BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS Daniel Tello 10118000, Laura Zamudio 11221264 Universidad Icesi Facultad

de Ciencias Naturales Laboratorio de Bioqumica Santiago de Cali, Colombia Abril 24 del 2012 1. Resultados: VASO No. Suspensin de levadura al 20% (ml) Agua destilada (ml) Solucin de DNP 80 mM (ml) Solucin de azida de sodio 800 (mM) (ml) Tabla 1. Concentracin 1 control 6.00 2 (DNP) 5.96 3 azida 6.07 1 control 5 2 (DNP) 5 3 azida 5

40

40 0.2

40

0.5

pH a los cero minutos pH despus de tres minutos pH despus de seis minutos Tabla 2. pH

5.77

5.78

5.96

5.65

5.74

5.90

Solucin de glucosa al 10% pH a los cinco minutos pH a los diez minutos pH a los quince minutos pH a los veinticinco minutos pH a los treintaicinco minutos Tabla 3. pH

1 control 5

2 (DNP) 5

3 azida 5

5.22

5.20

5.70

5.00

4.94

5.65

4.87

4.84

5.61

4.75

4.74

5.58

4.60

4.51

5.52

6.1 6 5.9 5.8 5.7 5.6 5.5 0 min 3 min 6 min Grfica 1. pH antes de aadir glucosa. Control DNP Azida

pH vs tiempo
5.8 5.6 5.4 5.2 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 5 min 10 min 15 min 25 min 35 min Grfica 2. pH despus de aadir la glucosa. Control DNP Azida

2. Anlisis de resultados: Por teora sabemos que el DNP acta como un desacoplante de la cadena de transporte electrnico y el Azida como un inhibidor de la misma, lo que afecta el flujo de protones a travs de la membrana mitocondrial interna. Teniendo en cuenta los procesos realizados en el laboratorio con clulas que realizan procesos anaerbicos, el proceso es homologo al nombrado anteriormente que se da en clulas aerobias, ya que utilizan las misma molculas para poder reducirse u oxidarse y as facilitar el transporte electrnico (NADH Y FADH), por este mecanismo, las clulas anaerobias mantienen un estado electrnico estacionario mediante la transferencia de electrones desde los transportadores reducidos a los aceptores electrnicos, como en la reduccin del piruvato a lactato en la gluclisis anaerobia.

Para entender lo que se nombrar es menester, realizar una comparacin entre los desacoplantes e inhibidores: * Bsicamente los desacoplantes permiten el paso de H+ desde el espacio intermembrana hacia la matriz con generacin de calor. Esto lleva a una disminucin en el gradiente de H+, disminuyendo as el potencial electroqumico (negativo y alcalino en el interior), con lo que la fuerza protnmotriz que impulsa el retorno de H+ desde el espacio intermembrana hacia la matriz a travs de la ATP sintasa es menor, de modo que la sntesis de ATP disminuye. * Los agentes inhibidores del transporte de electrones actan en sitios especficos en el ensamblaje de transporte de electrones, impidiendo que se siga generando el bombeo de electrones para contribuir a la fuerza protn-motriz.

En el laboratorio pudimos comprobar la teora anteriormente nombrada. Con respecto al DESACOPLANTE DNP, se muestra que el pH baja constantemente mientras el tiempo avanza, cuando el DNP se aproxima a la membrana interna desde el exterior se protona, debido al pH ms bajo existente en esta zona. Esta protonacin aumenta la hidrofobicidad del DNP, lo cual permite que difunda en la membrana, dentro de la matriz, el pH ms alto hace que el hidroxilo fenlico de la sustancia se desprotone. Por tanto, el desacoplador tiene el efecto de transporte de H+ nuevamente hacia la matriz, evitando que los electrones fluyan hacia el canal protnico de F0 y no se d la sntesis de ATP, es por ello que se observa un descenso en el pH ya que el aumento de hidrogeniones produce que el ambiente intracelular est cido. El Azida, se sabe por teora que inhibe el complejo 4 de la cadena de transporte de electrones, unindose a la forma oxidada del hemo A3 del enzima, lo que impide la funcin oxidoreductora de la misma, y por ello no se permite que se cree el gradiente de protones para la posterior sntesis de ATP; se observa que el pH disminuye ya que los protones que estn en la matriz proveniente de los otros complejos que estn funcionando normalmente se quedan acumulados lo que conlleva a la disminucin notable del pH (alta concentracin de hidrogeniones en la membrana interna mitocondrial). Es necesario realizar una comparacin entre el funcionamiento aerobio y anaerobio, una diferencia notable es la produccin menor de ATP en las clulas anaerbicas que en las aerbicas, ya que en las primeras solo hay glucolisis y a partir de la produccin de piruvato, se toma la va de la fermentacin para generar ms o menos 10 molculas de

ATP, lo que confirma que en la respiracin aerobia hay ausencia del ciclo del cido ctrico, y solo hay gliclisis y cadena de transporte electrnica. 3. Conclusiones * Para comprobar si los venenos funcionan se utiliza glucosa por que las levaduras hacen glicolisis y en este proceso se reducen molculas que despus van a donar esos electrones y se va a crear una fuerza protn motriz, es por eso que se deben medir los cambios de pH. * Los desacoplantes qumicos como el DNP daa la relacin entre la cadena de transporte de electrones y la fosforilacion oxidativa por que altera el gradiente protn motriz, algo que es observable con las medidas de pH ya que este disminuye por que la concentracin de protones aumenta.

4. Bibliografa * http://biofisicaguillermocordero.blogspot. com/2010/03/inhibidores-ydesacoplantes.html <Citado el 31 de octubre de 2011> * http://www.monografias.com/trabajos10/ viascat/viascat.shtml <Citado el 31 de octubre de 2011> * Stryer, Beng, Lubert. Bioqumica 10ta edicin, cap.18 Fosforilacin oxidativa, 2008. * Stryer, Beng, Lubert. Bioqumica 10ta edicin, cap.18 Fosforilacin oxidativa, 2008. viascat/viascat.shtml <Citado el 31 de octubre de 2011> * Stryer, Beng, Lubert. Bioqumica 10ta edicin, cap.18 Fosforilacin oxidativa, 2008.