu interstitiel lors de l'inflammation, qui se fait quant elle entre deux cellules endothliales. Si l'tat normal seules les cellules matures traversent la barrire endothliale, on sait que les cytokines, en particulier le G-CSF et le GM-CSF, utilises en thrapeutique stimulent le passage dans la circulation de progniteurs immatures et probablement des cellules souches capables de reconstituer l'hmatopose long terme [45]. L'implication des intgrines dans ces processus de migration est largement suggre d'une part par la disparition des molcules VLA-4 et VLA-5 la fin de la maturation rythrode [67], d'autre part par l'observation que l'injection des singes d'un anticorps anti-VLA-4 entrane une mobilisation importante des progniteurs dans la circulation [43]. Cette possibilit d'induire la mobilisation des progniteurs par les cytokines est actuellement exploite des fins thrapeutiques puisque les cellules mobilises sont collectes par cytaphrse et utilises en transplantation mdullaire [18]. Un processus de migration inverse permet la colonisation de la moelle par les cellules du donneur aprs transplantation mais les mcanismes de la slectivit de cette migration ne sont pas connus. Par analogie avec la migration lymphocytaire, on peut imaginer que des groupements carbohydrates (dont la protine CD34) et leurs rcepteurs de type lectine (L-slectine par exemple) soient impliqus [64]. La diversit des associations ligand-rcepteur, cre en particulier par l'htrognit des glycosylations d'une molcule unique (comme la molcule CD34) [1], peut expliquer la spcificit tissulaire des processus de migration [57].

Haut de page

CONCLUSION
Le rseau d'interactions molculaires qui aboutit une rgulation harmonieuse des diffrentes tapes de la diffrenciation hmatopotique humaine dans le tissu mdullaire commence peine tre dcrypt. De nombreuses cytokines et molcules d'adhrence, acteurs principaux de cette rgulation, ont t identifies et la fonction de chacune de ces molcules individuellement teste et dfinie. Le dfi de ces prochaines annes sera de comprendre comment ces molcules interagissent entre elles et si des associations spcifiques permettent de rguler slectivement le dveloppement de sous-populations de progniteurs hmatopotiques. Certains arguments exprimentaux suggrent dj que cytokines et molcules d'adhsion agissent en synergie , et que les cytokines rgulent l'expression des molcules d'adhrence et rciproquement [38]. Un second dfi sera de dterminer si certaines pathologies hmatologiques humaines peuvent rsulter d'un dysfonctionnement des interactions entre cellules souches hmatopotiques et cellules stromales mdullaires, affectant les processus d'adhrence ou la synthse de cytokines.

Rfrences
[1] [2] BAUMHUETER S, SINGER MS, HENZEL W , et al. the vascular sialomucin CD34. Science 1993 ; 262 Binding of L-selectin to : 436-438

BLEIBERG I, RICCIARDONE MD, REDDI HA, McCARTHY KF New bone formation and bone marrow differentiation induced in rats by extracellular bone matrix implantation : effect of local preirradiation on the process. Exp Hematol 1987 ; 15 : 309-315 BROUDY VC, KAUSHANSKY K, HARLAN JM, ADAMSON JW Interleukin- 1 stimulates human endothelial cells to produce granulocyte-macrophage colonystimulating factor and granulocyte colony- stimulating factor. J Immunol 1987 ; 139 : 464-468 BROUDY VC, KOVACH NL, BENNETT LG, LIN N, JACOBSEN FW, KIDD PG Human umbilical vein endothelial cells display high-affinity c-kit receptors and produce a soluble form of the c-kit receptor. Blood 1994 ; 83 : 21452152 CHARBORD P, GOWN AM, KEATING A, SINGER JW CGA-7 and HHF, two monoclonal antibodies that recognize muscle actin and react with adherent cells in human long-term bone marrow cultures. Blood 1985 ; 66 : 1138-1142 CHEVALIER S, PRALORAN V, SMITH C , et al. Expression and functionality of the trkA proto-oncogene product/NGF receptor in undifferentiated hematopoietic cells. Blood 1994 ; 83 : 1479-1485 CHICHESTER CO, FERNANDEZ M, MINGUELL JJ Extracellular matrix gene expression by human bone marrow stroma and by marrow fibroblasts. Cell Adhesion and Communication 1993 ; 1 : 93-99 COPELAND NG, GILBERT DJ, CHO BC , et al. Mast cell growth factor maps near the steel locus on mouse chromosome 10 and is deleted in a number of steel alleles. Cell 1990 ; 63 : 175-183 COULOMBEL L, EAVES CJ, EAVES AC Enzymatic treatment reveals the preferential location of primitive hemopoietic progenitors in the adherent layer. Blood 1983 ; 62 : 291-297 DE SAUVAGE FJ, HASS PE, SPENCER SD , et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature 1994 ; 369 : 533-538 DEXTER TM, ALLEN TD, LAJTHA LG Conditions controlling the proliferation of haematopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 1977 ; 90 : 335-344 DEXTER TM, ALLEN TD, LAJTHA F, TESTA NG, MOORE MA. In vitro analysis of self-renewal and commitment of hematopoietic stem cells. In : Clarkson, Marks, Till eds. Differentiation of normal and neoplastic hematopoietic cells. Cold Spring Harbor Conferences. 1978 ; pp 63-80 EAVES CJ, CASHMAN JD, KAY RJ , et al. Mechanisms that regulate the cell cycle status of very primitive hematopoietic cells in long-term human marrow cultures. II : Analysis of positive and negative regulators produced by stromal cells within the adherent layer. Blood 1991 ; 78 : 110-117 FIBBE WE, VAN DAMME J, BILLIAU A , et al. Interleukin-1 induces human marrow stromal cells in long-term culture to produce granulocyte colonystimulating factor and macrophage colony-stimulating factor. Blood 1988 ; 71 : 430 FLANAGAN JG, CHAN DC, LEDER P Transmembrane form of the kit ligand growth factor is determined by alternative splicing and is missing in the Sld mutant. Cell 1991 ; 64 : 1025-1035 GABRILOVE JL, WHITE K, RAHMAN Z, WILSON EL Stem cell factor and basic fibroblast growth factor are synergistic in augmenting committed myeloid progenitor cell growth. Blood 1994 ; 83 : 907-910 GHINEA N, HAI MT, GROYER-PICARD MT, MILGROM E How protein hormones reach their target cells : receptor-mediated transcytosis of hCG through endothelial cells. J Cell Biol 1994 ; 125 : 87-97 GIANNI AM, SIENNA S, BREGNI M , et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to harvest circulating haematopoietic stem cells for autotransplantation. Lancet 1989 ; II : 580-585 GORDON MY, RILEY GP, WATT SM, GREAVES MF Compartmentalization of

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11] [12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

a haemopoietic growth factor (GM-CSF) by glycosaminoglycans in the bone marrow microenvironment. Nature 1987 ; 326 : 403-405 [20] [21] GREENBERGER Hematol 1991 JS The hematopoietic microenvironment. ; 11 : 65-84 Crit Rev Oncol

GUADAGNO TM, OHTSUBO M, ROBERTS JM, ASSOIAN RK A link between cyclin. A expression and adhesion-dependent cell cycle progression. Science 1993 ; 262 : 1572-1575 HANNUM C, CULPEPPER J, CAMPBELL D , et al. Ligand for FLT3/FLK2 receptor tyrosine kinase regulates growth of haematopoietic stem cells and is encoded by variant RNAs. Nature 1994 ; 368 : 643-648 HASTHORPE S, BOGDANOVSKI M, ROGERSON J, RADLEY JM Characterization of endothelial cells in murine long-term marrow cultures. Implication for hemopoietic regulation. Exp Hematol 1992 ; 20 : 476-481 HEINRICH MC, DOOLEY DC, FREED AC , et al. Constitutive expression of steel factor gene by human stromal cells. Blood 1993 ; 82 : 771-783 HYNES RO Integrins : versatility, modulation and signaling in cell adhesion. Cell 1992 ; 69 : 11-25 ISSAAD C, CROISILLE L, KATZ A, VAINCHENKER W, COULOMBEL L A murine stromal cell line allows the proliferation of very primitive human CD34++/CD38-progenitor cells in long-term cultures and semi-solid assays. Blood 1993 ; 81 : 2916-2924 KAUSHANSKY KN, LIN N, ADAMSON JA Interleukin-1 stimulates fibroblasts to synthesize granulocyte-macrophage and granulocyte colony-stimulating factors ; mechanism for the hematopoietic response to inflammation. J Clin Invest 1988 ; 81 : 92-97 KINCADE P, LEE G, PIETRANGELI CE, HAYASHI SH, GIMBLE J Cells and molecules that regulate B lymphopoiesis in bone marrow. Ann Rev Immunol 1989 ; 7 : 111-125 KITTLER EL, McGRATH H, TEMELESS D, CRITTENDEN RW, KISTER VK, QUESENBERRY P Biological significance of constitutive and subliminal growth factor production by bone marrow stroma. Blood 1992 ; 79 : 3168-3178 KNOSPE WH, HUSSEINI SG, FRIED W Hematopoiesis on cellulose ester membranes. XI : Induction of new bone and a hematopoietic microenvironment by matrix factors secreted by marrow stromal cells. Blood 1989 ; 74 : 66-70 KRIEGLER M, PEREZ C, DEFAY K, ALBERT I, LU SD A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein : ramifications for the complex physiology of TNF. Cell 1988 ; 53 : 45-53 KUMAR S, WEST D, AGER A Heterogeneity in endothelial cells from large vessels and microvessels. Differentiation 1987 ; 36 : 57 KURT-JONES EA, BELLER DI, MIZEL SB, UNANUE ER Identification of a membrane-associated interleukin- 1. Proc Natl Acad Sci USA 1985 ; 82 : 1204-1208 LICHTMAN MA The ultrastructure of the hemopoietic environment of the marrow : A review. Exp Hematol 1981 ; 9 : 391 LONG MW 288-301 Blood cell cytoadhesion molecules. Exp Hematol 1992 ; 20 :

[22]

[23]

[24] [25] [26]

[27]

[28]

[29]

[30]

[31]

[32] [33]

[34] [35] [36]

LONG MW, WILLIAMS JL, MANN KG Expression of human bone-related proteins in the hematopoietic microenvironment. J Clin Invest 1990 ; 86 : 1387-1391 LORD BI The architecture of bone marrow cell populations. 1990 ; 8 : 317-331 Int J Cell Cloning

[37] [38]

LUKACS NW, STRITER RM, ELNER VM, EVANOFF HL, BURDICK M, KUNKEL SL Intercellular adhesion molecule- 1 mediates the expression of monocytederived MIP-1a during monocyte-endothelial cell interactions. Blood 1994 ; 83 : 1174-1178 MIGLIACCIO G, MIGLIACCIO AR, PETTI S , et al. Human embryonic hemopoiesis. Kinetics of progenitors and precursors underlying the yolk sac liver transition. J Clin Inv 1986 ; 78 : 51-60 MIYAKE K, WEISSMAN IL, GREENBERGER JS, KINCADE PW Evidence for a role of the integrin VLA-4 in lympho-hemopoiesis. J Exp Med 1991 ; 173 : 599-608

[39]

[40]

[41] [42] [43]

OGAWA M Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. 1993 ; 81 : 2844-2853

