CURVA DE CRECIMIENTO DE ESCHERICHIA COLI: CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS NILVIO ESTRADA, EDISON FUERTES, ELIANA CHAMORRO, HELBERT TUCANES.

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL UNIVERSIDAD DE NARIO-IPIALES

RESUMEN En el laboratorio se analizo el crecimiento y al mismo tiempo la cuantificacin de E. coli. Estos procesos sintticos de crecimiento celular bacteriano implican transformacin de energa, sntesis de pequeas molculas, as como cofactores y coenzimas necesarias para las reacciones enzimticas. Las reacciones mas importantes para la sntesis de macromolculas estn relacionadas con la sntesis de ADN, ARN y de protenas una vez completado este escenario complejo se produce el crecimiento celular. Nos pudimos dar cuenta que en las diluciones de 101 y 105 que se realizo con el inoculo de E.coli y midindole la absorvancia cada 30 minutos despus de haber pasado por la incubacin; esta tiende a aumentar lo cual indica que el ciclo de crecimiento de E.coli esta en este rango. Palabras claves: crecimiento, cuantificacin, sntesis, E.coli, inoculo, absorvancia ,

1. INTRODUCCION Existen varios mtodos para determinar el crecimiento de poblaciones de bacterias, puede ser por aumento de la masa del cultivo o por aumento del nmero de clulas, por mtodos directos o mtodos indirectos. Los mtodos directos de cuantificacin de microorganismos permiten establecer la poblacin total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rpidos aunque no es posible diferenciar a las clulas vivas de las muertas. Entre estos mtodos tenemos la turbidimetra y el conteo de clulas. Turbidimetra

En una suspensin microbiana la cantidad de microorganismos esta directamente relacionada con la turbiedad o densidad ptica. La metodologa es til con suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde los microorganismos son unicelulares y con un tamao de unos cuantos micrmetros, caractersticas que les permiten mantenerse suspendidos y homogneamente distribuidos; en tanto que con microorganismos de mayor tamao y con aquellos productores de polisacridos esta metodologa no es adecuada.

2. MATERIALES Y METODOS En la practica de laboratorio inicialmente se recibi una muestra inoculada de E.coli en 25ml de caldo nutritivo en erlenmeyer de 50ml, de esta sustancia se toma 2ml y se lo vierte en dos tubos con 1ml cada uno. Uno de los tubos se lo lleva al conteo en el espectrofotmetro y seguidamente se lo conduce a incubacin por un tiempo de 30min; mientras el otro le determinamos el PH y extraemos 100l los cuales vertimos en dos cajas petri con agar EMB y las conducimos a incubacin. Este proceso lo repetimos cada 30min con el fin de analizar el crecimiento de E.coli. 3. RESULTADOS Y DISCUSIN Teniendo el inoculo de E.coli se procede a tomar 1ml de la muestra y lo agregamos en dos tubos tapa rosca y dejamos uno para Blanco a los dos primeros los llevamos a incubacin por 30 minutos lo mismo que a la bacteria en cuestin la cual se encuentra en el erlenmeyer. Los tubos van en una serie de 101 y 106. Cada tandada en un tiempo de 30 minutos con el fin de analizar en el uno la absorbancia, en el otro PH y en el ultimo se toma 100l para realizar la siembra en caja petri con agar EMB. Los datos obtenidos se muestran en la tabla 1.

TUB O

Tiempo (Minutos ) 0 40 70 100 130 160 Tabla 1. Datos de laboratorio.

PH

Absorvanci a

6 0.006 7 0.132 7 0.178 7 0.244 7 0.252 7 0.261 la muestra dada en el

En la siguiente grafica se muestra el crecimiento de bacterias en el tiempo. Grafica 1.

0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 200 Tiempo 400 CURVA DE CRECIMIENTO

Grafica 1. Se puede mirar las fases de crecimiento de E.coli. De la Grafica 1. Podemos decir que E.coli a medida que transcurre el tiempo presenta un crecimiento exponencial y como sabemos esta clula con buenos

Numero de Bacterias

factores tanto nutricionales como genticos completa la fision binaria en 20 minutos aproximadamente lo cual genera una nueva clula.

104=330 105=580 106=710 y para calcular el numero de bacterias totales se hizo uso de la siguiente formula: Bacterias totales en cada caja petri= N de bacterias en el cuadrante * 4 * factor de dilucin.

De la misma manera en la tabla 2. Plasmamos los datos obtenidos en cada tubo.

TUBO Tiempo PH (Minutos) 0 6 40 70 100 130 160 7 7 7 7 7

absorvancia 0.006 0.039 0.053 0.056 0.073 0.078 Si tomamos nos queda. = 235*4* =94.000 bacterias. Los datos los agrupamos en la tabla 3. un ejemplo en

Tabla 2. Resultados de PH y absorvancias en cada tubo a medida que pasa el tiempo. Como nos podemos dar cuenta los datos obtenidos son lgicos ya que a medida que pasa el tiempo las clulas van a duplicarse lo cual va a aumentar la absorvancia de luz.

tubos

Bacterias totales en cada caja petri. 0 94.000 1320.000 23.200.000

Conteo de E.coli Para este proceso dividimos la caja de petri en cuatro partes y contamos el nmero de bacterias en uno de ellos. Los datos obtenidos son: 102=0 bacterias. 103=235

284.000.000 Tabla 3.numero de bacterias (E.coli) En 102 el nmero de bacterias fue nulo y las causas pueden ser varias algunas que podemos mencionar: E.coli no se adapto al medio ya que no se sintetizaron enzimas que permitan

metabolizar los componentes presentes en el medio;la celula pudo ser daada por calor toxicos,radiaciones, entre otros.

