Tehnoloko-metalurki fakultet Master studije Seminarski rad iz nanotehnologije

Dijagnoza i terapija kancera primenom nanoestica zlata

Sanja elija 3066/2010 Ivana Gluhovi 3023/2010 Zorka uri 3012/2010

UVOD
Nanoestice koje poseduju jedinstvena

optika svojstva i odgovarajuu veliinu predmet su interesovanja u oblasti molekularne biologije i medicine Plemeniti metali, posebno nanoestice zlata, imaju ogromni potencijal u dijagnozi i terapiji kancera Au nanoestice konjugovane ligandima, ciljanom dostavom do biomarkera na elijama raka, omoguavaju specifino, molekularno snimanje i detekciju raka Au nanoestice efikasno prevode potpuno apsorbovanu svetlost u lokalnu toplotu koja moe biti iskoriena za selektivnu lasersku fototermalnu terapiju kancera

 Menjanjem oblika ili sastava Au nanoestica, SPR se moe javiti u bliskoj

infracrvenoj oblasti, omoguavajui in vivo snimanje i fototermalnu terapiju raka Materijali nanometarskih dimenzija ispoljavaju jedinstvena optika, elektronska i magnetna svojstva, to nanostrukture ini atraktivnim za irok spektar primene Nanoestice inkorporirane u bioloke sisteme, predstavljaju idealne obeleivae (markere) Povrina nanoestica, koja je podlona hemijskim modifikacijama, prua mogunost oblaganja, funkcionalizacije (dodavanje funkcionalnih grupa na povrinu materijala) i olakane integracije nanoestica

Nanoestice plemenitih metala i povrinska plazmon rezonancija (SPR)

iroka primena nanoestica plemenitih metala potie od njihovih

zanimljivih optikih svojstava koja su ispitivana spektroskopskim i fotonskim tehnikama Dok je Faradej prvi pripisao svetle boje koloidima Au, Mie je 1908. godine objasnio poreklo ove pojave reavajui Maksvelovu elektromagnetnu jednainu za interakciju svetla sa sferinim cesticama. Mie- ova teorija za homogene sferine estice
3 24 2 R 3 m/ 2 " Cext ( ' 2 m ) 2 "2

 Ekstinkcioni maksimum se javlja na

talasnoj duini '= -m' navedeni izraz predstavlja uslov pobuivanja povrinskog plazmona Kada je uslov ispunjen, svetlosno polje indukuje rezonantnu dipolarnu oscilaciju slobodnih elektrona nanoestica Za nanoestice Ag, Au i Cu, uslov rezonancije je zadovoljen na talasnoj duini vidljive svetlosti Za sferine estice, iji je prenik mnogo manji od talasne duine svetlosti (d<<), elektromagnetno polje odreene frekvencije indukuje koherentnu rezonantnu oscilaciju slobodnih elektrona metala

Frekvencija i intenzitet SPR apsorpcije i rasejanja, zavise od sastava metala, veliine i oblika nanoestica, dielektrinih osobina okruujueg medijuma/supstrata

 Povrinska plazmon oscilacija elektrona metala rezultuje velikim

poveanjem apsorpcije i rasejanja elektromagnetnog zraenja Najee koriene nanoestice su od zlata ili srebra, zbog mnogo vee stabilnosti ovih metala u odnosu na nanoestice izraene od bakra

Transmisioni elektronski mikrografi (a) Au nanosfera, (b) Au nanotapoa (c) Ag nanoprizmi

Fotografije koloidnih rastvora (d) AuAg legure pri poveanju koncentracije Au, (e) Au nanotapia, (d) Ag nonoprizmi pri poveanju bonih strana

Prednosti Au nanoestica kao kontrasnih agenasa u biomedicini

Savremene dijagnostike tehnike koje se

primenjuju u molekularnoj biologiji i biomedicini, oslanjaju se na hemijske kontrasne agense Njihova funkcija ogleda se u bojenju/oznaavanju specifine elije i tkiva, a sve u cilju unapreenja slabih optikih signala koji potiu od endogenih hromfora i daju jedva primetnu spektralnu razliku izmeu normalnih i obolelih elija i tkiva Au nanoestice nisu podlone fotoizbeljivanju, biokomaptibilne su i necitotoksine

Primenom Au nanoestica olakana je biokonjugacija i biomodifikacija Povrina Au nanoestica ima jak afinitet vezivanja prema tiolima, disulfidima i aminima

