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Cancer/Radiother 2001 ; 5 : 109-29 2001 ditions scientiques et mdicales Elsevier SAS.

Tous droits rservs S1278321801000877/SSU

Mise au point

Mcanismes molculaires contrlant le cycle cellulaire : aspects fondamentaux et implications en cancrologie


J.F. Viallard1,2*, F. Lacombe2, F. Belloc2, J.L. Pellegrin1, J. Reiffers2
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Service de mdecine interne et maladies infectieuses, centre Franois-Magendie, hpital du Haut-Lvque, 5, avenue Magellan, 33604 Pessac, France ; 2laboratoire de greffe de moelle, UMR-CNRS 5540, universit Victor-Segalen, 146, rue Lo-Saignat, 33076 Bordeaux, France (Reu le 16 juin 2000 ; accept le 13 dcembre 2000)

RESUME Introduction. La connaissance des mcanismes rgulant la division des cellules eucaryotes a progress trs rapidement au cours des dernires annes et les molcules rgulatrices du cycle cellulaire jouent un rle de plus en plus important dans les processus cancreux. Nous nous proposons dans cette revue de dcrire les principaux mcanismes de contrle du cycle cellulaire. Nous aborderons, par quelques exemples, les liens entre la drgulation du cycle cellulaire et loncognse. Actualits et points forts. Le cycle cellulaire des cellules de mammifres est divis en quatre phases survenant selon un ordre tabli, chaque phase ne pouvant dbuter que si la prcdente est totalement termine. Le droulement correct des phases successives du cycle cellulaire est assur par une famille de kinases srinethronine dites kinases dpendantes des cyclines (CDK). La chronologie de leur activation est dtermine par leurs modications post-traductionnelles (phosphorylations/dphosphorylations), et par lassociation une cycline, qui constitue la sous-unit rgulatrice du complexe enzymatique. On distingue les cyclines dites G1 (cyclines C, D1-3 et E) qui contrlent la progression en phase G1 et la transition G1/S, et les cyclines dites mitotiques (cyclines A et B) qui interviennent la transition G2/M et en mitose. Les complexes cycline/CDK activs phosphorylent (et en consquence inhibent), entre autres, la protine suppresseur de tumeur pRb qui bloque le passage vers la phase S en rprimant lactivit transcriptionnelle des facteurs de la famille E2F. Les cyclines D et leurs partenaires CDK4 et CDK6 ont des proprits pro-oncognes mais leur fonction est rgule par une srie dinhibiteurs qui se lient eux et inhibent leur activit kinase. On distingue les membres de la famille INK4

(p16INK4A, p15 INK4B, p18INK4C, p19INK4D) qui interagissent spciquement avec CDK4 et CDK6, et les membres de la famille CIP/KIP (p21CIP1/WAF1, p27KIP1 et p57KIP2) qui inhibent un grand nombre de CDK. Linteraction entre p16INK4A, cycline D/CDK, et pRb/E2F constitue une unit fonctionnelle connue sous le nom de voie pRb . Chacun des composants de cette voie peut tre drgl dans un processus cancreux, et de plus en plus de donnes dsignent cette voie comme une cible obligatoire des tapes de loncognse dans pratiquement tous les cancers. Perspectives et projets. Les progrs raliss dans la connaissance des mcanismes rgulateurs du cycle cellulaire ont permis une meilleure comprhension des mcanismes molculaires de la cancrisation. Ces progrs ont dbouch sur la dcouverte de nouveaux leviers thrapeutiques, et de nouvelles molcules sont en dveloppement. Enn, le rle des molcules rgulatrices du cycle dans dautres pathologies que le cancer est probable et reste dnir. 2001 ditions scientiques et mdicales Elsevier SAS
cycle cellulaire / cycline / inhibiteurs des CDK / kinases dpendantes des cyclines (CDK)

*Correspondance et tirs part. Adresse e-mail : jean-franois.viallard@chu-bordeaux.fr (J.F. Viallard).

ABSTRACT Molecular mechanisms controling the cell cycle: main considerations and implications in oncology. Introduction. Comprehension of cell cycle regulation mechanisms has progressed very quickly these past few years and regulators of the cell cycle have gained widespread importance in cancer. This review rst summarizes major advances in the understanding of the control of cell cycle mechanisms. Examples of how this control is altered in tumoral cells are then described. Current knowledge and key points. The typical mammalian cell cycle consists of four distinct phases occurring in a well-dened order, each of which should be completed

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successfully before the next begins. Progression of eukaryotic cells through major cell cycle transitions is mediated by sequential assembly and activation of a family of serinethreonine protein kinases, the cyclin dependent kinases (CDK). The timing of their activation is determined by their post-translational modications (phosphorylations/ dephosphorylations), and by the association of a protein called cyclin, which is the regulatory subunit of the kinase complex. The cyclin family is divided into two main classes. The G1 cyclins include cyclins C, D1-3, and E, and their accumulation is rate-limiting for progression from the G1 to S phase. The mitotic or G2 cyclins, which include cyclin A and cyclin B, are involved in the control of G2/M transition and mitosis. The cyclins bind to and activate the CDK, which leads to phosphorylation (and then inhibition) of the tumor suppressor protein, pRb. pRb controls commitment to progress from the G1 to S phase, at least in part by repressing the activity of the E2F transcription factors known to promote cell proliferation. Both the D-type cyclins and their partner kinases CDK4/6 have proto-oncogenic properties, and their activity is carefully regulated at multiple levels including negative control by two families of CDK inhibitors. While members of the INK4 family (p16INK4A, p15 INK4B, p18INK4C, p19INK4D) interact specically with CDK4 and CDK6, the CIP/KIP inhibitors p21CIP1/WAF1, p27KIP1 and p57KIP2 inhibit a broader spectrum of CDK. The interplay between p16INK4A, cyclin D/CDK, and pRb/E2F together constitute a functional unit collectively known as the pRb pathway. Each of the major components of this mechanism may become deregulated in cancer, and accumulating evidence points to the pRb pathway as a candidate obligatory target in multistep oncogenesis of possibly all human tumor types. Future prospects and projects. Major advances in the understanding of cell cycle regulation mechanisms provided a better knowledge of the molecular interactions involved in human cancer. This progress has led to the promotion of new therapeutic agents presently in clinical trials or under development. Moreover, the components of the cell cycle are probably involved in other non-cancerous diseases and their role must be dened. 2001 ditions scientiques et mdicales Elsevier SAS
cell cycle / cyclin / cyclin dependent kinase (CDK) / inhibitors of CDK

Jusquau XIXe sicle, les scientiques navaient quune vague ide des lments qui constituent les tres vivants et de la faon dont ceux-ci peuvent se dvelopper et crotre. En 1665, lAnglais Robert Hooke avait bien dcrit les units microscopiques quil discernait, avec un microscope de sa fabrication, dans des coupes de lige. Il les nomma cellules, du latin cellula, petite chambre. la n des annes 1830, deux Allemands, le botaniste Matthias Schleiden (18041881), puis le zoologiste Thodor Schwann (18101882), ont propos la thorie cellu-

laire faisant de la cellule lunit de base de tout organisme vivant. En 1858, lAllemand Rudolf Virchow (18211902) a complt cette thorie en formulant le clbre axiome : toute cellule provient dune cellule , conduisant au concept de multiplication cellulaire par division. Luf issu de la fcondation dune cellule sexuelle femelle par un gamte mle, et qui donne naissance un embryon partir duquel se construit, division aprs division, un organisme aussi complexe que lhomme, est devenu, la n du XIXe sicle, le symbole de ce processus vital. Cependant, au cours du dveloppement embryonnaire, les cellules se diffrencient pour permettre la formation des divers organes. Au cours de ce processus, la division cellulaire est inhibe dans certaines rgions de lembryon. De mme, chez les organismes pluricellulaires adultes, il existe une htrognit parmi les cellules. Certaines cellules diffrencies ne se divisent plus (cellules du muscle squelettique par exemple), dautres continuent se diviser pendant toute la vie de lorganisme (cest le cas des cellules souches hmatopotiques), dautres enn ne se divisent que pour rparer une lsion ou compenser la mort dautres cellules (cellules de la peau par exemple). Toutes ces diffrences ne peuvent sexpliquer que par lexistence dun mcanisme de contrle de la division cellulaire. Il fallait donc identier les molcules participant la croissance et la division de la cellule pour ensuite lucider les mcanismes de rgulation du cycle de division. Ces molcules ont t dcouvertes dans les levures, les ufs damphibiens puis dans les cellules de mammifres. Les 15 dernires annes ont connu une vritable explosion des connaissances des mcanismes qui rgulent le cycle cellulaire. Cela a permis de proposer des principes gnraux qui semblent rgler la division cellulaire chez des tres vivants aussi diffrents que lhomme, la levure de bire (saccharomyces cerevisiae) ou encore la levure ssile (saccharomyces pombe). Du coup ces dcouvertes ont ouvert la voie une meilleure comprhension des mcanismes molculaires de la cancrisation qui dcoule de la multiplication de cellules anormales. Le droulement ordonn des diffrentes phases du cycle cellulaire ainsi que leur rgulation par les stimuli intra- et extracellulaires sont rguls par des protines srine/thronine kinases : les kinases dpendantes des cyclines ou CDK (cyclin dependent kinase) [120]. Les CDK subissent des phosphorylations qui modulent leur activit. Cette activit est de plus dpendante de lassociation avec des protines appeles cyclines dont lexpression (synthse et dgradation) est rgule lors de la progression dans le cycle. ce jour, pas moins de huit CDK (CDK1 CDK8) et huit diffrents types de cyclines ont t mis en vidence et clons chez les mammifres. Enn, lactivit des CDK est ngativement rgule par des inhibiteurs (cyclin dependant kinase inhibitor ou CKI). Ainsi,

