PROTEÍNAS

Qumica Biolgica I Captulo 4
Protenas

1
NDICE

CAPITULO 4: PROTENAS

4.1. GENERALIDADES
4.2. FUNCIN BIOLGICA
4.3. DEFINICIN
4.4. CLASIFICACIN
4.4.1. SEGN LOS ELEMENTOS QUE LA CONSTITUYEN
4.4.2. SEGN SU FUNCIN
4.4.3. SEGN SU FORMA
4.5. ESTRUCTURA
4.5.1. ESTRUCTURA PRIMARIA
4.5.2. ESTRUCTURA SECUNDARIA
4.5.3. ESTRUCTURA TERCIARIA
4.5.4. ESTRUCTURA CUATERNARIA
4.6. PROPIEDADES FSICO QUMICAS
4.6.1. PROPIEDADES CIDO-BASE
4.6.2. SOLUBILIDAD
4.6.2.1. Efecto del pH
4.6.2.2. Efecto de la fuerza inica
4.6.2.3. Efecto del solvente
4.6.2.4. Efecto de la temperatura
4.7. EJEMPLOS DE PROTENAS FIBROSAS Y GLOBULARES
4.7.1. PROTENAS FIBROSAS
4.7.1.1. Queratina
4.7.1.2. Fibrona
4.7.1.3. Colgeno
4.7.1.4. Elastina
4.7.2. PROTENAS GLOBULARES
4.7.2.1. Mioglobina y Hemoglobina
4.7.2.2. Inmunoglobulinas
4.8. ANLISIS DE PROTENAS
4.8.1. CUANTIFICACIN
4.8.1.1. Mtodos qumicos
Protenas

2
4.8.1.2. Mtodos fsicos
4.8.2. SEPARACIN
4.8.2.1. Precipitacin
4.8.2.2. Centrifugacin
4.8.2.3. Electroforesis
4.8.2.4. Cromatografa
4.8.2.5. Dilisis y Ultracentrifugacin
4.8.3. ESTUDIO CONFORMACIONAL
4.8.3.1. Espectroscopia de absorcin
4.8.3.2. Fluorescencia
4.8.3.3. Dicrosmo circular
4.8.3.4. Resonancia magntica nuclear
4.8.3.5. Espectrometra de masa

Protenas

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CAPTULO 4: PROTENAS

4.1. GENERALIDADES

Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en las clulas, constituyendo el 50% o ms
de su peso seco. Se encuentran en todas las partes de cada clula, ya que son fundamentales en todos los
aspectos de la estructura y funcin celulares. Existen muchas clases de protenas diferentes, cada una de ellas
especializada en una funcin biolgica diferente. Adems la informacin gentica es expresada en su mayor
parte por las protenas.
La estructura de las molculas de protena, as como su relacin con su funcin biolgica y actividad
constituyen problemas centrales de la bioqumica actual.

4.2. FUNCIN BIOLGICA

Las protenas desempean gran diversidad de funciones: actan como catalizadores, como elementos
estructurales, en los sistemas contrctiles, como reserva de elementos nutritivos y como vehculos de
transporte, y tambin actan como hormonas y como elementos de proteccin. En sta ltima categora se
hallan las inmunoglobulinas o anticuerpos, formados por los vertebrados en respuesta a los antgenos, es
decir, a sustancias extraas a las especies.

4.3. DEFINICIN

Son polmeros no ramificados formados por o-L-aminocidos unidos covalentemente. Para ser
considerados protena, la cadena debe tener ms de cincuenta aminocidos. Si consideramos como peso
promedio de un aminocido 120 Da, desde el punto de vista de la masa molecular, la masa mnima de una
protena debe ser de 6000 Da aproximadamente.
Tamao de las molculas proteicas. Los pesos moleculares de las protenas muy puras pueden
determinarse empleando mtodos fsicos. Aun entre las protenas que desempean el mismo tipo de funcin
no se pueden establecer generalizaciones sobre el tamao. Diferentes enzimas por ejemplo, poseen pesos
moleculares que varan desde 12000 a ms de 1 milln. El lmite superior del peso molecular de las
protenas slo puede ser establecido arbitrariamente, ya que depende de la definicin de los trminos
protena y molcula, como veremos ms adelante.
Las cadenas polipeptdicas individuales de la mayor parte de las protenas de estructura conocida
contienen de 100 a 300 restos aminocidos. Las cadenas polipeptdicas sencillas de ribonucleasa, de
citocromo C y de mioglobina, que se encuentran entre las protenas pequeas mejor conocidas, contienen
entre 100 y 155 restos aminocidos. Sin embargo, algunas protenas poseen cadenas mucho ms largas, tales
como la seroalbmina (aproximadamente 550 restos) y la miosina (aproximadamente 1800 restos).

4.4. CLASIFICACIN

Se han aislado centenares de protenas diferentes en forma pura y cristalina. Todas ellas contienen
carbono, hidrgeno, nitrgeno y oxgeno, mientras que casi todas contienen azufre. Las hay que contienen
algunos elementos adicionales, particularmente fsforo, hierro, cinc y cobre. Los pesos moleculares de las
protenas son muy elevados, pero por hidrlisis cida, las molculas proteicas dan una serie de compuestos
orgnicos sencillos de bajo peso molecular; son los -aminocidos (fig. 4-1), que difieren entre s en la
estructura de sus grupos R o cadenas laterales. Por lo comn, solamente se encuentran 20 o-aminocidos
distintos como sillares de las protenas.
En las molculas proteicas los sucesivos restos aminocidos se hallan unidos covalentemente entre s,
formando largos polmeros no ramificados. Estn unidos en una ordenacin cabeza a cola mediante unas
uniones amida sustituidas llamadas enlaces peptdicos (fig. 4-1), producidas por eliminacin de los
elementos del agua entre el grupo carboxilo de un aminocido y el grupo o-amino del siguiente. Estas
macromolculas, que reciben el nombre de polipptidos, pueden contener centenares de unidades de
aminocidos. Las cadenas polipeptdicas de las protenas no son, sin embargo, polmeros al azar, de longitud
indefinida, cada cadena polipeptdica posee una especfica composicin qumica, un peso molecular y una
secuencia ordenada de sus aminocidos estructurales y una forma tridimensional.

Protenas

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Fig. 4-1. Aminocidos, sus grupos R y estructura de los pptidos.
(a) Frmula estructural general de los o-aminocidos hallados en las protenas. La porcin recuadrada es comn a
todos los aminocidos; los grupos R son diferentes. (b) Estructura de un tetrapptido.

4.4.1. CLASIFICACIN SEGN LOS ELEMENTOS CONSTITUYENTES

Las protenas se dividen en dos clases principales basndose en su composicin: protenas simples y
protenas conjugadas. Las protenas simples son aquellas que por hidrlisis producen solamente
aminocidos, sin ningn otro producto principal, orgnico o inorgnico. Contienen habitualmente 50% de
carbono, 7% de hidrgeno, 23% de oxgeno, 16% de nitrgeno y de 0 a 3% de azufre. Las protenas
conjugadas son aquellas que por hidrlisis producen no solamente aminocidos, sino tambin otros
componentes orgnicos e inorgnicos. La porcin no aminocido de una protena conjugada se denomina
grupo prosttico. Las protenas conjugadas pueden clasificarse de acuerdo con la naturaleza qumica de sus
grupos protticos (tabla 4-1). De este modo tenemos nucleoprotenas y lipoprotenas, las cuales contienen
cidos nucleicos y lpidos, respectivamente, as como fosfoprotenas, metaloprotenas y gluprotenas.

Tabla 4-1. Algunas protenas conjugadas.

Clase Grupo prosttico % aproximado
en peso
Sistemas nucleoprotenicos
Ribosomas
Virus mosaico del tabaco

Lipoprotenas
|
1
-lipoprotenas del plasma

Glucoprotenas
-globulinas
Orosomucoide del plasma

Fosfoprotenas
Casena (leche)

Hemoprotenas
Hemoglobina
Citocromo c
Catalasa

Flavoprotenas
Succinato-deshidrogenasa
D-aminocido-oxidasa

Metalprotenas
Ferritina
Citocromo-oxidasa
Alcohol-deshidrogenasa
Xantinoxidasa

RNA
RNA

Fosfolpidos, colesterol, lpidos neutros

Hexosamina, galactosa, manosa, cido silico
N-acetil-galactosamina, cido N-acetilneuramnico

Fosfato esterificado a restos de serina

Ferroprotoporfirina
Ferroprotoporfirina
Ferroprotoporfirina

Flavin-nucletido
Flavin-nucletido

Fe(OH)
3

Fe y Cu
Zn
Mo y Fe

50 60
5

79

2
40

4

4
4
3.1

2
2

23
0.3
0.3
0.4

C
H
NH
2
R COOH
(a)
H
2
N
CH
C
NH
CH
C
NH
CH
C
NH
CH
C
OH
H
CH
3
CH
2
CH
2
O
O
O
O
OH
Extremo
aminoterminal
Extremo
carboxiloterminal

(b)
Protenas

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4.4.2. CLASIFICACIN SEGN SU FUNCIN

Las protenas poseen muy diversas funciones biolgicas diferentes. La tabla 4-2 da algunos ejemplos
representativos de los diferentes tipos de protenas, clasificados de acuerdo con su funcin. Las enzimas
representan la clase ms amplia. Se conocen cerca de dos millares de enzimas diferentes, cada uno de los
cuales cataliza un tipo diferente de reaccin qumica. Las enzimas poseen extraordinaria potencia cataltica,
mucha ms que los catalizadores fabricados por el hombre. Son extraordinariamente especficas en su
funcin. La enzima hexoquinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde el trifosfato de
adenosina (ATP) a la glucosa, siendo sta la primera etapa del metabolismo de la glucosa. Otras enzimas
deshidrogenan molculas de combustible. Y otras, como por ejemplo el citocromo c, transfieren electrones
hacia el oxgeno molecular durante la respiracin, o bien, como la DNA polimerasa y las enzimas
activadoras de aminocidos, participan en la biosntesis de componentes celulares. Cada tipo de molcula de
enzima tiene un centro activo, al que se une su sustrato especfico durante el ciclo cataltico. Muchas
enzimas contienen una sola cadena polipeptdica, pero en otras hay varias o muchas cadenas. Algunas
enzimas se hallan ms especializadas y desempean una funcin reguladora adems de su actividad
cataltica; son las llamadas enzimas reguladoras o alostricas. Cmo las protenas catalizan las reacciones
qumicas constituye uno de los problemas principales de la bioqumica moderna.
Otra clase importante de protenas desempea la funcin de almacenar aminocidos como elementos
nutritivos y como sillares para el embrin en crecimiento. Por ejemplo, la ovoalbmina de la clara de huevo,
la casena de la leche y la gliadina de las semillas de trigo.
Algunas protenas desempean una funcin de transporte, para lo cual son capaces de unirse y
transportar tipos especficos de molculas por la sangre. La seroalbmina se une estrechamente a los cidos
grasos libres, y de este modo transporta sus molculas entre el tejido adiposo y otros rganos de los
vertebrados. Las lipoprotenas del plasma sanguneo transportan lpidos entre el intestino, el hgado y los
tejidos adiposos (grasos). La hemoglobina de los eritrocitos de los vertebrados transporta oxgeno desde los
pulmones a los tejidos; los invertebrados poseen otros tipos de molculas proteicas transportadoras de
oxgeno, tales como las hemocianinas.
Otros tipos de protenas actan como elementos esenciales de los sistemas motiles y contrctiles. La
actina y la miosina son los dos elementos proteicos principales de los sistemas contrctiles del msculo; la
actina es una protena filamentosa, larga, constituida por muchas cadenas globulares polipeptdicas y
ordenada como una sarta de cuentas, y la miosina es una molcula semejante a una larga varilla cilndrica,
constituida por dos cadenas polipeptdicas entrelazadas helicoidalmente. En los msculos, estas protenas
estn ordenadas en disposiciones paralelas y se deslizan unas a lo largo de las otras durante la contraccin.
Algunas protenas desempean una funcin protectora o de defensa. Las protenas sanguneas trombina
y fibringeno participan en la coagulacin de la sangre e impiden de este modo la prdida de sangre del
sistema vascular de los vertebrados, pero las protenas protectoras ms importantes son los anticuerpos o
inmunoglobulinas las cuales se combinan con las protenas extraas y as las neutralizan, o con otros cuerpos
que se han introducido en la sangre o en los tejidos de un vertebrado determinado. En realidad el estudio de
los anticuerpos ha conducido a la conclusin de que cada especie de organismo posee su propio conjunto
especfico de molculas proteicas.
Las toxinas, o sea, sustancias que son extremadamente txicas para los animales superiores en
cantidades muy pequeas, representan otro grupo de protenas, que incluye a la ricina de la semilla de ricino,
a la gosipina de las semillas de algodn, a la toxina diftrica y a la toxina de la bacteria anaerobia
Clostridium botulinum, que es responsable de algunos tipos de envenenamiento por alimentos.
Entre las protenas ms interesantes se hallan aquellas que actan como hormonas, tales como la
hormona del crecimiento o somatotropina, una hormona de la glndula pituitaria anterior. La insulina,
segregada por ciertas clulas especializadas del pncreas, es una hormona que regula el metabolismo de la
glucosa; su deficiencia en el hombre provoca la enfermedad conocida como diabetes mellitus.
Otras clases de protenas comprenden a las que actan como elementos estructurales. En los
vertebrados, la protena fibrosa colgeno, es la principal protena estructural extracelular en el tejido
conectivo y en el hueso. Las fibrillas de colgeno colaboran tambin en la formacin de un continuo
estructural uniendo entre s grupos de clulas para formar un tejido. Otras dos protenas de los vertebrados
son la elastina, del tejido elstico amarillo, y la -queratina. El cartlago contiene no solamente colgeno
sino tambin glucoprotenas, que confieren propiedades lubricantes y deslizantes a las secreciones mucosas
y al fluido sinovial de las articulaciones de los vertebrados.
Adems de estas clases principales de protenas, algunas otras tienen funciones poco habituales. Las
araas y los gusanos de seda segregan una solucin espesa de la protena fibrona, la cual se solidita
rpidamente formando un filamento insoluble de fuerza tensil excepcional y que sirve para formar telaraas
y capullos. La sangre de algunos peces que habitan en las aguas antrticas, a temperaturas inferiores a 0C,
contienen una protena que impide el congelamiento de la sangre, y que recibe, muy adecuadamente, el
nombre de protena anticongelante. La monelina es una protena de sabor dulce, encontrada en algunos
frutos; cuando se desnaturaliza no conserva su sabor dulce.
Protenas

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Tabla 4-2. Clasificacin de las protenas por su funcin biolgica.

Tipos y ejemplos Localizacin o funcin
Enzimas
Hexoquinasa
Lactato-deshidrogenasa
Citocromo c
DNA-polimerasa

Protenas de reserva
Ovoalbmina
Casena
Ferritina
Gliadina
Cena

Protenas transportadoras
Hemoglobina
Hemocianina
Mioglobina
Seroalbmina
|
1
-lipoprotena
Globulina que liga hierro
Ceruloplasmina

Protenas contrctiles
Miosina
Actina
Dinena

Protenas protectoras en la sangre de vertebrados
Anticuerpos
Complemento
Fibringeno
Trombina

Toxinas
Toxina de Clostridium botulinum
Toxina diftrica
Venenos de serpientes
Ricina
Gosipina

Hormonas
Insulina
Hormona adrenocorticotrpica
Hormona del crecimiento

Protenas estructurales
Protenas recubrimiento viral
Glucoprotenas
o-queratina
Esclerotina
Fibrona
Colgeno
Elastina
Mucoprotenas

Fosforila glucosa
Deshidrogena lactato
Transfiere electrones
Replica y repara DNA

Protena de la clara del huevo
Protena de la leche
Reserva de hierro en el bazo
Protena de la semilla de trigo
Protena de la semilla de maz

Transporta O
2
en la sangre de los vertebrados
Transporta O
2
en la sangre de algunos invertebrados
Transporta O
2
en el msculo
Transporta cidos grasos en la sangre
Transporta lpidos en la sangre
Transporta hierro en la sangre
Transporta cobre en la sangre

Filamentos estacionarios en las miofibrillas
Filamentos mviles en las miofibrillas
Cilios y flagelos

Forman complejos con protenas extraas
Complejos con algunos sistemas antgeno-anticuerpo
Precursor de la fibrina en la coagulacin sangunea
Componente del mecanismo de coagulacin

Origina envenenamiento bacteriano de los alimentos
Toxina bacteriana
Enzimas que hidrolizan los fosfoglicridos
Protena txica de la semilla del ricino
Protena txica de la semilla del algodn

Regula el metabolismo de la glucosa
Regula la sntesis de corticosteroides
Estimula el crecimiento de los huesos

Cubierta alrededor del cromosoma
Recubrimientos celulares y paredes
Piel, plumas, uas, pezuas
Exoesqueletos de los insectos
Seda de los capullos, telaraas
Tejido conectivo fibroso (tendones, hueso, cartlago)
Tejido conectivo elstico (ligamentos)
Secreciones mucosas, fluido sinovial

Es extraordinario que todas las protenas incluso las que ejercen efectos biolgicos o txicos intensos,
estn constituidas por los mismos 20 aminocidos, los cuales por s mismos no poseen sino poco o ningn
efecto biolgico o txico. La conformacin tridimensional es la que le confiere a cada protena su actividad
biolgica especfica; la conformacin, por su parte, est determinada por la secuencia especfica de los
aminocidos en sus cadenas polipeptdicas.

Protenas

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4.4.3. CLASIFICACIN SEGN SU FORMA

Cada tipo de molcula proteica posee en su estado nativo una forma tridimensional caracterstica que
es conocida como su conformacin. Las protenas pueden clasificarse en dos clases principales, segn su
conformacin (fig. 4-2). Las protenas fibrosas se hallan constituidas por cadenas polipeptdicas ordenadas
de modo paralelo a lo largo de un eje, formando fibras o lminas largas. Son materiales fsicamente
resistentes, insolubles en el agua o en las disoluciones salinas diluidas. Las protenas fibrosas son los
elementos bsicos estructurales en el tejido conjuntivo de los animales superiores, tales como el colgeno de
los tendones y la matriz de los huesos, la -queratina del cabello, cuerno, cuero, uas y plumas, y la elastina
del tejido conjuntivo elstico.

(a) (b)

Fig. 4-2. Protenas fibrosas y globulares.
(a) Esqueleto de la cadena polipeptdica en una protena fibrosa tpica, el colgeno. El trmino estructura
secundaria se refiere a las ordenaciones arrolladas o en zig.zag de la cadena polipeptdica a lo largo de una dimensin.
(b) Plegado tridimensional de una protena globular tpica, la mioglobina. La cadena polipeptdica se halla plegada en
una forma globular compacta llamada estructura terciaria. Los tramos cortos de la cadena polipeptdica de protena
globular pueden tener tambin estructura secundaria helicoidal o en zig-zag. En las protenas oligomricas la ordenacin
empaquetada tridimensional de las cadenas polipeptdicas se conoce por el nombre de estructura cuaternaria.