Funkcionalizacija Au nanoestica sa antitelima, biomolekulima kao to je folna kiselina, ak i sa virusima, omoguava selektivno ciljanje elija raka
Modifikacija povrine sa tiolovanim poli(etilen)glikolom, usporava nanoestice i ini ih neporepoznatljivim za intravaskularni imuni sistem, poveavajui veme njihovog zadravanja u krvotoku

Podeavanje optikih osobina

Intenzitet apsorpcije i rasejanja nanoestica zlata je zbog fenomena SPR jai u odnosu na apsorpciju i fluorescenciju konvecionalno korienih boja u biologiji i biomedicinskim

snimanjima. Mie- ova teorija omoguava lako proraunavanje i karakterizaciju optikih svojstava metalnih nanoestica. Na primer, Mie- ova teorija predvia da su intenziteti apsorpcije Au nanosfera, 4 do 5 amplitudnih redova vii od optikih preseka konvencionalnih boja. To jest, Au nanosfere sa prenikom od 40 nm, molarnim koeficijentom apsorpcije od 7,7*109 M-1cm-1 na talasnoj duini od oko 530 nm, imaju za etiri reda amplitude vei ekstincioni koeficijent, nego to je za rodamin 6G (=1,2*105M-1 cm-1 na 530 nm) i malahit zeleno. Osim toga, Mie- ovi prorauni rasejanja pokazuju da je amplituda vidljive svetlosti rasejene plazmon-rezonancijom Au nanoestica, prenika 80 nm (CSCA~ 1, 2*10-14m2 na 560 nm), na istoj talasnoj duini, slina rasejanju mnogo veih nanosfera nainjenih od polistirena prenika 300nm (CSCA~ 1, 8*10-14 m2).

 Efikasnost nanoestica kao kontrasnih agenasa, zavisi od njihovih optikih svojstava. Nasuprot konvencionalnim bojama, osobine optike apsorpcije i rasejanja Au

nanoestica mogu se podeavati menjanjem njihove veliine i oblika.

Intenzitet apsorpcije i rasejanja se moe poveavati modifikacijom veliine i oblika nanoestica. Druga, interesantna osobina SPR spektra Au nanoestica je njihova osetljivost na lokalni indeks refrakcije/dielektrine konstante okoline nanoestica. Plazmon rezonancija nanosfera se pomera ka veim talasnim duinama sa poveanjem indeksa refrakcije medijuma.

Slika 3. Mie-ova teorija apsorpcije (crvena isprekidana kriva), rasejanja (plava takasta kriva) i ekstinkcije (zelena puna kriva) Au nanosfera prenika (a) 20 nm, (b) 40 nm, i (c) 80 nm. (d) UV-vis spektri ekstinkcije koloidnih rastvora Au N razliitih prenika u opsegu 9-99 nm

Snimanje elija raka korienjem biokonjugovanih Au nanoestica

Dijagnoza raka, to jest detekcija primenom aktuelnih optikih tehnologija snimanja kao to je optika koherentna tomografija (OCT) (nekontaktna metoda laserskog slojevnog snimanja mrenice i vidnog ivca), zasnovana je na snimanju mikroanatomskih karakteristika obolelih tkiva. Ova metoda poseduje ogranienu sposobnost da snima molekularne promene udruene sa karcinogenezom (izazivanje i stvaranje tumora). Znaajna prednost, a posebno sa stanovita rane detekcije i terapeutskog napretka, postignuta je primenom biomarkera za otkrivanje raka i optikim kontrastnim agensima. Na ovaj nain obezbeen je jak izvor specifinog molekularnog signala kanceroznog tkiva, na osnovu kog se mogu dobiti informacije i o molekulskim i o atomskim karakteristikama bolesti.

 Zbog intenzivnog poveanja povrinskog plazmona rasejanja, nanoestice zlata se mogu koristiti kao optike sonde i kao markeri. Jedna od tehnika za karakteristino molekularno obeleavanje elija raka je imunociljanje

nanoestica na antigene ija je ekspresija zapaena na elijama raka.

Sokolov i drugi su koristili imunociljanje Au nanoestica za snimanje epitelnih elija raka grlia materice (SiHa elije), poznate da ekspresiraju transmembranski glikoproteinreceptor epidermalnog faktora rasta (EFGR), ija ekspresija nije primeena kog zdravih

elija.

