ELISA. HEPATITIS.

VIH ELABORADO POR PRISCILA ALVA SUREZ La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en la fase slida, como una capa de captura. Despus de la reaccin del antgeno con el suero del paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase especficos Pasos generales de un ELISA 1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo 2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos 3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el posillo. 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antgeno no unido 5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adicin del sustrato 9. Unin del sustrato a la enzima 10. Desarrollo del color Los mtodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimtica se dividen en dos tipos: ELISA COMPETITIVO: En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando color Punto de corte Este trmino se refiere al valor mnimo (cut off) de confianza. El mtodo para determinar este punto de corte no siempre es el mismo. En algunos ensayos se determina promediando los valores de los controles negativos con el menor de los controles positivos, mientras que en otros se escoge un valor prefijado. Normalmente se hace con estndares de concentracin conocida. Generalmente hay un grado de sobreposicion entre valores de sujetos con y sin la enfermedad. El punto de corte es el valor por sobre el cual el resultado se considera positivo o negativo. Este parmetro define sensibilidad y especificidad de un test.

Validacin Para la validacin de pruebas ELISA, se debe incluir obligatoriamente controles internos en todos los anlisis

serolgicos, la cantidad por preparar va a depender de la frecuencia y el mtodo con que cada institucin realiza sus ensayos, esto con el fin de garantizar el volumen suficiente para la validacin de los test. Los controles internos positivos tienen vigencia de un ao y se deben analizar cada vez que se realizan ensayos de la muestra; no se debe descongelar ni utilizar las alcuotas ms de una vez, pues este procedimiento puede ocasionar disminucin de antgenos o anticuerpos presentes en la muestra y como consecuencia alterar el patrn de reactividad del control de calidad interno. El resultado obtenido del control debe expresarse en forma grfica, estableciendo el lmite inferior, medio y superior. Si los puntos del control de calidad, estn dentro de los lmites de variacin aceptables, la reaccin es vlida, (Grfico del control de calidad interno CCI), los puntos deben estar lo ms prximo a la media. El distanciamiento de los puntos en relacin con la media, es indicativo de problemas en los materiales, equipos o fallas en la ejecucin de la prueba. El control de calidad interno (CCI) no puede ser utilizado para definir el punto de corte de la reaccin o para evaluar las variaciones de sensibilidad. Es importante considerar la discrepancia cuando alcuotas de un mismo control interno, presenten resultados reactivos y no reactivos; debe considerarse la posibilidad de que hayan ocurrido fallas en el dispensado de la muestra, los lavados o inestabilidad en el desarrollo del ensayo, estos casos deben ser investigados para tomar las medidas correctivas. La seleccin de las muestras, preparacin, almacenamiento y uso de CCI requiere de procesos especficos. Tomando en cuenta que las muestras para la preparacin del CCI deben presentar un valor de densidad ptica (D.O.) de 1.5 a 4.5 veces al valor del punto de corte del ELISA que se est utilizando, ya que es la zona de reactividad, que permite la deteccin de errores durante la realizacin de las pruebas. Cada laboratorio clnico y banco de sangre que realiza pruebas de ELISA, debe preparar el control de calidad interno (CCI), ya que las condiciones de cada institucin en relacin con la metodologa, equipo y reactivos son diferentes. La preparacin del CCI debe ser designada a un profesional de laboratorio responsable de todo el procedimiento que incluye el anlisis, realizacin de grficas de los resultados que se obtengan en cada ensayo, al igual que de los errores que se detecten, para que sean notificados y se realicen las acciones correctivas. Solucin de lavado concentrado (20X) Control negativo Tampn tris NaCl pH7.4 Conservante Plasma humano negativo en VHA total y IgM, negativo en antgeno HBs, Ac anti VHC y Ac anti VIH Conservante: nitruro de sodio Plasma humano positivo en anticuerpos de IgM anti VHA, negativo en antgeno HBs, Ac anti VHC y Ac anti VIH diluido en base coloreada Conservante: nitruro de sodio Plasma humano positivo en anticuerpos de IgM anti VHA, negativo en antgeno HBs, Ac anti VHC y Ac anti VIH diluido en un combinado de plasma humano negativo en Ac anti VHA Conservante: nitruro de sodio Tampn tris con protenas, colorante indicador del sedimento de la muestra Tampn tris con protenas, lysat viral inactivado de VHA, aadido con colorante indicador del sedimento Tampn tris con protenas y detergante que contiene un conjugado: Ac monoclonales de raton anti VHA sensible a peloxidasa. Colorante indicador del sedimento Solucin de acido ctrico y acetato de sodio pH 4.0 con H2O2 y DMSO Tetrametilbenzidina(TMB) Solucin de acido sulfrico 1N

