1 Semestre - Licenciatura em Bioqumica

Introduo Bioqumica Professor Pedro Tavares

Actividade Experimental N 4

Titulao cido-Base de um Aminocido

Relatrio Realizado por:

Amlia Delessi N39650 Andreia Franco N39329 Mariana Campanio N40138 Rita Manguinhas N40082

25 de Novembro de 2012

Introduo Bioqumica

Titulao cido-Base de um Aminocido

1 ndice
1. 2. Resumo ................................................................................................................................ 3 Fundamentos tericos ....................................................................................................... 3 2.1 2.2 Titulao....................................................................................................................... 3 Titulao de um aminocido ..................................................................................... 4 Aminocidos ........................................................................................................ 4 Zwitterion.............................................................................................................. 4 Ponto Isoelctrico ............................................................................................... 5 Curva de Titulao de um Aminocido ........................................................... 5

2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 3.

Protocolo Experimental...................................................................................................... 7 3.1 3.1 Material......................................................................................................................... 7 Procedimento .............................................................................................................. 8

4. 5. 6. 7.

Resultados Experimentais ................................................................................................ 9 Discusso de Resultados ................................................................................................ 10 Concluses ........................................................................................................................ 13 Bibliografia ......................................................................................................................... 13 7.1 7.2 Livros .......................................................................................................................... 13 Web............................................................................................................................. 14

Ilustrao 1 - Titulao cido-Base ......................................................................................... 3 Ilustrao 2 - Imagem representativa de um aminocido .................................................... 4 Ilustrao 4 - Curva modelo de uma titulao de um aminocido ...................................... 6 Ilustrao 3 - Representao de um aminocido na sua forma Zwitterionica ............................. 5 Ilustrao 5 - Esquema de Montagem .................................................................................... 7 Ilustrao 6 - Processo de Calibrao do Elctrodo ............................................................. 8 Ilustrao 7 - Demonstrao do ponto 5 ................................................................................. 8

Tabela 1 - Tabela de reagentes (fonte: wikipdia.org) ......................................................... 7 Tabela 2 - pH do titulado medida que foi adicionado determinado volume de NaOH.9 Tabela 3 - Valores tabelados dos pKa's dos 20 principais aminocidos ......................... 11 Tabela 4 - pH esperado ao adicionar x equivalentes de NaoH......................................... 13

Grfico 1 - Curva de titulao para o aminocido x .............................................................. 9

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Titulao cido-Base de um Aminocido

1. Resumo
Neste trabalho experimental foi feita a titulao de um aminocido desconhecido com Hidrxido de Sdio (NaOH) como titulante. A partir da sua curva de titulao e os respectivos equivalentes, previamente calculados, foi possvel verificar os pKas deste e, posteriormente, a sua identificao. Embora esta identificao tenha alguns erros associados, chegou-se concluso que o aminocido X (etiqueta branca) ser, provavelmente, a alanina.

2. Fundamentos tericos
2.1 Titulao

A Titulao um processo laboratorial cujo objectivo determinar a concentrao de uma soluo, usando outra soluo com uma concentrao conhecida. Para tal, procede-se neutralizao da soluo em estudo com uma base ou cido forte, pois os cidos e bases fortes dissociam-se completamente e, por essa razo, fornecem pontos finais ntidos.

Ilustrao 1 - Titulao cido-Base (fonte: brasilescola.com)

Uma Titulao feita com base num princpio que menciona que o nmero de equivalentes - quantidade de matria (g) de uma substncia que pode reagir com 6,022 x 1023 eletres - do soluto do titulante igual ao nmero de equivalentes do soluto do titulado. A partir deste princpio, temos a frmula fundamental da volumetria:

CA VA CB VB

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Titulao cido-Base de um Aminocido CA= Concentrao do titulado VA= Volume do titulado CB= Concentrao do titulante VB= Volume do titulante
(adaptado de: infoescola.com; pt.scribd.com)

2.2
2.2.1

Titulao de um aminocido
Aminocidos

Protenas (do grego proteios, que significa primeiro) so um composto orgnico que esto presente e so vitais para todas as clulas vivas. Todas as protenas so

constitudas por aminocidos. O nmero de aminocidos pode variar desde dois at vrios milhares. Existem centenas de

aminocidos mas a maior parte das protenas so construdas utilizando apenas os vinte essenciais.
Ilustrao 2 - Imagem representativa de um aminocido (Fonte: pt.wikipdia.org)

Estes aminocidos tm todos uma estrutura semelhante, pois todos eles so compostos por um grupo carboxilo, um grupo amina, uma cadeia lateral - geralmente representada por um R - e um proto. Estes quatro elementos so unificados por um carbono central, usualmente referido como o carbono- . Com excepo da glicina, em que a cadeia lateral um proto, o carbono um ponto quiral.

