Rle du laboratoire de bactriologie dans le diagnostic des IOA

du prlvement aux techniques molculaires

Frdric LAURENT
Laboratoire de Bactriologie - Hpital de la Croix Rousse CNR des Staphylocoques INSERM 851 Equipe "Pathognie des Staphylocoques"

Trois acteurs majeurs dans la prise en charge bactriologique des IOA Chirurgien orthopdiste / Pdiatre/ Rhumatologue
Evacuer / Nettoyer Prlever

Microbiologiste
Dtecter Identifier Mesurer la sensibilit aux antibiotiques

Antibiothrapeute
Interprter Choisir de lantibiothrapie optimale

Points critiques pour le microbiologiste

Gestion des prlvements Conditions / Dlais de cultures Dtection et identification de variants ou de souches diffrentes Interprtation et rendu clair et cohrent des rsultats qui puissent aider la dcision thrapeutique

Difficults rencontres avec les IOA par le bactriologiste

Bactries IOA = +/- bactries de la flore cutane Infections plurimicrobiennes Bactries fragiles Bactries physiologiquement peu actives Antibiothrapie pralable au prlvement Bactries caches intracellulaires biofilm Bactries normale (IOA aigu) vs bactries stresses (IOA chronique) Gestion des prlvements +++ Cultures longues Milieux riches Multiplicit des milieux Contamination ou pas ?

Traitement adquat des prlvements

Expression phnotypique varie

Gestion des prlvements

Eviter toute contamination
. nature du prlvement
. fistule, trajet de fistule = Se et Sp mdiocre . biopsies tissulaires, pus, tissus per-op, liquide articulaire, synoviale, +++
Bactries IOA = +/- bactries de la flore cutane

. post-prlvement
. pots ou tubes secs striles / seringue sans aiguilles et closes . Hotte PSM, gants striles, matriel strile et ou usage unique

Ensemencer dans les meilleurs dlais

Bactries fragiles

. transport rapide (<4 heures) / Portagerm ou quivalent / ensemencement au bloc ? . prvenir si arrive tardive au laboratoire

Gestion des prlvements

Slectionner les prlvements pour IOA sur prothse
ni trop ... ni trop peu - risque contamination - pb gestion au laboratoire . 15 minutes/prelts/technicienne . matriel pour broyage . identification/localisation - taux positifs = critre dinterprtation Spe

1+ / 5 7 prelts 2+ / 5 7 prelts 3+ / 5 7 prelts

26% 53% 85%

Altweg, JSJB, 2003

+ identification du patient, du service, du prescripteur, du prlvement

Examen direct
Permettre ventuellement une orientation diagnostic rapide
. prsence de bactries et morphologie (sensibilit faible) Gram, Ziehl, auramine . prsence dune raction cellulaire signant une infection coloration MGG : PNN, macrophages Numration des lments et formule pour liquide articulaire Liquide articulaire sans prothse
< 1 000 GB < 20% PNN Arthrose Trauma Algodystrophie Mcanique 50% PNN PR Lupus Psoriasis 5 000 - 60 000 GB/mm3 60-80% PNN Cristaux
Ractionnelle
Chlamydia, Yersinia, Salmonelle, Shigelle, Campylo, Neisseria, Lyme
PCR

100 000 GB > 90%PNN Cristaux Infection > 90% PNN Infection

Inflammatoire +/- septique

Septique

Mathews, Ann. Rheum Dis., 2007

Examen direct
Permettre ventuellement une orientation diagnostic rapide
. prsence de bactries (sensibilit faible) et morphologie Gram, Ziehl , auramine . prsence dune raction cellulaire signant une infection MGG (PNN, macrophages) Numration des lments et formule pour liquide articulaire

Liquide articuliare avec prothse

Infection sur PTG
GB > 1700 / mm3 PNN > 65% Sensibilit 94% 97% Spcificit 88% 98%

** Trampuz, Am J Med , 2004

sensibilit = vrais (+), spcificit = vrais (-)

Mise en culture
Prsence de bactries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ?