Calibrador positivo umbral

Control positivo

Diluyente de la muestra Antgeno viral Conjugado

Tampn sustrato Cromgeno Solucin de interrupcin

Hepatitis viral Se define como hepatitis la lesin inflamatoria difusa del hgado producida por variados agentes etiolgicos que clnicamente puede ser asintomtica o cursar con grados variables de insuficiencia heptica. Bioqumicamente presenta en forma constante, elevacin de aminotransferasas. Dentro de las diferentes causas se encuentran agentes infecciosos,

trastornos metablicos, y agentes fsicos. Existen otros virus adems de los hepatotrpicos convencionales, que pueden causar un sndrome de hepatitis aguda como manifestacin clnica inicial; pueden ser de la familia herpes (EBV, CMV, HSV, VZV, y HHV6), el de la rubola,sarampin, Coxsackie, la fiebre amarilla y bola, capaces de presentar formas de hepatitis primaria o secundaria. El EBV es la causa ms comn de hepatitis aguda dentro de esta categora. Existen siete tipos diferentes de virus hepatotrpicos capaces de producir hepatitis; se les designa como A, B, C, D, E, F, G, aunque hay evidencias de la existencia de ms virusque pueden causar inflamacin y necrosis del hgado. Todos los virus hepatotrpicos tienen la capacidad de causar infeccin aguda del hgado pero slo el B, C, y D, ocasionan formas crnicas de la enfermedad. HEPATITIS A Causada por un virus pequeo que mide 25 a 28 nm, que posee una simetra icosadrica, pertenece a la familia de picornaviridae, contiene un genoma tipo RNA sin cubierta; el virin contiene tres polipptidos los cuales forman la cpside (VP1, VP2, VP3) y probablemente existe un cuarto polipptido ms pequeo VP4. El virus puede inactivarse medianteebullicin durante un minuto, en contacto con formaldehdo y cloro o con radiacin ultravioleta. Todas las cepas de este virus identificadas hasta la fecha son indeferenciables inmunolgicamente y pertenecen a unsolo serotipo; al contrario de otros virus de hepatitis, puede replicarse encultivos tisulares, aunque con menor eficacia Serologa El virus de la hepatitis A se elimina en las heces aproximadamente una semana antes del inicio de los sntomas hasta dos semanas despus, el diagnstico se hace detectando en el suero el anticuerpo del tipo IgM contra este virus (anti VHA IgM), positivo en el 99% de los casos al inicio de esta enfermedad, con un pico durante el primer mes y permanece en el suero durante 4 a 6 meses y en ocasiones pueden declinar los valores hasta un ao. Cuando disminuyen los niveles de anti VHA-IGM, progresivamente aumentan los ttulos de anticuerpo IgG, y ste probablemente persista de por vida; una prueba negativa para la determinacin de anticuerpos totales excluye el diagnstico de infeccin por hepatitis A. Cuando existe un segundo episodio de hepatitis A se alteran de nuevo las pruebas inmunoqumicas, el anticuerpo IgM se presenta en ttulos altos y los ttulos de anticuerpos IgG se hacen crecientes despus de la semana 6 de evolucin. Existen varios mtodos para determinar los anticuerpos pero se deben utilizar los ms sensibles o de tercera generacin como el radioinmunoensayo (RIE) o el inmunoensayo enzimtico (ELISA). Las alteraciones histolgicas de la hepatitis aguda por virus hepatotrficos comparten una imagen morfolgica independiente de su agente etiolgico, que incluyen degeneracin hepatocelular con necrosis focal de las clulas hepticas, infiltracin de mononucleares (linfocitos y clulas plasmticas) en espacios porta y parnquima, proliferacin de clulas de Kupffer y regeneracin hepatocelular; las lesiones predominan en el parnquima y afectan todos los lobulillos. Entre estos cambios morfolgicos existen algunos que permiten sugerir hepatitis secundaria a virus A como son la necrosis en la zona I del cino heptico y la colestasis, sin embargo no son exclusivos al virus al que se asocian, y existen otros agentes etiolgicos diferentes al virus, como los medicamentos, que pueden generar una imagen indistinguible a la hepatitis viral aguda. La biopsia heptica no est indicada en los casos tpicos, slo debe utilizarse en casos con deterioro progresivo de la funcin heptica o en el diagnstico diferencial entre hepatitis aguda y lesiones por frmacos, por obstruccin biliar u otras alteraciones, o cuando exista la duda sobre el agente etiolgico.

