FACULTADCIENCIASDELASALUD

LICENCIATURAENNUTRICIN
CampusMarinaCuitlhuac

Materia:BiologaCelularyGentica
Elabor:Mtro.GustavoLimnCamacho CienciasdelaSalud Primercuatrimestre


LICENCIATURAENNUTRICIN BIOLOGIACELULARYGENTICA 1cuatrimestre

ndice

Pgina

OBJETIVO....3 PRCTICA1.USODELMICROSCOPIOPTICOYPREPARACINDETINCINSIMPLE4 PRCTICA2.BIOMEMBRANAS..10 PRCTICA3.EXTRACCINDEADN.14 PRCTICA4.OBSERVACINDECROMOSOMAS...19

Fechadeelaboracin:Septiembre2011 Fechaderevisin:Junio2012 Responsable:Dra.PaolaBernalRosales

 Objetivo
Objetivogeneraldelcurso. Alfinalizarelcursoelalumnosercapazde: Describir la estructura y funcin bsica de los componentes celulares, as como los mecanismosdecrecimiento,duplicacinycontrolcelular. Identificarlosmecanismosdedesarrollodepatologasyenfermedadeshereditarias,ascomo analizar las alternativas y probables consecuencias de la intervencin gnica en enfermedades.

Acontinuacinsemencionanlasprcticasdelamateria,sealandotiempoinvertidoporcadauna ytiemposugeridoparallevarseacabo. Acontinuacinsedetallaelnombredelaprcticaysugerenciadesemanadeaplicacin:

Prctica
1. 2. 3. 4. Esobligatorioelusodebata Usodelmicroscopiopticoypreparacindetincinsimple Biomembranas ExtraccindeADN Observacindecromosomas

Semanade aplicacin
Apartirdesemana3 Apartirdesemana5 Apartirdesemana9 Apartirdesemana11

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR Y GENTICA

Prctica No. 1

Uso del microscopio ptico y preparacin de tincin simple

Preparado por: Prof. Gustavo Limn C.

http://www.chemir.com/images/microscopylab.jpg

La observacin microscpica de especmenes biolgicos constituye

una de las herramientas ms poderosas en las ciencias biolgicas. Desde sus orgenes, la microscopa ha aportado innumerables detalles sobre la estructura de virus, clulas y tejidos. Estas observaciones han sido importantes no slo para conocer detalles morfolgicos de los organismos, sino que revelan datos importantes sobre localizacin y trnsito de molculas en el contexto celular y han permitido por tanto estudiar los cambios morfolgicos que una clula experimenta durante su diferenciacin y en estadios anormales tales como anomalas genticas, infecciones, cncer, respuestas ante estmulos del medio ambiente como presin osmtica, pH, temperatura, etc. Existen distintos tipos de microscopio (ptico, confocal, electrnico, a efecto de tunel, etc.) y cada uno ofrece distinto poder de resolucin segn sea le material por observar.

Objetivos de aprendizaje
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de: Identificar las distintas partes del microscopio ptico. Manejar el microscopio ptico para observaciones en campo seco e inmersin. Preparar tinciones simples en clulas eucarinticas y procarinticas. Distinguir diferencias morfolgicas entre eucariontes y procariontes.

http://www.smcs.co.uk/images/sq1.jpg

INTRODUCCIN

Materiales provistos por el laboratorio

1 microscopio ptico. 1 portaobjetos. 1 cubreobjetos. 1 asa bacteriolgica. 1 mechero con manguera. 2 laminillas con preparacin histolgica. Cultivo bacteriolgico en agar. Etanol-ter para limpieza de objetivos. Solucin de azul de metileno. 1 gotero con agua destilada. Aceite de inmersin. Papel para limpieza de objetivos.

