Anlisis de la herencia de las mutaciones ebony y dumpy en Drosophila melanogaster Edward H. Molina-Henao1, Alejandra Ortega1, Andrs F.

Pea-Cruz1, Alejandra R. Rodrguez-Ortiz1

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Estudiantes de Biologa. Facultad de Ciencias Naturales y Exactas. Universidad del Valle

Resumen Con el fin de determinar el tipo de herencia que presenta el fenotipo silvestre y las mutaciones ebony y dumpy de Drosophila melanogaster, se parti de un cruce parental desconocido, obtenindose una F1 con individuos silvestres, sin embargo, al cruzar dichos individuos entre s, se obtuvieron 198 especmenes silvestres, 68 ebony, 40 dumpy y 14 ebony-dumpy. La segregacin de caracteres y los valores observados para esta F2 permitieron plantear que el tipo de herencia de las mutaciones es mendeliana autosmica recesiva, y al ser dihbridos, se esper una proporcin 9:3:3:1. Sin embargo, la prueba de chi-cuadrado rechaz esta hiptesis, lo cual fue inesperado puesto que en teora estas mutaciones no se heredan de otra manera. Un anlisis ms exhaustivo de las proporciones mostr que al presentarse la mutacin dumpy el nmero de individuos era mucho menor al esperado, esto llev a concluir que existan problemas en el ciclo de vida de estos individuos. De acuerdo a esto, se plantearon tres hiptesis apoyadas por investigaciones que demostraron pleiotropismo y letalidad segn la combinacin de la serie allica de dumpy, la primera relacionada con la identificacin de un individuo dumpy como silvestre, la segunda enfocada en el crecimiento desproporcional del aparato bucal y la constriccin de la trquea durante estados larvarios y la tercera relacionada con la habilidad de mayor apareamiento que tiene un individuo silvestre portador del alelo ebony contra un individuo silvestre portador del alelo dumpy. El desarrollo de estas hiptesis abre camino para una futura identificacin de las diferentes combinaciones allicas de dumpy en la colonia de la Universidad del Valle. Palabras clave: Drosophila melanogaster, ebony, dumpy, herencia mendeliana, pleiotropismo Abstract In order to determine the type of inheritance of the mutations ebony and dumpy in Drosophila melanogaster, we started from an unknown parental cross, obtaining a F1 with all wild individuals. Later, we crossed F1 individuals and obtained 198 wild, 68 ebony, 40 dumpy, and 14 ebony-dumpy specimens. The segregation of characters and the observed values for this F2 generation let us to suggest that the inheritance mode of these mutations is autosomal recessive, therefore, we expected a 9:3:3:1 ratio. However, the chi-square test rejected that hypothesis. Further ratio analysis showed that the number of dumpy individual was much lower than expected; this led to the conclusion that there were problems in the life cycle associated with this genotype. Accordingly, we proposed three hypotheses supported by research that showed pleiotropy and lethality due to the combination of allelic series of dumpy, the first relating to the identification of an individual dumpy as wild, the second focused on the disproportionate growth of mouthparts and constriction of the trachea during larval stages and the third related to increased mating ability in an wild individual carrying the ebony allele against an wild individual carrying the dumpy allele. The development of these assumptions paves the way for future identification of the different allelic combinations dumpy in the colony at the Universidad del Valle