HEPATITIS B El virus de la hepatitis B pertenece a la familia de los hepadnavirus, llamados as por ser hepatotrficos, estar formados de un genoma de DNA y compartir estructura y estrategia replicativa. Es un virus esfrico de 42 nm, contiene una molcula de DNA circular con 3,200 bases de longitud. El virus tiene dos componentes, uno externo que expresa al antgeno de superficie (HBsAg) y otro interno que contiene al antgeno central (HBcAg). En la porcin central se encuentra el DNA de doble cadena (HBVDNA) y la replicasa o polimerasa viral(DNAP o DNA polimerasa). El HBV-DNA tiene una cadena larga y otra corta. En la cadena larga se encuentra toda la informacin genmica del virus, la secuencia de genes que codifican las protenas virales tienen codones de inicio de mensajes y no tienen codones de finalizacin. Estas consecuencias codifican tanto protenas estructurales (pre-S, superficie, core) como protenas de replicacin (polimerasa y la protena X). El antgeno e (Hbe Ag) consiste en una protena de aproximadamente 15,000 daltones asociada al HBcAg y sintetizada por informacin nucleotdica (nucletidos 1814- 1901) contenida en la regin pre-core (pre-C), que se encuentra al inicio de la regin C. En ms del 95% de los casos, la mutacin pre-C involucra a una base nitrogenada (G-A en el nuclotido 1896 que cambia un codn de triptfano por un codn de alto). Serologa En la hepatitis aguda B aparecen en la sangre AgsHB, AgeHB y DNA HBV que se incrementan durante varias semanas hasta alcanzar cifras muy altas, aunque no haya manifestaciones de enfermedad; poco antes de que se manifiesten los sntomas, los niveles de DNA del HBV, el Age HB y el AgsHB comienzan a descender. En los casos de resolucin el AgeHB desaparece en el curso de seis semanas o antes, el DNA lo hace antes. El AgsHB puede persistir hasta por seis meses, pero en casos en resolucin su concentracin disminuye en las primeras cuatro semanas. El abcHB total y el de IgM se elevan al comienzo de los sntomas clnicos y alcanzan sus valores mximos durante la fase tarda en que aparece AceHB y por ltimo AcsHB. HEPATITIS C El genoma del HCV se compone de una regin no codificable adyacente a los genes que codifican las protenas estructurales (core de la nucleocpside y envoltura viral). Los genes 5no codificante y del core se conservan en todos los genotipos tienen un papel importante en la replicacin, pero la sntesis de las protenas de la envoltura es codificada por la regin hipervariable, que vara entre los diferentes especmenes e incluso en el mismo virus. Esto permite al virus evadirse de los mecanismos inmunitarios del husped dirigidos contra las protenas de envoltura viral. El extremo 3del genoma contiene los genes de las protenas no estructurales (NS) 1 a 5. Diagnstico Aunque el virus de la hepatitis C an no se ha visualizado, su existencia se sospech desde los aos 70. En 1989 se estableci la prueba para determinar el anticuerpo a HCV (anti HCV), pero las primeras pruebas carecan de sensibilidad y especificidad. Las pruebas de segunda generacin (ELISA II y RIBA II) tienen excelente sensibilidad y especificidad. La diferencia bsica entre las pruebas de primera y segunda generacin es el nmero de antgenos virales utilizados. Un inmunoensayo de tercera generacin est en venta en ciertos pases, la prueba incluye todos los antgenos virales de la prueba de segunda generacin, y un nuevo antgeno de la regin NS5 y se ha observado que tiene mayor sensibilidad que el inmunoensayo de segunda generacin. El RIBA II incluye los dos antgenos originales C33-cy y c22-3. Los antgenos virales son inmovilizados en un medio de nitrocelulosa; la positividad se manifiesta con dos o ms bandas oscuras, si slo una banda aparece, la prueba se