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les mcanismes de rgulation du cycle font intervenir trois groupes de protines : les CDK, les cyclines et les CKI. Nous nous proposons dans cette revue de dcrire les principaux aspects fondamentaux qui rgissent la progression dans le cycle cellulaire. Par ailleurs, nous verrons, par quelques exemples, quelles rpercussions les altrations survenant dans ces mcanismes contribuent au processus de cancrisation. Il ne sagit pas ici de faire une revue exhaustive mais dapporter les bases fondamentales ncessaires la comprhension du rle oncologique des protines du cycle cellulaire. LES TAPES DU CYCLE CELLULAIRE Les eucaryotes, de la levure lhomme, ont des cycles de division similaires. Les premires tudes par microscopie optique ont permis de dnir cinq tapes dans le cycle cellulaire : G0, G1, S, G2 et M (gure 1). G1 signie pause 1 (gap = pause, do le G) car il sagit dune pause dans le cycle durant laquelle on nobserve, au microscope, aucun phnomne li au cycle cellulaire. La plupart des cellules adultes, diffrencies, ne se divisant pas, se trouvent en phase G1 ou en tat de quiescence qui dnit la phase G0. S signie synthse dADN. Cest pendant cette phase que les chromosomes se rpliquent. Le brin nouvellement synthtis est exactement complmentaire la matrice. G2 signie pause 2 , cest le second arrt du cycle cellulaire, la cellule se prparant la mitose. Ltape M est la mitose. Les chromosomes se condensent et deviennent visibles sous la forme dentits indpendantes. Les deux organisateurs des microtubules, ou corps polaires, se dplacent pour se retrouver chacun dun ct du noyau. Des faisceaux de microtubules se dveloppent partir des corps polaires pour former le fuseau mitotique. Quelques-uns de ces microtubules sattachent aux kintochores des chromosomes qui, ainsi attachs, salignent alors sur la plaque mtaphasique qui est un plan situ mi-chemin entre les corps polaires. Lorsque tous les kintochores sont attachs aux microtubules et aligns sur la plaque mtaphasique, un signal est donn et lanaphase dbute. Les chromosomes commencent se dplacer vers les ples qui sloignent par ailleurs lun de lautre. Enn, la cellule se divise (cest la cytodirse) pour produire deux cellules lles en phase G1. LA NOTION DE POINT DE RESTRICTION Une cellule ne peut entrer en cycle que sous leffet de facteurs stimulateurs appels mitognes. Pendant la phase G1, la cellule dcide si elle continue progresser dans le cycle cellulaire, ce qui aboutira la division cellulaire, ou si elle quitte le cycle et entre alors dans un tat de quiescence (G0) ou de diffrenciation. Les mcanismes qui

Figure 1. Les tapes du cycle cellulaire.

contrlent la croissance cellulaire et la diffrenciation dans les organismes multicellulaires semblent donc lis la machinerie du cycle cellulaire prsente en phase G1. Il y a 20 ans, Temin a montr que des cellules de poulet deviennent indpendantes des signaux mitognes extrieurs plusieurs heures avant dentrer en phase S [166]. Cette notion a t reprise et dveloppe plus tard par Pardee qui a introduit le terme de point de restriction (R) [113]. R est le moment de G1 aprs lequel les cellules peuvent prolifrer indpendamment des stimuli extrieurs. La progression en dbut de phase G1 des cellules qui sortent de la mitose (cellules dites postmitotiques, pm) est rapidement interrompue si on enlve les facteurs de croissance du milieu de culture ou si on inhibe la synthse protique (20 50 % dinhibition) [184]. Nanmoins, au-del dun certain temps aprs la mitose (qui diffre selon le type de cellule, broblastique ou pithliale par exemple) les cellules ne sarrtent plus, mme si les facteurs mitognes sont retirs du milieu, mais avancent et effectuent un cycle complet. On distingue donc les cellules dites G1-pm (cellules postmitotiques arrtes par la privation en facteurs de croissance) et les cellules dites G1-ps (prphase S) qui sont capables dinitier une rplication de lADN en absence de facteurs mitognes (gure 2). La transition qui fait passer une cellule de la phase G1-pm la phase G1-ps correspond au terme anglo-saxon commitment : cest lengagement irrversible de la cellule vers un cycle chromosomique complet. Cette transition correspond au point R dit de restriction. LES CYCLINES Les cyclines sont une famille de protines qui subissent des variations de leur taux au cours du cycle et qui partagent toutes un degr de similitude quant leur composi-

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Figure 2. Modle du cycle cellulaire bas sur des expriences faites sur des broblastes humains. Les cellules sortent de la mitose et entrent nouveau en phase G1-pm. La progression jusquau point R est dpendante des facteurs de croissance (FC). Si les FC sont enlevs du milieu, les cellules entrent dans un tat de quiescence (G0). Lorsque les FC sont rintroduits, les cellules retournent au mme point de la phase G1-pm quelles ont quitt lors de leur entre en quiescence (daprs Zetterberg et al. [184]).

tion en acides amins. En effet, les cyclines sont dnies par une rgion commune denviron 100 acides amins appele cyclin box qui sert lier et activer les CDK [68, 78] (gure 3A). On distingue dune part les cyclines dites START ou G1 qui atteignent leur pic dexpression en phase G1 (cycline C, cyclines D : D1, D2 et D3) ou la transition G1/S (cycline E) et dautre part les cyclines dites mitotiques (cyclines A et B) dont le pic dexpression

se situe en G2/M [119]. La gure 3B est un exemple du prol dexpression des principales cyclines dans la ligne HeLa au cours du cycle cellulaire. Ces deux types de cyclines varient dans leur structure gnrale : les cyclines mitotiques ont environ 200 acides amins situs dans la partie N-terminale (gure 3A) alors que les cyclines START stendent en C-terminal pour former une rgion riche en proline, acide glutamique, srine

Figure 3. A : schma gnral de la composition des cyclines. B : exemple dexpression des cyclines au cours du cycle cellulaire dans la ligne cellulaire HeLa.

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et thronine appele PEST . Cette rgion PEST joue un rle dans le renouvellement rapide de ces cyclines et leur confre une demi-vie trs courte [69, 80]. Les cyclines D Les cyclines de type D sont au nombre de trois et sont les premires apparatre lors dune stimulation par des mitognes. Elles sont synthtises tout au long de la stimulation tant que le facteur de croissance reste dans le milieu si bien que les taux des cyclines D varient peu au cours du cycle, avec nanmoins un pic dexpression en G1S. Inversement, ds que le mitogne est retir du milieu, les cyclines D sont rapidement dtruites, quelle que soit la position de la cellule dans le cycle [151] : si la cellule a dpass le point R, leur destruction est sans effet ; si la cellule est en G1, la destruction des cyclines D empche la cellule daller plus loin dans le cycle. Leur synthse dbute en dbut de G1 et leur activit sur les kinases ne se fait quen milieu de G1 et augmente au fur et mesure que les cellules approchent de la transition G1-S [92, 96]. Les partenaires catalytiques majeurs des cyclines D sont CDK4 et CDK6 [4, 92, 96]. La fonction primaire des cyclines D est de stimuler la progression en phase G1. En dpit de leur similitude, les membres de la famille des cyclines D sont diffremment exprims selon la ligne cellulaire. Ainsi, la cycline D1 est absente des cellules de la ligne lymphode [1]. La cycline E La cycline E est une protine nuclaire de 50 kD dont lexpression est maximale en n de phase G1, aprs laugmentation des cyclines D [69]. Elle agit en n de phase G1 en se complexant avec CDK2 [24, 70]. Le complexe cycline E/CDK2 a une forte activit kinase juste avant lentre des cellules en phase S et phosphoryle la protine du rtinoblastome (pRb) [49, 169]. La surexpression de la cycline E raccourcit la dure de la phase G1, diminue la taille de la cellule, diminue la dpendance aux facteurs de croissance et prolonge la dure de la phase S [106, 129]. Des cellules bloques en phase G1 dbutent quand mme la rplication de leur ADN quand la cycline E est surexprime [129]. Des anticorps dirigs contre la cycline E injects dans des cellules en phase G1 inhibent lentre en phase S [106]. Cette inhibition na pas lieu si linjection se fait dans des cellules en phase S ce qui signie que la cycline E est indispensable la transition G1/S. Au cours de la phase S, lexpression de la cycline E diminue car elle est dgrade par le protasome aprs action de lubiquitine [178].

