Universidad de El Salvador Facultad de Medicina Departamento de Bioqumica Bioqumica II

Laboratorio practico No. 2: Determinacin de bilirrubina directa y total

OBJETIVOS

Que al finalizar el laboratorio prctico el estudiante sea capaz de: 1. Aplicar la tcnica de la determinacin de la Bilirrubina en suero por el mtodo enzimtico modificado Jendrassik/Grf. 2. Cuantificar la Bilirrubina Total y Directa en suero. 3. Deducir la concentracin de Bilirrubina Indirecta diferencindola con la Bilirrubina Directa.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS A UTILIZAR

MATERIAL Y EQUIPO 4 tubos de ensayo Gradilla Pipetas serolgicas de 1 y 5 mL Espectrofotmetro Bao de Mara (con agua a temperatura ambiente) Papel de aluminio

REACTIVOS Reactivo para Bilirrubina Total (TBR): Acido sulfanilico Acido clorhdrico Cafena Benzoato de sodio

Reactivo T- Nitrito para determinar bilirrubina Total (TNR): Nitrito de sodio.

Reactivo para Bilirrubina Directa (DBR): Acido sulfanilico Acido clorhdrico

Reactivo D- Nitrito para determinar Bilirrubina Directa (DNR): Nitrito de sodio.

MUESTRA Suero o plasma heparinizado. Evitar la hemolisis. Las muestras deben protegerse de la luz (cubrirse con papel aluminio).

PROCEDIMIENTO Para Bilirrubina Total: 1. Prepare 2 tubos de ensayo completamente secos y protegidos de la luz. 2. A continuacin soga las instrucciones de acuerdo al cuadro siguiente (agregar los reactivos en el orden indicado): Tubos Reactivos TBR TNR 1 Blanco 3.0 mL ---Mezclar completamente, incubar 5 minutos en agua de chorro SUERO 0.3 mL Mezclar, incubar a temperatura ambiente por 20 minutos 0.3 mL 2 Tubo de muestra 3.0 mL 0.12 mL

3. Medir la absorbancia de la muestra (tubo 2) contra el blanco (llevar a cero con el blanco, tubo 1) a 546 nm.

Para la Bilirrubina Directa: 1. Prepare 2 tubos de ensayo completamente secos y protegidos de la luz. 2. A continuacin siga las instrucciones de acuerdo al cuadro siguiente (agregar los reactivos en el orden indicado) Tubos Reactivos DBR DNR 1 Blanco 3.0 mL ---Mezclar completamente, esperar 2 minutos SUERO 0.3 mL Mezclar, incubar a temperatura ambiente por 5 minutos 0.3 mL 2 Tubo de muestra 3.0 mL 0.12 mL

3. Medir la absorbancia de la muestra contra el blanco a 546 nm

CLCULOS Calcular la Bilirrubina Total y Bilirrubina directa utilizando el factor 13. Concentracin de Bilirrubina Total Abs. De muestra x 13 = mg/dL

Concentracin de Bilirrubina Directa Abs. De Muestra x 13 = mg/dL

Calcule la Bilirrubina Indirecta

OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

RESUMEN BIBLIOGRFICO Determinacin de bilirrubina directa y total En condiciones fisiolgicas en el adulto humano cada hora se destruyen de 1 a 2x 10 8 eritrocitos, de este modo en un da el ser humano de 70kg recambia cerca de 6g de hemoglobina, se estima que de 1g de hemoglobina da 35mg de bilirrubina en humanos adultos cada da se forman alrededor de 250 a 350 mg de bilirrubina derivada principalmente de hemoglobina pero tambin de eritropoyesis ineficaz y de varias otras protenas hem como el citocromo P450. La conversin qumica de hem en bilirrubina por las clulas reticuloendoteliales puede observarse in vivo conforme el color purpura del hem en un hematoma con lentitud en el pigmento amarillo de bilirrubina la albumina plasmtica transporta hacia el hgado la bilirrubina formada en los tejidos perifricos, el metabolismo adicional de bilirrubina sucede en el hgado principalmente y se divide en 3 procesos separados: 1. Captacin de bilirrubina por el hgado, 2. Conjugacin de bilirrubina con glucuronato y 3. Secrecin de bilirrubina conjugada hacia la bilis. En el hgado la bilirrubina se hace hidrosoluble mediante conjugacin con dos molculas de acido glucuronico, y se secreta hacia la bilis. La accin de enzimas bacterianas en el intestino produce urobilinogeno y urobilina, que se excretan en las heces y en la orina. Cuando la bilirrubina en sangre excede 1mg/dl existe hiperbilirrubinemia la cual quiz se deba a la produccin de mas bilirrubina de la que el hgado normal puede excretar o el fracaso de un hgado daado para excretar bilirrubina producida en cantidades normales. En ausencia de dao heptico, la obstruccin de los conductos excretores del hgado, al impedir la excrecin de bilirrubina tambin suscitara hiperbilirrubinemia. En todas estas situaciones se acumula bilirrubina en sangre, y cuando alcanza una cierta concentracin (alrededor de 2 a 2.5mg/dl) se difunde hacia los tejidos, que entonces adoptan un color amarillo, ese estado recibe el nombre de ictericia. En estudios clnicos de ictericia, la medicin de la bilirrubina en el suero tiene un gran valor. El primer mtodo para valorar de modo cuantitativo el contenido de bilirrubina del suero fue ideado por Van den Bergh, mediante la aplicacin de la prueba de Ehrlich para bilirrubina en la orina. La reaccin de Ehrlich se basa en el acoplamiento de acido sulfanilico diazotizado (reactivo de diazo de Ehrlich) y bilirrubina para producir un compuesto azo de color purpura rojizo, en el procedimiento original descrito por Ehrlich se uso metanol para proporcionar una solucin en la cual fueron solubles tanto la bilirrubina como el reactivo diazo, Van den Bergh omiti de manera inadvertida el metanol en una