Blood

PAPAYANNOPOULOU T, BRICE M Integrin expression profiles during erythroid differentiation. Blood 1992 ; 79 : 1686-1694 PAPAYANNOPOULOU T, NAKAMOTO B Peripheralization of hemopoietic progenitors in primates treated with anti-VLA-4 integrin. Proc Natl Acad Sci USA 1993 ; 90 : 9374-9378 PEAULT B, THIERY JP, LEDOUARIN NM A surface marker for the hemopoietic and endothelial cell lineage in the quail species defined by a monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci USA 1983 ; 80 : 2976-2980 PETTENGELL R, TESTA NG, SWINDELL R, CROWTHER D, DEXTER TM Transplantation potential of hematopoietic cells released into circulation during routine chemotherapy for non-Hodgkin's lymphoma. Blood 1993 ; 82 : 2239-2248 RETTENMEIER CW, ROUSSEL MF Differential processing of colony-stimulating factor 1 precursors encoded by two human cDNAs. Mol Cell Biol 1988 ; 8 : 5026-5034 RIOS M, WILLIAMS DA Systematic analysis of the ability of stromal cell lines derived from different murine adult tissues to support maintenance of hematopoietic stem cells in vitro. J Cell Physiol 1990 ; 145 : 434-443 ROBERTS R, GALLAGHER J, SPOONCER E, ALLEN TD, BLOOMFIELD F, DEXTER TM Heparan sulphate bound growth factors : a mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis. Nature 1988 ; 332 : 376-378 ROSEMBLATT M, VUILLET-GAUGLER MH, LEROY C, COULOMBEL L Coexpression of two fibronectin receptors, VLA-4 and VLA-5, by immature human erythroblastic precursor cells. J Clin Invest 1991 ; 87 : 6-11 RUOSLAHTI E, YAMAGUCHI Y activities. Cell 1991 ; 64 : Proteoglycans as modulators of growth factor 867-869

[44]

[45]

[46]

[47]

[48]

[49]

[50] [51]

RYAN DH, NUCCIE BL, ABBOUD CN, WINSLOW JM Vascular cell adhesion molecule- 1 and the integrin VLA-4 mediate adhesion of human B cell precursors to cultured bone marrow adherent cells. J Clin Invest 1991 ; 88 : 9951004 SCHWARTZ MA, LECHENE C Adhesion is required for protein kinase cdependent activation of the Na+/H+ antiporter by platelet-derived growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ; 89 : 6138-6141 SIMMONS PJ, MASINOVSKY B, LONGENECKER BM, BERENSON R, TOROKSTORB B, GALLATIN WM Vascular cell adhesion molecule- 1 expressed by bone marrow stromal cells mediates the binding of hematopoietic progenitor cells. Blood 1992 ; 80 : 388-395 SIMMONS PJ, PRZEPIORKA D, THOMAS ED, TOROK-STORB B Host origin of marrow stomal cells following allogeneic bone marrow transplantation. Nature 1987 ; 328 : 429-432 SIMMONS PJ, TOROK-STORB B CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow. Blood 1991 ; 78 : 2848-2853 SPRINGER TA Adhesion receptors of the immune system. 346 : 425-434 Nature 1990 ;

[52]

[53]

[54]

[55] [56] [57] [58]

SPRINGER TA Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration : the multistep paradigm. Cell 1994 ; 76 : 301-314 STEIN J, BORZILLO GV, RETTENMEIER CW Direct stimulation of cells expressing receptors for macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) by a plasma membrane-bound precursor of human CSF-1. Blood 1990 ; 76 : 1308-1314 SUTHERLAND H, EAVES C, DRAGOWSKA W, LANSDORP P Characterization and partial purification of human marrow cells capable of initiating long-term hematopoiesis in vitro. Blood 1989 ; 74 : 1563-1570 SUZU S, OHTSUKI T, MAKISHIMA M , et al. Biological activity of a proteoglycan form of macrophage colony-stimulating factor and its binding to type V collagen. J Biol Chem 1992 ; 267 : 16812-16815 TAICHMAN RS, EMERSON SG Human osteoblasts support hematopoiesis through the production of granulocyte colony-stimulating factor. J Exp Med 1994 ; 179 : 1677-1682 TANAKA Y, ADAMS DH, HUBSCHER S, HIRANO H, SIEBENLIST U, SHAW S T-cell adhesion induced by proteoglycan-immobilized cytokine MIP-1b.

[59]

[60]

[61]

[62]

Nature [63] [64] [65]

1993 M

361

79-82 Br J Haematol 1979 ; 41 :

TAVASSOLI 297-302

The marrow blood-barrier.

TAVASSOLI M, HARDY C Molecular basis of homing of intravenously transplanted cells to the marrow. Blood 1990 ; 76 : 1059-1070 TOKSOZ D, ZSEBO KM, SMITH KA , et al. Support of human hematopoiesis in long-term bone marrow cultures by murine stromal cells selectively expressing the membrane-bound and secreted forms of the human homolog of the steel gene product, stem cell factor. Proc Natl Acad Sci USA 1992 ; 83 : 7350-7354 VERFAILLIE CM Direct contact between human primitive hematopoietic progenitors and bone marrow stroma is not required for long-term in vitro hematopoiesis. Blood 1992 ; 79 : 2821-2826 VUILLET MH, BRETON-GORIUS J, VAINCHENKER W , et al. Loss of attachment to fibronectin with terminal human erythroid differentiation. Blood 1990 ; 75 : 865-873 WATT S, VISSER J Recent advances in the growth and isolation of primitive human haemopoietic progenitors cells. Cell Prolif 1992 ; 25 : 263-397 WEINSTEIN R, RIORDAN MA, WENE K, KRECZKO S, ZHOU M, DAINIAK N Dual role of fibronectin in hematopoietic differentiation. Blood 1989 ; 73 : 111-116 WENDLING F, MARASKOVSKY E, DEBILI N , et al. humoral regulator of megakaryocytopoiesis. Nature 1994 574 c-Mpl ligand is a ; 369 : 571-

[66]

[67]

[68] [69]

[70]

[71]

WIGHT TN, KINSELLA MG, KEATING A, SINGER JW Proteoglycans in human long-term bone marrow cultures. Biochemical and ultrastructural analyses. Blood 1986 ; 67 : 1333-1343 WILLIAMS DA, RIOS M, STEPHENS C, PATEL VP Fibronectin and VLA-4 in haematopoietic stem cell-microenvironment interactions. Nature 1991 ; 352 : 438-441 YODER MC, VE P, BREITFELD PP, WILLIAMS DA Murine yolk sac endoderm- and mesoderm-derived cell lines support in vitro growth and differentiation of hematopoietic cells. Blood 1994 ; 83 : 2436-2443 ZANJANI ED, PALLAVICINI M, ASCENSAO JL , et al. Engraftment and longterm expression of human fetal hemopoietic stem cells in sheep following transplantation in utero. J Clin Invest 1992 ; 89 : 1178-1188 ZUCKERMAN KS, WICHA MS Extracellular matrix production by the adherent cells of long-term murine bone marrow cultures. Blood 1983 ; 61 : 540547

[72]

[73]

[74]

[75]

1995 Elsevier Masson SAS - Tous droits rservs

Cet article ne contient pas d'images.

Utilisation des mthodes isotopiques en hmatologie

Hmatologie [13-000-M-10] (1997)

Yves Najean : Professeur d'hmatologie, chef du service de mdecine nuclaire Hpital Saint-Louis, 1, avenue Claude-Vellefaux, 75475 Paris cedex 10 France

Rsum L'emploi des traceurs radioactifs en hmatologie est trop souvent mal compris, et l'utilisation mal adapte. Pourtant, leur dveloppement est ancien :

Lawrence pour le 32P ds 1945 ; Huff pour le 59Fe en 1951 ; Gray et Sterling pour le 51chromate en 1955 ; Cohen et Gadner, et nous-mmes pour ce mme traceur appliqu la cintique plaquettaire en 1959 ; Thakur pour le marquage des plaquettes par 111In.

Dans ces dernires annes on a dvelopp, avec un succs encore douteux, les anticorps monoclonaux marqus par divers radiolments. Cet chec relatif est d certainement au fait que les mthodes employes sont rbarbatives pour les cliniciens ; ce sont dans la plupart des cas des preuves fonctionnelles, et non des mthodes d'imagerie traditionnelle (comme la cytologie, ou la radiologie). L'aspect mathmatique des comptes-rendus peut tre, lui aussi, rebutant. Enfin, il existe une crainte diffuse du risque de la radioactivit, paradoxalement considr comme moindre lorsqu'elle est utilise par voie externe. Pourtant, les mthodes isotopiques peuvent apporter d'utiles informations pour le diagnostic, le pronostic, le traitement des maladies du sang. Mais c'est l'exemple mme o on doit crer une confrontation entre le clinicien et le mdecin nuclaire, afin que les questions soient bien poses, et que l'tude isotopique soit faite pour rpondre ces questions. Pour chacun des chapitres abords, nous prsenterons brivement la mthodologie, mais dvelopperons essentiellement l'intrt clinique de l'examen. La prsentation de ces chapitres sera plus celle de l'hmatologiste que de l'isotopiste. 1997 Elsevier Masson SAS - Tous droits rservs

Haut de page VOLUMES

Mthodologie La mesure des volumes repose sur le principe de la dilution. Le traceur est inject, se dilue dans l'espace mesurer et, une fois cette dilution homogne, sa concentration permet le calcul de l'espace de dilution.

Pour la mesure du volume globulaire (VG), les hmaties sont marques par 51 chromate de sodium, un isotope metteur gamma exclusif, de priode physique 28 jours, donc n'impliquant pas d'irradiation significative avec les doses modestes utilises pour le marquage (5 - 10 Ci, 100-200 KBq). On peut aussi utiliser 99m Tc pour marquer les hmaties, mais il y a une lution importante, qui rend la mesure du volume plus alatoire ; cette mthode est valable en cardiologie (mesure du flux), o le chiffre exact n'est pas important ; ce traceur est utilisable aussi en ranimation parce que la priode courte du 99m Tc permet de rpter des mesures court terme. Le calcul du VG est trs simplement fait partir de la radioactivit injecte , de la radioactivit de 1 mL de sang veineux extrapole au temps zro (A), et de l'hmatocrite corrig pour le plasma restant dans le culot (H). R est la quantit du traceur utilise et injecte (mesure partir d'un aliquot, avec soustraction de ce qui n'a pas t inject - rsidu de seringue...-) ; A est mesur en mme temps que l'aliquot de R, le ou les prlvements de sang tant faits entre 15 et 40 minutes, de sorte que la dilution de l'chantillon inject soit satisfaisante, H est l'hmatocrite veineux, qui doit tre mesur par une mthode directe (microcentrifugation) et non pas tre repris d'une mthode indirecte automatique ; H doit tre corrig pour deux causes d'erreur, l'une technique, le plasma dit trapp , l'autre physiologique, la diffrence entre l'H veineux et l'H somatique : H est en pratique pour les calculs H (mesur) 0,98 (plasma squestr) 0,92 (rapport H veineux/ H somatique). La mesure du volume plasmatique (VP) est faite par injection d'albumine marque par 125I. On peut utiliser d'autres protines plus lourdes (par exemple macroglobulines) qui diffusent plus lentement de l'espace circulant. L'inconvnient en effet de l'emploi de l'albumine est sa diffusion dans l'espace extravasculaire ; il est donc ncessaire de prvoir plusieurs prlvements aprs l'injection pour extrapoler T0 la radioactivit de 1 mL de plasma et calculer le VP. o R = radioactivit injecte, A = radioactivit de 1 mL de plasma, extrapole au T0. Le volume total (VT) est la somme des deux volumes fractionnels. Trs souvent il est calcul partir d'un seul d'entre eux en tenant compte de l'hmatocrite veineux. Cette mesure n'est thoriquement pas acceptable puisque la correction de H pour le rapport H veineux/H somatique dpend de la situation clinique et ne peut pas tre affirme a priori. En fait, sauf en cas de splnomgalie, les erreurs ainsi faites sont modestes et en pratique VT peut raisonnablement tre dduit de VG (mesur par 51Cr, et non par 99m Tc), moins

raisonnablement de VP, qui a des causes d'erreur (extrapolation T0). L'expression des rsultats doit rendre les chiffres intelligibles au mdecin. L'usage est de rapporter les volumes au poids du sujet ; les normes du Polycythemia Vera Study Group, trs largement employes, sont une limite suprieure de 36 mL/kg pour le VG de l'homme et 32 mL/kg pour celui de la femme. Pour les obses, o le poids global ne reprsente pas bien la masse corporelle vascularise, on a construit des abaques tenant compte de la surface corporelle ; il faut s'y rfrer pour savoir interprter les chiffres observs. Ces chiffres normaux de rfrence, anciens, sont critiquables cause des mthodes employes. Une analyse rcente fonde sur des chiffres anglais, belges, franais et italiens propose des valeurs normales tenant compte de la taille et du poids [7]. Les chiffres mesurs pour un sujet devraient tre considrs comme anormaux s'ils dviaient de ceux attendus par plus de 25 %.

