Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA - FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGA VETERINARIA - CATEDRA DE MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

PRUEBAS BIOQUMICAS:
PRODUCTOS QUMICOS Y BIOLGICOS PARA EL DIAGNSTICO.

INTRODUCCIN La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. Los pasos a seguir para una perfecta identificacin bacteriana son: 1.- Obtener un cultivo puro 2.- Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas morfolgicas de inters. 3.- Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos. 4.- Realizacin de pruebas primarias (Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad. 5.- Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.). Adems de los nutrientes bsicos y especficos, que le son proporcionados a las especies de inters, para que puedan desarrollarse plenamente a nivel de laboratorio, en la frmula de algunos medios de cultivo empleados al efecto, se incluyen determinados compuestos con el objetivo de favorecer su desarrollo en detrimento de otras especies contaminantes o no, o para distinguir y diferenciar las colonias producidas. Una vez aisladas, las especies deben ser identificadas, para lo cual se emplean indistintamente productos qumicos, principalmente carbohidratos, para conocer su capacidad metablica frente a esos sustratos o se enfrentan a otros tipos de compuestos para determinar su resistencia, as como a diversos productos biolgicos para evidenciar sus reacciones.

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1.- OBJETIVOS DE LA PRCTICA a. Entender, comprender y aplicar las tcnicas adecuadas para la realizacin de pruebas bioqumicas empleadas rutinariamente en los procedimientos de identificacin bacteriana. b. Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta realizacin de las pruebas bioqumicas convencionales en el proceso de identificacin bacteriana. c. Reconocer la necesidad de emplear cultivos puros como sustrato para la realizacin de pruebas bioqumicas requeridas en el proceso de identificacin bacteriana. d. Adquirir conocimientos bsicos tericos y prcticos de la siembra, aislamiento y proceso de identificacin de bacterias realizando las diferentes pruebas bioqumicas de uso rutinario en el laboratorio de diagnstico bacteriolgico.

2.- ACTIVIDADES DEL INSTRUCTOR: a. Explicacin sobre las pruebas bioqumicas de uso rutinario en el diagnstico bacteriolgico, los mtodos de siembra y sus aplicaciones en el proceso de identificacin bacteriana. b. Demostracin de las tcnicas de siembra y los pasos a seguir para la correcta realizacin de las pruebas bioqumicas empleadas en diagnstico bacteriolgico

3.- ACTIVIDADES DE LOS ALUMNOS: a- Aplicando tcnicas aspticas, siembre los diferentes medios de cultivo diferenciales lquidos a partir del tubo con el medio de cultivo lquido que se le suministra. Emplee el esquema de diseminacin del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37C. b- Aplicando tcnicas aspticas, siembre el medio de cultivo slido en tubo (medio con bisel) que se le suministra. Emplee el esquema de diseminacin del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37C.

PRUEBAS BIOQUMICAS: ASPECTOS GENERALES Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados (las llamadas pruebas bioqumicas convencionales), generalmente determinan la actividad de una va metablica de la bacteria (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Obviamente, en la identificacin bacteriana hay que partir de un cultivo puro obtenido en el aislamiento, sub-cultivado de una colonia bien aislada. Es aconsejable realizar una comprobacin efectuando una siembra en placa en la que crezcan nicamente colonias del mismo tipo. La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al 2

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). HIDRATOS DE CARBONO Los carbohidratos comnmente empleados son diversos. Los ms utilizados son los monosacridos como: glucosa, manosa, galactosa y fructuosas, entre otros y los disacridos como: lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. Tambin algunos trisacridos, entre los que se encuentra la rafinosa y polisacridos como la celulosa y el almidn. Uno o varios de estos carbohidratos suelen formar parte, como fuente de carbono, de la composicin de diversos medios, para el cultivo primario o las resiembras, as como, de los medios bioqumicos destinados para el diagnstico de las especies. El objetivo de su empleo, es determinar, si el microorganismo en estudio, fermenta "in vitro" el carbohidrato con formacin de sustancias cidas, como por ejemplo: el cido lctico, lo cual ser detectado por la accin del indicador presente en el medio de cultivo al variar el pH. INDICADORES Los indicadores son compuestos qumicos elaborados con cidos o bases dbiles, que se caracterizan por dar lugar al cambio de color de la disolucin o sustancia donde se encuentran al variar el pH, debido a su capacidad de ionizacin mediante la cual, a determinado nivel de la escala de pH, transforman los ines o molculas y viceversa. Los indicadores son de dos colores pudiendo ser uno de ellos incoloro. Cuando el indicador est cambiado de color, la mitad se encuentra en estado inico y la otra mitad en estado molecular, por lo que el color en esta fase no ser definido, sino ms bien un color intermedio entre ambos. Los indicadores que forman parte de la frmula del medio de cultivo, deben estar en concentraciones muy bajas, para que la determinacin del pH se deba exclusivamente a los cambios que tiene lugar en la solucin. En el siguiente cuadro se citan ejemplos de indicadores de pH: 3

