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ERLIQUIOSE CANINA: ALTERAES HEMATOLGICAS EM CES DOMSTICOS NATURALMENTE INFECTADOS CANINE EHRLICHIOSIS: HEMATOLOGIC ALTERATIONS IN DOMESTIC DOGS NATURALLY INFECTED
Christina de Siqueira MENDONA1; Antonio Vicente MUNDIM2; Alisson Sousa COSTA3 ; Tatiana Vasconcelos MORO 4 RESUMO: Erliquiose canina uma doena causada por infeco de clulas mononucleares pela Ehrlichia spp., riqutsias transmitida pelo carrapato que formam agrupamentos intracelulares. Com o objetivo de avaliar as alteraes hematolgicas em ces domsticos naturalmente infectados com Ehrlichia spp., foram realizados hemograma de 109 animais com presena de mrulas nos leuccitos em extenses de sangue coletado de capilares marginais da orelha. Observou-se com maior freqncia anemia (77,98%), trombocitopenia (87,15%), eosinopenia (64,22%), desvio nuclear de neutrfilos para a esquerda (50,46%), leucopenia (24,77%) e linfopenia (22,02%). A anemia de maior freqncia foi do tipo normoctica normocrmica quanto morfologia e arregenerativa quanto resposta da medula ssea. Concluiu-se que, embora no especficos, trombocitopenia, anemia arregenerativa, eosinopenia e desvio nuclear de neutrfilos para a esquerda, so achados freqentes na erliquiose canina. UNITERMOS: Erliquiose, Co, Hematologia. INTRODUO Erliquiose canina uma doena transmitida por carrapato causada por um parasita intracelular obrigatrio, Ehrlichia spp., riqutsias que formam agrupamentos intracelulares chamados mrulas. As espcies que naturalmente infectam ces incluem E. canis, E. equi, E. risticii, E. platys e E. ewingii (ANDEREG; PASSOS, 1999; NELSON; COUTO, 2001b; STILES, 2000; TROY; FORRESTER, 1990). A E. canis o agente que freqentemente infecta os ces causando quadro clnico mais severo (ANDEREG; PASSOS, 1999; NELSON; COUTO, 2001b). Localiza-se nas clulas do sistema retculo endotelial do fgado, bao e linfonodos, sendo seu primeiro ponto de replicao as clulas mononucleares e os linfcitos, onde se replicam por diviso binria. Geralmente a mrula observada nos leuccitos na fase aguda da infeco, mas em pequeno nmero e por um perodo curto
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de tempo. A mrula formada por um conjunto de microorganismos firmemente envoltos por uma membrana (ANDEREG; PASSOS, 1999; STILES, 2000). A fase aguda da infeco por E. canis ocorre aproximadamente de oito a 20 dias aps a infeco, e dura de duas a quatro semanas (ANDEREG; PASSOS, 1999; NELSON; COUTO, 2001b; STILES, 2000; TROY; FORRESTER, 1990). Durante esse perodo, o microorganismo replica-se nas clulas mononucleares da circulao, e o parasita dissemina-se para rgos como bao, fgado e linfonodos, infectando os fagcitos monocucleares. Nesta fase ocorre trombocitopenia entre 10 e 20 dias ps-infeco e um aumento no nmero de plaquetas imaturas circulantes, que persiste por toda a doena na maioria dos animais. A trombocitopenia devese diminuio da meia-vida das plaquetas, resultante da sua destruio, decorrente da estimulao do sistema imunolgico, da cascata de coagulao e, em parte, devido resposta inflamatria. A prpria infeco por E. canis

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Mdica Veterinria do Hospital Veterinrio da Universidade Federal de Uberlndia (UFU). Ps-graduanda em Cincias Veterinrias-clnica e cirurgia da UFU. csmendonca@terra.com.br. Professor assistente de Patologia Clnica. FAMEV/UFU. Doutorando em Medicina Veterinria UNESP/Jaboticabal. Acadmico em Medicina Veterinria da UFU. Mdica Veterinria autnoma. Received 07/05/04 Accept 26/10/04 Biosci. J., Uberlndia, v. 21, n. 1, p. 167-174, Jan./April 2005