Las protenas globulares, por otra parte, estn constituidas por cadenas polipeptdicas plegadas
estrechamente de modo que adoptan formas esfricas o globulares compactas (fig. 4-2). La mayor parte de
las protenas globulares son solubles en los sistemas acuosos. Generalmente desempaan una funcin mvil
o dinmica dentro de la clula. De los casi dos millares de enzimas diferentes conocidas hasta ahora casi
todas son protenas globulares, como tambin lo son los anticuerpos, algunas hormonas y muchas protenas
que desempean una funcin de transporte, tales como la seroalbmina y la hemoglobina. Algunas protenas
se hallan situadas entre los tipos fibroso y globular, parecindose a las protenas fibrosas por sus largas
estructuras cilndricas, y a las protenas globulares, por ser solubles en las disoluciones acuosas salinas. Se
encuentran entre ellas la miosina, elemento estructural importante del msculo, y el fibringeno, precursor
de la fibrina, elemento estructural de los cogulos sanguneos.

Protenas

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4.5. ESTRUCTURA. NIVELES DE ORGANIZACIN.

El trmino estructura primaria se refiere al esqueleto covalente de la cadena polipeptdica, y establece
en modo especfico la secuencia de sus restos aminocidos. La
estructura secundaria se refiere a la ordenacin regular y peridica en
el espacio de las cadenas polipeptdicas a lo largo de una direccin. La
estructura secundaria es sobre todo evidente en las protenas fibrosas,
en las que las cadenas polipeptdicas poseen una conformacin
extendida o arrollada longitudinalmente; lo mismo ocurre en
segmentos de cadenas polipeptdicas de las protenas globulares. El
trmino estructura terciaria se refiere al modo como la cadena
polipeptdica se curva o pliega para formar la estructura estrechamente
plegada y compacta de las protenas globulares (fig. 4-2). El trmino
estructura cuaternaria pone de manifiesto cmo se disponen en el
espacio las cadenas individuales polipeptdicas de una protena que
posee ms de una cadena. La mayor parte de las grandes protenas, ya
sean fibrosas o globulares, contienen dos o ms cadenas
polipeptdicas, entre las cuales pueden no existir enlaces covalentes
(fig. 4-2). El trmino ms general de conformacin, se emplea para
referirse a la estructura combinada secundaria, terciaria y cuaternaria
de una protena (fig. 4-3).
Las protenas con dos o ms cadenas polipeptdicas se conocen
por el nombre de protenas oligomricas y sus cadenas componentes
se llaman subunidades o protmeros. Un ejemplo bien conocido de
protena oligomrica es la hemoglobina, pigmento respiratorio de los
eritrocitos de la sangre, que est constituida por cuatro cadenas
polipeptdicas acopladas ntimamente, formando un conjunto globular
compacto de considerable estabilidad a pesar de la carencia de enlaces
covalentes entre ellas. Las protenas oligomricas contienen
habitualmente un nmero par de cadenas polipeptdicas, o que pueden
ser idnticas o diferir en longitud o secuencia aminocido. En las
subunidades de las protenas oligomricas ms pequeas, puede haber
desde dos a doce cadenas.
Puesto que las protenas oligomricas contienen dos o ms
cadenas polipeptdicas, que por lo general no estn unidas
covalentemente entre s, puede parecer impropio, o al menos ambiguo,
referirse a las protenas oligomricas como molculas, y hablar de su
peso molecular. Sin embargo, en muchas cadenas polipeptdicas
individuales se hallan tan estrechamente unidas que la partcula
completa se suele comportar en disolucin como una sola molcula.
Adems, todas las subunidades componentes de las protenas
oligomricas son necesarias para su funcin biolgica.

4.5.1. ESTRUCTURA PRIMARIA

Cuando se somete una protena a hidrlisis completa, quedan en libertad los aminocidos
constituyentes, los cuales pueden ser entonces identificados y su cantidad determinada. Por ejemplo, la
insulina bovina, pequea protena de masa prxima a 6000 Da, est constituida por tres unidades de alanina,
una de arginina, tres de asparagina, seis de cisterna, tres de fenilalanina, cuatro de glicina, cuatro de cido
glutmico, tres de glutamina, dos de histidina, una de isoleucina, seis de leucina, una de lisina, una de
prolina, tres de serina, cuatro de tirosina y cinco de valina. Es sta la composicin global de aminocidos,
informacin de inters sin duda, pero que nada dice acerca de la manera en la cual las unidades se disponen
en la cadena o, en otros trminos, sobre su secuencia u ordenamiento. A esta secuencia nos referimos al
hablar de estructura primaria.
Cada protena se caracteriza por poseer una composicin definida de aminocidos y especialmente por
la secuencia segn la cual las unidades se ordenan (fig. 4-4). El ordenamiento de los aminocidos en cada
una de las protenas sintetizadas por un organismo se realiza segn instrucciones contenidas en los genes. El
orden de las unidades constituyentes del material gentico (nucletidos del ADN) puede asimilarse a un
mensaje en cdigo que indica la secuencia en la cual deben ensamblarse los aminocidos.
Fig. 4-3. Los cuatro niveles
de estructura proteica.
Vase como el estudio de la
conformacin va desde una
estructura simple, como lo es
la estructura primaria, hasta
una compleja, como se ve en
la estructura cuaternaria.
Protenas

9
Veinte aminocidos diferentes pueden constituir, al asociarse mediante enlaces peptdicos, molculas de
protenas de cientos y hasta miles de unidades; el nmero de asociaciones diferentes tericamente posibles es
enorme. Para dar una idea de la magnitud de esos nmeros, basta calcular las combinaciones distintas que se
pueden obtener con los veinte aminocidos, formando cadenas en las cuales slo se presente una vez cada
uno de ellos. El resultado es 2.10
18
variedades diferentes. Si se aumenta el nmero total de unidades y se da
la posibilidad de repetir cualquiera de ellas en distintas proporciones, puede obtenerse una cantidad casi
infinita de polmeros diferentes. Sin embargo, debe aclararse que no todas las combinaciones posibles se dan
en la naturaleza, porque muchas de ellas no tienen capacidad funcional alguna. No obstante, es evidente el
enorme potencial de variacin molecular implcito en la estructura de las protenas.

Fig. 4-4. Representacin simplificada de una porcin secuencial de la estructura primaria de una protena.

Importancia de la estructura primaria de protenas. La secuencia de aminocidos de una protena es
el principal determinante de su conformacin, propiedades y caractersticas funcionales.
Los requerimientos estructurales para que una protena cumpla correctamente su papel fisiolgico son
muy rigurosos. No slo es necesario mantener el nmero y tipo de aminocidos constituyentes; adems, cada
uno de ellos debe ocupar una posicin definida en la cadena. Alteraciones en ese ordenamiento, o
sustituciones de aminocidos, pueden afectar la capacidad funcional de la molcula y hasta tornarla intil.
Como se ver ms adelante, las clulas sintetizan sus protenas ensamblando aminocidos segn
instrucciones precisas. Esta instrucciones estn contenidas en al cido desoxirribonucleico (ADN) que forma
el material gentico.
Modificaciones de ese material (mutaciones) pueden conducir a errores de la sntesis y a la
produccin de protenas anormales. Existe un importante grupo de enfermedades hereditarias que reconoce
este origen.
En general, la estructura primaria de una protena encargada de una funcin determinada, es idntica en
todos los individuos de la misma especie, pero presenta diferencias con la protena homloga de otras
especies. Sin embargo, existen protenas que difieren aun entre individuos de una especie. Estas diferencias
inter e intraespecficas tienen gran inters desde el punto de vista mdico. El organismo humano, y el de
otros animales, tiene la capacidad para detectar la entrada de protenas extraas, distintas en estructura
primaria de las constituyentes de sus propios tejidos, e iniciar una respuesta llamada reaccin inmunitaria.
Esta reaccin lleva a la produccin de anticuerpos especficos, con capacidad para unirse a la protena
intrusa y promover su destruccin. Este tipo de respuesta es uno de los mecanismos de defensa natural
contra agentes extraos.
En este sentido, tiene particular inters el anlisis de la secuencia de aminocidos en protenas
homlogas presentes en organismos de diversos niveles de la escala biolgica. Una protena muy estudiada
desde este punto de vista es el citocromo c, ampliamente distribuido en la naturaleza. Se ha determinado la
secuencia de esta molcula, formada por 104 aminocidos, en numerosas especies. En todas ellas se
comprueba la existencia de 27 posiciones ocupadas siempre por los mismos aminocidos. Estos sitios
invariables son los ms estrechamente relacionados con la funcin. En las restantes posiciones puede haber
diferencias y stas son tanto ms marcadas cuanto ms alejada en la escala filogentico estn las especies a
las cuales pertenecen. Por ejemplo, el citocromo c de caballo difiere del de levadura en 48 restos de
aminoacdicos, mientras el de pollo y el de pato tienen slo 2 aminocidos distintos. Con los datos de
diferencias en la secuencia de protenas se constituyen rboles filogenticos que permiten inferir el curso de
su evolucin y hasta estimar la poca probable en la cual distintos organismos comenzaron a diferenciarse de
un antecesor comn (fig. 4-5).

Protenas

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Fig. 4-5. rbol filogentico del citocromo c.
La matriz de la figura se puede emplear para determinarlas diferencias entre las especies. Por ejemplo, el citocromo
c de la rana toro difiere del citocromo c del pato de Pekn en 11 residuos, pero ste difiere del citocromo c del pingino
en slo 3 residuos. Se puede concluir que los patos de Pekn estn ms relacionados con los pinginos que con las ranas
toro.

Protenas

11
4.5.2. ESTRUCTURA SECUNDARIA

La disposicin espacial que adopta la cadena polipeptdica depende de la orientacin de los enlaces
entre los tomos CNCo que se suceden en forma repetitiva constituyendo la columna vertebral de la
protena. El enlace peptdico posee un carcter intermedio entre el de un enlace simple y uno doble, lo cual
otorga cierta rigidez a la unin CN y no permite la libre rotacin de esos tomos. Esta limitacin tiene
varias consecuencias: a) Los cuatro tomos directamente vinculados con el enlace peptdico (C, O, N e H) y
los dos Co unidos al carbono y al nitrgeno se encuentran en un mismo plano (fig. 4-6a); b) El O del
carbonilo (=CO) y el H unido al nitrgeno quedan en posicin trans, al igual que los dos Co; c) La cadena
lateral (R) y el H unido al carbono o se proyectan fuera del plano que contiene a los otros tomos.
Las uniones de los carbonos o (CoC y NCo) son simples (tipo sigma) y permiten libre rotacin (fig.
4-6b). En consecuencia, la orientacin que adopten esos enlaces determinar la disposicin de la cadena en
el espacio.

Fig. 4-6. (a) Modelo molecular de una unin peptdica. Los cuatro tomos directamente vinculados al enlace peptdico
(C, O, N e H) se encuentran en el mismo plano, al igual que los Co unidos al C y al N. los Co pueden rotar libremente.
(b) Rotacin de los enlaces en uniones peptdicas. Slo pueden rotar las uniones N-Co y Co-C=O; los ngulos de
rotacin son designados | (phi) y (psi) respectivamente. Se muestra la conformacin extendida, en la cual | y tienen
un valor de +180.

Uno de los mtodos que ms ha contribuido al conocimiento de la estructura d protenas ha sido el de
difraccin de rayos X. el estudio mediante rayos X de cristales de protenas altamente purificadas, permite
obtener diagramas de difraccin, en los cuales es posible reconocer la disposicin espacial de los tomos que
componen la molcula otras tcnicas utilizadas en el anlisis estructural de protenas son dispersin ptica
rotatoria, dicrosmo circular, resonancia nuclear magntica y espectrometra de masa.
A fines de la dcada del 40, Mailing y Corey realizaron un anlisis de longitudes de enlaces y de los
ngulos formados por los mismos. Estudios mediante distraccin de rayos X confirmaron los modelos
tericos y permitieron a esos autores proponer dos tipos de estructuras peridicas, repetitivas, para las
protenas: la hlice y la hoja plegada o lmina (las letras o y | slo indican el orden en el cual ambas
estructuras fueron propuestas por los investigadores mencionados).
Hlice . Frecuentemente la disposicin de la cadena determina su enrollamiento sobre un eje central,
como si estuviese envolviendo un cilindro (fig. 4-7). Una vuelta completa de la hlice cubre una distancia de
0,54 nm a lo largo del eje y requiere 3,6 restos aminoacdicos. Esto significa que cada residuo abarca una
altura de 0,15 nm y un Angulo de 100 alrededor del eje. El giro se hace en el sentido de las agujas del reloj
y por ello se dice que la hlice es dextrgira o derecha. Este tipo de estructura secundaria se mantiene por
uniones puente de hidrgeno.
El enlace de hidrgeno se establece entre dos tomos electronegativos. En la cadena polipeptdica, el
hidrgeno unido al nitrgeno de un resto amina es atrado por el oxgeno de un grupo carbonilo.
En la hlice, cada grupo =CO puede formar un enlace de este tipo con el grupo =NH del resto
aminoacdico situado cuatro lugares ms adelante en la cadena, cuando sta ha dado una vuelta completa y
ambos grupos quedan vecinos (fig. 4-9). La disposicin trans de esos grupos permite la formacin del
puente. Aunque aisladamente el enlace de hidrgeno es dbil, la existencia de gran cantidad de ellos a lo
largo de la hlice hace de sta una estructura muy estable y compacta.
Para que la hlice o pueda formarse, la estructura primaria de be cumplir ciertas condiciones. Por
ejemplo, la presencia de prolina es incompatible con la hlice o pues provoca una torsin de la cadena que
interrumpe la regularidad en la orientacin de los enlaces. El carbono o, incluido en el ncleo pirrolidina de
este aminocido, no puede rotar, forzando una posicin fija en la cadena. Por otra parte, la presencia de
Protenas

12
restos voluminosos, con carga (como los de arginina, lisina, cido glutmico), localizados prximos entre s,
originan fuerzas electrostticas que afectan la disposicin espacial de la cadena e impiden la formacin de
hlices o.

Fig. 4-7. Representacin esquemtica de un segmento de cadena polipeptdica enrollada en hlice .
R indica cadenas laterales de restos aminoacdicos. Las lneas de puntos representan los puentes de hidrgeno que
estabilizan la hlice.

Fig. 4-8. Modelo molecular con esferas y varillas de una hlice .
R representa cadenas laterales de los restos aminoacdicos. Las lneas de puntos indican los puentes de hidrgeno
que estabilizan la hlice (imitado de Corey y Pauling).

Lmina . La cadena polipeptdica se encuentra aqu ms extendida que en la hlice o. Cada residuo
aminocido cubre un espacio 0,35 nm en lugar de 0,15 nm como en la hlice o. Cuando dos o ms cadenas
as extendidas se aparean, pueden establecerse entre ellas puentes de hidrgeno entre grupos =NH de una
con grupos =CO de otra. Se forman as estructuras laminares que presentan un plegamiento en zigzag, como
muestran las figuras 4-9 y 4-10 (estructura en lamina plegada). Si las cadenas apareadas tienen el mismo
sentido (Nterminal Cterminal), se las llama paralelas; si marchan en direcciones opuestas, son
antiparalelas. A veces, una cadena puede hacer un giro y volver sobre s misma, formando una horquilla. En
este caso el apareamiento ser antiparalelo.
En ciertas protenas se presentan otros tipos de estructura secundaria. Una de ellas es la hlice del
colgeno, que se considerar ms adelante.

C O
C
N
H N
C
C R
O
Protenas

13

Fig. 4-9. Esquema de un segmento de lmina formada por dos cadenas polipeptdicas apareadas.
Los enlaces de hidrgeno que mantienen esta estructura estn indicados por lnea de punto. Las cadenas laterales
de aminocidos (R) se encuentran alternativamente por arriba y por debajo de la lmina plegada.

Fig. 4-10. Modelo molecular con esferas y varillas de dos tipos de lmina .
A la izquierda cadenas antiparalelas; a la derecha, paralelas. Las flechas indican la direccin Nterminal C
terminal. C: esferas negras; cadenas laterales: esferas rosadas; O: esferas rojas; N: esferas grises; H: esferas blancas
(imitado de Pauling).

Disposicin al azar. Puede suceder que la cadena polipeptdica no posea una estructura regular, en cuyo
caso se habla de disposicin o enrollamiento al azar. Esto no significa, sin embargo, que la cadena siga una
orientacin imprevisible; en general, se tiende a adoptar la orientacin espacial termodinmicamente ms
favorable.
En una misma molcula suelen encontrarse distintos tipos de estructura secundaria. Una protena
globular, no podra estar constituida en su totalidad por una hlice o, pues en ese caso habra gran
predominio del eje longitudinal y su forma correspondera a una protena fibrosa. Frecuentemente se
encuentran hlices o en varios segmentos de una molcula, conectadas entre s por trozos de disposicin al
azar. Las protenas globulares presentan habitualmente segmentos en hlice, en lmina plegada y al azar (fig.
4-11) y en algunos casos toda la molcula se dispone al azar. Las protenas fibrosas presentan
exclusivamente estructuras en hlice o o lamina |.

Fig. 4-11. Esquema de una protena formada
por la combinacin de hlices y laminas .
Se esquematizan los segmentos de hlice o como
cintas helicoidales y los trozos en lamina |, como
flechas planas (las puntas de las flechas indican la
direccin de la cadena polipeptdica). Estas estructuras
son unidas por tramos con disposicin al azar.

