Vous êtes sur la page 1sur 117

GUGUIANU ELEONORA

MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR
CURS

2011

Partea I

NOIUNI DE MICROBIOLOGIE GENERAL

NOIUNI INTRODUCTIVE 1.1.DEFINIIA I OBIECTUL DE STUDIU AL MICROBIOLOGIEI Microbiologia reunete tiinele biologice care au ca obiect de studiu vieuitoarele invizibile cu ochiul liber numite microorganisme. De-a lungul timpului, acestea au purtat denumiri diferite n funcie de nivelul cunoaterii lor: miasme (HIPPOCRATE- 460-377 a. Chr.) , germeni (,,seminaria morbi" n concepia medicului italian FRACASTORO,14681553),animaliculi (ANTONIUS van LEEUWENHOEK, 1632-1723), fermeni, microbi. Termenul de ,,microb" a fost inventat de Charles Sedillot n 1878 i i are originea n cuvintele greceti micros - mic i bios - via. Dei nu este considerat academic, el rmne de uz comun, la fel ca i sintagma ,,germeni microbieni". Lumea microorganismelor este imens i extrem de variat ca urmare a evoluiei pe parcursul a aproximativ 3 miliarde de ani cu succesiuni de ordinul minutelor ntre generaii, justificnd opinia potrivit creia trim ntr-o lume a microorganismelor i nu ntr-o lume cu microbi. Mult vreme, oamenii au fost tentai sa cread c lumea vie se rezum numai la ceea ce le relevau organele de sim, dei, nc din preistorie sesizaser o serie de efecte ale activitii acestora: unele benefice pe care, pragmatici, cutau s le obin (dospirea pinii, fermentaia alcoolic, lactic, acetic etc.), altele extrem de duntoare (bolile infecioase). Medicii, filozofii, chiar i unii poei ai acelor timpuri reflectau asupra cauzelor posibile ale acestor fenomene fr a putea depi ns stadiul de simple ipoteze. Descoperirea microorganismelor a devenit posibil abia n doua jumtate a sec. XVII ca urmare a inventrii aparatelor de amplificare optic. Studiul microcosmosului viu cu ajutorul microscoapelor din ce n ce mai performante a relevat existena de fiine vii cu structur celular i subcelular (acelular). Microorganismele celulare sunt algele microscopice, protozoarele, ciupercile microscopice (fungii, micromiceii) i bacteriile. Ele au, n general, toate cele trei artibute ale vieii: flux material, flux energetic i flux informaional. n categoria microorganismelor acelulare sunt incluse virusurile i viroizii, care dispun doar de flux informaional, dar i prionii (proteinele

infecioase transmisibile) - ageni patogeni neconvenionali pentru a cror descoperire PRUSINER a primit premiul Nobel n 1997. Pe msura perfecionrii metodelor de studiu i implicit a acumulrii de noi cunotine despre microorganisme, n cadrul microbiologiei s-au conturat numeroase discipline distincte cu un caracter fundamental (algologia, protozoologia, micologia, bacteriologia, virusologia, genetica microorganismelor, ecologia microorganismelor ,a.) i aplicativ (microbiologia medical, microbiologia veterinar, microbiologia alimentelor, microbiologia solului, microbiologia petrolului, microbiologia cosmosului etc.) Principalele caractere distinctive ale microorganismelor, care constituie obiectul de studiu al microbiologiei medicale i veterinare sunt redate n tabelul 1. Microbiologia are numeroase conexiuni interdisciplinare. Ea faciliteaz nelegerea i aprofundarea cunotinelor de morfopatologie, boli infecioase, imunologie, biologie molecular i reclam pentru a putea fi neleas i nsuit, cunotine de biochimie, indispensabile pentru studiul metabolisului bacterian, noiuni de biofizic pentru nelegerea funcionrii unor structuri bacteriene (membrana citoplasmatic, membrana extern a peretelui bacterian etc.), noiuni de anatomie i histologie pentru nelegerea funcionrii unor bariere antimicrobiene mecanice ( epiteliul cutanat i cel al mucoaselor, esutul conjunctiv dens, splarea mucoaselor prin secreii i excrete, transportul mucociliar) .a. Tabelul 1 Caracterele difereniale ntre principalele categorii de microorganisme Caracterul diferenial Tipul de organiz are Tipuri de acid nucleic Organizare a materialulu i genetic Echipament enzimatic i metabolism propriu Cretere Prioni Viroizi Virusuri acelular. Bacterii Celular procariot Micei Celular eucariot i 2 (ADN ARN i

acelular acelular

1 (ARN)

1 (ADN 2 (ADN sau ARN) ARN)

ARN de Genom talie viral mic Absente

Un singur Mai muli cromozom i cromozomi plasmide Prezente Prezente

Absente Absente

Absent Absent

Absent
4

Prezent

Prezent

Mod de Sintez reproducere amplifi cat prin convers ie Diferenier Nu este e celular cazul Parazitism Consta absolut nt, obligato riu Forme 1.P.P.C biologice .=protei de existen n n natur prionic celular normal 2.P.P.S .=protei n prionic patologi c scrapie

Sunt sintetiza i de celula gazd Nu este cazul Constant , obligator iu 1.ARN mic intranuc lear

Sunt Independent, sintetizate sciziparitate de celula gazd Nu este Absent cazul Constant, Absent obligatori u 1.Virion infecios, temporar extracelul ar 2.Virus vegetativ, intracelula r, n curs de sintez 3.Virus integrat, fixat n genomul celulei gazd La grania dintre viu i neviu 1.Celul vegetativ, 2.Spor (form de conservare )

Independent, sexuat sau asexuat

Prezent Absent

1.Miceliu sau pseudomi celiu 2.Spori de nmulire 3.Spori de rezisten

Poziia pe La scara grania filogenetic dintre viu i neviu

La grania dintre viu i neviu

Organisme vii cu organizare simpl (protiste )

Organisme vii cu diverse grade de complexitate.

1.2. SISTEMATICA MICROORGANISMELOR Stabilirea poziiei microorganismelor n sistematica biologic a ntmpinat n decursul anilor dificulti obiective, generate de criteriile care au stat la baza mpririi lumii vii n dou sau mai multe regnuri (fig. 1), de marea diversitate a acestor vieuitoare i de faptul c unele categorii de microorganisme se apropie prin caracteristicile lor de regnul animal (protozoarele) iar altele de regnul vegetal (algele, ciupercile microscopice, bacteriile).
5

Fig.1 Sistematizarea lumii vii n 5 regnuri Privite n ansamblu, aceste vieuitoare au ns trsturi distinctive de restul lumii vii, fiind situate pe o treapt inferioar de evoluie i organizare. Lundu-se drept criteriu de baz nivelul de organizare biologic (subcelular, unicelular sau pluricelular; eucariot sau procariot), la propunerea lui H a e c k e l (1866), reluat de S t a n i e r (1964), microorganismele au fost incluse ntr-un al treilea regn, alturi de cel vegetal i animal - regnul Protista divizat n protiste superioare, care grupau microorganismele eucariote (algele, protozoarele, miceii) i protiste inferioare, reprezentate de microorganismele procariote (algele albastre-verzi i bacteriile). n 1968, M u r r a y ncadreaz bacteriile i algele albastre-verzi n regnul Procaryotae, taxon nsuit de Determinatorul Bergey (1984) lucrare de o nalt probitate tiinific, unanim acceptat de bacteriologii din ntreaga lume. Un an mai trziu (1969), W h i t t a k e r creeaz regnul Fungi, care grupeaz ciupercile microscopice, prin desprinderea subncrengturii cu acelai nume, subsecvent ncrengturii Thallophyta, din regnul vegetal. Ulterior, virusurile, deoarece se deosebesc de celelalte microorganisme prin cel puin dou trsturi eseniale structura subcelular i lipsa metabolismului propriu , au fost ncadrate ntr-un regn de sine stttor, regnul Vira.
6

1.3. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI Existena fiinelor microscopice a fost intuit de foarte mult vreme dar, din lipsa mijloacelor tehnice, descrierea acestora a fost posibil abia dup ce inventarea microscopului a permis extinderea simurilor umane dincolo de capacitatea lor normal de percepie. Dac din acest motiv studiul microorganismelor a nceput foarte trziu, diferitele procese produse de microorganisme - n special bolile contagioase, care decimau milioane de oameni au fost n atenia oamenilor de tiin din cele mai vechi timpuri. Pn la HIPOCRATE (460-375 Hr) se considera c bolile sunt cauzate de intervenia unor fore supranaturale. Hipocrate, fondatorul medicinei raionale, afirma c toate bolile sunt naturale, produse de factori naturali i nu de zeiti, iar n ceea ce privete bolile molipsitoare, el le considera ca fiind rezultatul ptrunderii n organism a unor particule prezente i vehiculate de aer. Aceste particule au fost numite miasme, iar teoria care le admitea existena, teoria miasmatic. Trei sute de ani mai trziu, un scriitor i filozof roman, Varro (116-23 H) identifica miasmele cu nite animale mici animalia minuta invizibile cu ochiul liber. El coreleaz apariia unor mbolnviri cu particularitile arealului respectiv, cum ar fi existena mlatinilor. n lucrarea sa Rerum rusticarum de agricultura, Varro afirma: Dac ntr-un loc sunt mlatini, acolo cresc animale aa de mici, c ochii nu pot s le vad i acestea ajungnd n corp, cu aerul, pe gur sau pe nas, produc boli grele. Implicaia practic a teoriei miasmatice a fost considerabil pentru acele vremuri deoarece recomanda msuri eseniale de prevenire a rspndirii bolilor molipsitoare, care constau n fierberea apei i fumigaii cu sulf n spaiile considerate contaminate. Cu toate acestea, pn acum un secol i jumtate epidemiile evoluau nestnjenite; ciuma, holera i variola decimau uneori 80% din populaia arealelor geografice afectate (orae, ri, continente), iar difteria, tifosul exantematic, febra tifoid fceau ca mortalitatea prin boli contagioase s depeasc cu mult pierderile de viei omeneti determinate de toate celelalte calamiti naturale i rzboaie. Istoria evului mediu poate fi considerat, aadar, istoria marilor epidemii a cror apariie i recrudescen erau favorizate de pauperitatea msurilor profilactice de care dispunea omenirea la acea dat i de empirismul aplicrii lor. Msurile antiepidemice nu au putut fi nelese pn cnd n sprijinul ipotezelor privind existena microorganismelor au fost aduse dovezi clare, indubitabile. Se poate afirma c istoria microbiologiei i progresele ei sunt strns legate de curiozitaea tiinific a lui Leeuwenhoeck i de geniul lui Pasteur. LEEUWENHOECK (1632-1723), negustor i cercettor amator, care avea pasiunea lefuirii lentilelor, a reuit s evidenieze cu ajutorul unui microscop construit de el nsui, prezena n saliv, urin, puroi, apa de canal i
7

alte materiale, a unor organisme minuscule pe care le-a denumit viva animalicula . Descrierile lui Leeuwenhoeck sunt nsoite de desene surprinztor de exacte, care au fost reproduse n lucrarea Arcana naturae ope microspiorum detecta prezentat n anul 1675 Societii Regale de Biologie din Londra i tiprit la Delf n 1695. Deoarece lucrarea reprezint primul studiu de microbiologie din lume, ea este considerat certificatul de natere al microbiologiei. Constatrile lui Leeuwenhoeck nu au fost urmate de un progres rapid al cunotinelor, aa cum ar fi fost de ateptat. n schimb, ele au devenit obiectul unor polemici nverunate cu privire la originea microorganismelor, ntre preoi - partizani ai concepiei creaioniste i oamenii de tiin - susintori ai teoriei generaiei spontane. Aceast teorie, fondat nc din antichitate de marii filozofi materialiti Anaximandru, Democrit, Aristotel, Teofrast i alii, ncerca s explice apariia unor vieuitoare n alt mod dect prin actul creaiei divine. Aa s-a ajuns la acreditarea unor idei, cel puin bizare, potrivit crora broatele se nasc spontan din nmol, petii din frunzele copacilor czute n ap, oarecii din rufe murdare, viermii din brnz sau carne alterat, puricii din praf etc. Teoria generaiei spontane a fost susinut de numeroi adepi pn trziu, n cursul secolului XIX. Chiar i astzi, ca o expresie a ignoranei, unii oameni continu s cread c puricii pot s apar din praf. Utilizarea microscopului n secolul XVII a relevat organizarea anatomic foarte complex a acestor vieuitoare, semnnd ndoial n convingerile partizanilor acestei teorii, n sensul c structuri att de complexe nu ar putea s apar instantaneu din praf sau nmol. Mai mult, n 1668 biologul englez FRANCESCO REDI a demonstrat printr-o experien simpl c larvele se nasc din prini, acoperind cu tifon, pentru a evita depunerea oulor de musc, vasele n care au fost introduse fragmente de carne. Cu toate aceste dovezi tiinifice, partizanii generaiei spontane susineau c dac mutele se nasc din ou, apoi fiinele invizibile se nasc de la sine. Secolul al XVIII-lea a nregistrat puine progrese n cunoaterea lumii microorganismelor descoperite de Leeuwenhoeck. Aceast perioad se caracterizeaz prin acumulri de date privind morfologia microorganismelor, consecutiv perfecionrii aparatelor optice i prin ncercri de sistematizare a cunotinelor existente. LINN (1707-1778), n celebra lucrare Systema naturae, aprut n 1735, ncadreaz organismele microscopice n genul Chaos, nzestrndu-le cu puteri infernale (furia infernalis) care aveau semnificaia unei activiti patogene. n 1854, FERDINAND COHN creaz termenul de bacterie i mpreun cu EHRENBERG propune desprinderea acestui grup de microorganisme din regnul animal, argumentnd ncadrarea lui n regnul vegetal pe baza prezenei peretelui celular.
8

n istoria microbiologiei, secolul al XVIII-lea se ncheie cu o realizare empiric genial n domeniul imunologiei. n 1789 EDWARD JENNER (17491823), bazndu-se pe o ndelungat experien popular, obine prima imunizare artificial a oamenilor mpotriva variolei utiliznd o suspensie de cruste recoltate de pe ugerul vacilor bolnave. Toate aceste descoperiri i experiene empirice au constituit pai importani n cucerirea microcosmosului invizibil, anticipnd trecerea la etapa constituirii microbiologiei ca tiin independent. Aceast etap cuprinde a doua jumtate a secolului XIX i este indisolubil legat de numele marelui savant LOUIS PASTEUR (1822-1895), considerat n unanimitate printele microbiologiei. Plecnd de la observaia c fermentaiile alcoolic, lactic i butiric sunt rezultatul aciunii unor microbi, Pasteur fundamenteaz ntre anii 1857-1865 teoria microbian a infeciilor. El demonstreaz experimental relaia cauzal dintre micobi i infecie bazndu-se pe rezultatele cercetrilor efectuate asupra agentului etiologic al antraxului. Dei numeroi oameni de tiin ai acelor timpuri (Delafond, 1838; Pollender, 1849; Rayer i Davaine, 1850) au observat n sngele animalelor moarte de dalac (antrax) formaiuni bacilare cu lungimea de dou ori mai mare dect diametrul globulelor roii, iar Davaine le-a intuit rolul etiologic, Pasteur a fost acela care a demonstrat c prezena acestor germeni n organele oilor moarte reprezint cauza real a morii i nu consecine ale bolii. Bazat pe descoperirile sale privind mecanismele fermentaiilor i a infeciei, Pasteur demonstreaz indubitabil c microorganismele nu apar spontan n substraturile n care se multiplic ci prin contaminare, de vreme ce un mediu nutritiv sterilizat ntr-un recipient nchis etan rmne steril la infinit. Flacoanele sale cu lichide sterile se pstreaz i astzi la fel de limpezi ca n ziua n care au fost sterilizate. El a pus astfel bazele sterilizrii, oferind i mijloacele adecvate: pupinelul sau cuptorul lui Pasteur, autoclavul lui Chamberland. n paralel cu elucidarea cauzelor bolilor contagioase, eminentul cercettor a fcut descoperirea epocal a vaccinurilor microbiene, care a revoluionat medicina i gndirea biologic. Vaccinul contra holerei aviare a fost primul vaccin atibacterian bazat pe atenuarea patogenitii microbilor n condiii de laborator. Descoperirea principiului atenurii s-a datorat unei neglijene a colaboratorul su, Chamberland, care a uitat la termostat un timp mai ndelungat o cultur de Pasteurella multocida, agentul etiologic al holerei aviare. Inoculat la ginile sntoase, aceasta nu a mai produs infecia iar psrile respective au devenit rezistente la tulpina virulent ce le-a fost administrat ulterior. Inspirat de aceast ntmplare, trei ani mai trziu, n 1881, a procedat la atenuarea unei tulpini de Bacillus anthracis izolat de la oi moarte de antrax, pe care a inoculat-o apoi unor oi sntoase. Rezultatul a fost acelai, n sensul c dup reinocularea cu o cultur virulent oile au supravieuit deoarece deveniser imune.
9

La 28 februarie 1881 Pasteur a comunicat aceast descoperire Academiei de tiine. Rspunznd nencrederii cu care a fost primit de adversarii si, savantul a procedat la efectuarea unei demonstraii la o ferm din apropierea Parisului, n faa unei asistene compus din medici umani i veterinari, farmaciti, agricultori, politicieni i alte categorii de ceteni. Experimentul a constat n vaccinarea anticrbunoas a unui lot de oi i neadministrarea vaccinului la un lot martor. Dup 15 zile, ntregul efectiv a fost inoculat cu o suspensie de bacili crbunoi viruleni. Experimentul a avut rezultatul scontat, spulbernd scepticismul inamicilor vaccinrii. Prin aplicarea vaccinrii iniiate de Pasteur, incidena antraxului s-a redus considerabil, ceea ce a fcut ca utilizarea lui s se extind cu repeziciune n ntreaga lume. Geniul lui Pasteur este i mai pregnant ilustrat prin prepararea vaccinului antirabic. Fr a cunoate natura agentului etiologic al turbrii, de a crui existen nu s-a ndoit ns nici un moment, Pasteur a reuit s obin prin treceri succesive pe creier de iepure, virusul rabic fix. Acesta este incapabil s reproduc turbarea inoculat subcutanat, n schimb confer imunitate fa de infecia cu virus slbatic (de strad). Practica imunizrii antirabice cu virusuri fixe s-a pstrat pn n zilele noastre. Lui Pasteur i revine i meritul de a fi izolat i descris numeroi ageni etiologici ai unor infecii ale omului i animalelor: Clostridium septicum (vibrionul septic al lui Pasteur), stafilococii, streptococii, etc. Pasteur a avut numeroi discipoli, n jurul su constituindu-se o adevrat coal la care s-au format emineni microbiologi. Dintre acetia, lui EMILE ROUX i ALEXANDRE YERSIN li se datoreaz studiul toxinelor microbiene, ultimul fiind i descoperitorul agentului etiologic al ciumei (Yersinia pestis), iar Edmond Nocard mpreun cu Roux au izolat i identificat mai muli germeni microbieni cunoscui astzi sub denumirea de micoplasme. CHARLES EDUARD CHAMBERLAND este autorul unor inovaii tehnice deosebit de utile activitii curente de laborator, ca de exemplu primul filtru bacteriologic i autoclavul. Pintre discipolii lui Pasteur se numr i Victor Babe, fondatorul colii romneti de microbiologie. Marile descoperiri ale lui Pasteur n-au ntrziat s-i gseasc laturi aplicative i n alte domenii ale medicinii. Aa a fost cazul introducerii antisepsiei n chirurgie de ctre JOSEPH LISTER (1827-1917), cel mai convins i activ susintor al teoriei biologice a infeciilor formulat de Pasteur, cruia i scria: Dac vei veni vreodat la Edinburg, vei gsi, cred, cea mai bogat rsplat vznd n spitalul nostru ce binefaceri pentru umanitate produce opera dumneavoastr. Este vorba despre considerabila scdere a mortalitii prin infecia de spital ca urmare a folosirii fenolului n dezinfecie.
10

Un alt fondator al microbiologiei, ROBERT KOCH (1843-1910), inspirndu-se din lucrrile lui Pasteur, va completa conceptul de infecie introducnd criterii stricte de stabilire a responsabilitii etiologice a unui microorganism, care au rmas n literatura de specialitate sub numele de postulatele sau triada lui Koch. Numele su mai este legat de descoperirea agentului etiologic al tuberculozei, introducerea mediilor de cultur solide n practica bacteriologic, semnalarea fenomenului de alergie i prepararea primei substane revelatoare ( tuberculina). n perioada marilor descoperiri ale lui Pasteur i Koch au fost identificai i descrii agenii etiologici a numeroase boli, cum ar fi: Clostridium tetani de ctre NICOLAER i KITASATO(1884), salmonelele, de ctre EBERTH (1884), SALMON i SMITH (1886), Escherichia coli de ctre ESCHERICH (1885), .a. Secolul XX, a marcat o nou perioad de importante descoperiri i aprofundare a unor aspecte pn atunci incomplet elucidate, precum: introducerea substanelor chimioterapice i a antibioticelor n terapia infeciilor, relevarea unor aspecte morfofiziologice de finee ale microorganismelor, descoperirea virusurilor i a mecanismului infecei virale, efectuarea primelor studii de genetic molecular, dezvoltarea imunologiei i afirmarea ei ca ramur independent a tiinelor biologice. n jurul anului 1910 PAUL ERLICH introduce n practica medical primul chimioterapic salvarsanul -, folosit cu succes n tratamentul sifilisului. Antibioticele au intrat n patrimoniul terapiei antimicrobiene n anul 1941, cnd Ernst Chain i Howard Florey trateaz primii pacieni cu penicilin. Efectul antibacterian al acestei substane a fost descoperit nc din 1929 de ctre ALEXANDER FLEMING, n urma sesizrii antagonismului exercitat de o ciuperc din genul Penicillium fa de o cultur de stafilococ. Aprofundarea cunoaterii morfologiei i fiziologiei microorganismelor este tributar progreselor nregistrate n domeniul opticii, electronicii i chimiei. Astfel, vizualizarea virusurilor i cunoaterea ultrastructurii microorganismelor au devenit posibile dup inventarea microscopului electronic (1930-1940), iar determinarea structurii chimice a acestora i a activitii enzimelor bacteriene, prin folosirea izotopilor radioactivi. n cadrul etapei contemporane de evoluie a microbiologiei, a debutat i sa dezvoltat genetica microbian, tiina care are ca obiect ereditatea i variabilitatea microorganismelor. Avnd un aparat genetic mai redus, virusurile i bacteriile au constituit obiectul de studiu al cercetrilor fundamentale de genetic. Primele observaii care au contribuit la stabilirea sediului informaiei genetice la microorganisme i macroorganisme au fost efectuate de ctre GRFFITH n 1928 pe bacteria Diplococcus pneumoniae (pneumococul). El a constatat c n contact cu pneumococi viruleni omori prin cldur, pneumococii nepatogeni devin viruleni.
11

n 1944, AVERY i colaboratorii si au reuit transformarea genetic a unor pneumococi neviruleni n tipul virulent cu ajutorul ADN extras din pneumococii viruleni, demonstrnd astfel, c acidul dezoxiribonucleic (ADN) este suportul material al ereditii. F. IACOB i J. MONOD lanseaz n 1961 ipoteza existenei unui ARN mesager prin intermediul cruia informaia genetic este transferat de la ADN la ribozomi. Tot ei elaboreaz teoria reglajului genetic al activitii celulare (teoria operonului), pentru care au primit premiul Nobel. Lui GEORGE PALADE, A. CLAUDE i C. DUVE laureai ai premiului Nobel n 1974, le datorm descoperirea rolului ribozomilor n sinteza proteinelor. DEZVOLTAREA MICROBIOLOGIEI N ROMNIA nceputurile cercetrii i practicii microbiologice n Romnia se situeaz spre sfritul secolului al XIX-lea. VICTOR BABE (1854-1925) a fost fondatorul colii romneti de microbiologie. Marele savant romn s-a format lucrnd n perioada 1881-1884 n laboratorul lui PASTEUR i n 1885 n laboratorul lui KOCH. BABE a desfurat o prodigioas activitate tiinific elabornd peste 1.000 lucrri, 25 monografii i primul tratat de bacteriologie n colaborare cu VICTOR CORNIL n 1883. Descoperirea n 1887 a incluziilor produse de virusul turbrii n celulele piramidale din cornul lui Ammon, cunoscute sub numele incluziile lui Babe-Negri, a serurilor imune (mpreun cu LEPP n 1889), a paraziilor din hematiile unor specii de animale, paternitatea acestei descoperiri fiind recunoscut prin crearea genului Babesia n care au fost ncadrate microorganismele respective, reprezint contribuiile cele mai importante cu care VICTOR BABE a mbogit tezaurul tiinei romneti i universale. Alturi de acestea trebuie menionate i numeroasele sale cercetri asupra antagonismului bacterian i descrierea granulelor metacromatice din citoplasma bacilului difteriei (corpusculii Babe-Ernst). Paralel cu activitatea tiinific, VICTOR BABE a dezvoltat i o bogat activitate didactic, organizatoric i obteasc, conturndu-se ca o figur luminoas de savant patriot. Savanii care ulterior au dezvoltat n mod strlucit coala de microbiologie medical romneasc au fost: IOAN CANTACUZINO (18631934), CONSTANTIN IONESCU-MIHESTI (1883-1962), MIHAI CIUCA (1883-1969), DUMITRU COMBIESCU (1887-1961), iar n domeniul virusologiei CONSTANTIN LEVADITI (1874-1953) i TEFAN S. NICOLAU (1896-1967). PAUL RIEGLER (1867-1938) a fost fondatorul colii romneti de microbiologie veterinar. Elev al lui VICTOR BABE, el a introdus la noi n ar practica diagnosticului bacteriologic n medicina veterinar. n 1911 a fondat institutul de seruri i vaccinuri de uz veterinar (n acea perioad, al treilea
12

de acest fel n lume), care n 1922 primete numele lui PASTEUR. A desfurat o susinut activitate tiinific, remarcndu-se prin lucrrile sale privind bacilul morvei. ALEXANDRU VECHIU (1890-1954) s-a remarcat printr-o activitate multilateral. El a condus, dup RIGLER, Institutul Pasteur i Catedra de Microbiologie a Facultii de Medicin Veterinar din Bucureti. VECHIU a fost printre primii cercettori care au reuit atenuarea virusului pestei porcine prin lapinizare (adaptarea pe iepure). ALEXANDRU CIUC (1880-1972) a fost profesor de Boli Infecioase la Facultatea de Medicin Veterinar din Bucureti. Prin activitatea sa tiinific a adus contribuii importante n probleme ca: infecia experimental cu bacilul morvei la taurine, tipizarea virusului febrei aftoase, tratamentul durinei cu neosalvarsan etc. ILIE POPOVICI (1902-1982), personalitate fecund i multilateral, a adus printre altele, contribuii deosebite n problema preparrii de noi vaccinuri contra febrei aftoase, turbrii, agalaxiei contagioase a oilor i caprelor i holerei aviare. NICOLAE MUNIU (1909-1977), dup o serie de lucrri inedite privind bacilul morvei, a iniiat i organizat cercetarea i producia de biopreparate n domeniul febrei aftoase. NICOLAE STAMATIN, profesor de Microbiologie la Facultatea de Medicin Veterinar din Bucureti, continund tradiia inaugurat de PAUL RIGLER a contribuit la nflorirea colii romneti de Microbiologie Veterinar. Practica veterinar i datoreaz, printre altele, dou vaccinuri cu mare valoare profilactic: vaccinul anticrbunos preparat din tulpina acapsulogen 1190 R i vaccinul antirujetic preparat din tulpina VR2 - vaccinuri adoptate ulterior i n alte ri. Totodat, cercetrile fundamentale ntreprinse n domeniul biologiei sporogenezei, a antagonismului microbian, a bacteriofagilor speciilor din genul Bacillus, contribuiile aduse n domeniul clasificrii stafilococilor i pasteurelelor, completeaz palmaresul care l situeaz pe NICOLAE STAMATIN printre reprezentanii de frunte ai Bacteriologiei veterinare romneti. Pe lng ,,pionierii Microbiologiei romneti, se cuvine a fi menionate i alte personaliti reprezentative, care au desfurat o rodnic activitate pe tarmul microbiologiei veterinare, ca: ALEXANDRU POP, microbiolog, erudit a adus contribuii originale n domeniul brucelozei i al unor probleme de imunologie teoretic. CONSTANTIN SURDAN a elaborat numeroase lucrri privind pararickettsiile. VALENTIN VOLINTIR, pionier al unor domenii de cercetare, a diagnosticat i izolat, primul n ara noastr, ageni etiologici ca Listeria monocytogenes, Moraxella bovis etc.

