CAPITOLUL XIV 14.

1 TRANSFERUL PLANTELOR DE PE MEDIUL DE CULTUR N SOL ACLIMATIZAREA

O plant provenit din cultura in vitro difer din multe puncte de vedere de una provenita din mediul in vivo (Fossard, 1977; Grout si Aston, 1978; Grout si Debergh, 1982; Sutter, 1985) prin urmtoarele aspecte: 1. La plantele crescute n condiii in vitro stratul de cear (cuticular) de la suprafaa frunzelor i tulpinilor este foarte slab dezvoltat deoarece umiditatea relativ ntr-un vas de cultura este de 90-100%, iar plantele nu au avut nevoie s se protejeze mpotriva deshidratrii. Acest fapt are repercusiuni nefaste pentru plantulele transferate direct in vivo, care vor suferi pierderea unei cantiti mari de apa din esuturi, deoarece umiditatea aerului in vivo este mult sczut comparativ celei in vitro. Frunzele unei plante regenerate in vitro sunt moi, subiri i prezint o activitate fotosintetic mult redus, deoarece i pot procura carbonul necesar din mediul de cultur i anume din zaharurile din mediul de cultur, astfel c, atunci cnd o plantul regenerat in vitro va fi trecut in vivo va trebui s se readapteze la o activitate fotosintetic intens. De asemenea, frunzele plantelor provenite din cultura in vitro prezint, pe lng un numr sczut de celule palisadice, necesare pentru captarea eficient a luminii, i multe spaii aerifere n mezofil. Stomatele lor nu funcioneaz normal, iar trecerea plantelor de la mediul in vitro la cel in vivo constituie sursa cea mai important de stres hidric. n culturile de celule conexiunile vasculare, dintre lstari i rdcinue, sunt slab dezvoltate, ceea ce duce de asemenea la o slab circulaie a apei dintr-o parte a plantei n alta. Plantele in vitro au o hrnire heterotrof, pe cnd cele in vivo au o hrnire autotrof, acest fapt constituind un alt factor de stres pentru plntuele transferate n sol. Ele trebuie s-i dezvolte activitatea fotosintetic pentru a-i putea procura carbonul necesar. Din cele de mai sus se poate concluziona c aclimatizarea plantulelor trebuie s fie un proces lent, care s permit trecerea treptat a plantelor de la condiiile in vitro la cele in vivo, ceea ce presupune adaptarea la o umiditate relativ sczut, la dezvoltarea mecanismelor de nchidere i deschidere a stomatelor, la accelerarea procesului fotosintetic. Wardle i colab. (1983) au demonstrat c scderea umiditii aerului in vitro la Brassica oleracea Botrytis a dus la formarea unei pelicule de cear mai groas pe stratul cuticular, ceea ce a condus la o evaporare cuticular mult sczut i la creterea procentului de plante aclimatizate. 219

Aclimatizarea poate fi fcut prin generarea unei umiditi crescute n mediul in vivo unde vor fi transferate plantulele provenite din mediul in vitro, prin utilizarea unor aparate speciale, generatoare de cea, i prin meninerea unei luminoziti i temperaturi relativ constante i sczute. O alt metod de aclimatizare prevede lsarea vaselor de cultur deschise, ntr-un mediu steril, pentru a permite aclimatizarea treptat a plantulelor la condiiile exterioare. De asemenea, mai este posibil folosirea unor substane antiperspirante, care sunt pulverizate pe frunzele plantulelor transferate n sol, reducnd astfel procesul de evaporare al apei din esuturi (Sutter i Hutzel, 1985), dei aceast metod poate avea i efecte adverse. 2. Rdcinile plantelor provenite din cultura in vitro sunt mai vulnerabile i nu funcioneaz foarte bine in vivo, prezentnd foarte puini sau deloc periori absorbani. Aceste rdcini vor muri n scurt timp fiind nlocuite de altele generate direct n sol. Dezvoltarea periorilor absorbani in vitro poate fi determinat prin meninerea culturilor, pentru o perioad de timp, pe mediu lichid. Sistemul radicular slab dezvoltat determin o supravieuire slab a unei plante n condiiile de mediu natural, in vivo, mai ales n condiiile unei transpiraii intense. Pentru o plant provenit din cultura in vitro este vital pierderea unei cantiti ct mai mici de ap din esuturi. 3. Plantele care n condiiile mediului lor natural de via triesc n simbioz cu fungi (micorize) sau bacterii (ex: Leguminosae:Rhizobium) simt lipsa acestei simbioze atunci cnd sunt transferate n condiii in vitro, dar mai ales dac sunt din nou transferate in vivo. Mai multe studii au artat c inocularea unor plante in vitro mpreun cu microorganismul simbiont a determinat o cretere i dezvoltare mai bun a explantelor i o supravieuire crescut atunci cnd s-a procedat la aclimatizarea acestora. Dhawan i colab. (1986) au demonstrat c adiia de Rhizobium n timpul aclimatizrii plantelor de Leucaena a dus la formarea nodulilor la peste 80% dintre plantulele care au supravieuit transplantrii n sol, iar supravieuirea acestora a avut o rat cu 90% mai mare fa de cele care nu au nodulat. Morandi i colab. (1979) au raportat c plantele produse in vitro de Rubus idaeus au crescut mult mai bine dac au fost inoculate cu cteva microorganisme din specia Glanus mycorrhiza. De asemenea, Struller i colab. (1984) au raportat c micorizele joac un rol important n micropropagarea plantulelor de plop; inocularea explantelor mpreun cu micorize din specia Paxillus involutus a determinat o cretere cu 75% a plantelor comparativ cu cele inoculate fr micorize. Atunci cnd se iau n considerare problemele asociate cu sistemele radiculare ne-funcionale trebuie avut n vedere urmtoarele msuri speciale: -permiterea formrii rdcinilor in vitro, ce vor putea ulterior fie s se dezvolte n rdcini subterane proprii, fie mcar s asigure supravieuirea plantulei pn la formarea unor rdcini subterane proprii; 220