Indications et intrt clinique La mesure du VG et du VT est indispensable dans les polyglobulies :

pour le diagnostic, car elle permet de discriminer les vraies polyglobulies ou rythrocytoses avec excs du VG des pseudopolyglobulies o l'excs de l'hmatocrite est d une diminution du VP ; cependant, si l'hmatocrite dpasse 55 %, il est peu prs sr que le VG sera significativement excessif (98 % des cas) ; pour le pronostic, car des dcisions thrapeutiques urgentes peuvent dpendre de l'excs de volume ; ici, de mme, il ne faut pas attendre la mesure des volumes pour saigner (traitement d'urgence, non de fond), quand l'hmatocrite dpasse 55 % ; pour la surveillance, car notamment chez les malades saigns, la concentration (hmatocrite, hmoglobine, chiffre des hmaties) n'est pas toujours parallle au VG ; ici encore la mesure du VG n'est indique qu'en fonction d'un ventuel dsaccord entre les faits cliniques et les chiffres de la numration.

Le dveloppement d'une splnomgalie importante dans les cas de polyglobulies (spent phase, splnomgalie mylode) est trs gnralement observ long terme. La mesure des deux volumes est ici ncessaire : cause d'une hmodilution, le VG peut tre sous-estim, et un patient peut tre jug anmique alors qu'il ne l'est pas ; l'excs du VP est un index de pronostic. En cas de dysprotinmie, notamment mylome et macroglobulinmie, la mesure du VP est utile pour le bilan pronostique initial et pour la surveillance sous chimiothrapie et/ou plasmaphrse. La mesure du VP est importante avant toute plasmaphrse pour prvoir l'importance de l'change.

Haut de page DUR E DE VIE DES POPULATIONS CIRCULANTES

Mthodologie La dure de vie est le plus souvent mesure directement par un marquage des populations circulantes. Le marqueur devrait en principe runir des conditions optimales :

tre spcifique de la ligne cellulaire tudie ; tre homogne, c'est--dire, dans cette ligne, marquer galement les cellules, quel que soit leur ge ; tre dfinitif, c'est--dire ne s'luant pas spontanment de la cellule marque ; s'il disparat ainsi, le taux d'lution doit tre constant, connu et non fonction de l'ge cellulaire ; tre non rutilisable la mort des cellules dont on tudie la dure de vie ; tre non toxique pour les cellules marques, car alors bien entendu leur dure de vie serait modifie ; enfin, les caractristiques physiques doivent le rendre apte l'emploi demand : une priode assez longue compte tenu de la dure de vie de la population cellulaire marque, assez courte pour irradier le sujet aussi peu que possible, et une mission facilement dtectable pour l'appareillage disponible et les questions poses (mission gamma s'il y a ncessit de comptages externes rpts d'un organe ; bta ou gamma si on travaille sur des chantillons prlevs).

Aucun traceur ne rpond parfaitement ces exigences. Le plus anciennement utilis, le di-iso-propyl-fluoro-phosphate marqu par 3H ou 32P, est toxique, et difficile d'emploi ; il n'a de valeur qu'historique et de rfrence chez l'animal. Le radiochromate (51Cr - O4 - Na2) s'incorpore aux protines intracellulaires in vitro, sans manipulation complexe, sans toxicit pour la cellule, et avec une faible lution spontane (1 %/j) aprs la perfusion des cellules marques. Sa priode physique de 28 jours et son mission gamma de 325 KeV sont techniquement acceptables. Le 99m Tc a le dsavantage d'une lution importante (5 %/h environ) et d'une priode courte (6 h), ce qui le rend inutilisable pour des mesures de dure de vie qui se comptent en jours. Le 111In ne se fixe aux cellules qu'aprs sa liaison avec l'oxine ou le tropolonate ; sa priode (2,8 j), son mission gamma facilement mesurable (170 KeV), en font un trs bon marqueur de populations vie courte (plaquettes), mais pas de celles vie longue (hmaties). Dans tous les cas, la mthodologie fondamentale est la mme : prlvement de sang, isolement des cellules marquer (sans problme pour les hmaties, qui dominent en nombre), marquage, lavage, resuspension, prlvement d'un aliquot et rinjection. L'affaire est en pratique souvent plus complexe :

il faut que les cellules puissent tre rellement isoles en nombre suffisant (c'est en pratique clinique un problme majeur si on veut tudier la dure de vie des plaquettes autologues dans des thrombocytopnies graves) ; il faut que les cellules ne soient pas abmes par les manipulations et le marquage (ici de nouveau c'est le cas pour les plaquettes, qu'on doit marquer en anticoagulant acidifi [ACD] et en prsence de plasma ; cela peut tre le cas aussi pour des hmaties d'hmolyse constitutionnelle avec fragilit osmotique excessive).

Ces remarques techniques indiquent bien qu'une relation doit exister entre le

prescripteur et l'excutant avant l'examen, pour pouvoir adapter la technique. La mthode isotopique peut permettre le marquage de cellules normales et l'tude de leur dure de vie chez le malade (homotransfusion) ; la destruction excessive dans ce cas conduirait au diagnostic d'hmolyse extracorpusculaire (par exemple anticorps, obstacle mcanique). Le plus souvent, et maintenant presque toujours cause de la peur d'accident de contamination (et plus encore de peur d'une rglementation draconienne et tatillonne), l'examen est fait en situation autologue, avec les difficults indiques ci-dessus pour les thrombocytopnies importantes. Un intrt important serait le double marquage quand la fois se pose le problme du taux et du site de destruction, et le problme de son mcanisme corpusculaire ou extracorpusculaire. On peut raliser cette tude pour la cintique plaquettaire en marquant une population (par exemple autologue) par 111In et l'autre, homologue, par 51Cr ; ceci n'a que trs rarement d'intrt pratique. Pour les hmaties, o une telle tude serait souvent utile (hmolyses chroniques avec test de Coombs ngatif chez l'enfant ou l'adulte jeune), l'indium n'est pas un bon marqueur cause d'une lution trop importante, ce qui empche un double marquage. L'tude cintique permet, non seulement la mesure de la dure de vie, mais aussi celle de la rpartition des cellules dans l'organisme du receveur, et celle du site de leur destruction, apprcie par l'accumulation du traceur. Ceci exige l'emploi d'un traceur metteur gamma, dtectable en dehors de l'organisme, d'mission ni trop faible (arrte par les tissus), ni trop puissante (traversant sans beaucoup d'interactions les cristaux dtecteurs de l'appareil de mesure) : 111In et 51Cr sont satisfaisants cet gard. Les mesures utilisent, soit des sondes , c'est--dire des cristaux pleins collimats, soit une camra de scintillation, avec dans les deux cas une adaptation du dtecteur au pic d'mission photonique de l'isotope utilis. On peut dans les deux cas utiliser la spectromtrie gamma pour sparer l'mission de deux isotopes marquant deux populations. Le taux d'accumulation de la radioactivit dans des zones d'intrt (par exemple foie, rate, tumeur...) peut tre quantifi et exprim, soit par rapport la dose injecte, soit par rapport l'accumulation dans un autre organe (par exemple rate contre foie), soit par rapport la radioactivit restant circulante (par exemple rate contre coeur). Expression des rsultats Aprs l'injection des cellules marques, une courbe de dcroissance de la radioactivit est trace. On doit exclure la perte due l'lution du traceur. Cette correction faite, la pente rpond, soit l'quation d'une droite en coordonnes cartsiennes, indiquant une destruction par snescence : A (t)= Ao (1 - at), o t est le temps en jours et a le coefficient journalier de destruction, soit une droite en coordonnes semilogarithmiques, correspondant une destruction au hasard : A(t)=Ao.e-at, o e est la base des logarithmes npriens. Dans le second cas, a = 0,693/T, o T est la demivie ; la dure de vie moyenne de la population = 1,44 T. Ces deux quations, l'une cartsienne, l'autre logarithmique, s'appliquent aux hmaties et aux plaquettes qui ont toutes deux une dure de vie finie (avec une faible variation autour de la moyenne), si elles sont normales, dans un milieu normal. En pathologie, la destruction est au hasard. En thorie, on devrait tenir compte la fois de la snescence (destruction cartsienne) et de celle au hasard (logarithmique), qui s'associent ; des modles mathmatiques ont t construits pour cela (quation de Dornhorst, multiple hit model). En pratique clinique, en cas de destruction excessive

significative, la courbe de survie cellulaire est une exponentielle, et la seconde quation du premier paragraphe peut tre utilise. Dans tous les cas les rsultats doivent tre exprims en fraction de destruction par unit de temps, ce qui n'est valable que si la situation est stable (steady state). En effet s'il existe une variation importante des chiffres en cours d'preuve (par exemple un sujet anmique trs transfus, un purpura thrombopnique recevant des immunoglobulines efficaces), la courbe devient difficile interprter. La mesure du taux de renouvellement cellulaire permet au contraire, en tat stable, de fournir une information complmentaire, le taux de production : Ce calcul peut mme tre valable en tat non stable, si on admet que le volume total est stable : Le lieu de squestration est le plus souvent prsent, trs simplement, comme la courbe d'volution en fonction du temps du rapport de la radioactivit aire splnique/aire prcordiale, et aire hpatique/aire prcordiale. Comme ce qui intresse le clinicien est le taux de destruction dans la rate, en vue d'une splnectomie, il convient de lui fournir la courbe aire splnique/aire hpatique. Une autre mthode de mesure est l'excs de compte : au temps T0 la radioactivit mesure est seulement circulante ; s'il n'y avait pas de squestration splnique (ou hpatique), la radioactivit mesure sur ces aires devrait baisser comme celle du sang ; la diffrence entre ce que l'on mesure j1, j2,... et ce qu'on a ainsi calcul est l'excs de compte. Ces mesures ne sont, au mieux, que semi-quantitatives. Des efforts de quantification sont possibles (mesure en diverses positions, fantmes, permettant de tenir compte de l'attnuation), mais rarement utiliss en pratique clinique. Un point important concerne la dure de l'tude, qui devra tre plus ou moins prolonge selon que la destruction est peu ou trs excessive. Il faut en prvenir le malade, qui ne le sait pas toujours. Utilisation clinique

La mesure de la dure de vie des hmaties permet de quantifier les pertes, de mettre en vidence leur mcanisme corpusculaire ou extracorpusculaire, d'identifier une incompatibilit transfusionnelle. Les comptages externes apprcient le degr de squestration splnique, ce qui peut avoir un intrt diagnostique dans les anmies hmolytiques gntiques, mais qui a surtout un intrt pratique pour l'indication de la splnectomie dans les anmies acquises immunologiques ; la corrlation est bonne, bien que non parfaite, entre le sige de destruction et l'efficacit de l'intervention. L'accumulation du traceur dans certains organes peut aussi tre utile mettre en vidence dans des indications cliniques particulires (tumeurs, angiomes, poumons dans le cas de l'hmochromatose pulmonaire idiopathique). Une indication de la mthode est importante pour les centres de transfusion : validation des mthodes de conservation des cellules (hmaties, plaquettes). La mesure de la dure de vie des plaquettes permet de discriminer les thrombocytopnies dues un dfaut de production de celles dues un excs de destruction ; l'tude des mgacaryocytes du mylogramme n'est pas en effet un paramtre suffisant. On a rcemment montr la frquence de l'erreur de diagnostic entre le purpura

thrombocytopnique acquis d un excs de destruction et des thrombocytopnies chroniques (constitutionnelles, avec macrocytose ; acquises, dues le plus souvent une mylodysplasie) dues un dfaut de production. La cintique plaquettaire a t aussi utilise pour tenter de mesurer une consommation excessive dans l'artriosclrose, dans les prothses valvulaires et en cas de greffe vasculaire, et l'efficacit des traitements anticoagulants et antiagrgants (cf infra : Scintigraphie en hmatologie). Elle a un intrt particulier dans le lupus, les lymphomes et leucmies lymphodes, les infections virus de l'immunodficience humaine (VIH), les hpatites chroniques d'origine virale, o la thrombopnie peut tre due un excs de destruction ou un dfaut de production, avec un pronostic diffrent et des consquences thrapeutiques diffrentes. L'intrt majeur de cette tude est de prvoir l'efficacit de la splnectomie partir des comptages externes. La corrlation est excellente. Une rvision rcente personnelle de 280 splnectomies montre son succs chez 96 % des enfants et des adultes jeunes et chez 92 % des sujets de plus de 30 ans quand la squestration tait splnique, contre moins de 20 % lorsqu'elle tait hpatique. L'emploi des plaquettes marques pour authentifier et visualiser des thromboses artrielles ou veineuses n'a pas t gnralis en pratique clinique. La mesure de la dure de vie des granulocytes a peu d'intrt pratique et est techniquement trs difficile. L'intrt clinique serait le calcul des compartiments des cellules granuleuses, marginales et circulantes, mais cette information est donne par des tests plus simples. La cintique des lymphocytes marqus in vitro par 51Cr, ou 111In, ou in vivo par 3H-thymidine, n'a t tudie que dans le cadre de la recherche clinique. On a aussi utilis le marquage par 111In pour suivre le destin de cellules souches, normales ou ayant subi une manipulation gntique.