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico Cuadro. Colores a los que dan lugar los indicadores en su rango de pH
INDICADOR ROJO FENOL AZUL BROMOTIMOL ROJO DE METILO ROJO NEUTRO FENOLFTALEINA ROJO CRESOL PRPURA DE BROMOCRESOL
COLOR ACIDO BASE RANGO DE pH

Amarillo Amarillo Rojo Rojo Incoloro Amarillo Amarillo

Rojo Azul Amarillo Amarillo Rojo Rojo prpura Rojo

6.4 - 8.2 6.0 - 8.0 4.0 - 6.0 7.0 - 8.0 8.0 - 10.0 7.2 - 8.3 5.2 - 6.8

Los indicadores presentes en los medios de cultivo, cambian el color del medio o de las colonias, en correspondencia con las variaciones del pH. SANGRE Y HEMODERIVADOS La sangre se emplea en la elaboracin de algunos medios de cultivo, no teniendo como nica finalidad proporcionar un nutriente esencial para el desarrollo de determinadas especies, sino adems, el permitir evidenciar y diferenciar la actividad hemoltica de algunas de ellas. Por ejemplo, cuando se desarrollan en el medio "Agar sangre", colonias correspondientes a especies productoras de hemolisinas, stas actan sobre la sangre que se encuentra en sus inmediaciones, hemolizando a los hemates total o parcialmente. Si el tipo de hemolisina, destruye a los eritrocitos, el efecto se evidenciar por la formacin de un halo incoloro alrededor de la colonia. Este tipo de hemlisis total se clasifica como "betha". En cambio, si el tipo de hemolisina no destruye a los hemates, pero acta sobre la hemoglobina que porta, reducindola a biliverdina, el efecto se evidenciar por la presencia de un halo de color verde alrededor de la colonia. Este tipo de hemlisis se clasifica como "alpha". Tanto los eritrocitos de sangre humana, como los obtenidos de diversas especies de animales, como por ejemplo: carneros, conejos, cabras, etc., son utilizadas en diferentes pruebas de hemaglutinacin o para detectar diversas reacciones hemolticas. El suero sanguneo se emplea comnmente para serodiagnsticos y el plasma (sin preservo) es utilizado regularmente para poner en evidencia la capacidad enzimtica de especies productoras de coagulosa, una enzima que utiliza como sustrato el plasma sanguneo, provocando la formacin de cogulos. COLORANTES La edicin de determinados colorantes a la frmula del medio de cultivo, tiene como objetivo, inhibir el desarrollo de las especies ms sensibles, que interfieren el estudio, favoreciendo de esta manera el desarrollo de otras ms resistentes de inters en la investigacin, como por ejemplo: el "Verde brillante" que forma parte de la composicin del medio de cultivo del mismo nombre, utilizado para aislar algunas especies del gnero Salmonella, al interferir total o parcialmente el desarrollo de otras especies presentes en la muestra. Las colonias de Salmonella se observan adems en este 4

