DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS

1.- INTRODUCCION En el campo de la micologa industrial, se estudia tanto la accin nociva de los hongos microscpicos, que pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en le campo de la biotecnologa. Se trata de organismos fngicos que muestras diferencias considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonmicos muy diversos y, si bien se pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio. Comnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscopios, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepcin, es inseguro establecer el limite entre los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporgenas y reproductoras de micelio de las levaduras. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de clulas independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargados casi cilndricas. En algunos casos, forman cadenas de clulas alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un micelio, por lo que se denominan seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y segn se ha comentado ya, no existe un lmite de separacin definido entre levaduras y otros hongos que forman un micelio tpico. Las levaduras, cuando crecen sobre medios slidos forman colonias de aspectos caractersticos que recuerdan a las colonias bacterianas en casi todas las especies de inters industrial, el modo habitual de reproduccin vegetativa es por gemacin. Muchas de ellas presentan reproduccin sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse solamente por sus caracteres morfolgicos; se precisa la ayuda de pruebas bioqumicas para la identificacin especfica. 2.- OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GENERAL Determinar e identificar, mohos y levaduras en una muestra slida de harina de trigo. Mediante un anlisis microbiolgico. 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Aplicar todos los conocimientos anteriormente aprendidos para la determinacin de los parmetros en estudio. Determinar todos los requerimientos bsicos necesarios para las determinaciones de los parmetros en estudio. Conocer el medio y el modo de trabajo adecuado, para la determinacin de mohos y levaduras en la muestra harina de trigo. Conocer el medio de cultivo PDA para mohos y levaduras, tambin las condiciones de temperatura y tiempo de incubacion. Diferenciar y reconocer lo que es un moho y una levadura, observar sus caractersticas fsicas. Realizar el recuento de colonias en el medio, PDA.

3.- FUNDAMENTO TEORICO Mohos y Levaduras En el campo de la micologa industrial, se estudia tanto la accin nociva de los hongos microscpicos, que pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en le campo de la biotecnologa. Se trata de organismos fngicos que muestras diferencias considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonmicos muy diversos y, si bien se pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio. Comnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscopios, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepcin, es inseguro establecer el limite entre los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporgenas y reproductoras de micelio de las levaduras. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de clulas independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargados casi cilndricas. En algunos casos, forman cadenas de clulas alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un micelio, por lo que se denominan seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y segn se ha comentado ya, no existe un lmite de separacin definido entre levaduras y otros hongos que forman un micelio tpico. Las levaduras, cuando crecen sobre medios slidos forman colonias de aspectos caractersticos que recuerdan a las colonias bacterianas en casi todas las especies de inters industrial, el modo habitual de reproduccin vegetativa es por gemacin. Muchas de ellas presentan reproduccin

sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse solamente por sus caracteres morfolgicos; se precisa la ayuda de pruebas bioqumicas para la identificacin especfica. Las levaduras y los mohos crecen ms lentamente que las bacterias en los alimentos no cidos que conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos. Sin embargo, en los alimentos cidos y en los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que las bacterias, determinando por ello importantes prdidas por la alteracin de frutas frescas y jugos, vegetales, quesos, productos cerealcolas, alimentos salazonados y encurtidos, as como en los alimentos congelados y en los deshidratados, cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas. Adems, existe el peliro potencial de produccin de micotoxinas por parte de los mohos. Ni el hombre ni los animales deben consumir alimentos visiblemente enmohecidos, excepto, por supuesto, los quesos tales como Roquefort Camembert y ciertos salamis que deben sus sabores especiales a algunos mohos. Las levaduras crecen ms rpidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. Mientras que los mohos son casi siempre aerobios estrictos, las levaduras generalmente crecen tanto en presencia como en ausencia de oxgeno, aunque con mayor rapidez y hasta poblaciones ms elevadas en presencia de este gas. La fermentacin es completamente un proceso anaerbico. Las bebidas fermentadas estn fuera del marco de esta publicacin. En los alimentos frescos y en los congelados, pueden encontrarse nmeros reducidos de esporas y clulas vegetativas de levaduras, pero su presencia en estos alimentos es de escaso significado. Solo cuando el alimento contiene cifras elevadas de levaduras o mohos visibles, el consumidor se dar cuenta de la alteracin. La alteracin por levaduras no constituye un peligro para la salud. Factores de crecimiento de los mohos: Nutrimentos: Los mohos, por sus paredes celulares quitinosas duras, obtienen nutrimentos solo por difusin o por transporte de sustancias solubles y en consecuencia, su nutricin se limita a alimentos bastantes sencillos. Muchos mohos obtienen carbono y energa de los carbohidratos; especialmente de la glucosa, pero algunos utilizan alcoholes o cidos orgnicos. Pueden obtener tambin el carbono de las protenas, y si falta alguna fuente de fcil obtencin, lo obtienen de productos de la digestin de las protenas. Algunas especies utilizan exclusivamente grasas. Humedad y presin osmtica: El medio hmedo facilita el crecimiento de los mohos, pero dichos organismos no necesitan el mismo grado de humedad que bacterias y levaduras, que requieren un medio prcticamente hdrico. El crecimiento en materiales secos; pulpas secas, granos, tejidos, cuero curtidos y muebles ocurre solamente en una atmsfera hmeda. Al aublo o moho aparece en libros o zapatos; por ejemplo: durante periodos duraderos, hmedos y calurosos en climas en que hay poco sol.