Haut de page ETUDE QUANTITATIVE ET QUALITATIVE DE L'H MATOPOSE Les mthodes isotopiques apportent, condition que leur emploi soit bien programm, des informations importantes en complment des mthodes cytoet histologiques qui restent videmment capitales. Mthodologie d'tude de l'rythropose utilisant le fer radioactif Le fer radioactif est le traceur lectif de la synthse d'hmoglobine puisque normalement 80-90 % du fer qui s'change dans le plasma, li la transferrine, est destination de l'organe rythropotique. Le 59Fe a une priode assez longue (45 j), et de ce fait on n'utilise qu'une dose faible (10-20 Ci). Le renouvellement plasmatique du fer est donc une mesure de l'rythropose. Il est mesur quantitativement partir de la vitesse de disparition de la radioactivit injecte, de la sidrmie et du VP (espace de dilution de la transferrine) :

renouvellement plasmatique du fer (mg/j) = K VP (L) sidrmie (mg/L) o K = coefficient de disparition du fer radioactif = 0,693/t 50 (j). Les faits rels sont un peu plus compliqus, parce qu'une fraction du fer gagne des organes non rythropotiques et s'change avec le plasma de telle sorte que la pente de disparition de la radioactivit injecte est en fait biexponentielle. Mais mme si cela complique le calcul (on ne le dveloppera pas ici), le principe de l'interprtation reste le mme. L'incorporation globulaire est mesure par l'apparition de la radioactivit dans les hmaties circulantes, mesure tous les 2 ou 3 jours jusqu'au maximum, vers le dixime jour : Les volumes, plasmatique et globulaire, ont t mesurs en dbut d'preuve par la dilution de la transferrine marque et par celle d'hmaties marques par 51Cr, celle-ci permettant en outre l'tude directe de la dure de vie en mme temps que celle de l'rythropose et sur les mmes prlvements (51Cr et 59Fe sont faciles discriminer). Ces paramtres permettent le calcul de la production efficace en gramme d'hmoglobine par jour (1 g d'Hb contient 3,4 mg de fer), sa vitesse partir de la courbe d'incorporation, et l'hmolyse autologue partir de la comparaison du volume sanguin et de la production quotidienne calcule. Les comptages externes mesurent, d'une faon semi-quantitative, la fixation et la libration du fer dans les zones d'intrt : sacrum (organe reprsentatif de l'rythropose chez l'adulte), foie, rate, ventuellement d'autres zones (tumeur suppose rythropotique par exemple). Exploitation clinique de l'tude cintique de l'rythropose Cette mthodologie est longue. Il est donc ncessaire qu'une telle tude soit faite pour une raison clinique bien prcise. Les exemples ci-dessous n'en sont qu'une schmatisation. Le rapport direct clinicien-isotopiste est, particulirement dans ce cas, capital.

Dans les carences martiales, le test est presque toujours inutile, ne montrant qu'une grande vitesse de renouvellement. Dans les hmolyses connues, le test au fer radioactif donne une information sur la lyse autologue, alors que l'injection simultane d'hmaties homologues marques par 51Cr complte l'information sur le mcanisme. L'association des deux mthodes peut donc tre utile pour le diagnostic et l'indication thrapeutique (sige de la destruction), mais le plus souvent le seul test utilisant 51Cr est suffisant. Dans les pancytopnies par dfaut de production, la mthode isotopique a un faible intrt, sauf dans les cas, non rares, o il y a hsitation entre aplasie quantitative et mylodysplasie avec moelle pauvre. La mise en vidence d'un trouble qualitatif (renouvellement plasmatique du fer peu ralenti, fixation sacre non ngligeable, contrastant avec une incorporation globulaire faible et une sortie incomplte du fer fix dans le sacrum) est un lment trs fort pour le diagnostic de mylodysplasie. Dans les cas o on se demande seulement s'il existe une mtaplasie mylode,

il est probable que la scintigraphie mdullaire est plus utile parce que plus simple. Mais si elle est dmontre, il peut tre important de savoir ce qu'il reste de moelle active, et de mesurer les volumes fractionnels, le taux de lyse, tous paramtres utiles au pronostic. Surtout, elle doit tre faite avant la splnectomie : une hyperhmolyse, une hypervolmie, avec une moelle restant active, sont en faveur de ce geste chirurgical d'indication difficile. Autres mthodes de mesure de la mylopose On ne dispose pas de traceur spcifique de la thrombocytopose. Le 35S et la slno75-mthionine n'ont t employs qu'en recherche et sont d'ailleurs peu adapts. La seule mthode pratique est le calcul partir de la dure de vie (cf supra). La cintique de la granulopose a t mesure, mais seulement en exprimentation, en utilisant la thymidine tritie. La quantification des cellules souches repose sur des mthodes de culture in vitro ; la mesure de la fraction des cellules en cycle et au repos (Go), utilise aussi l'incorporation de la thymidine.

Haut de page ABSORPTION DIGESTIVE Les mthodes isotopiques ont sur les anciennes mthodes de bilan un triple avantage ; la dose du nutriment est physiologique (et non une dose de charge) ; le nutriment peut tre apport sous sa forme naturelle ; la mesure est rigoureuse et prcise. Mthodologie Le produit tester est apport, soit sous forme d'un repas marqu (absorption du fer), soit sous forme d'un mdicament marqu (tude de l'absorbabilit d'une drogue en exprimentation), soit sous forme d'un produit avec ou sans le cofacteur de l'absorption (cas de la vitamine B12 ingre lie et non lie au facteur intrinsque, en profitant de l'existence de deux traceurs discriminables, 57Co et 58Co).

La mthode thoriquement la plus simple est de comparer la radioactivit ingre et celle excrte ; la diffrence est la quantit absorbe. Mais ceci oblige un recueil prolong des selles et des manipulations dsagrables. Une variante de cette technique est l'emploi simultan d'un traceur non absorbable (par exemple baryum, chrome) ; le rapport radioactivit du produit d'intrt/celle du produit inerte est mesur l'ingestion et dans des chantillons des excreta ; la baisse du rapport est une mesure de l'absorption. Un second groupe de mthodes s'appuie sur la physiologie du produit utilis. Pour le fer, c'est la comparaison de l'incorporation globulaire entre un traceur donn par la bouche (par exemple 59Fe) et un autre donn par voie veineuse

(par exemple 55Fe). Pour la vitamine B12, c'est le classique test de Schilling, qui mesure l'excrtion urinaire de la vitamine aprs l'injection d'une dose de charge supprimant la capacit de transport et permettant ainsi de doser l'absorption d'aprs la fuite urinaire. Une troisime technique, thoriquement idale, est l'emploi du compteur global. Ce qui reste du traceur, aprs l'excrtion, est la quantit absorbe. Elle permet l'emploi de trs faibles doses, donc totalement sans risque. Mais cette mthode est dpendante d'un appareillage trs coteux, peu adapt la clinique humaine et qu'on ne trouve pas dans les services de mdecine nuclaire.

Utilisation clinique - Absorption du fer L'indication clinique de cette tude est restreinte. Il est trs rare qu'une anmie carentielle soit due une malabsorption du fer sans d'autres malabsorptions videntes. Une seconde indication concerne la mise sur le march de mdicaments. L'tude objective de l'absorption est importante pour prciser si tel ou tel adjuvant mrite d'tre utilis. L'intrt majeur de ce type d'tude est pidmiologique. Le taux d'absorption du fer est un index de la carence. L'tude d'absorption des repas marqus peut indiquer si les modalits de prparation (cuisine) ou la prsence d'ventuels inhibiteurs (th, argile) ont une responsabilit dans cette carence. La supplmentation systmatique prvue par les organisations internationales pour les populations carences doit tre rflchie : meilleure prsentation et meilleure acceptation certes, mais aussi bonne assimilation au meilleur cot. Utilisation clinique - Vitamine B12 L'intrt pratique est ici beaucoup plus clair. Existe-t-il un dfaut d'absorption, et, dans ce cas, est-il li un dfaut de scrtion du facteur intrinsque ? Le test de Schilling utilisant les deux traceurs rpond ces deux questions. Cet examen est demand d'abord par les gastroentrologues, qui l'utilisent comme test d'absorption et de fonction de l'intestin terminal : ici les deux isotopes sont absorbs (ou mal absorbs) simultanment. L'intrt pratique semble tre l'tude du caractre plus ou moins diffus d'une entropathie, d'un grle radique, d'une maladie de Crohn, et de l'effet de mdications (antibiotiques en cas de pullulation microbienne, rgime sans gluten dans la sprue). Il est demand plus rarement pour la recherche d'une maladie de Biermer, soit par les neurologues pour des syndromes des cordons postrieurs, soit par les hmatologistes du fait d'une macrocytose inexplique. On retient le diagnostic de maladie de Biermer quand le taux d'absorption avec facteur intrinsque est de 2,5 fois ou plus celui sans facteur intrinsque. Il existe une cause d'erreur potentielle : la vitamine B12 cristalline employe dans le test peut tre mieux absorbe que la vitamine des aliments. Comme pour le fer on peut prparer un repas marqu.

Haut de page RENOUVELLEMENT DES PROT INES La cintique de renouvellement (production, perte) de protines plasmatiques est une question quelquefois pose au mdecin nuclaire hmatologiste. Mthodologie Toute protine purifie peut tre marque, mais les conditions du marquage sont draconiennes, car il est ncessaire de ne pas l'abmer, avec le risque d'aboutir alors de fausses conclusions. Le marqueur est gnralement l'iode radioactif, mais d'autres traceurs peuvent tre utiliss. Comme l'indique le schma ci-dessous, les protines s'quilibrent entre un espace circulant et un espace extracirculant. La disparition du traceur introduit en (1) se fait donc selon un systme de deux exponentielles. Si on dispose d'assez de prlvements du plasma (compartiment 1), on dterminera A, B, et , et donc le volume respectif des compartiments et les flux d'change entre eux.Schma Utilisation clinique En hmatologie, on peut tre amen mesurer les espaces de diffusion et les flux d'change de l'albumine et du fibrinogne. En pratique, en dehors de la quantification des entropathies avec fuite digestive d'albumine, ces mthodes sont trs rarement utilises. Le fibrinogne marqu par 131I est encore utilis par certains, avec une efficacit discute, pour la mise en vidence de thromboses.