Protenas

14
4.5.3. ESTRUCTURA TERCIARIA

La arquitectura total de la molcula protenica determina una conformacin tridimensional caracterstica
para cada una de ellas. De acuerdo con la forma final se clasifica a las protenas en globulares y fibrosas.
En las protenas fibrosas o fibrilares bastan las estructuras secundarias descriptas para explicar su
conformacin. Toda la molcula puede disponerse en hlice, o en lmina plegada, lo cual determina franco
dominio del eje longitudinal sobre los transversales.
En las protenas globulares, en cambio, si bien pueden existir porciones de la cadena que adoptan
estructuras en hlice o o en lamina |, son necesarios segmentos dispuestos al azar entre las zonas
estructuradas para permitir las acodaduras y plegamientos indispensables a fin de alcanzar conformacin
esferoidal.
La disposicin tridimensional finalmente adoptada por la molcula no es fortuita. Se mantiene gracias a
uniones e interacciones de las cadenas laterales de residuos aminoacdicos del polipptido. Tambin es
necesario tener en cuenta factores de orden termodinmicos. La forma ms estable es aquella de menor
energa libre.
Las fuerzas responsables del mantenimiento de la estructura terciaria son de distinto tipo:
a) Fuerzas de atraccin o repulsin electrosttica. Grupos con carga elctrica, como los NH
3
+

de lisina y arginina, pueden enfrentarse con grupos de signo opuesto (COO
-
de aspartato y
glutamato), formando enlaces inicos, de tipo salino, capaces de mantener aproximadas zonas
distantes de la cadena. Si los grupos tienen igual signo, el efecto ser de repulsin y
alejamiento de los sectores correspondientes.
b) Enlaces de hidrgeno. El oxgeno de un carbonilo de un carboxilo libre de residuos asprtico o
glutmico, o un nitrgeno del ncleo imidazol de histidina, pueden atraer al hidrgeno de
grupos OH de serina, treonina o tirosina, estableciendo puentes de hidrgeno. Ntese que se
trata de uniones entre grupos distintos de los que estabilizan las estructuras secundarias hlice
o o lamina |.
c) Presencia de cadenas hidrofbicas o hidroflicas. La presencia de restos hidrofbicos como los
de leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, triptfano, etc., tiene gran importancia
como determinante de la conformacin de protenas en solucin acuosa. Las cadenas laterales
apolares tienden a alejarse del contacto con el agua y provocan plegamientos que agrupan
restos hidrfobos en el interior de la molcula. La proximidad de esos grupos generan fuerzas
de atraccin, llamadas de van der Waals.
Por otro lado, las cadenas laterales con grupos hidrfilos (COO
-
, NH
3
+
, OH, etc.) tienden
a disponerse hacia el exterior de la molcula, en contacto con el solvente polar.
d) Puentes disulfuro. El enfrentamiento de los grupos sulfhidrilos (SH) de dos residuos cisterna
puede determinar, por oxidacin, el establecimiento de una unin covalente SS, o puente
disulfuro. Este tipo de enlace, frecuente en la estructura de protenas, fija en una relacin de
vecindad inmediata dos zonas a veces muy alejadas en la secuencia.
El esquema de la figura 4-12 resume las fuerzas que contribuyen al mantenimiento de la estructura
terciaria. Ellas sostienen las acodaduras y pliegues de la cadena y determinan la forma general.

Fig. 4-12. Fuerzas que mantienen la estructura terciaria de una cadena polipeptdica.
I. Atracciones electrostticas; II. Puente de hidrgeno; III. Interacciones de cadenas o grupos no polares; IV. Puente
disulfuro; V. Grupos hidroflicos orientados hacia el exterior.

Protenas

15
Plegados distintos para funciones diferentes. Las protenas estructurales, aun siendo tan abundantes y
esenciales en cualquier organismo, slo constituyen una pequea parte de las clases de protenas que poseen.
La mayor parte del trabajo qumico de la clula (sinttico, transportador y metablico) se lleva a cabo con la
ayuda de una gran cantidad de protenas globulares. Estas protenas reciben este nombre debido a que sus
cadenas polipeptdicas se pliegan en estructuras compactas muy distintas de las formas filamentosas y
extendidas de las protenas fibrosas. La mioglobina es una protena globular tpica. Con slo una ojeada a su
estructura tridimensional, comparndola con la de, pongamos por ejemplo, el colgeno, se revela
inmediatamente esta diferencia cualitativa (ver fig. 4-2).
En la actualidad ya sabemos mucho sobre los detalles estructurales de muchas protenas globulares, en
gran medida gracias al uso de mtodos de difraccin de rayos X. a menudo la resolucin (la precisin de
detalles que pueden distinguirse) llega hasta menos de 0,2 nm. Esta resolucin es suficiente para identificar
residuos individuales de aminocidos, de modo que puede seguirse la cadena polipeptdica a lo largo de la
molcula.
A medida que se avanza a travs de la molcula, la cadena polipeptdica est a menudo plegada
localmente, formando alguno de los tipos de estructuras secundarias (hlice o, lmina |, etc.) que ya hemos
explicado. Pero para que la estructura sea globular y compacta, estas regiones tambin deben plegarse unas
sobre otras, formando as la estructura terciaria. La distincin entre las estructuras secundaria y terciaria
puede apreciarse claramente, por ejemplo, en la estructura de la mioglobina (vase fig. 4-2).
Aproximadamente el 70% de la mioglobina es una hlice o, y esa hlice se dobla y pliega para formar una
molcula compacta. Un hueco dentro de esta estructura contiene un grupo prosttico, el hemo. Muchas
protenas globulares llevan grupos prostticos, molculas pequeas que pueden estar enlazadas de modo
covalente o no covalente a la protena y capacitarla para que cumpla funciones especiales. En este caso, el
grupo hemo unido de modo no covalente contiene el lugar de unin del oxigeno de la mioglobina.

Fig. 4-13. Estructuras tipo de las protenas globulares.
El azul indica las hlices o; el naranja, las lminas |; y el verde, las regiones de estructura irregular.
(a) Predominantemente hlice o (haces de hlices). Parte superior: miohemeritrina. Parte inferior: protena de la
cubierta del virus del mosaico del tabaco.
(b) Principalmente lmina |. Parte superior: prealbmina (un dmero). Parte inferior: inmunoglobulina, dominio V
2
.
Ambas son ejemplos de cilindros | antiparalelos.
(c) Hlice o y lmina | mezcladas. Parte superior: piruvato quinasa, dominio 1. Contiene un ejemplo excelente de
cilindro | antiparalelo, que se observa aqu desde la parte superior. Tambin es un tipo de secuencia comn denominada
o/|, en la cual se alternan las regiones o y |. Parte inferior: hexoquinasa, dominio 2. Contiene un ejemplo claro de
lmina | enrollada.

Protenas

16
Cada protena globular posee una estructura terciaria singular, formada por elementos de estructura
secundaria (hlices, lminas, regiones irregulares) plegados de una manera especfica. A medida que
examinemos las protenas, descubriremos que cada conformacin de este tipo est adecuada para el papel
funcional concreto que desempea la protena.
Variedades de la estructura de las protenas globulares: modelos de plegados. A primera vista,
puede parecer que existe un nmero casi infinito de maneras en que las protenas globulares pueden
doblarse. Si examinamos todos los detalles posibles de plegado, esto es cierto. Sin embargo, cuando se
examina un gran nmero de estructuras conocidas, se encuentran determinados motivos y principios
comunes. El primer principio es que la mayora de las protenas estn formadas por ms de un dominio. Un
dominio, es una regin compacta plegada localmente, de la estructura terciaria. Los dominios estn
conectados entre s mediante la hebra polipeptdica que transcurre a lo largo de toda la molcula. Los
dominios mltiples son especialmente comunes en las protenas globulares ms grandes, mientras que las
protenas muy pequeas, como el BPTI, tienden a ser dominios nicos plegados. Como veremos en
apartados posteriores, los distintos dominios suelen realizar funciones diferentes y en ocasiones un tipo
determinado de dominio puede reconocerse en varias protenas diferentes.
Entre las variedades de dominio, Jane Richardson ha reconocido varias clases distintas. Los principales
patrones de plegado son de dos tipos: los que se producen alrededor de un empaquetamiento de hlices o y
los que se construyen sobre un entramado de estructuras de lmina |. En la figura 4-13 se presenta una serie
de ejemplos. El anlisis de las estructuras de centenares de protenas globulares ha concluido a formular
algunas reglas generales que rigen el plegado terciario:
- Todas las protenas globulares poseen un interior y un exterior definidos. Si examinamos las
secuencias de aminocidos de las protenas globulares, no observamos un modelo de
distribucin concreto de los residuos hidrfobos (fig. 4-14a). Pero cuando observamos las
posiciones de los aminocidos en la estructura tridimensional, invariablemente encontramos
que los residuos hidrfobos se sitan principalmente en el interior, mientras que los residuos
hidrfilos estn en la superficie, en contacto con el disolvente (fig. 4-14b).

Fig. 4-14. Distribucin de los residuos hidrfobos e hidrfilos en las protenas globulares.
(a) Secuencia de aminocidos del citocromo c de corazn de caballo. Los residuos hidrfobos (rojo), hidrfilos
(verde) y ambivalentes (blanco) parecen estar dispersos a lo largo de la secuencia.
(b) Estructura tridimensional de la misma protena. Izquierda: obsrvese el modo en que los aminocidos
hidrfobos (que se indican en rojo) se agrupan alrededor del grupo hemo y en el interior de la molcula. Derecha: en una
perspectiva diferente de la misma molcula, se muestran en verde los residuos hidrfilos. Obsrvese que tienden a
ubicarse en la superficie molecular.

(b)
Protenas

17
- Las lminas estn generalmente enrolladas, o envueltas en estructuras cilndricas. Pueden
observarse ejemplos claros en la figura 4-13. En la mayora de los casos, las lminas |
enrolladas presentan un enrollamiento a izquierdas, cuando se examinan en una direccin
perpendicular a los ejes de las cadenas (por ejemplo, vase la hexoquinasa, dominio 2, fig. 4-
13). Se ha argumentado que esta tendencia de las lminas | hacia un enrollamiento a izquierdas
es consecuencia de la configuracin L de los residuos de aminocidos. Es probable que la
estructura de la fibrona de la seda no sea exactamente plana, como se representa en la figura 4-
21, sino ligeramente enrollada.
- La cadena polipeptdica puede doblar las esquinas de diversas maneras, para ir desde un
segmento o una hlice al siguiente. Una clase de giro compacto se denomina giro | (fig. 4-
15). Existen distintas variedades de giro |, y cada una de ellas puede lograr una inversin
completa de la direccin de la cadena polipeptdica en slo cuatro residuos; el carbonilo del
residuo i unido por enlace de hidrgeno al hidrgeno amida del residuo i+3. En el giro , que es
incluso ms estrecho, el enlace es con el residuo i+2 (fig. 4-16). La prolina suele participar en
los giros, como en la figura 4-16, y tambin como fragmentador de hlices o, dado que este
residuo no puede acomodarse en la hlice. Las vueltas y giros se producen con ms frecuencia
en la superficie de la protena.

- No todas las partes de las protenas globulares pueden clasificarse convenientemente como
hlice , lmina o giros. Por ejemplo, el examen de la figura 4-13 revela en las cadenas
muchos pliegues y bucles de contorno extrao (las regiones que aparecen en color verde). En
ocasiones se las ha denominado regiones de ovillo aleatorio, aunque este trmino es
inapropiado, puesto que tales secciones de la cadena no son flexibles del mismo modo que lo
es un verdadero ovillo aleatorio. Ms bien cada regin concreta presenta su propio plegado
particular, exactamente el mismo en cada ejemplo de la molcula de protena concreta.
Conocemos esta regularidad porque los estudios de difraccin de rayos X muestran la misma
disposicin en todas las molculas del cristal. Podramos denominarlas regiones estructuradas
irregularmente. Algunas protenas tambin presentan regiones de ovillo aleatorio verdadero,
que suelen hallarse en el N o Cterminales.
En algunas protenas el plegado est dominado por un grupo prosttico. La mioglobina es un ejemplo de
ello. A pesar de que la mioglobina puede describirse aproximadamente como un manojo de hlice o, la
estructura terciaria de esta protena se ha distorsionado para formar una jaula hidrfoba alrededor del
voluminoso grupo hemo.

Fig. 4-15. Ejemplos de giros .
Cada uno de estos tipos de giro permite un
cambio brusco de la direccin de la cadena
polipeptdica. En el giro tipo II, el residuo 3
suele ser glicina, presumiblemente porque un
grupo R voluminoso presentara conflictos con
el oxgeno carbonilo del residuo 2.
Fig. 4-16. Giro .
Slo un residuo se encuentra fuera de la
secuencia del enlace de hidrgeno. En este
caso es una prolina, que en ningn caso
puede formar un enlace de este tipo.
Protenas

18
4.5.4. ESTRUCTURA CUATERNARIA

Hasta aqu se ha hablado de las protenas como constituidas por una cadena polipeptdica. Pero existen
muchas formadas por ms de una; se trata de protenas oligomricas, en las cuales cada una de las cadenas
representa una subunidad. Por ejemplo, la insulina est formada por dos subunidades, la hemoglobina y la
enzima lactato deshidrogenada, por cuatro, etc.
La estructura cuaternaria refiere a la disposicin espacial de las subunidades polipeptdicas
constituyentes de esas molculas complejas. Las fuerzas responsables de mantener en posicin a las
diferentes subunidades son puentes de hidrgeno, atracciones electrostticas, interacciones hidrofbicas,
puentes disulfuro entre cisternas, etc. Es obvio que slo las protenas cuyas molculas estn formadas por
varias subunidades polipeptdicas pueden presentar estructura cuaternaria (fig. 4-17).

Fig. 4-17. Estructura cuaternaria.
Se muestran esquemticamente la disposicin de subunidades polipeptdicas para formar una protena oligomrica
(tetramrica).

4.6. PROPIEDADES FSICO-QUMICAS

4.6.1. PROPIEDADES CIDO-BASE

Esta propiedad se debe a la existencia de:
- Grupos ionizables de las cadenas laterales de los aminocidos Asp, Glu, Lys, Arg, His, Tyr, Cys.
- Grupos COOH y NH2terminales (Tabla 4-3.)
por este motivo, las protenas poseen un considerable poder amortiguador en una amplia zona de pH.
Aunque cada AA tiene unos grupos ionizables con unas constantes de ionizacin (pKa) caractersticas, el
valor de dichas constantes puede verse ligeramente modificado por el entorno proteico. El grupo imidazol
del AA histidina es el principal responsable del poder amortiguador de las protenas a pH fisiolgico, ya que
su pKa est prximo a 7.
Cuando el pH es bajo, los grupos ionizables estn protonados, y la carga neta de la protena es de
signo positivo.Cuando el pH es alto, los grupos ionizables estn desprotonados, y la carga neta es de
signo negativo. Entre ambas zonas, habr un pH en el cual la carga neta de la protena es nula. Es el pH
isoelctrico o punto isoelctrico, y es caracterstico de cada protena (Esquema pag 19).
A valores de pH por debajo del pH isoelctrico la carga neta de la protena es positiva, y a valores de pH por
encima del pH isoelctrico, la carga neta de la protena es negativa. La mayora de las protenas
intracelulares tienen carga negativa, ya que su pH isoelctrico es menor que el pH fisiolgico (que est
proximo a 7). Se llaman protenas cidas a aquellas que tienen un punto isoelctrico bajo (como la pepsina),
y protenas bsicas a las que tienen un punto isoelctrico alto (como las histonas).

Protenas

19
Tabla 4-3. Valores de los pK de los grupos ionizables de las protenas

Grupo ionizable Equilibrio de disociacin pK tpico
*

Carboxilo
terminal
3.1
cidos asprtico
y glutmico
4.4
Histidina

6.5
Amino terminal

8.0
Cistena

8.5
Tirosina

10.0
Lisina

10.0
Arginina

12.0
*
Los valores de pK dependen de la temperatura, de la fuerza inica y del microentorno del
grupo ionizable
Protenas

20

4.6.2. SOLUBILIDAD

Las protenas en disolucin muestran cambios profundos de su solubilidad, en funcin de: 1) el pH; 2) la
fuerza inica; 3) las propiedades dielctricas del disolvente y 4) la temperatura. Estas variables que son
reflejo del hecho de que las protenas son electrolitos de peso molecular muy grande, pueden utilizarse para
separar mezclas de protenas, ya que cada protena posee una composicin en aminocidos caracterstica, la
cual determina su comportamiento como electrolito.

4.6.2.1. EFECTO DEL pH

La solubilidad de la mayor parte de las protenas globulares se halla profundamente influida por el pH
del sistema. La figura 4-18 muestra que la solubilidad de la |-lactoglobulina, una protena de la leche, es
mnima cuando el pH se encuentra entre 5,2 y 5,3, independientemente de la concentracin de cloruro de
sodio presente. A cada lado de este valor crtico del pH, la solubilidad experimenta un incremento muy
agudo. Casi todas las protenas globulares muestran un mnimo de solubilidad, aunque el pH al que ello
ocurre vara de una protena a otra.

Fig. 4-18. Efecto del pH y de la concentracin salina sobre la solubilidad de la |-lactoglobulina a 25C. Las cifras
dan la concentracin de NaCl.

El pH al que una protena muestra un mnimo de solubilidad es su pH isoelctrico, definido como aquel
valor de pH al que la molcula no posee carga elctrica y es incapaz de desplazarse en un campo elctrico
(tabla 4-4). En estas condiciones no existe repulsin electrosttica entre molculas de protenas vecinas y
tienden a coalescer y precipitar. Sin embargo, cuando los valores de pH estn por encima o por debajo del
punto isoelctrico, todas las molculas de protena poseen una carga elctrica neta del mismo signo. Por
dicha razn, se repelen mutuamente, impidiendo la coalescencia de las molculas sencillas para formar
agregados insolubles. Algunas protenas son virtualmente insolubles en sus pH isoelctricos.

Protenas

21
Tabla 4-4. Puntos isoelctricos de algunas protenas.

pH isoelctrico
Pepsina
Ovoalbmina
Seroalbmina
Ureasa
|-lactoglobulina
1
-globulina
Hemoglobina
Mioglobina
Ribonucleasa
Quimotripsingeno
Citocromo c
Lisozima
1,0
4,6
4,9
5,0
5,2
6,6
6,8
7,0
9,6
9,5
10,7
11,0

Puesto que las diferentes protenas poseen valores de pH isoelctricos tambin diferentes, debido a que
difieren en el contenido de aminocidos con grupos R ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de
otras, mediante precipitacin isoelctrica. Cuando el pH de una mezcla de protenas se ajusta al pH
isoelctrico de uno de sus componentes, la mayor parte o casi todo el componente precipitara, quedando en
la disolucin las protenas cuyos valores de pH isoelctrico se hallen por encima o por debajo de aqul. La
protena isoelctrica precipitada permanece en su conformacin nativa, y puede redisolverse en un medio de
pH apropiado y concentracin salina adecuada.
Para una protena determinada, el pH isoelctrico variar algo segn la composicin inica del medio,
puesto que las protenas pueden unirse a ciertos cationes y aniones. Cuando una disolucin de protena se
dializa a fondo frente a agua destilada para eliminar todos los iones pequeos distintos de H
+
y OH
-
, el pH de
la disolucin resultante se conoce como pH isoinico. El pH isoinico es constante para cualquier protena
determinada.

4.6.2.2. EFECTO DE LA FUERZA INICA

Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las protenas globulares, tal como
muestran las figuras 4-18 y 4-19. A baja concentracin, las sales incrementan la solubilidad de muchas
protenas, fenmeno que recibe el nombre de solubilizacin por salado. Las sales de los iones divalentes
tales como el MgCl
2
y el (NH
4
)
2
SO
4
, son mucho ms eficaces en la solubilizacin de las protenas que las
sales de iones monovalentes tales como el NaCl, el NH
4
Cl y el KCl. La capacidad de las sales neutras para
influir en la solubilidad de las protenas est en funcin de su fuerza inica (fig. 4-18), que constituye una
medida tanto de la concentracin como del nmero de las cargas elctricas existentes en los cationes y los
aniones aportados por la sal. El efecto d solubilidad por salado est causado por cambios en la tendencia a la
ionizacin, de los grupos R disociables de la protena.

