Materiales y cepas de referencia en laboratorios de Microbiologa Ambiental

Buenos Aires, Argentina 22-26 de septiembre, 2008

Dr.C. Mara Isabel Gonzlez Gonzlez Investigador Titular/ Profesor Auxiliar Laboratorio de Microbiologa de Aguas INHEM, Cuba Email: isa@inhem.sld.cu, mariaisa@infomed.sld.cu

Definiciones necesarias para considerar: Patrn:

Medida materializada, instrumento de medida, material de referencia o sistema de medida destinado a definir, realizar, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia.

Patrn primario:
Patrn que es designado o ampliamente reconocido como poseedor de las ms altas cualidades metrolgicas y cuyo valor se acepta sin referirse a otros patrones de la misma magnitud.

Patrn secundario:
Patrn cuyo valor se establece por comparacin con un patrn primario de la misma magnitud.
La mayor parte de los materiales de referencia certificados se encuentran dentro de esta categora puesto que la certificacin de los valores de la propiedad est usualmente realizada por un procedimiento que es trazable a patrones primarios.

Definiciones necesarias para considerar: Patrn de referencia:

Patrn, en general de la ms alta calidad metrolgica disponible en un lugar o en una organizacin determinada, del cual se derivan las mediciones realizadas en dicho lugar.

Material de referencia (MR):

Material o sustancia en la cual uno o ms valores de sus propiedades son suficientemente homogneos y estn bien definidos para permitir utilizarlos para la calibracin de un instrumento, la evaluacin de un mtodo de medicin, o la asignacin de valores a los materiales.

Definiciones necesarias para considerar: Material de referencia certificado (MRC):

Material de referencia, acompaado de un certificado, en el cual uno o ms valores de sus propiedades estn certificados por un procedimiento que establece su trazabilidad con una realizacin exacta de la unidad en la que se expresan los valores de la propiedad y para la cual cada valor certificado se acompaa de una incertidumbre con la indicacin de un nivel de confianza.

Material de referencia interno:

Es aquel preparado por un laboratorio para su propio uso.

Tipos de materiales de referencia

Fsicos, como pueden ser de masa (pesas), longitud de onda, temperatura y otras propiedades fsicas. Sustancias puras, soluciones y mezclas de alta pureza, utilizadas para la calibracin en procedimientos de anlisis. MR matriciales, materiales naturales y/o materiales naturales adicionados usados para la verificacin de procedimientos analticos y en casos especficos para la calibracin de instrumentos de medida.

Cules son las Exigencias de los Usuarios de Materiales de Referencia?

Un proveedor de material de referencia (MR) debe brindar informacin a travs de un certificado que acompae al material. Y adems deber demostrar su competencia en la produccin del MR.

Gestin de materiales de referencia: El laboratorio debe disponer de procedimientos para la seleccin, adquisicin, recepcin, registro, almacenamiento y utilizacin de los materiales de referencia, del mismo modo que para el resto de reactivos y materiales consumibles utilizados en los ensayos y calibraciones.

USOS del Material de Referencia (MR)?

General Calibracin de equipos o aparatos. Validacin de mtodos de medicin. Intercomparaciones Control de calidad interno Microbiologa Sensibilidad de medios de cultivo. Controles ambientales. Evaluacin de procesos de esterilizacin.

Qu caractersticas debe reunir un MR?

Estable Homogneo Con valores asignados a algunas de sus propiedades Con incertidumbre asignada a esos valores

Para su seleccin:
es necesario tener en cuenta el propsito al cual ser destinado

Criterios de seleccin: 1. Identificar las especificaciones requeridas con las de los MRC disponibles en el mercado. 2. Consultar la informacin disponible: catlogos de fabricantes, bancos de datos, publicaciones, recomendaciones, Gua ISO 34:2000, etc. 3. Asegurar que el MRC seleccionado est certificado para la medida o propiedad de inters y no es un valor meramente indicativo, y que su procedimiento de certificacin tiene un nivel de confianza apropiado y est suficientemente documentado.

Cultivos de referencia:
La acreditacin de un mtodo de ensayo en microbiologa requiere cultivos de referencia. El nmero y la eleccin del gnero y especie de las mismas depender de los ensayos que se efectan y las necesidades particulares de estos ltimos. Son necesarios para demostrar la trazabilidad. Se debe elaborar e implementar un procedimiento documentado para el uso y manejo de cultivos de referencia. En microbiologa es necesario demostrar la trazabilidad de los cultivos.

Agar Chromocult (Merck) Citrobacter freundii ATCC8090

Para qu se emplean los cultivos de referencia en microbiologa?

Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo. Realizar controles de calidad interno durante la ejecucin de los ensayos. Realizar controles de calidad de los reactivos. Pruebas confirmatorias. Validar mtodos.

Agar Chromocult ES (Merck)

E. coli ATCC 11775 Citrobacter freundii ATCC 8090

Los cultivos (cepas) de referencia pueden ser:

Cepas de referencia: Microorganismos obtenidos de una coleccin nacional o internacional reconocida. Cepas de trabajo: Cepas obtenidas a partir del cultivo de una cepa de referencia preparada y conservada por un laboratorio. Cepas de reserva: Subcultivos de microorganismos obtenidos a . partir de las cepas de referencia para ser utilizados en los ensayos que lo precisen.

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Agar Verde Brillante (Merck)

Las cepas de referencia deben tener:

VIABILIDAD: Las colecciones de cultivo reconocidas deben presentar un instructivo para su resucitacin. PUREZA: Se debe garantizar que el cultivo sea puro.
. ESTABILIDAD: deben mantener las caractersticas fenotpicas y genotpicas originales.