Mise en culture
Prsence de bactries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ?
Bactries IOA = +/- biofilm / intracellulaire

X 2940

2h
Fixation des S. aureus sur des irrgularits la surface du matriel

4h
Dbut de fabrication du "slime "

8h
La surface du matriel est recouverte par une couche paisse de "slime"

24 h
Des bactries mergent du biofilm, libres et prtes se fixer ailleurs

Olson, et al. J. Biomed Mater Res 1988 Olson, al.

Mise en culture
Bactries IOA = +/- biofilm / intracellulaire

COCCI

X 2940

Cocci au fond d'une cassure d'une couche paisse de biofilm d'un squestre infect Evans et al., Clin Orthop. 1998, 243-249

Mise en culture
Bactries IOA = +/- biofilm / intracellulaire

X 1000

Bactries (points noirs) internalises dans les ostocytes entours par des lamelles osseuses. (Internalization of S. aureus by osteoblasts in a patient with long term recurrent osteomyelitis JBJS 2005)

Mise en culture
Bactries IOA = biofilm / intracellulaire donc des bactries caches, englues et adhrentes des bactries stresses des bactries physiologiquement peu actives

Bactries IOA = trs diverses donc des bactries arobies des bactries anarobies des bactries croissance rapide / lente des bactries classiques / des bactries exigeantes/non cultivables

Mise en culture
Recommandation Rfrentiel de Microbiologie REMIC 2007
Broyage avant ensemencement
(merci de nous adresser des morceaux pas trop gros !!!)

. mortier/pilon, broyeur billes, . sonication (Trampuz, 2007 NEJM) Cultures . prolonges au moins 10 jours . en arobiose et anarobiose . sur gloses riches sang et chocolat isovitalex / J1-J10 . en bouillons denrichissement J10 J21 repiquage systmatique des bouillons mme si clairs +++ . en bouillons dhmoculture pour liquides articulaires

+ recherche de mycobactries pas systmatique mais y penser (surtout si ngatif)

Mise en culture

Glose Sang arobie + glose chocolat CO2 (lecture J2) Glose Sang anarobie + glose chocolat CO2 (lecture J10) Bouillon liquide (lecture jusqu J21) + repiquage sytmatique: . glose sang anarobie + glose chocolat lecture CO2 . lecture 48h

Diagnostic bactriologique
Infections aigus espces classiques Bactries " normales " facile ED + raction cellulaire ++ culture rapide
S. aureus

Infections chroniques Bactries "stresses" ED Peu de PNN culture lente >> 48 heures populations d'aspects diffrents perturbation de l'activit des ATB antibiogrammes diffrents

J10 J2

Staphylocoques coagulase ngative

Interprtatation des cultures

J2

J10

Interprtation des cultures

J2

J10

ou culture uniquement en bouillon liquide (sachant quun seul cocci ou un seul bacille suffit positiver)

Interprtation des cultures

Polymorphisme Polymicrobisme Contamination ????

Aide : caractres biochimiques (galerie), gntique ventt

Interprtation des cultures Infection polymicrobienne

(>15% des cas)
Rare (1 colonie) Staphylococcus aureus culture positive en 24h Quelques colonies de Staphylocoque coagulase ngative J4

Nombreuses petites colonies de P. acnes J10

Interprtation des cultures

Variation phnotypique de la morphologie et de la rsistance d un mme S. aureus
Pni R Genta S Peflo S Rif S Fosfo S
2 morphologies Souches Tmoin

Genta R Peflo I Rif R Fosfo S

2 morphologies

Peflo R Rif I Fosfo I

1 morphologie

Electrophorse Champs pulss

Interprtation des cultures

Variants microcolonies ou SCV "Small Colony Variants"
Faciles mconnatre :
dcrits pour beaucoup despces bactriennes (os, mucoviscidose) croissance lente et culture retarde colonies de petite taille perte pigmentation, perte dhmolyse auxotrophisme (Hmine, Thymidine, mnadione...) mtabolisme de l ATP profondment perturb forme de rsistance des bactries ?