Anatoma del microscopio ptico

Fuente de la imagen: http://www.onepoint.es/los_seres_vivos/ud1/photos/img_12.jpg

Descripcin de las partes de un microscopio ptico

I. Sistema ptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del objetivo. Objetivo: Lente situada cerca de la preparacin. Amplia la imagen de dicha preparacin. Condensador: Lente que concentra los rayos de luz sobre la preparacin. Foco o fuente de luz: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador

I. Sistema mecnico
Soporte: Mantiene la parte ptica y consta de pie o base y el brazo. Platina: Lugar donde se coloca la preparacin. Revlver: Contiene los objetivos que son intercambiables. Tornillos macro y micromtrico: Permiten acercar la platina para variar la distancia de los lentes respecto a la muestra.

Manejo del microscopio ptico

1. Manejarlo siempre de forma vertical sostenindolo con una mano bajo el pie del microscopio y con otra mano sujetando el brazo. 2. Transportarlo y colocarlo con cuidado sobre la mesa sin arrastrarlo, golpearlo o inclinarlo. 3. Antes y despus de su uso, limpiar los objetivos con papel fotogrfico humedecido con una mezcla de alcohol-ter. 4. Una vez que la muestra se coloca sobre la patina, girar el tornillo macromtrico para acercarla hacia el objetivo. Realizar esta operacin observando de frente al microscopio para evitar que la muestra toque el objetivo. 5. Observando a travs de los oculares, girar el tornillo micromtrico hasta lograr una imagen ntida. 6. Para observacin en el rango de micras, las muestras requieren observarse con un objetivo de 100x, el cual requiere de aceite de inmersin: Preparar la muestra sobre el portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el espcimen y a continuacin una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos. Proseguir como en el punto 5 pero esta vez asegurndose de que la gota de inmersin entre en contacto con el objetivo. A partir de este momento se enfoca la imagen con el tornillo micromtrico.

PROCEDIMIENTO
I. Preparacin de clula procarintica
1. Colocar una gota de agua sobre un cubreobjetos limpio. Flamear el asa bacteriolgica, dejar enfriar y tomar con ella una pequea porcin del cultivo bacteriano extendindolo sobre la gota de agua en el portaobjetos.

2. Fijar la muestra pasando rpidamente la parte inferior del portaobjetos sobre la flama. Verificar que la temperatura no sea excesiva colocando la preparacin sobre el dorso de la mano. Si se siente muy caliente, es posible que las clulas se hayan daad, en cuyo caso se debe repetir el paso 1.

3. Colocar una gota de solucin de azul de metileno sobre las bacterias fijadas en el portaobjetos y enjuagar con agua destilada vertindola gota a gota con el portaobjetos inclinado (no verter el agua directamente sobre la muestra).

4. Colocar un portaobjeto sobre la muestra y una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos.

5. Observar el especimen con el objetivo de 100x y dibujar lo observado.

II. Observacin de especmen eucarintico.

1. Observar las preparaciones de corte histolgico en objetivo de 75x y 100x (inmersin). Dibujar lo observado y comparar los tamaos de clulas procarinticas vs eucarinticas.

Cuestionario para el reporte

1.

Cul es el rango de tamao de las bacterias y en qu unidades se miden?

2.

Defina los conceptos: unicelular, pluricelular y multicelular.

3.

Porqu las muestras para microscopa ptica requieren ser muy pequeas o bien cortarse en secciones muy delgadas?

4.

Cul es el tamao mnimo de especmenes que pueden observarse con un microscopio ptico y cul para un microscopio electrnico?

5.

Cmo se define el poder de resolucin de un microscopio?

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR Y GENTICA

http://course1.winona.edu/sberg/308s1 0/Lec-note/Me mbrane sB.htm

Prctica No. 2

Biomembranas
Preparado por: Prof. Gustavo Limn C.

