E.A.

P Farmacia y Bioqumica Curso: Analisis Instrumental

PRCTICA NUMERO 02 ESPECTROFOTOMETRIA

I. OBJETIVOS: Determinacin cuantitativa de la concentracin de una sustancia coloreada, en una muestra problema. Elaboracin de una curva de calibracin de los colorantes a utilizar.

II.

FUNDAMENTO TEORICO: La Espectrofotometra se incluye dentro de la Espectroscopia, ciencia que estudia los fenmenos de absorcin y de dispersin de la luz. Los espectros pueden ser de: Emisin, cuando los tomos pierden energa radiante, emiten una radiacin electromagntica. Absorcin: cuando captan energa radiante, aumentan su energa interna. Esta energa que los tomos de una sustancia emiten o absorben constituye una radiacin electromagntica o REM. Las radiaciones electromagnticas tienen doble naturaleza: corpsculo y de onda: Corpuscular: porque la luz est constituida por pequeas partculas llamadas fotones. Onda; porque viajan en las tres direcciones del espacio con movimiento ondulatorio. Cada REM lleva una energa asociada que se calcula por la conocida ecuacin de Max Planck:

E=h.
Donde: E: Energa. h: Constante de Planck = 6,626 x 10-34 Joule seg. : Frecuencia de la radiacin en seg-1. La frecuencia de la radiacin es inversamente proporcional a su longitud de onda .

=C/
C=Velocidad de la luz (300 000 Km/seg) Muchos experimentos en bioqumica dependen de la medicin de absorcin de luz monocromtica de una sustancia en solucin en la regin visible y ultravioleta del espectro electromagntico. Diversos compuestos sean o no coloreados tienen la capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda, pero en otros casos, es necesario transformar la luz en un derivado coloreado usando reactivos apropiados.

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Las molculas de inters biolgicos absorben luz en la longitud de onda comprendida entre 200 y 8000 nanmetros (nm), como las purinas, aminocidos, cidos nucleicos, protenas y otros. Tanto el color (colorimetra) como la transmitancia (fotometra) de la luz de una solucin pueden usarse como medida de su concentracin. Para realizar las medidas de concentracin se utiliza un instrumento llamado ESPECTROFOTOMETRO, el cual contiene un prisma de dispersin entre la fuente de luz y la muestra para poder seleccionar la longitud de la onda analtica adecuada. La espectrofotometra consiste en comparar la transmisin de la luz a travs de una solucin que contiene muestra. La ley de Lamber Beer nos manifiesta que la fraccin incidencia absorbida por la solucin a una determinada longitud de onda esta relacionada con el espesor de la capa absorbente y concentracin de la especie que absorbe. Por la frmula:

A = a.b.c
Donde: A: Absorbancia. Capacidad de una solucin para absorber luz. a: Coeficiente de extincin molar. b: Espesor de la cubeta (1cm) c: Concentracin de la muestra (g/l; mg/ml, g/ml).

Anaranjado de metilo
Naranja de metilo es un colorante azoderivado, con cambio de color de rojo a naranja-amarillo entre pH 3,1 y 4,4. La frmula molecular de la sal sdica es C14H14N3NaO3S y su peso molecular es de 327,34 g/mol Se empez a usar como indicador qumico en 1878. En la actualidad se registran muchas aplicaciones desde preparaciones farmacuticas, colorante de teido al 5%, y determinante de la alcalinidad del fango en procedimiento petroleros. Tambin se aplica en citologa en conjunto con la solucin de Fuschin Tambin es llamado heliantina. Se usa en una concentracin de 1 gota al 0.1% por cada 10 ml de disolucin.