Variants microcolonies ou SCV

Mme souche (gntiquement) En bas : normale En haut SCV
SCV

Particularits des micro-colonies in vitro: . adhrence +++ . tps de gnration (doublement) x 10 . perte de l activit bactricide de certains ATB . persistance des bactries dans des niches cellulaires protectrices (Cellules endothliales des vaisseaux, ostoblastes, ). . peu de raction inflammatoire locale . lorigine dchec thrapeutique

Infection polymicrobienne
Infection chronique depuis 8 ans, PTH 4 change fois

Cotyle et synoviale gauche (4 prlvements): S. aureus : Pni R, S tout S. epidermidis multi R Fmur gauche (4 prlvements) S. aureus : Pni R, S tout S. epidermidis : 3 antibiogrammes diffrents (oxa S/R, Genta S/R, Ery S/R, Fosfo S/R, Pef S/R, Rif S/R) S. warneri : 2 antibiogrammes diffrents

Culture et identification
Isoler tous les aspects avec au moins: identification et antibiogramme sur les colonies diffrentes sur au moins deux prlvements diffrents (si possible)
Staphylocoques : . recherche systmatique du gne mecA (meti-R) ? (recommandations CA-SFM) . CMI Vanco et Teico systmatique ?

Rendu des rsultats avec pour chaque prlevement + :

Nombre de milieux + et lesquels nombre de colonies / milieu Antibiogramme(s)

synthse type "Anapath"

Que faire des prlvements rests striles ?

10 50 % des IOA selon les sries et les contextes pidmio-cliniques patient sous antibiotique (arrt minimum 15 j) prlvement mal fait transport trop long culture inadquate bactrie trop fragile espce particulire et/ou mconnue ou non cultivable mycobactrie

Comment amliorer le diagnostic ?

Un exemple : osto-arthrite de lenfant et Kingella kingae

190 prlvements
89 des 104 prlvements culture ngative Culture

<4 ans
Positif : 86 Negatif : 104
PCR spcifique

>4 ans
PCR Universel 16SrDNA

K. kingae

S. aureus 38 K. kingae 25 S. Pyogenes 4 S. Agalactiae 3 S. Pneumoniae 6 H. influenzae 2

Others 8

1+ Glose sang 12+ Flacon Hmoc ana 24+ Flacon Hmoc aro

29 +

60 -

29 K. Kingae

8 +
N. meningitidis W13 (1) S. pyogenes (1) S. constellatus (1) S. aureus (1) Streptococcus spp. (1)
Enterobacteria (2) Pseudomonas spp. (1)

52 -

Bilan Kingella kingae Culture glose Culture glose + flacon hmoculture Culture glose + flacon hmoculture + PCR

1/190 25/190 54/190

Nouveaux outils
travail encore possible pour loptimisation de conditions de culture (flacon dhmoculture) et dlais de mise en culture biologie molculaire rapidit, sensibilit potentielle optimiser + pas de miracle mais prometteur encore en phase dvaluation ncessit de coordonner des tudes prospectives dvaluation . de la PCR universelle . des PCR spcifiques . des schmas diagnostiques optimiss stratifis par groupe patients pour linstant : rserver quand culture et suspicion ++

Conclusion
Points cls gestion des prlvements conditions de cultures travail dlicat et difficults rencontres rsultats chellonns parfois longs obtenir Nouveaux outils amlioration des cultures outils molculaires

Remerciements
Anne-Marie FREYDIERE (CBE, HCL) Sylvestre TIGAUD Laboratoire bactriologie Chantal ROURE-SOBAS CBN, HCL Hlne SALORD Olivia RAULIN et lensemble des techniciennes du laboratoire de la Croix Rousse Bactriologistes du CBE et CBL des HCL