denomina incierta, la intensidad de las bandas es de 1 (+) a 4 (+). La posibilidad de detectar el RNA del virus ha permitido entender mejor la patogenia de esta enfermedad viral. La hepatitis C comprende un grupo de varias cepas virales, que pertenecen a un grupo mayor, el cual se subdivide en subtipos. Los genotipos del HCV tienen importancia clnica, se sabe que el subtipo Ib es resistente al tratamiento con antivirales. El diagnstico de hepatitis crnica C se hace mediante la prueba de ELISA de segunda generacin. Esta prueba es la que ms se utiliza en la actualidad y detecta la presencia de anticuerpo a las cuatro semanas despus de la inoculacin, con una sensibilidad y una especificidad de 82%. La prueba de RIBA tiene una sensibilidad y especificidad mayor del 95%. El RNA del virus de la hepatitis C puede ser detectado en el suero una o dos semanas despus de la transfusin, se encuentra en forma transitoria en la hepatitis aguda y de manera indefinida durante la hepatitis crnica. Esta prueba permite diagnosticar con mayor certeza la transmisin vertical del HCV, as como la respuesta al tratamiento antiviral. Se ha informado la visualizacin de partculas virales en tejidos de pacientes con hepatitis no A no B, la presencia de partculas del antgeno viral en el citoplasma es un hallazgo muy temprano de la enfermedad, pero an requiere verificacin. El diagnstico de hepatitis crnica se establece mediante biopsia heptica, la cual establece los grados de actividad por el puntaje de la clasificacin histolgica de Knodell, as como el grado de fibrosis. Los hallazgos histopatolgicos encontrados en la hepatitis crnica C son esteatosis, ndulos linfoides, y colangitis crnica. HEPATITIS DELTA El virus de la hepatitis D es un virus defectuoso, de tipo RNA que solamente se replica en hospederos que simultneamente estn infectados por virus de la hepatitis B, el virn es una partcula esfrica de 36 nm compuesta por una capa de lipoprotena. Dentro de la cubierta est la estructura de la nucleocpside de forma esfrica, tiene 18 nm de dimetro, el genoma del VHD es una molcula de RNA de 1.7 Kb, la un cleocpside contiene el antgeno D (AgD) que se puede liberar con tratamientos detergentes. El AgD est compuesto por dos especies de protenas, una de 24 y otra de 27 Kda, idnticas excepto porque la grande contiene una extensin de 19 aminocidos en la terminal de carboxilo; tienen funciones diferentes: el antgeno D pequeo activa la replicacin del RNAVHD mientras que el grande la inhibe, pero participa en el ensamblaje de partculas del VHD. Se ha demostrado que las partculas de VHD en el suero de pacientes contienen ambas formas de AgD: en el hgado durante 4 semanas aproximadamente, y en el suero por un periodo ms corto, lo que se correlaciona con la gravedad del dao heptico; en la hepatitis aguda no complicada el VHD se expresa en el hgado por un periodo ms corto (1 a 2 semanas). En la sobreinfeccin por VHD, el AgD se presenta en el suero en la etapa preclnica o muy temprano, cuando aparecen los sntomas, por lo que puede pasar inadvertido; en la hepatitis crnica la expresin del antgeno D en el tejido heptico, persiste durante varios meses. Diagnstico El diagnstico debe establecerse con marcadores serolgicos que muestran IgM-antiHD. El IgG anti HD no es un anticuerpo protector y persiste en la infeccin crnica. Demostrar RNA viral intraheptico mediante la prueba de PCR.