Koloidne nanoestice, prenika 12 nm su bile konjugovane sa anti- EGFR monoklonskim antitelima. Konjugacija je izvrena nekovalentnom elektrostatikom adsorpcijom antitela na negativno naelektrisanu povrinu Au nanoestica, prethodno obloenu citratom. Povrinska adsorpcija anti- EGFR molekula antitela rezultuje pomerajem pika za 6nm u

crvenom delu apsorpcionog UV-vis spektra Au koloida, potvrujuci na taj nain vezivanje antitela.

 Suzpenije elija su bile obeleene konjugatima Au nanoestice-antitela, jednostavnom inkubacijom. Korienjem skenirajueg konfokalnog mikroskopa koji pobuuje povrinski plazmon nanoestica laserskim zrakom talasne duine 647 nm, dobijamo prikaz SPR rasejanja obeleenih nanoestica sa desne strane tamne povrine (slika 4). Rasejanje sa povrine neobeleenih SiHa elija je bilo 50 puta manje i one nisu mogle biti identifikovane na tamnoj pozadini.

Slika 4. Slike SiHa elija obeleenih konjugatima anti-EGFR/Au

 Laserska skenirajua mikroskopija kancerogenih elija grlia materice, obeleene konjugovanim anti EFGR/nanoesticama, jasno pokazuje rasejanje nanoestica iz citoplazmaticne membrane elije, dok normalne eliije ne pokazuju obeleavanje pod slinim uslovima snimanja (slika 5).

Slika 5. Snimci dobijeni laserskom skenirajuom mikroskopijom: (a) prekancerogene elije; (b) normalne elije grlia materice obeleene sa biokonjugatima anti-EFGR/Au nanoestice

 Istraivai su takoe pokazali da je SPR rasejanje sa povrine Au nanoestica dovoljno jako da omogui korienje crvenog laserskog izvora ekscitacije za snimanje obeleenih

elija raka. Tako je potencijal primene Au biokonjugata za dijagnozu raka veoma povean. Iako je SPR rasejanje intenzivno, kao to pokazuju Sokolov i drugi, takoe je i auto-selektivno, i stoga se moe indukovati u irokoj oblasti spektra.
Jaka SPR apsorpcija biokonjugata Au nanoestica prua mogunost primene

mikroapsorpcione spektroskopije- nove metode raspoznavanja i kvantifikovanja specifino obeleenih molekularnih nanoestica.
Mikroapsorpcioni spektar obeleenih HOC i HSC elija pokazuje SPR apsorpcioni maksimum anti-EFGR/Au nanoetica izdvojenih iz rastvora, na oko 545 nm (slika 6),

koji je pomeren je za 9nm prema kraju crvene oblasti vidljivog dela spektra.
nekancerogena elija HOC elija HSC elija

Slika 6. Mikroapsorpciona spektrometrija kao tehnika za dijagnozu kancera- merena za 25 razliitih elija

nekancerogena elija

HOC elija

HSC elija

Slika 6. Mikroapsorpciona spektrometrija kao tehnika za dijagnozu kancera- merena za 25 razliitih elija

Na slici se vidi jasniji SPR apsorpsioni pik za kancerogene elije u odnosu na nekancerogene Intenzitet apsorpcije je u direktnoj zavisnosti sa brojem vezanih nanoestica i moe se koristiti u kvantifikovanju obeleenih oblika biomarkera. Intenzitet apsorpcije pokazuje izvesne razlike za dva tipa elije raka (HOC i HSC), ukazujui na razliitost u broju vezanih antitelo/antigen kompleksa. Ovi rezultati su u dobrom meusobnom odnosu sa relativnim brojem receptora prisutnih na povrini elija tri elijske linije. Na ovaj nain je uspeno iskorieno SPR rasejanje i SPR apsorpcija anti-EFGR/Au nanoestica da bi se razlikovale kancerogene elije od zdravih elija, na osnovu

ekspresije povrinskog EFGR.

