DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE

R.I.A

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pour le développement de la méthode de dosage radio-immunologique.INTRODUCTION  La radio-immunologie fait appel à la physique nucléaire     ‹‹radioactivité ››et à l'immunologie. Technique très sensible qui permet de mesurer des quantités infimes de substances biologiquement actives. Avec la collaboration du médecin américain Solomon Berson. Rosalyn Yalow commence à utiliser les radio-isotopes pour explorer et diagnostiquer diverses maladies. Leurs études sur les mécanismes du diabète de type 2 les conduisent à développer la méthode de dosage radioimmunologique : RIA Le premier dosage radio immunologique : Dosage de l’insuline par Yalow et Berson en 1959 Point de départ d’un ensemble de méthodes d’immuno-dosages faisant appel à un traceur. 5 .

en excès d’AC  6 .En effet. qui est généralement de l'iode 131 ou 125 ou du Trium H3   Le DRI repose sur l’utilisation : Réaction Ag-Ac Méthodes radioactives Cette combinaison est responsable de la spécificité et de la sensibilité du DRI    Les DRI peuvent être classes en deux groupes selon les proportions relatives d’anticorps et d’antigènes présentent dans la réaction. on marque les molécules avec un radionucléide.I. en défaut d’AC -Le dosage immuno-radiometrique : IRMA. On distingue : -Le dosage R. classique : RIA ou dosage par compétition.

Dosage par compétition (défaut d’Ac)  Méthodes faisant appel à des Ac ou à des Ag marqués  Immuno-dosages des Ag ou des Ac par des techniques en phase hétérogène  La phase est hétérogène parce qu'il faut isoler les complexes Ag-Ac formés des Ac ou Ag restés en solution.  L'Ac non marqué (Aco) et l'Ac marqué (Ac*) se fixent à l'Ag dans les proportions de leur mélange.  La quantité du complexe Ac*-Ag diminue au fur et à mesure qu'augmente la quantité d'Aco dans le milieu.  La mesure de la radio-activité du complexe Ac*-Ag ne peut être faite qu'après élimination de la fraction Ac* libre 7 .

une partie de l’antigène est liée à l’anticorps (Bound) le reste est libre (Free)  En utilisant un système de séparation on peut séparer B et F  Grâce au signal délivré par le marqueur on peut mesurer la concentration de l’antigène marqué libre F* et du complexe B*  Ces concentrations sont. à l’équilibre dans les mêmes proportions que les concentrations des fractions F et B de l’Ag non marqué  On a donc pour toutes les concentrations de l’Ag : B / F = B*/ F* Le signal délivré par le marqueur est inversement proportionnel à la concentration en antigène. A l’équilibre. 8 .

Les dosages immunologiques par compétition sont réalisés principalement avec les isotopes radioactifs et les enzymes comme marqueurs. la protéine A du staphylocoque.Les méthodes pour séparer le constituant libre et le constituant lié dans le complexe Ag-Ac sont nombreuses et font appel à différentes techniques -Précipitations  * soit immunologique (méthode du double Ac) : le complexe Ag-Ac est précipité par un sérum anti-gammaglobuline..). * soit physico-chimique : par les solvants organiques (alcools. 9 . le sulfate d'ammonium à demi-saturation (Test de Farr).. * soit fixation de l'Ag sur un support solide : c'est la méthode la plus développée actuellement de par sa simplicité et sa rapidité de mise en œuvre.

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HCG possèdent en commun une sous unité  Tout Ac qui reconnaît un épitope reconnaît les 4 hormones 11 . en particulier aux haptènes  Nécessitent une constante d’affinité élevée  Possibilité de réactions croisées  TSH. FSH-LH.Avantages et inconvénients des dosages par compétition  S’appliquent à tous les antigènes.

Dosage Immuno-Radiométrique : IRMA Immuno Radiométrique Assay  Depuis l’avènement des Ac monoclonaux. l’IRMA a remplacé la méthode par compétition.  Elle se distingue par : présence d’un excès d’Ac  utilisation d’un 2eme Ac marqué  2 Ac dirigés contre 2 épitopes suffisamment éloignés sur la molécule d’Ag   La molécule à tester est prise en sandwich entre les deux Ac  La radioactivité liée est proportionnelle à la quantité d’Ag 12 .

 Dans le premier temps de la réaction. les Ac (ou les Ag) qui se sont fixés.. contenant les Ac (ou les Ag). est mis en contact avec le support "sensibilisé" qui est ensuite lavé. plaques de microtitration en polystyrène.) 13 . soit par un fluorochrome pour la fluorimétrie). l'Ag (ou l'Ac) est fixé à un support solide (billes. (soit par une enzyme pour l'enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) ou pour l'immunoblot.. tubes. Dans ces tests. le liquide biologique à tester.  Après lavage. substrat de l'enzyme et spectrophotomètre.  Dans un deuxième temps. l'activité résiduelle est mesurée par un système adéquat spécifique du marqueur (compteur de désintégration. fluorimètre. sont révélés par l'addition d'un second Ac marqué : soit par un isotope radioactif pour les radio-immuno-assays (RIA).