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico medio con un color, rosado o casi blancas, dependiendo de las condiciones de cultivo y el tiempo de incubacin. Otro ejemplo lo constituye la siembra en el medio "Eosina-Azul de Metileno Agar". Estos colorantes inhiben el desarrollo de los grmenes gramnegativos y al mismo tiempo permiten diferenciar a las especies de Enterobacterias fermentadoras de lactosa, la sacarosa o ambos azcares, de los que no las fermentan. Por ejemplo, las colonias de E. coli, Citrobacter y P. vulgaris, adquieren un color azul oscuro, con aspecto metlico (que se evidencia con luz indirecta), en tanto que las Salmonella spp. y las Shigella spp., se mantienen incoloras o ligeramente teidas, mientras que las del resto de los coliformes se tien con un tono parduzco. PRODUCTOS QUMICOS Teniendo en cuenta, la informacin gentica de que dispone cada especie bacteriana, que la capacita para actuar metablicamente sobre determinados sustratos, es parcial o totalmente diferente entre s, se emplean para su diagnstico diversos sustratos, la mayora de naturaleza qumica, cuyas reacciones especficas, nos aportan informacin acerca de su identidad. Entre los productos qumicos, empleados con mayor frecuencia se encuentran los siguientes: Urea, citrato, malonato, nitrato, KCN, as como diversos tipos de aminocidos, entre otros. El producto qumico que se vaya a emplear, formar parte de la frmula de un medio de cultivo, que contiene adems los nutrientes necesarios para el desarrollo de la especie en estudio. Al actuar la bacteria sobre el producto qumico en cuestin, generalmente lo degradan por accin enzimtica a productos ms simples, caracterizados por tener un ph diferente al del producto reaccionante, lo cual se pondr en evidencia por la accin del indicador que forma parte del medio de cultivo, que proporcionar el cambio de color del medio, haciendo factible la lectura de esa prueba. AMINOCIDOS Los aminocidos: lisina, ornitina y arginina son utilizados corrientemente en el laboratorio, como parte de las pruebas que se realizan a una cepa en estudio, para determinar la identidad de la especie. De manera similar a la empleada con los productos qumicos para igual propsito, cada uno de estos aminocidos es adicionado por separado, en una proporcin del 1 % a un caldo base que contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo del germen y un indicador. El principio de estas pruebas radica en la capacidad de algunos microorganismos para decarboxilar uno o varios de estos aminocidos formando una amina con la consiguiente alcalinidad, lo que ser puesto de manifiesto por la accin del indicador, al producirse el cambio de pH. ANTIBITICOS Para medir la sensibilidad o resistencia de un microorganismo en estudio a los antibiticos, se realiza una tcnica denominada antibiograma con el empleo de discos de papel de filtro estriles de unos 5 6 mm de dimetro, impregnados por separado 5

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico con una carga en g o unidades de un antibitico determinado, equivalente a la concentracin srica media, obtenida en el pico de una teraputica a dosis habituales. Estos discos (desecados) se colocan con todas las precauciones de asepsia sobre la superficie del cultivo, tan pronto se realiza la siembra, siendo incubada de inmediato. Transcurridas 24 horas, un halo de inhibicin alrededor de cada disco, en dependencia del tamao del dimetro, ser indicativo de la sensibilidad o resistencia del microorganismo en estudio a cada uno de los antibiticos empleados. Basado en el mismo principio y por un procedimiento similar, se realizan pruebas especficas con el empleo de un solo disco, impregnado en este caso con bacitracina u optoquina. La bacitracina inhibe el crecimiento de ms del 95 % de los Estreptococos del grupo A, en tanto que la optoquina inhibe el desarrollo del S. pneumoniae (Neumococos), por lo que, la lectura de estas pruebas aportaran un importante dato para sus respectivos diagnsticos. Otras pruebas de resistencia, se realizan con el empleo de productos qumicos como: el cianuro de potasio o el desoxicolato de sodio, as como mediante la exposicin del microorganismo a sustancias de secrecin orgnica como la bilis. La interpretacin de los resultados se sustentar en el hecho de que los microorganismos sean o no capaces de desarrollarse en presencia de estos compuestos.

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico 1ra SESIN PRCTICA METABOLISMO PROTEICO Licuefaccin de gelatina (lenta y rpida) Fenilalanina desaminasa Indol Ureasa Lisina descarboxilasa PRUEBAS DE TOLERANCIA BHI con cloruro de sodio al 6,5% BHI con pH 9,6 Bilis esculina 2da SESIN PRCTICA METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Oxidacin Fermentacin de carbohidratos - glucosa Hidrlisis de carbohidratos: Medio CTA, Caldo Base Rojo de fenol y/o Bromocresol purpura con tubos durhan Manitol Movilidad Rojo de Metilo Voges-Proskauer: Acetoina 3ra SESIN PRCTICA METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Kliger Hidrlisis de almidn ENZIMAS SISTEMA TRANSPORTE ELECTRONES Catalasa Oxidasa Reduccin de Nitratos COMPUESTOS COMO FUENTE NICA DE CARBONO Utilizacin de Citrato OTRAS PRUEBAS Prueba de cloroformo