Temperatura: Algunas especies de hongos crecen a temperaturas menores de 42 C o mayores de 42 C. Oxgeno: Prcticamente todos los mohos son aerobios y necesitan bastante oxgeno. Solamente algunas especies; la que se emplea en la manufactura del queso Roquefort, crecen satisfactoriamente en medios con menor tensin de oxgeno. Incluso en este caso, no obstante, se facilita el crecimiento al picar el queso con alambres para obtener agujeros por el cuajo en maduracin. Cultivo de los Mohos: Para estudiar los mohos se usan los mismos mtodos generales de cultivo que para las bacterias. Casi todos, se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medios de cultivos bacteriolgicos usuales, a temperaturas que varan entre 20 y 30 C. La mayor parte lo hacen ms lentamente que las bacterias, y as, cuando llegan a coexistir, el desarrollo de estas sobrepasa con creces el de los mohos. Si se quiere aislar los mohos, resulta muy prctico usar un medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero que no sea ptimo para las bacterias. Medios cidos (PH = 5,6) con concentraciones relativamente elevadas de azcar con tolerados bien por los mohos pero inhiben muchas bacterias. Morfologa de los Mohos: Puesto que la identificacin de los hongos depende en gran parte de caractersticas morfolgicas como el tipo y la agrupacin de las esporas se deben tomar muchas precauciones al hacer preparaciones para el examen microscpico. En general, el cultivo en medios lquidos no es satisfactorio para este propsito. Los cultivos en medios slidos, sobre todo en placas se pueden ver con una lupa o con el objetivo seco dbil del microscopio, empezando desde el fondo hasta la parte superior de la placa lo cual nos proporcionar suficiente informacin para identificar o precisar el gnero del moho examinado. Se deben hacer observaciones posteriores tomando con una aguja o asa una pequea muestra de micelio en desarrollo, la que se coloca en una gota de azul algodn lactofenol que est sobre un portaobjeto y se cubre luego con el cubreobjeto. En una preparacin hecha de esta manera, la hifas deben ser examinadas para ver si hay tabiques, estructuras de las esporas y otras partes del hongo que son determinantes, sin embargo, una manipulacin de este tipo rompe y desorganiza las estructuras del organismo pues la disposicin caracterstica de la que depende la identificacin se pierde y no es posible clasificarlo. Un mtodo mejor para examinar los hongos es la tcnica de cultivos en portaobjeto (microcultivo), ya que permite manejar y observar la especie sin modificar su desarrollo, y el arreglo y acomodo de sus partes permanecen intactos. Factores de crecimiento de las levaduras: Agua:

Las levaduras necesitan un poco ms de agua que los mohos, pero menos que las bacterias. Conviene insistir no obstante, que entre las levaduras hay gran variacin; algunas especies crecen en medio que contienen incluso 40 por 100 de agua, por ejemplo en miel y jaleas o compotas. Los microorganismos que crecen en soluciones de gran presin osmtica se denominan osmfilos. PH: Las levaduras crecen en lmites amplios de pH, aunque sus requerimientos son ms limitados que los de los mohos. Muchas especies se multiplican en soluciones con acidez de pH 3 y alcalinidad de pH 7.5. La reaccin ptima suele localizarse entre pH 7.5 y 5.0 Temperatura: No hay crecimiento a temperaturas superiores a la del congelamiento, ni tampoco a temperaturas superiores a 47 C; las temperaturas mximas para algunas especies son algo menores. La temperatura ms adecuada suele situarse entre 20 y 30 C. La incubacin a 30 C suele ser satisfactoria Oxgeno: Las levaduras fueron los primeros microorganismos en que se encontr crecimiento en un medio sin oxgeno atmosfrico. Pasteur se admir notablemente de este hecho, y observ que la utilizacin anaerobia de azcar generaba principalmente alcohol y bixido de carbono, en tanto que los productos aerobios eran bixido de carbono y agua. La multiplicacin de las levaduras es ms rpida y la cosecha de clulas es mayor en condiciones aerobias que en anaerobias, en consecuencia, se necesita abundancia de oxgeno en la elaboracin de levadura comercial, pero el oxgeno se excluye cuando se desea producir alcohol (en la fermentacin de cerveza o en la produccin de vino). Recuentos de Mohos y Levaduras: Todos los mohos y levaduras crecen bien a valores de pH de 5,0 y an inferiores, por lo que generalmente sustituyen a las bacterias en los alimentos cidos. Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los medios diseados para el recuento de mohos y levaduras, en los ltimos 20 aos se han utilizado con eficacia los antibiticos. Entre ellos puede citarse la penicilina + estreptomicina, el cloranfenicol, la clorotetracilina, la oxitetracilina y la gentamicina. Para fines generales, han sido muy utilizadas la oxitetracilina, que se refiere al a clorotetracilina debido a su mayor estabilidad. La gentamicina suprime el crecimiento de las bacterias Gran negativas y es efectiva por ellos en alimentos tales como la carne refrigerada. El rosa de bengala retarda el crecimiento de aquellos mohos que normalmente producen abundante micelio areo, como Neurospora y Rhizopus. Sin embargo, tambin inhibe algunas levaduras. La mejor temperatura de incubacin de los cultivos se sita alrededor de 22 C, y el tiempo de incubacin es de 5 das. Las colonias de mohos pueden formarse a partir de hifas o de esporas. Por ello el talo de un moho que est muy cargado de espora dar recuentos de placas muchos ms altos que otro de tamao similar sin esporas

PDA.- El Agar Dextrosa y Papa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosmticos. El Agar Dextrosa y Papa puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este medio es recomendado para realizar el recuento colonial. Tambin puede ser utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clnica. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la produccin de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos sealan bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir el crecimiento bacteriano. La infusin de papa promueve un crecimiento abundante de los hongos y levaduras y el agar es adicionado como agente solidificante.

4.-MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS REACTIVOS Muestras: slida (harina de trigo) Agua Peptona Agar: PDA Alcohol Desinfectante detergente MATERIALES Y EQUIPOS Matraz Erlenmeyer de 500 ml Agitador bortex 3 tubos de ensayo con sus tapas 4 pipetas de 2 ml 3 cajas petri Balanza mecnica Mechero Gradilla Tijeras Cuchara Incubadora de 37 C

5.- METODOLOGIA Primeramente se hizo una limpieza general de los mesones con detergente y desinfectante ya que esto es muy importante adems puede interferir en muestro anlisis. Tambin es muy importante que los materiales que se van a utilizar deben estar previamente esterilizados. Sealar con un marcador las correspondientes concentraciones:

-2

-1

-2

Se procedi a pesar 25 gramos demuestra (harina de trigo) este para disolverla en la solucin madre. Se tubo el cuidado de pesar exactamente los 25 gramos de muestra en la balanza mecnica. Agitar la mezcla muy bien para que la solucin sea homognea.