CUESTIONARIO 1. METODOS DIRECTOS E INDIRECTOS: Los mtodos para el seguimiento de la evolucin de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los mtodos directos se basan en la medida de la evolucin del nmero de clulas vivas (tcnicas de plaqueo) o del nmero de partculas (tcnicas microscpicas y de contadores de partcuas). Los mtodos indirectos se basan en la medida de algn parmetro del cultivo que nos permite deducir informacin sobre la evolucin del nmero de microorganismos. La eleccin de un mtodo de seguimiento del cultivo en concreto depende de las caractersticas del cultivo y del proceso. Ejemplo de un mtodo directo e indirecto respectivamente: a) Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula).

Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas extraas (las pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato).

b) Recuento de viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. 2. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MTODO UTILIZADO EN LA PRACTICA. Una ventaja muy clara es muy rpido.pero slo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del microscopio es muy pequeo y poco

significativo estadsticamente. En bacterias mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol. Este mtodo tambin tiene la desventaja de no poder diferenciar las clulas vivas de las muertas.

4 .FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO Las bacterias enfrentan constantemente condiciones que limitan o impiden su crecimiento. Su habilidad para colonizar un ambiente requiere la capacidad para alternar periodos de rpida divisin celular y de crecimiento nulo.Las caractersticas de las clulas en estos periodos pueden analizarse en el laboratorio en condiciones controladas de temperatura, oxigenacin y composicin del medio de cultivo. Los factores que afectan el crecimiento pueden ser tanto nutricionales como genticos. En el primer punto la clula debe tener una fuente rica de carbono, abundante nitrgeno y otros oligonutrientes para para que los aprovechen y fabriquen su material celular y en el caso de que la falla sea gentica la celula no va a poder adaptarse al nuevo madio y por consiguiente va a morir o me va adar malos rendimientos en el cultivo y ese no es el objetivo. Tambin cave destacar las condiciones del medio de cultivo. Generalmente, los organismos crecen mejor en el pH de su hbitat natural, por ejemplo en el caldo de las bacterias especficamente, E.Coli; la cual tiene los lmites mnimos y mximos de pH entre 4.3 y 9.5; por lo cual no se considera el pH 3 ptimo para el desarrollo de este organismo. De manera general, la temperatura, el pH y otras caractersticas del medio, modifican intensamente el crecimiento y muerte de microorganismos, todos estos factores alteran los ndices o velocidades de las reacciones bioqumicas. Cabe aclarar que hay diferentes tipos de clulas y cada una requiere sus condiciones por ejemplo: Cuatro grupos de microorganismos con relacin a su temperatura optima: psicrofilos con temperatura optimas bajas 15C; mesofilos con temperaturas optimas

3. CURVA DE CRECIMIENTO: Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lag en la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metablica para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es variable y en general es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuando los microorganismos empiezan a duplicarse exponencialmente, pero las velocidades de crecimiento pueden variar esencialmente tal velocidad es influenciada por las condiciones ambientales asi como las caractersticas genticas de la celula.(3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sino que la aparicin de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la que el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias como: liberacin de metabolitos secundarios que se generaron en fase exponencial como estacionaria y esto hace que el medio donde habitan estos microorganismos se vuelva inhspito para el crecimiento microbiano lo cual conduce a infecciones, intoxicacionesy la muerte.

moderadas; termofilos con altas temperaturas optimas por encima de los 45C; e hipertermofilos con temperas optimas muy elevadas 80C. Si hablamos de PH los extremofilos presentan un pH ptimo de crecimiento muy elevado a veces tan alto como pH 10 se denominan alcalofilos. Los microorganismos alcalofilos se encuentran por lo general en hbitat muy bsicos como lagos sodicos y suelos muy carbonatados y tienen aplicacin industrial porque producen enzimas hidroliticas como proteasas y lipasas que funcionan bien a pH alcalino y se usan como aditivos de los detergentes domesticos. . CONCLUSIONES ---En nuestra practica no podemos decir que el conteo realizado en el cultivo de E.coli fue adecuado por lo que no contamos con con mtodos rpidos o mejor una automatizacin microbiologca de cuantificacion que nos me permite un campo de estudio dinmico que conjunta la utilizacin de mtodos microbiolgicos, para el aislamiento ms efectivo, la deteccin, caracterizacin y enumeracin ms rpida de microorganismos y sus productos en muestras, ambientales o de alimentos. BIBLIOGRAFIA 1.http://www.biologia.edu.ar/microgeneral /tp4.pdf. 2.http://www.scribd.com/doc/15957855/8Cuantificacion-de-microorganismos-porturbidimetria