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causa lise de plaquetas, porm casos sem trombocitopenia podem ocorrer. Na fase aguda raramente observa-se leucocitose (ANDEREG; PASSOS, 1999; STILES, 2000). De acordo com Nelson e Couto (2001b), a anemia nesta fase do tipo normoctica normocrmica regenerativa, devido perda de sangue. Quando o co sobrevive fase aguda instala-se a fase subclnica que dura aproximadamente de seis a nove semanas, progredindo para a fase crnica, com trombocitopenia devido disfuno da agregao plaquetria, leucopenia seguida de leucocitose e monocitose. A neutropenia tambm achado comum nesta fase. A pancitopenia rara na fase subclnica (ANDEREG; PASSOS, 1999; NELSO; COUTO, 2001b; STILES, 2000; TROY; FORRESTER, 1990). A fase crnica instala-se devido ineficincia do sistema imune do hospedeiro. A principal caracterstica desta fase a hipoplasia de medula ssea resultando em anemia aplsica, assim como monocitose, linfocitose e leucopenia (ANDEREG; PASSOS, 1999; STILES, 2000; TROY; FORRESTER, 1990). Segundo Meinkoth et al. (1989), Nelson e Couto (2001b), nesta fase ocorre uma anemia normoctica normocrmica arregenerativa devido supresso da medula ssea ou da anemia da doena crnica. Os ndices hematimtricos: volume corpuscular mdio (VCM), hemoglobina corpuscular mdia (HCM) e concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (CHCM) so essenciais para a classificao morfolgica das anemias, a fim de descobrir suas provveis causas. A classificao das anemias morfologicamente hoje a mais aceita mundialmente, dividindo as anemias em seis grupos: macroctica hipocrmica, macroctica normocrmica, microctica hipocrmica, microctica normocrmica, normoctica hipocrmica e normoctica normocrmica. A contagem de reticulcitos e o ndice reticulocitrio classificam a anemia quanto resposta medular (FIGHERA, 2001; MEYER; COLES; RICH, 1995). Os reticulcitos so eritrcitos jovens, com citoplasma ainda repleto de organelas (como mitocndrias, ribossomos e complexo de Golgi que lhes confere uma colorao azulada). O reticulcito a ltima fase dos precursores eritrocticos e nele ocorre ainda a sntese de 20% da hemoglobina. Essa clula permanece na medula ssea por dois a trs dias a fim de se maturar e ser liberada como eritrcito maduro. O reticulcito, quando liberado na corrente sangunea, matura-se em 24 a 48 horas, eles normalmente aparecem no sangue dos ces, em uma