13

POPA OCTAVIAN, autor al unor lucrri privind salmonelozele animalelor i cursuri de Microbiologie i Imunologie la F.M.V. Timioara. ANDREI STOENESCU (1914-2001), strlucit reprezentant al microbiologiei veterinare romneti, a condus destinele disciplinei de Microbiologie i Imunologie n cadrul Facultii de Medicin Veterinar Iai, din anul 1962 (data nfiinrii disciplinei), pn n anul 1974. Profesorul Stoenescu a desfurat o prestigioas activitate de cercetare, concretizat n peste 130 lucrri tiinifice originale. Demne de menionat, datorit prioritii lor naionale, sunt studiile privind encefalomielita infecioas (boala de Teschen) la porc n nordul Moldovei. ALEXANDRU GRECIANU (1930-1998), distins intelectual, remarcabil cercettor microbiolog i cadru didactic de excelen, a continuat consolidarea colii de Microbiologie din cadrul F.M.V. Iai, n perioada 1974-1995. Pe plan tiinific, a adus contribuii originale la metodologia identificrii grupului E. coli i la stabilirea corelaiilor existente ntre serogrup i specia animal receptiv. La ora actual, cercetarea de vrf n domeniul microbiologiei veterinare la noi n ar este efectuat de ctre cadrele didactice i doctoranzii de la cele patru faculti de Medicin Veterinar, cercettorii din cadrul Institutului Pasteur, medicii specialiti din laboratoarele veterinare centrale i din reeaua laboratoarelor judeene.

14

NOIUNI DE BACTERIOLOGIE GENERAL Bacteriologia este ramura microbiologiei care se ocup cu studiul microorganismelor unicelulare cu structur procariot, numite bacterii (termen creat de Ferdinand Cohn n 1872). Celula bacterian de tip procariot se caracterizeaz printr-o organizare simpl, primitiv, fiind lipsit de membrane intracelulare i unele organite (mitocondrii, aparat Golgi i reticul endoplasmatic propriu-zis) - structuri prezente n celulele eucariote (celula animal, vegetal i micetic). Bacteriile sunt metabolic active deoarece dispun de echipament enzimatic propriu, care realizeaz reaciile celulare de degradare i biosintez. Principala modalitate de multiplicare a bacteriilor este diviziunea simpl binar sau sciziparitatea. Unele specii bacteriene pot exista n natur sub dou forme biologice alternative: forma vegetativ care reprezint celula bacterian propriu-zis, dotat cu toate nsuirile caracteristice speciei din care face parte i sporul bacterian - form de rezisten i de conservare a speciei n condiii ostile, improprii vieii. 2.1 NOIUNI DE TAXONOMIE i NOMENCLATUR BACTERIAN 2.1.1 TAXONOMIA BACTERIILOR Taxonomia (gr. taxon = grup) sau sistematica biologic este tiina clasificrii. Un taxon biologic reunete o sum de indivizi asemntori ntre ei n virtutea descendenei dintr-un strmo comun, deci posesori ai unei informaii genetice comune. Prin urmare, clasificarea organismelor vii este o clasificare natural sau filogenetic. Comparativ cu celelalte regnuri, clasificarea organismelor procariote pe baza acestui criteriu a ntmpinat numeroase dificulti, generate de cauze obiective cum ar fi imposibilitatea studierii bacteriilor ca indivizi ci doar ca populaii din cauza dificultilor de manipulare a unei singure celule. Gruparea bacteriilor n categorii taxonomice pe criterii filogenetice a devenit posibil relativ recent, prin aplicarea tehnologiilor moderne de biologie molecular i biochimie n studiile de genetic bacterian. Principalii parametri luai n studiu, n acest scop, sunt :
15

1. coninutul relativ de guanin + citozin( G+C%) al ADN purificat; cu ct coninutul G+C a dou bacterii este mai apropiat, cu att acestea sunt mai nrudite; 2. omologia secvenelor nucleotidice ale ADN, cuantificat prin formarea moleculelor hibride pornind de la dou catene ADN cu origini diferite; 3. studiul secvenelor oligonucleotidice ale ARN ribozomal; gradul de nrudire a dou organisme este direct proporional cu omologia secvenelor nucleotidice din ADN sau cu numrul de secvene oligonucleotidice comune din ARN ribozomal. 4. studiul structurii primare a enzimelor izofuncionale sau a citocromului C; 5. studiul imunologic al proteinelor bacteriene omoloage. Pe baza criteriului omologiei materialului genetic, n ultimii ani clasificrile convenionale ale bacteriilor dar i a celorlalte categorii de microorganisme au fost supuse unor repetate remanieri. Dei acest criteriu de identificare i ncadrare taxonomic a bacteriilor este, indiscutabil, cel mai obiectiv, din cauza gradului crescut de dificultate tehnic i a aparaturii pe care o reclam, n practica bacteriologic curent se recurge n continuare la identificarea pe baza caracteristicilor fenotipice (morfologice, culturale, metabolice, antigenice, ecologice, de patogenitate, de sensibilitate la factori fizici, chimici i biologici etc. ). Categorii de taxoni Unitatea taxonomic de baz a lumii vii este specia. Specia bacterien poate fi definit ca populaii de celule cu caractere fenotipice comune, prin care difer semnificativ de alte populaii. Fiecare populaie care aparine unei specii poart numele de tulpin bacterian, clon sau su. Ea este o cultur pur care i are originea ntr-o singur izolare dintr-un mediu natural. Pentru practica bacteriologic, tulpina bacterian are, prin analogie cu organismele superioare, valoarea unui individ. Toate examenele necesare identificrii bacteriilor i ncadrrii lor taxonomice se execut pe tulpini bacteriene i nu pe celule izolate, plecnd de la premiza c o populaie de celule bacteriene, care constituie o tulpin provine din descendena uneia sau a unui numr restrns de celule i c este genetic omogen. Taxonii de rang superior speciei, n succesiunea lor ascendent, sunt: genul, familia, ordinul, clasa i diviziunea (ncrengtura sau phylum). Genul reprezint un grup taxonomic alctuit din mai multe specii nrudite cu specia tip. El poate fi format dintr-o singur specie (gen monotipic) sau din mai multe specii. Toate bacteriile i au locul n cadrul unui gen iar identificarea genului st la baza diagnosticului bacteriologic curent. Familia grupeaz mai multe genuri nrudite dintre care unul este considerat genul tip. Numeroase genuri nu au fost ncadrate nc n familii.
16

Ordinul este un taxon format din familii nrudite, mai rar utilizat, puine grupe de bacterii fiind ncadrate n ordine. Clasa este un taxon superior, care grupeaz mai multe ordine nrudite. Diviziunea reprezint o grupare de clase nrudite. Pentru identificarea i ncadrarea taxonomic corect a tulpinilor bacteriene izolate ntr-un laborator de microbiologie cu dotare clasic este necesar confruntarea caracterelor fenotipice evideniate pe parcursul examenului bacteriologic cu datele existente n determinatoare, manuale i ghiduri. Determinatorul cu cea mai larg utilizare n ntreaga lume este ,, Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology". 2.1.2. NOMENCLATURA BACTERIILOR Conform normelor generale de nomenclatur n biologie fiecare bacterie este numit prin dou cuvinte latinizate, care caracterizeaz foarte sintetic bacteria respectiv. Primul cuvnt indic genul i se scrie cu iniial majuscul iar cel de-al doilea, specia. Numele genurilor sunt inspirate , de regul, de : - caracterele morfologice, frecvent forma i modul de grupare (Bacillus = baston mic; Staphylococcus = ciorchine de strugure; Sarcina = pachet, etc.), asociate uneori cu habitatul natural al bacteriei (Lactobacillus = bastona din lapte); - numele bacteriologului care a izolat primul bacteria respectiv sau a avut merite deosebite n studiul ei : Brucella (Bruce), Pasteurella (Pasteur), Escherichia (Escherich) etc. Cel de-al doilea cuvnt denumete specia i este descriptiv pentru substantivul care reprezint genul. Numele speciei se scrie ntotdeauna cu liter mic. El se poate referi la : - un caracter morfologic, cultural sau biochimic (Staphylococcus aureus, Lactobacillus acidophilus, etc.); - gazda receptiv (Brucella suis, Streptococcus equi, Mycoplasma gallinarum etc.); - boala, un simptom sau o leziune caracteristic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis, Mycoplasma agalactiae, Listeria monocytogenes, etc.); - numele bacteriologului care a descris primul bacteria (Actinobacillus lignieresii, Clostridium chauvoei, Coxiella burneti, etc.). Numeroase specii bacteriene au i nume comune, folosite deseori n vorbirea curent, ca de exemplu : bacilul piocianic sau bacilul puroiului albastru , pentru Pseudomonas aeruginosa; bacilul lui Koch sau B.K., pentru Mycobacterium tuberculosis; bacilul tetanosului, pentru Clostridium tetani, etc Ordinul i familia sunt denumite cu numele genului celui mai reprezentativ pentru gruparea taxonomic respectiv, la care se adaug sufixele
17

,,ales pentru ordin i ,,aceae pentru familie (ex. genul reprezentativ Rickettsia, ordinul Rickettsiales, familia Rickettsiaceae). Din anul 1980 se consider valide numai denumirile (taxonii) citai n Lista Oficial a Denumirilor Bacteriene (Aproved List of Bacterial Names), care este reeditat periodic. Taxonii noi propui i modificrile aduse acestei liste dup ultima ediie trebuie s fie oficializate prin publicarea n revista ,,International Journal of Systematic Bacteriology (Rpuntean Ghe. i col., 2005).. 2.2 MORFOLOGIA I BIOLOGIA BACTERIILOR 2.2.1 MORFOLOGIA CELULEI VEGETATIVE Cunoaterea caracteristicilor morfologice (forma celulei, dimensiunile, modul de grupare, afinitile tinctoriale) are o importan deosebit n identificarea i ncadrarea taxonomic a bacteriilor deoarece, n practica curent a diagnosticului bacteriologic, acestea constituie criterii taxonomice de baz. 2.2.1.1 Forma i modul de grupare a bacteriilor Dup forma celulei, bacteriile pot fi grupate n patru categorii distincte: sferice, cilindrice, spiralate sau helicoidale i ptrate (fig.1).

Fig. 1. Forme posibile la bacterii 1.coc sferic; 2.coc oval; 3.coc asimetric cu un pol ascuit i unul rotunjit; 4.coc asimetric reniform; 5.form cocoid; 6.cocobacil; 7.bacil fin; 8.bacil asimetric n form de mciuc; 9.bacil cu capetele retezate; 10.bacil cu capetele rotunjite; 11.vibrion; 12.spirochet cu spire mari; 13.spirochet cu spire mici. La cele mai multe specii bacteriene, celulele fiice rezultate n urma diviziunii se separ i rmn independente. La unele specii ns, majoritatea celulelor-fiice nu se despart timp de una sau mai multe generaii formnd constant grupri caracteristice cu valoare taxonomic.
18

Modul de grupare a bacteriilor este determinat de raportul geometric dintre planurile succesive de diviziune. Bacteriile sferice n terminologia curent aceste bacterii poart denumirea de coci. Cocii pot avea form sferic, oval, lanceolat sau reniform, diametrele celulei fiind aproximativ egale. In funcie de raporturile care se stabilesc ntre celulele-fiice dup diviziune, cocii pot fi izolai sau grupai. Principalele moduri de grupare sunt (fig. 2): - diplococul, care rezult prin diviziunea celulelor n planuri succesive paralele, celulele fiice rmnnd grupate cte dou; - streptococul, constituit din coci nlnuii ca urmare a diviziunilor succesive n planuri paralele i a persistenei legturilor ntre celulele fiice pe parcursul mai multor generaii; - tetrada sau tetracocul - o grupare de patru celule rezultat din dou diviziuni succesive n planuri perpendiculare; - sarcina - o grupare de opt coci sub forma a dou tetrade suprapuse, care rezult n urma a trei diviziuni n planuri perpendiculare: al doilea pe primul i al treilea pe primele dou; - stafilococul, la care planurile succesive de diviziune sunt dispuse n direcii diferite astfel nct celulele rezultate formeaz grmezi neregulate, asemntoare ciorchinilor de struguri

Fig.2 Modalitile de grupare a cocilor n funcie de orientarea planurilor de diviziune celular.

19

Bacteriile cilindrice cunoscute sub denumirea comun de bacili, au form de bastonae. Raportul dintre cele dou axe variaz ns foarte mult, nct, unii bacili au un aspect filamentos sau chiar ramificat iar alii se apropie de forma sferic-oval, fiind numii din acest motiv cocobacili. Bacilii pot fi drepi sau uor ncurbai la mijloc sau la una din extremiti, cu capetele tiate drept ca la Bacillus anthracis, rotunjite ca la majoritatea speciilor, ascuite ca la Fusobacterium fusiformis, sau dilatate n form de picot sau de haltere - caracteristic a genului Corynebacterium. Diviziunea bacililor are loc dup un singur plan transversal pe axul longitudinal. Dup diviziune bacilii pot rmne izolai sau grupai cte doi (diplobcili), n lanuri cu lungimi variabile (streptobacili), n palisad (asemntor dinilor unui pieptene) sau sub form de idiograme chinezeti (fig. 3).

Fig.3. Modalitile de grupare a bacililor: 1.diplobacil; 2.grupare n forma literei V; 3.streptobacil; 4.filament; 5.filament cu citoplasm granular; 6.form ramificat; 7.grupare n palisad; grupare n ideograme chinezeti. Bacteriile spiralate sau helicoidale In funcie de numrul de spire i flexibilitatea peretelui celular, exist trei subtipuri morfologice de bacterii spiralate : - vibrionul, cu aspect de virgul sau asemntor literei ,,S; - spirilul, cu mai multe spire i un perete celular rigid, care i confer stabilitate morfologic i dimensional.; - spirocheta, alctuit de asemenea din mai multe spire dar care sunt flexibile (se pot strnge sau relaxa) datorit elasticitii peretelui celular . Bacteriile ptrate au fost puse n eviden n probele de ap hipersalin prelevate din blile Peninsulei Sinai. Ele formeaz adesea placarde de 4-16 celule rezultate din mai multe diviziuni succesive, la care se disting cu mult claritate planurile de diviziune. Forma ptrat a acestor bacterii i faptul c sunt mult aplatizate (0,1 0,5 m grosime) se explic prin lipsa presiunii interne a
20

celulelor n mediu hiperosmotic, situaie n care, teoretic,bacteriile pot lua orice form. 3.2.1.2. Constantele fizice Dimensiunile bacteriilor variaz n funcie de specie, ntre 0,1 15 micrometri (m) lungime (bacteriile filamentoase ajunnd pn la 500 m) i 0,02 2 m diametru transversal. Din acest punct de vedere bacteriile pot fi grupate n trei categorii : mici 0,3 1,5/0,1 0,5 m (ex. Brucella spp.); mijlocii 2 3/0,5 1 m (ex.Escherichia spp.); mari 10 - 15/1 - 2 m (ex. Bacillus spp., Clostridium spp. ). Volumul bacteriilor oscileaz ntre 0,oo3 x 10-12 (ex. Mycoplasma spp. ) i 7,068 x 10-12 (Bacillus megatherium ). Densitatea sau greutatea specific a celulelor bacteriene este ceva mai mare dect a apei, situndu-se ntre 1,07 i 1,032. Datorit densitii apropiate de cea a apei bacteriile plutesc n mediile lichide, din care pot fi separate prin centrifugare. 2.2.1.3. Structura celulei bacteriene Celula bacterin este constituit dintr-un nveli i un coninut. Unele specii bacteriene sunt prevzute n plus cu organite de micare (cilii sau flagelii) i/sau cu organite de aderen (pilii sau fimbriile). In figura 4 este reprezentat schematic structura unei bacterii ipotetice, cu toate componentele menionate.

Fig.4 Schema unei celule bacteriene tipice (www. ArabsLAB. com) NVELIUL Principalele componente ale nveliului celulei bacteriene sunt : - membrana citoplasmatic, prezent la toate bacteriile n contact intim cu citoplasma;
21

- peretele celular situat la exteriorul membranei, prezent la toate bacteriile cu excepia micoplasmelor; - capsula i glicocalixul structuri extraparietale prezente numai la un numr restrns de specii bacteriene i numai n anumite condiii de mediu. Membrana citoplasmatic Numit i membran plasmatic sau membran celular, aceast component esenial a tuturor bacteriilor acoper de jur mprejur citoplasma, separnd-o de faa intern a peretelui celular. Examinat la microscopul electronic, membrana citoplasmatic apare ca o formaiune triplu stratificat, cu o grosime de 7,510 nanometri (nm), constituit dintr-un strat subire electronotransparent delimitat de ambele pri de cte un strat mai gros, electronoopac. Scheletul biochimic al membranei este format dintr-un strat dublu de fosfolipide orientate cu extremitatea hidrofil (radicalul fosforic) spre exteriorul i respectiv spre interiorul celulei i extremitatea hidrofob (dou lanuri de acizi grai), fa n fa (fig.5). Acest strat bimolecular fosfolipidic confer membranei rolul de barier osmotic i constituie sediul a numeroase proteine funcionale: porine (prin oligomerizare delimiteaz pori transmembranari, mai mult sau mai puin specifici, prin care au acces nutrienii), proteine de legare i transport a nutrienilor n celul i a cataboliilor n sens invers, enzime (hidrolitice, respiratorii .a.).

Fig.5 Membrana citoplasmatic - reprezentare schematic a unui model tridimensional (dup Lodish i Rothman,1979; cit.de Zarnea G., 1983). Membrana citoplasmatic este implicat, de asemenea, n reglarea proceselor de diviziune celular i sporogenez. Prin invaginarea i plierea membranei spre interiorul celulei bacteriene iau natere nite formaiuni numite mezozomi, care i mresc suprafaa funcional.
22

Peretele celular Peretele celular este situat la exteriorul membranei citoplasmatice, mai gros dect aceasta (15 30 nanometri), rigid i poros. Structura morfochimic a peretelui celular este determinant pentru grosimea, gradul de rigiditate i afinitatea sa fa de anumite substane colorante (afinitatea tinctorial). In funcie de modul n care se coloreaz prin metoda Gram, bacteriile se mpart n Gram pozitive (colorate n violet) i Gram negative (colorate n rou), iar prin metoda Ziehl Neelsen, n acidorezistente (colorate n rou) i neacidorezistente (colorate n albastru). Peretele celular este format dintr-un strat bazal care ader la membrana citoplasmatic, similar ca i compoziie chimic la toate bacteriile i un strat superficial cu o structur diferit la cele trei categorii tinctoriale (Gram pozitive, Gram negative, acidorezistente), numit stratul structurilor speciale. Stratul bazal este un polimer glicopeptidic numit peptidoglican sau murein (lat. murus=zid). El este format din macromolecule lungi de dizaharide aminate nlnuite alternativ (N-acetilglucozamin i acid Nacetilmuramic), dispuse paralel i legate ntre ele prin puni polipeptidice, realiznd astfel o reea care ncorseteaz celula i i confer rezisten mecanic (fig.6 A i B).

23

Fig. 6 Structura reelei de peptidoglican a peretelui celular la bacteriile Gram pozitive (A) i Gram negative (B). La bacteriile Gram pozitive peretele celular este gros i rigid, alctuit din 70-80% peptidoglican structurat ntr-o reea tridimensional foarte rezistent (fig.6 A). Stratul structurilor speciale conine proteine, acizi teichoici, lipoteichoici i la numeroase specii, acizi teichuronici, care sporesc rigiditatea peretelui celular (fig. 7 A). Peretele bacteriilor Gram negative, dei mai subire, are o structur mai complex (fig. 7 B). Stratul bazal este format dintr-un complex peptidoglicanlipoprotein, cu un coninut mai mic de peptidoglican (~20%) structurat bidimensional (fig. 6B), iar stratul structurilor speciale este constituit dintr-o membran extern n care predomin liopopolizaharidele (LPS). Componenta lipidic (lipidul A), situat proximal, se leag de un miez polizaharidic (core) identic ca structur la toate bacteriile, care se continu cu un lan de trei, patru sau cinci uniti zaharidice repetate ce constituie un important antigen al bacteriilor Gram negative (atg. O). Diferenele de structur chimic a atg.O identificate la tulpinile unor specii bacteriene (ex. Escherichia coli, Salmonella enterica) a permis clasificarea lor n mai multe grupe serologice. Complexul LPS n ntregime are efect toxic constituind endotoxina bacteriilor Gram negative. Intre peretele celular i membrana citoplasmatic a bacteriilor Gram negative se gsete un spaiu periplasmatic, care conine proteine de legare cu rol n chimiotaxie i numeroase enzime (fosfataza alcalin, enzime hidrolitice, deoxiribonucleaze etc.) cu rol n pregtirea substanelor care au traversat peretele pentru trecerea lor prin membrana citoplasmatic. La bacteriile acidorezistente, structurile speciale sunt foarte bogate n complexe formate din acid micolic i ceruri, fapt care explic rezistena acestora la decolorarea cu acizi (coloraia Ziehl Neelsen).

A
24

Fig. 7 Structura peretelui bacterian: A -la bacteriile Gram pozitive; Bla bacteriile Gram negative (www ArabsLAB.com) Peretele celulelor bacteriene are o semnificaie biologic multipl : - prin rigiditatea sa, asigur meninerea formei celulelor bacteriene; - ndeplinete rol protector fa de factorii nocivi de mediu, n special fa de ocul osmotic, avnd n vedere c mediile de via ale bacteriilor sunt hipotonice n raport cu coninutul celulei bacteriene; - prin porii si, mediaz schimbul de substane ntre celula bacterian i mediu; - particip la procesul de cretere i diviziune celular urmnd membrana citoplasmatic n formarea septurilor transversale, care separ celula-mam n cele dou celule-fiice; - conine receptori pentru bacteriofagi i bacteriocine; - conine enzime autolitice care se activeaz n momentul sporulrii elibernd sporul prin liza sporangiului i n momentul germinrii determinnd liza nveliurilor sporale. Orice factor muralitic, care altereaz sau inhib sinteza peptidoglicanului (lizozimul, antibioticele de tip penicilinic, carenele nutritive etc.) determin, att ,,in vitro ct i ,,in vivo, apariia unor bacterii cu morfologie modificat, cunoscute sub denumirile de protoplati - forme bacteriene complet lipsite de perete provenite din bacterii Gram pozitive i sferoplati - forme rezultate din bacterii Gram negative, care mai pstreaz urme de perete. Dac agentul muralitic dispare din mediu, sferoplatii au capacitatea de a iniia sinteza i ansamblarea peptidoglicanului revenind la forma iniial. Aceste bacterii lipsite de perete celular sau cu peretele deficient sunt distruse prin deshidratare (uscare osmotic) n mediile hipertone i prin plasmoptiz (spargerea celulei prin hiperhidratare) n cele hipotone, deoarece membrana celular neprotejat de perete este incapabil s reziste presiunii osmotice. Capsula Capsula este o formaiune extraparietal, prezent numai la anumite specii bacteriene i numai n anumite condiii de mediu. Speciile patogene capsuleaz de regul n organism dar i pe mediile de cultur care conin un lichid organic (ser sanguin, plasm, lichid ascitic). Bacteriile capsulogene care intereseaz patologia veterinar sunt: Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae , Clostridium perfringens, Pasteurella multocida.