(adaptado de: COX, Michael M.NELSON, David L.; wikipedia.org)

2.2.2

Zwitterion

Os grupos funcionais amina e carboxilo num aminocido fornecem-lhe caractersticas anfotricas, ou seja, o aminocido pode comportar-se tanto como cido ou como base. Isto deve-se ao facto de o grupo carboxilo (COOH) poder ser desprotonado, ficando (COO-), e o grupo amina (NH2) poder ser protonado positivamente (NH3+). Quando os valores do pH so mais elevados que o pKa do grupo carboxilo, este encontra-se desprotonado e quando os valores de pH encontram-se abaixo do pKa do do grupo amina encontramos NH3+ em vez de NH2. Quando isto acontece a Pgina anula a carga positiva do grupo amina. A este estado molecular chamamos estado zwitterinico.
(adaptado de: COX, Michael M.NELSON, David L.; wikipedia.org)

carga geral do aminocido nula, uma vez que a carga negativa do grupo carboxilo

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Ilustrao 3 - Representao de um aminocido na sua forma Zwitterionica

(fonte: studyschoollearnsucceed.blogspot.com)

2.2.3

Ponto Isoelctrico

Da curva de titulao tambm conseguimos deduzir a relao entre a carga geral de um aminocido e o seu pH. Quando os valores pH variam entre os dois pKas, a forma zwitterinica a que existe em maior abundncia, mas continuam a existir em pequenas quantidades aminocidos carregados positivamente e negativamente. No ponto intermdio do pKa, as espcies positivas e negativas esto em igual concentrao, ou seja, a carga global da soluo nula. A este valor de pH especfico chama-se ponto isoelctrico e dado pela frmula pI

1 ( pK1 pK 2 ) ., sendo estes 2

pKas aqueles que esto nos equilbrios imediatamente antes e depois da espcie neutra, ou seja, em que a carga formal do aminocido igual a zero.
(adaptado de: COX, Michael M.NELSON, David L.; wikipedia.org; Chemistry.msu.edu)

2.2.4

Curva de Titulao de um Aminocido

As titulaes dos aminocidos so muito semelhantes a titulaes de cidos com mais do que um proto. Assim, na curva de titulao do aminocido h vrios pontos onde este vai ser desprotonado. Para titular um aminocido geralmente utilizase uma base forte como o NaOH.

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Ilustrao 4 - Curva modelo de uma titulao de um aminocido (Fonte: sci.sdsu.edu)

1.Quando

iniciamos

titulao,

aminocido

encontra-se

na

sua

forma

completamente protonada. 2.Chegamos ao primeiro meio ponto de equivalncia. Neste momento j adicionamos base suficiente para que a concentrao de molculas, que j perdeu um proto, seja igual concentrao daquelas que ainda no perdeu.

3.No primeiro ponto de equivalncia, todos os grupos carboxilos j perderam um proto. Neste ponto da titulao, o aminocido encontra-se na sua forma zwitterinica.

Este ponto o ponto isoelctrico.

Esta segunda parte da titulao corresponde remoo do proto do grupo anima. 4.Neste segundo ponto de meia titulao, a concentrao entre o 2 par conjugado de cido/base igual. Assim encontramos outro ponto em que o pH=pKa2. 5. Neste ponto, a titulao est completa, uma vez que j retiramos o segundo proto a todos os aminocidos presentes na soluo.

(adaptado de: COX, Michael M.NELSON, David L.; Chem.uluc.edu)

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3. Protocolo Experimental
Aminocido x (alanina) C3H7NO2 89.09 g/mol

Hidrxido de Sdio Frmula molecular Massa Molar

NaOH 39,9971 g/mol

Cuidados Corrosivo, R35, R36/38, S1/2, S26, S37/39, S45

Tabela 1 - Tabela de reagentes (fonte: wikipdia.org)

3.1 Material
Pipeta volumtrica de 50 mL 0,05 mL (1); Gobels de 250ml e de 100ml (2); Elctrodo de pH Crison pH meter Basic 20; Bureta de 25 mL 0,030 mL; Pompete; Suporte para montagem (3); Placa de agitao com agitador (4); gua desionizada; Solues para calibrao do elctrodo; Pipeta de Pasteur mais pipetador; Aminocido x 0,01M e NaOH 0,1M.