Haut de page D TECTION ET LOCALISATION DES H MORRAGIES DIGESTIVES Aprs marquage et rinjection des hmaties, on peut mesurer la radioactivit des selles, et ainsi quantifier des hmorragies. Les cliniciens s'intressent davantage la mise en vidence du site d'une hmorragie digestive, qui n'est pas toujours visualis par artriographie ; on emploie pour cela les hmaties marques par 99m Tc et la scintigraphie par gammacamra ; ceci permet de voir dans quelle partie de l'abdomen apparat la flaque de radioactivit, et guide le chirurgien. Mais l'examen n'est valable que si, au moment de l'preuve, l'hmorragie est importante ; c'est donc un examen faire d'urgence, et non pas sur programmation.

Haut de page FLUX VASCULAIRES Il existe des mthodes permettant le calcul du flux vasculaire dans les organes, notamment en utilisant des gaz rares (xnon 133), ou le calculant lorsque le traceur se fixe immdiatement dans l'organe, ou lorsqu'il s'quilibre avec un pool vasculaire changeable situ dans l'organe en question (cas des plaquettes qui s'quilibrent entre pool circulant et pool splnique). L'intrt clinique de ces mthodes est actuellement encore mal dfini, mais pourrait devenir important quand elles seront bien au point, notamment pour le flux sanguin splnique. En utilisant une injection en bolus d'hmaties marques par 99m Tc, et une gammacamra dote de l'lectronique adquate, on peut mesurer la fraction d'jection du ventricule gauche : Cette mesure est importante en hmatologie et oncologie pour dtecter l'apparition et suivre l'aggravation des cardiomyopathies induites par les anthracyclines. Une rduction moins de 50 % de la fraction d'jection (valeur normale 60 - 70 %) est une indication certaine d'avoir supprimer ce mdicament.

Haut de page SCINTIGRAPHIE EN H MATOLOGIE La mdecine nuclaire est dans une certaine mesure mal adapte l'imagerie, car la dfinition des images est, pour nous, toujours infrieure celle donne par les techniques de radiographie traditionnelles. Cependant, plusieurs remarques sont utiles :

l'irradiation du sujet, problme parfois mis en avant, est du mme ordre ou mme souvent plus faible avec les scintigraphies qu'avec les radiographies (conventionnelles ou scanner) ; les techniques isotopiques ont un intrt particulier lorsqu'elles sont spcifiques : par exemple, en employant un traceur spcifique d'organe (fer, iode) ou de tumeur (anticorps), ou de fonction (collodes et systme macrophagique par exemple) ; la scintigraphie apporte une information quantitative et dynamique : quantitative parce que les donnes de l'enregistrement peuvent tre traites par ordinateur ; dynamique parce qu'on peut enregistrer l'volution dans le temps de la fixation d'un traceur dans un organe et sa sortie.

Mthodologie Elle repose sur trois ncessits :

un appareillage convenable pour la dtection, c'est--dire une gammacamra grand champ et si possible une tomocamra (la camra de positrons n'a d'intrt que si on a accs un cyclotron producteur d'isotopes vie courte metteurs bta+) ; une informatique performante et bien adapte ; des traceurs bien choisis pour le problme pos, c'est--dire aussi fonctionnels qu'il se peut. Dans cet esprit, la mdecine nuclaire est de la physiologie, plus que de l'imagerie.

Scintigraphie mdullaire Cet examen scintigraphique est trs utilis actuellement en hmatologie. Le tissu histiocytomacrophagique est marqu par les collodes de 99m Tc. Le tissu rythroblastique est marqu idalement par 52Fe (metteur de positrons de priode courte : 8 h, mais cet isotope, produit de cyclotron, n'est pas disponible en France et trs peu de services disposent d'une camra positrons). On utilise donc volontiers la transferrine marque par 111In, comme succdan , puisqu'il est transport par la transferrine, et se fixe sur les rcepteurs de celle-ci, qui sont propres au tissu rythropotique. Des anticorps monoclonaux antiprotines granulocytaires pourraient tre, de mme, des marqueurs du tissu mylode. La scintigraphie par les collodes donne une bonne apprciation quantitative de la richesse mdullaire : diminue dans les hypoplasies, augmente avec extension dans les hmolyses chroniques. Mais, dans les aplasies dissocies (par exemple les rythroblastopnies pures) o le systme rticuloendothlial est normal, la scintigraphie est normale avec ce traceur. Les images obtenues par l'indium sont de moindre qualit, cause d'une mission photonique (170 KeV) moins bien adapte la dtection par la gammacamra, mais ont plus de spcificit. Cependant, les cellules non rythropotiques qui ont des rcepteurs de la transferrine (par exemple des tumeurs, des leucmies, des lymphomes) seront marques. L'intrt majeur de cette scintigraphie est de mettre en vidence la mtaplasie rythropotique de la rate, car l'indium ne se fixe pas dans la rate normale. Les images obtenues dans les mylofibroses primitives ou postpolyglobulie sont caractristiques : mtaplasie splnique, affaiblissement de la fixation dans le squelette axial, extension aux zones para-articulaires distales (genoux, coudes, parfois chevilles). Un autre intrt est pronostique : avec le temps, la fixation splnique augmente et celle osseuse diminue ; ceci a un intrt pour l'indication de la splnectomie. On a propos rcemment le 99m Tc-sestamibi, un complexe lipophile, pour mettre en vidence par scintigraphie les dpts lipidiques mdullaires dans la maladie de Gaucher. Un intrt de la scintigraphie peut tre aussi de guider la ponction de moelle, dans des cas de fibrose ou de ncrose o elle indiquera les sites rsiduels ventuels d'hmatopose active. Scintigraphie osseuse

Elle a son intrt majeur en cancrologie (dtection de mtastase) plus qu'en hmatologie o les lsions du mylome sont moins bien visualises que par la radiographie en gnral. De mme, dans les lymphomes, la scintigraphie osseuse a peu d'intrt. Un point particulier concerne le neuroblastome o la mta-iodo-benzylguanidine (MIBG - 131I) a une bonne spcificit et peut dtecter des mtastases osseuses encore inapparentes. Scintigraphie splnique Elle utilise soit des collodes marqus par 99m Tc, qui se fixent dans le foie et la rate, soit des hmaties marques lses par la chaleur qui se dtruisent dans la rate. Elle permet la mesure de la taille d'une rate difficile palper, la dtection d'hmatomes, de kystes... En fait, l'chographie et la radiographie (scanner) sont aussi prcises. Son intrt persiste cependant cause de la nature fonctionnelle de la mthode, pour mettre en vidence l'asplnie fonctionnelle d'une drpanocytose et pour rechercher de petites rates accessoires en cas de rechute d'hmolyse ou de thrombopnie aprs splnectomie. Lymphographie isotopique Cette mthode utilise l'injection de sulfure de rhnium collodal marqu par 99m Tc. Le traceur est inject par voie sous-cutane dans le territoire drain par les lymphatiques explorer. En cancrologie, les intrts pratiques sont, d'une part l'tude des gros bras aprs mammectomie et curage ganglionnaire de l'aisselle, pour juger de la circulation lymphatique, d'autre part la visualisation de la chane mammaire interne, dont l'anomalie peut conduire modifier le champ d'irradiation. En hmatologie, l'indication est faite des contre-indications (ge, tat cardiaque ou pulmonaire) de la lymphographie traditionnelle et de ses checs (impossibilit de dnuder des lymphatiques du pied). La scintigraphie donne de moins belles images que la radiologie, mais elles peuvent tre utiles. Recherche scintigraphique de localisations tumorales La scintigraphie peut tre employe pour rechercher, avec une spcificit malheureusement mdiocre, des localisations ganglionnaires ou extrahmatopotiques de lymphomes hodgkiniens ou non hodgkiniens. Le traceur le plus utilis est le gallium 67 (metteur gamma de 100, 180 et 390 KeV, priode 78 h). Malheureusement, les images abdominales obtenues sont souvent difficilement interprtables cause de la fixation hpatique et de l'excrtion intestinale du traceur. Des localisations ganglionnaires malignes ont pu tre utilement visualises dans le mdiastin ou dans des groupes ganglionnaires priphriques. Cette mthode a pu aussi rvler des localisations malignes pulmonaires. En fait, la scintigraphie au gallium est moins utile au bilan d'extension que pour la surveillance sous traitement. Si une masse ganglionnaire persiste, elle peut tre encore tumorale, ou fibreuse rsiduelle ; la fixation de 67Ga serait un fort argument pour la premire hypothse. Des travaux

l'octrotide marqu par 111In-DTPA (acide dithylne triamine penta-actique), cause de la prsence de ses rcepteurs sur les cellules lymphodes. Cet emploi pose peu prs les mmes problmes que celui du gallium. Il faut citer ici l'utilisation possible du 18 F-dsoxyglucose, comme scintigraphie mtabolique des cancers et lymphomes : intrt possible pour le diagnostic et le pronostic (la sensibilit serait de 100 %, contre seulement 90 % ou peut tre moins pour 67Ga) mais la dtection du positron exige une camra concidence, que peu de services possdent. Dans le mme esprit de scintigraphie mtabolique, des traceurs radio-iods pourraient tre valables pour tester l'hypoxie tumorale. Une utilisation trs particulire des mthodes isotopiques est la scintigraphie salivaire pour rechercher une maladie de Sj gren aprs une greffe de moelle (avec 99m Tc libre). Un intressant usage, si les faits sont confirms, serait l'emploi de 99m Tc-MIBI (mthoxy-isobutyl isonitrile) comme un traceur de la glycoprotine, produit du gne de multirsistance, en cancrologie et peut-tre dans les lymphomes. Recherche d'infection C'est un sujet important dans tous les domaines de la mdecine (ranimation et mdecine interne, rhumatologie et orthopdie, pathologie digestive, cardiologie, nphrologie). En oncologie et hmatologie, et dans l'infection VIH, il s'agit de visualiser un ventuel foyer infectieux, cause possible de fivre. Un problme particulier est ici la frquente neutropnie due la maladie ou son traitement, qui rend difficile ou impossible le marquage des polynuclaires autologues. De nombreuses techniques isotopiques sont disponibles ou en dveloppement. La plus utilise, probablement actuellement la plus fidle sauf pour la visualisation des infections du squelette axial, est le marquage des polynuclaires par 111In-oxinate, ou 99m Tc-hexamthyl-propylne-amine-oxine (HMPAO), ce dernier donnant une meilleure qualit d'images. Les immunoglobulines peuvent tre marques par 111In ou 99m Tc et se fixeraient par leur partie Fc sur les rcepteurs Fc des foyers inflammatoires ; leur sensibilit et leur spcificit sont peu prs similaires celles des leucocytes marqus ; l'inconvnient est le cot du ractif, l'avantage est la possibilit de la scintigraphie en cas de leucopnie. On peut utiliser aussi des nanocollodes qui s'accumulent dans les zones inflammatoires trs vascularises ; leur spcificit est mdiocre. Le citrate de gallium 67, de bonne sensibilit mais de faible spcificit, est valable pour la recherche des spondylodiscites. Des anticorps monoclonaux murins antigranulocytes (anticorps anti-NCA), marqus par 99m Tc, sont utiliss pour la recherche d'infections osseuses, endocardiques, abdominales ; leur inconvnient est le risque de dclencher une rponse HAMA (human anti-mouse antibody) empchant la rptition de l'tude. Divers dveloppements sont en cours : marquage d'antibiotiques polyvalents, d'interleukines, et surtout de peptides chimiotactiques. Immunoscintigraphie

est lent. Ceci est d l'insuffisante pntration de l'anticorps dans la cible (le rapport fixation/gramme de tumeur sur fixation/gramme de tissus normaux dpasse rarement 3), la dure de sjour vasculaire prolonge (bruit de fond lev), aux difficults de marquage (pouvant altrer la molcule), et surtout au dveloppement rapide de HAMA (empchant la rptition des tudes). Il ne faut pas non plus ngliger le cot lev du ractif. Pour diminuer le bruit de fond et peut-tre augmenter la fixation, on peut utiliser des fragments d'anticorps Fab ou F (ab') 2. Pour viter ou diminuer le dveloppement de l'immunisation antisouris, on dveloppe des anticorps chimriques (anticorps humains avec simplement l'pitope utile murin) ou des anticorps humains (mais trs difficiles obtenir in vitro). On peut aussi jouer sur des facteurs lis l'hte pour augmenter la fixation tumorale (hyperthermie, interfron) ou altrer le catabolisme de l'anticorps (plasmaphrse, hypergammaglobulinmie). La dtection est gnralement suprieure par SPECT (single photon emission computed tomography) que par scintigraphie planaire. En clinique, c'est essentiellement l'oncologie qui bnficiera des progrs mthodologiques (bilan d'extension locale et/ou ganglionnaire, recherche de mtastases), mais les tumeurs solides hmatopotiques (lymphomes) sont galement concernes. L'immunoscintigraphie est ncessaire avant immunothrapie pour mesurer le taux de fixation et donc calculer la dose employer.