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METABOLISMO PROTEICO
LICUEFACCIN DE GELATINA (LENTA) Detectar la produccin de una enzima proteoltica extracelular por parte de las bacterias que es la GELATINASA. Permite diferenciar gneros productores de Gelatinasa, que hidrolizan la Gelatina tales como: Staphylococcus: (+ muy rpida) Bacillus (+) Micrococcus: (+ lenta) Clostridium (+ lenta) Streptococcus - (negativos) Listeria - (negativos) FUNDAMENTO:
Gelatinasa(Proteasa) Gelatinasa (Peptidasa)

Gelatina + Agua Peptonada + bacteria

Polipeptidos

aa

(Proteina + agua)

PROCEDIMIENTO: 1) Siembra del m.o. en medio rico en Gelatina por puncin profunda Ej. Agua Peptonada + 12% gelatina Caldo nutritivo + 12% gelatina (esterilizados previamente) 2) Incubar por varios das (20 das) a 20-22C 3) Colocar en nevera 30 antes de la interpretacin RESULTADOS Medio se derrite (lquido) Gelatinasa + (bacteria hidroliz gelatina) Medio est slido Gelatinasa - (bacteria no hidroliz gelatina)

PRUEBA DE LICUEFACCIN DE GELATINA (LENTA)

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FENILALANINA DESAMINASA FUNDAMENTO: Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras enterobacterias PROCEDIMIENTO Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del bisel con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. RESULTADO La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verde-azulado.

PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico PRODUCCIN DE INDOL Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de las bacterias para producir indol a partir del triptfano. MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO Caldo triptonado + Triptona 10,0 g + Cloruro de sodio 5,0 g + agua destilada 1000,0 ml pH 7,1

Disuelva los ingredientes, reparta en tubos y esterilice en autoclave 15 minutos a 121C (15 libras de presin). Reactivo de Kovac Para-dimetil-aminobenzaldehdo 10,0 g Alcohol amlico o isoamlico 150,0 mL Acido clorhdrico concentrado 50,0 mL Se prepara disolviendo el aldehdo en el alcohol y aadindole el cido lentamente. Se reparte en pequeas cantidades y se almacena en el refrigerador cuando no est en uso. PROCEDIMIENTO Se inocula un tubo del medio con el asa de platino, transfiriendo una porcin del cultivo puro y se incuba a 37C por 40 a 48 horas. Luego se aaden 0,5 mL del reactivo de Kovac y se agita suavemente. RESULTADOS Una reaccin positiva es indicada por la aparicin de un anillo rojo en la superficie del medio (capa alcohlica).

PRUEBA DE PRODUCCIN DE INDOL

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UREASA Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para hidrolizar la rea, formando dos molculas de amonaco por la accin de la enzima ureasa. MEDIO DE CULTIVO Caldo rea Extracto de levadura 0,1 g Fosfato monopotsico 9,1 g Fosfato disdico 9,5 g rea 20,0 g Rojo fenol 0,01 g Agua destilada 1000,00 mL pH 6,7-6,9 Disuelva y esterilice por filtracin. PROCEDIMIENTO Con el asa de platino transfiera una porcin de cultivo puro proveniente de un medio slido. Incube a 37C por 24 horas. RESULTADOS Una reaccin positiva (hidrlisis de la urea) es indicada por un cambio de color del amarillo (pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o ms alcalino).

PRUEBA DE UREASA

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico DESCARBOXILACIN DE LA LISINA MEDIO DE CULTIVO Caldo Lisina Peptona 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Glucosa 1,0 g Lisina 5,0 g Prpura de bromocresol 0,02 g Agua destilada 1000,00 mL pH 6,8 Disuelva y caliente a ebullicin por 2 3 minutos, reparta en tubos y esterilice en el autoclave por 10 minutos a 121C (15 libras de presin). PROCEDIMIENTO Con el asa de platino transfiera una porcin de cultivo puro al caldo lisina. Incube a 37C por 24 horas. Cubra los tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de parafina estril. RESULTADO Las enterobacterias, por fermentacin de la glucosa producen cido, el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la descarboxilacin de la lisina se producir una amina, la cual neutralizar el cido producido por la fermentacin de la glucosa retornando el medio a su color original violeta.