proporo de l a 2% das clulas vermelhas. Nas anemias regenerativas dos carnvoros e primatas, incluindo o homem, os reticulcitos aumentam significativamente no sangue circulante. A reticulocitose altamente indicativa de boa regenerao medular (FIGHERA, 2001; MEYER; COLES; RICH, 1995). Se o ndice reticulcitario (IR) em um co for superior a 2,5%, a anemia regenerativa; se for inferior a 2,5%, a anemia arregenerativa (NELSON; COUTO, 2001a). O presente trabalho teve como objetivo avaliar as alteraes hematolgicas em ces domsticos naturalmente infectados com Ehrlichia spp. MATERIAL E MTODOS Foram realizados hemogramas de 109 ces de ambos os sexos, diversas raas, com presena de mrulas de Ehrlichia spp. em extenses de sangue coletado dos capilares marginais da orelha, de animais atendidos no Hospital Veterinrio da Universidade Federal de Uberlndia no perodo de fevereiro a outubro de 2002. O sangue para realizao dos hemogramas e contagem dos reticulcitos foi coletado por venopuno da veia radial ou jugular externa com seringas descartveis e transferido para tubos tipo vacutainer siliconizado, contendo como anticoagulante 0,1 mL de EDTA (cido etilenodiaminotetractico sal dissdico) a 10%. O volume globular, hemoglobinometria, hematimetria, leucometria, plaquetometria, e os ndices hematimtricos absolutos VCM, HCM e CHCM foram obtidos atravs de mtodo eletrnico utilizando aparelho Coulter T890; a contagem diferencial dos leuccitos foi realizada em extenses sanguneas coradas pelo MayGrnwalGiemsa, e a contagem dos reticulcitos realizada em esfregaos sanguneos corados com azul brilhante de cresil segundo Ferreira Neto,Viana e Magalhes (1981). O ndice reticulocitrio foi calculado segundo Nelson e Couto (2001a). Foi utilizado um delineamento inteiramente casualisado e para anlise estatstica dos resultados utilizou-se estatstica descritiva e para comparao das mdias o teste de hipteses para diferenas entre propores (Teste Z), com nvel de significncia de 5%. RESULTADOS E DISCUSSO As alteraes hematolgicas encontradas em 109 ces com erliquiose canina encontram-se nas Tabelas 1, 2, 3 e 4.

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Tabela 1. Mdia, desvio padro, amplitude de variao dos valores dos parmetros hematolgicos de 109 ces domsticos, naturalmente infectados por Ehrlichia spp. Parmetros avaliados Volume globular % Hemcias x 106/ L Hemoglobina g/dL VCM fL HCM pg CHCM % Plaquetas x 103/L Reticulcitos % ndice reticulcitrio % Leuccitos /L Neutrfilos jovens /L Neutrfilos segmentados /L Neutrfilos totais /L Linfcitos /L Moncitos /L Eosinfilos /L Basfilos /L
* Meinkoth & Clinkenbeard (2000).

Mdia 27,88 3,95 9,31 71,17 25,08 34,00 89,60 0,42 0,23 12.303 645 8.800 9.579 2.079 538 129 0

Desvio Padro 10,41 1,52 3,55 10,63 19,53 10,08 122,53 1,07 0,63 15.897 1.043 14.762 15.533 1.462 429 225 0

Mnimo 4,40 0,26 2,40 58,80 17,90 28,90 1,80 0 0 500 0 120 200 66 0 0 0

Mximo 63,30 9,24 20,70 166,10 225,90 136,00 912,00 9,70 6,23 141.800 8.498 137.546 138.964 8.778 2.178 1.776 0

Valores de Referncia * 37 - 55 5,5 - 8,5 12 - 18 60 - 77 32-36 200.000-500.00 0-1,5 2,5 6.000-17.000 0-300 3.000-11.5000 3.000-11.800 1.000-4.800 150-1.350 100-1.250 Raros

Conforme demonstrado na Tabela 1, ocorreu uma grande amplitude de variao nos valores dos constituintes do eritrograma e do leucograma nos animais estudados. Observou-se que estes valores foram inferiores aos fisiolgicos citados para a espcie por Meinkoth e Clinkenbeard (2000). Com relao ao leucograma, os valores mdios do nmero de leuccitos dos animais deste estudo, embora permanecendo dentro da faixa de normalidade citada pelo pesquisador acima referido, sua amplitude de variao foi grande. Esta grande variao e a discordncia com outros pesquisadores provavelmente se devem a fatores inerentes a patogenicidade da cepa, ao curso da infeco, resposta individual dos animais e presena de agentes infecciosos concomitantemente. Os achados da Tabela 2 foram obtidos aps serem confrontados os resultados dos exames dos animais deste estudo com os valores de referncia citados por Meinkoth e Clinkenbeard (2000). As alteraes hematolgicas observadas com maior freqncia nos animais do presente estudo foram: anemia em 85 (77,98%) dos ces, trombocitopenia em 95 (87,15%), eosinopenia em 70 (64,22%), desvio nuclear