Fig. 4-19. Efecto de una sal neutra (K
2
SO
4
) sobre la solubilidad de la carbonil-hemoglobina a su pH
isoelctrico.
La fuerza inica de una disolucin viene dada por Ec
i
z
i
2
, en la que c es la concentracin y z la carga. Cuando la
fuerza inica es baja, la protena se solubiliza por salado, es decir, aumenta en solubilidad. Cuando la concentracin
salina es elevada, disminuye la solubilidad y la protena precipita.

Protenas

22
Por otra parte, a medida que la fuerza inica aumenta, la solubilidad de una protena comienza a
disminuir (fig. 4-19). A una fuerza inica suficientemente elevada, una protena puede ser casi
completamente precipitada de su disolucin, efecto llamado insolubilizacin por salado. La base fsico-
qumica de la insolubilizacin por salado es bastante compleja; uno de los factores que concurren en ella es
que la concentracin elevada de la sal puede eliminar el agua de hidratacin de las molculas de protena,
reduciendo, por tanto, su solubilidad; pero tambin estn implicados otros factores. Cualquiera que sea su
base fsica, la solubilizacin y la insolubilizacin por salado, son procedimientos importantes para la
separacin de mezclas de protenas, ya que las diferentes protenas varan en su respuesta frente a la
concentracin de sales neutras. Las protenas precipitadas por salado retienen su conformacin nativa y
pueden disolverse de nuevo, normalmente sin experimentar desnaturalizacin. El sulfato amnico es el
preferido para precipitar las protenas por salado, debido a su gran solubilidad en agua, lo que permite
alcanzar fuerzas inicas muy elevadas.

4.6.2.3. EFECTO DEL SOLVENTE

La adicin de disolventes orgnicos neutros miscibles con el agua, particularmente etanol o acetona,
disminuye la solubilidad de la mayor parte de las protenas globulares en el agua, de tal manera que
precipitan de su disolucin. El estudio cuantitativo de este efecto muestra que la solubilidad de una protena
a un pH o fuerza inica determinados est en funcin de la constante dielctrica del medio. Puesto que el
etanol posee una constante dielctrica menor que a del agua (tabla 4-4), su adicin a una solucin acuosa de
protena incrementa la fuerza de atraccin entre las cargas opuestas, disminuyendo de este modo el grado de
ionizacin de los grupos R de la protena. Como resultado, las molculas de protena tienden a agregarse y
precipitan. Las mezclas de protenas pueden separase basndose en las diferencias cuantitativas de su
solubilidad en mezclas fras de etanol-agua y de cetona-agua. Una desventaja de este mtodo es que al poder
estos disolventes desnaturalizar a las protenas a temperaturas superiores, la temperatura a la que se trabaja
debe mantenerse muy baja.

Tabla 4-5. Constantes dielctricas de algunos lquidos a 20C.

Lquido Constante dielctrica (D)
Agua
Metanol
Etanol
Acetona
Benceno
Hexano
80
33
24
21,4
2,3
1,9

4.6.2.4. EFECTO DE LA TEMPERATURA

Dentro de una fluctuacin limitada entre los 0 y los 40C aproximadamente, la mayor parte de la
solubilidad de las protenas globulares aumenta al aumentar la temperatura, aunque existen algunas
excepciones, como ocurre con los electrolitos sencillos. Por encima de los 40 y los 50C, la mayor parte de
las protenas aumentan en inestabilidad y comienzan a desnaturalizarse, generalmente con prdida de
solubilidad en la zona neutra de pH. Los procedimientos de fraccionamiento de protenas se realizan por
norma general a 0C o a temperaturas de refrigerador, ya que la mayor parte de las protenas son estables a
bajas temperaturas; sin embargo, existen excepciones. Algunas protena son ms estables y su solubilidad es
mxima a temperatura ambiente o a la temperatura de su entorno celular normal.
Utilizando estos cuatro parmetros bsicos de la solubilidad de las protenas, a saber. pH, fuerza inica,
constante dielctrica, y temperatura, E. J. Cohn y J. T. Edsall y sus colaboradores en Harvard Medical
School durante la segunda guerra mundial idearon unos procedimientos coronados por el xito para el
aislamiento en gran escala de diversas protenas del plasma sanguneo humano, a saber: la seroalbmina,
utilizada para restaurar el volumen sanguneo en pacientes que haban sufrido prdida de sangre o shock; las
-globulinas sricas, o anticuerpos, de gran utilidad para la inmunizacin contra el sarampin, las paperas y
otras enfermedades; y el fibringeno, que provoca la coagulacin de la sangre. Estos parmetros de
solubilidad todava son muy utilizados, especialmente en las etapas iniciales de la purificacin de protenas,
aunque no proporcionan el elevado grado de resolucin de los mtodos desarrollados ms recientemente.
Protenas

23

4.7. EJEMPLOS DE PROTENAS FIBROSAS Y GLOBULARES

4.7.1. PROTENAS FIBROSAS: MATERIALES ESTRUCTURALES DE CLULAS Y TEJIDOS

Las protenas fibrosas se distinguen de las protenas globulares por su forma filamentosa, o alargada. La
mayora de ellas desempean funciones estructurales en la clula y tejidos animales: mantienen juntos los
distintos elementos. Las protenas fibrosas comprenden las principales protenas de la piel, del tejido
conjuntivo y de las fibras animales como el pelo y la seda. La secuencia de aminocidos de cada una de estas
protenas favorece un tipo concreto de estructura secundaria, que a su vez confiere un conjunto concreto de
propiedades mecnicas adecuadas a la sustancia. La tabla 4-5 indica la composicin de aminocidos de
cuatro ejemplos especficos, que consideraremos a continuacin.

Tabla 4-5. Composicin de aminocidos de algunas protenas fibrosas.

Protenas

24
4.7.1.1. QUERATINA

Dos clases importantes de protenas que tienen secuencia de aminocidos y funciones biolgicas
similares son las - y -queratinas.
Las -queratinas son las protenas ms importantes del pelo y las uas y forman una parte importante
de la piel animal. Las o-queratinas son miembro de un importante grupo de protenas filamentosas
intermedias, que desempean funciones estructurales importantes en los ncleos, los citoplasmas y las
superficies de muchos tipos de clulas. Todas las protenas filamentosas intermedias tienen
predominantemente una estructura de hlice o; de hecho, fue el patrn caracterstico de difraccin de rayos
X de la o-queratina el que Pauling y sus colaboradores buscaron para ilustrar su modelo de hlice o.
La estructura de una o-queratina tpica, como la del pelo, se representa en la figura 4-20. Las molculas
individuales contienen largas secuencias (de ms de 300 residuos de longitud) que son totalmente o-
helicoidales. Pares de estas clulas se enroscan en la estructura de ovillo enrollado a izquierdas que aparece
en la parte inferior de la figura 4-20a. La envoltura mutua es tal que las cadenas laterales de los aminocidos
(la mayora de las cuales son pequeas en la o-queratina; vase la tabla 4-5) forman interdigitaciones. En el
pelo, dos de los ovillos enrollados vuelven a enrollarse juntos para formar protofibrilla de cuatro molculas,
tal como se ve en la parte superior de la figura 4-20b. Finalmente, ocho protofibrillas se combinan en una
disposicin circular o cuadrada para crear la miofibrilla que es la base de la estructura del pelo (fig. 4-20a).
Estos cables enrollados son elsticos y flexibles, pero en los distintos tejidos la o-queratina se endurece, en
mayor o en menor medida, mediante la introduccin de enlaces cruzados disulfuro dentro de los diferentes
niveles de estructura de la fibra. (Obsrvese que la o-queratina presenta un contenido excepcionalmente alto
de cisterna; vase la tabla 4-5). Se dan muchos enlaces cruzados en las queratinas de las uas, mientras que
el pelo presenta relativamente pocos. El proceso de introduccin de una onda permanente en el pelo
humano comporta la reduccin de estos enlaces disulfuro, el reordenamiento de las fibras y la reoxidacin
para colocar las ondas introducidas de este modo.
Las -queratinas, como indica su nombre, contienen mucha ms estructura de lmina |. De hecho,
representaron la segunda clase estructural ms importante descripta por Pauling y sus colaboradores. Las |-
queratinas se encuentran principalmente en aves y reptiles, en estructuras como las plumas y las escamas.

Fig. 4-20. Estructura de ovillo enrollado en la -queratina.
(a) Estructura de las microfibrillas formadas por dos modos distintos de interaccin de las protofibrillas.
(b) Formacin de una protofibrilla a partir de dos ovillos enrollados.
Protenas

25
4.7.1.2. FIBRONA

La estructura de lmina | se utiliza de manera muy elegante en las fibras tejidas por los gusanos de seda
y las araas. La fibrona de los gusanos de seda (fig. 4-21) contiene largas regiones de lmina | antiparalela,
con las cadenas polipeptdicas paralelas al eje de la fibra. Las regiones de la lmina | contienen casi
exclusivamente repeticiones mltiples de la secuencia: [Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala
Gly (Ser Gly Ala Gly Ala Gly)
8
]. Al examinar esta secuencia, que casi un residuo s y otro no
es glicina, y que entre ellos se encuentran residuos de alanina o serina. Esta alternancia permite que las
lminas encajen juntas y se empaqueten una sobre otra del modo que se ve en la figura 4-21. Esta
disposicin produce una fibra que fuerte y relativamente inextensible, debido a que las cadenas unidas de
modo covalente estn extendidas hasta casi su longitud mxima posible. Sin embargo, las fibras son muy
flexibles porque los enlaces entre las lminas implican slo las interacciones dbiles de van der Waals entre
las cadenas laterales, que proporcionan poca resistencia al doblado.

Fig. 4-21. Estructura de la fibrona de la seda.
(a) Perspectiva tridimensional de las lminas | apiladas, con las cadenas laterales en color. La regin que se
presenta slo contiene residuos de alanita y glicina.
(b) Interdigitacin de las cadenas laterales de alanina o serina y las cadenas laterales de glicina en la fibrona. El
plano de corte es perpendicular a las lminas plegadas.

No toda la protena de fibrona est en lminas |. Como muestra la composicin de aminocidos de la
tabla 4-5, la fibrona contiene pequeas cantidades de otros aminocidos voluminosos, como valina y
tirosina, que no encajan en la estructura presentada. stos se encuentran en zonas plegadas compactas que
interrumpen peridicamente los segmentos de lmina | y probablemente dan cuenta de la capacidad de
extenderse que poseen las fibras de seda. De hecho, distintas especies de gusanos de seda producen fibronas
con distintos grados de tales estructuras diferentes a la lmina | y a las que corresponden diferencias de
elasticidad. La estructura completa de la fibrona es un ejemplo notable de molcula proteica que ha
evolucionado para realizar una funcin determinada: para proporcionar una fibra resistente, aunque flexible,
para el capullo del gusano de seda o para la tela de la araa.
Protenas

26
4.7.1.3. COLGENO

Dado que realiza tan extensa variedad de funciones, el colgeno es la protena ms abundante en la
mayora de los vertebrados. En los animales grandes, puede llegar a un tercio de la masa total de protenas.
Las fibras de colgeno forman la matriz, o cemento, el material de los huesos, sobre el que precipitan los
constituyentes minerales; estas fibras constituyen la mayor parte de los tendones, y una red de fibras de
colgeno es un constituyente importante de la piel. Bsicamente, el colgeno mantiene unidos a la mayora
de los animales.
Estructura del colgeno. La unidad bsica de la fibra de colgeno es la molcula de tropocolgeno,
una triple hlice de tres cadenas polipeptdicas, cada una de ellas con aproximadamente 1000 residuos. Esta
estructura helicoidal triple, que se presenta esquemticamente en la figura 4-22, es la nica del colgeno. Las
cadenas individuales son hlices a izquierdas, con aproximadamente 3.3 residuos por vuelta. Tres de estas
cadenas se enrollan una alrededor de las otras a derechas, con enlaces de hidrgeno que se extienden entre
ellas. El examen del modelo revela que cada tercer residuo, que debe encontrarse cerca del centro de la triple
hlice, slo puede ser glicina (vase la figura 4-22a). Cualquier cadena lateral distinta de H sera demasiado
voluminosa. La formacin de las hlices individuales del colgeno tpico tambin resultan favorecidas por la
presencia de prolina o hidroxiprolina en la molcula de tropocolgeno. Un conjunto que se repite en la
secuencia es la forma Gly X Y, donde X suele ser prolina e Y prolina o hidroxiprolina. Sin embargo, en
ocasiones se toleran otros residuos en estas posiciones. Como la fibrona de la seda, el colgeno es un buen
ejemplo de cmo un tipo concreto de secuencia repetitiva dicta una estructura especfica.
El colgeno tambin es excepcional en su extensa modificacin de prolina a hidroxiprolina. La mayora
de los enlaces de hidrgeno entre las cadenas de la triple hlice se establecen entre protones amidas y
oxgenos carbonilo, aunque los grupos HO de la hidroxiprolina tambin parecen participar en la
estabilizacin de la estructura. La hidroxilacin de los residuos de lisina en el colgeno tambin se produce,
pero es mucho menos frecuente. Desempea una funcin distinta, ya que sirve para formar lugares de unin
para los polisacridos.
Estas reacciones de hidroxilacin implican a la vitamina C, el cido ascrbico. Un sntoma de dficit
grave de vitamina C, denominado escorbuto, consiste en el debilitamiento de las fibras de colgeno
provocado por el fallo de la hidroxilacin de prolina y lisina. Las consecuencias son las que podan
esperarse: aparecen lesiones en la piel y las encas, y se debilitan los vasos sanguneos. El trastorno mejora
rpidamente al administrar vitamina C.

Fig. 4-22. Estructura de las fibras de
colgeno.
La protena colgeno est formada por
molculas de tropocolgeno empaquetadas
juntas para formar las fibras. La molcula
de tropocolgeno es una triple hlice.
(a) Estructura primaria de una molcula de
tropocolgeno.
(b) Estructura secundaria de una molcula
de tropocolgeno.
(c) Con pocos aumentos destaca la
estructura secundaria de triple hlice.
(d) Molculas de tropocolgeno alineadas
una al lado de otra de modo escalonado
para formar la fibra de colgeno.

Las molculas individuales de tropocolgeno se empaquetan juntas formando una fibra de colgeno de
una manera especfica (fig. 4-22d). Cada molcula tiene una longitud de aproximadamente 300 nm y se
solapa con su vecina en aproximadamente 64 nm, produciendo el aspecto caracterstico de bandas de las
fibras. Esta estructura proporciona una resistencia notable: las fibras de colgeno de los tendones presentan
una resistencia comparable a la del cable de cobre de alta resistencia.
Protenas

27
Parte de la dureza del colgeno se debe al enlace cruzado entre las molculas de tropocolgeno mediante
una reaccin que utiliza las cadenas laterales de lisina. Algunas de las cadenas laterales de lisina se oxidan
para dar lugar a derivados aldehdos, que a continuacin
pueden reaccionar con un residuo de lisina o bien unos con
otros mediante una condensacin aldlico y deshidratacin
para dar lugar a un enlace cruzado (fig. 4-23). Este proceso
sigue a lo largo de la vida, y los enlaces cruzados que se
acumulan hacen que el colgeno sea cada vez menos elstico y
ms quebradizo. Como consecuencia, los huesos y los tendones
de las personas mayores pueden romperse con mayor facilidad
y la piel pierde gran parte de su elasticidad. Muchos signos que
asociamos con el envejecimiento son consecuencias de este
sencillo proceso de formacin de enlaces cruzados.
Sntesis del colgeno. La triple hlice de tropocolgeno que acaba entrecruzada en una fibra de
colgeno extracelular es muy diferente de la que se sintetiza inicialmente en un ribosoma. En la figura 4-24
se presentan los pasos de esta transformacin, que empieza con la traduccin (paso 1). El polipptido recin
traducido se hidroxila (paso 2) y a continuacin se le aaden azcares (paso 3) para producir procolgeno
(paso 4). Esta molcula contiene alrededor de 1500 residuos, de los cuales aproximadamente 500 estn en
las regiones Nterminal y Cterminal que no tienen la secuencia tpica de la fibra de colgeno descripta
previamente. Tres molculas de procolgeno enrollan sus regiones centrales formando una triple hlice,
mientras que las regiones Nterminal y Cterminal se doblan formando estructuras proteicas globulares. Las
triples hlices de procolgeno se exportan a continuacin al espacio extracelular (paso 5); en este punto las
regiones Nterminal y Cterminal se separan mediante proteasas especficas, dejando slo la triple hlice do
tropocolgeno, con aproximadamente 1000 residuos (paso 6). A continuacin estas molculas se combinan
dando lugar a las formaciones escalonadas que se muestran en la figura 4-22d. Finalmente, la desaminacin
de los residuos de lisina para formar reaccin (paso 7), darn los enlaces cruzados que mantienen juntas a las
molculas formando una fibra dura de colgeno.

Fig. 4-24. Biosntesis y
ensamblaje del colgeno.
El proceso puede visualizarse en
varios pasos. Los pasos 1, 2, 3 y 4 se
producen en el citoplasma de las clulas
sintetizadoras del colgeno; los pasos 6
y 7 se producen en la regin
extracelular.
Gal = galactosa; Glc = glucosa.

Fig. 4-23. Formacin de un enlace
cruzado en el colgeno.
Protenas

28
4.7.1.4. ELASTINA

El colgeno se encuentra en los tejidos en los que se precisa resistencia o dureza, pero otros tejidos,
como los ligamentos y los vasos sanguneos arteriales, necesitan fibras muy elsticas. Estos tejidos contienen
grandes cantidades de la protena fibrosa elastina.
La cadena polipeptdica de la elastina es rica en glicina,
alanina y valina, y es muy flexible y puede extenderse
fcilmente. De hecho, su conformacin probablemente se
parece a la de un ovillo aleatorio, que carece casi totalmente de
estructura secundaria. No obstante, la secuencia tambin
contiene frecuentes cadenas laterales de lisina, que pueden
participar en enlaces cruzados. stos impiden que las fibras de
elastina se extiendan indefinidamente, haciendo que las fibras
vuelvan de golpe a su situacin habitual cuando se elimina la
tensin. Los enlaces cruzados de la elastina son bastante
distintos a los del colgeno, puesto que estn diseados para
mantener juntas a varias cadenas. Pueden combinarse cuatro
cadenas laterales de lisina para producir un enlace cruzado de
desmosina (fig. 4-25). Dado que estn conectados los carbonos
o de cuatro cadenas separadas, slo se precisa una pequea
cantidad de estos enlaces cruzados para convertir a las fibras de
elastina en una red gomosa altamente interconectada.

4.7.2. PROTENAS GLOBULARES: ESTRUCTURA TERCIARIA Y DIVERSIDAD FUNCIONAL

4.7.2.1. MIOGLOBINA Y HEMOGLOBINA

Se desarrollaran en el captulo correspondiente a hemoglobina.