Todo trabajo debe realizarse siempre detrs de un mechero esto para prevenir contaminacin a la muestra a analizar. Solo una persona debe realizar el trabajo sin la ayuda de nadie. (Siembra en profundidad) Realizamos la primera dilucin tomando una pipeta 2 ml de la solucin (peptona y muestra). Colocamos 1 ml al tubo -2, agitamos en el agitador bortex, y el otro 1ml a la placa -1 de PDA. - siempre se debe tomar en cuenta que se debe trabajar detrs del mechero y cada material pasar por la llama del mechero. - En la segunda dilucin con otra pipeta esterilizada tomamos 1ml del tubo -2. Colocamos, 1ml a la placa -2 de PDA. Una vez concluidas estas se procedi al vaciado al agar, a este mtodo se le conoce como siembra en profundidad o en masa. Mezclar perfectamente el medio e inculo sobre la mesa de trabajo, haciendo movimientos circulares

con la placa, a favor y en contra del sentido de las agujas del reloj y en forma de cruz, evitando al mismo tiempo que el medio impregne la tapa. Dejar solidificar el agar de las placas sobre una superficie hirizontal. Cuando se ha solidificado perfectamente el agar, NO se invierten las placas y se intruducen en la estufa, evitando que se apilen en exceso y que entren en contacto con sus paredes. Incubar a 25 C durante un periodo de 5 a 7 dias. Transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias en aquellas placas que muestren colonias aisladas.

6.- DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Agar: PDA (-1) Mohos 6 colonias Levaduras 4 colonias Mohos y levaduras

Agar: PDA (-2) Mohos 3 colonias Levaduras 0 colonias

Agar: PDA (blanco) Mohos 0 colonias Levaduras 0 colonias

Para el recuento de MyL se dejo incubar el PDA a 25C se recomienda que el tiempo de incubacin sea de 7 das Donde se obtuvieron los siguientes resultados: Parmetro MyL Medio de cultivo PDA Tiempo: 7 dias Dilucin UFC -1 6 mohos + 4 levad. -2 3 mohos + 0 levad. B 0 mohos + 0 levad.

El recuento total de mohos y levaduras es de:

No hubo desarrollo sobresaliente de mohos y de levaduras, lo que nos indica que se trata de un alimento contaminante de M y L, hay bastante discrepancia en los limites mximos control de los parmetros analizados para la muestra de harina de trigo.

7.- OBSERVACIONES En la caja petri 10-1 se observo la presencia de 6 mohos que presentan un color verdusco con negro son de un tamao muy visible con pelusas a su alrededor, pero hay muchos que aun estn creciendo y 4 levaduras caractersticos presenta un color cremoso y son lisas. En la caja petri con la dilucin 10-2 donde no se pudo observar levaduras pero se conto la presencia de 3 mohos concntricos, circulares, uniformes se ve que presentan pelusas a su alrededor pero si se los deja mas da para incubar crecern ms cantidad de colonias. En la caja petri (blanco) se observo ausencia de mohos y levaduras, lo cual es correcto porque es blanco.

Sin embargo no se hace el invertido de placas para mohos y levaduras porque las esporas saldran, contaminando as el medio ambiente.

8.- CONCLUSIONES

Las conclusiones de la prctica realizada son las siguientes: Es de vital importancia tener conocimientos de preparacin de medios de cultivo, tcnicas de asepsia, orden y cuidado en la manipulacin de las muestras, los materiales y los medios de cultivo con los que se trabajara, ya que se debe evitar ante todo el momento de realizar tanto la preparacin de la muestra y la siembra en el medio de cultivo que se de una contaminacin externa por manipulacin, pero lo mas importante es saber que medios y a que temperatura se deben de incubara las muestras. De igual manera se debe saber que materiales son los que se van a utilizar en cada una de las determinaciones, desde la dilucin, hasta que medios de cultivo son los adecuados para los parmetros que se tienen que estudiar. En todo caso lo que se debe realizar es una planeacin de cmo es que se va a realizar las determinaciones dado que en el caso de no realizar un buen pedido o preparacin de requerimiento se puede estar en apuros al momento de realizar las determinaciones, y eso nos puede llevar a que se contamine la muestra y que se tenga a que volver a empezara realizar la determinacin, no cabe dudas que la preparacin previa a los anlisis es importante para saber con exactitud que es lo que se va a realizar. Logramos determinar e identificar en una muestra solida de harina de trigo, mohos levaduras en el Agar de Patata y Dextrosa, para realizar el anlisis microbiolgico de M y L. En la determinacin de los mohos y levaduras (MyL) el medio que se utilizo es el PDA, se debe tener cuidado en la temperatura y tiempo de incubacin, pero adems que se debe tomar encuenta que la caja petri NO se debe invertir durante la incubacin. las diferencias entre mohos y levaduras son mnimas pero bastante apreciables, por lo que no hubo mucho problema al distinguirlos, el recuento final nos indico la presencia de pocos MyL que es muy bueno ya que se trata de un alimento inocuo. Se hizo un recuento aproximado de mohos y levaduras en el medio PDA

