Lesiones y Reparacin del ADN

Lesin
(alteracin qumica en el ADN)

/ =

Mutacin
(Modificacin en la secuencia del ADN)

Mutacin: Cambio en la secuencia nucleotdica de una regin corta de un genoma. Se producen por errores de la replicacin del ADN o por accin de mutgenos (agentes qumicos y radiacin). Deficiencia en la reparacin del ADN. Tipos de mutaciones: Puntuales (transiciones y transversiones). Inserciones Deleciones Efectos de las mutaciones: Letales o no letales. Organismos unicelulares o multicelulares. Reparacin de las mutaciones: Prereplicativa o posreplicativa.

Categora de mutaciones
Espontnea vs inducida Somtica vs germinal

Tipos de mutaciones
Cambios a nivel de un nucletido (puntuales) en el ADN:

Sustitucin de bases

Inserciones y deleciones Insercin: + A-T TGGTCGTAT ACCAGCATA TGGTCGTAT ACCAGCATA TGGTCAGTAT ACCAGTCATA TGGTCTAT ACCAGATA

Delecin:

- G-C

Tipos de mutaciones

Alteraciones qumicas producidas en las bases nitrogenadas

Agentes alquilantes: metilmetano sulfonato (mutgeno qumico), aade grupos alquilo a las bases nucleotdicas. El efecto depende de la posicin en la que es modificado el nucletido.

Las radiaciones ionizantes Producen diversos efectos que dependen

del tipo de radiacin y de su intensidad. Pueden actuar de forma indirecta al estimular la formacin de molculas reactivas, como perxidos en las clulas. Accin de los radicales libres sobre el DNA

GC

TA

Desaminacin del ADN: la eliminacin del grupo amino ocurre espontneamente a baja frecuencia, que puede ser aumentada por agentes qumicos (cido nitroso: desamina A, C, G, T no tiene grupo amino). Bisulfito de sodio: desamina C. La prdida tambin puede ser espontanea dependiente de temperatura y pH. CG UA TA
A Grupos amino C exocclicos G

Transicin C T 100 a 500 eventos por clula en un da

5mCG TG TA

Mutaciones causadas por mutgenos qumicos

Anlogos de bases. Son bases pricas y pirimidnicas que presentan similitud a las bases convencionales y se incorporan errneamente como sustratos durante la sntesis de ADN.

5-bromouracilo : anlogo a la timina, pero se aparea con Guanina adems de Adenina cuando existe en la forma enol (hacia donde est favorecido el equilibrio entre sus tautmeros).

Efecto mutgeno del 5-bromouracilo

Es un anlogo de Timina; se aparea con Adenina, pero su tautmero lo hace con Guanina. Resultado: transicin T-A CG durante la replicacin.

Efecto mutgeno de la 2-aminopurina:es un anlogo de Adenina; se aparea con Timina, pero su tautmero lo hace con Citosina. Resultado: transicin T-C durante la replicacin.

Prdida de bases
La despurinizacin (prdida espontnea de purinas) del DNA puede verse favorecida por accin de la temperatura. El calor estimula la degradacin inducida por agua del enlace b-N-glucosdico, que une la base al componente hidrocarbonado del nucletido. Esto sucede ms a menudo con las purinas que con las pirimidinas, creando un sitio AP (apurnico/apirimidnico) o sitios sin bases. Una clula de mamfero pierde entre 2.000 a 10.000 purinas cada 20 h a 37C. En general los sitios apurnicos son reparados, pero si permanecen se producen mutaciones durante la replicacin.

Ruptura del enlace glicocdico entre la base y la desoxirribosa. Se pierde G o A.

Agentes intercalantes: Por lo general se asocian con mutaciones de insercin. Son molculas planas que se intercalan en el ADN, aumentando la distancia entre los pares de bases adyacentes.

Radiacin UV: Induce dimerizacin de bases pirimidnicas adyacentes,

sobre todo si ambas son Timinas, originando un dmero de ciclobutilo. Tambin se forman dmeros 5CT3; 5TC3; y 5CC3 en orden de frecuencia decreciente). Los dmeros de purina son mucho menos comunes. Por lo general se producen deleciones cuando se copia la cadena modificada.

Cuando los daos no son reparados, se pueden generar cambios en las secuencia de las bases durante la replicacin, produciendo una mutacin. REPARACIN Correccin directa del DNA daado. Eliminacin de la regin daada del DNA y relleno con DNA recin sintetizado.