ocasin cuando estaba intentando valorar el pigmento biliar en bilis humana, para sorpresa la aparicin normal del color ocurri de modo directo. As esta forma de bilirrubina que reaccionaria sin la adiccin de metanol se llamo de reaccin directa, despus se encontr que esta misma reaccin directa tambin suceda en suero de individuos con ictericia debida a la obstruccin biliar, comoquiera que sea, aun fue necesario aadir metanol para determinar bilirrubina en el suero normal o la que estuvo presente en exceso del suero de sujetos con ictericia hemoltica en los cuales no se hallo evidencia de destruccin, a esa forma de bilirrubina que solo poda medirse luego de adiccin de metanol se aplico el termino de reaccin indirecta. Despus se descubri que la bilirrubina directa es bilirrubina libre o no conjugada, en ruta al hgado desde los tejidos reticuloendoteliales, donde la bilirrubina se produjo originalmente por la desintegracin de porfirinas hem. Puesto que esta bilirrubina no es hidrosoluble, requiere metanol para iniciar el acoplamiento con el reactivo diazo. En el hgado la bilirrubina libre se conjuga con acido glucuronico y el conjugado, predominantemente diglucuronido de bilirrubina puede excretarse entonces hacia la bilis, adems la bilirrubina conjugada, al ser hidrosoluble, puede reaccionar de manera directa con el reactivo diazo, de modo que la bilirrubina directa de Van den Bergh en realidad es un conjugado de bilirrubina (glucuronido de bilirrubina). Dependiendo del tipo de bilirrubina en el plasma es decir conjugada o no la hiperbilirrubinemia se clasifica como hiperbilirrubinemia por retencin, debida a produccin excesiva, o hiperbilirrubinemia por regurgitacin, debida a reflujo hacia el torrente sanguneo por obstruccin biliar, la bilirrubina no conjugada y la especie conjugada se pueden separar y cuantificar usando cromatografa liquida de alta presin, debido a su hidrofobicidad nicamente la bilirrubina no conjugada puede cruzar la barrera hematoencefalica hacia el sistema nervioso central, de esta manera, la encefalopata debida a hiperbilirrubinemia (kernicterus) solo puede ocurrir en relacin con bilirrubina no conjugada, como se encuentra en la hiperbilirrubinemia de retencin. Por otra parte, debido a su hidrosilubilidad, nicamente la bilirrubina conjugada puede aparecer en la orina en consecuencia, la ictericia colurica (pigmentos biliares en la orina) solo suceden en la hiperbilirrubinemia por regurgitacin, y la ictericia acolurica nicamente ocurre en presencia de un exceso de bilirrubina no conjugada. En circunstancias normales solo hay cantidades traza de urobilinogeno en la orina, en la obstruccin completa del conducto biliar no se encuentra urobilinogeno en la orina, dado que la bilirrubina no tiene acceso al intestino donde puede convertirse en urobilinogeno. En este caso la presencia de bilirrubina en orina sin urobilinogeno sugiere ictericia obstructiva, sea intra o pos heptica, en la ictericia consecutiva a hemolisis la produccin aumentada de bilirrubina conduce a incremento de la produccin de

urobilinogeno que aparece en gran cantidad en la orina. La bilirrubina por lo general no se encuentra en la orina en la ictericia hemoltica porque la bilirrubina no conjugada no pasa hacia la orina de modo que en la combinacin de urobilinogeno aumentado y ausencia de bilirrubina es sugestiva de ictericia hemoltica, el incremento de la destruccin de sangre por cualquier causa desencadena un aumento del urobilinogeno urinario. Adems cabe mencionar una serie de trastornos que se dan en el metabolismo de la bilirrubina como las anemias hemolticas, la ictericia fisiolgica neonatal, sndrome de Crigler-Najjar tipo I; ictericia no hemoltica congnita, sndrome de Crigler-Najjar tipo II, sndrome de Gilbert, hiperbilirrubinemia toxica (causada por cloroformo, tetra clorur de carbono, acetaminofen, virus de la hepatitis, cirrosis e intoxicacin por el hongo Amanita),obstruccin del rbol biliar (ictericia colurica, ictericia colestatica), sndrome de Dubin Johnson, adems las mediciones de la bilirrubina plasmtica total y no conjugada, el urobilinogeno y la bilirrubina urinarios, y de ciertas enzimas sricas, as como la inspeccin y el anlisis de muestras de heces ayudan a distinguir entre estas causas de los trastornos.

BIBLIOGRAFA CONSULTADA

Murray, Roberto K. Bender, David A. Harper BIOQUMICA ILUSTRADA 28 Edicin Mxico, Mc Graw-Hill, Interamericano editores, S.A de C.V 2010, Capitulo 31; Porfirinas y pigmentos biliares, paginas 278, 280, 281, 282, 283.