Les cyclines mitotiques Les cyclines mitotiques comprennent la cycline A et la cycline B. Elles possdent une squence dacides amins partiellement conserve (dnomme destruction box) situe en partie N-terminale, indispensable leur destruction rapide et soudaine spciquement pendant la mitose [39]. Cette destruction se fait par la voie de la protolyse dpendante de lubiquitine [161]. Le taux des cyclines mitotiques augmente progressivement au cours des phases S et G2 pour atteindre un pic en mitose. Les cyclines A et B interagissent toutes les deux avec la kinase CDK1 pour dclencher la mitose et la dgradation de ces deux protines est ncessaire pour que la cellule sorte de la mitose [98, 135]. Cependant, la synthse et la destruction de la cycline A ont toujours lieu en avance par rapport la cycline B [98, 135]. La cycline A La cycline A est une protine de 60 kD qui apparat la transition G1/S. Cest la premire cycline qui a t clone et squence [164]. Elle est situe en position nuclaire [117]. Elle a dabord t considre comme une cycline mitotique ne jouant un rle qu la transition G2/M, mais plusieurs expriences ont permis de dmontrer que la cycline A agissait plus prcocement dans le cycle cellulaire, tant dtecte et active ds la n de la phase G1 juste avant lentre en phase S [7]. Lactivit kinase associe la cycline A la transition G1/S est celle de CDK2 et non pas CDK1 [28, 134]. La surexpression de la cycline A entrane une entre prmature en phase S [133]. Les cyclines E et A sont ncessaires au passage en phase S mais ont des fonctions diffrentes. La cycline A serait utile pour dbuter la rplication de lADN. Le complexe cycline A/CDK2 se lie au facteur de transcription PCNA (proliferating cell nuclear antigen, qui est une sous-unit de la polymrase de lADN intervenant dans la rplication et la rparation de lADN) au niveau de certains sites de rplication de lADN et linhibition de la cycline A par des anticorps inhibe la synthse de lADN dans des cellules humaines [8, 109]. La cycline B Il existe trois cyclines B : B1, B2, B3. La cycline B1 est la mieux connue et joue un rle important dans les mcanismes de dclenchement de la mitose. La cycline B1 est cytoplasmique pendant linterphase (en association avec les microtubules et les centrosomes) jusqu la n de la prophase o elle est transfre brutalement dans le noyau alors que la cycline A reste nuclaire [117, 118]. La cycline B1 est intressante car cest une des premires protines du cycle dont la rgulation est non seulement temporelle mais aussi spatiale. En effet, les choses ne sont pas ges. La cycline B1 circule continuellement entre le

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phase, la destruction de la cycline B1 sopre par la voie de la polyubiquitination ce qui est indispensable linactivation du complexe cycline B1/CDK1 et la sortie de la mitose [39]. La destruction est initie par le cyclosome [65]. Les cyclines virales Les virus du groupe herps drglent le cycle cellulaire. Ainsi, lEBV (Epstein-Barr virus) immortalise les lymphocytes B en exprimant deux protines, EBNALP et EBNA2 qui permettent une surexpression de la cycline D2 [156]. Dautres mcanismes daction interviennent et notamment la scrtion de cyclines dites virales. Des travaux rcents ont t rapports concernant lherps virus 8 (HHV8) agent du sarcome de Kaposi, mais qui est galement associ la maladie de Castleman et certains lymphomes survenant notamment chez les sujets infects par le virus de limmunodscience humaine (VIH). Le gnome de lHHV8 contient plusieurs gnes qui partagent de grandes similitudes avec des gnes impliqus dans le contrle du cycle cellulaire et de lapoptose [138]. Un de ces gnes qui code pour une protine homologue aux cyclines de mammifres est dnomm cycline K [11]. Deux autres cyclines virales ont t galement identies : la cycline V et la cycline M qui sont codes par des herps virus contaminant des animaux [163]. Ces cyclines ont une homologie de squence troite avec les cyclines D ; par ailleurs, les cyclines K et V forment prfrentiellement des complexes avec la kinase CDK6 [40]. Les cyclines virales ressemblent donc aux cyclines D tant par leur fonction que par leur squence. Leur expression entrane des drglements du cycle donnant un avantage prolifratif aux cellules infectes. Implications des cyclines en cancrologie Parmi les cyclines jouant un rle dans la progression de la phase G1 et dans le passage la phase S (cyclines D, cycline E et cycline A), seules les cyclines D sont frquemment impliques dans les tumeurs. Lexemple le plus marquant est lexpression ectopique de la cycline D1 dans les lymphomes B (notamment les lymphomes du manteau folliculaire) [144]. Cette expression anormale est le plus souvent la consquence de la juxtaposition du gne de la cycline D1 aux rgions rgulatrices des chanes lourdes des immunoglobulines par une translocation t(11 ;14)(q13 ;q32). La cycline D1 a t la premire cycline D tre identie dans les macrophages de souris [93]. Elle a galement t identie comme le produit du gne PRAD1, un rarrangement connu dans les adnomes humains parathyrodiens [101] (inversion du chromosome 11, le gne de D1 devenant li au gne codant pour la parathormone,

Figure 4. La cycline B1 a une localisation cytoplasmique jusqu la prophase (reprsente en gris sur la gure). Il existe un va-et-vient permanent de la cycline B1 entre le noyau et le cytoplasme mais limport nuclaire (assur par limportine ) est contrebalanc par lexport nuclaire (assur par CRM1) qui est plus rapide si bien que la cycline B1 est cytoplasmique. la prophase, la phosphorylation de quatre rsidus serine dans le site appel CRS de la cycline B1 empche la reconnaissance de la cycline B1 par CRM1 si bien que la cycline B1 devient nuclaire.

noyau et le cytoplasme pendant linterphase [41, 42, 167]. Cependant, la cycline B1 saccumule dans le cytoplasme car limport nuclaire est contrebalanc par lexport nuclaire qui est plus rapide. En effet, pendant linterphase, le complexe cycline B1/CDK1 est maintenu dans le cytoplasme grce lactivit dun facteur nuclaire dexportation appel CRM1 ou exportine. En position N-terminale, la cycline B1 possde un signal dit de rtention cytoplasmique (CRS) qui correspond une rgion de 42 acides amins [118]. Si on injecte dans le noyau de cellules HeLa en phase G2, de la cycline B1 dpourvue du CRS, la protine reste nuclaire. Le CRS est donc plus un signal dexport nuclaire quun signal de rtention cytoplasmique. Le CRS possde une rgion hydrophobe de 11 acides amins hautement conserve parmi les cyclines de type B chez les mammifres. Dans cette rgion, il existe quatre rsidus srine qui, sils sont phosphoryls, empchent la reconnaissance du CRS par CRM1. En consquence, cest la phosphorylation de ces quatre rsidus srine qui stoppe la sortie de la cycline B1 du noyau en prophase (gure 4). Les protines kinases qui phosphorylent la cycline B1 en CRS pour rguler sa rtention nuclaire restent identier. Ds que la cycline B1 devient nuclaire, lenveloppe nuclaire explose, signiant que le complexe cycline B1/CDK1 agit comme une kinase des lamines nuclaires. La cycline B1 se lie alors lappareil mitotique, en particulier aux ples du fuseau et ses bres principales. En dbut de mtaphase, la cycline B1 sassocie transitoirement aux chromosomes condenss. Ds lentre en ana-

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inv [11] [p15 ;q13]), le produit de loncogne bcl-1 [176] (translocation 11 ;14 [q13 ;q32]). La translocation (11 ; 14) est caractristique des lymphomes du manteau et dplace lenhancer du gne codant pour la chane lourde des immunoglobulines dans le locus de la cycline D1, laissant le codage de D1 ininterrompu. La cycline D1 est surexprime dans beaucoup de cancers soit par amplication de son gne (43 % des carcinomes tte et cou, 34 % des carcinomes de lsophage, 15 % cancers de la vsicule, 13 % des cancers du sein, 10 % des carcinomes bronchiques petites cellules et des hpatocarcinomes) soit par translocations ciblant le locus de D1 sur le chromosome 11q13 [44]. La cycline D2 est code par un gne situ sur le chromosome 12p13 [56]. Ce gne a t identi comme le site dintgration dun provirus murin responsable dune leucmie T chez la souris et qui entrane une surexpression de la cycline D2 [45]. La cycline D2 est parfois surexprime dans certaines prolifrations malignes telles que les hmopathies lymphodes chroniques B [18] ou dans les lymphocytes B transforms par lEBV [156]. La cycline D3 est code par un gne situ sur le chromosome 6p21 [56]. Ce gne na pas t identi comme un proto-oncogne bien quil soit rarrang dans de multiples dsordres lymphoprolifratifs. LES KINASES DPENDANTES DES CYCLINES (CDK) Toutes les kinases ont dans leur extrmit NH2 terminale une squence xGxPxxxxREx (o x reprsente nimporte quel acide amin). Il sagit dune rgion conserve qui correspond au domaine de liaison aux cyclines [23, 30]. Les CDK sont au nombre de huit. CDK1 (ou p34cdc2) est la premire CDK dcrite chez lhomme. CDK1 est absente des cellules quiescentes. Dans les cellules qui prolifrent, elle peut tre dtecte tout au long du cycle mitotique, mais son ARN messager (ARNm) varie au cours du cycle, avec un minimum en phase G1 [37]. Dans de nombreux types cellulaires, la concentration de la protine varie peu au cours de linterphase mais dans les cellules lymphodes humaines, celle-ci suit les mmes variations au cours du cycle cellulaire que celles de son ARNm [177]. Lactivit enzymatique de CDK1 ne se manifeste que pendant une priode trs courte la transition G2/M, entranant le dclenchement de celle-ci. Linitiation de la mitose est dirige de faon temporelle et spatiale par une cascade de phosphorylation de protines qui aboutit lactivation du complexe cycline B1/CDK1 [105]. Durant la phase S, CDK1 sassocie la cycline B synthtise de novo. CDK1 peut aussi tre active par la cycline A avant lactivation par la cycline B.