Esquema de cultivos de referencia:

CEPA DE REFERENCIA

Reconstitucin (Slo se acepta un nico repique)

*
OBTENCIN DE LAS CEPAS DE RESERVA CONSERVACIN MEDIANTE DISTINTOS MTODOS (Liofilizacin, nitrgeno lquido, ultracongelacin rpida, etc.) Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento Descongelacin / reconstitucin

Subcultivo una sola vez.

CEPAS DE TRABAJO (Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

UTILIZACIN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIN DE MTODOS Y CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD (

* ) Deben realizarse los controles de pureza y pruebas bioqumicas de la cepa.

La manipulacin y modo de conservacin de los cultivos de referencia deben evitar:

El deterioro de las cepas. La contaminacin cruzada. Mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas tpicas de las cepas.

Su crecimiento caracterstico debe ser documentado sobre cada medio en el que se utiliza como cepa control.
Con el objetivo de evitar cambios en las caractersticas de los cultivos de referencia, el nmero de repiques a partir de la cepa de referencia, debe ser limitado (en general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia)

Bacillus cereus ATCC11778 Agar Sangre No.2

Los cultivos de referencia deben ser obtenidos de una coleccin de cultivos nacional o internacional de reconocido prestigio para demostrar su trazabilidad.
Son microorganismos definidos: Por lo menos a nivel de gnero y especie catalogados. muy caracterizados. de origen conocido. se comercializan liofilizados.

Bacillus cereus ATCC11778 Agar Sangre No.2 (Merck)

Los cultivos de referencia deben ser obtenidos de una coleccin de cultivos nacional o internacional de reconocido prestigio para demostrar su trazabilidad.
Son microorganismos definidos: Por lo menos a nivel de gnero y especie catalogados. muy caracterizados. de origen conocido. se comercializan liofilizados.
Si una cepa se adquiere por cualquier va que no sea la propia coleccin, NO se puede mencionar utilizando el nmero que tienen en esa coleccin, sino solamente como derivada de la cepa de coleccin.

Bacillus cereus ATCC11778 Agar Sangre No.2 (Merck)

Adquisicin de Cepas de referencia:

1 ra. opcin: Obtencin directa a partir de una coleccin nacional e internacional reconocida.

Proveedores de cepas de referencia: Ejemplos:

ATCC (American Type Culture Collection). SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection) CECT (Coleccin espaola de cultivos tipos). CNCM (Collection Nationale Cultures Microorganismes)lnst.Pasteur, Fance NCCB (The Netherlands Culture Collection of Bacteria, Holanda). NRRL: (ARS Culture Collection, USA). UKNCC: (United Kingdom National Culture Collections, (Reino Unido).

Adquisicin de Cepas de referencia:

2 da. opcin: Proveedores comerciales certificados por ISO 9001. Comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en una coleccin reconocida. Generalmente el 3er o 4 repique. Deben mantener sus recipientes originales. Requerimiento en la recepcin (compra de insumo): certificado de origen donde conste el nmero de repique y el origen entre otro. Proveedores de cepas de referencia: Ejemplos: Proveedores acreditados por ISO 9001 que realizan repiques a partir cepas adquiridas en la coleccin reconocida. Oxoid Companie

10

El certificado del cultivo de referencia debe poseer: Nombre y direccin del organismo de certificacin Ttulo del documento. Condiciones del certificado (provisorio) Nombre del material Nmero de muestra (N del lote puntual) Fecha de certificacin Disponibilidad de otras formas y tamao del MR Fuente del MR Proveedor del MR Preparador del MR Descripcin del MR

11

El certificado del cultivo de referencia debe poseer:

Destino. Almacenamiento. Instrucciones para el uso correcto del MR. Mtodo de preparacin del MR. Determinacin de homogeneidad. (descripcin de los ensayos realizados). Valores obtenidos para una determinada propiedad y sus lmites de confianza. Valores asignados pueden ser generados por un laboratorios o un grupo de laboratorio. Incertidumbre.

Cepas de Referencia y de Reserva

Pueden ser subcultivadas una sola vez para obtener cepas de reserva De las cepas de reserva se obtendrn las cepas de trabajo Las cepas de reserva se deben conservar utilizando tcnicas que mantengan las caractersticas deseadas de la cepa de referencia (liofilizacin, ultracongelacin, conservacin en nitrgeno lquido)

12

Cepas de Reserva
La tcnica de conservacin depende de: Tipo de microorganismo Disponibilidad de equipos del laboratorio Frecuencia de uso Medidas de bioseguridad Mtodo de distribucin dentro del laboratorio La tcnica elegida debe asegurar el mnimo nmero de repiques de la cepa original Si se congela, una vez descongelada no se puede volver a congelar

El registro de las cepas de reserva debe tener:

Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. Tipo y N de la coleccin. N de lote cepa de referencia. N de criovial o vial. Fecha de reconstitucin de la cepa referencia. N de repique. Frasco en uso. Fecha de baja criovial. Ubicacin de almacenamiento. Observaciones

13

LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA es de notable importancia:

Un buen mtodo de conservacin de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana original. Tener los conocimientos bsicos de Microbiologa (ej. tipo de microorganismo, crecimiento, etc.). Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo. Con cada subcultivo, hay Riesgo de cambio de la cepa.

Yo no quisiera ser una muestra de referencia!

14

GRACIAS POR SU ATENCION

15