A tubo sin inocular

B resultado positivo

C resultado negativo

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico PRUEBAS DE TOLERANCIA BHI CON CLORURO DE SODIO AL 6,5% Se estudia sembrando el microorganismo en un medio capaz de soportar su desarrollo, al cual se le ha agregado NaCl en la concentracin referida. El medio puede usarse solo, en cuyo caso se lee simplemente por observacin de crecimiento o no, o puede adicionarse con glucosa al 1% y un indicador de pH, como el rojo fenol, para facilitar la lectura. En este ltimo caso, los microorganismos capaces de fermentar la glucosa, y tolerar la concentracin salina del medio, desarrollan y acidifican, con el consiguiente viraje de color en el medio RESULTADOS Crecimiento: Tolera la concentracin de sal No crecimiento: no tolera la condicin

BHI CON pH 9,6 Puede usarse el caldo nutritivo como base, ajustando el pH a 9,6 antes de su esterilizacin. Puede adicionarse glucosa y un Indicador de pH, como se indic en el caso anterior, para facilitar la lectura de resultados RESULTADOS Crecimiento: Tolera el nivel de pH a 9,6 No crecimiento: no tolera la condicin

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico BILIS ESCULINA Medio utilizado para el aislamiento e identificacin presuntiva de estreptococos del grupo D. FUNDAMENTO Los estreptococos del grupo D crecen rpidamente en el agar bilis esculina e hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompaante. MEDIO DE CULTIVO Frmula (en gramos por litro) Extracto de carne 3 g Peptona de carne 5 g Esculina 1 g Citrato frrico 0.5 g pH final: 6.6 0.2

Bilis de buey 40 g Agar 15 g

Suspender 64,5 g en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullicin hasta su completa disolucin. Distribuir en tubos o frascos y esterilizar 15 minutos a 121C. PROCEDIMIENTO Sembrar el material en estudio, en tubo o placa segn la preferencia. Incubacin Hasta 3 das a 35-37 C, en aerobiosis. RESULTADOS
Microorganismos Enterococcus faecalis ATCC 29212 Bueno + + Proteus mirabilis ATCC 43071 Bueno Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Inhibido Inhibido Inhibido

Crecimiento Hidrlisis de la Esculina Oscurecimiento

CARACTERSTICAS DEL MEDIO: Medio preparado: mbar u oscuro ligeramente opalescente. El medio con esculina tiene un leve tinte azulado.

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METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
OXIDACIN FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS (GLUCOSA) FUNDAMENTO: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilizacin. Se usa el medio OF de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una relacin 1:5. Al ser menor la concentracin de peptonas, hay menor produccin de productos de oxidacin a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los cidos dbiles producidos por los microorganismos no fermentadores. El medio posee azul de bromotimol como indicador de pH. El test es til en la diferenciacin de los Gneros incluidos en la Familia Micrococcaceae como para diferenciar miembros de la Familia Enterobacteriaceae de las Pseudomonas. PROCEDIMIENTO: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F glucosa o lactosa o cualquier otro carbohidrato por cada agente a estudiar. Se hace la siembra profunda con aguja de platino. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con parafina estril (1,5 a 2 cm de alto) para crear condiciones anaerobias. Se incuba a 37C por 24 horas y hasta 14 das dependiendo del microorganismo. Los organismos oxidativos y fermentativos utilizan el carbohidratos tanto el tubo aerbico (sin parafina) como en el anaerbico, acidifican el medio y provocan el viraje del color del indicador de verde a amarillo. Los microorganismos oxidativos slo podrn utilizar el carbohidrato en el tubo aerbico. Como la produccin de cido en algunas especies puede ser lenta, se recomienda incubar el medio por 7-14 das, a menos que se observe cambio con anterioridad. INTERPRETACIN: Microorganismos oxidativo: producen cido solo en el tubo expuesto al O 2 atmosfrico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosfrico cambia su color original a amarillo. Microorganismos fermentadores: producen cido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo. Bacterias sacarolticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino despus de la incubacin, conservando su color original.