CDK2 a une masse molculaire de 33 kDa. Son gne est localis sur le chromosome 12 en 12q13 [19]. Elle acquiert une activit kinase en association avec la cycline A ou E [121, 19]. Le complexe cycline A/CDK2 dveloppe une activit kinase ds la phase G1 tardive jusqu la mtaphase, quand la cycline A est dtruite. Lactivit kinase du complexe cycline E/CDK2 se manifeste aussi ds la phase G1, atteint son maximum en dbut de phase S, puis disparat [121, 19]. Cette kinase, en association avec la cycline E, est indispensable la mise en route de la rplication de lADN [169]. Durant la phase S, la cycline E est remplace dans ce complexe par la cycline A [77]. la diffrence de la plupart des CDK connues, CDK4 na pas dactivit kinase sur les histones H1. Son gne est localis sur le chromosome 12 en 12q13, dans la mme rgion que CDK2 [19]. Ses partenaires rgulateurs sont les cyclines D [91]. Le complexe cycline D1/CDK4 devient actif comme kinase au milieu de la phase G1, avec une activit maximale la transition G1/S, et reste dtectable jusqu la mitose [92]. Les souris knock-out pour CDK4 sont viables, mais sont de petite taille et striles [128]. Ces souris dveloppent un diabte en raison dun dcit en cellules pancratiques. CDK4 pourrait tre un rgulateur spcique de certains types de cellules. CDK5 est retrouve des taux levs dans les neurones et joue un rle essentiel dans le mtabolisme crbral. CDK5 est particulire car elle nest pas active par une cycline et possde des activateurs qui lui sont propres [146]. CDK6 est une protine de 40 kDa formant des complexes avec toutes les cyclines D. Elle a une activit kinase sur pRb. Aprs la stimulation des lymphocytes T par la PHA, cette activit se manifeste ds le milieu de la phase G1 [96]. CDK7 phosphoryle CDK1, CDK2 et CDK4 respectivement sur les rsidus thronine (Thr) 161, 160 et 172, ce qui conditionne leur activation comme kinase des histones H1. Elle se lie la cycline H et subit une phosphorylation sur la Thr 170 pour acqurir lactivit kinase (homologie avec les Thr 161 de CDK1, 160 de CDK2 et 172 de CDK4 toutes faisant lobjet de phosphorylations activatrices). Le complexe cycline H/CDK7 est dnomm CAK (CAK : CDK activating kinase). Ni lexpression de la protine CDK7, ni son activit enzymatique ne varient au cours du cycle mitotique des cellules prolifrantes, ce qui suggrerait un mcanisme particulier gouvernant son action sur les autres CDK [14]. CDK8 est le partenaire CDK de la cycline C. Rgulation de lactivit CDK Lactivation dune CDK est rgule trois niveaux : la liaison une cycline,

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la phosphorylation, la liaison des protines aux fonctions variables mais en gnral inhibitrices. La liaison une cycline est indispensable Une CDK a une structure bilobaire [15, 66, 67] et lie son substrat et lATP dans une partie situe entre les deux lobes. Dans sa forme inactive monomrique, une CDK se lie lATP dans une conformation qui rend impossible une attaque nuclophilique par un substrat hydroxyle sur le pont - phosphate de lATP. De plus, une partie conserve de la kinase (appele boucle T), cache la fente catalytique et empche la liaison aux substrats. La liaison une cycline entrane un changement de conformation de la CDK (gure 5A). Par exemple, en se liant la kinase CDK2, la cycline A modie lorientation de lATP dans la fente catalytique et provoque un dplacement de la boucle T [58, 60]. Ces deux vnements ont pour consquence une neutralisation des deux facteurs principaux qui gardent CDK2 dans une forme inactive. Les rgions de la cycline A et de CDK2 qui interagissent entre elles sont conserves parmi les autres membres des cyclines et des CDK. La liaison la cycline permet la phosphorylation La liaison la cycline ne suffit pas pour activer une CDK (gure 5A). La liaison une cycline fait quune CDK devient accessible laction du complexe CAK qui phosphoryle un rsidu thronine (Thr161 pour CDK1, 160 pour CDK2) dans la boucle T [90]. La boucle T devient ainsi positionne en situation C-terminale loin de la fente catalytique ce qui, dans lexemple concernant CDK2 et la cycline A, stabilise le complexe cycline A/CDK2 [58]. Il existe une phosphatase qui rverse la phosphorylation de la boucle T en Thr par CAK : cest la KAP (CDKassociated phosphatase) [46, 125]. KAP peut se lier aux complexes cycline/CDK, mais peut dphosphoryler une CDK seulement si elle est monomrique. Donc la dphosphorylation dune CDK ne peut ncessairement que suivre la dgradation de la cycline. La phosphorylation dune CDK nest pas forcment synonyme dactivation. Seule la phosphorylation de Thr (160 ou 161 selon la kinase) est activatrice. La phosphorylation de Thr14 et tyrosine (Tyr) 15 (qui seffectue par des kinases telles que wee1 ou Myt1 ou Mik1 selon les espces) inhibe la CDK (gure 5B). Pour tre active, une CDK doit donc tre dphosphoryle sur la Thr 14 et la Tyr 15 ; cest le rle de CDC25 qui est une phosphatase [25, 141]. Lactivit kinase napparat que lorsque la phosphatase code par le gne CDC25 dphosphoryle ces deux acides amins, dbloquant ainsi lenzyme. Le dbut de la mitose est donc dclenche par lactivation de CDC25 et linactivation de Wee1 (kinase qui phosphoryle la Tyr15). Il existe trois isoformes de CDC25 [38] : A, B et C.

Figure 5. A : activation dune CDK grce la liaison une cycline et grce laction de CAK. B : exemple de rgulation de lactivation de CDK1. CDK1 est active si plusieurs conditions sont runies : la liaison une cycline, la phosphorylation en Thr161 par CAK et labsence de phosphorylation en Thr14 et Tyr15. La phosphorylation de ces deux derniers rsidus se fait par des kinases dont le nom varie selon les espces.

CDC25A est implique dans la transition G1/S ; CDC25B et C sont impliques dans linitiation de la mitose. LA PROTINE DU RTINOBLASTOME (pRb) pRb gardienne du point R La protine du rtinoblastome (pRb) est une sorte de gardienne molculaire qui empche la progression en phase G1 [175]. pRb semble agir au point R : cest la gardienne de la porte du point R aprs lequel la cellule est engage irrversiblement dans les autres phases du cycle et donc la division cellulaire. pRb est hypophosphoryle (forme

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Figure 6. Les complexes cycline/CDK, en phosphorylant pRb en n de phase G1, rendent possible lexpression des gnes dpendants des facteurs de transcription de la famille E2F.

active de la molcule) lors de la premire partie de G1 et devient hyperphosphoryle (et donc inactive) aux alentours du point R. La cellule, lorsquelle arrive au point R, ne peut progresser que si pRb devient phosphoryle. Selon le schma le plus probable, les complexes cyclines D/CDK4-CDK6 et cycline E/CDK2 phosphorylent pRb, inhibant ainsi son activit antiprolifrative. Seules les cyclines de type D (pas les cyclines E ni A) peuvent se lier directement pRb [22, 31]. Il est probable que pRb reste phosphoryle au cours des phases S, G2 et M par les CDK dpendantes des cyclines A et B, et ne se dphosphoryle quune fois la mitose termine, les cellules migrant vers la phase G1 (ou G0). pRb se lie aux membres de la famille E2F pRb sous forme dphosphoryle exerce une action antiprolifrative par son association aux facteurs de transcription de la famille E2F et les empche ainsi de transactiver des gnes ncessaires la rplication de lADN. La phosphorylation de pRb, en n de phase G1 libre les facteurs E2F de laction inhibitrice de pRb (gure 6) [87, 162]. En effet, pRb contrle lactivit de plusieurs protines notamment celles de la famille E2F qui sont des facteurs de transcription rgulateurs de la transcription de plusieurs gnes requis pour la progression travers le cycle cellulaire (par exemple les gnes codant pour la thymidine kinase ou pour les cyclines A ou E) ou impliqus dans la rplication de lADN (gnes codant par exemple pour lADN polymrase ou PCNA) [17, 79, 102, 103]. Les protines E2F sont des htrodimres composs dune molcule E2F (E2F-1 E2F6) et dune des protines de la famille DP (DP1 ou DP2) [74]. La formation de