Ilustrao 5 - Esquema de Montagem

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3.1

Procedimento

1. Calcular o valor de um equivalente para a base utilizada (NaOH); 2. Calibrar o elctrodo: 2.1. Retirar a soluo de armazenamento; 2.2. Lavar com gua desionizada e limpar com papel de laboratrio; 2.3. Mergulhar a soluo cujo pH 7 e calibrar; 2.4. Lavar e limpar novamente; 2.5. Repetir o procedimento com uma soluo de pH 4.

Ilustrao 6 - Processo de Calibrao do Elctrodo

3. Medir 50 mL de soluo de aminocido num gobel e adicionar uma barra de agitao; 4. Introduzir o elctrodo no gobel com o mximo cuidado de modo a que este no interfira com a agitao nem com a titulao; 5. Adicionar NaOH na bureta e iniciar o processo de titulao, adicionando pequenos volumes de titulante e tendo especial ateno de adicionar volumes menores perto dos pontos de equivalncia, para que a curva esteja bem definida. Apontar o pH do titulado em funo do volume adicionado de NaOH.

Ilustrao 7 - Demonstrao do ponto 5

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4. Resultados Experimentais
Volume NaoH (mL)
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 4,7 4,9 5 5,3 5,5 5,7

pH
2,39 2,42 2,49 2,59 2,7 2,81 2,96 3,15 3,55 6,84 8,05 8,5 8,69 8,86 8,97 9,11

Volume NaoH (mL)

5,9 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13

pH
9,2 9,26 9,43 9,58 9,74 9,87 10,07 10,27 10,46 10,74 10,88 11,03 11,19 11,25 11,34 11,41

Volume NaoH (mL)

13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20

pH
11,47 11,52 11,57 11,61 11,65 11,67 11,71 11,73 11,77 11,8 11,81 11,84 11,87 11,88

Tabela 2 - pH do titulado medida que foi adicionado determinado volume de NaOH

Curva de titulao
14,00 12,00 10,00 pH 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 Volume de NaOH (mL)
Grfico 1 - Curva de titulao para o aminocido x

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5. Discusso de Resultados
Para qualquer cido, tm-se que: HA + H2O A- + H3O+

Durante uma titulao, quando as concentraes de cido e de base so iguais, diz-se que se atingiu o ponto de equivalncia, ou seja, ncido = nbase. Como a concentrao dada pela frmula , ento n = c V.

Ao volume de titulante que necessrio adicionar ao titulado para que [H3O ]=[OH-], d-se o nome de 1 equivalente. Clculo do volume de 1 equivalente, para a titulao Aminocido X-NaOH: cAA VAA = cNaOH VNaOH Dados: cAA = 0,01 M VAA = 50 mL cNaOH = 0,1 M VNaOH = ?
+

Assim sendo, para se atingir o ponto de equivalncia so necessrios 5 mL de NaOH.

No entanto, necessrio ainda saber os valores de pKa1 e pKa2 para identificar o aminocido X.

pKa = -log (Ka)

pKa = -log

pKa = pH + log

O primeiro valor de pKa obtm-se quando observamos o pH de 2,5 mL (altura em que

aos 7,5 mL, ou seja, pKa = 9,74.

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O segundo valor de pKa obtm-se quando o grfico denuncia outro ponto de inflexo,

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[A-] = [HA], logo o pH = pKa) e em que o grfico sofre um ponto de inflexo: 2,81

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O ponto isoeltrico calcula-se da seguinte forma:

PI

pKa1 pKa 2 logo, PI AAx 6, 275 2

Tabela 3 - Valores tabelados dos pKa's dos 20 principais aminocidos (fonte: Lehninger Principles of
Biochemistry 5th edition)

Analisando os valores tabelados dos pKa1 e pKa2 para os 20 principais aminocidos, verificou-se que o aminocido que mais se aproxima do aminocido X a alanina. Chegou-se a esta concluso comparando apenas o valor do segundo pKa pois pensa-se que seja o mais correcto. A razo pela qual o primeiro pKa tenha sido desprezado deve-se ao facto de que para o aminocido estar na forma totalmente protonada, teve que se adicionar cido clordrico (visto que ao comprar-se o aminocido ele vem na forma zwiterionica). Se a quantidade de HCl adicionada for em excesso, o NaOH vai reagir primeiro com o HCl e s depois com o aminocido, alterando, assim, o valor do primeiro pKa.