Haut de page DOSAGES PAR IMMUNO-ESSAI

Mthodologie En tant que traceur, facile dtecter trs faibles doses ne changeant pas le mtabolisme, un radio-isotope est un outil idal. Il est trs particulirement utilis pour les dosages par comptition ; l'isotope n'est ici qu'un traceur, d'autres peuvent tre employs (dosages immunoenzymatiques, de polarisation de fluorescence...), le choix tant fonction de la commodit du test, de l'quipement du laboratoire, du cot des ractifs, et de la lgislation locale. En fait, dans la plupart des cas, le dosage est initialement mis au point par mthode radio-immunologique (RIA) (qui reste le gold standard), puis dvelopp par mthode immunoenzymatique (EIA) lorsqu'il devient un test de routine. Rappelons que cette mthodologie a valu le prix Nobel Roselyne Yalow. Intrt clinique des immuno-essais en hmatologie Plusieurs dosages par comptition sont devenus d'intrt clinique rgulier en hmatologie. Nous les citerons ici, sans prtendre tre exhaustif.

Les antignes viraux (hpatites, VIH, parvovirus pour ne citer que ceux qui intressent les hmatologistes et les transfuseurs) et leurs anticorps sont dtects et doss par immuno-essai. La vitamine B12 srique et les folates (sriques et rythrocytaires) sont doss

par RIA simultanment (B12 marque par 58Co, folates par 125I). L'indication concerne les anmies macrocytaires, et des tudes nutritionnelles. Il faut se mfier dans l'interprtation des taux bas de B12, extrmement frquents chez le sujet g. L'anticorps antifacteur intrinsque est aussi dos par immuno-essai. La ferritine est dose par RIA ou EIA, mais le dosage nphlomtrique est moins cher ; encore faut-il dmontrer qu'il est aussi fiable. Pour l'immunoessai, il faut se mfier du hook-effect, paradoxale baisse du chiffre mesur aux teneurs sriques leves, ce qui impose dans cette situation de faire des dilutions du srum transmis au laboratoire. La 2-microglobuline (RIA ou EIA), est un marqueur important du pronostic dans les lymphomes malins, les mylomes, les macroglobulinmies, peut-tre les leucmies lymphodes chroniques. Une cause d'erreur possible est l'excs d une insuffisance glomrulaire. Le dosage est aussi utile pour le pronostic de l'infection par le VIH. Le dosage du rcepteur soluble de la transferrine (RIA) a t rcemment dvelopp ; il est un index de la richesse du tissu rythropotique. Il faut cependant tenir compte de la sidrmie, la carence martiale augmentant le taux des rcepteurs. Le dosage pourrait concurrencer la mesure de la rticulocytose, mais il mesure aussi une hyperplasie rythropotique inefficace. titre anecdotique, il a t propos pour dtecter le dopage par l'rythropotine : trace de la stimulation rythropotique. Curieusement ce dosage reste peu prs ignor en France. Le dosage du procollagne III (RIA) est un indicatif, non du degr de fibrose (collagne fix), mais de l'volutivit de celle-ci. Son intrt est donc pronostique et d'valuation de l'effet des traitements, dans les mylofibroses (splnomgalie mylode primitive ou postpolyglobulie, hmopathie maligne avec fibrose), dans les cirrhoses hpatiques, dans la sclrodermie. Le dosage du PDGF (platelet-derived growth factor) et des FGF (fibroblast growth factors) pourrait tre intressant dans ces maladies. En hmostase, de nombreux facteurs (facteur Willebrand, fibrinopeptides, thromboglobuline et PF4, protines membranaires...) sont doss par immunoessai (RIA ou EIA). D'autres sont plutt analyss par des tudes fonctionnelles plaquettaires. Les radio-isotopes sont employs dans des tests fonctionnels cellulaires, de routine ou pas ; citons ici le test de lymphotoxicit, utilisant 51Cr. On peut mettre en vidence des anomalies de la p53, par le dosage des anticorps anti-p53 qui se dveloppent en cas de mutation de cette protine ; l'intrt est uniquement pronostique, et en fait plus intressant en oncologie qu'en hmatologie, o la p53 est rarement anormale. Un champ d'application trs vaste est le dosage des facteurs de croissance (cytokines). Celui le plus couramment employ est le dosage de l'rythropotine. Les mthodes utilises (RIA, EIA) sont trs reproductibles, la diffrence des mthodes biologiques quelquefois encore publies. L'intrt pratique est de dmontrer un taux bas de ce facteur dans les anmies des cancers et des mylodysplasies, o un taux bas d'Epo peut faire esprer une efficacit du traitement. Un autre intrt est la dmonstration d'un taux bas dans les polyglobulies vraies, d'un taux lev dans les polyglobulies secondaires. On doit noter que l'interprtation du dosage doit tre faite en fonction de l'hmatocrite du jour du prlvement : la faible dure de vie de l'Epo (environ 6 h) fait qu'elle est trs adapte au degr de l'anmie. Pour le moment, il n'existe pas de dosage fiable de la thrombopotine. Les dosages des facteurs de croissance granuleux (G-CSF [granulocyte colony stimulating factor] et GM-CSF [granulocyte macrophage colony stimulating factor]) ou

totipotents (interleukine 3, stem-cell factor) n'ont d'intrt que pour la recherche clinique. Parmi les autres facteurs de croissance, il en est peu d'intrt de routine. Peuttre peut-on citer le rcepteur l'interleukine 2, facteur de pronostic pour les lymphomes, et celui l'interleukine 6, probablement important pour les mylomes. Dans les lymphomes aussi le dosage de CD 30, un marqueur de diffrenciation qui a une fraction extracellulaire soluble, pourrait tre utile. On connat actuellement 17 interleukines, plus des facteurs spcifiques mylodes, par exemple interleukine 3, CSF, M-CSF, thrombopotine, et d'autres facteurs rgulateurs non inclus dans cette liste, par exemple les TGF (transforming growth factors), les intgrines, les TNF (tumour necrosis factors). Pour presque tous ces cas, ds que le facteur et son rcepteur ont t clons, on a pu dvelopper un RIA. En pratique clinique, mme si l'antigne et l'anticorps sont proposs la vente, et un dosage ainsi possible, l'utilisation n'est encore que de recherche clinique.

Pharmacocintique Les mdicaments antileucmiques ou anticancreux sont doss des molarits infrieures 10-7, 10-8 soit par la mthode de comptition, soit par HPLC (chromatographie liquide haute performance), soit par spectrographie de masse. L'avantage de la mthode isotopique est sa simplicit et sa prcision ces trs faibles taux ; son inconvnient est que, ici aussi, elle dose un produit et une partie de ses mtabolites, sans les discriminer ; c'est le cas par exemple pour les anthracyclines. Dans certains cas, l'tude pharmacologique peut utiliser des drogues marques (tude de leur absorption, de leur rpartition, de leur mtabolisme). L'intrt de produits retard, et par exemple de la libration de drogues partir de liposomes, est dmontr aussi grce des marqueurs de cette forme pharmacologique. En pratique clinique, en hmatologie, seul le dosage de la ciclosporine est d'utilisation rgulire. Il permet de s'assurer d'une prise convenable, et d'un taux qui ne cre pas de risque rnal. Les dosages mis au point pour le mthotrexate lorsqu'on tentait une utilisation trs fortes doses, pour les anthracyclines lorsqu'on analysait des voies originales d'introduction, pour l'interfron lorsqu'on craignait le dveloppement d'anticorps, ont permis des publications de recherche clinique, mais n'ont pas dbouch sur des utilisations pratiques. Le marquage des mdicaments est en revanche indispensable dans les essais de phases I et II. Dans ces cas il y a une ncessit de modlisation rendant compte du temps de disponibilit du produit aux doses actives, la fois dans le compartiment circulant et celui non circulant. L'analyse de ces donnes peut, trop souvent, tre critique. En tout cas, ces analyses ne sont pas entre les mains des cliniciens, et ce sont gnralement les socits pharmaceutiques intresses qui marquent le produit, s'assurent de sa qualit, dfinissent le design de l'tude cintique, et font les calculs, le clinicien fournissant le malade et les prlvements, et les biologistes de l'hpital tant oublis pour l'analyse des rsultats... et la publication des rsultats.

Haut de page UTILISATION DES RADIO-ISOTOPES EN TH RAPEUTIQUE H MATOLOGIQUE

Radiophosphore Cet isotope metteur , de priode 14,5 jours, se fixe dans l'ADN des cellules en prolifration et dans le pool renouvelable du phosphate des os. Il a t propos ds les annes 1940 pour le traitement des hmopathies malignes chroniques (John Lawrence). Il n'est plus utilis dans les leucmies mylodes et les lymphodes chroniques, o la chimiothrapie est plus efficace. Dans les thrombocytmies, des essais comparatifs ont montr que la chimiothrapie donnait des rmissions plus frquentes et plus durables, mais il peut y avoir une indication dans des cas rsistants. Son indication reste essentielle dans les polyglobulies. Dans cette maladie, le radiophosphore (prescrit en Europe la dose usuelle de 1 mCi/10 kg de poids, aux Etats-Unis de 2,7 mCi/m2) donne presque 100 % de rmissions compltes d'excellente qualit, de longue dure (mdiane dans notre srie = 32 mois), sans aucune toxicit. Cette efficacit est suprieure celle de toutes les chimiothrapies, sauf peut-tre le busulfan, dont les rmissions sont gales ou mmes suprieures celles du 32P, mais qui comporte un risque d'aplasie grave et de fibrose pulmonaire s'il est mal prescrit ou son emploi mal suivi. Le danger de ce traitement est en fait le risque leucmogne long terme, c'est--dire au-del de la dixime anne, risque qu'il partage d'ailleurs avec les autres chimiothrapies radiomimtiques, et mme non radiomimtiques. Notre analyse, portant sur plus de 600 cas, indique un risque actuariel de leucmie de 10 % 10 ans, mais qui n'est pas dpendant de la dose reue, et n'est pas rduit par adjonction comme traitement d'entretien d'une chimiothrapie non radiomimtique (hydroxyure), qui pourtant diminue des deux tiers la rptition des doses de 32P. L'indication thrapeutique doit donc tenir compte des avantages : bonne rmission facile obtenir et suppression du risque vasculaire, et des risques qui lui sont dus : leucmie tardive. Ainsi propose-t-on le phosphore aux sujets gs de plus de 65 ans (le risque vasculaire est lev, le risque leucmique au-del de la 75e anne devient statistiquement mince), ou aux sujets de moins de 65 ans, mais qui ont un risque vasculaire lev (antcdents de thrombose artrielle ou veineuse, thrombocytmie importante, diabte, hypertension artrielle, probabilit de mauvaise surveillance). Un autre risque, dans les polyglobulies, est celui d'volution vers la mylofibrose avec splnomgalie mylode. Ce risque est particulirement lev chez les sujets seulement saigns ou traits par une chimiothrapie non agressive (hydroxyure). La mylosuppression par 32P amne un avantage majeur sur ce point. Autres emplois thrapeutiques des radiolments Ils sont pour le moment limits.

