Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin Saltar a: navegacin, bsqueda En biologa molecular, el trmino polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin

o RFLP (del ingls Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias especficas de nucletidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restriccin (tambin llamadas endonucleasas de restriccin) y que varan entre individuos. Las secuencias de restriccin presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposicin diferentes en el ADN de diferentes individuos de una poblacin, por lo que se dice que la poblacin es polimrfica para estos fragmentos de restriccin. La tcnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relacin gentica entre individuos. Metodologa El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la tcnica molecular Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (del ingls Polymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de restriccin especficas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Los fragmentos de restriccin se separan mediante electroforesis en geles de agarosa. Esto proporciona un patrn de bandas que es nico para un ADN en particular. [editar] Aplicaciones El anlisis de la variacin de RFLP en genomas ha supuesto en el pasado una herramienta fundamental en el mapeo genmico y el anlisis de enfermedades genticas. Cuando los investigadores pretendan determinar la localizacin cromosmica de una determinada enfermedad, analizaban el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad, y buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia similares a los de la enfermedad. Una vez el gen era localizado, el anlisis RFLP de otras familias podra predecir su riesgo de padecer esa enfermedad, o quines tenan posibilidades de portar el gen mutante. El anlisis RFLP fue tambin la base de las modernas tcnicas de anlisis de huellas genticas (Genetic Fingerprinting analysis en ingls), tiles en la identificacin de muestras recuperadas de la escena de un crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la biodiversidad en poblaciones animales.

[editar] Diagnstico de una enfermedad mediante screening de un marcador RFLP Cuando un RFLP normalmente se asocia con una enfermedad de origen gentico, la presencia o ausencia de ste puede usarse a modo de consejo sobre el riesgo de desarrollar o transmitir la enfermedad. La suposicin es que el gen en el que los investigadores estn realmente interesados est localizado tan cerca del RFLP que su presencia puede servir como indicador de la alteracin en el gen. A veces, un RFLP en particular puede estar asociado con el alelo sano. Por esto es esencial examinar no slo al paciente, sino a todos los miembros de la familia que sea posible. Las pruebas ms tiles para tales anlisis son las asociadas a una nica secuencia del DNA; esto es, una secuencia que est presente en un solo lugar del genoma. A menudo, este DNA presenta una funcin que es desconocida. Esto puede ser de ayuda si ha mutado libremente sin daar al individuo. La muestra del sujeto sometido al diagnstico hibridar con distintas longitudes de DNA digerido de diferentes personas dependiendo de los sitios de corte de la enzima que haya heredado. Una gran variedad de polimorfismos puede presentarse en la poblacin, obteniendo una gran coleccin de alelos. Algunas personas sern homocigotos y presentarn una nica banda, otros ( ej, todos los miembros de la familia mostrados abajo) sern heterocigotos y presentarn una banda distinta por cada alelo. Archivo:RFLPSCREENING.GIF El pedigree muestra la herencia del marcador RFLP a travs de tres generaciones en una sola familia. Un total de 8 alelos (numerados a la izquierda del gel) estn presentes en la familia. Los RFLPs de cada miembro de la familia estn enumerados justo debajo de ellos. Si, por ejemplo, cada persona que hered el alelo RFLP 2 tuviera tambin cierto desorden heredado, y ninguno de los que carecieran del alelo tuviera la afeccin, deduciramos que el gen de la enfermedad est ligado de manera muy prxima al RFLP. Si los padres decidieran tener otro hijo, un test prenatal podra revelar si el nio presentara la enfermedad. Pero destacar que el cruzamiento durante la formacin de los gametos podran mover el marcador RFLP al alelo sano. Por esto, a mayor distancia entre el RFLP y el locus del gen, disminuye la probabilidad de un diagnstico preciso. Mtodo RFLP - Polimorfismo de Fragmentos de Restriccin RFLP (a menudo pronunciado "labio del Rif", como si se tratara de una palabra) es un mtodo usado por los bilogos moleculares para seguir una secuencia particular de ADN, que se transmite a otras clulas. RFLP se puede utilizar en muchos entornos diferentes para lograr diferentes objetivos. RFLP se pueden utilizar en casos de paternidad o casos penales para determinar el origen de una muestra de ADN. RFLPs puede ser utilizado determinar el estado de la enfermedad de un individuo. RFLP se puede utilizar para medir las tasas de recombinacin que puede conducir a un mapa gentico con la distancia entre los loci RFLP medidos en centimorgans. En esta pgina web, se puede ver cmo se producen los RFLP y, a continuacin tres ejemplos de la aplicacin del anlisis de RFLP: paternidad y estado de la enfermedad , y mapeo gentico .