4.7.2.2. INMUNOGLOBULINAS

Existen cinco clases de inmunoglobulinas (anticuerpos), que llevan a cabo distintas funciones en el
sistema inmunitario (tabla 4-6). Sin embargo, todas ellas se construyen a partir del mismo patrn de
inmunoglobulina bsico, que se presenta en un esquema molecular en la figura 4-26.

Fig. 4-26. Modelos esquemticos de una molcula de anticuerpo y un fragmento Fab.
La molcula de anticuerpo se construye con dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas, que se mantienen juntas
mediante enlaces disulfuro. Cada cadena contiene dominios constantes (C) y dominios variables (V). Los dominios
constantes son los mismos en todas las molculas de anticuerpo de una determinada clase, mientras que los dominios
variables confieren especificidad frente a un determinante antignico concreto. La rotura mediante enzimas proteolticas
en la regin bisagra permite la produccin de fragmentos Fab monovalentes. El hidrato de carbono (CHO) unidos a las
cadenas pesadas facilita la determinacin de los destinos de los anticuerpos en los tejidos y la estimulacin de respuestas
secundarias como la fagocitosis.
Fig. 4-25. Formacin de un enlace
cruzado en la elastina.
Ntese que en la desmosina hay cuatro
carbonos o, de cadenas separadas,
conectados.
Protenas

29
Las distintas clases de anticuerpos pueden contener de una a cinco molculas de inmunoglobulina;
cuando hay ms de una, los monmeros estn unidos por un segundo tipo de polipptido denominado
cadena J (vase la tabla 4-6).

Tabla 4-6. Las cinco clases de inmunoglobulinas.

La IgM se produce durante la respuesta inicial contra un microorganismo
invasor. Es la inmunoglobulina ms grande y contiene cinco unidades en forma de Y
con dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas cada una. Las unidades se
mantienen juntas mediante un componente denominado cadena J. el tamao
relativamente grande de la IgM limita su presencia al torrente circulatorio.

Las molculas de IgG, tambin denominadas -globulinas, son los anticuerpos
circulantes ms abundantes. Una variante de ellas se fija a las superficies de las
clulas B. Las molculas de IgG estn formadas por una sola unidad en forma de Y
y pueden atravesar con bastante facilidad las paredes de los vasos sanguneos;
tambin atraviesan la placenta y llevan parte de la proteccin inmunitaria materna al
feto en desarrollo. La IgG desencadena adems un mecanismo importante para la
destruccin de las clulas extraas, que se denomina sistema del complemento.

La IgA se encuentra en las secreciones corporales, como la saliva, el sudor y
las lgrimas, y a lo largo de las paredes del intestino. Es el principal anticuerpo del
calostro, la secrecin inicial mamaria de la madre tras el parto, y de la leche. La IgA
se encuentra en forma de monmero o de agregados de dos unidades de la molcula
proteica en forma de Y. Las molculas de IgA tienden a disponerse a lo largo de la
superficie de las clulas corporales y a combinarse all con los antgenos, como los
situados en la superficie de una bacteria, con lo que impiden que la sustancia extraa
se fije directamente a la clula corporal. La sustancia invasora puede eliminarse
entonces del organismo junto con la molcula de IgA.

Se sabe menos sobre las inmunoglobulinas IgD e IgE. Las molculas de IgD se
encuentran en la superficie de las clulas B, pero no se sabe mucho sobre su
funcin. La IgE se asocia con algunas de las respuestas alrgicas del cuerpo, y sus
concentraciones estn elevadas en los individuos que sufren alergias. Las regiones
constantes de las molculas de IgE pueden unirse frecuentemente a los mastocitos,
un tipo de clulas del tejido conjuntivo que libera histaminas como parte de la
respuesta alrgica. Tanto las IgD como las IgE estn formadas por unidades
sencillas en forma de Y.

Cada monmero de inmunoglobulina est formado por cuatro cadenas, dos cadenas pesadas (M = 53000
cada una) y dos cadenas livianas (M = 23000 cada una), que se mantienen unidas mediante enlaces
disulfuro. En cada cadena existen dominios constantes (idnticos para todos los anticuerpos de una clase
determinada) y un dominio variable. Son las variaciones de la secuencia de aminocidos (y por tanto de la
estructura terciaria) de los dominios variables de las cadenas livianas y pesadas lo que crea la enorme
diversidad de especificidades de los antgenos para distintos determinantes. Obsrvese que los cuatros
dominios variables se encuentran en los extremos de la horquilla en forma de Y de la molcula, en donde
forman dos lugares de unin para los determinantes antignicos.
Una protena grande, un virus o una clula bacteriana tienen en su superficie muchos posibles
determinantes antignicos diferentes. Pueden generarse anticuerpos frente a varios de estos determinantes,
uniendo muchas molculas de antgenos juntas, y de sta manera precipitando el antgeno (fig. 4-27). Si el
antgeno es tan pequeo que slo posee un determinante, se producir la unin pero no habr precipitacin.
La precipitacin requiere que tambin el anticuerpo sea bivalente (es decir, que tenga dos lugares de unin).
Mediante una protelisis cuidadosa, es posible romper los anticuerpos por la regin bisagra (vase fig. 4-26)
para producir fragmentos Fab con un solo lugar de unin cada uno. Estos fragmentos se unirn al antgeno
pero no precipitaran.
Protenas

30

Fig. 4-27. Determinantes antignicos.
Un objeto extrao, o antgeno (como un virus, una clula bacteriana o una protena extraa), puede desencadenar la
produccin de anticuerpos frente a varios determinantes antignicos distintos de su superficie. Cuando el antgeno se
mezcla con su coleccin de anticuerpos, se produce la precipitacin.

El lugar de unin del antgeno se encuentra en el final del extremote los dominios variables y en l
participan aminocidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas. Diferentes secuencias de
estas regiones variables originan distintas estructuras secundarias y terciarias locales y pueden definir de esta
manera lugares de unin adaptados a distintos antgenos. La figura 4-28a muestra los resultados de los
estudios de difraccin de rayos X de la interaccin de un fragmento Fab con un antgeno proteico, la
lisozima. Se establecen contactos estrechos entre 16 aminocidos de la lisozima, y 10 aminocidos de la
cadena pesada y 7 de la cadena liviana. Las superficies del antgeno y del anticuerpo encajan juntas de una
forma muy complementaria.

Fig. 4-28. (a) Modelo de la molcula de Ig G a partir de los estudios de difraccin de rayos X.
Las cadenas pesadas estn coloreadas de rojo oscuro y de azul oscuro, y las cadenas livianas correspondientes de
rojo claro y azul claro. Los hidratos de carbono unidos a la cadena pesada estn en verde.
(b) Unin del antgeno por un fragmento Fab.
La unin de un fragmento Fab a un antgeno especfico, la protena lisozima, muestra el estrecho contacto que se
produce entre las superficies del antgeno y el anticuerpo. La cadena ligera del anticuerpo se indica en amarillo, el
fragmento de la cadena pesada en azul, y la molcula de lisozima en verde. El punto rojo corresponde a la glucosa 121
de la lisozima, que encaja ajustadamente dentro de la hendidura existente entre las cadenas livianas y pesadas. Las
superficies de la lisozima y del lugar de unin del anticuerpo encajan ajustadamente juntos, y se establecen diversos
enlaces de hidrgeno especficos a travs de esta superficie.

Los dominios constantes de las cadenas pesadas de la base de la molcula en forma de Y no slo sirven
para mantener las cadenas unidas. Estas regiones actan tambin como efectores, para sealar a los
macrfagos del sistema circulatorio que ataquen a las partculas o clulas que han sido marcadas por la unin
de anticuerpos. Los macrfagos son glbulos blancos grandes que estn especialmente adaptados para la
(a) (b)
Protenas

31
funcin de engullir y digerir las partculas extraas. Adems, las diferentes cadenas pesadas identifican los
tipos de inmunoglobulinas para su descarga a los distintos tejidos, o para su secrecin (vase la tabla 4-6).
Tanto los anticuerpos de la respuesta humoral como las molculas
que intervienen en la respuesta celular contienen elementos de
estructura comn. Los dominios de estas molculas se construyen con
un motivo comn, el pliegue de inmunoglobulina, en el que dos
lminas | antiparalelas se encuentran una frente a otra (fig. 4-29). Esta
estructura constituye probablemente el elemento estructural primitivo
en el proceso evolutivo de la respuesta inmunitaria. De hecho, el
pliegue de inmunoglobulina se encuentra tambin en otras protenas
que intervienen en el reconocimiento celular.

Fig. 4-29. Pliegue de inmunoglobulina.
El pliegue de inmunoglobulina es una estructura comn en los dominios
de muchas protenas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Hay dos
capas de lminas | antiparalelas apiladas una frente a la otra. En este modelo
de una cadena liviana de inmunoglobulina, el pliegue se produce dos veces:
una vez en la regin constante y otra en la regin variable.

Resulta instructivo comparar la familia de protenas de inmunoglobulinas con la familia mioglobina
hemoglobina. En ambos casos, la funcin primaria de las protenas es la unin. En la familia mioglobina
hemoglobina observamos indicios de la evolucin progresiva de mtodos cada vez ms sofisticados para
regular la unin de una molcula concreta (el oxgeno) y para acoplar la unin oxgeno con la unin de CO
2
.
En la familia de las inmunoglobulinas, la evolucin a partir de un motivo sencillo ha conducido a una
enorme diversificacin de la funcin de unin. La evolucin ha dado lugar a un mecanismo que permite la
produccin de una inmensa gama de molculas con distintas capacidades de unin. Distintas tareas requieren
distintos instrumentos para su realizacin.

4.8. ANLISIS DE PROTENAS

4.8.1. MTODOS DE CUANTIFICACIN

4.8.1.1. MTODOS QUMICOS

Mtodo de Kjeldahl
El mtodo de Kjeldahl se utiliza como mtodo de referencia para cuantificar una protena y, a pesar de
lo tedioso e incmodo que resulta, tiene un alto nivel de precisin, con un coeficiente de variacin menor al
1%. Es especialmente adecuado cuando se conoce la proporcin de nitrgeno en la protena y puede
asegurarse la recuperacin total de nitrgeno de la muestra. Esto puede comprobarse con experimentos de
recuperacin, que en la mayora de los casos dan valores muy altos.

Mtodo del biuret
El mtodo se desarroll a partir de la observacin de que el biuret daba un complejo de color prpura al
reaccionar con una solucin alcalina de sulfato de cobre. En ausencia de otro ms adecuado se ha mantenido
el nombre de biuret, a pesar de que su semejanza qumica en la cuantificacin de protenas es confusa. Si se
ha utilizado, sin embargo, para dilucidar la naturaleza del complejo de cobre formado (fig. 4-30). Los iones
cobre forman un complejo de coordinacin con los cuatro cuerpos NH nucleoflicos, que en la reaccin con
las protenas provienen de los enlaces peptdicos de los aminocidos. El complejo muestra mximos de
absorcin a 330 y 545 nm (fig. 4-31). La absorbancia generalmente se mide a 545 nm, pues aunque es mayor
la sensibilidad a 330 nm, es ms fcil que se presenten interferencias.

Protenas

32
C
N
NH
2
O
C
NH
2
O
H
Cu
2 +
C
N
H
2
N O
C
NH
2
O
H
C
N
H
2
N O
C
NH
2
O
C
N
NH
2
O
C
NH
2
O
H H

Los compuestos que contiene dos cualesquiera de los grupos siguientes, unidos a travs de un tomo de
carbono o nitrgeno, dan una reaccin similar: CONH
2
, CH
2
NH
2
, C(NH)NH
2
, CSNH
2
.
Algunos polialcoholes, sobre todo la glicerina y el etilenglicol, forman tambin complejos similares,
aunque el mximo de absorcin vara ligeramente respecto al de los complejos cobreprotena.
El reactivo de biuret est formado por una solucin alcalina de sulfato de cobre a la que se aade tartrato
sdicopotsico o citrato sdico para evitar que precipiten los iones cpricos en forma de hidrxido. A veces
se aade yoduro potsico para evitar la reduccin espontnea de los iones cpricos, aunque no suele ser
necesario cuando el sulfato de cobre es puro y se utilizan concentraciones adecuadas de tartrato.
El mtodo es poco susceptible de errores; cumple la ley de BeerLambert hasta concentraciones finales
de protenas de aproximadamente 2 g/L (concentracin en la muestra, 20 g/L), pero las muestras en la que la
concentracin final es menos de 100 g de protena (concentracin en la muestra, 1 g/L) son ya difciles de
medir. El color alcanza su intensidad mxima a los 15 minutos, y es estable durante al menos varias horas.
El mtodo es sencillo, digno de confianza, y se presta fcilmente a la automatizacin, aunque tiene la
desventaja de que no es muy sensible. Todas las protenas reaccionan de una forma similar, mostrando
diferencias muy pequeas entre cada una de ellas.

Mtodo de Lowry
Lowry (1951) comenz la utilizacin para la cuantificacin de protenas del reactivo de Folin y
Ciocalteu, empleados generalmente para detectar grupos fenlicos. Este reactivo en su forma ms sencilla
detecta los residuos de tirosina, debido a su naturaleza fenlica, aunque su sensibilidad se mejora aadiendo
iones cpricos. El complejo cobreprotena formado, utilizando una versin diluida del reactivo de biuret,
produce la reduccin de los cidos fosfowolfrmico y fosfomolbdico, principales constituyentes del reactivo
de Folin y Ciocalteu, dando azul de wolframio y azul de molibdeno. No se conoce la estructura exacta de
estos compuestos, que muestran picos de absorcin anchos en la regin roja del espectro visible (600800
nm). Aproximadamente el 75% de la reduccin que se produce se debe al complejo cobreprotena mientras
que los residuos de tirosina (y en menor extensin los de triptfano) son los responsables de la restante. La
composicin del reactivo de Folin y Ciocalteu es muy compleja, y se prepara calentando a reflujo el
wolframato y el molibdato sdico con cido ortofosfrico. Tambin se aaden otros ingredientes para
aumentar la estabilidad del reactivo, que es normalmente de color amarillo plido, y tiene una vida limitada.
Debido a lo complejo de su preparacin es preferible comprarlo.
Este mtodo es ms sensible que el de biuret y tiene un rango analtico entre 10 g y 1 mg de protena.
La relacin entre la absorbancia y la concentracin de protena no es una lnea recta y hace falta una curva
de calibrado. Algunos iones interfieren en este mtodo, como el potasio o el magnesio, as como algunos
compuestos orgnicos, como el tampn Tris o el EDTA (cido etilendiaminotetraactico). Los compuestos
fenlicos presentes en la muestra tambin reaccionan por este mtodo, lo que tiene particular importancia en
el anlisis de extractos de plantas.

Fig. 4-30. Reaccin del biuret.
Complejo de coordinacin formado en solucin alcalina
entre los iones cpricos y los tomos de nitrgeno
nucleoflicos de cuatro molculas de biuret.

Fig. 4-31. Espectro de absorcin
del complejo protenacobre de la
reaccin del biuret.
Protenas

33
Mtodo de fijacin de colorantes
Es un hecho bien conocido que la presencia de protenas influye en el cambio de color de algunos
indicadores utilizados en las valoraciones cidobase; en este fenmeno se basan una serie de mtodos de
cuantificacin de protenas que utiliza el cambio en la caractersticas de la absorcin de estos colorantes.
Como la presencia de protenas altera el color producido por estos indicadores cuando se utilizan como
indicadores de pH, es fundamental controlar el pH en la cuantificacin de las protenas por medio de estos
mtodos.
El naranja de metilo se une a la albmina, a pH 3.5, con una afinidad mucho mayor que para las otras
protenas, y el complejo que se obtiene presenta una disminucin de la absorbancia a 550 nm. El mtodo no
es vlido para cuantificar protenas en general, ya que la capacidad de enlace del colorante con las distintas
protenas vara considerablemente de una a otra.
El azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue) se ha utilizado mucho para cuantificar protenas; el
complejo con la protena muestra un cambio en el mximo de absorbancia desde 464 hasta 595 nm, de tal
modo que el incremento en la absorbancia a 595 nm puede utilizarse para medir la concentracin de
protenas (fig 4-32). La absorbancia mxima aparece muy rpidamente (2 a 5 minutos) y es estable al menos
una hora.

Fig. 4-32. Espectro de absorcin del complejo
protena-azul de Coomassie G250.
A: curva de absorbancia para el colorante;
B: curva de absorbancia para el complejo
protenacolorante.

El mtodo es adecuado para todas las protenas, aunque la cantidad de colorante ligado puede variar de
una protena a otra en una forma que parece estar relacionada con la proporcin de aminocidos bsicos en
la protena. La albmina de suero bovino, por ejemplo, da unos valores de absorbancia un 60% mayores que
los de la albmina de huevo a la misma concentracin. Por tanto, es importante que la solucin de protena
estndar utilizada tenga la misma composicin que la protena muestra. El control de pH es importante y,
aunque el reactivo est fuertemente tamponado, cualquier muestra muy alcalina puede alterar el pH,
modificando los resultados. Algunos detergentes interfieren en forma significativa dando lugar a un gran
incremento en los valores de la absorbancia.
El mtodo es capaz de detectar niveles de hasta 5 g de protena, siendo necesaria una curva de
calibrado, no solamente por las variaciones entre las diferentes protenas sino tambin debido a la no
linealidad de la relacin absorbanciaconcentracin
El verde de bromocresol se utiliza frecuentemente para cuantificar la albmina, a la que se une
selectivamente a pH 4.2, dando lugar a un gran aumento de la absorbancia a 630 nm. El colorante es de un
color amarillo, mientras que el complejo protenacolorante tiene un intenso color azul (fig. 4-33). Este
mtodo es relativamente especfico para la albmina, y el reactivo es capaz de desplazar a muchas sustancias
que estn unidas a las molculas de protena.

Fig. 4-33. Espectro de absorcin del complejo
albuminaverde de bromocresol.
A: curva de absorbancia del colorante;
B: curva de absorbancia del complejo albumina
colorante.

Protenas

34
El mtodo es sensible, con un lmite de deteccin de 50 g de protena; hasta 0,2 g de relacin entre
absorbancia y la concentracin de protena es lineal.
El uso de verde de bromocresol para medir la albmina es susceptible de algunas crticas. El complejo
coloranteprotena tiende a precipitar a pH 4.2, que est muy prximo al pH isoinico de la albmina. Este
mtodo no es absolutamente especfico para la albmina, sobre todo cuando se analizan muestras de suero,
que tienden a resultar sobrevaloradas. Tambin vara algo la intensidad del color producido con albminas
de diferentes fuentes, lo que hace que la eleccin del estndar sea importante.
Se ha indicado que el prpura de bromocresol tiene mayor especificidad para la albmina y una menor
variacin en la intensidad de color que el verde de bromocresol. El complejo colorantealbumina tiene un
mximo de absorcin a 603 nm, y como se utiliza un reactivo tamponado a pH 5.2, se reduce
apreciablemente la tendencia del complejo a precipitar.