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POSITIVO

POSITIVO

NEGATIVO

POSITIVO

NEGATIVO

NEGATIVO

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico HIDRLISIS DE CARBOHIDRATOS La mayora de las bacterias utiliza un cierto nmero de carbohidratos como fuente de energa, ya sea por va oxidativa, fermentativa o ambas, provocando acidificacin del medio que se pone de manifiesto por el viraje de un indicados de pH incorporado al mismo. Algunas bacterias, producen tambin gas como producto de la fermentacin del carbohidrato, lo que es tambin una caracterstica de inters para su identificacin. La investigacin de la hidrlisis de distintos carbohidratos se realiza utilizando un medio basal como por ejemplo el Cysteina Trypticase Agar (medio o agar CTA), que es un medio semislido, el Caldo Base Rojo de Fenol (rojo en medio neutro o alcalino; amarillo en medio cido), el caldo base Prpura Bromo Cresol (Violeta en medio neutro o alcalino y amarillo en medio cido), etc. A los medios basales, conteniendo un indicador de pH, se aade el azcar a una concentracin final del 1%. a.- Medios lquidos: Cuando el medio basal es lquido, se reparte en tubos 12x120 mm o mayores, dentro de los cuales se introduce un tubo de pequeo dimetro o tubo de Durham, en posicin invertida. Este tubo se llena completamente durante la esterilizacin, pues por efecto de la temperatura y la presin, se desplaza el aire contenido dentro de el. Procedimiento: El medio se siembra con el microorganismo en prueba, se incuba por 24-48 horas y se procede a la lectura, observando viraje del indicador y presencia o no de gas en el tubo Durham. b.- Medios semislidos y slidos: se procede igual, excepto que no requiere introducir tubos Durham, pues el gas que se pueda generar queda atrapado en el agar y se observa desplazamiento del mismo. HIDRLISIS DE CARBOHIDRATOS (BROMOCRESOL PURPURA CON TUBOS DURHAN)

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HIDRLISIS DE CARBOHIDRATOS (CYSTEINA TRYPTICASE AGAR - CTA)

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico MANITOL MOVILIDAD Se incluyen en este apartado 2 pruebas debido a que pueden realizarse cultivando el microorganismo en un nico medio (el Manitol Movilidad), que se prepara en tubo con agar en taco y se siembra en picadura, incubndose a 37C durante 24 horas. Tambin existe la posibilidad de hacer las pruebas en medios separados. Prueba del Manitol: Sirve para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiar a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clnica, la prueba del manitol sirve para diferenciarStaphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-). Prueba de la Movilidad: Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos mviles. El medio manitol movilidad permite la realizacin de esta prueba gracias a ser semislido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma lnea de la picadura en que se sembraron. Entre las Enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el gnero Klebsiella (-) de las restantes que suelen poseer movilidad (+). Dentro del gnero Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico ROJO DE METILO FUNDAMENTO: La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la concentracin de iones hidrgeno presente cuando una bacteria cataboliza la glucosa. Con esta prueba se investiga si el microorganismo acta por la va cido mixta sobre los azcares, sta es una va metablica en la que se producen cidos del tipo frmico, actico, lctico y succnico (cidos muy fuertes dentro de la debilidad de los cidos orgnicos). PROCEDIMIENTO: Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP), cuya composicin es la siguiente: Peptona 7g Glucosa 5g K2HPO4 5g Agua destilada 1000 ml Este medio es lquido y se prepara y distribuye a razn de 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos. La lectura se realiza agregando solucin de rojo de metilo, en solucin alcohlica al 0,2% (p/v). Una vez que se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los resultados. RESULTADOS: Si el microorganismo ha producido cidos a partir de la glucosa, se mantendr rojo el indicador. Medio cido indicador rojo RM (+) (Escherichia coli) Medio neutro indicador amarillo naranja. RM (-) (Klebsiella)

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VOGES-PROSKAUER: ACETOINA FUNDAMENTO: La reaccin de VP se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona) a partir de le fermentacin butanodilica de la glucosa. Las bases bioqumicas de la prueba consideran que a partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir vas metablicas diferentes para la obtencin de energa, segn la composicin de sus sistemas enzimticos. Una de estas vas es la fermentacin butanodilica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetona es su precursor. La prueba de VP se basa en la deteccin de este ltimo metabolito. La acetona que se produce en la fermentacin cuando reacciona con el hidrxido de potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanidnicos de la arginina, que est presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloracin rojiza. PROCEDIMIENTO Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de metilo. Se siembra el microorganismo problema y se incuba a 37C durante 48 horas. La lectura se realiza agregando el cultivo 6 a 8 gotas de una solucin de KOH al 40% y luego 1 ml de solucin alcohlica del alfa naftol al 5% (p/v). Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en la estufa, el cultivo con los reactivos agregados. RESULTADOS (NTERPRETACIN) La formacin de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la prueba es positiva. Escherichia coli es VP Klebsiella sp es VP +

