PRACTICA 3.

CUANTIFICACIN DE LA CANTIDAD DE PROTENA DE UNA MUESTRA VEGETAL

En la mayora de trabajos bioqumicos es bueno cuantificar la protena total de un extracto proteico despus de los distintos pasos de extraccin, purificacin, etc., con el fin de poder saber los rendimientos de estos procesos y si stos han sido adecuados o no. Existen varios mtodos de cuantificacin de protenas, pero los ms usados son aquellos en los que un colorante se une, de forma inespecfica, a las protenas, dando al extracto una coloracin caracterstica y cuantificable en un colormetro. Los diferentes mtodos colorimtricos tienen diferentes caractersticas en cuanto a sensibilidad y linealidad de respuesta, pero el ms utilizado de todos ellos es la cuantificacin con el reactivo de Bradford (1976), que se basa en la reaccin del azul Comassie con las protenas y posterior medida de la absorbancia desarrollada a 595 nm. Para determinar la concentracin de protena es necesario disponer de una curva patrn en la que se mide la A595 de unas soluciones cuya cantidad de protena se conoce y despus se interpolarn en la curva patrn los valores de absorbancia obtenidos en las muestras cuya concentracin de protena se pretende determinar. El objetivo es cuantificar la protena total del extracto enzimtico obtenido, as como en los sedimentos y sobrenadantes obtenidos con los dos agentes precipitantes, por uno de los mtodos ms utilizados: el mtodo de Bradford.

Protocolo experimental 1. Material y reactivos - Centrfuga - Tubos de ensayo - Muselina - Pipetas Pasteur - Extracto enzimtico de hojas de naranjo y algunas diluciones del mismo (1/3, 1/10 y 1/20).

- Tampn fosfato sdico 0.2 M pH 7.5 - Colormetro - Tubos de ensayo - Pipetas y micropipetas (5 mL y 100 L) - Reactivo de Bradford 5X - Curva patrn de BSA

2. Procedimiento 2.1. Preparacin del extracto enzimtico La preparacin del extracto enzimtico es muy sencilla. Se trituran en un mortero de porcelana 2 g de hojas troceadas, lavadas previamente con agua destilada y secadas, a las que se le aade 20 mL de tampn fosfato sdico 0.2 M pH 7.5. Se filtra en muselina sobre el tubo de centrfuga crex y el homogeneizado se centrifuga a 18000 rpm a 4C durante 20 min. El sobrenadante constituye el extracto enzimtico. Se utilizar el extracto enzimtico diluido con el tampn de reaccin para que la reaccin sea cuantificable. Inicialmente se probar con 1/3, 1/10 1/20).

2.2. Preparacin del reactivo de Bradford (5x) Disolver 100 mg de Azul Comassie G en 50 mL de etanol 96%, aadir 100 mL de H3PO4 y agua destilada hasta 200 mL y despus filtrar. Este reactivo est concentrado cinco veces (5x). Para utilizarlo se diluye con cuatro partes de agua (1 parte de Bradford y 4 partes de agua). Para determinar la concentracin de protena, a 100 L de la muestra se le aaden 5 mL del reactivo de Bradford diluido y se mide A595.

2.3. Preparacin de la curva patrn de BSA En primer lugar se prepara una disolucin patrn de seroalbmina bovina (BSA) al 0.1% aproximadamente. Para ello se pesan unos 12 mg de BSA en la balanza de precisin y se disuelven en 10 mL de agua. Dado que la BSA en polvo se encuentra

hidratada, la concentracin de las disoluciones preparadas gravimtricamente es slo aproximada. La concentracin exacta de la BSA en la disolucin patrn se determinar espectrofotomtricamente de acuerdo con la Ley de Lambert-Beer, sabiendo que, para la BSA, 280
-1

cm-1. (La Ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia

de una determinada sustancia a una longitud de onda dada es igual a la concentracin de la misma (M) por el coeficiente de extincin molar de esa sustancia a esa longitud de onda y por el paso ptico de la cubeta del espectrofotmetro (cm)) . A280 = 280 c l c =
A 280 l
280

En la tabla siguiente se detallan las mezclas de reaccin necesarias para la obtencin de la curva patrn de la BSA. A cada uno de estos tubos se le aadieron 5 mL de reactivo de Bradford diluido y, a continuacin, se midi la A595, siendo los valores de absorbancia los que se dan en la tabla siguiente:

l disoluci n BSA 0 (blanco) 15 30 45 60 75

l agua

A595

100 85 70 55 40 25

Conocida la concentracin real de BSA es posible determinar la concentracin de BSA en cada una de las alcuotas anteriores. Representando la absorbancia de la BSA a 595 nm frente a la concentracin real, obtenemos la recta patrn buscada, donde x ser la concentracin de protena en g de protena/mL.

2.4. Determinacin de la cantidad de protena. Para determinar la cantidad de protena total del extracto se mezclarn 100 l de extracto con 5 mL del reactivo de Bradford diluido y se medir la absorbancia a 595 nm. Si se satura el espectrofotmetro se ha de elegir la dilucin del extracto que d un valor de absorbancia que est dentro del rango de la curva patrn obtenida (diluciones el extracto 1:2, 1:3 1:5 con el tampn). As, los 100 L de extracto sern de la dilucin adecuada. (Recordad que antes de usar este reactivo de Bradford debe diluirse a la quinta parte con agua destilada). El blanco se hace aadiendo 100 L de tampn a 5 mL del reactivo de Bradford diluido. El clculo de la protena contenida en el extracto se realiza interpolando el valor de la absorbancia a 595 nm en la curva patrn de BSA obtenida anteriormente. Los resultados finales se han de expresar en g de protena por mL de extracto, por lo que hay que considerar los factores de dilucin necesarios.