INTRODUCCIN

Las

biomembranas, o membranas biolgicas, son estructuras compuestas esencialmente de fosfolpidos dispuestos en doble capa, con los extremos hidroflicos orientados hacia el citoplasma y el exterior de la clula. Adicionalmente a los lpidos, las biomembranas tienen incrustadas numerosas molculas de protenas, carbohidratos y glicoprotenas, entre otras. Todos estos compuestos juegan un papel esencial en la funcin principal de la biomembrana que es contener y permitir el paso selectivo de materiales hacia y desde el citoplasma mediante mecanismos como la difusin y el transporte activo, regulando con ello el flujo de nutrimentos, agua, electrolitos, hormonas y un sinfn de compuestos que determinan el estado fisiolgico de la clula. El estudio de las biomembranas reviste gran importancia dado que constituyen el lmite entre la clula y su entorno y, en el caso de los eucariontes, forman tambin el lmite entre los organelos y el citosol.

Objetivos de aprendizaje
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de:

Comprender de forma prctica el concepto de permeabilidad de membrana. Identificar las condiciones osmticas ideales que permiten a una clula mantener su turgencia.

http://www.cmu.edu/biolphys/smsl/

Materiales provistos por el laboratorio

1 tramo de bolsa de dilisis (5 cms). Solucin acuosa de almidn al 2% p/v. 2 clips de mariposa pequeos. 75 ml Solucin de Iodo al 0.5% 1 vaso de precipitados de 100 ml. 1 lanceta estril para toma de sangre. Algodn y etanol para desinfeccin. 1 microscopio ptico. 2 portaobjetos. 4 cubreobjetos. Solucin de NaCl al 0.85% P/V. Solucin de NaCl al 3.0% P/V. Agua destilada.

PROCEDIMIENTO
I. Estudio de permeabilidad
1. Cerrar un extremo de la bolsa de dilisis con un clip y llenarla con la solucin de almidn a de su capacidad. Eliminar el aire empujando con los dedos el extremo abierto y cerrar la bolsa con el segundo clip. 2. Enjuagar muy bien el exterior de la bolsa con agua destilada y secar sobre toalla de papel.

3. Colocar la bolsa de dilisis dentro de la solucin de Iodo en el vaso de precipitados.

4. Despus de 30 minutos, retirar la bolsa de dilisis, enjuagar y secar sobre papel. Anotar el color del almidn y de la solucin de Iodo y explicar en el reporte las razones de los cambios que ocurran en la solucin de iodo y de almidn.

II. Estudio de presin osmtica.

1. Limpiar bien los portaobjetos con alcohol y etiquetarlos comose indica: 1er portaobjetos: Control negativo y agua destilada. 2 portaobjetos: NaCl al 3.0% y NaCl al 0.75% 2. Colocar en cada portaobjeto las soluciones respectivas en forma de gotas separadas (el control no llevar ninguna solucin).

3. Desinfectar la yema del dedo de uno de los integrantes del equipo con un algodn impregnado de alcohol y obtener sangre con la ayuda de la lanceta estril

4. Colocar una gota de sangre en cada portaobjetos al lado de la solucin respectiva (control, agua, NaCl al 3% o NaCl al 0.75%) 5. Mezclar la sangre con cada solucin, cubrir con un portaobjetos y dejar as durante 4 minutos. Observar al microscopio en campo 100X (con aceite de inmersin). Dibujar lo observado y explicar las diferencias en funcin de la solucin a la que fueron expuestas las clulas sanguneas.

Cuestionario para el reporte

1. 2. Cmo se define una clula turgente y una clula plasmolizada? Porqu a la solucin de NaCl se le llama tambin solucin salina fisiolgica? 3. Cul es la diferencia entre permeabilidad y permeabilidad selectiva? 4. Porqu se dice que las biomembranas son estructuras dinmicas y qu papel juega el colesterol en las membranas de clulas animales?