Sistemas de Reparacin del ADN

Reparacin directa

DNA fotoliasa: revierte los dimeros de timina - fotorreactivacin Transferasas de grupos alquilo: eliminan los grupos alquilo generados por mutgenos (metanosulfonato de etilo, nitrosoguanidina) Escisin de la regin daada Escisin de la regin daada seguida de reemplazamiento preciso -Escisin de base -Escisin de nucletidos
Reparacin de errores de replicacin - Desapareamientos (mismatch repair) - Translesin (by-pass) Reparacin de roturas de doble cadena - Unin de extremos no-homlogos - Unin de extremos homlogos: recombinacin homloga

Reparacin directa

Reparacin directa

Reparacin por escisin

Etapas principales
Reconocer la lesin Eliminar la lesin escindiendo parte de una de las hebras Nueva sntesis para llenar el hueco Sellar la mella para restablecer la continuidad del DNA

Reparacin por escisin de base

Una glucosilasa elimina la base, deja la cadena intacta La AP endonucleasa corta la cadena, la AP liasa elimina el azcar La DNA polimerasa rellena el hueco La DNA ligasa sella la mella

Reparacin por escisin de nucletido

Un corte doble elimina la lesin, se elimina un oligonucletido (12-13 nucletidos en E. Coli, 27-29 en humanos) La DNA polimerasa rellena el hueco La DNA ligasa sella la mella

Reparacin por escisin de base

El sistema de reparacin
G

Despurinacin de G

por escisin de base tambin repara los daos en el DNA producidos por despurinacin de bases, a partir de AP endonucleasa

Reparacin por escisin de nucletido

Este sistema de reparacin acta sobre una gran variedad de lesiones Dmeros de pirimidina

Modificaciones qumicas con carcingenos: benzopireno,

aflatoxina y con agentes quimioterpicos como cisplatino Bases desapareadas y pequeos lazos del DNA

Es el sistema de reparacin ms genrico y flexible

Este sistema, en E. Coli consta de 4 componentes

Funcin Escaneo DNA Nucleasa: ESCINUCLEASA Helicasa Sistema de replicacin

Componente UvrA UvrB, UvrC UvrD DNApol I/DNApol II; ligasa

Reparacin por escisin de nucletido

Fig 9-16 .- Biologa Molecular del Gen 5 ed., Watson y col.

Protena de reconocimiento del dao

Alteracin en la estructura del ADN producida por un dmero de Timina

Reparacin por escisin de nucletido

Comparacin entre E. Coli y en humanos

Funcin Escaneo DNA Nucleasa: ESCINUCLEASA E. Coli UvrA UvrB, UvrC Humanos XPA, XPC; RPA XPF, XPG

Helicasa
Sistema de replicacin

UvrD
DNApol I/DNApol II; ligasa

XPB, XPD
DNApol d/e; ligasa

Reparacin por escisin de nucletido en humanos

Gen humano XPA XPB XPC XPD XPF XPG ERCC1 RPA Funcin de la protena Protena de reconocimiento del dao (interaccin con DNA lesionado) DNA helicasa, subunidad de TFIIH Reconocimiento inicial de la lesin. Interaccin con TFIIH DNA helicasa, subunidad de TFIIH Actividad nucleasa (5lesin) Actividad nucleasa (3 lesin) Unin a XPF y a protena RPA Unin al complejo XPF-ERCC1 (reconocimiento de lesin junto a XPA)

Reparacin por escisin de nucletido en humanos

Reparacin global de genoma El heterodmero XPC hHR23B localiza lesiones que distorsionan a la doble hlice.

Reparacin por escisin de nucletido en humanos

Este sistema de reparacin tambin repara lesiones durante la transcripcin. En este caso (Reparacin acoplada a la transcripcin), es la RNA polimerasa (No XPC hHR23B ) quien identifica el dao en el ADN. Se detiene la transcripcin

Un tercer sistema de reparacin reconoce a las bases no complementarias y pequeos lazos de ADN que se incorporan durante la replicacin que no fueron eliminadas por la DNA polimerasa

Reparacin de errores de replicacin Reparacin de bases desapareadas (mismatch repair)

Los eucariotas tienen un sistema de reparacin similar. El reconocimiento de la cadena recientemente sintetizada se realiza por la presencia de roturas en ambos extremos de los fragmentos de Okazaki, mientras que la hebra conductora se puede identificar por su extremo 3en crecimiento.
Cncer colorectal hereditario no poliposo (HNPCC) o sndrome de Lynch

Consecuencia de un defecto en los mecanismos de reparacin de los apareamientos incorrectos Mutaciones en los genes hMSH2y hMLH1 Equivalentes humanos de los genes MutS y MutL de E. coli

Los pequeos lazos de ADN que se incorporan durante la replicacin se pueden producir cuando

Sistemas de reparacin inducibles

Se activan cuando hay un dao extenso al DNA. En bacterias es el sistema SOS. Se activa con dao extenso ej. UV La tasa de mutacin es ms alta despus de la reparacin por este sistema que si no existiera. Mutantes sin sistema SOS presentan menor tasa de mutacin.