25

Capsulele acestor specii se deosebesc prin structura chimic, gradul de aderen la peretele cellular i grosime (fig. 8). .

Fig.8 Tipurile de structuri capsulare la bacterii: 1.microcapsula; 2.capsula propriu-zis; 3.stratul mucos; 4.zoogleea.P.C. - perete celular; M.C. microcapsul; mc membran citoplasmatic. Din punct de vedere chimic, capsula este format din 98% ap, restul fiind reprezentat de polizaharide sau polipeptide (n funcie de specie), care constituie antigene bacteriene cu o mare specificitate, notate cu litera ,,K". Funcia biologic a capsulei este de a proteja celula bacterian fa de aciunea unor factori nocivi. n organism, capsula are rol n evitarea procesului de fagocitoz, constituind un important factor de patogenitate. nafara organismului, prin coninutul crescut de ap capsula protejeaz bacteriile de efectele deshidratrii. CONINUTUL Coninutul celulei bacteriene se compune din citoplasm i genom bacterian. Citoplasma Citoplasma celulei bacteriene are consisten de gel, nu prezint cureni citoplasmatici i n consecin, nici deplasri evidente ale elementelor componente. Citoplasma reprezint sediul materialului genetic i al unor structuri cu caracter de granule, incluzii i vacuole. Spre deosebire de celulele eucariote, in citoplasma celulelor bacteriene lipsesc mitocondriile, aparatul Golgi i reticulul endoplasmatic propriu-zis. Ribozomii sau granulele lui Palade reprezint elementele de baz ale citoplasmei, n care apar ca mici granule relativ sferice, cu un diametru de 10-20 nanometri, numrul lor fiind de ordinul zecilor de mii. Din punct de vedere chimic, ribozomii sunt alctuii din acid ribonucleic (65%) i proteine (30-35%). Sub raport funcional, ribozomii constituie sediul sintezei proteinelor structurale i enzimatice. Incluziile sunt structuri inerte, prezente inconstant n citoplasma bacteriilor. Ele reprezint materiale de rezerv care se acumuleaz n celul
26

direct proporional cu vrsta i coninutul mediului n substane nutritive. Din punct de vedere chimic, incluziile sunt formate din polimeri organici (amidon, glicogen, acid poli--hidroxibutiric), cristale de substane anorganice (sulf, carbonat de calciu) i polimeri anorganici. Cromatoforii, prezeni la bacteriile fotosintetizante, sunt organite specializate n procesele de biosintez prin mecanisme analoage fotosintezei plantelor. Vacuolele sunt variabile ca mrime (0,3 0,5 m) i numr (6-20/celul), fiind mai frecvent ntlnite la celulele tinere. Ele pot conine lichide cu rol n reglarea presiunii osmotice, sau gaze. Pigmenii sunt substane colorate prezente n citoplasma bacteriilor cromogene. Speciile patogene pentru om i animale, productoare de pigmeni sunt: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus equi, Mycobacterium tuberculosis.. n funcie de localizarea pigmenilor, bacteriile pot fi: - cromofore (pigmentul este present n citoplasm); - paracromofore (pigmentul este legat de faa intern a peretelui cellular), de exemplu, stafilococii; - cromopare (pigmentul este eliberat din celul n mediul extern) de exemplu, bacteriile din genul Pseudomonas. Semnificaia biologic a pigmenilor bacterieni difer n funcie de natura chimic a pigmentului, fr a fi complet elucidat. Ei pot avea rol fotosintetic (clorofilele), protector (pigmenii carotenoizi protejeaz bacteriile fa de radiaiile ultraviolete), funcie vitaminic, antibiotic sau enzimatic (vitamina K, respectiv, piocianina, flavoproteinele). In citoplasma celulelor bacteriene se gsete cea mai important parte din echipamentul enzimatic rspunztor de metabolismul celulei, precum i diferite tipuri de ARN (mesager, ribozomal i solubil). Citoplasma constituie sediul metabolismului bacterian unde se desfoar procesele de asimilaie i dezasimilaie, precum i alte funcii vitale ale celulei bacteriene cum sunt reproducerea i sporogeneza. Materialul genetic Materialul genetic al bacteriilor este constituit din nucleu i din plasmide . Nucleul este format dintr-un singur cromozom i nu este delimitat de o membran proprie. Pentru a marca aceste diferene fa de nucleul celulelor eucariote, termenul de ,,nucleu a fost nlocuit cu termenii de ,,nucleoid, ,,genom bacterian, ,,cromozom bacterian sau ,,nucleozom. Cromozomul este constituit dintr-o macromolecul de ADN bicatenar care conine 4 x 106 perechi de nucleotide i are o lungime de aproximativ 1 mm. Macromolecula de ADN se afl ns ntr-o stare condensat, prin pliere, spiralare i superspiralare astfel nct ocup doar 5-16% din volumul celulei. Pe lng ADN, cromozomul bacterian mai conine cantiti reduse de proteine, lipide i ARN.
27

Plasmidele sunt molecule mici de ADN dublu catenar, independente de cromozom, caracteristice pentru celula procariot. Att cromozomul ct i plasmidele au posibilitatea de autoreplicare. Replicarea plasmidelor are loc independent de cea a cromozomului. Funcia biologic a materialului genetic const n determinarea caracterelor care definesc fiecare specie bacterian i transmiterea lor ereditar ORGANITELE CELULARE Organitele celulare (cilii sau flagelii, pilii i fimbriile) sunt formaiuni extraparietale facultative, prezente numai la unele specii bacteriene, cu rol n procesele de adaptare la mediu. Cilii (flagelii ) Cilii sunt organite de form cilindric, cu diametrul de 12-25 nanometri i lungimea de 25-30 micrometri, cu rol n n micare, bacteriile ciliate fiind mobile. Cel mai adesea nu pot exista simultan cilii i capsula. ntre speciile bacteriene ciliate exist diferene sub aspectul numrului i al modului de dispunere a cililor pe suprafaa celulei bacteriene, distingndu-se urmtoarele categorii de bacterii: atricha (neciliate), monotricha (un singur cil dispus polar), lofotricha (un smoc de cili la unul din poli) amfitricha (unul sau mai muli cili la ambii poli), i peritricha (numeroi cili pe toat suprafaa celulei) fig. 9.

Fig. 9. Numrul i modalitile de dispunere a cililor pe suprafaa celulei bacteriene: 1- atricha; 2- monotricha; 3- lofotricha; 4- amfiticha; 5peritricha. Bacteriile realizeaz o micare de rostogolire cnd cilii se rotesc n sensul acelor de ceasornic i o deplasare n linie dreapt cnd acetia se rotesc n sens antiorar. n determinarea direciei de deplasare intervin mecanisme de tip chimiotactic; substanele utile metabolismului bacterian (glucidele, aminoacizii, ionii de calciu i de magneziu, oxigenul pentru bacteriile aerobe etc.) sunt atractante, exercitnd un chimiotactism pozitiv asupra bacteriilor ciliate iar cele

28

nocive (alcoolii, ionii de hidrogen, ionii hidroxil, metalele grele etc.) au un efect repelant (de respingere) printr-un chimiotactism negativ. Din punct de vedere chimic, cilii sunt compui dintr-o protein contractil numit flagelin. Asemntor substanelor capsulare, flagelinele bacteriene reprezint antigeni cu mare specificitate, notai cu litera ;;F". Pilii (fimbriile Pilii sunt apendici filamentoi mult mai subiri i mai scuri dect cilii dar mult mai numeroi, aezai peritrich pe suprafaa bacteriilor i vizibili numai la microscopul electronic. Denumirile prin care sunt desemnate aceste structuri sugereaz caracteristicile lor morfologice: fimbrii (lat. fimbria = franjuri), pili (lat. pilus = pr). In funcie de unele caractere morfologice, de numr i de funcia biologic pe care o ndeplinesc, se deosebesc 6 tipuri de pili, notate cu cifre romane de la I la V i cu litera F (pilul sexual sau donor). In ultimii ani exist tendina de a departaja, din punct de vedere semantic, cei doi termeni - ,,fimbrii i ,,pili - n sensul utilizrii primului pentru desemnarea tipurilor I-V i a celui de-al doilea, numai pentru pilii de sex. Fimbriile sunt formaiuni tubulare compacte, fr canal, cu ajutorul crora bacteriile ader la suprafaa epiteliilor i a altor substraturi, fiind considerate factori de patogenitate. Pilii de tip F, denumii i pili sexuali, sunt structuri tubulare strbtute de canal axial. Ei sunt codificai de o plasmid numit factorul ,,F (de fertilitate sau de sex), care confer celulei purttoare proprietatea de donor de material genetic sau celul-mascul (F+). Rolul pililor ,,F este analog organului copulator, deoarece prin lumenul lor are loc transferul de ADN de la o celul bacterian F+ la una F- n cadrul procesului de conjugare - o form primitiv de sexualitate, singura posibil la bacterii. 2.2.2. FIZIOLOGIA BACTERIILOR 2.2.2.1. COMPOZIIA CHIMIC A CELULEI BACTERIENE Compoziia chimic elementar a bacteriilor, sub aspectul coninutului n elemente biogene, nu difer de a celorlalte organisme vii. Compoziia molecular se difereniaz ns de cea a organismelor vegetale i animale prin prezena unor constitueni moleculari specifici bacteriilor. O celul bacterian conine aproximativ 3000-6000 tipuri de molecule diferite, dintre care aproximativ jumtate aparin compuilor anorganici cu mas molecular mic (apa i srurile minerale), iar cealalt jumtate, compuilor organici cu diverse grade de complexitate structural (glucide, lipide, acizi nucleici, proteine).
29

Apa reprezint 75-80% din masa celular. Cea mai mare cantitate se gsete liber n citoplasm i doar o mic parte sub form legat (n structura constituienilor celulari) Ea provine din mediul extern, de unde bacteriile o preiau prin difuzie simpl i ntr-o msur mai mic din unele procese metabolice, fiind rezultatul unor reacii oxidative ale compuilor ce conin hidrogen n molecul. Rolul apei: - constituie mediul de dispersie pentru celelalte componente celulare; - particip la procesele metabolice; - n prezena apei libere proteinele structurale, dar mai ales cele enzimatice se degradeaz termic foarte uor, asfel nct bacteriile n stare vegetativ sunt omorte la 55-60C n 15-20 minute. Sporii, deoarece conin foarte puin ap liber, rezist la temperaturi mult mai ridicate (100-120C temperatur umed). Datorit efectului ei bactericid, cldura utilizat prin diverse procedee (autoclavare, tindalizare, etuvare .a.) constituie principalul factor de sterilizare a materialelor din laboratoarele de diagnostic microbiologic. Srurile minerale reprezint 3 30% din greutatea bacteriilor uscate. Elementele care intr n compoziia lor sunt: P, K, Na, Cl, S, O, H, Fe i n proporii mai reduse, Mg, Cu, i Zn. Srurile minerale ndeplinesc urmtoarele funcii biologice: asigur reglarea presiunii osmotice la nivelul membranei citoplasmatice; realizeaz sistemul tampon adecvat meninerii pH-ului optim al mediului celular; activeaz unele sisteme enzimatice, rol pe care l ndeplinesc mai ales ionii de Cu i de Mg; intr n structura unui important numr de constituieni celulari (rol plastic). Proteinele reprezint 40-80% din greutatea uscat a celulei bacteriene i se gsesc sub form simpl, sub form de complexe glucido-lipido-polipeptidice i sub form de heteroproteine (mucoproteine, cromoproteine, nucleoproteine). n structura lor apar anumii aminoacizi existeni doar la bacterii (de ex., acizii teichoici, acidul micolic, acidul diaminopimelic, acidul glutamic dextrogir). Din punct de vedere al rolului pe care l ndeplinesc, proteinele bacteriene pot fi grupate n : proteine constitutive, care fac parte din structura diferitelor componente celulare, i proteine enzimatice, care constituie biocatalizatorii ntregii activiti metabolice a celulei bacteriene. Din aproximativ 3000 de tipuri de proteine ale unei celule bacteriene, 2000 sunt enzime. Numrul mare de enzime confer bacteriilor o intens activitate metabolic. Fiecare specie bacterian dispune de un echipament enzimatic caracteristic, care poate fi pus n eviden utiliznd substraturi adecvate enzimelor i diferii reactivi.
30

Examenul caracterelor metabolice ale bacteriilor constituie un criteriu de baz n identificarea tulpinilor bacteriene (criteriu taxonomic). Clasificarea enzimelor 1. Dup locul de aciune: endoenzime (enzime intracelulare care catalizeaz reaciile de biosintez); exoenzime (enzime eliminate de bacterii n mediul exterior, unde acionez asupra substanelor cu molecul complex transformndu-le n nutrieni, sau confer bacteriilor virulen). 2. Dup modul de aciune asupra substratului nutritiv: hidrolaze (proteinaze, RN-aze, DN-aze, lipaze, carbohidraze etc.); transferaze; oxidoreductaze (desmolaze); izomeraze (racemaze). 3. Dup modul de apariie: enzime constitutive (elaborate permanent); enzime inductibile sau adaptative (sintetizate numai n prezena nutrienilor asupra crora acioneaz); enzime mutative (absente la o specie, ele apar consecutiv unei mutaii iar sinteza lor are loc numai la mutanta respectiv). Glucidele totalizeaz 14 25% din greutatea celulelor bacteriene uscate, proporia lor variind n funcie de specia bacterian, vrsta culturii i compoziia chimic a substratului nutritiv. Ele sunt reprezentate de aproximativ 200 tipuri de molecule, incluznd mono-, di-, tri- i polizaharide. Spre deosebire de celula vegetal, n structura bacteriilor nu intr celuloza. Glucidele ndeplinesc, dup caz, rol plastic, energetic sau de material de rezerv. Lipidele, prezente n celula bacterian n proporie de 1 20 % din greutatea uscat a bacteriilor, pot fi din punct de vedere chimic, gliceride, fosfatide, steride i ceruri. Fosfatidele i cerurile sunt prezente cu precdere la bacteriile acido-alcalo-alcoolo-rezistente din genul Mycobacterium. Cu excepia micoplasmelor, bacteriile nu conin colesterol. Alturi de glucide, lipidele constituie rezervele nutritive ale celulei bacteriene cu un potenial energetic crescut. Acizii nucleici. Spre deosebire de virusuri, care conin un singur tip de acid nucleic, n celula bacterian sunt prezeni ambii acizi nucleici. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) reprezint aproximativ 1/5 din coninutul celulei, fiind constituientul nucleoidului, respectiv al cromozomului bacterian i al plasmidelor (fragmente de material genetic extracromozomal). Acidul ribonucleic (ARN), se gsete n citoplasm sub cele trei forme diferite sub aspectul mrimii moleculei i al funciei biologice pe care o ndeplinesc n mecanismul sintezei proteinelor: ARN mesager, ARN de transport sau solubil i ARN ribozomal. ARN-ul total constituie 10 20 % din greutatea uscat a celulei.

31

Rolul biologic al acizilor nucleici este acelai la toate organismele vii. El a fost menionat la structura celulei bacteriene i urmeaz a fi detaliat n capitolul de genetic microbian. 2.2.2.2. NUTRIIA LA BACTERII Microorganismele, ca i celelalte organisme vii, sunt caracterizate printr-o activitate fiziologic nentrerupt, mai mult sau mai puin intens, n cursul creia cresc, se divid ,i modific structura, compoziia chimic i poziia n mediu, etc. Exercitarea acestor activiti presupune prezena n mediile lor de via a unor substane nutritive utilizabile n sinteza constituienilor celulari (surse plastice) i a unor surse de energie . Exigene i tipuri nutritive la bacterii Posibilitile bacteriilor de a folosi diverse surse plastice i energetice sunt extrem de variate. Considerate n ansamblu, microorganismele sunt cele mai omnivore organisme cunoscute, deoarece i realizeaz metabolismul folosind cele mai diverse surse de substane nutritive: de la N molecular, CO2 i S, pn la substanele organice complexe. In raport cu sursa de energia pe care o utilizeaz n procesul de nutriie, bacteriile se ncadreaz n dou tipuri principale : - tipul fototrof care utilizeaz energia luminoas transformnd-o n energie de legare chimic cu ajutorul unor pigmeni asemntori clorofilei; - tipul chimiotrof, lipsit de pigmeni fotosintetizani, pentru care unica surs de energie o reprezint reaciile biochimice de oxidoreducere. Pe baza capacitii de a utiliza substanele anorganice i organice ca surse de material de sintez i energie se difereniaz : - tipul litotrof ( lith = piatr ) sau autotrof ( n sensul de independent , liber ) cruia i aparin bacteriile capabile s-i sintetizeze toi constituenii celulari pornind de la surse simple anorganice de C i de N ca : CO2 , NH3, NO2 ,NO3 ,etc.; - tipul organotrof sau heterotrof n care se ncadreaz bacteriile dependente de materia organic, care nu se pot dezvolta dect n prezena substanelor organice ca surse de energie , C i N . Deci, n timp ce autotrofele prin sintezele lor genereaz substane organice, heterotrofele le descompun. Ansamblnd cele dou criterii, bacteriile fototrofe pot fi mprite n fotoautotrofe ( fotolitotrofe ) i fotoorganotrofe ( fotoheterotrofe ), iar bacteriile chimiotrofe se pot clasifica , de asemenea, n chimioautotrofe ( chimiolitotrofe ) i chimioorganotrofe ( chimioheterotrofe Deoarece bacteriile autotrofe nu intereseaz bacteriologia medical i medical-veterinar, n
32

continuare vor fi menionate numai sursele de substane organice pentru cele mai importante elemente biogene necesare bacteriilor chimioheterotrofe, categorie n care se ncadreaz majoritatea bacteriilor patogene. Principala surs de carbon pentru aceste bacterii o reprezint glucidele i polialcoolii. Sursele de azot organic sunt reprezentate n primul rnd de aminoacizi, urmai n cazul a numeroase specii, de alte substane cu azot diferite ca grad de complexitate: uree, peptone, proteine . Unele bacterii patogene pot folosi i surse de azot anorganic, cum este amoniacul rezultat din hidroliza ureei sau din reducerea nitrailor n nitrii i a nitriilor n amoniac. Inafar de carbon i azot, toate bacteriile au nevoie de macroelemente (P, S, O, H, K, Mg, Fe, Ca,Mn etc.) i microelemente ( Cu, Zn, Mo etc.), acestea din urm fiind indispensabile activitii catalitice a unor enzime. 2.2.2.3 METABOLISMUL BACTERIAN Prin analogie cu celula vegetal i animal, metabolismul bacterian implic totalitatea reaciilor biochimice catalizate enzimatic care permit bacteriilor s obin din nutrieni, att compuii necesari pentru sinteza constituienilor celulari, ct i energia necesar pentru aceste sinteze i pentru alte activiti care necesit consum de energie. Activitatea metabolic a bacteriilor poate fi difereniat n metabolism energetic care include catabolismul i respiraia i metabolism de sintez sau anabolismul. 2.2.2.3.1 Catabolismul Substraturile exogene care pot constitui surse energetice i plastice pentru bacteriile heterotrofe sunt reprezentate n majoritatea cazurilor de compui organici cu structur complex : proteine, glucide, lipide. Eliberarea energiei prin procesele de catabolism se realizeaz treptat, n trei faze distincte. Faza I . Macromoleculele sunt dezansamblate n unitile lor de construcie: proteinele n aminoacizi, polizaharidele n monozaharide, iar lipidele n glicerol i acizi grai. In aceast prim faz se elibereaz de obicei mai puin de 1% din energia total a macromoleculelor care se pierde n bun parte sub form de cldur. Faza II. Aminoacizii, monozaharidele i acizii grai rezultai n prima etap sufer o degradare incomplet cu formarea de produi intermediari - amoniac, acid piruvic, acizi grai inferiori, etc.- bioxid de carbon i ap. Energia eliberat reprezint aproximativ o treime din energia total a substraturilor iniiale. In aceast faz, hexozele pot fi metabolizate pe ci diferite - calea glicolizei, calea Entner-Doudoroff sau calea hexozomonofosfatului - dar produii finali nu sunt foarte diferii. In mod similar , aminoacizii pot fi
33

catabolizai pe ci diferite , dar, indiferent de calea utilizat , rezultatul const n formarea de acetil-Co A sau de intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici ( ciclul Krebs ) . Faza III In cursul acestei faze, produii intermediari sunt descompui n CO2 i H2O pe calea acizilor tricarboxilici, rezultnd, de regul, cantitatea maxim de energie. Nu toate substraturile ajung ns la aceast ultim faz. In multe cazuri, degradarea se oprete la produii intermediari care sunt deseori preluai sub form de precursori i introdui n filiera reaciilor anabolice sub aciunea enzimelor biosintetizante. Pentru produii finali rezultai din activitatea catabolic, celula bacterian dispune de multiple ci de utilizare, i anume : -hidrogenul rezultat din procesele de oxidare este introdus n circuitul respirator pentru reaciile de reducere cu cedare ctre ali acceptori. -oxigenul rezultat n urma reaciilor de reducere este valorificat n procesele de oxidare; -energia rezultat n diferite etape ale catabolismului este utilizat n procesele endergonice (consumatoare de energie) ale biosintezelor celulare. 2.2.2.3.2 Respiraia Bacteriile ,ca toate celelalte vieuitoare, respir, ceea ce n sensul obinuit al cuvntului nseamn c ele consum oxigen pentru a produce cu ajutorul lui reacii chimice exoterme eliberatoare de energie. Pasteur a observat cel dinti c unele specii bacteriene triesc i se nmulesc n absena oxigenului mai bine chiar dect n prezena lui, deci respir fr oxigen. Aceast constatare, pe lng altele, a dus la o lrgire a coninutului noiunii de respiraie, n sensul c se numete proces respirator orice reacie chimic eliberatoare de energie care se petrece ,,in vivo" n prezena sau n absena oxigenului. Bacteriile chimiotrofe i procur cea mai important parte a energiei prin procesul de respiraie celular, care const ntr-o succesiune de reacii de oxidoreducere biologic ce pot avea loc n aerobioz sau anaerobioz. Principala surs de energie o constituie glucidele, n special glucoza (fig. 10). Prin oxidoreducere biologic se nelege pierderea atomilor de H (e i + H ) din molecula unei substane chimice ( S ) care se oxideaz elibernd energie i transferul lor ctre o substan acceptoare ( A ), care se reduce, conform ecuaiei: SH2 + A< => S + AH2 + energie Respiraia la bacterii se rezum n esen, la preluarea hidrogenului rezultat din reaciile catabolice prin intermediul unor enzime numite dehidrogenaze i cedarea lui ctre un acceptor final care poate fi oxigenul sau alt substan. Dup natura acceptorului final de electroni de H , respiraia bacterian este de trei feluri:
34

- respiraia aerob (oxibiotic), un proces de oxidare complet a substraturilor cu ajutorul oxigenului molecular ca acceptor final de H i eliberarea unei cantiti mari de energie (de exemplu, glicoliza) ; - respiraia anaerob (anoxibiotic) n care acceptorul final de H poate fi orice substan anorganic, exceptnd oxigenul; - fermentaia, un proces de oxidare parial, care are loc n condiii de anaerobioz sau n prezena oxigenului dar fr intervenia lui i n care electronii din structura unei substane organice sunt transferai pentru a se forma ali compui organici. Energia este obinut, aadar, prin utilizarea compuilor organici att ca donatori ct i ca acceptori de electroni. Spre deosebire de respiraia aerob, n cursul fermentaiei se elibereaz o mic parte din energia coninut n substratul iniial, rezultnd numeroi produi de degradare parial, care difer n funcie de microorganismul care a produs fermentaia (fig.11).

Fig. 10 Glicoliza i fermentarea glucozei

35

Fig. 11 Produii de fermentaie a glucozei relizat de unele bacterii i levuri

Deoarece eliberarea brusc a energiei din substraturile oxidate - ntr-o singur treapt (aa cum arat reacia de mai sus) - ar fi duntoare pentru celul, transferul hidrogenului ctre acceptor se realizeaz n mai multe etape, cu participarea unui ntreg arsenal de enzime respiratorii (dehidrogenaze piridinice, flavinice, citocromi) .Ele se reduc i se oxideaz succesiv prin preluarea i respectiv cedarea hidrogenului de la una la alta ctre acceptorul final, constituind sistemul transportor de electroni sau catena de respiraie celular. O parte din energia eliberat prin oxido-reduceri este utilizat direct pentru unele funcii celulare (transportul activ al nutrienilor, biosinteze, mobilitate etc.) iar energia suplimentar (care depete nevoile de moment ale celulei bacteriene) este nmagazinat n macromolecule de adenozin-trifosfat (ATP) - compus macroergic care deriv din acidul adenozin-monofosforic (AMP) prin dou fosforilri oxidative consecutive, cuplate cu lanul respirator.