de neutrfilos para a esquerda em 55 (50,46%), leucopenia em 27 (24,77%) e linfopenia em 24 (22,02%), alteraes estas estatisticamente significativas (p<0,05). As demais alteraes observadas no hemograma embora estatisticamente significativas, ocorreram com menor freqncia e so pouco representativas. O encontro de 77,98% de ces com anemia neste estudo, foi prximo ao de Moreira et al. (2002) que detectaram 70,3%, aos de Waddle e Littman (1988) e Kuehn e Gaunt (1985) que detectaram volume globular baixo em 81% e 72% dos animais por eles estudados respectivamente. Diferem dos de Codner e Farris-Smith (1986), que relatam a no ocorrncia de anemia em dez ces com infeco subclnica de erliquiose. Dos 85 ces com anemia, 84 (98,82%) apresentaram ndice reticulocitrio inferior a 2,5% e apenas um (1,18%) superior a 2,5%, o que demonstra que 84 (98,82%) dos animais anmicos eram portadores de anemia do tipo arregenerativa, alterao tambm observada por Kuehn e Gaunt (1985) em 40 ces anmicos com erliquiose canina. A etiologia da anemia na erliquiose canina ainda no est totalmente esclarecida. Acredita-se que seja devido destruio de hemcias
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pelo sistema monoctico/macrofgico e/ou lise destas clulas por ao de complemento e uma reao de hipersensibilidade do tipo II, ou devido a supresso da eritropoiese. Segundo Nelson e Couto (2001b), a anemia

normoctica normocrmica arregenerativa origina-se de supresso da medula ssea ou da anemia da doena crnica.

Tabela 2. Achados hematolgicos em 109 ces domsticos, naturalmente infectados por Ehrlichia spp. Parmetros avaliados Volume globular /% Hemcias /x106/L Hemoglobina /g/dL VCM /fl CHCM /g/dL Plaquetas /L Leuccitos totais /L Neutrfilos jovens /L Neutrfilos segmentados /L Neutrfilos totais /L Eosinfilos /L Basfilos /L Moncitos /L Linfcitos /L Reticulcitos /% Diminudo N % 85a 85a 85a 2c 27b 95a 27b 0b 20b 14b 70a 0 14b 24b 0 77,98 77,98 77,98 1,83 24,77 87,15 24,7 0 18,35 12,84 64,22 0 12,84 22,02 0 Normal N % 23b 23b 23b 97a 77a 13b 67a 54a 74a 80a 38b 0 90a 81a 105a 21,10 21,10 21,10 88,99 70,64 11,93 61,47 49,54 67,89 73,39 34,86 0 82,57 74,31 96,33 Aumentado N % 1c 1c 1c 10b 5c 1c 15c 55a 15b 15b 1c 0 5c 4c 4b 0,92 0,92 0,92 9,17 4,59 0,92 13,76 50,46 13,76 13,76 0,92 0 4,59 3,67 3,67 Valores de Referncia* 37 - 55 5,5 - 8,5 12 - 18 60 - 77 32 - 36 200.000 - 500.000 6.000 - 17.000 0 - 300 3.000 - 11.500 3.000 - 11.800 100 - 1.250 Raros 150 - 1.350 1.000 - 4.800 0 - 1,5

* Meinkoth; Clinkenbeard (2000). N nmero de animais. Letras minsculas distintas diferem significativamente entre si (p < 0,05).