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico KLIGER FUNDAMENTO: Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono especfico incorporado a un medio de crecimiento bsico as como la de producir gas y cido sulfhdrico. Se utiliza para identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. MATERIALES: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos en pico de flauta con agar hierro de Kligler, pH=7,4. PROCEDIMIENTO: 1.- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por puncin y por estra en el mismo tubo de medio agar hierro de Kligler. 2.- Incubar a 37 C durante 18-24 horas. 3.- Observar entre las 18 horas y las 24 horas de cultivo (ni antes ni despus). INTERPRETACIN DE RESULTADOS: La utilizacin de un hidrato de carbono implica la liberacin al medio de productos cidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el medio. Cuando se interpretan los resultados de esta prueba deben analizarse los siguientes aspectos: A) Utilizacin del hidrato de carbono: - Si el microorganismo en estudio slo fermenta la glucosa: a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo. b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo. - Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa: a) en superficie: reaccin cida, color amarillo. b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo. - Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa (no entrico): a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo. b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento ni cambio de color; si el microorganismo es facultativo, reaccin alcalina, color rojo. - Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla: a) en superficie: reaccin cida a tiempos cortos y luego alcalina, color rojo. b) en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color. B) Produccin de gas: Si el microorganismo en estudio es aerognico, la produccin de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formacin de una o varias burbujas o el desprendimiento del medio del fondo del tubo dejando un rea clara. 22

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico Si el microorganismo en estudio es anaerognico, no hay produccin de gases. C) Produccin de cido sulfhdrico (SH2): Si el microorganismo en estudio produce este cido, se manifestar por la presencia de un precipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda del tubo. Si el microorganismo en estudio no produce este cido, se manifestar por la ausencia de dicho precipitado.

1.- Glucosa (+), Lactosa (-), H2S (-), Gas (-) 2.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (-), Gas (-) 3.- Glucosa (-), Lactosa (-), H2S (-), Gas (-) 4.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (-), Gas (+) 5.- Glucosa (+), Lactosa (-), H2S (-), Gas (+) 6.- Glucosa (+), Lactosa (-), H2S (+), Gas (+) 7.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (+), Gas (+) 8.- Glucosa (-), Lactosa (-), H2S (+), Gas (-) 9.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (+), Gas (+)

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico HIDRLISIS DE ALMIDN Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio de una enzima capaz de hidrolizarel almidn. Esta enzima es muy comn en distintos miembros del gnero Bacillus. MATERIALES: - Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - Placas de Petri con agar almidn. - Lugol. PROCEDIMIENTO: 1.- Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa con agar almidn. 2.- Incubar a 37 C hasta observar desarrollo. 3.- Inundar la placa con lugol. 4.- Dejar actuar 10 minutos. 5.- Observar la coloracin. INTERPRETACIN DE RESULTADOS: Prueba positiva: halos de degradacin (marrones o transparentes) alrededor de las colonias sobre fondo azul. Prueba negativa: ausencia de halos; coloracin azul alrededor de las colonias (presencia de complejo Iodo-almidn).

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ENZIMAS SISTEMA TRANSPORTE ELECTRONES CATALASA La catalasa es una enzima respiratoria, es una porfirina de hierro cuya funcion es desdoblar los peroxidos en H2O y O2. Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar los gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+)de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas: 1. Mtodo del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Mtodo del tubo de ensayo:

Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en bisel densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico OXIDASA FUNDAMENTO: La Prueba de la Oxidasa hace una diferenciacin inicial de las bacterias Gram. negativas. Se basa en que determinadas bacterias poseen las enzimas citocromo oxidasa o indofenol oxidasa, que catalizan el transporte de electrones. En esta prueba, un tinte incoloro, como el dihidrocloruro de p-fenilendiamina sirve como un aceptor artificial de electrones para la enzima oxidasa. El tinte es oxidado y forma el compuesto coloreado, azul de indofenol. Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus, Staphylococcus y Micrococcus (-) de algunas especies de Pseudomonas u Aeromonas (+). MATERIALES: - Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - Tiras de papel de filtro impregnadas en reactivo de Kovacs (1 naftol + dimetilparafenilendiamina). PROCEDIMIENTO: 1.- Levantar con el asa de platino una colonia del cultivo puro. 2.- Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de oxidasa, asegurndose de extender bien el material. 3.- Esperar 5-10 segundos y observar la coloracin. INTERPRETACIN DE RESULTADOS: Prueba positiva: la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa vira al color azul por oxidacin de dicho compuesto a azul de indofenol. Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa no se modifica.