2.2.2.3.3 Anabolismul Anabolismul const n reacii enzimatice prin care se efectueaz sinteza constituienilor celulari, pornind de la produii intermediari ai catabolismului sau de substanele preluate din mediu.
36

Ca i procesele de catabolism, reaciile de biosintez se realizeaz tot n trei faze care se succed n sens invers: - producerea de subuniti care vor intra n componena macromoleculelor specifice fiecrui constituient celular; - activarea subunitilor cu ajutorul energiei eliberate prin descompunerea compuilor macroergici de tip ATP (adenozin-trifosfat) n care a fost stocat pe parcursul degradrii diferiilor compui ; - formarea de macromolecule prin polimerizarea sau condensarea subunitilor activate. Totui, cile catabolice i anabolice pentru un anumit substrat nu sunt complet reversibile. Reaciile anabolice au ca punct de plecare , de cele mai multe ori, compui intermediari foarte diferii de cei care rezult din catabolismul compusului respectiv iar enzimele implicate sunt parial diferite . De exemplu, catabolismul serinei duce la formarea de piruvat, n timp ce sinteza ei ncepe de la 3-fosfoglicerat; histidina este catabolizat la -cetoglutarat, iar sinteza ei este iniiat de la ribozo-5-fosfat; degradarea glicogenului la acid lactic este catalizat de 12 enzime dintre care numai 9 catalizeaz reacii reversibile .

2.2.2.4. CRESTEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR 2.2.2.4.1 Creterea bacteriilor Creterea se poate realiza uni- sau multidimensional, n funcie de locul i modalitatea de dispunere a substanei nou elaborate. Dup Lamanna (cit. de Zarnea, 1984), exist urmtoarele posibiliti teoretice de cretere a celulei bacteriene: - creterea la una din extremiti ; - cretera la ambele extremiti ; - creterea n vecintatea constituirii viitorului sept de diviziune ; -creterea prin intususcepiune (depunerea de substan nou diseminat i intercalat printre constituienii celulari preexisteni); - cretere prin depunerea materialului nou n zona periferic a celulei (limitrof nveliului). In cursul creterii celulei bacteriene, raportul suprafa / volum se micoreaz treptat datorit faptului c n timp ce suprafaa bacteriilor crete cu o raie ptratic, volumul lor se mrete cu o raie cubic. Ori, activitatea normal a bacteriilor este condiionat de existena unui raport optim ntre volumul celulei, care consum i suprafaa ei, prin care se face absorbia substanelor nutritive i eliminarea cataboliilor. In consecin , pe parcursul creterii, aportul
37

de substane nutritive din mediu satisface din ce n ce mai puin exigenele metabolice ale celulei iar echilibrul ei chimic se altereaz deoarece circulaia substanelor prin difuzie n ambele sensuri devine mai dificil. Din cauza acestor perturbri, atunci cnd disproporia dintre suprafa i volum atinge un anumit punct critic, raportul lor adecvat se restabilete prin diviziunea celulei. Astfel, diviziunea celular este prin ea nsi o form necesar de reglare a activitii celulei bacteriene (Buiuc i colab., 2002) 2.2.2.4.2. Multiplicarea bacteriilor Spre deosebire de organismele pluricelulare la care multiplicarea celulelor duce la mrirea taliei individului, la bacterii i la toate celelalte organisme unicelulare, ea are ca rezultat creterea numrului de indivizi i implicit a populaiei respective. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplic prin diviziune direct (diviziune simpl, sciziparitate) iar un numr redus de grupuri taxonomice se poate multiplica pe alte ci: prin corpi elementari, ramificare, nmugurire, spori. Multiplicarea prin diviziune direct const n scindarea unei celule bacteriene care a atins punctul critic de cretere n dou celule-fiice, cel mai frecvent identice. La bacteriile de form alungit (bacili, spirochete), diviziunea se face transversal dup un plan perpendicular pe marele ax al celulei, n centrul acesteia i rareori excentric. La coci, diviziunea se poate realiza dup unul, dou sau trei planuri perpendiculare succesive. In urma diviziunii, celulele rezultate se pot separa sau, la numeroase specii, pot s rmn unite una sau mai multe generaii realiznd grupri caracteristice cu valoare taxonomic. Diviziunea celulei bacteriene este precedat i iniiat de replicarea semiconservativ a ADN-ului cromozomial. Nucleoizii nou formai sunt segregai prin intervenia mezozomilor, astfel nct cele dou celule surori vor fi dotate cu o copie a genomului celulei parentale Multiplicarea prin corpi elementari a fost descris la chlamidii, la care, pe lng diviziunea direct exist posibilitatea desfurrii unui ciclu vital. Punctul de plecare al acestui ciclu este reprezentat de corpii elementari-structuri corpusculare mici (0,20,5micrometri), electronoopace. In celula gazd, fiecare corp elementar crete transformndu-se n corp iniial sau reticulat (0,8 1,5 micrometri), care se multiplic prin diviziune direct. Celulele fiice rezultate se vor reorganiza transformndu-se n corpi elementari. Multiplicarea prin ramificare, nmugurire i spori - proprie ciupercilor microscopice (micei filamentoi i levuri) este ntlnit doar la actinomicete i unele bacterii fotosintetizante. 2.2.2.4.2.1 Dinamica multiplicrii bacteriilor

38

Deoarece examinarea direct a bacteriilor n diferite medii naturale este foarte dificil, se cunosc puine date referitoare la multiplicarea populaiilor bacteriene n natur (Zarnea, 1994). Cultivarea bacteriilor n laborator a permis ns un studiu detaliat al dinamicii procesului de multiplicare n condiii experimentale i al relaiilor dintre multiplicare i factorii de mediu. S-a constatat astfel c o cultur bacterian prezint n cursul existenei sale patru faze, distincte prin viteza de multiplicare a germenilor i prin numrul de celule vii pe unitatea de volum. Aceste faze sunt: faza iniial de adaptare ,de laten sau de lag1, faza de multiplicare exponenial sau logaritmic, faza staionar i faza de declin. Multiplicarea n mediile lichide. Faza de laten este cuprins ntre momentul introducerii celulelor bacteriene n mediu, prin nsmnare sau transplantare i momentul cnd ele ncep s se multiplice (n medie, 2 ore), perioad n care cultura nu este vizibil macroscopic. Faza de multiplicare exponenial sau logaritmic se caracterizeaz prin multiplicarea celulelor bacteriene, la debut cu o vitez progresiv mrit, apoi ntr-un ritm constant i caracteristic pentru fiecare specie bacterian. La majoritatea bacteriilor patogene, n condiii optime , diviziunile se succed la intervale de 20-30 de minute, timp care reprezint vrsta unei generaii i care este urmat de dublarea populaiei bacteriene. Durata fazei de multiplicare logaritmic este n medie de 6-24 de ore Faza staionar urmeaz unei scurte perioade (aproximativ 2 ore) n care multiplicarea nu se mai produce n progresie geometric ci ntr-un ritm care scade progresiv. Incetinirea multiplicrii este determinat de modificarea mediului de cultur (scderea concentraiei nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici n concentraii inhibitorii, reducerea coninutului n oxigen, etc.), dar mai ales de realizarea unei concentraii maxime de celule bacteriene pe unitatea de volum (3 107 - 3 109 pe ml). O dovad a faptului c principala cauz este o problem de spaiu, o constituie multiplicarea de nlocuire care caracterizeaz aceast perioad, n care rata de cretere a populaiei bacteriene este nul. Practic, diviziunile continu numai n limita disponibilitilor de spaiu create prin moartea unor celule. Aceast faz dureaz de la cteva ore pn la 7-8 zile, n funcie de specie. Faza de declin se caracterizeaz prin absena diviziunilor i moartea logaritmic a celulelor bacteriene pn la sterilizarea mediului. Cauzele care duc la moartea bacteriilor sunt multiple i sunt legate n special de epuizarea substane nutritive, diminuarea rezervelor respiratorii i aciunea toxic exercitat de cataboliii acumulai n mediu. Uneori un numr mic de bacterii poate supravieui cteva sptmni sau luni pe seama substanelor nutritive eliberate prin autoliza celulelor moarte.
1

(engl. to lag =a ntrzia, a rmne n urm) 39

Fenomenul este cunoscut sub denumirile de reluarea creterii, cretere criptic sau canibalism. S-a estimat c pentru un supravieuitor sunt necesare substanele provenite de la aproximativ 50 de celule moarte (Grecianu A., 1986 ). In faza de declin, bacteriile prezint un polimorfism accentuat determinat de prezena celulelor mbtrnite, cu forme atipice (celule sferice, mici sau gigante, deformate, filamentoase, ramificate, etc.) i cu afinitate tinctorial sczut. Evitarea erorilor generate de aceste modificri reclam efectuarea examenelor pentru ncadrarea taxonomic, testarea patogenitii, testarea sensibilitii bacteriilor .a., numai pe culturi n faza exponenial. Multiplicarea bacteriilor pe mediile solide. Particularitile multiplicrii pe mediile solide se datoreaz n primul rnd absenei micrilor browniene care asigur dispersarea bacteriilor n masa mediilor lichide i accesul nediscriminatoriu al celulelor la resursele nutritive. Prin urmare, att pe suprafaa ct i n profunzimea mediilor solide, n urma multiplicrii rezult aglomerri de milioane de bacterii care, n funcie de abundena inoculului i activitatea aparatului ciliar, pot mbrca macroscopic dou forme: colonia izolat i gazonul bacterian. Colonia reprezint o mas compact de celule rezultate, de regul, din multiplicarea unei singure celule bacteriene. Dup declanarea fazei logaritmice, diviziunile se distaneaz treptat pe msur ce colonia crete, deoarece ntre celulele bacteriene care o compun se creeaz diferene privind posibilitile de acces la substanele nutritive din mediu sau la oxigen (n cazul speciilor aerobe) n funcie de poziia lor: limitrof mediului sau n centrul coloniei. Celulele de la periferia coloniilor, deoarece beneficiaz de un aport optim de oxigen i de nutrieni, se multiplic activ n timp ce bacteriile din centrul coloniei pot fi moarte. Dezvoltarea unei colonii bacteriene este condiionat nu numai de interaciunile celulelor individuale ci i de influena coloniilor vecine; cu ct coloniile sunt mai numeroase i mai dese, cu att sunt mai mici, din cauz c se jeneaz reciproc prin eliminarea de metabolii toxici i prin diminuarea concentraiei nutrienilor. Gazonul reprezint cultura care rezult prin confluarea coloniilor n cazul unui inocul abundent, sau prin invazia mediului de ctre bacteriile ciliate peritrich,- fenomen numit roire sau crare. 2.3. MORFOLOGIA I BIOLOGIA SPORULUI BACTERIAN Sporul bacterian este o form de rezisten a unor specii bacteriene n condiii nefavorabile pentru celula vegetativ.

40

Procesul de formare a sporului are loc n interiorul celulei vegetative (endospor) i poart denumirea de sporogenez. In condiii de mediu optime are loc germinarea sporului, din care va rezulta o nou celul vegetativ. Faptul c ntr-o celul vegetativ se formeaz un singur spor, iar prin germinarea acestuia rezult o singur celul vegetativ, demonstreaz c sporogeneza la bacterii nu reprezint o cale de nmulire. Excepie fac actinomocetele, singurele bacterii la care, ca i la ciupercile microscopice, sporul reprezint o form de reproducere. Speciile sporogene patogene pentru om i animale aparin genurilor Bacillus i Clostridium. 2.3.1. Sporogeneza Sporogeneza este un proces de formare n interiorul celulei bacteriene a unei celule de tip nou, diferit din punct de vedere chimic, enzimatic i fiziologic. In celula vegetativ, asupra genelor care codific acest proces acioneaz inhibitor un represor sintetizat pe baza unor compui chimici preluai din mediu. Cnd substanele respective sunt epuizate i represorul nu mai este prezent n celul, genele sunt depresate i se exprim fenotipic prin declanarea procesului de sporogenez. Ali factori care influeneaz favorabil sporogeneza sunt: anumite limite de temperatur (la Bacillus anthracis ntre 18o C i 420 C), uscciunea, o anumit densitate a germenilor pe unitatea de volum etc. Sporogeneza evolueaz n trei faze succesive: stadiul preparator, formarea presporului i maturarea acestuia (fig. 13).

Fig. 13 Fazele sporogenezei: 1 celula bacterian n stadiul premergtor sporogenezei; 2 scindarea materialului genetic cromozomal; 3 formarea presporului prin constituirea septului de sporogenez; 4 formarea cortexului; 5,6 formarea celorlalte nveliuri sporale; 7 spor liber (dup Rducnescu H. i col.,1986).

41

Pregtirea celulei pentru procesul de sporogenez const n replicarea semiconservativ a AND-ului nuclear cu formarea a doi cromozomi distinci. Formarea presporului presupune, ntr-un stadiu incipient, separarea celor doi cromozomi printr-un sept transversal rezultat din invaginarea membranei citoplasmatice. Cele dou segmente celulare vor evolua pe ci diferite, unul devenind prespor iar cellalt, sporangiu. Sporangiul se autolizeaz elibernd sporul (ex. Bacillus cereus), sau rmne ataat de spor un timp nedefinit (ex. Clostridium tetani. Maturarea sporului se realizeaz prin urmtoarele transformri care se petrec n prespor: morfogeneza nveliurilor sporale; apariia unor compui chimici specifici, inexisteni n celula vegetativ; reducerea sensibil a activitii metabolice; dobndirea rezistenei la factorii fizici i chimici fa de care celula vegetativ este sensibil. 2.3.2. Morfologia sporului In frotiuri, sporii se pot gsi liberi, ataai de celula n care s-au format sau n interiorul acesteia, avnd form rotund, oval sau cilindric. In cazul cnd sporul rmne n interiorul sporangiului el poate fi aezat central, subterminal (n apropierea unui capt), terminal (la unul din capete) sau lateral (fig. 14). Diametrul sporului poate fi egal, mai mare sau mai mic n comparaie cu diametrul transversal al celulei bacteriene. In funcie de poziia sporului i raportul dintre cele dou diametre, bacteriile sporulate pot adopta diferite forme cu semnificaie taxonomic, i anume: bacil nedeformat (bacteridie) cu sporul situat central, caracteristic pentru bacteriile din genul Bacillus; bacil deformat de sporii care depesc diametrul transversal al celulei vegetative (clostridie), avnd aspect de: lmie, cnd sporul este situat central; sticl de lamp de petrol, cnd sporul este situat subterminal; rachet de tenis sau b de chibrit, cu spor sferic terminal; bacil asimetric cu sporul excentric, caracteristic speciei Bacillus laterosporus.

42

Fig.14 Raporturi posibile ntre spor i sporangiu: 1 spor liber; 2 spor central nedeformant; 3 6, diferii spori cu diametrul transversal mai mare dect al celulei (3 - central; 4 subterminal; 5 terminal; 6 lateral). 2.3.3. Ultrastructura sporului Prile componente ale sporului bacterian sunt redate n figura 15.

Fig.15 Anatomia sporului: 1 smburele sporului; 2 sporoplasma; 3 nucleoplasma; 4 ribozomi; 5 cortex; 6 - nveliuri sporale externe; 7 exosporium.
1. inima sporului numit i

smbure, ,, core sau protoplast sporal,

cuprinde: sporoplasma, corespunztoare citoplasmei, dar mai dens i cu aspect granular, i materialul nuclear sau nucleoplasma. 2. membrana intern (intina), similar membranei citoplasmatice, care rezult din creterea septului sporal n jurul protoplastului; 3. cortexul sporal constituit din peptidoglican modificat, similar peretelui bacterian; 4. nveliul extern (exina sau tunicile sporale), pluristratificat; 5. exosporium, un nveli suplimentar analog capsulei, prezent numai la sporii anumitor specii; 6. corpii parasporali, formaiuni cristaloide obseservate pe suprafaa sporilor unor specii bacteriene patogene pentru insecte (ex. Bacillus thuringiensis) Afinitile tinctoriale ale sporului difer de cele ale celulei vegetative, astfel nct prin metoda Gram se coloreaz palid numai conturul sporului, nu i coninutul. Pentru colorarea acestuia sunt necesare metode energice, care presupun colorarea la cald cu soluii concentrate, capabile s impregneze structurile dense ale sporului.

43

2.3.3.4. Particularitile sporului Particularitile biochimice Din punct de vedere biochimic, sporii se caracterizeaz printr-un coninut mai redus n ap liber, sruri de fosfor, sruri de potasiu i acizi nucleici. Ei conin ntr-o proporie mai mare dect celula vegetativ, cistein, ioni de calciu i ioni magneziu. In spor se gsesc i unii compui chimici abseni n celula vegetativ, cum sunt enzimele litice sporale i dipicolinatul de calciu. Particularitile fiziologice ale sporului constau n faptul c nu realizeaz schimburi de substane cu mediul ambiant, nu crete i nu se multiplic. Insuirile biologice Sporii bacterieni se caracterizeaz printr-o rezisten foarte mare la cldur, radiaii, uscciune i aciunea substanelor chimice, asigurnd supravieuirea speciei n natur o perioad ndelungat (zeci, sute, sau chiar mii de ani)2. De exemplu, sporii de Bacillus anthracis i pstreaz capacitatea de germinare timp de peste 70 de ani i rezist cteva ore la 120 0 C i cteva minute la 1800 C cldur uscat. Sporii altor specii i menin viabilitatea timp de o sptmn n fenol 5% i mai multe sptmni n alcool. Rezistena sporilor la factorii nocivi din mediul extern este asigurat de: - starea de deshidratare (ap 40-50%, fa de 80-90% la formele vegetative) i coninutul foarte sczut n ap liber; - apa ,,legat nu poate participa la reaciile chimice de denaturare i coagulare a proteinelor prin cldur, antiseptice i dezinfectante ; - prezena unei cantiti mari de dipicolinat de calciu, care are rolul de a modifica conformaia proteinelor enzimatice, conferindu-le astfel termostabilitate; - numrul mare de nveliuri protectoare. 2.3.3.5 Implicaiile sporogenezei n patologie i epidemiologie Bacteriile sporogene se caracterizeaz printr-o existen saprofit. Nia ecologic natural a speciilor sporulate patogene pentru om i animale este solul. De aici, n mod accidental ele pot ajunge pe diverse ci n organism provocnd mbolnviri cunoscute sub denumirea generic de infecii telurice (antraxul, tetanosul, crbunele emfizematos), sau n alimente unde elaboreaz toxine determind toxiinfecii alimentare (Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Clostridium perfringens).
S-au gasit spori viabili n roci care s-au format n era cuaternar i care au fost scoase de la adncimi de 37-45 m. Prezena unui numr de 5-10 spori pe gram de roc, exclude contaminarea ulterioar (Zarnea G., 1983) .
2

44

2.4 ACIUNEA FACTORILOR FIZICI I CHIMICI ASUPRA BACTERIILOR Ca i viaa organismelor superioare, viaa microorganismelor este dependent i permanent influenat de complexul factorilor fizici, chimici i biologici, care constituie mediul ambiant. Sub aciunea unor astfel de factori, care influeneaz nefavorabil reaciile metabolice implicate n procesele de cretere i multiplicare, apar dezechilibre care se pot traduce prin: moartea microorganismelor (efect microbicid); oprirea reversibil a multiplicrii (efect bacteriostatic, efect micostatic); transformarea n spori, n cazul bacteriilor sporogene; modificarea microorganismelor, fie prin inducerea mutaiilor, fie prin selectarea mutantelor rezistente. Determinarea unuia sau altuia dintre aceste efecte depinde de caracteristicile factorului activ (intensitatea sau concentraia lui), particularitile morfofiziologice ale microorganismului supus aciunii sale (structura nveliurilor celulare, sporogeneza, antibiorezistena etc.), natura mediului n care are loc aciunea (microorganismele nglobate n produse patologice, alimente, medii de cultur i alte substane organice complexe sunt mai rezistente dect cele aflate ntr-o suspensie apoas), timpul de aciune (pentru acelai efect, timpul de aciune este direct proporional cu intensitatea factorilor fizici i concentraia celor chimici) etc. Studiul aciunii factorilor de mediu asupra microorganismelor a avut drept rezultat elaborarea metodelor i a produselor utilizate pentru prevenirea i combaterea infeciilor: metodele de sterilizare, dezinfecia chimioterapia, antibioterapia. 2.4.1 Aciunea factorilor fizici asupra bacteriilor Temperatura Spre deosebire de temperaturile extreme, care sunt nocive, temperaturile moderate permit desfurarea normal a proceselor metabolice i prin aceasta, creterea i multiplicarea bacteriilor. Ansamblul acestor valori termice reprezint zona temperaturilor de dezvoltare. n aceast zon, cuprins ntre 5 i 70-800C, exist valori care corespund temperaturii optime, minime i maxime de dezvoltare pentru o specie dat. n funcie de preferinele termice, bacteriile, ca i celelalte microorganisme, au fost grupate n trei categorii: 1. psichrofile (criofile), nepatogene, se multiplic la temperaturi cuprinse ntre 0 i 35 C, avnd temperatura optim de dezvoltare de 15C;
45

mezofile, al cror interval termic de dezvoltare se situeaz ntre 10 i 45C, optimum termic fiind de 37C. n aceast categorie intr majoritatea bacteriilor patogene pentru om i animale. 3. termofile, nepatogene, au un preferendum termic cuprins ntre 50 i 800C. Ele sunt prezente n apele uzate calde provenite de la diferite industrii, furajele nsilozate, platformele de gunoi. Temperatura maxim la care s-ar putea desfura nc procesele metabolice a fost extins, pe baza unor date experimentale, pn la 1500C (bacterii hipertermofile). Temperaturile care depesc limitele maxime tolerabile ale bacteriilor (temperaturile supramaximale) sunt nocive determinnd moartea acestora. Efectul bactericid al cldurii factorul cel mai utilizat n sterilizare - este atribuit n primul rnd denaturrii proteinelor celulare, n special a enzimelor, care sunt termosensibile Cldura umed prezint un grad de penetraie mai ridicat i un efect nociv mai puternic. De aceea metodele de sterilizare prin cldur umed (fierberea, autoclavarea, tindalizarea, pasteurizarea, ultrapasteurizarea) necesit temperaturi mai mici sau un timp de expunere mai scurt comparativ cu procedeele de sterilizare prin cldur uscat (flambarea, nclzirea la rou, etuvarea, incinerarea). Temperaturile sczute sunt mai bine tolerate de microorganisme dect temperaturle supramaximale. La temperaturile frigiderului (+4, + 100 C), majoritatea bacteriilor trec ntr-o stare de laten, care poate s dureze luni i chiar ani de zile dac se evit uscarea. Stocarea n frigider reprezint i la ora actual metoda curent de conservare a culturilor bacteriene, alimentelor, medicamentelor i a altor produse biologice. Procesul de ngheare lent, la temperaturi puin sub 00 C, are un puternic efect bactericid determinat de deshidratare, concentrarea electroliilor n celul (,,moarte prin sare ) i ruperea nveliurilor celulei bacteriene sub aciunea cristalelor de ghia intra- i extracelulare. ngheul i dezgheul repetat reprezint o metod de dezintegrare a bacteriilor pentru extracia coninutului celular. La temperaturi mult mai sczute (- 300 C, - 400 C), efectul bactericid este practic anulat, deoarece nghearea brusc mpiedic cristalizarea apei, care trece ntr-o stare amorf, vitroas (Zarnea G., 1970; Duca Eugenia, 1974). Decongelate brusc pn la temperaturile optime de multiplicare i introduse n medii favorabile, bacteriile i reiau metabolismul, creterea i multiplicarea. Congelarea brusc la -300,-800C asociat cu uscarea n vid constituie un procedeu de conservare a unor produse biologice (culturi bacteriene, extracte celulare, toxine, antibiotice etc.), numit liofilizare (gr. lio=lichid; filein=a atrage).
2.