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Naranja de metilo (Indicador de pH ) Inferior a pH 3,1 Rojo Sobre pH 4,4 Naranja-amarillo

Anaranjado de metilo

Viraje del Naranja de Metilo

Azul de metileno

3,7-bis (dimetilamino)Nombre qumico Cloruro d fenazationio Cloruro de tetrametiltionina Frmula qumica C16H18N3ClS Masa molecular 319,85 g/mol Nmero CAS [61-73-4] Nmero EC 200-515-2 Punto de fusin 100 C Punto de ebullicin Se descompone CN(C)c3ccc2nc1ccc(N(C) SMILES C)cc1[s+]c2c3.[Cl-] El azul de metileno, cuyo nombre cientfico es Cloruro de Metilionina, es un colorante que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia. Es un compuesto qumico heterocclico aromtico con frmula molecular: C16H18ClN3S.

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III.

MATERIALES Y REACTIVOS: REACTIVOS Anaranjado de metilo Verde malaquita Agua destilada MATERIALES DE LABORATORIO 12 tubos de ensayo grandes. 12 tubos de ensayo pequeos. 04 gradillas. 04 varillas de vidrio. 02 probetas de 50ml. 02 fiola de 100ml. 02 pipetas de 2ml. 02 pipetas de 5ml. 02 pipetas de 10 ml 02 pipetas pasteur

IV. PARTE EXPERIMENTAL: 1. Espectro de Absorcin y Longitud de mxima absorcin: El presente experimento tiene por objetivo encontrar la curva de un colorante y determinar su longitud de onda analtica en una solucin coloreada. El proceso consiste en aplicar el mtodo de absorcin en el espectro visible. Procedimiento: a) En un tubo de ensayo de 10ml de capacidad colocar 2ml de los colorantes anaranjado de metilo y azul de metileno. Diluir cada uno con 1ml de agua destilada. b) En otro tubo de ensayo colocar 3ml de agua destilada para calibrar el espectrofotmetro a cero absorbancia. c) Determinar la longitud de onda analtica de mayor absorbancia. Medir a 300; 340; 360; 420; 460; 500; 540; 580nm. 2. Curva de Calibracin para un colorante:

El objetivo del presente experimento es poner en evidencia la ley de LambertBeer, mediante la construccin de la curva de calibracin para el anaranjado de metilo y verde malaquita, usando las concentraciones progresivas de este colorante y las absorbancia obtenidas mediante el uso del espectrofotmetro. Se utiliza el mtodo de absorcin visible, que considera longitudes de onda comprendidas entre 380 y 700nm. Procedimiento: a) Establecer el siguiente sistema de tubos de ensayo. Componentes 1 2 3 4 5 6

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Colorante(10g/ml) Agua destilada

0,0 5,0

1,0 4,0

2,0 3,0

3,0 2,0

4,0 1,0

5,0 0,0

b) Medir la absorbancia de cada uno de los tubos de ensayo contiendo la solucin colorante.

Componentes Concentracin del Colorante Absorbancia a .nm 3.

1 0,0

2 1,0

3 2,0

4 3,0

5 4,0

6 5,0

Determinar Concentraciones desconocidas:

El objetivo del presente experimento es determinar la concentracin de una sustancia desconocida mediante el uso de la curva de calibracin y del factor de calibracin. Procedimiento: a) Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la muestra problema. b) Medir la absorbancia de la muestra utilizando la longitud de onda analtica. c) Determinar la concentracin de la muestra problema usando la curva de calibracin o el factor de calibracin. V. RESULTADOS: Describir las observaciones realizadas en cada procedimiento, anotar los cambios respectivos y esquematizar los resultados. Realizar todas las reacciones qumicas, si hubiera. VI. DISCUSIN: VII. CONCLUSIONES: VIII. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Que entiendes por coeficiente de extincin molar. La densidad ptica es igual a la absorbancia. Que entiendes por factor de calibracin. Formula matemtica de factor de calibracin. Explique las desviaciones a la ley de Lambert-Beer Qu es un fotocolormetro.

7. Cul es la longitud de onda para las bases nitrogenadas. 8. Qu longitudes de onda podramos utilizar en la Absorbancia de sustancias no coloreadas como cidos nucleicos, nucletidos, protenas, aminocidos.
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IX. BIBLIOGRAFIA: Q.F Vernica Amanda Apaza Coronel