Selektivna fototermalna terapija raka upotrebom biokonjugovanih Au nanoestica

SPR apsorpcija Au nanoestica je praena brzom konverzijom (1ps) apsorbovane svetlosti u energiju. Sposobnost Au nanoestica da uspeno konvertuje apsorbovanu svetlost u lokalnu energiju moe biti iskoriena za selektivnu fototermalnu terapiju kancera kao i saniranje bakterijske infekcije. Selektivno ciljanje nanoestica do biomarkera na elijama smanjuje koliinu laserske svetlosti potrebnu za ubijanje bolesnih elija bez oteenja zdravih elija.
Intenzitet apsorpcije Au nanoestica (Cabs~ 2,9*10-15m2 za sfere sa prenikom od 40 nm sa apsorpcionim pikom na oko 530 nm) je 5 amplitudnih redova vei nego za indocijanin zeleno boju (Cabs~ 1,7*10-20m2 sa apsorpcionim pikom na oko 800 nm) koja je ranije koriena za potrebe ispitivanja laserske fototermalne terapije tumora.

Shodno tome, Au nanoestice pruaju mogunost efektivne fototermalne terapije sa mnogo niim sadrajem energije zraenja.

 El Sayed i saradnici su nedavno pokazali efikasnost Au nanosfera kao fototermalnih agenasa primenjujui imunociljanje na ivim elijama, in vitro. Kao to je spomenuto ranije, dve elijske linije karcinoma jednjaka, HOC i HSC, kod

kojih dolazi do ekspresije EFGR proteina mogu biti efikasno obeleene upotrebom Au nanoestica, prenika 40 nm. Najpre se mora izvriti konjugovanje Au nanoestica sa anti-EFGR antitelima. Snimci dobijeni primenom mikroskopije u tamnom polju, a na osnovu SPR rasejanja iz nanoestica, pruaju vizuelni prikaz povrine obeleenih elija raka.

 Za fototermalnu terapiju je korien argon-jon laser koji je izazvao pobuivanje povrinskog plazmona. Talasna duina koriene svetlosti, podeena na 530 nm, obezbeuje maksimum apsorpcije nanoestica. Da bi testirali sposobnost rasta elija nakon fototermalnog zraenja, elije su bojene tripan plavom bojom koja se selektivno akumulira u mrtve elije, bojei ih u plavo, dok ive elije ostaju nepromenjene na snimcima nainjenim mikroskopom (slika 7).

Kancerogene elije, HOC i HSC, trpe fototermalno oteenje u roku od 4 minuta pri odreenom sadraju energije lasera (19 W/cm2 i 25 W/cm2) koji je za upola manji nego energetski sadraj koji podnose zdrave HaCaT elije (57 W/cm2). Dakle, efikasnost specifinog ciljanja biokonjugata Au nanoestica na elije raka, u kombinaciji sa velikim intenzitetom apsorpcije nanoestica, upotrebom laserske energije na kojoj benigne elije ostaju neoteene omoguava selektivnu fototermalnu terapiju kancera.

Slika 7.Selektivno fototermalno oteenje elija kancera primenom anti-EGFR/Au biokojugata nanoestica njihovim izlaganjem CW laserskom zraenju na apsorpcionoj SPR frekvenciji nanoestica u tajanju od 4 min.

Blisko infracrveno snimanje i terapija

Uspeh terapije/snimanja kancera, korienjem vidljive svetlosti koju apsorbuju nanoestice, moe se ostvariti i primenom na kou i na povrinski tip tumora.
Meutim, in vitro upotreba snimanja i fototermalne terapije za dublja tkiva zahteva primenu svetlosti u bliskoj infracrvenoj (NIR) oblasti gde je najizraenija propustljivost tkiva. Primenom svetlosti talasne duine 650-900 nm moe biti ostvarena penetracija i do nekoliko centimetara. Plazmon rezonancija nanoestica za primenu in vitro mora biti u NIR oblasti. Menjanje oblika Au nanoestica kao i sastava nudi dramatine varijacije karateristika SPR apsorpcije i rasejanja.

Zanimljive nanostrukture, kao to su:

silikatne nanoestice sa Au omotaem, Au nanotapii, Au uplje porozne nanoestice i agregatne Au nanoestice

pokazuju optiku kompatibilnost u NIR oblasti koja pogoduje upotrebi in vitro.

Alternativni metod: postizanje kontrolisane samoagregacije Au

nanoestica na elijskoj membrani Rezultat pomeranje apsorpcione trake u NIR oblasti.