RFLP de Produccin Cada organismo hereda su ADN de sus padres. Dado que el ADN se replica en cada generacin, cualquier secuencia que se puede pasar a la siguiente generacin. Un RFLP es una secuencia de ADN que tiene un sitio de restriccin en cada extremo con un "blanco" secuencia en el medio. Una secuencia diana es cualquier segmento de ADN que se unen a una sonda mediante la formacin de pares complementarios de bases. Una sonda es una secuencia de ADN de cadena simple que ha sido etiquetado con radiactividad o una enzima de manera que la sonda puede ser detectado. Cuando una sonda de pares de bases a su objetivo, el investigador puede detectar esta unin y saber dnde la secuencia diana es desde la sonda es detectable. RFLP produce una serie de bandas cuando una transferencia de Southern se realiza con una combinacin particular de enzima de restriccin y secuencia de la sonda. Por ejemplo, vamos a seguir un determinado RFLP que se define por la enzima de restriccin EcoR I y la secuencia diana de 20 bases de GCATGCATGCATGCATGCAT. EcoR I se une a su GAATTC seuqence reconocimiento y corta el ADN de doble cadena como se muestra:

En el segement de ADN se muestra a continuacin, puede ver los elementos de un RFLP; una secuencia diana flanqueado por un par de sitios de restriccin. Cuando este segmento de ADN es cortado por EcoRI, tres fragmentos de restriccin se producen, pero slo uno contiene la secuencia diana que puede estar vinculado por la secuencia de la sonda complementaria (violeta).

Echemos un vistazo a dos personas y los segmentos de ADN que llevan a que contienen esta RFLP (para mayor claridad, slo veremos uno de los dos stands de ADN). Desde que Jack y Jill son organismos diploides, que tienen dos copias de este RFLP. Al examinar una copia de Jack y una copia de Jill, vemos que son idnticos: Jack 1:-GAATTC --- (8,2 kb) --- GCATGCATGCATGCATGCAT --- (4,2 kb) --- GAATTC-

Jill 1:-GAATTC --- (8,2 kb) --- GCATGCATGCATGCATGCAT --- (4,2 kb) --- GAATTCCuando examinamos sus segundas copias de este RFLP, vemos que no son idnticos. Jack 2 carece de un sitio de restriccin EcoRI que Jill tiene 1,2 kb upstream de la secuencia diana (diferencia en cursiva). Jack 2:-GAATTC - (1,8 kb) - CCCTTT - (1,2 kb) - GCATGCATGCATGCATGCAT - (1,3 kb)GAATTCJill 2:-GAATTC - (1,8 kb) - GAATTC - (1,2 kb) - GCATGCATGCATGCATGCAT - (1,3 kb)GAATTCPor lo tanto, cuando Jack y Jill tienen su objeto de ADN para el anlisis de RFLP, tendrn una banda en banda comn y una que no coincide con el otro es en el peso molecular:

Caso de paternidad Vamos a usar la tecnologa RFLP para determinar si Carlos es el padre del hijo de Jill llamado Payle. En este escenario, se extrajo el ADN de las clulas blancas de la sangre de los tres individuos y se someti a anlisis de RFLP. Los resultados se muestran a continuacin:

En este caso, parece ser que Jack podra ser el padre, ya que Payle hered el fragmento de 12,4 kb de Jill y el fragmento de 4,3 de Jack. Sin embargo, es posible que otro hombre

con semejante patrn de RFLP podra ser tan well.To ser cierto, varios loci RFLP ms sera probado. Sera muy poco probable que dos hombres (que no sea los gemelos idnticos) que comparten mltiples patrones de RFLP y por lo tanto la paternidad pudo ser confirmado. En un escenario diferente, se extrajo el ADN de las clulas blancas de la sangre de los tres individuos y se someti a anlisis de RFLP. Los resultados se muestran a continuacin:

Esta vez, se puede determinar que Jack no es el padre de Payle Payle ya tiene una banda de alrededor de 6 kb y Jack no lo hace. Por lo tanto, es muy probable que el padre de Payle no es Jack, aunque es posible que Payle lleva una nueva mutacin en este locus y una banda de tamao diferente fue producido. Qu podra hacer usted como a un investigador para estar ms seguro de que Jack no era el padre de Payle?

Enfermedad de Estado En este ejemplo, queremos saber si una persona lleva cualquier fibrosis qustica (FQ) alelos y si es as, cuntos. Debido a que la FQ es una enfermedad recesiva, anyonne con FQ debe ser homocigticos para alelos de enfermedad. De la informacin de pedigr, a menudo podemos determinar quin en esta familia es portadora. Sin embargo, si una pareja llega a un asesor en gentica, a menudo un anlisis de RFLP se lleva a cabo sobre el ADN de la pareja. RFLPs son conocidos por CF y por lo que sera fcil determinar si una persona eran homocigotos de tipo salvaje (wt), heterocigotos "portador", o alelos homocigotos la enfermedad y por lo tanto tienen esta enfermedad.

Para las parejas que esperan un hijo, sera fcil poner a prueba a ambos padres y hacer una prediccin sobre el estado de la enfermedad final de su feto. Por ejemplo, si ambos padres son homocigotos en peso, entonces todos sus hijos tambin seran homocigotos peso:

Sin embargo, si ambos padres son heterocigotos, que podran tener los nios con cualquiera de los tres genotipos, aunque los nios heterocigotos sera el doble de probabilidades que uno de los genotipos homocigotos.

Con el aumento de informacin secuencia genmica, el creciente nmero de enfermedades genticas pueden predecir a partir de anlisis de RFLP.

Mapeo gentico Para calcular la distancia gentica entre los loci que, tiene que ser capaz de observar la recombinacin. Tradicionalmente, esto se realiza mediante la observacin de fenotipos pero con el anlisis de RFLP, es posible medir la distancia gentica entre dos loci RFLP si son una parte de los genes o no. Veamos un ejemplo sencillo de moscas de la fruta. Dos loci RFLP con dos bandas RFLP posibles en cada lugar:

Estos loci se encuentran en el mismo cromosoma de la hembra (izquierda) y macho (derecha). El locus superior puede producir dos bandas diferentes llamados 1 y 3. El locus inferior puede producir bandas llamadas 2 o 4. El macho es homocigtico para la banda 1 en el locus superior y 2 para el locus inferior. La hembra es heterocigota en ambos loci. Thier patrones de RFLP de bandas se puede ver en la transferencia Southern a continuacin:

El hombre slo puede producir un tipo de gametos (1 y 2), pero la hembra puede producir cuatro gametos diferentes. Dos de los cuatro posibles son llamados los padres porque llevan ambas bandas RFLP del mismo cromosoma; 1 y 2 de la izquierda o cromosoma 3 y 4 del cromosoma derecha. Los otros dos cromosomas son recombinantes, ya ha producido la recombinacin entre los dos loci y por lo tanto las bandas RFLP se mezclan de manera que uno est ahora vinculada a 4 y 3 est ligada a 2.

Cuando estos dos compaero de moscas, la frecuencia de la progenie de cuatro posibles se puede medir ya partir de esta informacin, la distancia gentica entre los dos loci RFLP (superior e inferior) se puede determinar.

En este ejemplo, el 70% de la progenie fueron producir a partir de huevos genotipo parental y 30% fueron producidos por huevos genotipo recombinantes. Por lo tanto, estos dos loci RFLP son 30 centimorgans aparte de uno al otro.