4.8.1.2. MTODOS FSICOS

La facilidad con que se precipitan muchas protenas ha dado como resultado una amplia serie de
mtodos para su cuantificacin basados en este fenmeno. Para ello se utilizan reactivos especficos para su
precipitacin, y la turbidez producida se compara con la producida por una concentracin conocida de
protena. Se usan algunos cidos orgnicos, tales como el cido tricloroactico, el cido pcrico, o el
salicilsulfnico, y la turbidez resultante se mide o bien por comparacin visual o fotomtricamente. Los
anticuerpos pueden utilizarse tambin como agentes precipitantes, lo que proporciona un mtodo muy
especfico y de gran sensibilidad cuando la turbidez resultante se mide con un nefelmetro.
El hecho de que el peso especfico de una solucin de protena aumente con el contenido de sta puede
utilizarse como un mtodo cuantitativo sencillo. Se preparan varias soluciones de sulfato de cobre de distinto
peso especfico y se introduce una gota de solucin de protena dentro de cada una de ellas. Los iones
cpricos originan la aparicin de una membrana de protena precipitada alrededor de la gota, manteniendo su
integridad y variando poco su peso especfico. Generalmente la gota cae o flota segn su mayor o menor
peso especfico respecto al de la solucin, permaneciendo en equilibrio cuando ambos coinciden. Se puede
prepara una curva de calibrado o un nomograma a partir de soluciones de protenas de concentracin
conocida, que puede utilizarse para determinar la cantidad de protena que hay en la muestra. El mtodo no
es muy exacto y se ve influido por la presencia de otros solutos adems de las protenas, aunque proporciona
una prueba muy simple, utilizable para comparar entre ellas muestras de composicin similar.

4.8.2. MTODOS DE SEPARACIN

4.8.2.1. PRECIPITACIN

La precipitacin fraccionada con sales, como el sulfato amnico, es un paso tradicional en la
purificacin de protenas que se utiliza todava frecuentemente. En soluciones salinas concentradas unas
protenas son ms solubles que otras, y de este modo puede realizarse una separacin aproximada de
fracciones proteicas.
Las interacciones de los macroiones (como las protenas) se modifican enormemente por la presencia en
la misma solucin de iones pequeos, como los de las sales disueltas. Cada macroin recoge sobre l una
atmsfera contrainica, rica en pequeos iones con carga opuesta, y esta nube de iones tiende a apantallar
las molculas unas de otras (fig. 4-34a). Obviamente, cuanto ms elevada sea la concentracin de pequeos
iones, ms eficaz ser este apantallamiento electrosttico. Sin embargo, la relacin precisa del
apantallamiento con la concentracin es bastante compleja. Una expresin cuantitativa de este efecto para
los macroiones esfricos, propuesta por P. Debye y E. Hckel, se plantea en funcin de un radio efectivo (r)
de la atmsfera contrainica. Este radio puede tomarse como medida de la distancia a la que dos macroiones
sienten la presencia mutua. Segn la teora de DebyeHckel: r = K / I
, donde K es una constante que

depende de la constante dielctrica del medio y de la temperatura, e I es una funcin de la concentracin,
denominada fuerza inica. La fuerza inica se define como: I = M
i
Z
2
i
donde la suma incluye todos los
iones pequeos de la solucin. Para cada clase de in, M
i
es su molaridad y Z
i
es su carga estequiomtrica.
Para un electrolito 1:1 como el NaCl, tenemos Z
Na+
= +1 y Z
Cl-
= 1; y puesto que M
Na+
= M
Cl-
= M
NaCl
,
entonces I
NaCl
= M
NaCl
. De ah que la fuerza inica sea igual a la molaridad de la sal para los electrolito 1:1,
pero esto no es cierto si intervienen iones multivalentes. Estos iones tienen una influencia individual mayor
en la atmsfera inica que los iones monovalentes, como refleja el hecho que se incluya el cuadrado de la
carga del in al calcular la fuerza inica. En estos electrolito, I>M.
Los efectos de la fuerza inica del medio sobre la interaccin entre macroiones cargaos se pueden
resumir como muestra la figura 4-34b. Cuando la fuerza inica es muy dbil, la atmsfera contrainica es
Protenas

35
muy extensa y difusa, y el apantallamiento es ineficaz. En dicha solucin, los macroiones se atraen o se
repelen con fuerza. Si la fuerza inica aumenta, la atmsfera contrainica se contrae y se concentra alrededor
del macroin, y las interacciones de atraccin entre los grupos positivos y negativos se apantallan con
eficacia.
El efecto de apantallamiento de la atmsfera contrainica ayuda a explicar una observacin general
relacionada con la solubilidad de las protenas: el aumento de la fuerza inica (hasta un determinado punto)
aumenta la solubilidad, incluso en el punto isoelctrico. Este efecto de disolver las protenas incrementando
la concentracin salina se denomina salting in.
El aumento de la concentracin salina hasta niveles muy elevados (por ejemplo, superior a varias
unidades molares) causa el efecto opuesto. En soluciones salinas muy concentradas, gran parte del agua que
normalmente solvatara la molcula de protena est enlazada en las capas de hidratacin de numerosos iones
salinos, impidiendo una hidratacin suficiente de la protena. As, con concentraciones salinas
extremadamente altas, la solubilidad de una protena disminuye de nuevo, un efecto denominado salting
out. Puesto que protenas diferentes responden de modo diferentes a esos dos efectos, con frecuencia se
utiliza el salting in y el salting out para purificar las protenas.

Fig. 4-34. Influencia de los iones pequeos sobre las interacciones entre macroiones.
(a) Cuando se coloca un macroin (en este ejemplo, cargado negativamente) en una solucin salina acuosa, los
iones pequeos con signo opuesto tienden a agruparse a su alrededor, formando una atmsfera contrainica. Hay ms
cationes que aniones cerca del macroin que se muestra aqu; lejos del macroin, las concentraciones medias de cationes
e iones son iguales.
(b) Cuando la fuerza inica es baja, la atmsfera contrainica es difusa e interfiere poco con las interacciones de los
macroiones. Cuando la fuerza inica es alta, la atmsfera contrainica se concentra alrededor de los macroiones y reduce
en gran medida sus interacciones.

Los efectos de las interacciones inicas sobre el comportamiento de las macromolculas biolgicas
hacen que el bioqumico deba prestar mucha atencin tanto a la fuerza inica como al pH. Generalmente, los
investigadores utilizan una sal neutra (como NaCl o KCl) para controlar la fuerza inica de una solucin, as
como un tampn para controlar el pH. Para determinar la cantidad de sal que se debe aadir, a menudo
intentan imitar las fuerzas inicas de la clula y de los lquidos corporales. Aunque las fuerzas inicas varan
de una clase de clula a otra o de un lquido a otro, un valor de 0,1 a 0,2 M suele ser adecuado en los
experimentos bioqumicos.

4.8.2.2. CENTRIFUGACIN

Puede decirse que cualquier partcula sometida a un campo centrfugo al girar en un rotor de una
centrfuga est sujeta a una fuerza centrfuga (fig. 4-35). Para una partcula de masa m, esta fuerza viene
dada por: f
c
= m (1 ) e
2
r.

Protenas

36
En esta expresin r es la distancia de la partcula desde el centro
del rotor, que est girando a una velocidad angular de e radianes/s
(e = 2t/60 x RPM, donde RPM es el nmero de revoluciones por
minuto). El factor (1) es el factor de flotacin, que tiene en
cuenta el hecho que la solucin que rodea a la partcula la hace
flotar. Este factor contiene la densidad de la solucin (g/mL) y el
volumen especfico de la partcula (mL/g). El volumen especfico
puede considerarse igual a 1/
p
, donde
p
es la densidad efectiva
de la partcula. Por consiguiente el factor de flotacin (1) = (1
1/
p
). Evidentemente, si
p
= , no hay una fuerza neta sobre la
partcula, ya que sta desplaza su propia masa de solucin; esta
partcula no sedimentar. El movimiento de la partcula encuentra la
resistencia de una fuerza f
r
= f
v
, donde es la velocidad y f es el
coeficiente de friccin. Se establece una velocidad constante de
sedimentacin, donde f
r
= f
c
; por consiguiente: f = m (1 )
e
2
r. Dividiendo la velocidad por la intensidad del campo, siendo la
intensidad del campo centrfugo e
2
r, obtenemos: S = v/ e
2
r = m (1
)/f = M (1 )/Nf, donde M es el peso molecular y N el nmero
de Avogadro. El peso molecular (que es ms correcto denominar
masa molar) es la masa de 1 mol de sustancia, expresada en gramos.
La cantidad S es el coeficiente de sedimentacin. La magnitud S est
definida como velocidad/intensidad de campo, y se expresa en
trminos moleculares (a la derecha) como la proporcin de un factor
que describe la fuerza impulsora respecto a un factor que tiene en
cuenta la resistencia de friccin.
El coeficiente de sedimentacin tiene unidades de segundos. Los valores tpicos para las molculas se
encuentran cerca de 10
-13
s, por lo que esta cantidad se ha designado como 1 unidad Svedberg (S), que toma
el nombre de un pionero de la investigacin sobre la centrifugacin. Por ejemplo, el coeficiente de
sedimentacin de la hemoglobina es de aproximadamente 4.10
-13
s, o 4 S. las partculas celulares suelen
identificarse por su valor de S, por ejemplo: ribosoma 70 S.
Evidentemente, S aumenta con la masa de la partcula, pero la relacin no es lineal ni sencilla, dado que
el coeficiente de friccin, f, aumenta con el tamao de la partcula y tambin depende de la forma de sta. A
pesar e que podemos utilizar la sedimentacin como una medida estimativa del peso molecular, la relacin
es slo aproximada.
Puesto que las partculas o molculas de distinto tamao difieren en cuanto a S, y en consecuencia
tambin difieren en su velocidad de sedimentacin, la sedimentacin es una herramienta til para la
separacin. Se utilizan diversas tcnicas, dependiendo de lo que el investigador desee separar. Si la tarea
consiste sencillamente en eliminar las partculas grandes o agregados de una solucin de molculas. Puede
que sea suficiente una centrifugacin a baja velocidad con un rotor provisto de tubos de Angulo fijo (fig. 4-
35). Por ejemplo, un primer paso en el aislamiento de las protenas suele comportar la fragmentacin de las
clulas y la separacin de las protenas solubles del citosol de los ncleos celulares, los fragmentos de pared
celular, las organelas y otros restos densos. La sedimentacin en un rotor de Angulo fijo a unos pocos miles
de RPM durante 1020 minutos suele ser suficiente para lograr esta separacin. En casos ms difciles,
donde distintos tipos de molculas grandes o partculas deben separarse unas de otras, puede utilizarse la
tcnica de gradiente de sacarosa que se presenta en la figura 4-36. el mtodo de gradiente de sacarosa
produce una mejor separacin que la sedimentacin de Angulo fijo, ya que los componentes se paran en
bandas discretas. Puede utilizarse, por ejemplo, para obtener protenas individuales a partir del sobrenadante
obtenido mediante una centrifugacin a baja velocidad de clulas rotas. Para separar molculas proteicas, se
precisa una velocidad del rotor elevada (a menudo hasta 70000 RPM).
Tambin puede utilizarse la sedimentacin para analizar mezclas, en vez de separarlas
preparativamente. En tales casos se utiliza una ultracentrfuga analtica, en la que puede seguirse el proceso
de sedimentacin de los componentes individuales durante el experimento. Con estos experimentos, pueden
determinarse con exactitud los coeficientes de sedimentacin de las macromolculas, utilizando la ecuacin
de S, vista anteriormente.

Fig. 4-35. Fuerzas que actan
sobre una partcula en un campo
centrfugo en un rotor de ngulo fijo.

Protenas

37

Fig. 4-36. Centrifugacin preparativa que
utiliza el mtodo de gradiente de sacarosa.

4.8.2.3. ELECTROFORESIS

Cuando se aplica un campo elctrico a una solucin, las molcula de soluto con carga neta positiva se
desplazan hacia el ctodo las molculas con carga neta negativa se desplazan hacia el nodo. Este
desplazamiento se denomina electroforesis. La velocidad de las molculas depende de dos factores.
Conduciendo el movimiento est la fuerza ejercida por l campo elctrico sobre la partcula, donde q. es la
carga de la molcula (en Culombios) y es la fuerza del campo elctrico (en voltios/metro). Resistiendo el
movimiento est la fuerza de friccin f., que ejerce el entorno sobre la partcula, siendo la velocidad de la
partcula y f su coeficiente de friccin, que depende del tamao y de la forma de las molculas. Las
molculas grandes o asimtricas encuentran ms resistencia de friccin que las molculas pequeas o
compactas, y por tanto, tienen unos coeficientes de friccin mayores.
Cuando se activa el campo elctrico, la molcula se acelera rpidamente hasta alcanzar una velocidad en
la que estas fuerzas se equilibran y luego se mueven constantemente a esa velocidad. La velocidad constante
viene determinada por el equilibrio de las fuerzas: f = q.
Podemos reformular esta ecuacin como / = q/f para expresar la velocidad del movimiento por unidad
de fuerza de campo, /. Este coeficiente se denomina movilidad electrofortica () de la molcula.
Resumiendo, tenemos que: = / = q/f = Ze/f.
En el lado derecho de la ecuacin, hemos expresado la carga sobre la molcula como el producto de la
unidad de carga del electrn (o protn), e, multiplicado por el nmero de unidades de carga, Z (un nmero
entero, positivo o negativo). Puesto que f depende del tamao y de la forma de la molcula, la ecuacin
Protenas

38
vista, f = q, nos indica que la movilidad de una molcula depende de su carga y de las dimensiones
moleculares. Dado que los iones y los macroiones difieren en ambos aspectos, su comportamiento en un
campo elctrico proporciona una buena manera de separarlos. La separacin electrofortica es uno de los
mtodos ms utilizados en bioqumica.

Electroforesis en papel y Electroforesis en gel
Aunque la electroforesis pueda llevarse a cabo de modo libre en una solucin, es ms conveniente
utilizar alguna clase de medio de soporte. Los dos medios de soporte ms utilizados son el papel y el gel.
La electroforesis en papel (fig. 4-37) suele emplearse para separar mezclas de molculas pequeas
cargadas. Se extiende un trozo de papel de filtro humedecido con una solucin tampn para controlar el pH,
entre dos cubetas que contienen electrodos. Se coloca en el papel una gota de la mezcla que se va a analizar
y se aplica la corriente elctrica. Cuando las molculas se han desplazado durante un perodo de tiempo
suficiente, generalmente varias horas, se retira el papel, se seca y se tie con un colorante que da color a las
sustancias que se van a examinar. Cada clase de molcula cargada de la mezcla se habr desplazado una
distancia determinada hacia el nodo o hacia el ctodo, dependiendo de su carga y dimensiones, y aparecer
como una mancha coloreada en el papel en la nueva posicin. Normalmente las manchas suelen identificarse
comparndolas con una serie de patrones que han corrido en el mismo papel. Si las sustancias reconocidas
son radiactivas, se pueden recortar las manchas su medir su radiactividad mediante recuento de centelleo.

Fig. 4-37. Electroforesis en papel.

La electroforesis en gel (fig. 4-38) es una tcnica muy utilizada con las protenas y los cidos nucleicos.
Se coloca un gel que contenga la solucin tampn adecuada a modo de lmina entre dos placas de cristal.
Los materiales ms corrientes son la poliacrilamida, un polmero reticulado soluble en agua, y la agarosa, un
polisacrido. La lmina se coloca entre los compartimentos de los electrodos, seleccionando la parte inferior
como nodo o ctodo, dependiendo de si se van a separar aniones o cationes. Con una pipeta, se coloca
cuidadosamente una pequea cantidad de una solucin de cada muestra en cada una de las muescas
practicadas previamente en la parte superior del gel. Generalmente, se aade a la muestras glicerol y un
colorante de localizacin catinico o aninico soluble en agua. El glicerol hace que la solucin de la
muestra sea densa, de modo que no se mezcle con la solucin tampn de la cmara del electrodo superior. El
colorante se desplaza ms rpidamente que la mayora de los macroiones, de modo que el investigador puede
seguir la evolucin del experimento con facilidad. La corriente se mantiene conectada hasta que la banda del
colorante de localizacin est cerca de la parte inferior de la lmina. Entonces se retira el gel de entre las
placas de cristal y generalmente se tie con un colorante que se une a las protenas o a los cidos nucleicos.
En este momento, se toma una fotografa del gel para poder guardar la informacin obtenida. Dado que la
mezcla de protenas o de cidos nucleicos se aplic en forma de banda estrecha en la parte superior del gel,
los componentes que se desplazan con movilidades diferentes aparecen como bandas estrechas en el gel,
aunque las bandas puedan ensancharse en cierta medida por difusin. Algunas tcnicas permiten estrechar
todava ms las bandas, de modo que cada clase de macroiones aparecen como lneas estrechas en el gel; la
figura 4-39 muestra un ejemplo de separacin de fragmentos de DNA con ste mtodo. La movilidad
relativa de cada componente se calcula a partir de la distancia que se ha desplazado con relacin al colorante
de localizacin.