A: oxidasa positivo

B: oxidasa negativo 27

Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico REDUCCIN DE NITRATOS Se determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito o en nitrgeno libre. Muchos organismos pueden llevar a cabo una reduccin no asimiladora del nitrato, que acta como aceptor final de electrones. Este proceso es facultativo y se produce cuando hay disponibilidad de oxgeno muy baja o nula. Corresponde a una respiracin anaerobia, es un proceso de oxidacin por el cual las sustancias inorgnicas, especialmente el nitrato que proporciona el oxgeno para que sirva como aceptor de electrones para suministrar energa. La reduccin del nitrato da lugar a nitrito como producto final, que a su vez puede ser reducido hasta la produccin de derivados gaseosos (desnitrificacin). La presencia de nitritos en el medio de cultivo, originados por la reduccin de los nitratos, puede detectarse con reactivos adecuados. El caldo base se debe ajustar a un pH = 7.0. Extracto de carne Peptona KNO3 Agua destilada 3g 5g 1g 1L

Una vez preparado el medio se coloca en tubos que deben contener campanas Durham para detectar produccin de gases. Luego se esteriliza el medio a 121C durante 20 minutos. PROCEDIMIENTO: Despus de inocular los tubos, estos deben ser incubados a 37C durante al menos 24 horas y hasta cinco das. Luego se procede a la lectura, observndose en primer lugar la presencia o no de gases. Luego se adicionan los reactivos de nitratos, un ml de solucin A y un ml de solucin B, a cada tubo. La aparicin de un color rojo intenso indica la presencia de nitritos en el medio y por tanto la positividad de la reaccin. A los casos que resulten negativos se les debe agregar granalla de zinc para determinar si los nitratos han sido reducidos, si aparece una coloracin roja es debido a que en el medio existen nitratos; una ausencia de color rojo indicara que no hay nitratos en el medio (estos han sido reducidos inicialmente a nitritos, y despus a gas), siendo en este caso la prueba considerada como positiva. Reactivo A: Solucin al 0,8% de cido sulfanlico en cido actico 5N. Reactivo B: Solucin al 0,5% de alfa-naftilamina en cido actico 5N. Ambas soluciones se disuelven por calentamiento suave. Esta prueba ayuda a la identificacin de Enterobacterias que por lo general reducen los nitratos.

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico

COMPUESTOS COMO FUENTE NICA DE CARBONO UTILIZACIN DE CITRATO Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono para el metabolismo, provocando una alcalinizacin en el medio. Los microorganismos que utilizan el citrato tienen la enzima citrato permeasa, que permite el paso del citrato a travs de la membrana celular. El medio a utilizar para esta prueba es el Kocer Citrato (lquido) o Citrato de Simons (slido e inclinado en tubo). Estos medios contienen citrato como nica fuente de carbono, sales minerales, y adems un indicador de pH, el azul de bromotimol. INTERPRETACIN DE RESULTADOS: El medio en un principio es de color verde y cuando un microorganismo utiliza el citrato ocurre una alcalinizacin del medio, variando de verde a azul. Color azul en el medio, prueba del citrato + Color verde en el medio, prueba del citrato

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Pruebas Bioqumicas: Productos qumicos y biolgicos para el diagnstico OTRAS PRUEBAS PRUEBA DE EXTRACCIN DE PIGMENTO CON CLOROFORMO Esta prueba bioqumica permite investigar los pigmentos producido por cepas de Pseudomonas. MATERIALES: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo nutritivo. - cloroformo PROCEDIMIENTO: 1.- Sembrar el microorganismo en estudio en caldo nutritivo. 2.- Incubar a 37 C. 3.- Agregar 1 ml de cloroformo al contenido del tubo y agitar. 4.- Observar los resultados. INTERPRETACIN DE RESULTADOS: Prueba positiva: La fase clorofrmica toma color azul verdoso por extraccin de piocianina. Prueba negativa: La fase clorofrmica permanece amarilla (no se extrajo pigmento).

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