Gradul de ionizare (pH-ul) n general, pH-ul optim pentru bacteriile patogene este neutru sau uor alcalin, cuprins ntre 7,2-7,4 - pH care corespunde cu gradul de ionizare al
46

esuturilor i umorilor organismului. Exist ns i excepii cum sunt de exemplu, vibrionul holeric adaptat la mediile bazice (pH optim=8,5-9) i specia Helicobacter pylori, creia i se atribuie responsabilitatea etiologic n ulcerul gastroduodenal la om, capabil s reziste la aciditatea gastric (pH=1,6-2,0). Ionii de H (mediile acide) sunt mai toxici dect ionii oxidrilici OH (mediile alcaline) Presiunea osmotic Presiunea osmotic a unei soluii este direct proproional cu concentraia total a ionilor i moleculelor prezente n soluie. n condiii normale, o soluie molar a unui ion oarecare are o presiune osmotic de 22,4 atmosfere. n general, presiunea osmotic din interiorul celulelor bacteriene este mai mare dect a mediilor de cultur uzuale, datorit faptului c citoplasma conine n stare solvit cantiti mari de substane minerale i organice. Ca urmare, apa din mediu tinde s ptrund n celul pentru egalizarea concentraiilor intra- i extracelulare a substanelor solvite, determinnd o stare de turgescen a acesteia, caracteristic de altfel tuturor celulelor vii. Dezvoltarea bacteriilor decurge normal atunci cnd mediul lor de via are o presiune osmotic aproximativ echivalent cu cea intracelular, deci n condiii de izotonie. Excepie fac bacteriile osmofile, care se dezvolt numai n medii cu presiune osmotic ridicat i bacteriile osmotolerante sau facultativ osmofile, care se pot dezvolta la presiuni osmotice variabile. Ele se numesc halofile atunci cnd se dezvolt n condiiile unei saliniti crescute (apa mrilor i a oceanelor, a lacurilor srate i a salinelor, n care concentraia de NaCl poate atinge 16 35 % ) i zaharofile cnd se dezvolt n prezena unei concentraii mari de zahr (50 70%). Dintre bacteriile patogene, doar stafilococii, vibrionii i listeriile sunt capabile s se dezvolte n medii hipersaline (Larpent J.P., 2000). Majoritatea bacteriilor - protejate de un perete celular suficient de rezistent (mai ales la Gram pozitive) suport relativ uor modificrile presiunii osmotice, dac abaterile de la izotonie survin lent. n cazul variaiilor mari i brute ale presiunii osmotice, bacteriile sufer dou tipuri de modificri: plasmoliza i plasmoptiza. Plasmoliza (uscarea osmotic, ratatinarea) se produce n mediile hipertone, deoarece apa din celul trece n mediul extracelular. n consecin, unele bacterii intr ntr-o faz de via latent, iar altele mor. Uscarea osmotic are aplicaii n conservarea alimentelor prin saramurare i zaharare. Prezena bacteriilor osmofile n aceste condiii nu determin ntotdeauna alterarea alimentelor, unii halofili avnd chiar o aciune util prin participarea la procesele de ,,maturare a unor alimente (brnzeturi, carne srat, murturi .a.). Plasmoptiza are loc n cazul suspendrii bacteriilor ntr-un mediu hipotonic (de exemplu, apa distilat). Din cauza ptrunderii apei din exterior, turgescena
47

celulei crete pn cnd presiunea intracelular, depind capacitatea de distensie a peretelui celular, determin ruperea nveliurilor i moartea bacteriei. Presiunea hidrostatic Rezistena bacteriilor la aciunea presiunilor nalte este variabil n funcie de habitatul lor natural i este favorizat de capacitatea de sporogenez; sporul este de dou ori mai rezistent dect forma vegetativ. n funcie de comportarea lor n raport cu valoarea presiunii hidrostatice, bacteriile pot fi (Zarnea G., 1994): a) barofobe, sensibile la presiuni care depesc 200 de atmosfere categorie n care se ncadreaz bacteriile din sol, apele puin adnci, zonele de suprafa a oceanelor i mrilor; b) barofile - bacterii care populeaz adncul mrilor (- 1500m) i sunt adaptate la presiuni de 400-500 atmosfere, n lipsa crora unele specii (barofilele absolute) nu se pot dezvolta; c) barotolerante, care prefer presiunea normal (1 atm.) dar suport i presiuni moderat ridicate; d) barodure sau abisale, izolate de pe fundul mrilor i din adncul oceanelor (5100 m), capabile s reziste la 1000 1400 atmosfere (ex. Pseudomonas bathycetes). Majoritatea bacteriilor sunt foarte sensibile la modificrile brute alternative ale presiunii, astfel nct compresarea i decompresarea poate constitui un procedeu de distrugere a celulelor bacteriene. Radiaiile Efectul radiaiilor solare asupra microorganismelor difer n funcie de lungimea de und a acestora. Coninutul energetic al radiaiilor cuprinse ntre 12 000 A0 i 2000 A0 poate provoca modificri fotochimice cu efect bactericid. O larg utilizare n practica decontaminrii o au radiaiile ultraviolete (UV) cu lungimea de und cuprins ntre 2540 2800 A0, care acioneaz asupra ADN ului bacterian, prin ruperea punilor de hidrogen intercatenare i nlocuirea lor cu legturi mai solide, de tip dimer timin-timin, blocnd astfel replicarea ADN-ului (Zarnea G.,1970; ogoe I.,2006). Efectul letal al UV se exercit i n mod indirect, prin aciunea fotochimic asupra mediului (formarea de ozon n aer i peroxizi n ape). O larg utilizare n decontaminarea aerului i a suprafeelor din laboratoare, boxe de lucru, sli de operaie etc., o au lmpile care produc radiaii UV n urma descrcrilor electrice ntre doi electrozi plasai n atmosfer de vapori de mercur. Radiaiile cu lungimi de und sub 2000 A0 au un coninut energetic att de ridicat nct moleculele situate pe traiectul lor sunt ionizate prin desprinderea electronilor, de unde i denumirea de radiaii ionizante dat radiaiilor X,
48

particulelor alfa, beta i gama i radiaiilor cosmice. Efectul ionizrii este mutagen sau letal, n funcie de capacitatea de penetrare a radiaiei. Iradierea cu radiaii ionizante emise de cobaltul radioactiv (Cobalt60) sau cu acceleratorul de particule este utilizat la scar industrial pentru a steriliza produse medicale (seringi de unic utilizare, sisteme de perfuzie, sonde etc.) i consumabile de laborator (plci Petri i anse de nsmnare din material plastic), care nu suport sterilizarea termic. Factorii mecanici Avnd dimensiuni mici i un perete rigid, bacteriile sunt n general rezistente la leziunile de ordin mecanic. Totui, particulele mici i dure, sub form de pudre fine, pot distruge peretele celular dac sunt agitate energic cu o suspensie bacterian. Ultrasunetele Ultrasunetele (vibraiile cu o frecven mai mare de 20 000 Hz) produc moartea bacteriilor prin ,,bombardare" cu bulele de gaz care se formeaz n apa extra- i intracelular, ca rezultat al agitaiei produse de vibraiile cu frecven nalt (fenomenul de cavitaie).. Aciunea bactericid a ultrasunetelor a gsit aplicaii n industria vaccinurilor pentru dezintegrarea celulelor bacteriene n scopul eliberrii antigenelor somatice, n separarea endoenzimelor bacteriene sau a altor constituieni chimici ai celulei bacteriene i n sterilizarea anumitor produse.

Factorii chimici n funcie de natura i concentraia lor, substanele chimice pot exercita asupra bacteriilor un efect favorabil, atunci cnd pot fi utilizate ca surse plastice i energetice, sau un efect nociv (bacteriostatic sau bactericid), prin producerea unor dezechilibre fizicochimice. De exemplu, n concentraie de 1% zaharoza reprezint o surs de carbon i energie, iar n concentraii mari (40%) se comport ca un agent bacteriostatic fa de majoritatea speciilor. Aciunea substanelor chimice difer nu numai n raport cu natura i concentraia unei substane date, ci i n funcie de particularitile fiziologice ale bacteriilor supuse aciunii ei. Mycobacterium tuberculosis, de exemplu, reclam pentru dezvoltare, prezena n mediul de cultur a glicerinei - substan nociv pentru restul speciilor bacteriene. Substanele cu efect antibacterian au o larg utilizare n aciunile de prevenire i combatere a bolilor infecioase prin decontaminare (dezinfectantele i antisepticele), precum i n terapia acestora (antibioticele i chimioterapicele de sintez). Substanele utilizate n decontaminare aciunea de ndeprtare, neutralizare sau distrugere a microorganismelor de pe suprafaa elementelor animate i neanimate - se numesc dezinfectante dac, din cauza efectelor
49

iritante sau toxice, pot fi aplicate numai pe suprafee inerte (duumele, jgheaburi, perei, instrumentar etc.) i antiseptice, dac toxicitatea mai redus permite aplicarea lor pe tegumente, mucoase sau plgi (Coman I., Brhal Helena-Maria, Florescu Rodica, 1997; Buiuc D., Negu M., 1999). Uneori, aceeai substan (de exemplu, cloramina) n soluii diluate este antiseptic, iar n soluii concentrate, dezinfectant. Agenii decontaminani i exercit aciunea nociv asupra microorganismelor pe diverse ci: modificarea permeabilitii peretelui celular i a membranei citoplasmatice (fenolul, spunurile, detergenii anionici i cationici); denaturarea proteinelor, determinnd inactivarea enzimelor i precipitatea sau coagularea proteinelor structurale (acizii, alcalii, alcoolii); interferena cu gruprile active ale enzimelor, blocnd sau modificnd activitatea enzimatic (formaldehida, srurile metalelor grele, permanganatul de K, peroxizii, clorul ) etc. Chimioterapicele sunt produse de sintez cu aciune toxic selectiv asupra microorganismelor, fiind lipsite de nocivitate pentru celula animal, fapt care permite utilizarea lor n terapia infeciilor. Principalele grupe de substane chimioterapice sunt: sulfamidele, nitrofuranul i derivaii acestuia, acidul paraaminosalicilic (PAS), hidrazida acidului nicotinic (HIN), etanbutolul, acidul nalidixic i derivaii si, etc. Majoritatea au efect bacteriostatic i acioneaz ca, inhibitori competitivi ai unor produi de metabolism eseniali pentru celula bacterian. Sulfamidele, de exemplu, acioneaz prin blocarea sintezei acidului folic - factor indispensabil pentru formarea acizilor nucleici, respectiv pentru creterea i multiplicarea bacteriilor. Datorit analogiei sterice cu acidul paraaminobenzoic (vitamina H), care este precursor n sinteza acidului folic, sulfamidele intr n competiie cu acesta, substituindu-l i formnd analogi nefuncionali ai acidului folic (fig.25). Bacteriile cu funciile de cretere blocate din cauza sulfamidelor, care acioneaz ca o antivitamin, sunt distruse de organism prin elementele naturale de aprare ale acestuia.

50

Fig.25 Mecanismul de aciune al sulfamidelor

NOIUNI DE MICOLOGIE GENERAL Ciupercile microscopice (micromicetele, fungii, mucegaiurile) reprezint un grup heterogen de microorganisme larg rspndite n natur. Se apreciaz c exist aproximativ 3000-4000 de genuri de micei cu peste 200000 de specii. Micromicetele au un tip de organizare eucariot, sunt constituite din ansambluri celulare (micelii, pseudomicelii) deseori specializate pe funcii i se multiplic printr-o mare diversitate de forme sexuate i asexuate. Pe baza nsuirilor morfologice i fiziologice, ciupercile microscopice au fost mprite n dou grupe mari: levurile (drojdiile) i ciupercile filamentoase (mucegaiurile). ntre aceste dou forme distincte se plaseaz
51

fungii dimorfi care, n raport de condiiile de mediu (organism, mediu de cultur, temperatur etc.), pot crete fie ca levuri, fie ca fungi filamentoi.
3.1

NCADRAREA TAXONOMIC I NOMENCLATURA CIUPERCILOR MICROSCOPICE

n prezent ciupercile microscopice sunt incluse ntr-un regn de sine stttor, regnul FUNGI cu dou ncrengturi: PSEUDOMYCOTA i EUMYCOTA. Principalele caractere discriminatorii pentru subdiviziunile taxonomice sunt structura miceliului (septat, neseptat), posibilitatea de reproducerea sexuat i caracteristicele formelor sexuate ncrengtura Pseudomycota cuprinde subncrengtura Mastigomycotina, care include micei lipsii de importan medical, cu excepia speciei Rhinosporidium seeberi (Nichita Ileana, 2007). Fungii de importan medical sunt plasai n ncrengtura Eumycota care se subdivide n patru subncrengturi: Zygomycotina, Ascomycotina, Bazidiomycotina, Deuteriomycotina . Nomenclatura ciupercilor microscopice este cea binar latin, conform cu normele Codului Internaional al Nomenclaturii Botanice (International Cod of Botanical Nomenclature ICBN).

3.2 MORFOLOGIA CIUPERCILOR MICROSCOPICE Unitatea funcional a micromicetelor este celula, cu o structur specific i o compoziie particular, care o individualizeaz n lumea vieuitoarelor microscopice. n marea lor majoritate, ciupercile microscopice dispun de urmtoarele structuri: - un perete extern rigid (la levuri, cu o structur mai dens spre exterior i mai lax n zonele superficiale), cu funcii protectoare, n structura cruia intr substane proteice, polizaharide (hemiceluloz, glucan, manan, chitin), acizi organici superiori; - membran citoplasmatic lipoproteic ce conine steroli (compui care la bacterii sunt prezeni numai la micoplasme); - citoplasm, n care se gsesc organite (mitocondrii, reticul endoplasmatic, aparat Golgi) i structuri granulare (ribozomi, substane de rezerv); - nucleu, delimitat de membran nuclear i alctuit din carioplasm, 2-4 cromozomi i nucleol. Levurile
52

Levurile au, de regul, o organizare unicelular asemntoare bacteriilor. Celulele levurice au form sferic sau oval i pot forma ansambluri celulare numite pseudomicelii (fig.16.).

Fig.16 Aspectul morfologic levurilor cu forme pseudomiceliene

al

53

Ciupercile filamentoase Ciupercile filamentoase reprezint grupul de fungi situai pe o treapt filogenetic superioar levurilor, deoarece la ele apare diferenierea ansamblurilor celulare pe principalele funcii vitale: de nutriie i de reproducere. Ele sunt constituite din filamente lungi i subiri numite hife, care formeaz n ansamblul lor un miceliu adevrat numit i tal. Miceliul majoritii ciupercilor filamentoase este format din dou pri distincte morfologic i fiziologic: aparatul vegetativ i cel reproductor. Aparatul vegetativ este constituit din hife ramificate care pot fi septate delimitnd celule cilindrice uninucleate, sau neseptate numite sifonoplati, alctuite dintr-o unic celul multinucleat (fig.17).

Fig.17 septat

Tipuri de micelii fungice: A- miceliu neseptat B- miceliu

Septurile prezint pori prin care citoplasma, uneori i nucleii trec dintr-o celul n alta, sub influena curenilor intracitoplasmatici. Ele confer hifelor un grad crescut de rezisten i rigiditate. Indiferent de tipul de miceliu (septat sau neseptat), numrul nucleilor este relativ constant pentru o anumit specie i pentru speciile nrudite. Sub aspectul raportului cu mediul pe care se dezvolt, la un miceliul se pot deosebi dou poriuni: - sistemul rizoidal constituit din hife fine, ramificate i bine implantate n mediu; - miceliul aerian format din hife care se detaeaz din sistemul rizoidal i care sunt mai puin ramificate i mai rezistente. Aparatul reproductor este constituit din hife aeriene specializate pe care se formeaz organele de nmulire numite n mod curent corpi fructificani, deoarece conin spori n interiorul sau pe suprafaa lor (endo-, respectiv ectospori).
54

Morfologia corpilor fructificani se caracterizeaz printr-o mare diversitate, constituind un important criteriu de difereniere a numeroaselor specii de fungi (criteriu taxonomic). 3.3 MODALITILE DE NMULIRE ALE CIUPERCILOR MICROSCOPICE Reproducerea micromicetelor se face pe cale vegetativ i prin spori A. Reproducerea vegetativ se poate realiza prin diviziune direct, ntlnit cu precdere la levuri i prin creterea n lungime urmat de ramificarea hifelor, caracteristic pentru ciupercile filamentose. B. Reproducerea prin spori este, de asemenea, de dou feluri: reproducere prin spori imperfeci i reproducere prin spori perfeci. B.1 Sporii imperfeci (mitotici, asexuai) iau natere prin transformarea n spor a unor celule constituiente ale miceliului sau pseudomiceliului i poart denumirea generic de talospori i printr-un proces de morfogenez n interiorul sau pe suprafaa corpilor fructificani. Din categoria talosporilor fac parte blastosporii, clamidosporii, artrosporii i aleuriile, iar sporii asexuai derivai din corpii fructificani sunt sporangiosporii i conidiosporii. Blastosporii iau natere printr-un proces de burjeonare sau nmugurire. ntlnit mai frecvent la levuri. Procesul const n formarea unui mugure", reprezentnd o celul-fiic, prin evaginarea peretelui celular al celulei-mam. Pe celula de origine, mugurii pot fi dispui polar, bipolar sau multilateral. Atunci cnd celulele-fiice nu se transform n spori separndu-se de celula-mam ci continu formarea de muguri adiionali, rezult, n cazul levurilor, pseudomicelii arborescente.

Clamidosporii se formeaz n interiorul celulei hifale (endospori) ntr-un mod asemntor sporilor bacterieni (fig.28). Ei au peretele ngroat i citoplasma condensat, fiind deosebit de rezisteni la cldur i uscciune. Clamidosporii sunt spori de rezisten programai genetic s asigure, prin structura lor, persistena speciei n condiii nefavorabile, ca i sporii bacterieni. Prin comparaie cu acetia, ceilali spori vegetativi i sporii sexuai (meiotici) sunt doar spori de nmulire deoarece nu rezist mult timp n mediul ambiant. Ei sunt programai genetic s germineze rapid i s regenereze aparatul micelian, asigurnd nmulirea ciupercilor microscopice n condiii favorabile de mediu. Artrosporii sau oidiile (Zarnea G.,1970) se formeaz la mucegaiurile septate prin fragmentarea n celulele componente a unor hife vegetative terminale (fig.18).
55

Fig. 18 Genul Geotrichum: segmentarea hifelor terminale pentru a forma artrospori (A) si modul de formare al clamidosporilor (C); B- artrospor pe cale de germinare Aleuriile sunt sporii unor ciuperci dermatofite ce se dezvolt pe filamentul micelian, de care rmn ataai; pot avea diferite mrimi (macroaleurii, microaleurii) i diverse moduri de dispunere (fig.19).

Fig.19 Corpi fructificanti la ciuperci dermatofite: 1.Tricophyton; 2Microsporum Sporangiosporii sunt caracteristici fungilor neseptai din genurile Mucor, Absidia i Rhizopus (fig.20). Ei se formeaz n interiorul unor corpi fructificani cu aspect globulos numii sporangi sau sporociti, rezultai prin dilatarea extremitii unor hife fertile (sporangiofori) i formarea unui perete transversal care realizeaz disjuncia ntre hif i sporange. Uneori, filamentul sporangiofor pe care se edific sporocistul poate prezenta o dilataie terminal numit columel n interiorul sporangelui au loc mitoze repetate, dup care nucleii-nou formai se nconjoar de o mas de citoplasm proprie prin formarea unui perete celular, transformndu-se n spori. Sporangiosporii pot fi de 2 feluri: - aplanospori, imobili, cu mai muli nuclei n citoplasm;

56

- zoospori sau planospori, uninucleai care prezint pe suprafaa un numr variabil de cili cu ajutorul crora se deplaseaz n mediile lichide. Multiplicrea prin zoospori se ntlnete la Saprolenia ferax, care are sediul n ap i poate parazita petii.

Fig.20 Rhizopus nigricans: A-miceliu reproducator: a-sporange imatur:b-columela,c- sporange matur plin cu spori, d-sporange rupt, fspori; B- miceliu vegetativ: g-rizoizi Conidiosporii (conidiile) sunt spori externi care iau natere pe vrful dilatat al hifei specializate numite conidiofor, printr-un proces asemntor nmuguririi, formnd iraguri. ntre hif i iragurile de conidii se interpun nite piese intermediare numite sterigme. Forma corpilor fructificani conidiogeni variaz n funcie de gen sau specie; la Aspergilus spp., de exemplu, au aspect de mciuc, iar la Penicillium spp., aspect de penson (fig. 21) B.2 Sporii perfeci (meiotici, sexuai) rezult din fuzionarea a dou celule-gamei cu potenial ereditar diferit, situate pe aceeai hif sau pe hife distincte dar apropiate. Cu excepia unor particulariti de detaliu corelate cu nivelul evolutiv al miceilor, procesul de fuzionare a celor dou celule se realizeaz n dou faze

Fig. 21 Aspecte de micelii aeriene cu corpi fructificanti: 1-Rhizopus, 2- Aspergillus, 3-Penicillium


57

succesive. n prima faz are loc fuzionarea citoplasmei (plasmogamia) iar n etapa urmtoare, fuzionarea nucleilor (cariogamia), rezultnd astfel un zigot cu nucleu unic diploid (set dublu de cromozomi). Dup un anumit interval de timp, nucleul sufer o diviziune reducional (meiotic) reveninindu-se la haploidie. Se deosebesc urmtoarele tipuri de spori sexuai: zigosporii, oosporii, ascosporii i bazidiosporii. Zigosporii rezult din gamei identici ca structur, form i dimensiuni (izogamei sau gametangi) care apar sub forma unor protuberane pe dou hife apropiate din acelai miceliu sau aparinnd unor micelii diferite. Ajungnd la un moment dat n contact, membranele celulare se rezorb la acel nivel iar coninutul lor protoplasmatic se contopete rezultnd un zigospor (fig.22)

Fig. 22 Etapele succesive ale procesului de formare a unui zigospor. Dou celule din acelai miceliu sau din micelii diferite se ntlnesc (A,B) produc celule sexuale speciale ( C) care fuzioneaz (D) i formeaz un zigospor acoperit cu un perete protector, negru (E) care rmne n stare laten pn la germinare, cnd formeaz un corp fructificant de tip asexuat (F) Oosporii rezult din gamei difereniai morfofiziologic (heterogamei): unul mai mare (oogonul), de sex feminin i altul mai mic, de sex masculin (anteridia). Oogonul fecundat se transform n oospor. Att zigosporii ct i oosporii sunt ntlnii la ciupercile inferioare i reprezint faza diploid a ciclului de dezvoltare al acestora. Prin germinarea sporilor se revine la faza haploid reprezentat att prin aparatul vegetativ ct i prin sporii asexuai (fig. 32) Ascosporii i bazidiosporii sunt caracteristici micromiceilor superiori, la care cariogamia nu are loc imediat dup contopirea celor doi gamei: ascogonul i anteridia. n urma acestui proces va rezulta mai nti un miceliu special care va da natere unor corpi fructificani diferii ca form, numii asce (aspect saciform) la micromiceii din subncrengtura Ascomycotina i bazidii (aspect de mnu cu degete), la cei din subncrengtura Bazidiomycotina. n interiorul acestor formaiuni are loc cariogamia prin fuzionarea celor doi nuclei. Dup un interval de timp, nucleul diploid sufer una sau mai multe diviziuni reducionale. La ascomicete diviziunea reducional va conduce la formarea a doi, patru sau opt nuclei haploizi care, la rndul lor, nconjurndu-se de un strat de plasm
58

condensat i un perete celular, vor genera un numr echivalent de ascospori (fig.23). Eliberarea ascosporilor se face prin ruperea ascelor. Bazidia este ntructva similar unei asce, dar, spre deosebire de aceasta, i poart sporii nu n interiorul, ci la exteriorul ei.

Fig. 23 Formarea ascosporului la mucegaiuri. n celula binuclear (A) produs prin fuzionarea a dou celule din acelai miceliu sau din micelii diferite, nucleii se unesc (B), se divid repetat (C i D) formnd 8 nuclei sporali (E) coninui ntr-o celul numit asc(F). Nucleul diploid al bazidiei se divide de dou ori rezultnd patru nuclei haploizi. n partea apical a bazidiei se formeaz apoi patru mici excrescene, numite sterigme, n care vor migra cei patru bazidiospori (fig.24). Pentru eliberarea acestora, la baza sterigmelor apare cte o pictur de lichid care crete treptat i care , prin presiunea pe care o exercit, determin deschiderea sterigmelor i proiectarea sporilor n aer (Zarnea G., 1970).