Protenas

39

Principios de separacin en la electroforesis en gel. Cuando la electroforesis se realiza en un gel o en
otro medio de soporte, la movilidad es inferior a la que cabra de esperar segn la ecuacin: f = q, debido a
que el gel u otra matriz muestra un efecto de tamizado molecular. Esto puede verse representando
grficamente la movilidad como una funcin de la concentracin del gel (fig. 4-40a). Generalmente, una
grfica del logaritmo de frente al porcentaje del gel es lineal; esto se denomina una representacin de
Ferguson. La movilidad lmite que se aproxima cuando el porcentaje del gel se acerca a cero se denomina
movilidad libre; se puede determinar, aproximadamente, mediante la ecuacin anterior. La inclinacin de la
representacin de Ferguson depende del tamao y de la forma del macroin, puesto que refleja la dificultad
que experimenta el macroin cuando pasa a travs del entramado molecular del gel.
Como resultado de estos diversos factores, diferentes clases de molculas pueden mostrar
comportamientos muy diferentes en la electroforesis en gel (fig. 4-40b). Sin embargo, algunos casos simples
tienen gran importancia. Los polielectrolitos como el DNA o la molcula de polilisina tienen una unidad de
carga en cada residuo, de modo que cada molcula tiene una carga (Ze) proporcional a su longitud
molecular. Pero el coeficiente de friccin (f) tambin aumenta con la longitud molecular, de modo que en
una primera aproximacin, un macroin cuya carga es proporcional a su longitud tiene una movilidad libre
casi independiente de su tamao. En una mezcla de esta clase de molculas, el efecto de tamizado molecular
determina las movilidades relativas en cualquier concentracin de gel dada (fig. 4-40c) y el efecto de
tamizado es proporcional a la longitud molecular o al peso molecular. Esto significa que, mediante la
electroforesis en gel, podemos separar perfectamente dichas molculas basndose slo en su tamao, como
muestra la figura 4-38. Para las molculas alargadas, como los cidos nucleicos, la movilidad relativa suele
ser, aproximadamente, una funcin lineal del logaritmo del peso molecular (fig. 4-40d). Normalmente, en
una o ms calles del gel se colocan patrones de peso molecular conocido. Entonces se puede leer el peso
molecular en una grfica como la de la figura 4-40d obtenida a partir de estos patrones de referencia.
Enfoque isoelctrico. Existe otra tcnica de electroforesis en gel, que permite separar las molculas
nicamente segn sus caractersticas de carga. Un polianflito se desplazar en un campo elctrico como
otros iones, si tiene una carga neta positiva o negativa. Sin embargo, en su punto isoelctrico, su carga neta
es cero y no es atrado ni hacia el nodo ni hacia el ctodo. Si empleamos un gel con un gradiente de pH
estable que cubra un amplio intervalo de pH, cada molcula de polianflito se desplaza hacia la posicin de
su punto isoelctrico y se acumula en ese lugar. Podemos establecer un gradiente as, utilizando como
tampn del gel una mezcla de anflitos de bajo peso molecular. Este mtodo de separacin, denominado
enfoque isoelctrico, da lugar a bandas bien diferenciadas de polianflitos acumulados y puede separar
molculas con diferencias muy pequeas de punto isoelctrico (fig. 4-41). Puesto que se conoce el pH de
cada porcin del gel, el enfoque isoelctrico tambin puede utilizarse para determinar el punto isoelctrico
de un polianflito concreto.
Fig. 4-38. Electroforesis en gel. Fig. 4-39. Gel que muestra la separacin de
fragmentos de DNA
Protenas

40

Fig. 4-40. Movilidad de las partculas en la electroforesis en gel.
La movilidad de las partculas toma valores diferentes en funcin de la concentracin del gel. Una representacin
de Ferguson dispone el logaritmo de la movilidad relativa () frente al porcentaje de gel en la matriz.
(a) Representacin de Ferguson para una sola clase de molcula. Si se lleva la representacin hasta el 0% de gel, se
obtiene la movilidad libre terica de la molcula.
(b) Representacin de Ferguson para cuatro molculas con tamao y carga diferentes. Obsrvese que las
movilidades libres dependen ms de la carga que del tamao, mientas que la pendiente depende principalmente del
tamao.
(c) Representacin de Ferguson para molculas con carga proporcional a su longitud. Las molculas estn
numeradas en orden de longitud y carga crecientes. Las movilidades libres de dichas molculas son casi iguales, pero
cuanto ms larga es la molcula, ms se lentifica la aumentar la concentracin del gel.
(d) representacin de la relacin entre el peso molecular y la movilidad. El logaritmo del peso molecular (M) de las
cuatro molculas que aparecen en (c) est representado frente a sus movilidades, a una nica concentracin de gel.
Cuando esta clase de grficos se prepara a partir de patrones de referencia, puede utilizarse para determinar los pesos
moleculares de molculas separadas.

Fig. 4-41. Enfoque isoelctrico de los polianflitos.
En un gel con un gradiente de pH se coloca una mezcla de variantes del polianflito hemoglobina. Cuando se aplica
un campo elctrico, cada variante se desplaza hasta su propio punto isoelctrico.

Protenas

41
Determinacin del nmero y peso aproximado de las subunidades de protenas: electroforesis en
gel SDS
Una vez determinado el peso molecular nativo, la manera ms fcil de averiguar el peso o pesos
moleculares de las subunidades consiste en utilizar la electroforesis en gel en presencia de SDS. En estas
condiciones, las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de las protenas se descomponen todas. La
cadena se despliega y se rodea de molculas de SDS. Las numerosas cargas negativas transportadas por las
muchas molculas de SDS unidas a la protena hacen que la carga que sta transporta sea insignificante. En
consecuencia, la cadena polipeptdica plegada se transforma en un objeto alargado, cuya carga y longitud
son proporcionales a la longitud (y, por lo tanto, al peso molecular) de la cadena. Tal como se seal
anteriormente, estas partculas migrarn en la electroforesis en gel con movilidades relativas, que dependen
nicamente de sus longitudes. Este fenmeno se demuestra en el grfico que aparece en la figura 4-42. Si la
electroforesis de una cadena proteica desconocida se lleva a cabo en el mismo gel que un conjunto de
estndares de referencia, el peso molecular de la desconocida puede medirse por interpolacin en un grfico
como el de la figura 4-42.

Fig. 4-42. Electroforesis en gel con SDS.
El grfico representa el logaritmo M frente a la movilidad
electrofortica relativa para una serie de protenas disueltas en
una solucin que contiene el detergente SDS. La curva
resultante se utiliza para interpolar los datos de una protena
desconocida.

Cuando se investigan las subunidades de una protena mediante esta tcnica, es aconsejable realizar dos
experimentos: uno en presencia de un agente reductor de enlaces disulfuro como el |mercaptoetanol
(HSCH
2
CH
2
OH) y otro en su ausencia. De este modo, se distinguir entre las subunidades que se mantienen
juntas mediante puentes SS y las que se mantienen juntas mediante fuerzas no covalentes. Si se
encuentra una sola banda en cada uno de estos geles con SDS, correspondiente en peso molecular a la de la
protena nativa, podemos concluir que la protena existe en condiciones fisiolgicas como una nica cadena
polipeptdica. Si la banda o bandas observadas son de un peso molecular muy inferior, est indicada una
estructura de mltiples unidades. Aunque los valores de peso molecular obtenidos a partir de la
electroforesis en gel pueden ser aproximados, debern ser lo suficientemente exactos para una buena
estimacin del nmero de unidades.
Suponiendo que el examen indique que hay mltiples subunidades, hay slo un tipo o hay varios? La
presencia de ms de una banda en el gel con SDS es una indicacin clara de que se trata de mltiples tipos
de subunidades. Pero hallar slo una banda no demuestra que las subunidades sean idnticas. De hecho,
puede haber varios tipos de subunidades con distintas secuencias de aminocidos pero pesos moleculares
casi idnticos; estas subunidades distintas no pueden diferenciarse en geles con SDS. Para dejar claro que
slo est presente un tipo de cadena, el investigador debe recurrir a otros mtodos. Si puede hallarse un
modo de disociar la protena sin utilizar detergentes o agentes caotrpicos, el enfoque isoelctrico puede ser
una tcnica muy sensible.

Protenas

42
4.8.2.4. CROMATOGRAFA

Gran parte de la bioqumica moderna se basa en la utilizacin d mtodos de cromatografa en columna
para separar molculas. Los mtodos cromatogrficos comportan el paso de una solucin a travs de un
medio que presenta una absorcin selectiva para los distintos componentes solutos. En la figura 4-43 se
ilustran los principios generales comunes a todas las cromatografas. Se llena la columna con un material
que pueda absorber molculas de modo selectivo debido a alguna diferencia de su estructura qumica.
Inicialmente se humedece la columna con la solucin tampn adecuada. A continuacin se coloca la mezcla
de las molculas que se van a separar en la parte superior de la columna y se hace pasar lentamente a lo largo
de la columna una solucin tampn. Se forman fracciones, utilizando un colector automtico de fracciones,
mientras contina este proceso de elucin (paso a travs de la columna). Algunas clases de molculas slo se
absorben dbilmente o no se absorben en absoluto, y son las primeras que eluyen. Las que se absorben con
ms intensidad son las ltimas en eluir. En ocasiones debe modificarse la composicin de una solucin
tampn durante la elucin para eliminar las molculas ms fuertemente ligadas. El material de la columna
utilizado y el mtodo de elucin dependen de la base que desee utilizarse para la separacin. En las
secciones que siguen se describen algunos mtodos importantes de cromatografa en columna.

Fig. 4-43. Principio de la cromatografa en columna.

Cromatografa de intercambio inico
La cromatografa de intercambio inico se utiliza para separar molculas de acuerdo con su carga
elctrica. Se utilizan resinas de intercambio inico, que son polianiones o policationes. Supongamos que
deseamos separa tres clases de molculas, una de las cuales est cargada negativamente, otra con una dbil
carga positiva y la tercera con una carga positiva fuerte. Se utilizar une resina aninica, que lleva grupos
cargados negativamente, para el material de la columna. Las molculas de la muestra cargada negativamente
pasarn a travs sin absorberse y se hallarn en las fracciones iniciales. Los dos tipos de molculas con carga
positiva sern ligados por la resina, aunque las de carga positiva dbil quedarn fijadas con menor fuerza.
Dado que los aumentos de concentracin salina tienden a romper las interacciones electrostticas de este
tipo, puede utilizarse un gradiente salino una vez recogidas las primeras fracciones. Es decir, se incrementa
gradualmente la concentracin salina de la solucin tampn eluyente (por ejemplo, utilizando NaCl). A
continuacin eluirn los cationes fijados dbilmente y los fijados intensamente con fuertes cargas positivas
slo eluirn con la concentracin salina ms elevada.

Cromatografa de afinidad
La cromatografa de afinidad es una clase de cromatografa ms especfica, ideal para aislar una o unas
pocas protenas de una mezcla compleja. Muchas protenas presentan interacciones bastantes fuertes con
otras molculas, por ejemplo las interacciones de las enzimas con anlogos de sus sustratos o cofactores. Las
molculas adecuadas, acopladas de modo covalente a una matriz inerte, actuarn como anzuelos
moleculares para captar la protena deseada. Todas las protenas restantes simplemente pasarn a lo largo de
la columna. Las molculas proteicas capturadas pueden liberarse a continuacin eluyendo la columna con
una solucin tampn que contenga copias libres de las molculas anzuelo, o algn otro reactivo que pueda
romper la interaccin. En una variante de ste mtodo, se acoplan a la resina anticuerpos para una sustancia
concreta y proporcionan una retencin muy especfica del producto deseado.

Protenas

43
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
La cromatografa suele ser un proceso lento. Con los procedimientos habituales slo se aplica una
pequea presin hidrosttica para hacer que los fluidos pasen a travs de la columna y la elucin requiere
varias horas. Este proceso no slo precisa mucho tiempo sino que en ocasiones es perjudicial para los
productos sensibles. Adems, la muestra tiende a esparcirse, debido a la difusin, a medida que baja a lo
largo de la columna. Cuanto ms dure el experimento, ms grave ser la extensin y quedar afectada la
resolucin de los componentes. Por todos estos motivos, los investigadores bioqumicos han agradecido el
desarrollo de mtodos de cromatografa lquida de alta resolucin. Con estas tcnicas se utilizan presiones de
5000 a 10000 psi para hacer que las soluciones pasen rpidamente a travs de la resina. Este nivel de presin
ha requerido el desarrollo de resinas no compresibles y columnas metlicas fuertes donde realizar el proceso.
De este modo, las separaciones que anteriormente precisaban horas, en la actualidad pueden realizarse en
minutos y con una resolucin ms elevada.

Filtracin en gel
La filtracin en gel es un tipo de cromagrafa en el que la base de la separacin es el tamao molecular
en vez de las propiedades qumicas. En consecuencia, suele ser una alternativa a la sedimentacin. A
menudo constituye un mtodo adecuado para separar macromolculas de tamao diferente o para eliminar
contaminantes de peso molecular bajo de soluciones de molculas grandes.
El aparato utiliza para la filtracin en gel (fig. 4-
44) es muy similar al descrito para la cromatografa en
columna. Se llena la columna con esfera de un gel
poroso, normalmente un polisacrido con enlaces
cruzados. Se elige la porosidad del gel de modo que
las molculas ms pequeas de la mezcla puedan
penetrar en las esferas, mientras que las mayores no
puedan hacerlo. La muestra se aplica en la parte
superior de la columna, las molculas ms grandes se
mueven ms rpidamente, ya que no pueden entrar en
las esferas del gel y slo pueden fluir por los
intersticios que hay entre ellas. Las molculas
pequeas pueden entrar en las esferas del gel y en
consecuencia se rezagan. Si se recogen las fracciones
cuando se pasa la solucin tampn a travs de la
columna, las primeras fracciones contendrn las
molculas ms grandes. Si se elige adecuadamente la
porosidad de las esferas, pueden separarse mezclas de
distintos tipos de tamaos; incluso puede calibrarse la
columna con sustancias conocidas para obtener una
medida aproximada del tamao molecular basndonos
en el punto en el que aparece un componente
concreto.

4.8.2.5. DILISIS Y ULTRAFILTACIN

Es posible obtener membranas semipermeables con poros lo suficientemente grandes para permitir que
las molculas ms pequeas pasen libremente pero que sean una barrera para las protenas y otras
macromolculas. Este tipo de membranas se utilizan para la purificacin y concentracin de biopolmeros.
La dilisis se utiliza usualmente para eliminar las pequeas molculas contaminantes o para cambiar
suavemente las condiciones de una solucin tampn. Por ejemplo, se coloca una solucin de una protena en
una bolsa cerrada fabricada con una membrana de este tipo y sumergida en un volumen mucho mayor de
solucin tampn. Despus de muchas horas los contaminantes de peso molecular bajo salen fuera y el
entorno original de las molculas proteicas se reemplaza por la solucin tampn exterior (a menudo la
solucin exterior se cambia varias veces durante el proceso).
La ultrafiltracin se utiliza algunas veces para concentrar soluciones de macromolculas. Se utiliza una
membrana semipermeable similar, pero se aplica presin para hacer salir al disolvente y a las molculas
pequeas a travs de la membrana, con lo que se concentran las macromolculas.

Fig. 4-44. Principio de la filtracin en gel.
Protenas

44
4.8.3. ESTUDIO CONFORMACIONAL

La difraccin de rayos X es el mtodo por excelencia para determinar los detalles de la estructura
tridimensional de las protenas globulares y otros biopolmeros. Sin embargo, esta tcnica presenta la
limitacin fundamental de que slo puede utilizarse cuando las molculas han cristalizado, y la cristalizacin
no siempre es fcil o siquiera posible. Adems, este mtodo no puede utilizarse con facilidad para estudiar
los cambios de conformacin que se producen en respuesta a cambios del entorno de las molculas. Sin
embargo, existen otros mtodos que nos permiten estudiar molculas en disolucin. Varios de estos mtodos
pueden agruparse en la categora de tcnicas espectroscpicas.

4.8.3.1. ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN

Las protenas, los hidratos de carbono y los cidos nucleicos son molculas complejas que pueden
absorber radiacin a lo largo de un amplio margen del espectro. No obstante, los principios bsicos de su
absorcin pueden explicarse en trminos ms sencillos de molcula, una molcula diatmica.

Fig. 4-45. Principios de la espectroscopia de absorcin.
(a) Transiciones electrnicas y de vibracin de una molcula diatmica.
(b) Espectro electromagntico.

Cuando dos tomos interactan para formar una molcula, la curva de energa potencial para el estado
electrnico de energa ms baja (estado basal) se parecer a la curva inferior de la figura 4-45a. Los estados
electrnicos excitados presentarn curvas similares para la energa frente a la distancia interatmica, pero a
energas ms elevadas. Para cada estado electrnico de la molcula habr una serie de estados de vibracin
permitidos, con niveles de energa indicados por las lneas horizontales en la figura. La base de la
espectroscopia molecular puede comprenderse con dos reglas sencillas: 1) Las transiciones son posibles slo
entre estados de energa permitidos de la molcula (los niveles de energa estn cuantizados), y 2) la energa
(AE) que debe absorberse en cualquier transicin determina la longitud de onda () de la radiacin que se
absorbe para lograr esa transicin. La energa de un cuanto de radiacin es inversamente proporcional a :
E = hc/ y E = E
estado final
E
estado inicial
, en donde h es la constante de Planck (6,626.10
-34
Js) y c es la
velocidad de la luz (3.10
8
m/s). Segn la ecuacin, las pequeas diferencias de energa corresponden a las
longitudes de onda largas y las diferencias grandes a las longitudes de onda cortas. Esta relacin concuerda
con la figura 4-45b, que indica que las transiciones de energa elevada entre estados electrnicos de una
molcula conducen a la absorcin en la regin visible o ultravioleta del espectro, mientras que las
transiciones de energa baja entre distintos niveles de energa de vibracin corresponden a la absorcin de
energa infrarroja.
Los biopolmeros complejos como las protenas y los cidos nucleicos pueden experimentar multitud de
tipos de vibraciones y oscilaciones moleculares. En consecuencia, la espectroscopia infrarroja puede
proporcionar informacin directa relativa a la estructura macromolecular. Por ejemplo, las posiciones
exactas de las bandas infrarrojas correspondientes a las vibraciones del armazn polipeptdico son sensibles
al estado de conformacin (hlice o, lmina |, etc.) de la cadena. Por lo tanto, los estudios en esta regin del
espectro suelen utilizarse para investigar las conformaciones de las molculas proteicas.
Protenas

45
La mayora de los biopolmeros no absorben luz visible en cantidades significativas. Algunas protenas
son coloreadas, pero invariablemente contienen grupos prostticos (como el hemo en la mioglobina) o iones
metlicos (como el cobre) que les confieren la absorcin. La sangre y la carne roja deben su color a los
grupos hemo transportados por la hemoglobina, la mioglobina y otras hemoprotenas. Esta absorcin a
menudo puede aprovecharse para investigar cambios del entorno molecular del grupo prosttico. Un ejemplo
de ello es el uso de la espectroscopia de absorcin en el espectro visible para seguir la oxigenacin de la
mioglobina o la hemoglobina. No obstante, los usos ms comunes en bioqumica de las tcnicas
espectroscpicas son, con diferencia, los de la espectroscopia ultravioleta. En la regin ultravioleta, tanto las
protenas como los cidos nucleicos absorben intensamente (fig. 4-46). La absorcin proteica ms fuerte se
encuentra en dos mrgenes de longitud de onda dentro de las regiones ultravioleta, en la proximidad de 280
y 200 nm. En el margen de 270290 nm, vemos la absorcin por las cadenas laterales aromticas de
fenilalanina, tirosina y triptfano. Dado que esta regin del espectro es fcil de estudiar, la absorcin a 280
nm se utiliza de modo sistemtico para medir las concentraciones proteicas.

Fig. 4-46. Espectros de absorcin cercano al ultravioleta
de una protena tpica y del DNA.
La absorcin a 280 nm se utiliza habitualmente para medir
concentraciones de protenas, mientras que la absorcin a 260 nm
es ms sensible para los cidos nucleicos.