Key words: Drosophila melanogaster, ebony, dumpy, mendelian inheritance, pleiotropy ___________________________________________________________________________________ Introduccin Drosophila melanogaster, conocida comnmente como la mosca de la fruta, ha sido utilizada como organismo experimental en estudios genticos desde principios del presente siglo, debido a su fcil manipulacin y mantenimiento, resultando relativamente econmica su productividad en comparacin con la utilizacin de otros organismos. Es un animal que mide unos 3 mm, con un ciclo de vida de 15-21 das dependiendo de la temperatura, de coloracin amarilla ocre en cuerpo, tarsos y alas; definida por sus caractersticas genitales en las cuales se observa dimorfismo sexual: abdomen apical negro para machos, en bandas oscuras posteriores para hembras; presencia de peines sexuales masculinos de aproximadamente 10 cerdas localizados en la base del tarso del primer par de apndices locomotores (Ashburner et al., 1986). Aunque tiene un tamao pequeo, su genoma permite revelar grandes procesos que se pueden extender a otros organismos ms complejos (Alvarado, 2000), inducindosele factores ambientales o de laboratorio y combinando mutaciones en su genoma con gran facilidad (Amors, 2001). Entre las mutaciones que se han logrado para Drosophila melanogaster y las cuales son objeto del presente informe, se encuentran: ebony (e), mutacin en locus 70,7 centimorgan del cromosoma III, recesiva autosmica (Prez, 2009); su genotipo homocigoto es ee//ee y su fenotipo se exhibe como un color caf oscuro en el cuerpo y una venacin alar ms oscura en comparacin con el fenotipo silvestre; inclusive, se ha revelado en investigaciones bioqumicas que la accin del gen que produce esta mutacin, puede tener efectos sobre la transmisin neurolgica (Kyriacou et al. 1978). La mutacin dumpy (dp) se presenta en el locus 13,0 centimorgan del cromosoma II y al igual que la ebony, es recesiva autosmica dd//dd (Pierce, 2010); se caracteriza por expresar alas cortas con puntas romas en contraste con las alas alargadas de puntas redondeadas del fenotipo silvestre. Sin embargo, se ha demostrado que dumpy presenta una serie allica que se complementa y puede llamarse pseudoalelismo (Carlson, 1962), las diferentes combinaciones presentan tres efectos mutantes recesivos principales segn Southin (1966): alas oblicuas (o), vrtices torcicos con tumores y setas alteradas (v) y, el efecto letal (l). Hasta el da de hoy se han reportado 100 diferentes genotipos mutantes para dp segn Offner (1996). Adems de secuenciar una enorme protena extracelular que organiza la estructura de la cutcula (Wilkin et al. 2000), dumpy se expresa en la superficie interna del micrpilo del ovulo maduro y posiblemente permite el reconocimiento del espermatozoide (Carmon et al. 2007). Ahora bien, si dos moscas con este fenotipo se cruzan, la descendencia toda ser dp, pero si se aparea con una silvestre toda la F1 ser silvestre; si dos individuos de esa F1 se aparean, en la F2 se tendr tanto dp como silvestre; habindose segregado el carcter en la segunda generacin; la descendencia obtenida presentar una proporcin mendeliana 3:1, ms silvestres que dp (Smith, 2000). La herencia de estas dos mutaciones se comportan de acuerdo a la Ley de Segregacin de Mendel, puesto que en la formacin de los gametos se segregan los cromosomas y genes debido al proceso de meiosis, dando como resultado que una mitad de los gametos lleven uno de los miembros del par de genes y la otra mitad lleven el otro miembro del par de genes (Prez, 2009). Para comprobar que las proporciones fenotpicas obtenidas en un experimento se ajustan a cierto tipo de herencia se usa una prueba de bondad de ajuste X2 de Pearson. Esta determina si las

discrepancias existentes entre proporciones fenotpicas observadas y esperadas para un determinado patrn de herencia, son estadsticamente significativas o son tan pequeas que se pueden atribuir al azar. En el caso de probar una herencia mendeliana para cruce dihbrido, se plantea una hiptesis nula que sostiene que la herencia se debe a un solo gen con dominancia completa y no existe diferencia significativa entre las proporciones esperadas y observadas; la hiptesis alternativa defiende que las herencias son significativas, y la proporcin no es de 9:3:3:1, el nmero de grados de libertad es igual al nmero de clases fenotpicas menos 1 (Griffiths et al. 1993) El objetivo de esta prctica fue determinar el tipo de herencia de las mutaciones ebony y dumpy en Drosophila melanogaster, mediante el reconocimiento fenotpico y el conteo de los individuos de la F1 y F2, obtenidas durante el experimento realizado y su posterior anlisis estadstico con la prueba de chi-cuadrado. Asimismo, obtener los parentales y las mutaciones puras a partir de la F1 y F2. Materiales y mtodos El da 13 de septiembre de 2011, la Seccin de Gentica de la Universidad del Valle le entreg a los diferentes grupos del laboratorio los medios de agar-banano que contenan la descendencia F1 en estado larval y pupal de parentales desconocidos de Drosophila melanogaster; a los autores se les asign el frasco #2 para que se realizara el anlisis del tipo de herencia de las mutaciones presentes en dichos individuos. El da 14 de septiembre de 2011 nacieron los primeros adultos, los cuales se depositaron de manera individual en pitillos para asegurar su virginidad hasta la identificacin en el laboratorio, posteriormente se colocaron dentro de un frasco de vidrio y se anestesiaron con ter etlico, se observaron al estereoscopio en una caja Petri y se clasificaron por sexo y fenotipo. Se sigui este procedimiento con todas los individuos de la F1 que iban naciendo en el transcurso de los das, durante tres semanas. Los especmenes clasificados se separaron en parejas, asegurndose que las hembras fueran vrgenes, y se depositaron en nuevos medios para producir la segunda generacin. Al transcurrir seis semanas, se obtuvieron los individuos de la F2, los cuales se ordenaron segn el sexo y la mutacin que presentaba cada uno usando las tcnicas descritas anteriormente. Paralelo al nacimiento de individuos de la F2, se aislaron algunas parejas -hembra y macho- que tenan igual fenotipo en un frasco con medio agar-banano, con el objetivo de purificar la cepa hasta obtener las mutaciones homocigotas, en el caso de dumpy se necesitaron 3 generaciones, y en el caso de ebony solo 1 generacin ms, para finalmente depositarse en la Colonia de la Seccin de Gentica de la Universidad del Valle. Con el fin de explicar el tipo de herencia basndose en las proporciones obtenidas de la F2 se utiliz la prueba de bondad de ajuste de chi-cuadrado con grados de libertad 3: donde e= valor esperado y o= valor observado, tal como se recomienda para anlisis genticos en Kurtzke (1965) y Klug et al. (2006).