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Desvio%

valorexp erimental valortabelado valortabelado

100

DesviopKa1 20, 09%

DesviopKa 2 0,52%

DesvioPI 4, 41%
Embora os desvios em relao aos valores tabelados no tenham sido muito significativos, exceptuando o do primeiro pKa, houve algumas dificuldades em identificar o aminocido X, no s por ter havido uma subida repentina do pH (dificultando a leitura do mesmo), como tambm por serem 3 valores experimentais a comparar com os respetivos valores tabelados. Estes desvios verificaram-se devido ao aminocido X estar contaminado, visto que a amostra j fui usada anteriormente por vrios grupos de trabalho. Tambm podem ter sido devido a erros pessoais na titulao ao manusear a quantidade de NaOH para titular o aminocido.

A partir do aminocido identificado foi feita a seguinte tabela, com uma estimativa dos valores esperados aquando da titulao da alanina: LH2+ LH LpKa1 = 2,34 pKa2 = 9,69 Ka1 = 4,57 x 10-3 Ka2 = 2,04 x 10-10 Equivalentes adicionados LH2+ + H2O LH + H3O+ 0,01 0 0 0,01-x x x Ka1 = => 4,57 x 10-3 = pH esperado 0,01-x 0,01 6,76x10-3 0,01

=> x = 6,76 x 10-3

0,5

pH = -log[ H3O+] = -log(6,76x10-3) = 2,17 LH2+ + H2O LH + H3O+ 0,01x0,5 0,01x0,5 0,01x0,5 Como [LH] = [LH2+], log =0 pH = pKa1 + log => pH =2,34

pH = = 6,015 pI = pH = 6,015, porque a espcie maioritria (LH) neutra. Como [LH] = [L-], log =0

1,5 2

pH = pKa2 + log L + H2O LH + OH

-

=> pH =9,69
-

V2eq = 10 mL Vtotal = 60 mL

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LH + H2O L- + H3O+ 0,01x0,5 0,01x0,5 0,01x0,5

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Titulao cido-Base de um Aminocido 0,01x -x x x => 4,90x10-5 = c1V1 = c2V2 => 0,01x50 = c2x60 => => x = 6,39x10-4

c2=0,01x M Kb = = pOH = -log[OH-] = -log(6,39x10-4) = 3,19 pH = 14 pOH = 10,81 Vtotal = 50 + 12,5 = 62,5 mL 2,5 [OH-] = = 4x10-3 M pOH = -log[OH-] = -log(4x10-3) = 2,40 pH = 14 pOH = 11,60 Vtotal = 50 + 15 = 65 mL [OH-] = = 7,69x10-3 M pOH = -log[OH-] = -log(7,69x10-3) = 2,11 pH = 14 pOH = 11,89 Vtotal = 50 + 17,5 = 67,5 mL [OH-] =
-

3,5

= 0,011 M

pOH = -log[OH ] = -log(0,01) = 2,00 pH = 14 pOH = 12,00 Vtotal = 50 + 20 = 70 mL 4 [OH-] = = 0,014 M pOH = -log[OH ] = -log(0,014) = 1,85 pH = 14 pOH = 12,15

Tabela 4 - pH esperado ao adicionar x equivalentes de NaOH

6. Concluses
Nesta actividade experimental foi realizada uma titulao de um aminocido, da qual foi obtida uma curva de titulao, e a partir desta, os respectivos pKas. Aps os resultados obtidos e a anlise dos mesmos, concluiu-se que, embora o erro do primeiro pKa tenha sido elevado, o aminocido X era a alanina. Tambm se verificou que este aminocido no podia ter cadeia lateral ionizvel, visto que na sua curva de titulao houve a existncia de apenas 2 pKas.

7. Bibliografia
7.1

Livros

NELSON, David L. COX, Michael M.; Lehninger - Principles of Biochemistry; W.H. Freeman and Company; New York; 2008

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7.2

Web

http://pt.scribd.com/doc/37371876/12/Titulacao-de-solucoes-e-principio-deequivalencia www.infoescola.com/quimica/titulometria http://pt.scribd.com/doc/37371876/12/Titulacao-de-solucoes-e-principio-deequivalencia http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid Chemistry.msu.edu Chem.uluc.edu

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