Las medidas espectroscpicas de concentracin proteica utilizan un espectrofotmetro, en el que una
cubeta de grosor l que contiene una solucin de la protena se coloca en un haz de radiacin monocromtica
de intensidad I
0
(fig. 4-47). La intensidad del haz emergente disminuir hasta un valor de I porque la
solucin absorbe parte de la radiacin. La absorbancia a la longitud de onda se define como A
= log (I
0
/I)
y est relacionada con l y la concentracin c por la ley de Beer: A
/c, donde
es el coeficiente de
extincin a una longitud de onda para la sustancia concreta que se estudia. Sus dimensiones dependen de
las unidades de concentracin empleadas. Si la concentracin de protena se mide en mg/cm
3
y l en cm,
entonces
debe tener las dimensiones cm

2
/mg, dado que A en una magnitud sin unidades. En cambio,
cuando las concentraciones se expresan en molaridad (M), las unidades de pasan a ser M
1
cm
1
. Una vez
determinado el coeficiente de extincin de una protena concreta (por ejemplo, midiendo la absorbancia de
una solucin que contenga un peso conocido de la protena), la concentracin de cualquier otra solucin de
esa protena puede calcularse a partir de una simple medida de absorbancia, utilizando la ecuacin A
/c.
Se utiliza habitualmente el mismo mtodo para los cidos nucleicos, pero en este caso suele emplearse una
longitud de onda de 260 nm, dado que los cidos nucleicos absorben ms intensamente en esa regin del
espectro.

Fig. 4-47. Medida de la absorcin de luz con un espectrofotmetro.

La segunda regin de fuerte absorcin en el espectro de las protenas se encuentra entre 180 y 220 nm.
La absorcin a estas longitudes de onda surge de las transiciones electrnicas en el propio armazn
polipeptdico, y en consecuencia es sensible a la conformacin del armazn. De hecho, ambas regiones del
espectro de absorcin de las protenas resultan algo afectadas por el estado conformacional. Los coeficientes
de extincin cambian ligeramente cuando una molcula pasa de una forma globular a otra de ovillo aleatorio,

Protenas

46
porque se modifica el entorno local de todos los grupos, incluyendo las cadenas laterales aromticas. Dado
que la espectroscopia puede realizarse con gran exactitud, pueden medirse incluso cambios pequeos y
puede utilizarse para seguir la desnaturalizacin proteica.

4.8.3.2. FLUORESCENCIA

En la mayora de los casos, las molculas que pasan a un estado electrnico excitado por la absorcin de
energa radiante vuelven al estado basal por una transferencia sin radiacin de la energa de excitacin a las
molculas circundantes. En pocas palabras, la energa vuelve a aparecer como calor. Pero en ocasiones,
como se ve en la figura 4-48a, una molcula perder slo parte de su energa de excitacin por transferencia
(flecha amarilla) y volver a radiar la parte ms grande (flecha verde). Con ello surge el fenmeno
denominado fluorescencia. Dado que, como se aprecia en la figura, el cuanto de energa reemitida como
fluorescencia siempre es menor que el cuanto que se absorbi inicialmente (flecha naranja), la longitud de
onda de la luz fluorescente ser ms larga que la longitud de onda de la luz de excitacin. En la figura 4-48b
se contrasta el espectro de emisin de fluorescencia de la tirosina con su espectro de absorcin. En las
protenas, la tirosina y el triptfano son los grupos fluorescentes ms importantes. El entorno de estos
residuos puede modificar en gran medida la intensidad de su fluorescencia, y esta tcnica puede utilizarse
para el seguimiento de los cambios de conformacin proteica. Adems, la excitacin de la fluorescencia por
la luz polarizada planar proporciona un modo de estudiar la dinmica de la estructura proteica. Si los
residuos excitados pueden moverse o rotar de modo apreciable antes de que se reemita la luz fluorescente, la
fluorescencia se despolarizar en alguna cantidad.

Fig. 4-48. Fluorescencia.
(a) Principio de la fluorescencia.
(b) Espectros de absorcin y de emisin de fluorescencia de la tirosina.

4.8.3.3. DICROSMO CIRCULAR

A pesar de que la espectroscopia de absorcin y la fluorescencia pueden resultar tiles para seguir los
cambios de moleculares, estas medidas son difciles de interpretar directamente en trminos de cambios de la
estructura secundaria. Para este objetivo, han adquirido importancia las tcnicas que utilizan luz polarizada.
La luz puede polarizarse de varias maneras. La ms conocida es la polarizacin plana (fig. 4-49a, parte
superior), en la que el campo elctrico variable de la radiacin tiene una orientacin fija. Mientras que la luz
no polarizada consta de ondas que vibran en todos los planos perpendiculares a la direccin del
desplazamiento, la luz polarizada plana tiene ondas que vibran en un nico plano. Menos conocida, pero
igualmente importante, es la polarizacin circular, en la que la direccin de polarizacin rota con la
frecuencia de la radiacin (fig. 4-49a, parte inferior). Si observa un haz polarizado circularmente que se la
acerca, el campo elctrico puede estar rotando tanto en sentido de las agujas del reloj como en sentido
contrario. La primera se denomina luz polarizada circularmente hacia la derecha, y la segunda luz
polarizada circularmente hacia la izquierda.

(a) (b)
Protenas

47

Fig. 4-49. Dicrosmo circular.
(a) Polarizacin de la luz. Arriba: luz polarizada plana. Abajo: luz polarizada circularmente.
(b) Espectros de dicrosmo circular de polipptidos con diversas conformaciones.

La mayora de las molculas estudiadas por los bioqumicos son asimtricas (por ejemplo, los
aminocidos L y D, las hlices proteicas a derechas y a izquierdas, y las hlices de cidos nucleicos a
derechas y a izquierdas). Estas molculas presentan una preferencia por la absorcin de la luz polarizada
circularmente hacia la izquierda o hacia la derecha. As, por ejemplo, un haz polarizado circularmente hacia
la derecha interacta de modo distinto frente a una hlice o a derechas en comparacin con un haz
polarizado circularmente hacia la izquierda. Esta diferencia de absorcin, denominada dicrosmo circular, se
define como: A = (A
L
A
R
)/A, donde A
L
es la absorbancia de la luz polarizada circularmente hacia la
izquierda, A
R
es la cantidad correspondiente para la polarizacin circular hacia la derecha y A es la
absorbancia de la luz no polarizada. Dado que A puede ser positivo o negativo, un espectro de dicrosmo
circular (o espectro DC) es distinto de un espectro de absorcin normal en que se permiten valores + y .
La figura 4-49b presenta espectros DC de polipptidos con conformaciones de hlice o, lmina | y
ovillo aleatorio. Debera ser evidente, a partir de la figura, que el dicrosmo circular puede ser una potente
herramienta para el seguimiento de cambios conformacionales de las protenas. As, por ejemplo, si se
desnaturaliza una protena de modo que su estructura nativa, que contiene regiones de hlice o y de lmina
|, se transforma en una estructura desplegada de ovillo aleatorio, se reflejar en un cambio muy notable de
su espectro DC.
El dicrosmo circular puede utilizarse de otro modo, para calcular el contenido de hlices o y de
lminas | en protenas nativas. Las contribuciones de estas estructuras secundarias distintas al dicrosmo
circular a diferentes longitudes de onda son conocidas, de modo que podemos intentar hacer corresponder un
espectro observado de una protena con una combinacin de estas contribuciones. Este tipo de anlisis
frecuentemente coincide con la composicin de estructura secundaria indicada por los estudios de rayos X, y
ha apoyado la idea de que las estructuras de las protenas globulares observadas en cristales se conservan
cuando los cristales se disuelven en soluciones tampn a pH fisiolgico.
A pesar de que el dicrosmo circular es una tcnica extraordinariamente til, no resulta muy
discriminadora. Esto es, en la actualidad no puede decirnos lo que sucede en un punto concreto de una
molcula proteica. Un mtodo que tiene la posibilidad de hacerlo es la resonancia magntica nuclear.

Protenas

48
4.8.3.4. RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

RM unidimensional
Los ncleos de determinados istopos de algunos elementos tienen una propiedad denominada spin, que
hace que los ncleos se comporten como imanes diminutos. Slo un nmero limitado de istopos tiene esta
propiedad; algunos que son tiles para los bioqumicos se indican en la tabla 4-7. Si se aplica un campo
magntico externo a una muestra que contenga estos ncleos, las distintas orientaciones del spin nuclear
tendrn energas diferentes. La radiacin de microondas puede hacer pasar estos ncleos de un estado
energtico a otro, un fenmeno denominado resonancia magntica nuclear (RM). La RM es en realidad un
tipo de espectroscopia. Como se ve en la figura 4-50a, con un campo magntico determinado, una energa
concreta correspondiente a una longitud de onda particular en la regin de microondas del espectro
corresponder exactamente a la diferencia de energa entre los estados de spin. De este modo, el investigador
puede usar un campo magntico fijo y cambiar la longitud de onda de las microondas hasta que se haya
obtenido la resonancia. Ms a menudo, el experimento se realiza a la inversa: la longitud de onda de la
radiacin se mantiene fija y se vara el campo magntico hasta conseguir la resonancia.
Los niveles de energa de un ncleo girando en un campo magntico son muy sensibles al entorno que
rodea el tomo en cuestin. Hidrgenos distintos de un compuesto, por ejemplo, alcanzarn la resonancia a
distintas intensidades del campo magntico. Estas diferencias suelen expresarse en trminos de desviaciones
qumicas (o) definidas respecto al material de referencia aadido a la muestra: o = (H
ref
H/H
ref
) x 10
6
,
donde H es la intensidad del campo para la resonancia del ncleo en cuestin, y H
ref
es la de un ncleo de
referencia.

Tabla 4-7. Ncleos utilizados con mayor frecuencia en los experimentos bioqumicos de RM

Istopo Spin Abundancia
natural
a
(%)
Sensibilidad
relativa
b

Aplicaciones
1
H 99,98 (1,0000) Casi cualquier tipo de estudio bioqumico
2
H 1 0,02 0,0096 Estudios de compuestos deuterados selectivamente
13
C 1,11 0,0159 Estudios de grupos especficos que contienen carbono
19
F 100,00 0,8340 Sustituido por H como sonda de estructura local
31
P 100,00 0,0664 Estudios de cidos nucleicos y compuestos fosforilados

a
El nmero representa el porcentaje de este istopo en la mezcla de istopos de cada elemento que se produce naturalmente. Los
istopos con cifras prximas al 100% pueden estudiarse directamente en los biopolmeros que se producen naturalmente. Los istopos
raros, como el
2
H (deuterio) y
13
C, suele ser preciso que se enriquezcan artificialmente en las sustancias a estudiar.
b
Indica la sensibilidad (en comparacin con
1
H) de los instrumentos de RM convencionales para cada istopo. Los valores bajos
significan que el experimento ser ms difcil o que requerir ms tiempo.

Fig. 4-50. Resonancia Magntica Nuclear (RM).
(a) Principio de la RM.
(b) Parte del espectro de RM de
1
H del inhibidor de la tripsina pancretica bovina. El eje es la desviacin qumica,
o, en partes por milln (ppm). Las letras indican resonancias asignadas a grupos especficos de tomos.

Con los instrumentos grandes y modernos de RM, es posible diferenciar resonancias de la mayora o
todos los protones, incluso en una molcula grande. As, por ejemplo, en la figura 4-50b se presenta un
espectro de RM de la protena inhibidora de la tripsina pancretica bovina. Si pueden identificarse estas
resonancias, una tarea que presenta alguna dificultad, es posible preguntarse qu le sucede a un grupo o
tomo particular en una molcula tan grande como una protena. Un ejemplo de esta discriminacin se
presenta en la figura 4-51, que muestra las curvas de titilacin de los residuos de histidina individuales de la
protena ribonucleasa. La figura tambin demuestra grficamente un principio: los grupos individuales de un
Protenas

49
tipo determinado pueden presentar valores de pK
a
muy distintos debido a sus entornos diferentes dentro de la
molcula de protena compleja.

Fig. 4-51. Titulacin de los cuatro residuos de histidina
de la ribonucleasa mediante RM.
Cada curva sigue la titulacin de un grupo individual de
histidina. Las marcas como H12 y H48 indican las posiciones
de los grupos en la cadena.

Los ejemplos del poder discriminador de la RM son legin. Como otro ejemplo, podemos utilizar la RM
31
P para mostrar lo que hacen los grupos fosfato en una molcula de cido nucleico. Los espectros de RM
13
C de la figura 4-52 diferencian los tipos individuales de tomos de carbono en el polipptido sinttico poli
(bencil) Lglutamato. Esta figura demuestra otra aplicacin importante de la RM. Cuando los tomos
slo pueden moverse lentamente en solucin, las lneas de RM se ensanchan. Obsrvese el contraste de
definicin de los picos entre las formas de hlice y de ovillo aleatorio de este polipptido. En el ovillo
aleatorio, el armazn y las cadenas laterales son libres para dar una vuelta con movimiento aleatorio; pero en
la hlice, cada uno est fijado en su sitio y slo puede moverse con el movimiento lento de toda la molcula
grande de forma alargada. En consecuencia, en este caso la RM nos permite estudiar de modo ms directo la
transicin hlice ovillo aleatorio.

Fig. 4-52. Espectro de RM de
13
C de dos conformaciones de un polipptido.
Los picos individuales para los carbonos o, |, y bencilo de las cadenas laterales se resuelven claramente.
(a) Espectro del poli (bencil) Lglutamato en la conformacin de hlice o.
(b) Espectro del mismo polipptido en la conformacin de ovillo aleatorio. Obsrvese el estrechamiento de los
picos.

RM multidimensional
El tipo de espectro tridimensional que aparece en la figura 4-50b nos puede decir mucho sobre el
comportamiento de los tomos individuales de una protena, pero no revela toda la informacin
potencialmente disponible con la RM. El desarrollo de la RM bidimensional de las protenas, durante los
ltimos aos, ha abierto toda una nueva gama de aplicaciones.
Bsicamente, las tcnicas de RM bidimensional de espectroscopia de correlacin (COSY) y de
espectroscopia e efecto Overhauser nuclear (NOESY) se basan en el hecho que los spin de distintos
protones interactan unos con otros. Con el uso de tcnicas de pulsacin mltiple, es posible perturbar el
spin de un ncleo y detectar su efecto sobre el estado de spin de otro. Los protones que estn unidos a
tomos adyacentes, y que en consecuencia pueden acoplar el spin directamente, pueden estudiarse con el
mtodo de COSY. Este mtodo permite al investigador asignar frecuencias de RM a protones concretos
rastreando de un tomo al siguiente. El espectro NOESY es incluso ms importante, y se basa en el hecho
de que dos protones que estn a menos de 0,5 nm de distancia el uno del otro perturban mutuamente sus spin
incluso si no estn estrechamente acoplados en la estructura primaria. En consecuencia, la NOESY nos
permite averiguar qu protones estn cerca en el espacio y nos proporciona una ruta para la determinacin de
la estructura tridimensional. En la figura 4-53 se presenta un espectro NOESY bidimensional tpico. Las
Protenas

50
manchas en la diagonal corresponden al espectro convencional unidimensional, mientras que las manchas
fuera de la diagonal muestran interacciones cercanas entre pares de protones correspondientes a las manchas
de la diagonal. Por ejemplo, los protones que estn a menos de 0,5 nm se muestran con la mancha etiquetada
as, y con su contrapartida al otro lado de la diagonal.

Fig. 4-53. Uso de los espectros de RM NOESY para
determinar la proximidad de los tomos.
(a) Pptido YGRGDSP.
(b) Espectro NOESY del pptido (regin de H de
amida). La presencia de un pico cruzado correspondiente a
la interaccin del protn de la glicina 4 (G4NH) con el
protn NH del aspartato (DHH) demuestran que estn
cerca en el espacio.

Cuando se combinan con las asignaciones de los protones y las restricciones de enlaces, estos datos
pueden proporcionar modelos bastante exactos de protenas pequeas en solucin. Se presenta un ejemplo en
la figura 4-54, donde la estructura de armazn del BPTI obtenida por rayos X se compara con cinco modelos
posibles generados a partir de los espectros de RM bidimensionales.

Fig. 4-54. Comparacin de las estructuras del BPTI obtenidas por
RM y por rayos X.
La lnea gruesa representa la conformacin del armazn de la
estructura de rayos X. las lneas finas representan cinco posibles estructuras
calculadas a partir de los datos de RM.

Recientemente, se ha ampliado la potencia de estos mtodos mediante la expansin a otras
dimensiones, observando las interacciones entre, por ejemplo, los spin de los protones y los spin de
13
C.
La potencia de la RM para el estudio de estructuras proteicas est aumentando rpidamente.

Protenas

51
4.8.3.5. ESPECTROMETRA DE MASA: determinacin de pesos moleculares exactos de las
subunidades de protenas

En los ltimos aos se ha aplicado una tcnica fsica antigua (espectrometra de masas) al estudio de las
protenas, con resultados notables. En los espectrmetros de masas, las molculas se ionizan y
posteriormente se aceleran a travs del vaco mediante un campo elctrico. Las partculas de distinta relacin
masa/carga se separan mediante su deflexin en un campo magntico o bien simplemente midiendo su
tiempo de vuelo hasta un detector.
A pesar de que la tcnica se ha utilizado durante mucho tiempo para molculas pequeas, recientemente
se han desarrollado mtodos para producir iones proteicos libres. Aqu slo mencionaremos uno, la
desabsorcin lser facilitada por una matriz. La protena se coloca en una matriz adecuada de molculas
orgnicas pequeas y se calienta brevemente mediante un destello lser (fig. 4-55). El resultado obtenido se
presenta en la figura 4-55. Los dos picos corresponden a la protena (inmunoglobulina G
1
) con una y dos
cargas protnicas. La masa calculada es de 148 dalton (140150). En este momento es posible conseguir de
modo habitual una exactitud de 1 parte en 10.000 con las protenas ms pequeas.
El mtodo es extraordinariamente exacto y precisa poco material. No obstante, no proporcionar los
pesos moleculares de las protenas oligomricas unidas de modo no covalente.

Fig. 4-55. Espectrometra de masas de desabsorcin lser facilitada mediante matriz.
Un rayo lser libera iones proteicos de una matriz orgnica. stos se aceleran elctricamente hacia un analizador de
masa de tiempo de vuelo, que separa los iones en funcin de su relacin masa/carga.

Bibliografa

- Blanco A. Qumica Biolgica. El Ateneo. (2000).
- Devlin T. Bioqumica, libro de texto con aplicaciones clnicas. 3 Edicin. Editorial Revert (1999).
- Holme DJ. y H. Peck. Bioqumica Analtica. Ed. Acribia. (1987).
- Mathews C, Ahern KG, Van Holde KE.Bioqumica. Editorial Pearson Educacin (2003)
- Murray R, Granner D, Mayes P, Rodwell V. Bioqumica de Harper. Ed. El Manual Moderno (1992)
- Rawn J. Bioqumica. Interamericana Mc Graw- Hill (1989)
- Stryer L. Berg J, Tymoczko JL. Bioqumica. Ed. Revert. 5 Edicin. (2003).
- Voet D,Pratt CW, Voet JG. Fundamentos de Bioqumica. Editorial Medica Panamericana. (2007).

Dra. Laura C. Leiva de Vila

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Qumica Biolgica I Captulo 4

, donde K es una constante que

debe tener las dimensiones cm

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