Reparacin por sntesis de translesin trans lesion synthesis (TLS)

Qu ocurre si la DNA pol de replicacin encuentra una lesin, dmero de T o un sitio AP, que no ha sido reparada? Acta un mecanismo de seguridad que permite que la maquinaria de replicacin se salte by pass estos sitios de lesin

Sntesis de translesin
Este sistema es muy propenso a cometer errores, pero evita que un cromosoma se replique de manera incompleta

Reparacin por sntesis de translesin

(TLS)
Polimerasas de translesin: Familia Y de DNA polimerasas Sintetizan DNA a travs del sitio de la lesin Son dependientes de molde Incorporan nucletidos de una manera independiente de apareamiento de bases, por eso cometen errores con frecuencia
Fig 9-18 .- Biologa Molecular del Gen 5 ed., Watson y col.

E. Coli

Reparacin de roturas de doble cadena

Las roturas de doble cadena son potencialmente letales
Causas de rotura de doble hebra Radiaciones ionizantes (rayos g, rayos X)

Especies de oxgeno reactivas

Quimioterpicos (bleomicina)

Se pueden reparar por un mecanismo conocido como reparacin recombinatoria Se conocen dos vas principales de reparacin recombinatoria: Recombinacin con secuencias homlogas de un cromosoma intacto (Este mecanismo acta tras la replicacin, cuando las cromtidas hermanas an permanecen unidas). Reparacin mediante unin de extremos no homlogos (NHEJ)(alta tasa de error)

Reparacin mediante Unin de Extremos No Homlogos (propenso a error)

Los extremos rotos son alineados y recortados, luego son ligados. Varias protenas participan en NHEJ: Ku-heterodmero de Ku70 y Ku80 DNA ligasa IV

Xrcc4
Ku se une a los extremos del AND de doble cadena. El recorte de nucletidos se lleva a cabo por el complejo Mre11, dependiente de ATP.

Los baches son rellenados por DNA polimerasas y sellados por DNA ligasa IV y Xrcc4.

Reparacin mediante recombinacin con secuencias homlogas

Las roturas de cadena simple pueden repararse utilizando la cadena de ADN intacta, utilizandola como dadora de informacin de secuencia. Las roturas de doble cadena, pueden repararse utilizando la informacin faltante de otro DNA de doble cadena, que puede provenir de: cromtidas hermanas, durante la fase S tarda o en G2 del ciclo celular El cromosoma parental homlogo en organismos diploides Elementos de secuencias repetidas
Using the sister as a template for repair (late S-phase)

Intramolecular information donor

Intermolecular information donor Homologous chromosome or ectopic sequence repeat

Reparacin de Rotura de ADN de doble cadena mediante Recombinacin Homloga 1. Los extremos son recortados para generar ADN de cadena simple. Los extremos 3 invaden a la secuencia homloga y forman pares de Uniones de Holliday. Sntesis de ADN y ligacin Resolucin de ambas estructuras de Holliday.

2. 3.

Inmunofluorescencia verde (anticuerpos anti histona H2AX fosforilada; inmunofluorescencia roja (anticuerpos anti subunidad cataltica de ADN-PK). La imagen de la derecha muestra la superposicin de las otras dos imgenes, apareciendo en amarillo los puntos en los que coincide una seal verde con una roja. Tras la irradiacin (que genera muchas roturas bicatenarias en el ADN) de fibroblastos, se crean unos focos de reparacin donde se concentran las maquinarias encargadas de llevar a cabo dicha reparacin. Aunque en esta imagen se muestran molculas que intervienen en la reparacin no homloga de extremos libres, la utilizacin de anticuerpos frente a componentes del sistema de reparacin por recombinacin homloga (RAD51, NBS, etc) da lugar a imgenes similares.

Reparacin de roturas de doble cadena mediante recombinacin homloga