Fig. 24 Etapele succesive ale formrii unei bazidii i eliberarea bazidiosporilor: A- celula binucleat, B- fuziunea nucleilor, C- i D diviziunea nucleilor, E- formarea bazidiosporilor, F i G eliberarea lor ( dup Stanier, cit.Zarnea,G. 1970)

59

3.4 NUTRIIA I CRETEREA FUNGILOR Fungii au o nutriie de tip chimioheterotrof deoarece, asemntor bacteriilor, utilizeaz substanele organice ca principal surs de carbon i energie, dezvoltndu-se pe materia organic moart (fungii saprofii) sau pe seama organismelor vii (fungii parazii). Substanele cu molecul mic (monozaharidele, aminoacizii) strbat peretele celulelor hifale i levurice prin difuzie simpl. Substanele macromoleculare (proteine, polizaharide, lipide), sunt supuse mai nti unui proces de digestie extracelular sub aciunea enzimelor fungice glicolitice, proteolitice, lipolitice, fiind transformate astfel n nutrieni ce pot fi preluai ulterior prin absorbie transparietal. La fungii patogeni, aceste enzime constituie factori de virulen cu ajutorul crora strbat barierele naturale ale organismelor vii pe care s-au adaptat s triasc (Ileana Nichita, 2007). Fungii se pot dezvolta la o gam larg a valorilor de pH (2,0 9,0), fiind n general acidofili (pH-ul optim =5,0 6,0). Temperatura optim de dezvoltare este de 22-32o C, limitele extreme situndu-se ntre 5 oC i 45 oC. Umiditatea crescut influeneaz favorabil metabolismul, creterea i multiplicarea ciupercilor filamentoase - activiti stopate cnd umiditatea mediului se reduce la 20%. Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe, dezvoltndu-se n special la suprafaa substraturilor nutritive, iar drojdiile sunt facultativ anaerobe: ele desfoar un metabolism oxidativ, descompunnd carbohidraii pn la bioxid de carbon i ap, dar sunt active metabolic i n lipsa oxigenului, cnd recurg la un metabolism fermentativ cu producere de etanol i bioxid de carbon. Datorit structurii peretelui celular, fungii sunt mai rezisteni la presiunea osmotic n comparaie cu bacteriile, fiind capabili s creasc i n medii cu o concentraie ridicat de zahr sau sruri. Dotai cu un echipament enzimatic complex, fungii sunt capabili s utilizeze zaharuri complexe (celuloz, lignin) inaccesibile pentru majoritatea bacteriilor i s-i obin nutrienii din substraturi cu umiditate redus. Creterea fungilor se realizeaz la extremitile libere ale hifelor, pe baza substanelor rezultate din metabolismul de biosintez,. Celula terminal se alungete apoi se formeaz un sept transversal care o mparte n dou celulefiice. Totdeauna, celula terminal continu procesul de cretere i diviziune n timp ce celula subterminal particip doar facultativ, atunci cnd produce o ramnificaie lateral dotat, la rndul ei, cu capacitatea de cretere apical. n dinamica procesului de cretere ,,in vitro se pot distinge 3 faze i anume: faza de lag, faza de cretere liniar i faza de nvechire. - Faza de lag, n care procesul propriu-zis de cretere este absent. Aceast faz se caracterizeaz prin regenerearea hifelor care au servit la nsmnare sau germinarea sporilor.
60

- Faza de cretere linear corespunde cu apariia pe suprafaa mediului de cultur a coloniei circulare. Aceast colonie are o cretere mai rapid la periferie, n timp ce zona central se caracterizeaz printr-o cretere mai lent sau chiar prin absena creterii. Pe medii srace n substane nutritve creterea are loc n suprafa, sub forma unei reele fine de hife. Pe medii bogate creterea se face mai lent n diametru transversal, n schimb, miceliul este mai gros. - Faza de nvechire se traduce prin ncetinirea vitezei de cretere pe msur ce marginile coloniei se apropie de bariera mecanic, reprezentat de marginea plcii Petri n care se cultiv respectivul mucegai. Aceast ncetinire este determinat de acumularea produilor de catabolism, care se face cu att mai rapid cu ct condiiile nutritive, de temperatur i aeraie sunt mai aproape de exigenele optime ale speciei cultivate. 3.4. PARTICULARITILE ECO-FIZIOLOGICE ALE CIUPERCILOR MICROSCOPICE i IMPLICAIILE N ACTIVITATEA OMULUI Majoritatea ciupercilor microscopice sunt saprobiote utiliznd n scop trofic substanele din materia organic moart. Acestea sunt ubicvitare n mediile naturale, realizeaznd prin aciunea de gradare i mineralizare a cadavrelor animale i vegetale, autopurificarea solului i a apelor i circuitul general al materiei, fr de care viaa nu ar fi posibil. Unele specii, dei nu att de numeroase ca cele saprobiote, sunt parazite ale organismele vii plante, insecte, peti, reptile, psri, mamifere, om provocnd boli a cror gravitate depeete uneori pe aceea cauzat de bacterii i virusuri. Numeroase specii de ciuperci pot tri n anumite faze ale dezvoltrii lor ca saprobiote, iar n anumite condiii ca parazite. Din aceast categorie fac parte ciupercile facultativ parazite, care se dezvolt obinuit pe substraturi lipsite de via dar pot s se adapteze pentru o perioad scurt de timp pe esuturi vii i ciupercile facultativ saprobiote , care sunt adaptate la parazitism dar pot avea i o existen saprobiot (Ileana Nichita, 2007). Capacitatea miceilor de a popula un anumit biotop este condiionat de posibilitile de a exploata resursele nutritive i energetice ale acestuia prin intermediul echipamentului enzimatic de care dispun i care difer de la o specie la alta. Din acest punct de vedere, ciupercile microscopice pot fi clasificate n trei categorii: monofage, oligofage i polifage (Coman I., Mare M., 2000). Ciupercile monofage i oligofage dispun de un sistem enzimatic redus, limitat uneori la compoziia chimic a esuturilor unei singure specii vegetale sau animale, ca o consecin a adaptrii lor la un mod de via strict parazit. n categoria ciupercilor polifage intr majoritatea speciilor saprobiote dar i cele facultativ parazite i facultativ saprobiote specii dotate cu un echipament enzimatic complex. n raport cu activitatea omului, efectele miceilor pot fi favorabile sau nefavorabile.
61

I. Efectele favorabile constau n activitile enzimatice ale acestora valorificate n diferite ramuri ale industriei. Industria alimentar: - obinerea drojdiei de panificaie din levura Saccharomyces cerevisiae; - obinerea alcoolului, berii i cidrului prin fermentaia alcoolic a unui substrat glucidic (amidon, zaharoz, suc de fructe), produs de levuri aparinnd genurilor Saccharomyces, Kluiveromyces, Candida; - fermentarea dirijat a laptelui cu ajutorul unor specii de micei din genul Penicillium (P. roqueforti, P. camemberti, P. candidum) pentru obinerea brnzeturilor din sortimentele Roquefort,Camembert, Brie.a. ; - prepararea salamurilor crude i uscate cu mucegai de suprafa (Penicillium nalgiovense). Industria farmaceutic: - obinerea de antibiotice naturale din categoria penicilinelor i a cefalosporinelor din culturi de micei din genul Penicillium respectiv, Cephalosporium; - sinteza unor hormoni (ex., micetul Rhizopus arrhizus, datorit capacitii de a hidroliza progesteronul - intermediar n procesul de sintez a cortizonului reduce considerabil numrul etapelor de sintez chimic a acestui hormon); - sinteza de interferoni (n 1981 genele interferonului au fost transferate prin inginerie genetic n celulele levurei Sacharomyces cerevisiae, fiecare celul fiind capabil s sintetizeze pn la 106 molecule de interferon); - sinteza de proteine virale imunogene (antigenul HbsAg) utilizate la prepararea vaccinurilor contra hepatitei B, cu ajutorul levurilor modificate genetic (Sasson A., 1993); - sinteza unor enzime: amilaze (Aspergillus niger, Aspergillus usamii, Rhisopus oryzae, Rhisopus delemar .a.), proteaze (Aspergillus spp., Mucor pusillus .a.), lipaze (Saccharomycopsis lipolytica .a.); industria producerii de biomas i proteine neconvenionale prin metabolizarea unor deeuri agricole i industriale de ctre unele specii de levuri. II. Efectele nocive produse de micei constau n alterarea (mucegirea) alimentelor vegetale i animale i producerea de mbolnviri la plante, animale i oameni. Dintre miceii fitopatogeni, o importan deosebit, prin pierderile economice pe care le determin, au speciile care produc: - mana: Phytophtora infestans (mana cartofilor), Plasmopara helianthi (mana florii soarelui), Peronospora spp. (mana viei de vie) etc. - tciunele la porumb i gru (Ustilago maidis); - rugina cerealelor (Puccinia spp.); - putrezirea fructelor (Fusarium spp., Alternaria spp., Trichotecium spp. .a.)
62

Bolile produse de ciupercile microscopice la animale i om pot fi clasificate pe baza mai multor criterii. n funcie de categoria n care se ncadreaz micetul ele pot fi grupate n levuroze i micoze propriu-zise iar dup mecanismul patogenitii, n micoze i micotoxicoze. Micozele se caracterizeaz prin prezena i multiplicarea miceilor n diferite organe i esuturi, ndeosebi la indivizii imunosupresai. n funcie de localizarea proceselor patologice, micozele se clasific n: dermatomicoze sau micoze externe (tricofiia, candidoza cutanat, microsporidioza, onicomicozele etc.) i micoze viscerale sau endomicoze ( ex., aspergiloza n special pulmonar). Micotoxicozele se caracterizeaz prin leziuni i tulburri funcionale produse prin ingerarea toxinelor (micotoxinelor) elaborate de speciile de micei toxigeni n materiile prime, alimentele finite i furajele pe care se dezvolt. Micotoxinele cu implicaii majore in sanatatea oamenilor si animalelor sunt: aflatoxinele (carcinoame hepatice, tumori renale, tumori ale aparatului respirator a altor organe), ochratoxinele (nefropatii acute si cronice), fusariotoxinele (estrogenism, cancer esofagian, drunken bred -boala consumului painii care imbata, aleucie toxica alimentara s.a), ergotoxinele (ergotismul gangrenos si convulsiv). Biosinteza micotoxinelor n alimente i furaje are loc n anumite condiii, dintre care Apostu S. (2006) menioneaz: 1. nsuirile genetice; dintre sutele de mii de specii de micei, ~ 250 au capacitatea de a produce micotoxine prin dezvoltarea lor pe vegetale sau produse de origine vegetal i mai rar pe cele de origine animal; 2. compoziia chimic a substratului: coninutul crescut n glucide favorizeaz elaborarea micotoxinelor; 3. umiditatea substratului; se apreciaz c pentru majoritatea cerealelor punctul critic de umiditate favorabil dezvoltrii miceilor este de 13%; 4. pH-ul optim = 4-6; 5. prezena unor elemente minerale i vitamine cu rol stimulator: zincul (mai ales pentru biosinteza aflatoxinelor), fierul, manganul, tiamina. 6. competiia intermicrobian din substrat, care poate reduce sau suprima sinteza micotoxinelor; Aspergillus niger inhib parial dezvoltarea speciei Aspergillus flavus i producerea de aflatoxine de ctre acesta; Flavobacterium auranticum metabolizeaz aflatoxina B1, reuind s detoxifice complet substraturile naturale contaminate; 7. temperatura de 25-38C, umiditatea atmosferic de 85% i luminozitatea medie constituie condiiile optime pentru elaborarea majoritii micotoxinelor. Contaminarea cu micotoxine a alimentelor de origine animal este, de obicei, consecina absorbiei la nivelul intestinelor animalelor n via a micotoxinelor prezente n furaje, care pot cumula n diferite esuturi sau se pot elimina prin lapte i ou. Cu toate acestea, carnea este contaminat cu
63

micotoxine n cazuri foarte rare iar laptele i produsele lactate pot conine rareori cantiti semnificative de micotoxine. S-a stabilit c laptele vacilor care au consumat furaje cu un coninut ridicat de aflatoxine conine un metabolit al aflatoxinei B1, cu semnificaie patologic important, numit iniial ,,milkotoxin" iar n prezent, aflatoxina M1. Cantiti mai mari de micotoxine au fost puse n eviden n produsele vegetale: boabe de porumb mucegite (238-2500 ppb aflatoxine, 100-1000 ppb zearalenon), semine de oleaginoase (50-1000 ppb) i uleiul extras din acestea, mere intrate n putrefacie (25000 ppb patulin) i sucul extras din asemenea fructe (80000ppb) etc. Micotoxinele au efecte nefavorabile asupra organismului uman i animal, care se reflect asupra creterii, strii de sntate i capacitii imunogene a organismului. Mecanismele patogenetice sunt complexe: interferarea sintezei principalelor grupe de substane nutritive (proteine, glucide, lipide, vitaminele A, D, K), imunosupresie, efect oncogen (cancerigen) etc..

64

NOIUNI DE VIRUSOLOGIE GENERAL Virusurile sunt definite ca forme acelulare sau subcelulare de via, metabolic inerte i lipsite de capacitatea de cretere i multiplicare nafara organismelor vii, fiind parazite obligatoriu intracelular. Virusologia - tiina care se ocup cu studiul virusurilor - constituie un domeniu particular al microbiologiei prin specificitatea metodelor de cercetare, care constau n cultivarea virusurilor pe esuturi vii, microscopie electronic, metode chimice i imunologice proprii. 4.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR Virusurile prezint unele particulariti care le difereniaz de celelalte microorganisme, i anume: 1.- dimensiunile foarte reduse, cuprinse ntre 10 i 300 nanometri (nm), care le confer urmtoarele proprieti: - nu sunt vizibile la microscopul optic, ci numai la microscopul electronic; - traverseaz fitrele obinuite, care rein bacteriile; -sedimenteaz numai prin ultracentrifugare (>10000 turaii/minut). 2.- sunt lipsite de metabolism propriu deoarece nu dispun de enzime metabolice i prin urmare: -nu cresc i nu se divid singure ci sunt replicate de o celul gazd (animal, vegetal, fungic, bacterien); - relaia cu celulele gazd este una de parazitism deoarece virusul deviaz metabolismul acestora n sensul sintezei de noi particule virale pe baza rezervelor nutritive i energetice ale celulei. 4.2.FORMELE DE EXISTEN A VIRUSURILOR N NATUR Virusurile pot exista n natur sub trei forme biologice, fiecare dintre ele reprezentnd, n acelai timp, un stadiu al ciclului ontogenetic. Virusul complet (virionul) constituie forma matur, care posed toate componenetele caracteristice virusului i toate atributele speciei din care face parte. El are capacitatea de a rezista un timp limitat nafara celulei sensibile i este dotat cu infeciozitate (posibilitatea de a ptrunde ntr-o celul gazd
65

receptiv, capabil s-l reproduc) i patogenitate (capacitatea de a determina modificri morfologice i funcionale echivalente cu starea de boal). Virusul vegetativ reprezint o form de existen intracelular a virusului, sub form de elemente structurale dispersate n citoplasma celulei. Conform informaiei genetice coninute n acidul nucleic viral, celula cu aparatul ei enzimatic sintetizeaz componentele virale care, n urma ansamblrii, formeaz noi virioni. Eliberai din celula parazitat, acetia vor ptrunde n alte celule receptive, relund circuitul care asigur conservarea virusului n natur. n faza de virus vegetativ, dependena virusului de celul este total, el fiind incapabil de a supravieui nafara acesteia. Virusul integrat sau provirusul este tot o form de existen intracelular total dependent de celula gazd, cu deosebirea c celula parazitat nu sintetizeaz material viral. Acidul nucleic viral se integreaz n genomul celulei receptive, unde rmne n stare ocult un timp nelimitat, comportndu-se ca un fragment de material genetic propriu celulei. Aceast form de existen este bine cunoscut la bacteriofagi (virusuri care paraziteaz bacteriile) i la virusurile tumorale. Virusul integrat se poate transforma n virus vegetativ, de obicei sub aciunea unor factori stresani pentru celul, n care caz genomul viral se desprinde de cromozomul celulei i ncepe s codifice sinteza de material viral, trecnd n stadiul de virus vegetativ 4.3. MORFOLOGIA i STRUCTURA VIRUSURILOR 4.3.1. FORMA i DIMENSIUNILE Din cauza dimensiunilor reduse ale virusurilor, morfologia i structura lor pot fi examinate numai prin microscopia electronic a seciunilor ultrafine i prin difracia razelor X. Virusurile se prezint ntr-o gam foarte variat de forme, n funcie de specie: bastona drept, filament pliat, icosaedru, corpuscul sferic, crmid cu colurile rotunjite, ghiulea, spermatozoid etc. (fig.25). n general: - forma rotunjit (corpuscular) este specific virusurilor patogene pentru animale (zoovirusuri); - forma alungit, virusurilor patogene pentru plante (fitovirusuri) i insecte; - forma spermatozoidic, virusurilor patogene pentru bacterii (bacteriofagi). Dimensiunile virusurilor difer de la o specie la alta, fiind cuprinse ntre 10-20 nanometri la virusurile mici (ex. virusul febrei aftoase) i 300-350 nanometri la virusurile mari (ex. virusurile variolice).

66

Fig. 25 Reprezentarea schematic a formelor i dimensiunilor comparative ale principalelor grupe i familii de virusuri.

4.3.2. STRUCTURA VIRUSURILOR Virusurile complete (virionii) sunt formate dintr-un singur acid nucleic ADN sau ARN -,care constituie genomul viral i un nveli proteic n contact direct cu acidul nucleic numit capsid , formnd mpreun nucleocapsida. La unele virusuri, nucleocapsida este nconjutat de un nveli suplimentar numit pericapsid (anvelop, peplos), prevzut cu o serie de emergene numite spiculi (fig.27).

67

Fig.27 Structura general www.anisn.it/omodeo/omodeo/virus.htm).

virusurilor

4.3.2.1

Genomul viral

Genomul viral este reprezenrat de acidul nucleic viral. n funcie de natura acestuia, virusurile se mpart n ribovirusuri (virusuri cu ARN) i dezoxiribovirusuri (virusuri cu ADN). La virusurile fitopatogene (patogene pentru plante) acidul nucleic este ntotdeauna ARN, n timp ce la virusurile zoopatogene i bacteriofage, poate fi ADN sau ARN. Configuraia acizilor nucleici virali poate fi linear sau circular iar structura, n funcie de numrul lanurilor din care este constituit molecula, monocatenar sau dublu catenar. De regul, dezoxiribovirusurile au o molecul unic de ADN dublu catenar circular iar ribovirusurile, ARN monocatenar linear divizat n segmente separate (BUIUC i col., 2003). Genomul viral conine ntre 3 i 250 de gene i este componenta esenial a virusului, deoarece poart informaia genetic necesar pentru propria sa replicare i pentru devierea metabolismului celulei gazd n sensul sintezei celorlali constituieni ai particulei virale. Ribovirusurile constituie un unicat n biologie, n ce privete posibilitatea pstrrii informaiei genetice de ctre ARN. Masa molecular a genomului reprezint 5-30% din masa total a virionului i este constant pentru fiecare specie, constituind unul din criteriile taxonomice aplicate n clasificarea virusurilor.

68

4.3.2.2. nveliul CAPSIDA nveliul extern, prezent la toate virusurile, se numete capsid (gr. kapsa=cutie) i este format din mai multe subuniti de natur proteic identice, numite capsomere (gr. kapsa+meros=pri ale cutiei). Capsomerele sunt riguros aranjate, conform unei arhitecturi cristalografice, numrul i simetria lor fiind bine definite pentru fiecare virus n parte. Se cunosc trei tipuri principale de simetrie a capsidei virale. 1. Capsida cu simetrie icosaedric sau cubic dispus n jurul genomului (acidului nucleic viral) pliat sub form de ghem. Icosaedrul, prin cele 20 de fee n form de triunghiuri echilaterale, 12 vrfuri i 30 de muchii reprezint forma ideal de dispunere a capsomerelor deoarece asigur minimum de material pentru maximum de volum. El are trei tipuri de axe de simetrie rotaional axe n jurul crora, prin rotaie complet, va avea 2, 3, respectiv 5 poziii identice (fig. 28) : - axe de tip 2 care unesc dou laturi opuse exact la jumtatea acestora; - axe de tip 3 care trec prin punctele centrale a dou fee triunghiulare opuse; - axe de tip 5 care traverseaz fiecare dou unghiuri opuse.

Fig. 28 Tipurile de axe de simetrie ale icosaedrului (www.britannica.com/ebc/art.697 )

Dispunerea capsomerelor n structura capsidei icosaedrice este urmtoarea: feele i laturile sunt formate din hexone sau hexamere (capsomere formate din 6 monomere sau molecule proteice, nconjurate de 6 capsomere identice) iar vrfurile, din pentone sau pentamere (capsomere structurate din 5 molecule proteice) prevzute cu o prelungire mcicat numit fibra pentonei (fig. 29).
69

Fig. 29 Model de virus cu simetrie icosaedric: poziia pentonelor i a hexonelor 2. Capsida helicoidal, de forma unui tub cilindric, rezult din dispunerea capsomerelor n form de spiral, asemntor unui resort n stare comprimat. Spirala capsomerelor delimiteaz pe faa intern a tubului un an n care este aezat, tot helicoidal, ntr-un perfect paralelism cu capsida, genomul viral (fig. 30).

Fig. 30 Structura capsidei helicoidale a virusului mozaicului tutunului (schem). 3.Capsida cu simetrie binar sau dubl este caracteristic bacteriofagilor cu cap i coad (fig. 31.). Capsida capului este de tip icosaedric, iar capsida cozii este structurat dup tipul de simetrie helicoidal (fig. 32).

70

Fig. 31 Structura bacteriofagului T4 www.manisfield.osu.edu/...)

Fig.32 Simetria capsidei la fagul T4

PERICAPSIDA La unele virusuri, exterior capsidei se gsete un nveli suplimentar, nimit pericapsid, anvelop, sau peplos (fig.2). Pericapsida deriv din membrana celulei gazd; n cursul maturrii, virionii ,,nmuguresc" prin membrana celular pregtit n prealabil prin inseria de glicoproteine virus codificate. Aceste proteine vor proemina sub form de spiculi pe suprafaa anvelopei avnd, dup caz, funcie de liganzi (ex. hemaglutininele), mai rar de enzime (ex. neuraminidaza) sau factori de fuziune a membranelor citoplasmatice. Virusurile lipsite de pericapsid se numesc virusuri nude. Capsida mpreun cu pericapsida protejeaz genomul viral de aciunea factorilor de mediu i asigur fixarea virionului de receptorii celulei gazd 4.4 MULTIPLICAREA VIRUSURILOR ZOOPATOGENE Virusurile sunt cele mai mici structuri biologice care dispun de toat informaia genetic necesar pentru propria lor reproducere. Pentru virusuri, termenul de multiplicare nu reflect ntocmai realitatea fenomenelor care au loc n celula gazd. n interiorul acesteia virusurile nu se multiplic ci sunt sintetizate de celul prin activitatea metabolic a acesteia redirecionat, n urma substituirii informaiei genetice a celulei cu cea a virusului, ctre necesitile replicative ale acestuia. Acidul nucleic viral deine informaia necesar pentru a dirija propria sa replicare, sinteza proteinelor virale i inhibarea biosintezelor celulare normale (uneori - n infeciile endosimbionte produse de leucovirusuri, virusul sarcomului lui Rous - se stabilete un echilibru virus/gazd astfel nct, att genomul viral ct i cel al celulei codific simultan sinteza de proteine).
71

Componentele particulei virale se constituie pe seama rezervelor energetice i nutritive (aminoacizi, nucleotide) ale celulei parazitate. Multiplicarea virusurilor implic urmtoarele etape succesive: adsorbia i penetrarea virionilor n celul, decapsidarea cu eliberarea intracelular a genomului viral, replicarea propriu-zis, morfogeneza noilor virioni i eliberarea acestora din celula gazd (fig.33)..

Fig. 33 Etapele replicrii virusurilor animale 1. Adsorbia sau fixarea virionilor pe celul Dup o serie de ciocniri ntmpltoare ale virusurilor cu celulele animale i dup o faz de adsorbie nespecific reversibil, urmeaz faza de adsorbie ireversibil la nivelul unor receptori celulari specifici. Acetia sunt reprezentai de gruprile chimice ale membranei celulare, complementare sub aspect stereo, electrostatic i geometric cu capsida sau pericapsida virionului. Specificitatea de receptor explic tropismul celular, tisular i de organ al unor virusuri: virusul rabic se fixeaz pe receptorii pentru acetilcolin, virusurile gripale pe glicoproteinele care conin acid sialic i care sunt complementare neuraminidazei (enzima din pericapsida acestor virusuri), virusul poliomielitei, pe receptorii de pe enterocite i neuronii sistemului nervos central etc. Adsorbia poate fi oprit prin blocarea receptorilor n urma aciunii unor factori fizici, chimici sau biologici. Virionul rmas extracelular este repede distrus de factorii de aprare ai organismului. 2. Ptrunderea virionului n celul. Dup fixare, ptrunderea virusurile nude prin membrana celular se realizeaz printr-un proces activ de ncorporare din partea celulei, numit
72

viropexie. Membrana celular se invagineaz i se adncete progresiv n dreptul virionului pn cnd acesta este complet nglobat n celul. Virusul ptruns n celul se afl inclus ntr-o vacuol delimitat de membrana celular invaginat (endozom), care se dezintegreaz treptat. La virusurile cu anvelop, de regul, are loc fuziunea acesteia cu membrana citoplasmatic i eliberarea nucleocapsidei direct n citoplasm. Spre deosebire de virusurile zoopatogene i fitopatogene, care ptrund n ntregime n celula sensibil, la bacteriofagi capsida rmne nafara celulei, n care este introdus numai genomul dup o prealabil decapsidare. 3. Decapsidarea Dup ptrunderea n celul are loc mai nti decapsidarea virusurilor sub aciunea unor enzime produse de celula gazd sub determinismul genomului viral. Din momentul decapsidrii pn n momentul apariiei noilor virioni, virusul se afl n stare vegetativ (subuniti dispersate n citoplasm) fiind complet dependent de celula gazd i lipsit de infeciozitate. Acest interval din replicarea virusurilor poart denumirea de perioad de eclips deoarece virusurile, lipsite de identitate morfologic, nu sunt evideniabile prin mijloace electronooptice. Primele trei etape ale replicrii virale sunt relativ ineficiente deoarece: - rata fixrii (eficiena coliziunilor) este redus (3-5 x 10-9),raportat la multitudinea de particule virale care ptrund n organism; - nucleocapsidele nu sunt eliberate uneori din endozomi; - genomurile virale sunt atacate de endonucleazele celulei gazd. n acest context, raportul dintre numrul virionilor adsorbii i al celor efectiv replicai de celulele receptive este subunitar. 4. Replicarea propriu-zis (Sinteza componentelor virale). Virusurile ARN sunt replicate n citoplasm, cu excepia virusurilor gripale la care unele faze ale procesului replicativ se desfoar in nucleu. Virusurile ADN sunt replicate n nucleu, cu excepia poxvirusurilor al cror genom este replicat n citoplasm. La scurt timp dup ptrunderea n celul, acidul nucleic viral antrenat la locul replicrii i preia atributele de material genetic autonom, programnd i dirijnd sinteza componentelor virale care include: replicarea genomului viral, sinteza ARNm viral i sintezele proteice. Replicarea genomului este controlat de polimeraze (enzime ale celulei gazd sau incluse n nucleocapsida viral) i are loc n mod diferit n funcie de structura mono- sau dublu catenar a acidului nucleic: de regul, replicare semiconservativ la ADN i ARN dublu catenar i replicare mai nti complementar i apoi semiconservativ cnd acizii nucleici sunt monocatenari. Sinteza proteinelor virale Prin mecanisme incomplet elucidate, genomul viral scoate din funcie ADN celular astfel nct n celul este prezent numai ARNm transcris de pe genomul viral, care va transmite la nivelul ribozomilor un mesaj genetic nou,
73

oblignd celula s sintetizeze proteine virale n locul enzimelor i al celorlalte proteine proprii. Sinteza proteinelor virale are loc la cele mai multe virusuri (n principal, virusurile ADN) n dou faze: precoce i tardiv. 1) Faza precoce debuteaz imediat dup infectarea celulei. Proteinele timpurii au rolul de enzime, fiind implicate n sinteza ADN sau ARN viral i a unor precursori ai proteinelor virale structurale precum i n inhibarea sintezelor proprii celulei gazd. 2) Faza tardiv corespunde sintezei proteinelor virale structurale. Ea se declaneaz n momentul cnd, n urma replicrii ADN s-a ajuns la un anumit numr de genomuri virale, genele precoce fiind, de regul, inhibate. Se pare c la virusurile ARN sinteza proteinelor enzimatice i a celor structurale se desfoar simultan. 5. Morfogeneza virionilor progeni (nou formai) La sfritul fazei de biosintez, cnd n celul s-au acumulat cantiti mari de acid nucleic i proteine virale, are loc asamblarea virionilor progeni. La virusurile mici, aezarea capsomerelor n jurul genomurilor virale (ncapsidarea), se petrece spontan printr-un proces de autoasamblare. La cele mai multe virusuri, asamblarea implic ns intervenia unor enzime. ntre sinteza proteinelor capsidale i apariia lor n structura virionilor nou formai exist un interval de aproximativ 20 de minute. Morfogeneza, ca regul general, are loc pentru virusurile ARN n citoplasm, iar pentru virusurile ADN, intranuclear, dup migrarea materialului viral din citoplasm n nucleul celulei gazd. Componentele virale acumulate n exces pot genera incluzii celulare virale (Buiuc D., 2003). 6. Eliberarea virionilor din celul Virionii nou formai pot fi eliberai din celul prin mai multe mecanisme. 1) nmugurirea sau burjeonarea este modalitatea de eliberare a virusurilor cu anvelop. ntr-o prim faz, virionii nou asamblai sunt inclui n nite vezicule (cisterne) care se ataeaz de faa intern a membranei celulare pe care o bombeaz, proeminnd asemntor unor muguri. Ulterior, virusurile se detaeaz de celul prin mici aperturi care apar n membran. 2) Liza celulei gazd sub aciunea unor enzime sintetizate de celul n ultima faz a morfogenezei virionilor. Acest mecanism, caracteristic bacteriofagilor, se mai ntlnete la virusurile animale nude (Carp-Crare Mihai, 2001). 3)Eliberarea virionilor consecutiv morii celulei i dezintegrrii acesteia. Aceste virusuri apar cel mai trziu, iar punerea lor n libertate se caracterizeaz printr-o frecven moderat. 4) Trecerea virionilor direct la celula adiacent celei n care a avut loc multiplicarea, prin porii membranei celulare.