Podeavanje povrinski plazmon rezonancije u NIR oblasti na primeru silikatnih nanoestica sa omotaem od zlata

Halas i saradnici su postigli eljenu optiku kompatibilnost, korienjem

kompozitnih estica sa silikatnim jezgrom i tankim Au omotaem. Variranjem relativne debljine jezgra i omotaa Au nanoomotaa, SPR se moe oekivati du iroke oblasti talasnih duina, koje se pruaju od vidljive do NIR oblasti. Prema tome, ove nanoestice prilikom sinteze, mogu biti dizajnirane tako da imaju jako SPR rasejanje i/ili apsorpciju u NIR oblasti olakavajui in vitro, optiko snimanje i terapiju.

Hirsch i saradnici pokazali: izlaganje humane elije karcinoma dojke inkubirane sa silikatnim nanoesticama sa Au omotaem (prenik SiO2 jezgra 55 nm, debljina Au omotaa 10 nm) NIR laserskoj svetlosti (820 nm, 4 W/cm2, 7 min), dovodi do pobuivanja povrinskog plazmona na talasnoj duini od 800nm, pri emu ove elije trpe fototermalno oteenje.
In vivo terapija: sprovedena direktnim ubrizgavanjem silikatnih nanoestica sa Au omotaem koje su prethodno obloene tiolovanim PEG-om u tumorne elije mia. Povrinski sloj PEG-a vea stabilnost u poreenju sa aglomeracijom nanoestica u fiziolokim uslovima. Male doze laserske NIR svetlosti indukuju razvijanje visokih temperatura u oblastima tumora (T=37,4 + 6,6 C to je pokazano snimanjem upotrebom magnetne rezonance), koje dovode do ireverzibilnog oteenje tkiva. Analiza tkiva koja su bila izloena NIR svetlosti bez ubrizgavanja nanoestica pokazuje mnogo manje poveanje temperature (T< 10C) koja ne izaziva njihovo oteenje

oOzraene elije bez nanoomotaa (a i c) pokazuju dobru

sposobnost rasta i integritet membrane oOzraene elije sa nanoomotaem (b i d) poseduju jasno definisane zone mrtvih elija

Otputanje Au nanoestica do mesta tumora

Predloeni mehanizmi u zavisnosti od naina aplikacije:
povrinska aplikacija (u sluaju epitelijalnih tumora), direkno ubrizgavanje u tumorno tkivo korienjem igle (za fiziki pristupane

tumore), intravaskularno ubrizgavanje i intraoperativna aplikacija (u zaostale tumore ili sumnjive oblasti).

Intravaskularno ubrizgavanje atraktivno jer su na ovaj nain terapijom obuhvaene sve elije tumora u telu. Savremena tehnologija prua mogunost upotrebe Au nanoestica obloenih PEG-om kao nosaa antikancerogenih hemoterapeutika. Oblaganje nanoestica PEG-om obezbeuje: njihovu biokompatibilnost svodi aglomeraciju nanoestica na minimum ini ih neprepoznatljivim za imuni sistem usporene PEG nanoestice, ubrizgane intravenski, poseduju vee retenciono vreme u krvi i preferencijalno se akumuliraju unutar mnogih telesnih tumora.

Zakljuak i primena u budunosti

Visok intenzitet rasejanja i apsorpcije Au nanoestica ini ih novom i krajnje

efikasnom vrstom kontrastnih agenasa koji nalaze primenu u dijagnostici i fototermalnoj terapiji raka. Specifino molekularno snimanje i terapija kancera zasniva se na sintezi nanoestica konjugovanih sa odgovarajuim antitelima i njihovoj ciljanoj dostavi do receptora na elijama raka iju ekspresiju izazivaju.
Potreban optimalan broj faktora za uspenost istraivanja: intenzitet apsorpcije i rasejanja nanoestica vezivanje nanoestica za odgovarajua antitela i vezivanje biokonjugovanih nanoestica za tano odreene elije.

Aspekti koji utiu na fizioloke uslove: protok krvi, permeabilnost, mogunost izlivanja tumora, fizioloke reakcije, stabilnost nanoestica Postoji potreba za prouavanjem zavisnosti navedenih faktora u funkciji: veliine nanocestica, hemijskih interakcija izmeu povrsina i naina isporuke.

Najefikasniji metod za isporuku NIR svetlosti do obolele elije razliitih vrsta karcinoma se jo uvek istrauje.
Mehanizmi koji dovode do oteenja tumornih elija usled fototermalne terapije nisu dobro razumljivi i zahtevaju dodatna objanjenja.