cet htrodimre est importante pour la liaison lADN et la transactivation des gnes. Lactivit des facteurs E2F est trs strictement contrle au cours du cycle cellulaire : ils sont inactifs pendant les deux premiers tiers (environ) de la phase G1 (car les facteurs E2F sont lis pRb) ; ils sont activs lorsque la cellule passe le point de restriction R. La molcule qui contrle les facteurs E2F et autorise leur activation est pRb qui se lie physiquement au domaine transactivateur des protines E2F. Cette interaction se fait via la rgion de pRb dans laquelle sont localises la plupart des mutations observes dans les tumeurs, la poche A/B [174]. La poche A/B est galement le domaine de pRb avec lequel interagissent certaines protines transformantes qui inactivent pRb, comme lantigne T de SV40 ou la protine E1A de ladnovirus. pRb est donc un rpresseur de la transcription qui masque le domaine transactivateur des facteurs E2F avec lequel la protine pRb interagit directement, les empchant ainsi de remplir leur fonction transactivatrice. La phosphorylation de pRb libre les protines E2F leur permettant de se lier aux promoteurs des gnes cits. La transcription peut avoir lieu et la progression dans le cycle se poursuit au-del du point R. Les protines E2F ont un rle primordial dans la transition de G1 S, le facteur E2F-1 pouvant par exemple lui seul promouvoir lentre en phase S de broblastes quiescents [59]. Le promoteur de E2F-1 a plusieurs sites de xation pour les autres facteurs E2F, suggrant que E2F-1 rgule sa propre expression dune faon dpendante du cycle, provoquant alors une forte augmentation des taux des protines E2F libres en n de phase G1 [26]. Une fois la cellule passe en phase S, les membres de la famille E2F sont inactivs. Les complexes cycline A/CDK2 (pas les complexes cycline E/CDK2 qui nont pas cette fonction) se lient aux membres de la famille E2F et phosphorylent DP-1, empchant ainsi leur liaison lADN [71, 72]. LES INHIBITEURS DES KINASES DPENDANTES DES CYCLINES (CKI) Quelle stratgie la cellule peut-elle mettre en jeu pour freiner lactivit kinase des complexes cycline/CDK ? Durant lanne 1993, une rponse cette question a t apporte par la mise en vidence dans les cellules de mammifres dune srie de petites protines capables de lier les complexes cycline/CDK et dinhiber leur activit kinase. Cela fournit la cellule un moyen dinhiber les complexes cycline/CDK en rponse divers stimuli et rduit ses possibilits de passer le point R. Ces protines inhibitrices peuvent participer la rgulation du cycle cellulaire en retardant lactivation des divers complexes cycline/CDK spciques de G1/S jusquau temps adquat

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et en assurant leur mise en uvre ordonne. Ainsi, une lsion de lADN dclenche laccumulation de p53 qui induit lexpression de p21WAF1/CIP1 qui se lie tous les complexes cycline/CDK, et larrt en G1 permettant la rparation de lADN [139]. Deux grandes familles dinhibiteurs des complexes cycline/CDK ont t dcrites. La famille des inhibiteurs KIP/CIP (pour CDK inhibiting protein) est constitue des protines p21WAF1/CIP1 (p21), p27KIP1/ICK/PIC2 (p27) et p57KIP2. Ces protines partagent la proprit dinhiber la plupart des complexes cycline/CDK. loppos, les protines de la famille INK4 (pour INhibitor of CDK4), p16INK4a/MTS1/CDKN2/CDK4I (p16), p15INK4b/MTS2, INK4c/INK6A INK4d/INK6B p18 , et p19 inhibent spciquement CDK4/6. Chacune de ces protines est code par un unique gne et constituent ainsi les principaux rgulateurs de la phosphorylation de pRb. La famille des inhibiteurs KIP/CIP Les protines de cette famille sont nuclaires et ont toutes la proprit de rprimer lactivit de toutes les CDK de faon universelle. Leur action dinhibition se fait par lintermdiaire dun domaine situ en position N-terminale et relativement conserv entre les trois protines [122, 168]. La xation de p27 sur une CDK entrane des changements de conformation du domaine catalytique de la CDK bloquant ainsi laccs lATP [137]. Par ailleurs, les trois protines de cette famille CIP/ KIP dirigent les complexes cycline D/CDK vers le noyau. p21CIP1/WAF1 p21 est indispensable larrt du cycle cellulaire au point de contrle G1 en rponse des lsions de lADN [20]. Elle inhibe en effet la progression du cycle cellulaire en se liant, par son domaine aminoterminal, aux complexes cycline/CDK de la phase G1 et, par son domaine carboxyterminal, lantigne nuclaire PCNA, bloquant ainsi lactivation de lADN polymrase [9]. Des tudes plus rcentes ont montr que, paralllement cette action antiprolifrative, p21 exerce aussi une action antiapoptotique [57, 159]. LARNm codant pour la protine p21 est induit dans les broblastes durant la transition de G0 G1 [81]. p21 se lie aux complexes cycline D/CDK4 et cycline E/CDK2 durant la phase G1 donnant penser quelle agirait comme un facteur dunion de la cycline et de la kinase. Alors que les complexes ne contenant quune seule molcule de p21 sont actifs (activit catalytique), ceux qui en contiennent plusieurs sont inactifs et les changements dans la stchiomtrie de p21 sont suffisants pour rendre compte de cette conversion [185]. En effet, des complexes p21-CDK2-cycline A existent sous forme active ou inactive selon la stchiomtrie de p21, leffet inhibiteur

ne sexerant que lorsque le taux de la protine modulatrice devient suprieur celui des complexes cycline/ CDK. Bien que la saturation du complexe par p21 puisse ainsi bloquer leur activation par CAK, p21 peut galement inhiber lactivit du complexe qui a dj subi la phosphorylation par CAK. Lexpression de p21 est universelle et lexpression de son gne est rgule par p53 [47, 180, 27]. Dans les cellules des patients atteints du syndrome de Li-Fraumeni (maladie caractrise par une absence dexpression de p53), p21 est absente des complexes cycline/CDK [182]. Inversement, la synthse de p21 augmente quand p53 est induite par une lsion de lADN (radiations ionisantes). En inhibant indirectement lactivit CDK, p53 empche la phosphorylation de pRb et la libration des facteurs E2F. Dans les cellules normales, p21 se trouve dans un complexe quaternaire incluant la kinase, la cycline, p21 et PCNA [181]. p21 est capable dinhiber directement la rplication de lADN dpendante de PCNA lors de labsence de complexes cycline/CDK [171]. p21 est donc un mdiateur central du point de contrle G1 induit par p53. p27kip1 Le gne codant pour p27 est localis sur le chromosome 12p13 [124]. Il a t clon par divers groupes [122, 157, 168] et son analyse structurale a t publie en 1996 [137]. p27 a t dcouvert dans les cellules pithliales de poumon de vison (Mv1 Lu) par Koff et Massagu lors dtudes concernant linhibition de la prolifration cellulaire par TGF-. Le TGF- induit un arrt des cellules Mv1 Lu en n de phase G1 et empche la phosphorylation de pRb qui prcde lentre en phase S dans les cellules en cycle. En avril 1993, Koff et Massagu ont dmontr que ces effets taient la consquence de lincapacit des cellules traites par TGF- de former des complexes cycline E/CDK2 actifs. Cest une protine dnomme p27 qui, en se liant aux complexes cycline E/CDK2, empche leur activation par phosphorylation de CDK2 sur la Thr160. Mcanismes daction de p27 Dans les cellules quiescentes, les taux de p27 sont relativement levs alors que ceux de p21 sont bas mais augmentent en rponse aux signaux mitogniques durant la progression en G1. La stimulation de lymphocytes T humains par linterleukine (IL)-2 entrane une chute du taux de p27 [36]. p27 chute lors de la stimulation de macrophages par CSF1 (colony stimulating factor), mais la costimulation de ces mmes cellules avec des substances analogues ou inducteurs dAMPc augmente le taux de synthse de p27 empchant lactivation des complexes cyclines D/CDK et entranant larrt en G1 [63].

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Figure 7. Reprsentation schmatique de la rgulation des protines CIP/KIP. Aprs stimulation mitognique, les complexes cycline D/CDK squestrent les protines CIP/KIP ce qui empche ces dernires dinhiber les complexes cycline E/CDK qui ds lors peuvent phosphoryler pRb. Les facteurs transcriptionnels de la famille E2F sont alors librs et augmentent la transcription du gne de la cycline E. Les complexes cycline E/CDK phosphorylent alors les protines CIP/KIP qui vont tre dtruites par le protasome.

Quand la cellule entre en cycle, p27 est capte par les complexes cyclines D/CDK. La squestration des molcules de p21 et de p27 libres (non lies) par les complexes cycline D/CDK allge la contrainte des molcules CIP/ KIP sur les complexes cycline E/CDK2 facilitant ainsi lactivation de ces derniers (gure 7). Il y a une comptition entre les complexes cycline D/CDK et cycline E/CDK2 vis--vis des protines CIP/KIP. Ds que le processus de squestration de ces protines diminue le taux de p27 actif en-dessous dun seuil, le complexe cycline E/CDK2 facilite sa propre activation en phosphorylant p27 en Thr187 dclenchant ainsi sa dgradation [147, 170]. Les molcules rsiduelles de p27 et de p21 restent lies aux complexes cycline D/CDK tout au long des cycles successifs et le pool de ces molcules CIP/KIP lies est libr quand les facteurs de croissance sont retirs du milieu inhibant ainsi les complexes cycline E/CDK et arrtant la cellule en phase G1. Dans les cellules pithliales de poumon de souris, le TGF- inhibe la synthse de CDK4 [32] ce qui augmente le taux de p27 libre (qui nest pas capte par les complexes cycline D/CDK4) qui va donc se xer sur les complexes cycline E/CDK2 donnant lieu un arrt en G1 [122]. Ainsi la captation de p27 par les complexes cycline D/CDK4 permet de promouvoir lactivit kinase des complexes cycline E/CDK2 aidant tablir lordre dactivation. Comme pour p21, la stchiomtrie de p27 dtermine sil est activateur ou inhibiteur. Les protines CIP/KIP se lient dabord aux cyclines D ce qui permet lassemblage avec CDK4 ou CDK6 et conduit non pas linhibition mais lactivation et la stabilisation du complexe. Dans des souris knock-out pour p27, les taux de complexes cycline D1/CDK assembls est diminu de plus de dix fois [12]. En fait, les protines CIP/KIP facilitent dans un