74

4.5. RELAIA VIRUS GAZD. 4.5.1. TROPISMUL VIRUSURILOR Deoarece genomul viral este extrem de simplu, virusurile nu dein informaia genetic necesar sintezei enzimelor metabolice (de ex. enzimele necesare catabolizrii glucidelor, enzimele care catalizeaz reaciile de biosintez a proteinelor etc.). Fiind lipsite de metabolism propriu, ele sunt obligate s paraziteze diverse gazde celulare. Virusurile sunt, prin urmare, parazii ai celulelor animale, vegetale, fungilor, protozoarelor sau bacteriilor. Celulele receptive le furnizeaz att energia i precursorii necesari sintezei acidului nucleic i proteinelor virale ct i aparatul de biosintez al acestora. Virusurile animale ptrund n organism pe diverse ci: digestiv (ex. virusul hepatitei A, enterovirusurile), respiratorie (ex. virusurile gripale), transcutanat (ex. virusul rabic), genital (virusul Herpes simplex tip 2, virusul verucilor umane). Unele virusuri rmn cantonate la poarta de intrare, care poate constitui n acelai timp i organul int (n virozele respiratorii, enteritele virale, virozele genitale) iar altele sunt diseminate n organism prin intermediul sngelui (diseminare hematogen) sau pe cale nervoas (diseminare neurogen). Diseminarea hematogen sau viremia const n trecerea virusurilor n snge la nivelul capilarelor i vehicularea lor prin intermediul leucocitelor polimorfonucleare neutrofile. Diseminarea neurogen (neuroprobazia) se realizeaz de-a lungul axonilor neuronali i poate fi centrifug (ex. virusul herpetic) sau centripet (ex. virusul turbrii). Virionii diseminai n organism se localizeaz n anumite esuturi fa de care prezint un tropism special (histotropism) sau numai n anumite celule (citotropism). Virusurile manifest, de asemenea , genotropism sau afinitate pentru o anumit specie biologic. Genotropismul a permis mprirea virusurilor n monopatogene (patogene pentru o specie) i polipatogene (patogene pentru dou, trei, sau mai multe specii), n zoovirusuri, fitovirusuri, bacteriofagi i micofagi. n funcie de histotropism, virusurile pot fi grupate n : - virusuri epiteliotrope (dermatotrope), care au afinitate pentru piele i mucoase (ex. virusurile variolice , virusul febrei aftoase, virusurile herpetice); - virusuri neurotrope, cu afinitate pentru esutul nervos (ex. virusul rabic, virusul poliomielitei); - virusuri organotrope (viscerotrope), cu afinitate pentru anumite organe interne, care, la rndul lor, pot fi clasificate n: pneumotrope (ex. virusurile gripale, virusul jigodiei), enterotrope (ex. virusul diareei virale bolii mucoaselor); hepatotrope (virusurile hepatitelor); - virusuri pantrope (mezenchimotrope), cu afinitate pentru toate esuturile i organele bogate n celule mezenchimale.(ex. virusurile pestelor la diferite specii animale).
75

Citotropismul reprezint afinitatea virusurilor pentru anumite celule din cadrul aceluiai esut. Virusul rabic, de exemplu se multiplic de preferin n neuronii piramidali din cornul lui Amon, iar virusul poliomielitei, n neuronii motori din coarnele anterioare ale mduvei spinrii. 4.5.2. TIPURI DE INFECIE VIRAL Virusurile ptrunse n organism determin din partea gazdei reacii de rspuns numite generic infecii virale sau viroze, care pot evolua diferit din punct de vedere clinic. 1.Infeciile virale acute (manifeste clinic) apar atunci cnd multiplicarea virusului n organism determin modificri morfologice i funcionale care se manifestat prin semne clinice evidente, corespunztoare strii de boal. Gravitatea bolii virale clinice este condiionat de o serie de factori ca: numrul de virioni infectani, rezistena general a organismului, vrsta, sexul, alimentaia, igiena, etc. Un aspect particular al patogenezei infeciei virale l constituie asocierea sinergic virus-bacterie. Aceast asociere este frecvent ntlnit n virozele respiratorii, n care leziunile produse de virus constituie pori de intrare pentru bacteriile oportuniste prezente n mod normal pe mucoasele cilor respiratorii anterioare. 2. Infeciile virale persistente, inaparente clinic n unele infecii virale, dup un episod acut sau chiar n lipsa acestuia, virusurile pot rmne n organismul animal, perioade lungi de timp, chiar toat viaa, ducnd la instalarea infeciilor persistente. Acestea se caracterizeaz prin lipsa semnelor clinice i pot fi lente, cronice sau latente . Infeciile lente se caracterizeaz printr-o perioad lung de incubaie (ani de zile) ca urmare a stabilirii unui echilibru ntre virus i organismul gazd. Acest tip de infecie se ntlnete n anemia infecioas a calului, leucozele aviare i mamifere, sindromul imunodeficienei umane (SIDA) .a. Unii factori de mediu (radiaiile, temperatura, umezeala etc.), sau factori interni (infecii intercurente, stimuli endocrini) pot determina ruperea acestui echilibru, care este urmat de replicarea virusului i instalarea bolii clinice. n infeciile cronice, dup un episod acut, virusul infecteaz organismul n mod cronic, adic pentru o lung perioad de timp n care simptomele lipsesc sau sunt slab exprimate dei infecia evolueaz. Exemplul tipic de infecie cronic evolutiv l constituie hepatitele umane cu virus B i C . n infeciile latente, cum sunt cele produse de virusurile herpetice (virusul Herpes simplex, virusul varicela-zoster), genomul viral se inser n genomul anumitor celule unde rmne n stare ocult o perioad nelimitat. n acest timp, virusul nu este multiplicat iar prezena lui n organism este lipsit de expresie clinic. Ocazional, n situaii stresante care induc imunosupresie dar i n condiii necunoscute, aceste infecii se pot activa.

76

3. Infeciile transformante sunt determinate de virusurile oncogene (citochinetice) i se caracterizat printr-o multiplicare anarhic a celulelor infectate, cu apariia de formaiuni tumorale. Ipoteza originii virale a unor tumori este veche (Mecinikov i Borrel, 1903) iar capacitatea unor virusuri de a produce tumori n condiii naturale i experimentale a fost evideniat n anul 1908 de Ellerman i Bang , care au demonstrat c leucozele aviare pot fi transmise n serie prin filtrate acelulare. Dintre virusurile identificate pn n prezent la animale, aproximativ prezint potenialul oncogen. Mecanismul oncogenezei virale nu este complet elucidat; se pare c integrarea unor gene virale n genomul celulei gazd determin transformri care duc la pierderea controlului reglator asupra multiplicrii celulare i implicit apariia de tumori benigne sau maligne. 4.6. CULTIVAREA VIRUSURILOR N LABORATOR Diagnosticul de certitudine n viroze se bazeaz pe cultivarea, izolarea i identificarea virusurilor. Din cauza lipsei echipamentului enzimatic, deci a unui metabolism propriu, virusurile nu pot fi cultivate pe medii artificiale ci numai pe gazde vii: culturi de celule, embrioni de gin, animale de laborator. Pentru reuita izolrii se va ine seama de tropismul virusului a crui izolare se urmrete, adic de prezena celulelor receptive capabile s-l replice. 4.6.1 Cultivarea virusurilor pe culturi celulare Relaiile virus-gazd n infecia natural sau experimental au putut fi explicate n mare parte prin studiul relaiilor virus-celul gazd ,,in vitro" (n culturi de celule). Culturile celulare se obin din esuturi sau organe proaspt prelevate (culturile primare), din esuturi embrionare (liniile de celule diploide) i din tumori canceroase (liniile celulare permanente). Cultivarea virusurilor pe linii celulare permanente (denumire atribuit datorit faptului c pot fi subcultivate indefinit) are avantajul c sensibilitatea celulelor respective fa de un anumit virus este stabil I cunoscut, iar rezultatele obinute n diferite laboratoare sunt comparabile. Dou dintre cele mai utilizate linii celulare permanente sunt linia HeLa obinut dintr-un carcinom de col uterin i linia KB din carcinom rinofaringian. esuturile sau organele din care se prepar culturile celulare sunt mai nti fragmentate n piese mici, apoi sunt disociate cu tripsin n celule individuale. Acestea se introduc n recipiente de sticl sau plastic cu medii nutritive speciale (fig.34). Celulele ader la pereii interni ai recipientului i se multiplic formnd un film continuu de cultur (monostrat de celule)- fig.35. Cultura confluent este inoculat cu suspensia viral obinut din prelevatele patologice prin omogenizare (pentru eliberarea virusurilor din celule), centrifugare (pentru ndeprtarea resturilor celulare i a eventualelor celule bacteriene) i tratare cu antibiotice (pentru a preveni creterea bacteriilor i a fungilor contaminani).

77

Fig.34 Plci Coli cu medii pentru culturi celulare. (www. Koihealth. org)

Fig.35 Monostrat de celule neinfectat. Coloraie hematoxilin-eozin (100x). Dup o perioad de incubaie, necesar replicrii virusului, culturile celulare sunt examinate pentru detectarea prezenei acestuia pe baza efectelor produse asupra celulelor parazitate. 1.Efectul citopatic const ntr-o serie de modificri morfologice ale celulelor infectate cu virusuri: - ratatinarea celulelor devierea de la forma normal - (arbovirusuri); - formarea de sinciii (celule gigante cu numeroi nuclei) prin fuzionarea celulelor din monostrat (paramixovirusuri) fig.36; - vacuolizarea citoplasmei (virusurile vacuolizante);

Fig. 36 Efect citopatic (sinciii) produs de virusul Measles (v. rujeolei umane) n filmul liniei celulare permanente HeLa . Coloraie hematoxilineozin (200x).

78

2. Efectul citolitic este o form particular a efectului citopatic, caracterizat prin liza celulelor i desprinderea lor de pe suport. Zonele de liz, care se pot observa cu ochiul liber fiind distincte de restul filmului celular normal, poart denumirea de ,,plaje". 3. Hemadsorbia const n adsorbia hematiilor sau eritrocitelor pe suprafaa celuleor din monostrat, care au replicat virusuri prevzute cu hemaglutinine (virusurile gripale, paragripale). Hemadsorbia poate fi mai precoce dect efectul citopatic i poate s se produc chiar n absena lui. 4. Hemaglutinarea este produs de supernatantul i omogenatul culturilor celulare infectate cu virusuri posesoare de hemaglutinine, fiind consecina adsorbiei virionilor pe suprafaa globulelor roii, la nivelul crora produc modificri de natur electrostatic. Identificarea acestor virusuri se poate face prin reacii serologice de inhibare a hemadsorbiei sau a hemaglutinrii folosind seruri antivirale specifice. Metoda se bazeaz pe pierderea capacitii de hemadsorbie, respectiv, hemaglutinare a virusului izolat, dup neutralizarea acestuia cu anticorpi specifici. 5. Interferena viral. Unele virusuri (ex., virusul rubeolei), fr a produce efect citopatic determin un efect de interferen, astfel nct replicarea lor n culturi celulare se depisteaz n mod indirect prin incapacitatea culturilor de a replica un virus cunoscut ca fiind citopatogen. 6. Transformarea neoplazic (transformarea celulelor normale n celule canceroase) este efectul multiplicrii virusurilor oncogene (ex., virusul sarcomului Rous). Celulele transformate au tendina de rotunjire, metabolism modificat, se divid anarhic ntr-un ritm accelerat i se aglomeaz n straturi supraetajate formnd tumori miniaturale ca urmare a pierderii inhibiiei de contact. 7. Efectul incluziogen. n celulele n care se multiplic un virus apar frecvent structuri corpusculare (acumulri de virioni sau componente virale) de dimensiuni variabile, numite incluzii virale. Ele au fost descrise cu mult nainte de descoperirea virusurilor i poart numele celor care le-au observat i descris pentru prima dat: incluziile Babe-Negri n turbare; incluziile Bollinger, n variola aviar; incluziile Guarnieri, n infeciile cu virus vaccinal etc. Evidenierea incluziilor prin coloraii speciale n preparate histologice, prin imunofluorescen n amprente de organe i prin alte tehnici reprezint o metod frecvent utilizat n diagnosticul virozelor. Specificitatea incluziilor pentru un anumit virus este dat de prezena lor n esutul pentru care virusul manifest tropism i de poziia lor: n citoplasm sau n nucleu. La noi n ar, la nivelul laboratoarelor veterinare judeene, evidenierea incluziilor Babe-Negri n neuronii piramidali din cornul lui Ammon (fig.37 A i B), constituie o metod curent n diagnosticul turbrii.

79

A B Fig. 37 Incluzii Babe-Negri (granulele de culoare roz) n citoplasma neuronilor piramidali din cornul lui Ammon (A - 100x; B 400x). Coloaia hematoxilin-eozin. (www.pathguy.com/lectures/rabies.jpg) 4.6.2 Cultivarea virusurilor pe embrioni de gin Oul embrionat constituie un mediu optim pentru cultivarea virusurilor deoarece este constituit din esuturi n dezvoltare, cu multiplicare activ, este steril i lipsit de mijloacele de aprare antiinfecioas existente la animalele adulte (Ivanof A. i col. 1982). nainte de inoculare oule incubate se verific la ovoscop, n camer obscur, pentru a le elimina pe cele neembrionate sau cu embrioni mori. Suspensia viral preparat din prelevatele patologice se inoculeaz innd cont de vrsta optim a embrionului (6-15 zile) i de calea optim de inoculare pentru diverse virusuri: pe membrana corioalantoidian (virusurile herpetice, poxvirusurile), n cavitatea amniotic sau alantoidian (ortomyxo- i paramyxovirusurile), n sacul vitelin i mai rar intavenos sau intracerebral (fig. 38).

Fig 38 Structura oului embrionat . Cile de inoculare a suspensiei virale (n chenare).(www studentsguide. in/microbiology/ viruses-vir) Dup 4-7 zile de incubare la 35-37C, multiplicarea virusului poate determina moartea embrionului, apariia de pustule (pocks) pe membrana corioalantoid sau acumulare de hemaglutinine n lichidul amniotic sau alantoidian 2.6.3 Cultivarea virusurilor pe animale de laborator La ora actual, cultivarea virusurilor pe animalele de laborator este o metod la care se apeleaz numai n cazul unor virusuri care nu se pot izola n
80

alte sisteme celulare (ex., arbovirusurile se izoleaz pe oricelul nou-nscut prin inoculare intracerebral, deoarece culturile celulare sunt mai puin sensibile). Pe lng problema proteciei animalelor, experimentarea pe animale de laborator (oareci albi, obolani, hamsteri, iepuri etc.) prezint o serie de inconveniente de ordin practic, cum ar fi specificitatea de gazd a unor virusuri i reactivarea unor infecii virale latente ale animalelor n cursul experimentului. Ultimul inconvenient poate fi evitat prin utilizarea animalelor germ free (sterile din punct de vedere microbiologic). Replicarea virusului pe animalele inoculate este atestat de: apariia simptomelor caracteristice i eventual, moartea acestora; prezena virusului n organele sau esuturile int, evideniat prin examene histopatologice, activitatea hemaglutinant a omogenatelor sau prin infeciozitatea acestora (capacitatea de a transmite boala prin reinoculare). Ca regul general, modificrile aprute la gazdele inoculate pentru detectarea virusurilor (culturi celulare, ou embrionate, animale de experien) dau indicaii asupra grupului de virusuri (familie, gen) cruia aparine virusul inoculat, identificarea speciei fcndu-se prin reacii antigen-anticorp. 4.7 ACIUNEA UNOR AGENI FIZICI i CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR Cunoaterea comportamentului virusurilor fa de factorii fizici i chimici are implicaii practice att pentru identificarea unui virus, ct i pentru msurile de profilaxie nespecific a bolilor virale. Temperatura n general, virusurile sunt sensibile la cldur, unele inactivndu-se n mediul extern la temperatura de 20-22C, n decurs de cteva ore. Inactivarea virusurilor are loc n majoritatea cazurilor la 56C n 30 minute, iar la 100C n cteva secunde. Temperatura optim pentru multiplicarea virusurilor coincide, n marea majoritate a cazurilor, cu temperatura optim pentru celula gazd. De aceea reacia febril a organismului n cursul infeciei trebuie privit ca un mijloc de aprare antiviral, avndu-se n vedere c temperatura corporal realizat prin hipertermie este de cele mai multe ori nefavorabil multiplicrii virusului, fr a fi nociv pentru celula gazd. Temperaturile sczute au proprieti conservante, metoda folosit pentru pstrarea virusurilor n colecii, luni sau chiar ani de zile, fiind congelarea la 40 pn la 196C . Variaiile de pH Limitele de pH n care virusurile i menin viabilitatea se situeaz ntre 59, cu unele excepii cum ar fi enterovirusurile care i pstreaz infeciozitatea i la pH 2,2 (dup Buxton i col. citai de Carp-Crare M., 2001).
81

Energia radiant Radiaiile cele mai active fa de virusuri sunt ultravioletele n doze mari. Efectul acestora este ns diminuat proporional cu protecia pe care o exercit asupra virusurilor materia organic n care sunt incluse (secreii, excreii, cadavre). Substanele chimice Diversele substane dezinfectante i antiseptice ca formolul, soda caustic, sublimatul de mercur, soluiile de iod, soluiile srurilor de argint, etc., distrug virusurile, viteza de aciune fiind n funcie de durata de contact i de concentraia soluiei. Hidroxidul de sodiu (soda caustic) exercit un puternic efect virulicid mai ales n soluie ferbinte. Formaldehida este activ dar aciunea ei antiviral este mai lent. Ea se utilizeaz ns n mod curent la prepararea vaccinurilor inactivate (omorte), deoarece nu modific structura antigenic a virusurilor. Eterul i cloroformul au o aciune electiv, n sensul c sunt inactivante pentru unele virusuri i inofensive pentru altele, astfel nct sensibilitatea la cele dou substane reprezint pentru virusuri, un criteriu taxonomic. Glicerina n soluie salin 50% constituie un bun conservant pentru majoritatea virusurilor, asigurndu-le infeciozitatea luni i chiar ani de zile. Antibioticele i chimioterapicele de uz curent n terapia antibacterian i antimicotic (penicilina, streptomicina, tetraciclinele, sulfamidele, cefalosporinele etc., respectiv, stamicina, nistatinul, nizoralul .a.), sunt inactive fa de virusuri. Utilizarea n practica medical a compuilor chimici cu aciune antiviral este limitat de toxicitatea neselectiv a acestora; deoarece virusurile utilizeaz mecanismele de biosintez ale celulei gazd, este dificil de selectat agenii care s interfereze specific replicarea viral fr s altreze integritatea morfofuncional a celulei parazitate. Agenii antivirali folosii n terapie pot fi clasificai n dou categorii: naturali i de sintez. Agenii antivirali naturali sunt interferonii (IFN) - proteine sintetizate n cursul infeciei virale de unele celule ale organismul gazd. Se cunosc trei tipuri de interferon: IFN , sintetizat, n principal, de leucocite, IFN produs de fibroblati i IFN sintetizat numai de limfocitele T. Eliberai din primele celule parazitate de virus, interferonii recunosc receptori specifici pe suprafaa celulelor nvecinate, de care se fixeaz, protejndu-le. IFN nu exercit o aciune antiviral direct, ci prin intermediul unor proteine i enzime a cror sintez este indus de cuplarea IFN cu receptorii celulari. Acestea blocheaz replicarea viral prin inhibarea traducerii ARNm.n proteine virale, fr s afecteze sinteza proteinelor normale ale celulei gazd. Interferonii au un spectru larg de aciune, n sensul c inhib replicarea a numeroase alte virusuri , nu numai a virusului care a indus sinteza lor, dar au o
82

strns specificitate de specie (ex., protecia omului este realizat numai de IFN uman). Dei la ora actual interferonii sunt produi n cantiti mari prin inginerie genetic (gena uman care codific sinteza IFN este clonat n celule bacteriene), din cauza efectelor secundare i a preului prohibitiv, ei sunt utilizai doar n terapia unor viroze umane cronice, agresive cum sunt hepatitele virale B i C. Agenii terapeutici antivirali de sintez au ca mecanism de aciune inhibarea uneia din fazele replicrii virale: blocarea penetrrii n celula receptiv i a decapsidrii (amantadina i rimantadina), sinteza acidului nucleic viral (aciclovir, farmciclovir, zidovudina .a.), sinteza proteinelor virale (indinavir, ritonavir). Aceste substane au o utilizare restrns din cauza fenomenelor adverse multiple i a capacitii virusurilor de a dezvolta rezisten prin selecia de mutani (Buiuc D., 2003). 4.8 BACTERIOFAGII Bacteriofagii sunt virusuri adaptate parazitrii celulelor bacteriene. Ei au o larg rspndire n natur, fiind prezeni n toate mediile naturale unde exist bacterii, deoarece aproape toate speciile bacteriene pot fi gazde pentru unul sau mai muli bacteriofagi. Bacteriofagii sau fagii sunt denumii dup gazda natural i poart un simbol (de exemplu, T1, T2, T3T7, , x 174 sunt bacteriofagi care paraziteaz celulele speciei Escherichia coli). Majoritatea bacteriofagilor prezint o specificitate de gazd limitat la tulpinile unei specii bacteriene sau ale unui gen. Uneori spectrul se extinde la genurile bacteriene nrudite (de ex.,exist bacteriofagi care infecteaz tulpini de Shigella i Escherichia), sau, dimpotriv, se reduce la anumite tulpini din cadrul unei specii bacteriene sau doar la celulele bacteriene posesoare de pili sexuali organite care constituie receptorii specifici pentru anumii bacteriofagi (fagii de sex). Compoziia chimic i structura Bacteriofagii au o compoziia chimic i o arhitectur asemntoare cu a virusurilor animale, cu excepia unor fagi (de ex. bacteriofagii T2, T4, T6 ai bacteriei Escherichia coli) care prezint ca particularitate, alctuirea din dou pri distincte: capul i coada (fig. 39). Capul este icosaedral i conine ADN viral (genomul), nconjurat de un nveli proteic format din capsomere (capsida). Coada este n exclusivitate de natur proteic i este format din urmtoarele structuri: a. la exterior, teaca cozii - un manon format din capsomere dispuse helicoidal i care are proprieti contractile, putndu-i reduce lungimea la jumtate din cea iniial; b. tija cozii (gtul, cilindrul axial) formaiune strbtut de canal central;
83

c. d.

gulerul cozii ,de form hexagonal, situat n partea proximal a tecii cozii; placa bazal, situat n partea distal a cozii, are form asemntoare cu gulerul, de colurile ei fiind ataate croetele. Acestea sunt subuniti proteice care, mpreun cu nite filamente numite fibrilele cozii, realizeaz fixarea fagului pe suprafaa bacteriei.