O encontro de trombocitopenia em 87,15% dos animais do presente estudo, corrobora com Wadlle e Littman (1988), Troy e Forrester (1990) Waner et al. (1997) que detectaram trombocitopenia em 84,0%; 86,0% e 89,0% dos animais por eles estudados, respectivamente. No entanto este achado superior aos de Kuehn e Gaunt (1985) que encontraram trombocitopenia em 64% dos ces com erliquiose e ao de Codner e Farris-Smith (1986) e Moreira et al. (2002), que observaram somente em 50%. A trombocitopenia descrita habitualmente em ces com erliquiose sendo importante para o diagnstico da doena. um achado consistente no estgio agudo da doena. Alguns mecanismos so propostos para explicar esta alterao. Alm da aplasia de medula ssea e/ou supresso de suas atividades eritropoiticas, leucopoiticas e trombopoiticas, pode ser atribuda a diminuio da meia-vida das plaquetas circulantes durante a fase aguda da infeco, reduzida agregao plaquetria devido a anticorpos antiplaquetrios, efeito direto da E.

canis sobre as plaquetas circulantes ou devido ao dano endotelial e agregao das plaquetas (KUEHN; GAUNT, 1985; TRESAMOL; DHINAKARAN; SASEENDRANATH, 1995; WANER et al., 1997). Kakoma, Carson e Ristic (1980) sugeriram que a trombocitopenia observada com freqncia nos casos da doena, fosse decorrente da produo de um fator inibidor da migrao plaquetria, e de linfcitos T citotxicos, capazes de destruir plaquetas. Pierce et al. (1977) relataram a existncia de uma substncia no identificada, em ces infectados por E. canis, capaz de inibir a liberao do fator plaquetrio-3 (FP-3) pelos trombcitos. Embora a leucopenia ter sido relatada como uma das alteraes mais comuns nos animais acometidos por Ehrlichia spp., no presente estudo foi observada em 24,77% dos ces, achado semelhante ao de Kuehn e Gaunt (1985) que detectaram em 25% dos ces por eles estudados, prximo aos de Troy e Forrester (1990) e Moreira et al. (2000) que observaram em 31 e 30% dos
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animais respectivamente. Inferior aos de Waner et al.(1997) que relataram leucopenia em 78% dos ces. Os mecanismos que induzem a leucopenia podem ser os mesmos atribuidos anemia ou seja, granulopoiese ineficaz nos animais com infeces crnicas graves, devido a hipoplasia da medula ssea. Para Hibbler, Hoskins e Greene (1986), pode ser devido tambm a uma vasculite observada de forma generalizada em vrios rgos e sistemas dos ces infectados por Ehrlichia spp. Segundo Cotran, Kumar e Robbins (1989) a vasculite e a produo de interleucina 1 (IL-1) podem ser responsveis pela marginao e adeso de leuccitos parede vascular e sada destes da circulao para os focos de inflamao. O desvio nuclear de neutrfilos para a esquerda (DNNE) ocorreu em 50,46% dos animais deste estudo, este achado corrobora com os de Moreira et al. (2002) que encontraram aumento no nmero de bastonetes em 66,7% dos animais, e diferem dos de Waddle e Littman (1988) que encontraram esta alterao em somente 26% dos animais estudados. O DNNE provavelmente devido a migrao, seqestro e destruio de leuccitos nos rgos e tecidos onde ocorrem a multiplicao do agente, vasculite e focos de inflamao. O encontro de eosinopenia em 64,22% dos ces, condiz com os achados de Waddle e Littman (1988), Troy e Forrester (1990) e Tresamol, Dhinakaran e Saseendranath (1995) que encontraram respectivamente 63%, 56% e 58% dos ces por eles estudados eosinopnicos.