premier temps lactivit des complexes cycline D/CDK en permettant lassemblage de la cycline D et de la CDK et en stabilisant le complexe [12]. Dans un second temps, quand le nombre de molcules p27 xes sur les complexes cycline D/CDK augmente, leffet dinhibition est mis en jeu. La rgulation de p27 est traductionnelle [52] et posttraductionnelle [110]. Quand des broblastes en prolifration sont privs de srum la synthse de p27 augmente, mais p27 est galement libre des complexes cycline D/CDK car la cycline D est dgrade. La perte de lactivit des CDK dpendantes des cyclines D couple linhibition de CDK2 par p27 induit larrt en G1/S. Lutilisation de nuclotides antisens dirigs contre la synthse de p27 peut empcher les cellules de devenir quiescentes [13, 132]. Rles de p27 en pathologie Les souris knock-out pour p27 dveloppent beaucoup de tumeurs notamment hypophysaires (avec 100 % de pntrance) [34]. Le nombre de tumeurs dpend du nombre de copies du gne (les souris p27-/- dveloppent plus de tumeurs que les souris p27-/+) [33]. De plus, les souris knock-out pour p27 sont trs sensibles aux agents carcinognes. La perte de lexpression de la protine pourrait favoriser le dveloppement et/ou la progression dune tumeur si bien que p27 a t tudi dans beaucoup de cancers. Nanmoins, la diffrence des gnes suppresseurs de tumeurs, les anomalies (mutations, dltions homozygotes) concernant le gne sont exceptionnelles dans les tumeurs [124, 64]. En revanche, labsence ou la diminution dexpression de p27 (ou laugmentation de la dgradation de p27) est un facteur pronostic pjoratif puissant dans plusieurs cancers (cancers du sein ou colorectaux par

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exemple) [84]. la diffrence des autres CKI dont labondance est rgule par le taux de transcription de la protine, les taux de p27 sont surtout rguls par un mcanisme post-traductionnel, cest--dire par les voies qui assurent sa dgradation [2]. La dgradation de p27 se fait par la voie de lubiquitine et du protasome [85] et ncessite dune part sa phosphorylation, et dautre part son transfert du noyau vers le cytoplasme. Il existe donc une rgulation temporelle et spatiale. Dans une rcente tude, Loda et al. montrent le caractre signicativement pjoratif de labsence de p27 chez des patients affects dun cancer du clon, et prouvent que cette perte dexpression de la protine est lie non pas une anomalie du gne mais une forte activation des mcanismes de dgradation de la protine [85]. Ce mcanisme est tout fait original et doit se vrier dans dautres tumeurs. Par ailleurs, p27 aurait un rle dans la diffrenciation mais aussi dans la protection contre linammation. Rcemment, Ophascharoensur et al. montrent que les lsions de glomrulonphrite induites exprimentalement chez les souris knock-out pour p27 sont signicativement plus importantes que chez les souris normales suggrant un rle de p27 dans la protection contre linammation [108]. La famille des inhibiteurs INK4 Les protines INK4 sont des polypeptides de 15 19 kDa qui partagent prs de 40 % dhomologie entre elles. Elles sont largement conserves parmi les espces, les protines murines ayant 90 % didentit avec les protines correspondantes de lhomme. Elles sont composes de motifs ankyrine plusieurs fois rpts qui jouent un rle dans les interactions protineprotine [142]. Le troisime motif est crucial pour linteraction des protines INK4 avec CDK4 ou CDK6 [104]. Les signaux qui conduisent la synthse de ces protines sont peu connus, mais il est clair par exemple que p15INK4b est induite par le TGF- et contribue sa capacit dinduire un arrt en phase G1 [130, 131]. p16 saccumule progressivement au fur et mesure que les cellules vieillissent, jouant un rle probable dans la snescence [143, 188] alors que p18INK4C et p19ARF sont focalement exprimes durant le dveloppement ftal jouant un rle dans la diffrenciation terminale [188, 100]. Mcanismes transcriptionnels La rgion 9p21 comporte deux gnes codant pour p16INK4a et p15INK4b. Les deux gnes ont une homologie de squence trs importante suggrant une duplication ancestrale, et sont situs environ 30 kb lun de lautre. Le gne codant pour p15INK4b comporte deux exons et gnre deux transcrits, p15 et p10, utilisant le mme cadre de lecture. En revanche, le gne codant pour p16 (appel

locus INK4a/ARF) est remarquable par son organisation gnomique, puisquun exon est partag par deux gnes qui codent pour des protines fonctionnellement diffrentes (gure 8) [126, 160]. Alors que les virus utilisent souvent cette organisation de gnes se chevauchant dans le but doptimiser au maximum les squences codantes, une telle organisation est trs inhabituelle dans le gnome humain. En effet, le locus INK4a/ARF a une structure pour le moment unique : un premier transcrit (correspondant p16) est gnr partir dun exon 1 et des exons 2 et 3 [126, 160]. Un deuxime transcrit dnomm p19ARF est galement gnr partir des exons 2 et 3 mais aussi par un deuxime exon 1 situ 13 kb en amont de lexon 1 et dnomm exon 1. La protine appele p19ARF (ARF pour alternative open reading frame) est donc traduite par un autre cadre de lecture [76]. Il ny a donc aucune homologie de p19ARF avec les protines de la famille INK4. La protine p19ARF a en revanche la proprit de bloquer les cellules en phase G1 et G2, par un mcanisme rcemment lucid (gure 8) [62, 123, 186]. La protine p19ARF participe la dgradation de la protine mdm2, cette dernire ayant pour fonction de bloquer lactivit transactivatrice de p53 [149]. p19ARF serait donc un activateur indirect de p53 [62]. Rcemment, plusieurs groupes ont montr que p19ARF inhibe la prolifration cellulaire en activant p53. En effet, les signaux de prolifration manant de lexpression de certains oncognes (tels que myc, E1A, E2F1 ou ras V12) aboutissent laugmentation des taux de p19ARF permettant ainsi dinitier une cascade dvnements qui aboutissent la stabilisation et lactivation de la protine p53 [62, 123, 16]. Par contraste, les signaux qui rgulent p16 restent identier. Cependant, lintrt de ce locus INK4/ARF semble crucial en cancrologie car il code pour deux protines qui interviennent dans deux voies diffrentes dinhibition des tumeurs, la voie de pRb et celle de p53. Fonctions des protines INK4 Les protines INK4 se lient spciquement CDK4 et CDK6 et inhibent leur activit [148]. Rappelons que CDK4 et CDK6 sont lies aux cyclines D et ont pour substrat principal pRb [144]. Dans les cellules prolifrantes, CDK4 (ou CDK6) existe sous trois formes [89] : un complexe de 450-kDa compos de CDK4 (ou CDK6) et de Hsp90/cdc37 ; un complexe de 150-170-kDa compos dune cycline D, de CDK4 (ou CDK6), et de p21 ou p27 ; un complexe de 50 kDa compos de CDK4 (ou CDK6) et dune protine INK4. Dans les cellules quiescentes, CDK4 est complexe avec Hsp90/cdc37 [75, 158]. Au fur et mesure de la progression en phase G1, CDK4 forme des complexes avec les cyclines D nouvellement synthtises et p21 ou p27 (gure 7). Plus en avant dans le cycle, p27 est libre des

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Figure 8. Reprsentation schmatique du locus INK4a/ARF situ entre les gnes de linterfron et le gne MTAP dans la rgion chromosomique 9p21. Le locus INK4a/ARF code pour deux protines diffrentes, p16INK4a et p19ARF. p16INK4a est code par les exons 1, 2 et 3 (rectangles noirs) ; p19ARF est code par les exons 1, 2 et 3 (rectangles hachurs). p16INK4a se lie aux complexes cycline D/CDK4-6 et les inhibe empchant ainsi la phosphorylation de pRb ce qui entrane un arrt des cellules en G1. p19ARF interagit avec mdm2, protine qui inhibe p53. En permettant la dgradation de mdm2, p19ARF active indirectement p53 et entrane un arrt de la cellule en G1 et en G2.

complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2, vnement qui permet lactivation de ces complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2 qui, en retour, peuvent dune part phosphoryler p27 et promouvoir sa dgradation, et dautre part phosphoryler pRb. Alors les cellules peuvent entrer en phase S (gure 7). Alternativement, dans lhypothse dune situation o une protine INK4 serait exprime, une CDK4 nouvellement synthtise peut entrer en contact avec une protine INK4 et former un htrodimre inactif (gure 9A) mais stable car CDK4 ne peut plus alors tre recrute dans un complexe actif avec la cycline D [43, 114]. Il y a donc une comptition entre les protines INK4 dun ct et les

protines CIP/KIP couples aux cyclines D de lautre ct pour lassociation CDK4 [115]. Linduction et laugmentation des taux de p16 non seulement entrane un dplacement des molcules nouvellement synthtises de CDK4 vers p16, mais peut galement provoquer la rupture des complexes CDK4/cdc37/Hsp90 dj forms librant CDK4 qui sera ainsi pris en charge par p16 (gure 9B). En consquence, il y a augmentation du nombre de complexes CDK4/INK4, les cyclines D non lies tant alors rapidement dgrades par la voie du protasome [21]. La perte des cyclines D empche alors la squestration des molcules p27 qui peuvent alors exercer librement leur action inhibitrice sur les complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2, entranant labsence de phosphorylation de pRb et donc un arrt de la cellule en G1. La surexpression des protines de la famille INK4 est donc responsable dun arrt des cellules en G1 mais dune faon dpendante de lintgrit de pRb [87, 94]. En effet, la perte de la fonction de pRb empche la capacit de blocage en G1 des protines INK4. La perte de pRb libre les molcules E2F ce qui a pour consquence laugmentation du taux et de lactivit des complexes cycline E/CDK2 [53, 55] qui phosphorylent p27 dont la protolyse est alors acclre (gure 10) [147, 170, 112]. Les cellules qui nont pas une pRb fonctionnelle ont des taux trs levs de p16, suggrant que pRb rgule p16 ngativement [114]. Dans une cellule normale, le taux de p16 est maximal en phase S. En fait, il existe physiologiquement une boucle de rgulation positive entre pRb et p16. Aprs phosphorylation par les complexes cycline D/CDK4 ou CDK6, pRb libre les facteurs de transcription qui activent la transcription de p16. Ainsi, p16 se lie et dissocie les complexes cyclines D/CDK4 ou CDK6. Quand laction inhibitrice des membres de la famille CIP/KIP sur les complexes cycline E/CDK2 et cycline A/CDK2 est neutralise, les CDK dpendantes des cyclines D ne sont plus utiles pour la progression dans le cycle cellulaire (gure 11). Les cellules nexprimant ni p27 ni p21 nont pas pour autant des cycles perturbs en dpit du fait que lactivit des kinases dpendantes des cyclines D soit faible [12]. Inversement, lactivit des complexes cycline E/CDK2 est trs leve et pRb est priodiquement phosphoryle pendant le cycle mme sur les sites prfrentiellement reconnus par CDK4 ou CDK6. De telles cellules sont videmment rsistantes laction inhibitrice de p16 mais pas laction de p27. En labsence des membres de la famille CIP/KIP, la fonction de squestration des complexes cyclines D/CDK est rendue superue et les kinases dpendantes des cyclines E et A sont suffisantes pour phosphoryler pRb. Ainsi, de telles cellules tolrent parfaitement une rduction de lactivit des kinases dpendantes des cyclines D. Ces observations sont rapprocher de celles constates chez les souris dcientes en

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Figure 9. A : une molcule CDK4 nouvellement synthtise se lie cdc37 et Hsp90. Si elle se complexe une cycline D elle devient active ; si elle est lie une protine de la famille INK4 elle est inactive. B : linduction et laugmentation des taux de p16INK4a peut galement provoquer la rupture des complexes CDK4/cdc37/Hsp90 dj forms librant CDK4 qui sera ainsi pris en charge par p16INK4a. En consquence, il y a augmentation du nombre de complexes CDK4/INK4, avec arrt de la squestration des protines de la famille CIP/KIP qui sont libres et qui vont donc pouvoir inhiber les complexes cycline E/CDK2.

cycline D1 et/ou D2 qui sont viables en dpit de quelques anomalies de dveloppement [153, 154]. De rcentes observations dmontrent que le remplacement de la

cycline D1 par la cycline E permet de corriger les anomalies du dveloppement de ces animaux et sont compatibles avec lide que la cycline E peut fonctionner sans la cycline D1. LA NOTION DE CHECKPOINT Il existe plusieurs transitions au cours du cycle cellulaire. Une transition correspond un changement unidirectionnel de la cellule qui se dplace dun tat o elle effectuait un certain nombre de processus vers un autre tat o elle va effectuer dautres processus. Comment ces transitions sont-elles coordonnes pour survenir un temps bien prcis et dans un ordre bien dni ? Pour que les vnements cellulaires se fassent dans un ordre voulu, il faut que chaque tape prcdant un vnement soit compltement et correctement effectue. Il existe des circuits de rgulation qui sont des mcanismes de surveillance qui surveillent lachvement de certains vnements cruciaux pour la cellule et ainsi autorisent la survenue dune transition et la progression dans le cycle. Il y a deux classes de circuits : les mcanismes intrinsques oprant chaque cycle cellulaire pour ordonner des vnements succes-

Figure 10. Dans les cellules dcientes en pRb, les facteurs de transcription E2F ne sont pas inhibs par pRb si bien que leur activit se fait pleinement notamment sur la transcription de la cycline E. Cela entrane une augmentation du nombre de complexes cycline E/CDK2 qui phosphorylent les protines CIP/KIP dont la dgradation sacclre. Les complexes cycline D/CDK se dsunissent et les protines CDK4 sont alors mobilises dans des complexes avec p16INK4a.

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Le checkpoint G1/S Chez les mammifres, les rponses vis--vis dune lsion de lADN sont les mmes que chez la levure avec en plus la possibilit dentrer en apoptose (le but nest pas la survie dune cellule endommage mais la survie de lorganisme). Le checkpoint en G1 en rponse une lsion de lADN est le mieux connu. Trois gnes le contrlent : ATM (ataxia telangiectasia mutated, le gne mut dans la maladie ataxie tlangiectasie) [111, 140], p53 [83] et p21 [5]. p53 est le gne suppresseur de tumeur le plus frquemment mut dans les cancers humains [150]. Il code pour un facteur de transcription qui est activ en rponse une lsion de lADN ou une perturbation du pool de nuclotides. p53 active est capable dinhiber le cycle cellulaire et de promouvoir lapoptose [99]. Les cellules dpourvues de p53 sont incapables de sarrter en phase G1 en rponse une irradiation et ont une apoptose rduite. Une partie de la capacit de p53 arrter la cellule en phase G1 vient de lactivation de la transcription de p21 inhibiteur des CDK qui contrlent lentre en phase S [29]. Les broblastes embryonnaires de souris qui nont pas p21 ne sarrtent que partiellement en phase G1 suggrant lexistence dune autre voie dpendante de p53 permettant larrt en phase G1. Cette voie est inconnue. Le produit du gne ATM a t impliqu dans la rgulation de p53. Ce gne, qui code pour une protine kinase, est mut dans le syndrome ataxie tlangiectasie. Les cellules qui nont pas ce gne ont une activation rduite et retarde de p53 en rponse une lsion de lADN [86]. Laction de la protine kinase ATM ne passe pas par p19ARF. Lors dune lsion de lADN, ATM phosphoryle la partie N-terminale de p53 ce qui stabilise p53 et empche sa dgradation [155]. Dautres kinases (telles que la DNA-PK, DNA-dependent protein kinase) capables de phosphoryler p53 ont t mises en vidence et joueraient le mme rle quATM en rponse des lsions de lADN [179]. Lactivation de p53 (par lexpression doncognes ou par lsions de lADN) est associe une stabilisation post-translationnelle de la protine. Cette stabilisation rsulte en partie de linhibition de la protine mdm2 qui promouvoit la dgradation de p53 [73]. Le fait que les gnes codant pour p53 et ATM soient frquemment muts dans les cancers humains [54] suggre que la fonction des checkpoints est importante dans la prvention des cancers. On en sait plus sur les checkpoints de la levure que chez lhomme et tout va dpendre des degrs de conservation entre les mcanismes de lhomme et de la levure. Cela dit, la perte de p21 entrane peu de cancers [5, 20] et les mutations de p21 sont rares dans les tumeurs [152]. Donc le fait de dire que la perte

Figure 11. La perte des protines CIP/KIP a pour consquence une dsunion des complexes cycline D/CDK4-6 entranant une destruction des cyclines D et une squestration des molcules CDK4 dans des complexes avec p16INK4a. Il en rsulte une augmentation de lactivit des complexes cycline E/CDK2 ce qui suffit pour phosphoryler pRb et compenser la perte des complexes cycline D/CDK.

sifs ; les mcanismes extrinsques induits seulement pour agir quand un dfaut est dtect (altration de lADN par exemple). La perte de ces voies de contrle rduit la dlit des vnements cellulaires tels que la rplication et la sgrgation chromosomiques. De telles altrations peuvent conduire une prolifration non contrle et la cancrisation. Checkpoint est le nom donn des sous-units particulires de ces mcanismes intrinsques et extrinsques [48]. Cest une voie biochimique qui sassure de la dpendance dun processus vis--vis dun autre. Cette dnition est large mais dans le langage scientique courant, on parle de checkpoint en rfrence au contrle des transitions du cycle cellulaire. Le mot conjugue la fois un terme de lieu (frontire) et un terme dexamen. Parfois le terme est utilis la place du mot transition mais il devrait tre restreint aux voies biochimiques qui assurent la dpendance dun processus vis--vis dun autre. Par exemple, le DNA-damage checkpoint est le mcanisme qui dtecte une altration de lADN et gnre un signal qui arrte les cellules dans la phase du cycle o elles se trouvent et induit la transcription de gnes rparateurs. La position darrt dans le cycle dpend de la phase laquelle la lsion de lADN a lieu. Les checkpoints sont des points de dcision o des mcanismes de contrle oprent et empchent la progression dans le cycle si les tapes prcdentes nont pas t compltes ou si lADN est altr. Ainsi, en G1, une cellule doit surveiller sa taille, la prsence de nutriments et lintgrit de son ADN avant de commencer le processus dinitiation de la synthse dADN. En G2 il existe un checkpoint qui, dans le cas o lADN est endommag ou non rpliqu, empche la cellule dentrer en mitose.