9.- BIBLIOGRAFIA 1. Seeley H y Van Demark P, Microbios en accin, Ediciones Blume, 1ra ed., Espaa 1973. 2. Larraaga I et all, Control e higiene de los alimentos, McGraw Hill, Espaa 1999. 3. Pascual Anderson R, Microbiologa Alimentaria, Ediciones Diaz de Santos, 2da ed., Espaa 2000

10.- CUESTIONARIO 1.- Cuales son las principales estructuras caractersticas de las levaduras y hongos? 2.- Cmo se clasifican los mohos y levaduras? 3.- Describir brevemente tres problemticas concretas para el hombre causada por los hongos y tres ejemplos de utilizacin benfica.

4.- De que manera influye el pH, la temperatura y la actividad del agua en el crecimiento de mohos y levaduras? 5.-De acuerdo a la norma boliviana vigente Cul es el limite mximo permisible para hongos y levaduras, en la chicha, api morado, yogurt casero, apanado, harina de perro, dar el numero de norma. ( en caso de no contar con ellos, especifique segn su criterio). 6.- Que pruebas bioqumicas se realizara para la caracterizacin de levaduras?. Mencione las caractersticas bioqumicas de principales levaduras de importancia de salud pblica. (por lo menos tres) 7.- Explicar brevemente como se realiza la prueba bioqumica del auxonograma en placa (las dos formas) 8.- Como se realiza la identificacin de hongos filamentosos (mencione por lo menos tres). 1. Crecimiento permitido segn norma para el alimento analizado en su grupo para los parmetros trabajados. Al ser un alimento que es nuevo, se debe considerar que no se llego a un acurdo internacional de cual es el adecuado lmite la presencia de R.T.B.A.M. o MyL, pero sin embargo hay algunos pases que se pusieron lmites que son los siguientes: Parmetro Limite mximo R.T.B.A.M. 5*103. MyL 1*103. Observando estos lmites podemos afirmar que nuestra muestra analizada es inocua y libre de riesgo para el consumo, ya que estn por debajo estos lmites mximos. 2. Medios que se emplean para el anlisis de mohos y levaduras. Existe una variedad grande medios de cultivo especiales para la determinacin de mohos y levaduras entre los ms conocidos y comunes son: PDA, Caldo Triptona Soja (TSB), Agua de Triptona (TW), Solucin de Ringer, Solucin de Tween, Agar extracto levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE), agar extracto de levadura, agar extracto de malta y otros que no son muy utilizados o que en todo caso son particulares para el tipo de alimento a analizar. 3. Funciones que cumplen los suplementos adicionados al medio empleado para mohos y levaduras. El acido tartrico se usa en diversas recetas de cocina donde se conoce como crmor trtaro, especialmente en repostera y confitera para aumentar la masa y consistencia ya que enriquece la fermentacin de levaduras y mohos, es por ese principio que el acido tartrico tiene la propiedad de estabilizar el medio PDA que se utilizo para la determinacin del recuento de MyL.

Mientras que la oxitetraciclina acta como un agente selectivo, impidiendo el crecimiento bacteriano, es decir es un antibitico que impedir que se desarrollen bacterias en este medio de cultivo y as no se contamine tan fcilmente el medio.