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR Y GENTICA

Prctica No. 3

Extraccin de ADN
Preparado por: Prof. Gustavo Limn C.

http://www.pyroenergen.com/articles09/images/dna.jpg

http://images.sciencedaily.com/2008/10/081007192526-large.jpg

INTRODUCCIN

Existen muchas tcnicas que permiten aislar al ADN

a partir de clulas eucarinticas y procarinticas. Las variaciones de dichas tcnicas se realizan en funcin del cido nuclico por extraer: ADN nuclear, mitocondrial o plasmdico, ARN total, mRNA, etc. Esencialmente, la extraccin de cidos nucleicos inicia con la desintegracin de membranas y otras estructuras como pared celular, cpsula bacteriana, etc (segn sea el organismo en estudio), mediante detergentes, sales, lcalis y enzimas. A este proceso se le conoce como lisis celular. Posteriormente, el homogenizado es filtrado para eliminar restos de membrana y tejido que no alcanz a lisarse. Finalmente, los cidos nucleicos pueden purificarse mediante solventes orgnicos, esferas magnticas o simplemente por precipitacin con etanol fro. En esta prctica realizaremos un protocolo sencillo para extraer ADN nuclear a partir de fresas empleando sal, detergente y etanol.

Objetivos de aprendizaje
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de: Conocer los principios de la extraccin fsico-qumica de cidos nucleicos a partir de clulas eucarinticas. Identificar el papel de los detergentes y sales inicas en la disrupcin de biomembranas con el fin de obtener ADN como paso elemental para anlisis genmicos y biotecnolgicos.

Materiales provistos por el laboratorio

1 pipeta graduada de 5ml. 5 ml de detergente alcalino. cucharadita de sal. taza de agua. 20 ml de etanol fro (4 C). 1 vaso de precipitados de 250 ml. 1 varilla de vidrio. Papel negro (10x10 cms).

Materiales provistos por el alumno

3 fresas. 1 bolsa tipo ziplock 1 filtro para caf. Papel negro (10x10 cms).

PROCEDIMIENTO
1. Macerar tres fresas en una bolsa ziplock durante dos minutos.

2. Preparar la solucin de lisis con 1/2 taza de agua , 5 ml de detergente alcalino y 1/2 cdita. de sal.

3. Aadir la solucin de lisis al pur de fresas, homogenizar con las manos y dejar reposar por 2 minutos.

4. Filtrar el homogenizado por papel filtro para caf sobre el vaso de precipitados. Descartar lo que queda en el filtro.

5. Aadir al lisado lentamente y en ngulo de 45 , 20 ml de etanol fro (a 4 C).

6. Dejar reposar por 5 minutos. El ADN precipita con el etanol formando filamentos blancos mucosos.

7. Retirar el ADN de la interfase (zona entre el lisado y el etanol) con una varilla de vidrio y pasarlo al papel negro.

8. Tomar una fotografa del ADN extrado e incluirla en el reporte.

1.

Qu papel desempean la sal y el detergente en la extraccin del ADN?

2.

Cuntas copias del genoma contiene la fresa (diploide, triploide, etc)?

3.

Porqu el ADN precipita con el etanol? Explquelo en trminos qumicos.

4.

Mencione otros dos procedimientos para extraer ADN.

http://www.ilunchbox.com/images/Cont ent%20 Images /straw berries.j pg

Cuestionario para el reporte

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http://wallpapers-diq.net/es_21__Y-Chr omosome_DNA _with_ Featur es.html

Prctica No. 4

Observacin de Cromosomas
Preparado por: Prof. Gustavo Limn C.

INTRODUCCIN

Los cromosomas son estructuras de cido Desoxirribonuclico de

doble cadena y constituyen el elemento principal del genoma de un organismo (los plsmidos son tambin parte del genoma pero de forma circular y ms pequeos en longitud). Los cromosomas procarinticos son circulares y su longitud es de algunos millares de pares de bases, mientras que los cromosomas eucarinticos son molculas abiertas y contienen millones de pares de bases y requieren estructurarse en forma de nucleosomas y bucles para evitar que el ADN se dae y tambin como mecanismo de regulacin gnica, silenciando as genes que no requieren expresarse en un momento dado. Adicionalmente al ADN, los cromosomas y protenas que se asocian por sus cargas positivas al ADN (de carga negativa). Dichas protenas varan en tipo y nmero segn se trate de cromosomas procarinticos o eucarinticos. Para visualizar los cromosomas, se prefiere estudiarlos en fase mittica ya que es cuando se hallan replicados presentando al menos dos cromtidas segn sea la ploida de la clula estudiada.