Resultados Al finalizar el conteo de la F1, se obtuvo que todos los individuos eran de fenotipo silvestre ++//++, despus de los cruces realizados entre esta se obtuvo una F2 con un total de 320 individuos, entre los cuales se identificaron las mutaciones ebony ee//ee, dumpy dd//dd, y ebony-dumpy ee//dd en las proporciones que se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Nmero total de individuos de la F2 clasificados segn sexo y fenotipo Machos ebony dumpy Silvestre ebonyebony dumpy 25 20 78 6 43 Total

Hembras dumpy Silvestre 20 120

ebonydumpy 8

El fenotipo con mayor nmero de representantes en la F2 fue el silvestre con un total de 198 individuos entre hembras y machos, seguido por ebony con 68, dumpy con 40 y la menor cantidad fue identificada en ebony-dumpy con un total de 14 individuos. Segn los resultados anteriores se plantea como hiptesis (Ho) que las proporciones observadas para la F2 se ajustan al tipo de herencia mendeliano para cruces dihbridos, es decir, las proporciones esperadas son 9:3:3:1. Para esto se realiz el anlisis estadstico de chi-cuadrado mostrado en la tabla 2. Posteriormente, en la figura 1 se presenta mediante un cuadro de Punnet los diferentes genotipos formados para los individuos de la F2:

Tabla 2. Anlisis de chi-cuadrado para los porcentajes esperados de 9:3:3:1 en la F2 Fenotipo Valores observados Valores esperados Desviacin2 (d2) X2 198 180 324 1,8 Silvestre ebony 68 60 64 1,06 dumpy 40 60 400 6,66 ebony-dumpy 14 20 36 1,8 320 11,32 Total

Tabla=X2(0,05; 3)= 7,82 11,32>7,82

Fig. 1. Cuadro de Punnet que presenta los diferentes genotipos formados para los individuos de la F2

El anlisis muestra que la hiptesis planteada es rechazada ya que el X2 calculado fue mayor al de la tabla. En cuanto al proceso de purificacin para la mutacin dumpy, se inici con el aislamiento de 3 parejas de la F2 con el fenotipo mencionado, lo que dio como resultado individuos con fenotipo ebony-dumpy y dumpy en aproximadamente la misma proporcin. Posteriormente se aislaron de nuevo 2 parejas dumpy de la generacin anterior obteniendo ms individuos con fenotipo dumpy que ebonydumpy. Sin embargo fue necesaria una tercera generacin para obtener el 100% de individuos con la mutacin dumpy. Para purificar la mutacin ebony solo se necesit 1 generacin, pues al aislar de la F2 una pareja del fenotipo mencionado, se obtuvieron individuos con la mutacin ebony en un 100%. Discusin El inicio del experimento se realiz con estados inmaduros de la mosca, sin conocer la ascendencia de las mismas. Como en la F1 se obtuvo 100% individuos silvestres, no se saba en ese momento cules seran las mutaciones esperadas. En la segunda generacin, se obtuvieron organismos silvestres y organismos mutantes, presentando el fenotipo dumpy, ebony, y la combinacin de ambos. A partir de este resultado, se plante el origen de la F1, concluyndose que para que la descendencia presentara ambas mutaciones, los parentales deban contener estos genes, de acuerdo a lo que se observa en la figura 2:

Fig. 2. Parentales del experimento. Uno de ellos era fenotpicamente silvestre y el otro era dimutante: ebony-dumpy.