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. addition séquentielle des réactifs séparée par une étape de lavage. l’Ag ne réalise plus de pont entre les deux Ac ce qui entraîne une baisse du signal.Avantages et inconvénients : IRMA  Spécificité L’utilisation de deux Ac améliore la reconnaissance  Sensibilité Toute molécule(trace) d’Ag mise en présence de l’Ac liant est susceptible d’être captée Gamme de concentrations plus étendues(détections en exces)  Inconvénients Réactions croisées : Epitope semblable Présence d’auto Ac Effet crochet. 15  Pour éliminer ce phénomène . peut apparaître pour des concentrations élevées d’Ag .

 Elle se déroule en 4 étapes : Incubation du sérum du patient(Ac anti ADN) avec l’ADN double brin marqué Séparation des complexes immuns par précipitation et centrifugation Elimination de l’ADN double brin marqué non lié à l’ Ac Mesure de la radioactivité (proportionnalité entre la radioactivité mesurée et la quantité d’anticorps présents dans le sérum)  Une courbe étalon établie avec des quantités connues et croissantes d'Aco pour une même quantité connue et constante d'Ac*. permet par simple report de connaître une quantité inconnue d'Aco contenue dans un liquide biologique 16 .Test de Farr est une technique de dosage radio-immunologique : elle utilise de l’ADN double brin marqué par un radio-isotope (125I).

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 18 .062 29 5568 ans 12.7 j 8.Marqueurs Elément Radioactivité (Ci/mmol) Demi-vie Rayonnement C14 H3 0.1 j  .3 ans   I125 I131 2200 16100 59.

souris). En cas de dosages effectués en double. il se forme un complexe entre l’anticorps anti-hTSH (monoclonal. 19  . souris) fixé sur la paroi du tube. la partie libre du traceur est éliminée par décantation (ou aspiration) et rinçage. dans les plages de concentrations importantes sur le plan physiologique est pratiquement exclue. Une fois la réaction effectuée. Les anticorps monoclonaux contenus dans la trousse sont hautement spécifiques de la TSH. Une réaction croisée avec hLH.        Les échantillons dépassant la plage de mesure sont dilués avec le tampon de lavage. Principe du dosage   Le RIA-gnost® hTSH permet de doser in vitro la thyrotrophine dans le sérum (ou le plasma) humain d’après le principe du test sandwich à 1 étape. Au cours de ce test. La standardisation à été réalisée par rapport au standard hTSH WHO 80/558. L’évaluation des résultats fournis par les échantillons inconnus se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie dans des conditions identiques. la TSH contenue dans l’échantillon et l’anticorps anti-hTSH marqué à l’125I (monoclonal. hFSH et hCG. La fraction de traceur spécifiquement fixée sur les tubes revêtus d’anticorps est mesurée à l’aide d’un compteur gamma. on peut traiter au maximum 42 échantillons de patients avec une seule courbe d’étalonnage.

Lecture des résultats  Porter sur du papier millimétré d’une part les coups par minute : cpm des standards S1 à S6  d’autre part la concentration de TSH correspondante (μUI/ml).  Construire la courbe étalon  Marquer les valeurs du sérum de contrôle et des échantillons à doser. puis lire sur la courbe d’étalonnage la concentration en TSH. 20 .

1 ml ----------------------------------------► Décanter (aspirer) . Standards (ml) Sérum de contrôle (ml)  Echantillons (ml)  N° des tubes S1 S2 S3 S4 S5 S6 C.. laver avec 1 ml Compter( cpm) . 1..100 μl ------------------------------------     21 ---► Agiter pendant 2 h (300 ± 50 tr/min) Tampon de lavage ◄-------------------------------------------.. 2.  Standards 200/200 μl  Sérum de contrôle / Echantillons  Traceur antihTSH  ◄-----------------------------------------..

erreur systématique . reproductible  Deux sortes d’erreurs .CONTRÔLE DE QUALITE  Définir les caractéristiques de la méthode employée  Résultat doit être précis .erreur aléatoire 22 .

Erreur systématique  Ecart toujours de même signe entre un résultat et la valeur vraie  Paramètres entrainant une erreur systématique .Matériel : pipettes non calibrées .Ac : utilisation d’Ac peu spécifique ( résultats plus élevés) .Echantillon : présence d’auto anticorps 23 .Etalon : conservation .

Erreur aléatoire  Ecart de signe et de grandeur imprévisible entre un résultat et la valeur vraie.Distribution des différents réactifs .Méthode de séparation .Erreurs de mesure du signal L’erreur aléatoire estime la précision de la technique 24 .  Facteurs responsables .

elle est liée à la nature des Ac 25 .CRITERES DE QUALITE  Exactitude : valeur vraie ou estimée au mieux ( dilution)  Précision : mesures répétées sur le même échantillon  Sensibilité : variation minimale à imposer à la concentration pour obtenir une variation significative de la réponse  Spécificité : mesurer l’analyte désiré et seulement celui-ci .