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des capacits arrter les cellules en G1 conduit une instabilit gnomique et donc un cancer reste prouver. Le checkpoint G2/M Le checkpoint G2/M est moins connu dans les cellules de mammifres que le checkpoint G1/S. Ce checkpoint empche une sgrgation impropre des chromosomes, phnomne frquent en cancrologie humaine [116]. Les tudes gntiques menes chez les levures ont permis didentier des gnes contrlant ce checkpoint et certains sont conservs entre la levure et les cellules de mammifres. Les protines intervenant dans le contrle de ce checkpoint sont en cours didentication mais il semble que CDC25 et p53 soient des modulateurs de la transition G2/M. ALTRATIONS DE LAXE DE RGULATION DE LA PHOSPHORYLATION DE pRB DANS LES TUMEURS Linteraction entre p16, cycline D/CDK, et pRb/E2F constitue une unit fonctionnelle connue sous le nom de voie pRb (pRb pathway). Chacun des composants de cette voie peut tre drgl dans un processus cancreux, et il devient de plus en plus vident que cet axe constitue une cible obligatoire du processus oncologique de pratiquement toutes les tumeurs humaines. Les analyses biochimiques et molculaires de lignes et tumeurs primaires ont montr des anomalies extrmement frquentes dexpression des molcules impliques dans cet axe. Par exemple, une mutation ou une surexpression de CDK4 est souvent prsente dans des tumeurs telles que les mlanomes ou les glioblastomes [3, 50] ; la surexpression de la cycline D1 est un facteur pronostic ngatif dans une grande varit de tumeurs solides [97] ; une dltion du gne codant pour p16 est prsente dans un grand nombre de tumeurs solides et reste laltration gntique la plus frquemment observe dans les leucmies aigus lymphoblastiques (LAL) T de ladulte [61, 127]. Ainsi, linactivation fonctionnelle de pRb serait une tape obligatoire de la gense des tumeurs. La molcule pRb elle-mme joue un rle fondamental [174] et les anomalies retrouves peuvent tre classes schmatiquement en deux groupes selon que la fonction et/ou lexpression de pRb est anormale ou normale. Le premier groupe danomalies comprend les dfauts dexpression de pRb par dltion, mutation ponctuelle ou inhibition transcriptionnelle. Les consquences fonctionnelles de ces anomalies sont proches de celles dues des protines virales (telle la protine E7 du papillomavirus) qui inhibent la xation de pRb aux facteurs de transcription (cancer du col de lutrus). Dans les hmopathies malignes, des dltions, mutations ponctuelles ou inhibitions dexpression

ont t retrouves de faon assez frquente dans les leucmies aigus mylodes, les leucmies aigus lymphodes Ph1+, les leucmies lymphodes chroniques et les lymphomes malins de haut grade [187]. Lorsque la structure de pRb est normale et que la protine est correctement exprime, les altrations aboutissant un raccourcissement de la phase G1 sont dues des anomalies touchant les molcules impliques dans la phosphorylation de pRb ou dans sa rgulation. Selon que ces molcules jouent un rle positif ou ngatif dans ces phosphorylations, les anomalies seront diamtralement opposes. Les anomalies touchant les molcules rgulant positivement la phosphorylation de pRb sont des surexpressions ou des expressions ectopiques et les gnes impliqus sont des oncognes candidats. Inversement, des dfauts dexpressions de certains rgulateurs ngatifs sont retrouvs dans les tumeurs, les gnes correspondants se comportant comme des gnes suppresseurs de tumeurs. titre dexemple, nous dtaillerons le rle de p16 dans certaines tumeurs. Anomalies de p16 et cancer Il existe dsormais de nombreux liens chez lhomme entre loncognse et les altrations gntiques du locus INK4a/ARF. Des dltions homozygotes de ce gne ont t dcouvertes dans un grand nombre de tumeurs incluant notamment des sarcomes, des lymphomes et des leucmies aigus lymphoblastiques (LAL) de lenfant [61, 136, 107]. p16, protine sassociant CDK4 et CDK6, a t mise en vidence pour la premire fois par lquipe de Xiong et al. [182] puis ultrieurement clone par le systme des doubles hybrides [142]. Cette protine a suscit rapidement un grand intrt en cancrologie car sur les 290 lignes tumorales tudies par Kamb et al., 46 % prsentaient des dltions au niveau de p16 : 82 % des astrocytomes, 71 % des gliomes, 60 % des ostosarcomes et des carcinomes mammaires, 58 % des mlanomes et 56 % des cancers rnaux prsentaient de telles altrations [61]. Seuls les cancers du clon et les neuroblastomes chappaient au phnomne. p16 se voyait dote dun statut gal celui de p53. En revanche, la frquence des dltions de p16 observes dans les tumeurs primaires (et non plus dans les lignes tablies) chute moins de 20 % [6]. Le gne codant pour la protine p16 est frquemment mut dans les cas de mlanomes notamment expression familiale [88]. Par ailleurs, des mutations de ce gne sont frquemment observes dans les adnocarcinomes pancratiques, les carcinomes sophagiens, et, moins frquemment, dans les cancers du poumon non petites cellules et les carcinomes de la tte et du cou [82]. Enn, il est dsormais tabli que les rarrangements chromosomiques intressant ce locus reprsentent un vnement gn-

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tique caractristique des leucmies aigus lymphodes de type T [150]. En effet, de nombreuses tudes ont dmontr de frquentes dltions des gnes codant pour p16 et p15INK4b [10, 51, 165]. Les altrations du gne codant pour p16 sont dans la majorit des cas des dltions. En fait, une dltion au niveau de ce gne peut entraner non seulement un dcit en protine p16 mais galement, du fait de son mcanisme transcriptionnel particulier, en deux autres protines (p15INK4b et p19ARF) ce qui donne la cellule cancreuse un avantage prolifratif plus important que si elle ne possdait quun dcit en une seule de ces protines. Dautres mcanismes dinactivation peuvent intervenir. Lquipe de Sidranski a mis en vidence que certaines lignes cellulaires (cancer du poumon ou des voies arodigestives) ne possdaient plus quune seule copie du gne p16 mais que celle-ci tait indemne de toute mutation. Nanmoins, aucune expression transcriptionnelle du gne ne pouvait tre mise en vidence, suggrant une anomalie au niveau des signaux de rgulation. Lanalyse de la rgion 5du gne p16 montre quelle contient une rgion trs riche en dinuclotides CpG (lot CpG). La mthylation des rsidus C prsents dans ces lots participe la rgulation de lexpression gntique. En gnral, lhypermthylation de ces rgions saccompagne de linactivation de lexpression du gne adjacent llot CpG. Lanalyse de llot CpG situ en 5 du gne p16 a montr que celui-ci tait hypermthyl dans 42 % des cas (onze lignes sur 26) [95]. Dans tous les cas, cette hypermthylation tait associe labsence dexpression du gne. Dans les tumeurs primaires, les auteurs ont observ une mthylation dans 20 % des cas. Si le rle suppresseur de tumeur de la protine p16 est maintenant fermement tabli, il reste comprendre si son expression survient dans les cellules normales do drivent les tumeurs. Plusieurs travaux laissent imaginer que lexpression de p16 agisse comme un mcanisme suppresseur dvnements oncogniques, son inactivation secondaire aboutissant une slection et une prolifration des cellules transformes [173]. Anomalies des facteurs transcriptionnels E2F1 et cancer E2F1 tient une place particulire [172]. Son action transformante in vitro en fait un bon oncogne candidat. Dans ce contexte, le phnotype des souris E2F1-/- apparat tonnant [35, 183]. Ces souris sont en effet caractrises par une incidence leve de tumeurs spontanes. E2F1 apparat donc comme un gne possdant la fois les proprits doncogne et de gne suppresseur de tumeur. Bien que ce phnomne reste encore mal compris, il est peut-tre rapprocher des fonctions diffrentes des formes libres dE2F1 et des formes lies pRb. E2F1 asso-

cie pRb semble en effet capable de se lier aux rgions rgulatrices de certains gnes et den inhiber la transcription. E2F libre en revanche est capable de stimuler la transcription de gnes impliqus dans le passage et/ou le droulement de la phase S. CONCLUSION Les progrs considrables raliss au cours de la dernire dcennie dans la connaissance des mcanismes rgulateurs du cycle cellulaire ont permis une meilleure comprhension des mcanismes molculaires de la cancrisation. Malgr la profusion de travaux sur le sujet, aucune implication de pratique clinique ne sest rellement dgage, mais de nouvelles stratgies thrapeutiques sont en cours dvaluation [145]. Par exemple, de nouveaux inhibiteurs des CDK sont en dveloppement, ainsi que des molcules capables dinhiber les checkpoints des cellules cancreuses permettant ainsi daugmenter les rponses cytotoxiques des chimiothrapies dj en cours dutilisation. De mme, quelques travaux de thrapie gnique ont t publis mais se heurtent des problmes techniques tels que la vectorisation. Enn, il est probable que les molcules rgulatrices du cycle cellulaire, du fait de leurs fonctions dpassant la simple stimulation de la prolifration, soient impliques dans la pathognie dautres maladies. REFERENCES u u
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