Objetivos de aprendizaje
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de:

Preparar clulas eucarinticas a partir de tejido vegetal para observacin de distintas fases del ciclo celular. Realizar tincin histolgica para identificacin de cromosomas en fase mittica.

http://www.tetrasomy18p.ca/

Materiales provistos por el laboratorio

1 microscopio ptico. 3 portaobjetos. 1 cubreobjetos. 1 pinzas. 1 navaja de diseccin. HCl 1N. 1 tubo de ensayo pequeo. Pinzas para tubo de ensayo. Vaso de precipitados de 100 ml. Mechero con manguera. Soporte para vaso de precipitado. Agua destilada en gotero. Solucin de Feulgen comercial o preparada en laboratorio (ver frmula y preparacin en el apndice.

Materiales provistos por el alumno

3 brotes de germinado de soya

PROCEDIMIENTO
1. Con ayuda de las pinzas y la navaja, cortar la punta de dos germinados de soya ( Aprox. 1 cm).

2. Colocar los cortes en un tubo de ensayo pequeo y aadir HCl 1N hasta cubrirlos. Llevar a bao de agua durante 12 minutos

3. Remover los cortes de germinado y con las pinzas transferirlos cuidadosamente a un portaobjetos y enjuagar 3 veces con agua destilada gota a gota..

4. Aadir a cada germinado una gota de tincin de Feulgen e incubar a temperatura ambiente durante 12 minutos. Las puntas del germinado pueden tornarse rojas por la incorporacin del colorante a los cromosomas.

http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch05/chromosome_X_1.html

5. Enjuagar los brotes 3-4 veces cuidadosamente con agua destilada gota a gota.

6. Transferir 2 brotes a otro portaobjetos limpio (un brote por portaobjeto) y con la navaja cortar la parte no teida y descartarla.

7. Colocar un cubreobjetos sobre el brote y oprimir la muestra suavemente contra el portaobjetos (NO GIRAR EL CUBREOBJETOS).

8. Observar al microscopio iniciando con el objetivo 10x hasta el 100x (de inmersin), dibujando lo observado.

Fuente: http://www.marietta.edu/~biol/introlab/Onion%20root%20mitosis.pdf

Cuestionario para el reporte

1. Explique en trminos qumicos porqu los cromosomas fijan a la Fuschina bsica que es el colorante de la solucin de Feulgen. 2. Cmo influye el que un cromosoma sea abierto o cerrado en cuanto

a su degradacin por nucleasas?

3. Mencione dos agentes (sustancias) que puedan colorear cromosomas, distintos al empleado en esta prctica.

Apndice

Preparacin se la solucin de Feulgen

1. Pesar 150 mg de Fuchsina bsica y transferir a un vaso de precipitados de 250ml.

2.

Aadir 30 ml de agua hirviente a la Fuchsina y agitar hasta

disolucin total.

3. 4. 5.

Enfriar a 50 C y filtrar por papel Whatman No. 1. Aadir 4.5 ml de HCl 1N y mezclar bien. Aadir 0.45 g de K2S2O5 (metabisulfito de potasio) a la solucin de Fuchsina-HCl.

6. 7.

Dejar la solucin en reposo y obscuridad durante 24 hrs. Decantar la solucin a un gotero mbar y mantener en refrigeracin.

Estructura de la Fuchsina bsica

Fuente: http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/Root_tip_chromosomes/Feulgen_Stain.htm