La lymphographie isotopique thrapeutique (131I) n'est plus gure utilise, car les ganglions malins sont prcisment ceux qui fixent peu le produit de contraste, et parce qu'il y a un risque important d'irradiation pulmonaire. Mningites leucmiques. Des publications rappellent de temps autre l'intrt de collodes marqus (198Au) pour le traitement curatif ou prventif des mningites leucmiques. L'irradiation locale des arthrites hmophiliques par des metteurs (or, yttrium, erbium, rhnium) est une mthode thrapeutique symptomatique parfois utile. L'emploi d'anticorps monoclonaux marqus en thrapeutique hmatologique a fait l'objet de dveloppements rcents pour les lymphomes plus que pour les leucmies. Les anticorps utiliss sont dirigs contre des antignes lymphodes B, et les essais actuels emploient des anticorps chimriques. Les deux isotopes en gnral utiliss sont 131I, dont l'mission permet l'effet thrapeutique, et l'mission la mesure de la localisation et la dosimtrie, et 90Y, qui est un metteur pur, mais qui ne permet pas de scintigraphie de reprage. Des metteurs (bismuth, astatine) sont envisags, mais n'ont t utiliss que chez l'animal : leur faible parcours au lieu d'mission fait esprer un effet destructeur majeur, mais un effet mutagne important.

Les questions importantes sont le taux de fixation la cible et, corrlativement, la dose utiliser. La toxicit est, en effet, mdullaire (pancytopnie). Cette radiothrapie a mme t envisage l'occasion d'une greffe de moelle, permettant la fois la prparation la greffe et un traitement ablatif spcifique. Les rsultats dj publis dpassent 200 cas. Ils concernent surtout les lymphomes non hodgkiniens, avec de bons rsultats dans des cas graves, avec ou sans greffe ultrieure. D'autres anticorps ont t employs dans des leucmies aigus myloblastiques. Comme la plupart de ces essais ont t conduits dans des cas en bout de course, on ne peut encore gure juger aujourd'hui de l'apport pratique ultrieur de cette mthode. Dosimtrie Nous prsentons le tableau I concernant l'irradiation corps entier observe avec les radio-isotopes les plus communment employs en hmatologie. Ces chiffres seraient diffrents si on analysait (ce qui n'est pas facile) l'irradiation de l'organe cible ventuel, par exemple la moelle pour le 59Fe, la rate et/ou le foie pour les hmaties marques. Rappelons que la dose moyenne annuelle acceptable pour la population normale est de 50 mSv (l'irradiation naturelle en France est de 2 mSv). On voit donc que, en dehors de certains examens faits chez des malades graves avec une pathologie maligne, l'utilisation des radio-isotopes en hmatologie n'entrane aucune irradiation importante. Rfrences [1] Desai AG, Thakhur ML Radio-pharmaceuticals for spleen and bonemarrow studies. Semin Nucl Med 1985 ; 15 : 229-239 [2] Jurcic JG, Scheinberg DA Recent developments in the radioimmunotherapy of cancer. Curr Opin Immunol 1994 ; 6 : 715-721

[3] Kaminski MS, Zasadny KR, Francis IR , et al. Iodine -131-anti-B1 radio-immunotherapy for B cell lymphoma. J Clin Oncol 1996 ; 14 : 1974-1981 [4] Krenning EP, Kurkkeboom DJ, Baker WH Somatostatin receptor scintigraphy with 111In and 123I - octreotide : experience with more than 1 000 patients. Eur J Nucl Med 1993 ; 20 : 716-731 [5] Najean Y Thrombocytopnies pures sans excs de destruction : un syndrome encore mal class. Hematologie 1996 ; 2 : 224-232 [6] Najean Y, Rain JD. Treatment of polycythemia vera Use of 32P alone or in combination with maintenance therapy using hydroxy-urea in 461 patients over the age of 65 years. Blood 1997 ; (sous presse) [7] Pearson TC, Guthrie DL, Simpson J, Chinn S, Barosi G, Ferrant A , et al. Interpretation of measured red cell mass and plasma volume. Br J Haematol 1995 ; 89 : 748-756 [8] Rain JD, Najean Y, Billotey C Bone-marrow scintigraphy as useful method for estimating the physiological status of bone-marrow and spleen in polycythaemia vera. Leuk Lymph 1996 ; 22 (suppl 1) : 105-110 1997 Elsevier Masson SAS - Tous droits rservs

Fig :

Fig :

Tableaux

Tableau I.

Encyclopdie Mdico-Chirurgicale 13-002-B-10

13-002-B-10 4-080-A-15

Anmies dysrythropotiques congnitales


J Delaunay

Rsum. Les anmies dysrythropotiques congnitales (CDA) reprsentent un groupe de maladies gntiques rares qui affectent lrythropose, habituellement un stade avanc de celle-ci. Les rythroblastes sont anormaux. Une fraction dentre eux subissent une destruction intramdullaire, et ceux qui demeurent donnent naissance une quantit insuffisante de globules rouges. Les hmaties mises en circulation sont elles-mmes anormales et connaissent une hmolyse prmature. lanmie dorigine centrale sajoute donc, encore que de faon moindre, une anmie dorigine priphrique. Non loin dune dizaine dentits nosologiques, dnies pour la plupart sur des bases morphologiques, entrent ou essayent dentrer dans le cadre des CDA, dont les frontires demeurent donc ce jour incertaines. Deux affections, qui ont le plus grand intrt pratique en raison de leur frquence relative, ont cependant t largement documentes : les CDA I et II. Nous les envisageons en dtail, cependant que les autres CDA, exceptionnelles et insuffisamment dnies, sont seulement mentionnes. Pour les CDA I et II, les manifestations cliniques, les particularits biologiques, notamment les aspects morphologiques de la moelle en microscopie optique et lectronique, et lvolution sont tablies de faon de plus en plus prcise. Leur traitement devient plus spcique, ainsi que lillustre lefficacit de linterfron a dans les formes graves de CDA I. Les gnes de la CDA I et II ont t respectivement localiss en 15q15.1-15.3 et 20q11.2, et les tentatives didentication de ces gnes se poursuivent. Les mcanismes molculaires sous-jacents restent inconnus.
2002 Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.

Mots-cls : dysrythropose congnitale, interfron alpha, maladie hrditaire.

Introduction
Le terme de kongenital dyserythropietische Anmie ou anmie dysrythropotique congnitale (CDA), fut cr par F Wendt et H Heimpel en 1967 [41]. Un an plus tard, les mmes auteurs tablirent une classication partielle des CDA [16]. CDA dsigne aujourdhui un groupe daffections gntiques dans lesquelles lrythropose est qualitativement et quantitativement anormale. Nous verrons principalement les CDA I et II, qui sont les moins rares et les mieux connues, et ne ferons que mentionner les autres CDA. Beaucoup drythroblastes prsentent des anomalies morphologiques, et ceux dentre eux qui nanmoins arrivent maturit sont en nombre insuffisant. Les hmaties correspondantes prsentent elles-mmes des anomalies. Les CDA associent donc un dcit de production des globules rouges et une acclration de leur destruction, donc une anmie dorigine centrale et priphrique la fois, celle-ci tant moindre toutefois que celle-l. Lexamen au microscope optique et lectronique de la moelle a longtemps t, et demeure dans une large mesure, la pierre angulaire du diagnostic. Cependant, des anomalies morphologiques spciques, affectant les rythrocytes eux-mmes, permettent de reconnatre les CDA I et II de faon moins invasive et avec une abilit comparable. Lidentication des gnes responsables, attendue dans un futur proche, devrait ouvrir encore une autre voie diagnostique. La connaissance des protines dfectueuses est le passage oblig de la comprhension des dsordres molculaires sous-jacents. Nul doute que de nouveaux pans de lrythropose normale seront mis jour cette occasion.

Anmie dysrythropotique congnitale de type I


MODE DE TRANSMISSION ET INCIDENCE

La CDA I a une transmission autosomique rcessive. Son incidence est faible mais, faute de rpertoires internationaux solidement tablis, difficile connatre avec prcision. Heimpel fait tat de 77 familles [15]. Wickramasinghe mentionne 70 cas sporadiques [44]. En France, nous avons recrut 12 familles. Un isolat gntique a t trouv parmi des bdouins vivant dans le dsert du Nguev et prsentant un degr lev de consanguinit, avec plus de 25 personnes atteintes [38]. Un cas de CDA I a t rapport dans la population polynsienne franaise, encore que lallle pathogne en cause ait pu tre introduit par les Europens (Roda et al, rsultats non publis). Beaucoup reste faire pour tablir la frquence relle de la maladie et sa distribution au sein de diffrentes populations.
PHNOTYPE CLINIQUE ET BIOLOGIQUE COMMUN

Jean Delaunay : Professeur des Universits, praticien hospitalier, laboratoire dhmatologie, dimmunologie et de cytogntique, hpital de Bictre, facult de mdecine Paris-Sud et Inserm U473, 78, rue du GnralLeclerc, 94275 Le-Kremlin-Bictre, France.

Nous prendrons pour type de description un cas de svrit moyenne, ventualit la plus frquente. Lge de dcouverte se situe dans la premire dcennie. Lanmie est modre et associe un subictre intermittent, une splnomgalie et, parfois, une hpatomgalie. Lanmie reste au-dessus du seuil transfusionnel. Le compte des rticulocytes est normal ou diminu. Il existe une tendance vers la macrocytose et une anisocytose prononce : elliptocytes, pokilocytes avec de nombreux dacryocytes. Les anomalies morphologiques sont associes une discrte rduction de la protine 4.1 lors de llectrophorse des protines de la membrane rythrocytaire ( [1] et rsultats non publis). Ce stigmate biochimique est un phnomne secondaire, mais remarquable par sa constance et donc de grande valeur diagnostique. La

Toute rfrence cet article doit porter la mention : Delaunay J. Anmies dysrythropotiques congnitales. Encycl Md Chir (Editions Scientiques et Mdicales Elsevier SAS, Paris, tous droits rservs), Hmatologie, 13-002-B-10, Pdiatrie, 4-080-A-15, 2002, 4 p.

150 561

EMC [298]

13-002-B-10 4-080-A-15

Anmies dysrythropotiques congnitales


1
Anomalies mdullaires au cours de lanmie dysrythropotique congnitale (CDA) I et II en microscopie optique. CDA I : on observe un pont interchromatinien, aspect le plus caractristique de la CDA I. CDA II : on remarque la prsence de plusieurs rythroblastes binucls.

