Estrategias de Secuenciacin de Genomas

Jos Guillermo Dvila Ramos Centro de Ciencias Genmicas, UNAM

Secuenciacin del DNA

Principios y Mtodos ms empleados

Genomas Secuenciados
En aos recientes, se ha logrado la secuenciacin a gran escala del genoma de organismos eucariotes Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos pluricelulares son: 1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 107 pb - un nemtodo 2000 Homo sapiens - 3 x 109 pb - el Humano 2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 108 pb- una planta 2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 108 pb - la mosca de la fruta 2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 108 pb - el mosquito vector de la malaria

Secuenciacin Tipo Sanger

El mtodo de secuenciacin de Sanger aprovecha la forma normal de la replicacin del DNA Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deber estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3 de la deoxiribosa Los fragmentos se generan al agregar pequeas cantidades de 2 3 dideoxinucletidos a la reaccin lo que interrumpe la polimerizacin cada vez que son incorporados en la cadena de DNA La polimerasa usada deber de carecer de la actividad de la exonucleasa de correccin 3 > 5 para que funcione el mtodo

Dideoxinucletidos
La secuenciacin de DNA usando el mtodo de Sanger emplea 23dideoxinucletidos trifosfatados ademas de los normales 2- Fosfato HO deoxinucletido trifosfatado Ya que los 23-dideoxinucletidos trifosfato carecen del grupo 3 hidroxilo, y la polimerizacin del DNA ocurre solo en la direccin 3, cada vez que un 23dideoxinucletido trifosfato es incorporado la extencin se detiene
2-deoxinucletido monofosfato
OH P O
5CH2 4 3

N O

Base

NH2 N N

Azucar 2
H

H OH

23-dideoxinucletido monofosfato

OH HO P O CH2 O O N N N

NH2
N

OH

O HO

H O

P
O

N O O N O CH2 O

CH2

OH

P HO

HO

NH2

Los 23 dideoxinucletidos terminan la sntesis del DNA

CH2 O

O O HO P O CH2 O H

P OH H

OH

O
N N

O NH N NH2

CH2

P H

HO

H2O

Secuenciacin de DNA
fragmento Clonado

Prmero

Sitios de Prmeros

Plsmido con un fragmento clonado de DNA

La Reaccin con ddATP

Pol. 3AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5 Pol. Pol. Pol. 5TTATCG 5TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA 5TTATCGTACCATGACTAGA 5TTATCGTACCATGA 5TTATCGTA Ya no
puedes!
Otra vez! No De nuevo!

A que la!

5TTATCGTA 5TTATCGTACCA 5TTATCGTACCATGA 5TTATCGTACCATGACTA 5TTATCGTACCATGACTAGA 5TTATCGTACCATGACTAGATGCGA 5TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA

Separacin de los Fragmentos

Todos los mtodos actuales de secuenciacin requieren que la separacin de los fragmentos de DNA detecten diferencias en longitud de una base Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de poliacrilamida o en capilares con polmeros lquidos

Separacin de Fragmentos (Sanger)

Lectura 5 a 3 desde la basa al tope

Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequea cantidad de uno de los cuatro dideoxinucletidos, son cargadas en el gel y sometidas a electroforesis Como la polimerizacin es solo en direccin 5 a 3, los fragmentos ms cortos estarn en 5 y los ms largos que se encontrarn en la direccin 3

ddATP

ddCTP

ddGTP

ddTTP

Applied Biosystems
Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes fluorescentes ms sensibles, mejorado el mtodo de cargado de la muestra y la electroforesis Cuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad electrofortica, pueden ser usados para marcar ya sea los prmeros o los nucletidos que terminan la reaccin Si se usan los dideoxinucletidos fluorados, la reaccin de secuenciacin completa se realiza en un solo tubo En lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un solo capilar con un polmero lquido que se remplaza al final de cada corrida

Secuencia con Terminadores Fluorados

Pol. Pol. Pol. Pol. 3AATAGCATAACGTTAACGTTACGCTAT5 5TTATCG 5TTATCGTA 5TTATCGTACCATAATTGCA 5TTATCGTACCATAATT 5TTATCGTACCAC me Let Oh come Not Through! Agggg. on! Again! 5TTATCGTA Como la base al 5TTATCGTAT 5TTATCGTATT final de cada 5TTATCGTATTG fragmento esta 5TTATCGTATTGC marcada con un 5TTATCGTATTGCA fluorforo nico, la 5TTATCGTATTGCAA reaccin total se 5TTATCGTATTGCAAT 5TTATCGTATTGCAATT puede hacer en un 5TTATCGTATTGCAATTG solo tubo 5TTATCGTATTGCAATTGC 5TTATCGTATTGCAATTGCA

Sistema Prisma 310 ABI

ATTGC A

Capilar
Pol. lquido
.. Laser Placa caliente Prisma Detectores Reaccin Secuencia

Ventana

El ABI Prisma 3700

ABI Prism 3700

El Estado del Arte

El ABI Prisma 3730XL, representa la ltima generacin de equipos de secuenciacin capilar automtica El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases diarias Con esta capacidad el genoma de una bacteria de 5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente secuenciado en un mes El desarrollo ms reciente es la piro-secuencia, que incrementa en un orden de magnitud el nmero de bases obtenidas por da

Estrategias para la Secuenciacin de Genomas

Secuenciacin al Azar y Secuenciacin Jerrquica al Azar

Mtodo de Secuenciacin al Azar

Genoma

Fragmentacin

Secuenciacin y alineamiento de los insertos

ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC

Refinamiento clonacin
ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG

Plsmido

Secuencia final

Genoteca del genoma

Secuenciacin Jerrquica al Azar

Genoma 2. Clonacin BAC

1. Fragmentacin

Genoteca de BACs 4. Secuenciacin y alineamiento de los insertos de cada BAC

ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC

3. Secuencia de los bordes de los insertos de los BACs y alineamiento para crear un mapa de CONTIGS

Refinamiento
ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG

Secuencia final

H2O

O2

CO2

N2 O2 NH4+

suelo
Rizsfera
H2O

N2

ndulo

El Genoma de Rhizobium etli

f e d = plsmido simbitico c a b

Plsmidos

Cromosoma circular

El primer genoma completo hecho en Mxico