Una vez se obtuvo la F2 se segregaron los caracteres, permitiendo postular que las proporciones observadas se ajustan a 9:3:3:1, no obstante, el valor calculado de chi-cuadrado es mayor al de la tabla para 3 grados de libertad, lo que implic el rechazo de la hipotesis. Esto implica que los valores observados no se ajustan al tipo de herencia mendeliano para cruces dihbridos. Sin embargo, esta afirmacin es invalida puesto que solo dumpy demostr alejarse de los valores esperados con un valor chi-cuadrado de 6.06 lo cual es muy alto pues casi iguala el valor tabla de 7.82 , mientras que ebony y silvestre se ajustan a las proporciones esperadas con valores chi-cuadrados de 1,06 y 1,8 respectivamente. A pesar que la mutacin dumpy se hereda de manera autosmica recesiva y mendeliana, se demostr que la explicacin no est ligada al tipo de herencia de esta mutacin, sino de factores fenotpicos y del ciclo de vida que produce dumpy, pues este es un gen pleiotrpico (Carlson, 1959). Ahora bien, para justificar este hecho fueron planteadas tres nuevas hiptesis. Segn Carlson & Oster (1961) y Southin (1966), la mutacin dumpy es una serie allica y por ende se manifiesta mayoritariamente en tres efectos pleiotrpicos recesivos: alas oblicuas (o), vrtices torcicos con tumores y setas alteradas (v) y, el efecto letal (l); esto es fundamental puesto que en la identificacin de

los organismos, se clasificaron como mutantes dp nicamente los individuos que presentaban alas truncadas de una longitud similar a la del trax del animal (fenotipo del alelo ov y obm), sin tener en cuenta las otras expresiones fenotpicas que presenta este locus, con alelos simples o combinados (ver figura 3). Esto permiti plantear la primera hiptesis, la cual contempla la posibilidad de haber contado un individuo dumpy como silvestre solo por sus alas normales, pero sin observar su trax con protuberancias. Esta hiptesis tambin abre la posibilidad de haber contado una mosca dumpy con el genotipo letal (l) como un individuo silvestre, pues como se explic anteriormente y segn se presenta en la figura 3, los dumpy que expresan el alelo letal, exhiben un fenotipo completamente silvestre, solo que duran poco tiempo vivas en su estado adulto.

Fig. 3. Expresin fenotpica de la mutacin dumpy (Carlson y Oster, 1961)

Ahora bien, durante el tiempo en el que se desarrollaron los individuos de la F2, se pudo observar algunas larvas muertas y pupas que nunca eclosionaron y despus de un tiempo se despegaban de la pared del frasco y caan al medio. Se cree que estos individuos muertos prematuramente presentaban la mutacin dumpy en una de sus tantas combinaciones allicas letales (Carlson, 1959), lo cual llev a postular la segunda hiptesis, cuyo soporte es encontrado en Wilkin et al. (2000), pues ellos demostraron que dumpy produce en los embriones defectos en la cutcula alrededor del lumen de la trquea en desarrollo, impidiendo que esta se llene de aire, en conjunto con esto, el aparato bucal de las larvas llega a crecer fuera de la proporcin normal del cuerpo, lo cual impedira una alimentacin adecuada e incluso el desarrollo normal de otros tejidos; esto explicara por qu se observaban algunas larvas que despus de alimentarse uno o dos das, se quedaban quietas en un solo sitio sin moverse y posteriormente tomaban una coloracin oscura, esto indic que el organismo muri. Por esta razn muchos individuos dumpy muertos no fueron tenidos en cuenta para el anlisis estadstico y como se observ en la tabla 2 esto afect drsticamente la prueba del chi-cuadrado, rechazando la hiptesis cuando esta no deba ser rechazada. Otro dato interesante fue que los individuos dimutantes, es decir los ebony-dumpy, tambin tuvieron un valor observado muy bajo al compararlo con el esperado segn la tabla 2, esto demostr dos cosas, la primera, que la mutacin ebony como tal no afecta el anlisis estadstico, pues aparentemente no presenta problemas en su ciclo de vida; la segunda, muestra claramente que cuando dumpy se hace presente en conjunto con ebony -dimutante- aparece una disminucin de individuos; por tanto se concluye que la presencia de las series allicas dumpy influyen