A linfopenia observada em 22,02% dos ces deste estudo, difere dos ndices de 41%, 48%, 46%, e 37%, relatados por Kuehn e Gaunt (1985), Waddle e Littman (1988), Troy e Forrester (1990) e Tresamol, Dhinakaran e Saseendranath (1995), respectivamente. A linfopenia e eosinopenia observadas, so alteraes leucocitrias atribudas ao dos corticosterides e catecolaminas liberadas pela adrenal no perodo de estresse da infeco aguda. Embora o mecanismo responsvel pela eosinopenia no esteja ainda bem esclarecido, tem sido proposto para justificar sua ocorrncia, lise intravascular de eosinfilos, seqestro reversvel em rgos do sistema monoctico fagocitrio e acentuada migrao para os tecidos. A linfopenia resultante da linflise e/ou sequestro de grande nmero de linfcitos nos tecidos corpreos, principalmente no tecido linfide. Quanto morfologia, o tipo de anemia predominante nos animais estudados foi a normoctica normocrmica, observada em 57 (67,05%) dos animais anmicos, seguida da normoctica hipocrmica em 18 (21,18%). Os demais tipos de anemia foram de menor ocorrncia (Tabela 3). Estes achados diferem dos encontrados por Tresamol, Dhinakaran e Saseendranath (1995), que estudando 29 ces naturalmente infectados por E. canis, detectaram anemia em 53% dos animais, sendo o tipo normoctica normocrmica observado em 78,0% dos animais anmicos.

Tabela 3. Frequncia dos tipos morfolgicos de anemia em 85 ces domsticos naturalmente infectados por Ehrlichia spp. Tipo de anemia Normoctica normocrmica Normoctica hipocrmica Microctica hipocrmica Macroctica normocrmica Macroctica hipocrmica Total N de animais 57a 18b 01d 02c 07c 85 Freqncia(%) 67,05 21,18 1,18 2,35 8,24 100,00

Letras minsculas distintas diferem significativamente entre si (p < 0,05).

Segundo Meinkoth e Clinkenbeard (2000) as anemias podem ser classificadas quanto severidade em leve, moderada, severa e muito severa. No presente trabalho, 50,59% dos animais anmicos apresentaram grau moderado de anemia, 27,06% severa a muito severa e

22,35% apresentaram grau leve (Tabela 4). Estes dados so importantes na escolha do tratamento e no estabelecimento do prognstico da doena. No foram encontrados na literatura dados referentes severidade da anemia em ces com erliquiose canina.

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Tabela 4. Freqncia dos graus de anemia em 85 ces domsticos infectados por Ehrlichia spp. Grau de anemia Leve Moderada Severa Muito severa Total Valores do volume globular (%)* 30 - 37 20 - 29 13 - 19 <13 N de animais 19a 43b 14c 9d 85 Freqncia(%) 22,35 50,59 16,47 10,59 100

* Meinkoth; Clinkenbeard (2000). Letras minsculas distintas diferem significativamente entre si (p < 0,05).

Vale ressaltar que dos 109 ces naturalmente infectados por Ehrlichia spp, deste estudo, quatro (3,67%) apresentaram infeco concorrente com Babesia spp., achado semelhante ao de Moreira et al. (2002) que relatam a ocorrncia em 3,44% dos ces com erliquiose em associao a outros hemoparasitas como: Haemobartonella canis e Babesia canis.

CONCLUSO Embora no especficos, trombocitopenia, anemia arregenerativa, eosinopenia, desvio nuclear de neutrfilos para a esquerda, so achados freqentes na erliquiose canina.

ABSTRACT: Canine ehrlichiosis is a disease transmitted by tick caused by an obligate, intracellular parasite, Ehrlichia spp., rickettsial agent, which form intracellulars groupings. With the objective to evaluate the hematologic alterations in domestic dogs naturally infected by Ehrlichia spp., hemograms were put into practice in 109 animals with the presence of morulae in the leukocyte in blood extensions collected from margins capillarys of the ear. The hematologic alterations observed with larger frequency were: anaemia (77.98%), thrombocytopenia (87.15%), eosinopenia (64.22%), nuclear deviation of neutrophils to the left (50.46%), leukopenia (24.77%) and lynphopenia (22.02%). Among the anemic animals, the anaemia with larger frequency was the one of type normocytic normochromic as for the morphology and nonregenerative as for the answer of the bone medulla. It is ended that, although not specific, trombocytopenia, nonregenarative anaemia, eosinopenia, nuclear deviation of neutrophils to the left, they are found frequent in the canine ehrlichiosis. UNITERMS: Ehrlichiosis, Dog, Hematology.

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