HEPATITIS E La hepatitis E es un padecimiento similar a la hepatitis A. Se sabe que el virus de la hepatitis E pertenece a la familia de los Picornavirus, aunque tambin se ha considerado clasificarlo dentro de una nueva familia: Herpesvirus. El virus de la hepatitis E es extremadamente lbil, no tolera altas concentraciones de sal, su tamao es de 32 a 34 nm de dimetro, se visualiza nicamente con microscopio inmunoelectrnico, su forma esfrica, con picos visibles, en la superficie del mismo, aunque se han encontrado partculas de virus de tamao ms pequeo, 27 a 32 nm, que se asocian a algunos casos de esta enfermedad. Tiene coeficiente de sedimentacin de 185 S, densidad boyante de 1.29 g/mL con un genoma nico de RNA poliadenizado de 7.5 Kb. HEPATITIS F En pases desarrollados, aproximadamente del 4 al 5% de las hepatitis adquiridas no tienen etiologa viral especfica y se presupone la existencia de otros agentes productores. En la literatura mdica se utilizan diversos nombres para sealar a estos virus: hepatitis F, hepatitis no A-E o el de hepatitis no A, no B, no C, no D, no E. El cuadro clnico es indistinguible de otras hepatitis conocidas y por el momento no hay un patrn epidemiolgico o grupo de alto riesgo identificado. La frecuencia de hepatitis postransfusional por virus X sugieren que la elevacin de aminotransferasas, inespecfica, es difcilmente atribuible a algn agente viral. Muchos casos de hepatitis fulminante o de anemia aplsica asociada a hepatitis aguda no tienen etiologa precisa y no corresponden a formas virales conocidas. Aproximadamente 15% de las hepatitis crnicas han sido catalogadas como criptognicas y por ende ser candidatas a ser producidas por virus, suelen seguir un curso clnico similar a las formas crnicas virales habituales, terminando en cirrosis heptica y siendo candidatas a transplante heptico. HEPATITIS G Se trata de un RNA virus (HGV) de polaridad positiva, cuya secuencia de nucletidos ha sido completamente determinada. Los virus ms relacionados son los flavivirus, el virus C y los recientemente descritos GBVA, GBVB, el virus HGV se ha descrito como un nuevo virus de la familia flaviviridae. Su prevalencia es de 1 a 2% en poblacin sana de donadores voluntarios de sangre, este agente debe ser considerado en el diagnstico diferencial de hepatopatas crnicas y agudas de etiologa desconocida, ya que en un estudio reciente se encontr un 90% de HGV RNA en una poblacin de pacientes con hepatopata criptognica. La infeccin se encuentra en proceso de caracterizacin, en Mxico no hay reportes de frecuencia o incidencia de la infeccin por este virus. Frecuentemente se asocia a hepatitis C y en menor frecuencia a hepatitis B: se detecta en laboratorios de investigacin con anticuerpos anti-HGV o con HGV-RNA. La hepatitis por virus G tiene escasa repercusin clnica, se encuentra en fase de caracterizacin, no se ha determinado con precisin si existe una fase crnica, no hay recomendacin teraputica en la actualidad. Referencias bibliogrficas Hepatitis D Virus. Disponible en: http://www.stanford.edu/group/virus/delta/2005/. Consultado el 18 de octubre de 2012 Hepatitis virales. Disponible en: http://www.hepatitisviral.com.ar/pdf/manual.pdf. Consultado el 17 de octubre de 2012 Manual para el control de calidad de las pruebas de VIH. Disponible en: http://asp.mspas.gob.sv/regulacion/pdf/manual/Manual_calidad_pruebas_VIH.pdf. Consultado el 18 de octubre de 2012. Punto de corte. Disponible en: http://escuela.med.puc.cl/paginas/cursos/tercero/saludpublica/Apuntes2001/Test/sld023.htm. Consultado el 18 de septiembre de 2012. Jos, Varguez, FA, Halabe Cherem J. Hepatitis viral. Rev Fac Med UNAM Vol.43 No.3 Mayo-Junio, 2000. Pp. 90-100