en un desarrollo anormal de los individuos y puede llevar a concluir errneamente que dicha mutacin no se hereda mendelianamente recesiva. La tercera hiptesis presenta la mutacin ebony, de acuerdo a Sndergaard (1983) y posteriormente Mora et al. (2000), con una capacidad de cpula en un cruce homocigoto ee//ee mayor que en un cruce homocigoto de un organismo silvestre ++//++. Un macho ebony tienen mayor capacidad de cpula sobre una hembra silvestre que un macho ++//++ sobre la hembra ee//ee. De acuerdo a esto, se podra inferir que por ser los parentales heterocigotos (++//+e), pueden tener esta capacidad de cpula, teniendo una mayor productividad en la reproduccin versus los organismos dumpy. Aunque se ajusten los datos a las proporciones esperadas, ebony presentara un mayor nmero de individuos con esta mutacin. Para obtener las cepas puras, fue necesario aparear machos y hembras que presentaran fenotpicamente la misma mutacin, asegurndose que las ltimas fueran vrgenes, debido a que estn preparadas para la cpula a las ocho horas despus de la emergencia del imago, momento en el cual alcanzan la madurez sexual, teniendo la capacidad de almacenar esperma viable despus de la inseminacin para una posterior fertilizacin de otras posturas (Alvarado, 2000). Por lo tanto, para mayor certeza, se separaron los individuos lo ms rpido posible despus de que salieran de la pupa en pitillos, mientras se les haca el reconocimiento del sexo y la mutacin. En el proceso de purificacin de la mutacin dumpy se necesit de 3 generaciones para lograr homocigotos puros para esta caracterstica, esto fue debido al genotipo de las parejas que se aislaron inicialmente de la F2, puesto que se presentaron 2 genes (para cuerpo y alas) y 4 alelos, 2 para cada gen. Esto representa las diferentes posibilidades fenotpicas que se pudieron presentar, sin embargo, conforme a los resultados obtenidos, es decir, ebony-dumpy y dumpy, se plantearon solo dos genotipos posibles para los dos individuos base para la purificacin: Uno de ellos debi ser dd//e+, es decir, homocigoto recesivo para el tamao de las alas y heterocigoto para el color del cuerpo, y el otro individuo debi ser dd//++, es decir, homocigoto para ambas caractersticas. Al cruzarse estos dos genotipos no se obtuvo una descendencia pura todava, por esto se realiz otro cruce, en el que de nuevo surgi el fenotipo ebony-dumpy, la razn de esto fue muy clara ya que al escoger las parejas para el cruce, estas presentaban el genotipo anteriormente mencionado, sin embargo al realizar un tercer cruce, todos los individuos obtenidos fueron de fenotipo dumpy, lo cual indic que el genotipo presente en esta ltima generacin fue dd//++, es decir una cepa pura de dumpy. Con respecto a la purificacin de la mutacin ebony, solo fue necesario cruzar una pareja de fenotipo ebony escogida de la F2, esto se debi a que los dos individuos base para la purificacin presentaban el genotipo ++//ee, es decir homocigotos para tamao de las alas y color de cuerpo. Es importante resaltar que fue cuestin de azar, puesto que si se hubieran escogido alguno de los individuos heterocigotos para color de cuerpo, hubieran sido necesarios ms cruces as como ocurri con la mutacin dumpy. En conclusin, se determin que las mutaciones ebony y dumpy se heredan de manera autosmica recesiva para el caso de cruces dihbridos, por lo cual solo aparecieron en la F2. Adems, se determin que la prueba de bondad de ajuste de chi-cuadrado era afectada significativamente cuando se manifestaba el gen dumpy. Esto implic tericamente que dicha mutacin se hereda recesivamente, pero se encontr que dumpy no es un locus de dos alelos, sino toda una serie allica pleiotrpica que segn la combinacin de los alelos puede expresarse o no fenotpicamente; esto explic porque los valores observados para los individuos dumpy o ebony-dumpy eran mucho menores a los esperados,

puesto que se pudieron presentar combinaciones allicas letales que detuvieron el desarrollo del individuo en estado larval o sencillamente murieron prematuramente en su adultez. Como se concluy anteriormente, las tres hiptesis planteadas presentan la tentativa de determinar y si es posible purificar las diferentes combinaciones allicas del gen dumpy que se encuentran presentes en la colonia de Drosophila melanogaster de la Universidad del Valle, considerando esto de gran importancia puesto que la mutacin afecta el ciclo de vida de los individuos, causndoles en ocasiones la muerte y concibiendo un desequilibrio en la prueba de chi-cuadrado, generando una equivocacin al plantear que dumpy no se hereda mendelianamente. Bibliografa
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