Hmatologie Pdiatre

supplmentaire ou dun pied bot. On peut aussi observer des yeux bleus en forme damande, un hypertlorisme, un micrognathisme, une grande bouche avec une lvre infrieure paisse, de longues oreilles et des cheveux blonds [7, 24, 45]. Cette liste nest pas exhaustive. On spcule sur le fait que des anomalies dysmorphologiques analogues, quoique diffrentes, surviennent galement dans lanmie de Blackfan-Diamond et lanmie de Fanconi.
ASSOCIATION SINGULIRE

Dans une famille franaise, un syndrome des gnes contigus a t trouv, qui associe une CDA I, une surdit et une azoospermie [39]. On suppose que la dltion au niveau de lacide dsoxyribonuclique (ADN) gnomique, non visible par les mthodes de la cytogntique, a emport le gne responsable de la CDA I, ou sest produite proximit.
GNTIQUE MOLCULAIRE

bilirubinmie est augmente et lhaptoglobinmie diminue. La ferritinmie est accrue. Une augmentation de lhmoglobine A2 et du rapport (a/non-a) de synthse des chanes de la globine in vitro a t rapporte. Il sagit l encore de phnomnes secondaires. Lvolution de la CDA I est marque par des complications biliaires. Il est utile, cet gard, de rechercher, dans le promoteur du gne codant la bilirubine UDP-glucuronosyltransfrase 1, le polymorphisme A(AT7)TAA, associ la maladie de Gilbert [4]. Mais cest la surcharge martiale qui reprsente la menace principale. Il convient de rechercher des polymorphismes du gne HFE associs lhmochromatose primitive [11]. En microscopie optique, la moelle prsente une hyperplasie rythrode et des rythroblastes morphologiquement anormaux. Le cytoplasme de ces derniers peut contenir des ponctuations basophiles. Leur noyau est parfois irrgulier ou caryorrhectique. Un nombre anormal drythroblastes possde deux noyaux, de taille ingale, voire trois ou quatre. Quelquefois, les noyaux de deux rythroblastes spars restent relis par un lament plus ou moins tnu et long de chromatine (g 1). Cest un aspect trs caractristique. En microscopie lectronique, la chromatine prend un aspect spongieux, connu sous le nom de Swiss cheese. Lenveloppe nuclaire prsente des invaginations, permettant lintrusion dans la rgion nuclaire de cytoplasme et dorganelles cytoplasmiques (mitochondries charges de fer, vacuoles autophagiques) [36, 45].
FORMES SVRES

Vingt-quatre personnes atteintes de CDA I, appartenant quatre grandes familles de bdouins (cf supra), ainsi que les apparents sains, permirent, grce la mthode de cartographie de lhomozygotie, de localiser le gne responsable de la CDA I en 15q15.2-15.3 [38]. Ltude reposa sur 14 marqueurs couvrant un intervalle de 12 centimorgans. Des recombinaisons gntiques rtrcirent lintervalle dintrt moins de 1 centimorgan, entre les marqueurs D15S779 et D15S778. Utilisant quatre marqueurs, Hodges et al [17] ont haplotyp six patients anglais non apparents et deux patients libanais apparents. Ceux-ci prsentaient le mme haplotype, alors que ceux-l avaient des haplotypes tous diffrents.
TRAITEMENT

Pendant longtemps, le traitement de la CDA I fut limit des mesures symptomatiques : transfusions, traitement chlateur du fer, cholcystectomie. La splnectomie a des rsultats contrasts [8, 27], ce qui saccorde avec la prdominance de la composante centrale de lanmie. Lutilisation de lrythropotine recombinante na pas deffet [37]. Aprs une dcouverte fortuite [22] et une srie dessais [23, 28, 35, 40, 43] (Roda et al, rsultats non publis), lutilisation de linterfron a sest avre utile pour rduire lanmie dans les formes graves. En gnral, il fait disparatre, ou presque, les besoins transfusionnels. La posologie est mal tablie. Par exemple, Parez et al [28] utilisent 1 million dunits trois fois par semaine dans un traitement institu au cours de la deuxime anne de vie. Roda et al (rsultats non publis) xent la dose 3 millions dunits trois fois par semaine dans une thrapeutique institue lors de la quinzime anne. Nanmoins, le traitement doit tre rduit, eu gard aux complications, notamment neurologiques, gnres par ladministration dinterfron a au long cours. La diminution posologique se fait vue , sur la base des donnes hmatologiques.

Les formes svres se manifestent ds la naissance, et parfois pendant la vie intra-utrine [28, 34, 47] . Avant la naissance, des transfusions intra-utrines peuvent savrer ncessaires [28]. Aprs la naissance, les transfusions simposent parfois un rythme rapproch, faisant de la surcharge martiale un problme rapidement proccupant, qui domine le pronostic. Dans certains cas, une hypertension pulmonaire [14] a t dcrite chez le nouveau-n. Shalev et al [33] ont suggr que soit voqu le diagnostic de CDA I en face dune hypertension pulmonaire chez le nouveau-n.
DYSMORPHOLOGIES

Anmie dysrythropotique congnitale de type II


Aprs la description princeps de lanmie dysrythropotique congnitale de type II (CDA II) par Heimpel et Wendt [16, 41] , Crookston et al [9] ajoutrent deux lments la prsentation biologique de cette affection : la positivit du test dhmolyse par certains srums en milieu acidi, et lagglutination par des srums anti-antigne i. Le premier caractre confre la maladie lacronyme HEMPAS (hereditary erythroblastic multinuclearity with positive acidied serum), qui aujourdhui tombe en dsutude.
MODE DE TRANSMISSION ET INCIDENCE

Des dysmorphologies peuvent tre associes aux manifestations hmatologiques, sans relation avec la gravit de celles-ci, au point que les enfants sont parfois orients dabord vers des units de dysmorphologie [24]. On rencontre, selon des combinaisons variables et des degrs divers, une petite stature, une syndactylie des doigts et/ou des orteils (impliquant, particulirement, les troisime et quatrime orteils), lhypoplasie ou labsence dun ou plusieurs ongles ou dune ou plusieurs phalanges, lexistence dun mtatarsien
2

La CDA II a un mode de transmission rcessif strict. Son incidence est faible mais, de nouveau, faute de rpertoires internationaux disponibles, difficile connatre avec prcision. Seuls Iolascon et al [21] ont tabli un registre document de faon systmatique. Il porte sur 44 familles italiennes et 20 familles non italiennes (originaires dEurope [en dehors de lItalie], dAsie, dAmrique du Nord et de

Hmatologie Pdiatre

Anmies dysrythropotiques congnitales

13-002-B-10 4-080-A-15

primitive (homozygotie pour la mutation C282Y) chez une jeune patiente, associe une CDA II [10] : la CDA II joue le rle dun facteur aggravant de la surcharge martiale. Il convient donc de rechercher des polymorphismes du gne HFE, associs lhmochromatose primitive [11]. Des tumeurs mdiastinales postrieures [26] et des infections parvovirales [42] ont t dcrites, mais avec une frquence bien moindre que dans certaines anmies hmolytiques. En microscopie optique, la moelle prsente une hyperplasie rythrode (la proportion drythroblastes est augmente de cinq dix fois). Les rythroblastes matures sont sensiblement normaux, mais 10 40 % drythroblastes matures (polychromatophiles et acidophiles) sont bi- ou multinucls (g 1). Dans les rythroblastes binucls, les noyaux ont une taille peu prs quivalente. Il existe des cellules ressemblant des cellules de Gaucher. En microscopie lectronique, le caractre le plus marquant, et qui est hautement spcique, est laccolement, le long de la face interne de la membrane plasmique, de vsicules allonges [6, 46]. Il sagit de vsicules du rticulum endoplasmique. Leur copurication avec la membrane rythrocytaire rend compte des protines supplmentaires apparaissant sur le prol lectrophortique des protines de cette dernire (cf supra).
FORMES EXTRMES

Anomalies lectrophortiques des protines de la membrane rythrocytaire au cours de lanmie dysrythropotique congnitale (CDA) II. Llectrophorse est accomplie sur gel de polyacrylamide en prsence de sodium dodcyl sulfate (SDS-PAGE). I et II : coloration par le bleu de Coomassie. I : prol normal ; II : rtrcissement et migration acclre vers lanode de lchangeur des anions 1 dans la CDA II. III VI : rvlation par western blot (aprs SDS-PAGE) ; III : prol normal ; IV VI : prols dans la CDA II ; IV : calrticuline (58) ; V : glucose-regulated protein (73) ; VI : protein disulphide isomerase (59). Les poids molculaires apparents sont donns en kilodaltons [kDa]). Ces trois dernires protines appartiennent au rticulum endoplasmique.

Nouvelle-Zlande). La frquence inhabituellement leve de la CDA II en Italie du Sud semble reter un effet fondateur, suivi par une priode dendogamie, avant que ne surviennent les migrations vers le nord du pays. Nanmoins, il na pas t possible de reconnatre un haplotype commun aux patients italiens, vraisemblablement cause de recombinaisons gntiques qui ont eu le temps de se produire. En France, lincidence de la CDA II semble plus faible encore que celle de la CDA I. Nous avons identi un cas dans la population polynsienne (Roda et al, rsultats non publis), mais nous ne pouvons exclure que lallle responsable ait t apport par les Europens.
PHNOTYPE CLINIQUE ET BIOLOGIQUE COMMUN

Il existe des formes svres. Les manifestations sont agrantes ds la naissance et les transfusions doivent tre mises en place aussitt. La surcharge martiale devient rapidement proccupante. Une tude rythrocintique est motive dans de tels cas, an de dterminer limportance de la squestration splnique et denvisager, le cas chant, une splnectomie. linverse, nous avons observ, dans une fratrie comportant trois cas de CDA II avec un haplotype document, une personne prsentant le mme haplotype que les membres atteints, mais dpourvue de tout symptme, y compris en microscopie lectronique et llectrophorse des protines de la membrane rythrocytaire [3]. Nous navons pu identier la nature du facteur suppresseur mis en cause.
GNTIQUE MOLCULAIRE

La CDA II a une prsentation clinique assez homogne, de gravit modre. Cependant, un petit nombre de cas sont graves : nous les envisageons part. Dans la forme commune, lge de la dcouverte se situe en rgle au cours de la premire dcennie. Lanmie est modre et associe un subictre intermittent, une splnomgalie, et parfois une hpatomgalie. Lanmie reste au-dessus du seuil transfusionnel. Le compte des rticulocytes est normal ou diminu. La bilirubinmie est accrue et lhaptoglobinmie diminue. La ferritinmie est augmente. Llectrophorse des protines de la membrane rythrocytaire montre des anomalies agrantes et spciques, dont la recherche tend remplacer la recherche dune lyse en milieu acidi. La premire anomalie a trait lchangeur des anions 1 (AE1, souvent appel bande 3). Cette glycoprotine prsente un aspect rtrci et une migration acclre vers lanode, tmoin de son hypoglycosylation (g 2) [12]. La deuxime anomalie consiste en la prsence, bien mise en vidence aprs western blot, de protines du rticulum endoplasmique : une glucose-regulated protein (GRP 78) (74 kDa), une protein disulphide isomerase (59 kDa) et la calrticuline (58 kDa) (g 2) [2]. Il sagit de la traduction biochimique de laccolement de membranes la membrane rythrocytaire, comme nous le verrons plus loin. En pratique, les deux anomalies cites reprsentent une aide dcisive au diagnostic. Lvolution de la CDA II est marque par des complications biliaires. Il est utile, cet gard, de rechercher dans le promoteur du gne codant la bilirubine UDP-glucuronosyltransfrase 1, le polymorphisme A(AT7)TAA, associ la maladie de Gilbert [4]. Les patients prsentant une maladie de Gilbert ont 4,75 plus de chances de dvelopper des complications biliaires que ceux qui en sont dpourvus [29]. Mais cest la surcharge martiale qui reprsente la principale menace. Fargion et al ont dcrit un cas dhmochromatose

Le gne candidat de la CDA II se situe en 20q11.2 [13]. Nanmoins, il semblerait que 10 % des cas de CDA II ne soient pas relis ce gne [18]. Le dysfonctionnement molculaire de la CDA II nest pas connu. On a cru quil sagissait dun trouble de la glycosylation, au vu de lhypoglycosylation de lchangeur des anions [12], mais aussi de lhyperglycosylation de certains glycolipides neutres [5, 48] . Nanmoins, plusieurs gnes du mtabolisme de glucides ont t limins par analyse de liaison [20].
TRAITEMENT

Le traitement de la CDA II reste symptomatique : transfusions dans les cas graves, traitement des complications biliaires et de la surcharge martiale. Comme pour la CDA I, la question de la splnectomie est en suspens, car lanmie dorigine priphrique cde le pas lanmie dorigine centrale. Se fondant sur une tude statistique, Iolascon et al [19] montrrent que la splnectomie entranait une lvation de lhmoglobine et une diminution de la bilirubinmie, toutes deux signicatives. Dans les formes graves, la splnectomie est susceptible davoir un impact notable. La transplantation mdullaire est envisage en dernier recours.

Autres anmies dysrythropotiques congnitales


ANMIE DYSRYTHR