-permiterea dezvoltrii in vitro a rdcinilor, atunci cnd e posibil, prin meninerea culturilor, o perioad de timp, cu rdcinile n mediul lichid, acestea fiind apoi capabile s preia toate funciile unei rdcini normale, atunci cnd va fi transferat n sol; -transferarea ntregii faze de nrdcinare n mediu in vivo. nrdcinarea n sol nu este realizabil la toate speciile de cultur, dar poate fi stimulat prin nmuierea bazei lstarilor n soluie de auxin. Totui pentru multe specii faza de nrdcinare este bine s aib loc in vitro mai ales pentru speciile care nu nrdcineaz uor nici n condiii normale de cultur, cu ar fi speciile ierboase. Atunci cnd se recurge la aclimatizarea unor plntue obinute prin tehnicile de regenerare in vitro, trebuie s se in seama de urmtoarele: 1.Pentru a evita infeciile cu fungi sau bacterii: -agarul de pe rdcinuele explantelor (ce conine zaharuri) trebuie ndeprtat prin splarea acestora cu ap cldu; -solul sau substratul solid, n care vor fi trecute plntuele regenerate in vitro, trebuie s fie sterilizat prin meninerea la temperaturi ridicate (n etuv la 180oC pentru 3 ore) sau prin iradiere cu radiaii gama. 2.Asigurarea unor condiii ct mai sigure de via, prin executarea tratamentelor de combatere a insectelor, bacteriilor, fungilor, melcilor (limax), determin o rat mai mare de supravieuire a plantelor transferate in vivo, care sunt destul de sensibile. 3.Pentru a se evita rnirea rdcinuelor se recomand folosirea, pentru nceput, a unui sol uor. 4.Pentru a mbunti aclimatizarea plantulelor la condiiile in vivo, nrdcinarea este bine a avea loc pe medii de cultur srace n sruri minerale (MS concentrat la jumtate sau KNOP). 5.Uneori este necesar un tratament cu temperaturi sczute (4-8 sptmni la 5oC) in vitro sau imediat dup transferul in vivo, pentru a scoate plantulele din perioada de laten. Acest procedeu este necesar mai ales plantelor cu bulbi, arbutilor i plantelor lemnoase, dar i cerealelor care necesit o perioad de vernalizare pentru a putea produce semine. 6.Plantele care formeaz protocorm (cormofitele) sau bulbi, trebuie transferate n sol n aceast form (protocorm, bulbi), ceea ce va crete ansele de aclimatizare i supravieuire ale acestora. 7.Transferarea lstarilor generai in vitro pe un mediu fr zaharuri i mbogirea mediului nconjurtor cu CO2 poate duce la o aclimatizare mai uoar a plantelor (Langford i Wainwright, 1986). Mai jos sunt prezentate pe scurt ultimele descoperiri n domeniu: 1.n unitile comerciale, transferul plantelor pentru aclimatizare se face direct n straturi acoperite cu folie de plastic, ceea ce ajut la meninerea umiditii (uneori se folosesc i pulverizatoare de ap n acest scop), iar luminozitatea i temperatura trebuie s fie relativ sczute. 221

2.Lstarii obinui in vitro la unele specii (Gerbera i Rhododendron) sunt transferai direct pe un substrat artificial, care va permite nrdcinarea acestora. Laboratoarele Twyford au confecionat un tip de ldie de plastic prevzute cu 400 de orificii, care vor fi umplute cu substrat pentru nrdcinare. Acestea vor permite scurgerea surplusului de apa i susinerea optim a lstarilor. nrdcinarea lstarilor n ldiele perforate va avea loc ntr-o ncpere semisteril, climatizat, n care umiditatea aerului este meninut ridicat. Imediat ce nrdcinarea este suficient i lstarii ncep s creasc, butaii sunt transferai din ldiele perforate direct n ser. Speciile lemnoase sunt n prezent nrdcinate mai mult in vivo dect in vitro, deoarece astfel se economisete mai mult timp i bani. La specii ca Rhododendron, Kalmia, Amelanchier, Betula, Vaccinium, Syringa vulgaris (Zimmerman, 1985) i n general la toate speciile lemnoase, care sunt propagate comercial, se aplic acest tip de nrdcinare. 3.Compania Milcop din Frana a produs un substrat artificial pentru nrdcinare, pe baz de polypropilen, autoclavabil, stabil biologic, inert chimic, permind o aerare bun. Acest substrat este disponibil sub form de fulgi, fiind potrivit pentru nrdcinarea in vitro. Pentru o nrdcinare direct, in vivo, exist blocuri (cuburi) mici, din acelai material, n care lstarii pot fi plasai cu uurin. Pe baza celor prezentate mai sus, se poate presupune c, n viitorul apropiat, vor aprea pe pia tot mai multe tipuri de substraturi artificiale, ce vor face aclimatizarea plantulelor mult mai eficient i mai uoar, dect a fost n trecut. Trecerea direct a butailor in vivo este important, pentru c va duce la eliminarea fazei de nrdcinare in vitro, care este relativ costisitoare i necesit o perioada de timp suplimentar, ceea ce crete perioada dintre doua generaii de plantule, fapt nedorit de companiile comerciale productoare de material semincer. Astfel micropropagarea va deveni o tehnic uzual i mai la ndemn, necesitnd doar camere de cretere special amenajate pentru aclimatizarea i nrdcinarea butailor direct pe substraturile artificiale.

222