Fig. 39. Structura unui bacteriofag cu cap i coad schem. Relaii bacteriofag bacterie (multiplicarea fagilor) Exist dou tipuri de relaie fag-bacterie infectat (Debeleac Lucia, 2003, Ivanof I., 1982 ). A.Ciclul litic de multiplicare (ciclul productiv, infecia litic) duce la formarea de noi virioni, care sunt eliberai n mediu prin liza bacteriei. Infecia litic se realizeaz n mai multe etape: 1. Adsorbia bacteriofagului la receptorii de pe suprafaa celulei bacteriene. Mai nti se fixeaz fibrele cozii apoi are loc o ancorare mai ferm, prin intermediul croetelor. Acestea elibereaz muramidaz enzim care determin liza peretelui celular n zona de ataare. 2. Injectarea genomului fagic prin contractarea tecii, strpungerea peretelui bacterian de ctre tija cozii i trecerea acidului nucleic viral prin canalul acesteia, din capul bacteriofagului n celula bacterian. nveliul proteic rmne la exterior i poart denumirea de ,,fag fantom". 3.Multiplicarea bacteriofagului. Imediat dup ptrunderea ADNului fagic, apare o scurt perioad de eclips. Apoi, treptat, ADN-ul bacteriei este blocat, fiind substituit funcional de ADN-ul fagic care se va autoreplica i va induce sinteza de proteine virale pe seama rezervelor bacteriene. Fagul n multiplicare poart numele de fag vegetativ. 4. Maturarea fagilor. Genoamele fagice i proteinele structurale se ansambleaz formnd bacteriofagii maturi viruleni. 5. Eliberarea bacteriofagilor. nainte de sistarea metabolismului , celula bacterian parazitat sintetizeaz o enzim (endolizina), care lizeaz peretele bacterian permind eliberarea fagilor maturi. B. Ciclul lizogen (reductiv) Lizogenia const n integrarea genomului fagic n cromozomul bacteriei infectate.
84

Integrarea este consecina aciunii unei proteine bacteriene cu efect represor care inhib exprimarea funciilor vegetative ale fagului (replicarea acidului nucleic, sinteza proteinelor fagice, ansamblarea n virioni) i a unor gene fagice i bacteriene care asigur recombinarea situs-specific (integrarea ntr-un locus unde exist omologie de baze azotate ntre ADN-ul fagic i cel bacterian). Bacteria se reproduce normal, transmind descendenilor gena reprezentat de fag, uneori, implicit un caracte nou codificat de aceasta. Producerea de toxin difteric, de exemplu, este consecina lizogenizrii bacilului difteric cu bacteriofagul -tox). . Fagul integrat n genomul bacterian se mai numete profag, fag latent, fag endogen sau fag temperat. Odat instalat, starea de profag este stabil. Totui, ntr-o populaie bacterian cu fag latent (lizogen), la un numr mic de celule (10-5-10-4) acesta trece spontan n fag vegetativ, multiplicndu-se. n contact cu o populaie bacterian lipsit de profag (lizosensibil) fagii eliberai de bacteriile lizogene vor produce liza acesteia. Aplicaiile bacteriofagiei n medicin, aplicaiile practice ale bacteriofagiei sunt lizotipia i tratamentul infeciilor. Lizotipia. Existena unei specificiti restrnse fag - bacterie a constituit premiza utilizrii fagilor n crearea de diviziuni taxonomice n cadrul unor genuri i specii bacteriene numite lizotipuri. Lizotipia sau tipizarea fagic (operaiunea de ncadrare a unei tulpini bacteriene n lizotip cu ajutorul bacteriofagilor cunoscui) prezint importan practic n stabilirea filierei epidemiologice a bolilor contagioase i n toxiinfeciile alimentare. Tratamentul prin bacteriofag are o utilitate restrns deoarece efectul este inconstant i imprevizibil. 4.7. CLASIFICAREA VIRUSURILOR Problema clasificrii virusurilor este nc nerezolvat; ea formeaz obiectul de studiu al unui comitet internaional. Principalele criterii care stau la baza clasificrii virusurilor sunt: - natura chimic a acidului nucleic (ADN sau ARN); - simetria nucleocapsidei (cubic, helicoidal, binar); - prezena sau absena unui nveli pericapsidal; - numrul de capsomere pentru virusurile cu simetrie cubic sau diametrul nucleocapsidei pentru virusurile cu simetrie helicoidal. Pe baza acestor criterii, virusurile au fost ncadrate n phylum VIRA mprit n dou subphyla pe baza naturii chimice a genomului viral: - DEZOXIVIRA, - RIBOVIRA
85

n funcie de simetria capsidei helicoidal sau cubic - , virusurile se grupeaz n clase: - dezoxihelica i dezoxicubica; - ribohelica i ribocubica. Ordinele se bazeaz pe prezena sau absena unui nveli pericapsidal, iar familiile, n principal, pe numrul de capsomere i diametrul nucleocapsidei. Pe baza unor criterii suplimentare, n cadrul familiilor au fost individualizate subfamilii i genuri virale, iar n cadrul fiecrui gen, una sau mai multe specii. Virusurile au o nomenclatur latin cu terminaiile: - viridae, pentru familii; - virus, pentru gen . Exemple: familia Coronaviridae genul Coronavirus; familia Parvoviridae,genul Parvovirus.

86

Partea a II-a

NOIUNI DE MICROBIOLOGIE A ALIMENTELOR

87

Microorganismele sunt prezente din abunden n toate mediile n care au fost cutate: sol, ape, aer, corpul fiinelor vii (om, animale, plante), materia organic moart, alimente etc. Aceast ubicvitate decurge din capacitatea de a coloniza i de a supravieui n habitatele cele mai puin adecvate vieii (fundul oceanelor, gheurile polare, zcmintele de iei, izvoarele hidrotermale etc.) i de a metaboliza cele mai neobinuite substraturi anorganice (N2, S, CO, CO2) i organice (hidrocarburi, fenoli, crezoli, lemn, asfalt etc.). n ceea ce privete rspndirea pe vertical a microorganismelor, ea este, de asemenea, neobinuit de extins n raport cu a celorlalte vieuitoare. Cu ajutorul unor sonde speciale, bacteriile au putut fi detectate n atmosfer la nlimea de 12.000 m, la 4000 m adncime n pmnt i la 11000 m n adncul mrilor i al oceanelor. Practic, nu exist mediu natural la nivelul cruia s fie posibil viaa i din care microorganismele s lipseasc. Pe baza unor criterii cum sunt prezena constant i n numr mare, microorganismele din fiecare biotop pot fi grupate n dou categorii: - microorganisme adaptate filogenetic la condiiile fizico chimice oferite de biotop, care alctuiesc o comunitate de populaii (specii) relativ stabil, formnd microbiota autohton (normal sau rezident) i - microorganisme provenite din alte medii, a cror prezen este n mod obinuit tranzitorie deoarece sunt mai puin adaptate la noile condiii. Ele constituie microbiota alohton sau strin a biotopului respectiv. Prin nutrienii din compoziia lor, alimentele constituie un mediu de cultur optim pentru multiplicarea unui numr mare de specii bacteriene i fungice i asigur supravieuirea pentru un timp limitat a microorganismelor strict parazite (rickettsii, chlamidii, virusuri). Microbiota autohton a alimentelor este constituit din microorganismele saprofite pe care fiecare aliment le ntlnete n circuitul su, de la obinere pn la consumator. Prezena acestor microorganisme n numr mare influeneaz negativ sntatea consumatorului prin produii rezultai din degradarea enzimatic a alimentelor (alterare) i reprezint un indicator al condiiilor de igien necorespunztoare. De asemenea, prin microorganismele patogene pe care le vehiculeaz i prin metaboliii lor toxici, alimentele pot genera boli infecioase grave cu poart de intrare digestiv (tuberculoza, antraxul, hepatitele virale etc. ) i toxiinfecii alimentare.
88

6.1 Microbiota unor alimente de origine animal 6.1.1 Microbiota laptelui Microorganismele prezente n lapte sunt de provenien mamar i extramamar ( Apostu S., 2006). La anumalele sntoase glanda mamar este steril. Microorganismele, reprezentate de streptococi, lactobacili, colibacili i alte bacterii comensale nepatogene sau condiionat patogene sunt prezente n mod normal doar pe mucoasa treimei inferioare a canalelor galactofore. n cazul reducerii imunitii locale sau generale (imunosupresie) germenii comensali dotai cu factori de virulen i germeni din mediul ambiant (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae Escherichia coli, Aspergillus spp., Candida albicans etc.) ptrund n mamel pe cale ascendent determinnd infecii clinice sau subclinice. Patogeni recunoscui ca Mycobacterium bovis, Brucella spp., Rickettsia spp etc., determin mamite primare sau secundare de obicei pe cale descendent, consecutiv ptrunderii n torentul sanguin Laptele provenit de la animalele sntoase i recoltat n condiii igienice conine de obicei un numr redus de microorganisme (300 500/ml). ncrctura microbian a laptelui este mai mare n primele jeturi, deoarece antreneaz microflora existent pe mucoasa canalelor galactofore, apoi scade treptat. n laptele provenit de la animalele cu infecii ale glandei mamare, numrul microorganismelor pe mililitru poate fi de ordinul sutelor de mii sau chiar mai mult (Grecianu Al. i col., 1973). Sursele de contaminare a laptelui dup recoltare sunt reprezentate de adposturile insalubre, recipientele sau instalaiile de muls neigienizate, minile murdare ale mulgtorilor, ugerul murdar etc. Imediat dup muls, microorganismele sunt repartizate uniform n masa laptelui. n timpul pstrrii ns, odat cu ridicarea grsimilor, ele sunt antrenate la suprafa concentrndu-se n stratul de smntn. Microbiota normal a unui lapte igienic se compune n cea mai mare parte din bacterii aparinnd genurilor Lactobacillus (L. acidophilus, L.casei . L. bulgaricus .a. ) i Streptococcus (S. lactis, S. cremoris, S. thermophilus etc.) bacterii care prin activitatea lor fermentativ imprim produselor lactate un gust specific, plcut, fiind utilizate in industria laptelui sub form de maiele (culturi selectionate). Mirobiota de contaminare este dependent calitativ i cantitativ de condiiile de recoltare i de pstrare a laptelui i este responsabil de alterarea acestuia. Ea poate nsuma specii bacteriene aparinnd genurilor: Pseudomonas, Achromobacter, Leuconostoc, Micrococcus, Propionibacterium, Proteus, Escherichia, Enterobacter, Clostridium etc. (Mnescu S., 1989). Dat fiind originea intestinal a unora dintre aceste bacterii (Escherichia coli, Proteus spp.,Enterococcus spp., Clostridium perfringens), prezena lor denot o poluare de origine fecal i constituie un indicator al condiiilor sanitare pe circuitul laptelui.
89

Speciile patogene care pot contamina laptele i care produc infecii la om n urma consumului de lapte nefiert sunt: Mycobacterium bovis, Brucella abortus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes etc. 1. Microorganismele nepatogene prezente n lapte 1.1. Microorganisme care actioneaza n principal asupra lactozei n aceast categorie intr bacteriile lactice homofermentative i heterofermentative a. Bacteriile lactice homofermentative produc n urma actiunii asupra lactozei 1% - 95% acid lactic si cantitati foarte mici de dioxid de carbon i acid acetic. Ele sunt reprezentate de specii din genurile Lactobacillus si Streptococcus. Principalele specii de bacterii din aceasta subgrupa, care au importanta pentru tehnologia laptelui i a produselor lactate sunt: L.lactis, L.bulgaricus, L.helveticus, L.acidophilus, L. casei. L. p!antarum i S. termophilus, S. lactis, , S. cremoris. b. Bacteriile lactice heterofermentative produc n urma actiunii asupra lactozei cca. 50% acid lactic, 20-25% dioxid de carbon, 20-25% alcooli (etanol, manitol) i acid acetic. Ele fac parte din genurile Lactobacillus, Leuconostoc , Bifidobacterium, Propionibacterium. Speciile utilizate n tehnologia laptelui i produselor lactate sunt: Bifidobacterium bifidum, L. desidiosus (caucasicus), L. brevis, Leuc. mesenteroides, Leuc. cremoris (citrovorum). Principala specie din genul Propionibacterium cu semnificatie pentru tehnologia produselor lactate este P.freudenreichii care determina formarea ochiurilor de fermentaie caracteristice la brnza Schweizer. 1.2 Microorganisme care actioneaza predominant asupra proteinelor din lapte n aceasta grup intr specii de microorganisme din aproape toate diviziunile taxonomice, care hidrolizeaz proteinele din lapte n peptone, polipeptide i aminoacizi. Uneori aminoacizii sunt descompui n continuare pn la amoniac, indol, scatol, hidrogen sulfurat i ali catabolii responsabili de modificri organoleptice importante: coagularea dulce, peptonizarea sau proteoliza laptelui, coloraii si mirosuri anormale. Bacteriile din genurile Bacillus i Clostridium, fiind microorganisme sporulate ubicvitare, ajung n lapte n timpul mulsului i manipularii neigienice. Sporii rezist la procesul de pasteurizare a laptelui crud i la procesele de fermentare-maturare pe care le sufer produsele lactate, reprezentnd o problem pentru sterilizarea i prelucrarea industrial a laptelui. Specii ale genului Bacillus ( B.subtilis, B.cereus v. mycoides, B.circulans, B.licheniformis, B.sphaericus, B.coagulans, B.polymixa, B.macerans .a.) produc coagularea dulce (cazeoas) a laptelui pasteurizat n care nu mai exist microflora acidolactic concurent, distrus prin pasteurizare. Coagulul dulce produs de aceste bacterii este peptonizat n scurt timp, rezultnd o mas lichid galben-maronie cu reacie alcalin, care conine cantiti nsemnate de acizi aminai (tirozina, leucina), uree i sruri amoniacale.
90

Clostridiile, n funcie de specia contaminant, pot avea activitate puternic glucidolitic (Cl. butyricum, Cl .paraperfringens), proteolitic (Cl. hystolyticum, Cl.sporogenes) sau mixt (Cl .perfringens, Cl.acetobutylicum, Cl. aurantibutyricum, Cl.chauvei, Cl.septicum). Clostridiile puternic zaharolitice sunt incriminate n balonarea trzie a brnzeturilor. Acest defect se produce atunci cnd activitatea bacteriilor acidolactice este deficitar iar clostridiile fermenteaz cu producere de gaze lactoza nedescompus de microflora lactic, care n condiii normale constituie un concurent eficient . Cl.sporogenes, o specie cu activitate proteolitic, poate fi prezent n brnzeturile obinute n condiii neigienice determinnd apariia mirosului de varz alterat din cauza producerii hidrogenului sulfurat. Streptococcus faecalis subsp. liquefaciens, Micrococcus luteus i ali coci Gram pozitivi pot produce la nceput coagularea laptelui apoi acidifiere urmat de proteoliz i apariia gustului amar. Bacteriile Gram negative nesporogene aparinnd genului Pseudomonas (Ps.fluorescens, Ps.alcaligenes, Ps.syncyanea) Proteus (Pr.vulgaris) i Serratia (Serratia marcescens) sunt peptonizante i alcalinizante. n urma aciunii acestora laptele devine tulbure de culoare galben-verzuie, fluorescent, cu miros de amoniac, de pete sau de urin (Ps fluorescens), de culoare albastru-violet (Ps.syncyanea) sau roz-rou (S.marcescens). Asemenea modificri de culoare sunt mai evidente la brnzeturi. Unele specii de bacterii din aceasta grup sunt psihrotrofe (se multiplic la temperaturi pozitive apropiate de O0C) i determin defecte la laptele i brnzeturile depozitate la rece. Proteoliza cazeinei, alcalinizarea laptelui i gustul amar mai pot fi produse de unele actinomicete (A..griseus, A. violaceus) i de anumite levuri i mucegaiuri : Torula, Saccharomyces, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Oidium .a. 1.3 Microorganisme care actioneaza asupra lipidelor din lapte Microorganismele lipolitice care pot polua laptele i produsele lactate sunt reprezentate de cele mai diverse grupe de bacterii i micei: Pseudomonas, Micrococcus, Staphylococcus, Serratia, Bacillus, respectiv Cladosporium, Penicillium, Oidium .a. Unele dintre acestea sunt psihrotrofe, fiind capabile s se multiplice i s acioneze asupra lipidelor i atunci cnd produsele n care se afl se pstreaz la temperaturi joase. Aceste microorganisme dispun de enzime numite lipaze, care determin hidroliza grsimilor cu formarea unor compui chimici ce determin modificri de miros (butiric,neptor, rnced) i gust (iute, picant). Deoarece majoritatea microorganismelor lipolitice desfoar i alte activiti enzimatice, n special activitate proteolitic, modificarile produse de lipaze vor fi aproape ntotdeauna nsoite i de unele modificari proteolitice, cum ar fi mirosul de sulf, de amoniac, gustul amar s.a. 2. Microorganismele patogene 2.1. Virusurile
91

Laptele crud, cel contaminat dup pasteurizare i brnzeturile contaminate joaca un rol important n diseminarea unor virusuri patogene pentru om, mai ales n arile n curs de dezvoltare. Enterovirusurile. Aceste virusuri, transmisibile pe cale oral, se multiplic n mucoasa gastro-intestinal a omului i animalelor. Cele mai patogene pentru om sunt virusul poliomielitei i virusul Coxsackie, care pot ajunge n lapte prin contaminare fecal de ctre persoanele purttoare, clinic sntoase. S-a demonstrat c i alte tipuri de virusuri din aceast grup pot determina mbolnaviri la om, cum sunt cele care provoaca"diareea de var" la copii. Prin examene de laborator s-a demonstrat c virusul poliomielitei este inactivat prin pasteurizrile curente corect efectuate n timp ce virusul Coxsackie suspendat n lapte pare a fi mai rezistent la pasteurizarea obinuit, unele tulpini supravieuind la tratamente termice de 71oC-15 sec. Virusul febrei aftoase. Virusul febrei aftoase este unul din cele mai contagioase virusuri pentru animale. La om, boala apare foarte rar i are ca surs de infecie laptele crud provenit din fermele contaminate. Virusul trece n lapte n faza de viremie a animalului bolnav dar i n timpul mulsului prin lichidul care se scurge din aftele deschise prezente pe uger. Virusul nu rezist la temperatura de pasteurizare i moare n scurt timp n produsele lactate acide Virusul hepatitei infecioase de tip A. Hepatita infecioas de tip A este considerat ,,boala minilor murdaredeoarece se transmite pe cale oral n condiiile nerespectrii unor norme minime de igien cum ar fi splatul pe mini. Acest virus este eliminat prin materii fecale de ctre persoanele bolnave sau convalescente ajungnd n alimente i ap. Hepatita infecioas viral este considerat una din cele mai grave maladii virale n care laptele poate s constituie o important surs de infecie. Contaminarea laptelui se realizeaz prin manipulare de persoanele purttoare i eliminatoare de virus i prin apa contaminat folosit n ntreprinderile prelucratoare i de distribuie. Virusul encefalitei transmisibile prin artropode.. Boala apare la om ca urmare a nepturilor produse de capuele Ixodes persulcatus i Ixodes ricinus, care constituie vectorii acestui virus sau prin consum de lapte netratat termic provenit de la caprele infectate. Virusul a fost pus in evident n laptele de capr, vac i oaie infectate natural i experimental. Concentraia sa in laptele animalului infectat este de sute de ori mai mare dect n snge. Aceasta s-ar putea datora multiplicrii virusului la nivelul ugerului sau filtrrii i concentrrii lui n uger. Virusul a fost pus n eviden n smntn, unt i ca preparate din lapte contaminat. n smntna i untul conservate la 4C, virusul a supravietuit 2 luni iar n ca a rezistat aproximativ 2 saptamni. Virusul este inactivat n 20 min.la 70C i n 30 min. la 62-63C, deci pasteurizarea comercial curent execut corect este eficient. n perspectiv, vaccinarea animalelor de lapte ar putea deveni un mijloc eficient de lupt contra acestei boli transmisibile la om.
92

2.2 Bacterii i toxine bacteriene S.aureus. Principalul pericol al contaminrii laptelui i produselor lactate cu stafilococi const n elaborarea unei enterotoxine capabile s provoace la om gastroenterit acut. Enterotoxina stafilococic este termostabil din care cauz, dup elaborarea ei n lapte, este greu sau chiar imposibil de inactivat. De aceea toxiinfecia cu enterotoxina stafilococic poate s apar i n urma consumului de lapte pasteurizat dac laptele a fost contaminat n prealabil i inut n condiii favorabile multiplicrii stafilococilor. S. aureus este frecvent purtat de oamenii sntoi care manipuleaz laptele i produsele lactate dar i de animalele de lapte. La om, portajul de S. aureus variaz ntre 30-50%, bacteria fiind prezent de regul pe suprafaa pielii i mucoasa nazal. Frecvena purttorilor este mai mare printre persoanele care prezint sau au prezentat furunculi i panariii. Sursele de origine animal a contaminrii laptelui cu stafilococi sunt mamita stafilococic i leziunile externe infectate ale ugerului i mameloanelor. Brnza nematurat preparat din laptele de vac, oaie sau capr contaminat cu stafilococi enterotoxigeni i netratat termic poate declana gastroenterita acut. S-a stabilit ca enterotoxina stafilococic atinge concentraii nocive cnd densitatea celulelor vii de stafilococi este de minimum 500.000-1.000.000/ ml(g) de aliment, valori atinse dup 10-12 ore de multiplicare la 30-37 C. Prin pstrarea alimentelor la temperaturi sub 10 C, multiplicarea stafilococilor fiind practic inhibat nu mai are loc nici producerea de enterotoxin. Termorezistena enterotoxinei stafilococice are o importana practic considerabil, .metodele de pasteurizare fiind ineficace. Abia dup o fierbere de 60 min. se constat o reducere nsemnat a activitii enterotoxinei, inactivarea ei fiind posibil numai prin autoclavare la o presiune de 2 atmosfere. Enterotoxina prezent n lapte se menine i n produsele lactate. Multe cazuri de toxiinfecii alimentare sunt consecina consumului de lapte praf, smntn, brnzeturi la fabricarea carora se folosete lapte de calitate inferioar, nepasteurizat. Aciditatea laptelui influeneaz att viabilitatea germenilor ct i capacitatea lor de a elabora enterotoxin. Astfel, n brnzeturi pe parcursul procesului de maturare numarul de stafilococi se micoreaz treptat pn la dispariia lor n raport i cu ncrctura iniial cu stafilococi a laptelui materie prim. Brnza Cheddar, de exemplu, fabricat din lapte cu < de 100 stafilococi/ml. devine liber de stafilococi dup 16 sptmni de la fabricare, pe cnd cea fabricat din lapte cu >l00 stafilococi/ml., conine stafilococi vii i dup 20 de sptamni. Prezena de stafilococi patogeni n laptele acru este totui semnalat de numeroi cercettori. Streptococii
93

Streptococcus pyogenes- specia care produce la om mai multe afeciuni acute (angin, otit medie, scarlatina, erizipelul etc.) ajunge n lapte prin contaminarea acestuia de ctre persoanele bolnave, convalescente i purttorii asimptomatici. Acest lapte, consumat proaspt sau insuficient tratat termic, poate fi surs de infecii sporadice sau epidemice pentru om. Bacteria este distrus prin pasteurizare nct cazurile de streptococie la om consecutiv consumului de lapte sunt n exclusivitate consecina consumului de lapte crud i lapte contaminat dup pasteurizare. Produsele lactate fabricate din lapte crud sau insuficient tratat termic pot fi, de asemenea, contaminate cu aceast bacterie dar, sensibilitatea ei crescut la procesele biochimice ce se desfasoara n produsele lactate fac ca aceste sortimente s aib au un rol minor n mbolnavirea omului. Diplococcus pneumoniae, o specie implicat frecvent n etiologia infeciilor respiratorii la om, este incriminat i n producerea unor cazuri de mamit la vaci dar transmiterea la om prin consumul de lapte nu a fost suficient demonstrat. Salmonelele Contaminarea laptelui i produselor lactate cu agenii febrelor tifoide i paratifoide (Salmonella typhi, S. paratyphi) se face n mod direct sau indirect (ap, mute, recipiente contaminate) exclusiv de purttorii umani deoarece aceste bacterii nu sunt patogene n mod natural pentru animalele i prin urmare ele nu constituie surse de contaminare a laptelui. Ajunse n lapte, la temperaturi mai mari de 15C (laptele nercit imediat dup recoltare) salmonelele se pot multiplica destul de repede, realiznd n scurt timp concentraii periculoase pentru consumatori. Smntna, untul i brnzeturile au fost gsite responsabile de unele epidemii de febr tifoid. De regul, salmonelele din brnzeturi mor n 2-3 sptamni, mai ales cele localizate n straturile superficiale. nafar de salmonele patogene n exclusivitate pentru om i serotipurile abortigene (S.abortus ovis, S.abortus equi), majoritatea salmonelelor patogene pentru animale se pot transmite la om prin intermediul alimentelor contaminate producnd toxiinfecii alimentare. Contaminarea laptelui cu salmonele se realizeaz prin excretarea aestora n lapte de ctre vacile bolnave dar mai ales n mod indirect, prin fecalele vacilor bolnave sau purtatoare de germeni, prin ustensile, manipulatori i mute. Mai multe varieti de brnzeturi au fost incriminate n producerea toxiinfeciilor salmonelice dei au fost fabricate din lapte pasteurizat. Aceasta denot o contaminare a laptelui dup pasteurizare sau a produselor lactate n timpul procesrii. Persistena salmonelelor n brnzeturi este influenat de nivelul pH-ului i de calitatea culturilor starter dar nu i de concentraia de clorur de sodiu. Astfel, n brnza de vaci cu pH 4,1-4,4 salmonelele mor dup 3-7 zile dar supravietuiesc i se multiplic n brnzeturlile cu 8% NaCl. S-a constatat c o concentraie de 3% NaCl are chiar un uor efect stimulator asupra multiplicarii.
94

Shigelele. Laptele vehiculeaz frecvent specii de Shigella (S. flexneri, S. sonnei). Literatura menioneaz numeroase episoade de dizenterie bacilar (shigeloz) produse prin consumul de lapte contaminat. n toate cazurile s-a demonstrat c shigelele din lapte proveneau de la persoane purttoare, care prelucrau sau manipulau laptele.: Aceste bacterii se pot multiplica n laptele pstrat la temperaturi mai mari de 15C, multiplicarea fiind mai intens n laptele pasteurizat dect n laptele crud, din cauza lipsei florei concurente. Escherichia.coli enteropatogen (EPEC) EPEC grupeaz tulpini de E.coli care provoac diaree la om (mai frecvent la copii) ca urmare a atarii celulelor bacteriene prin intermediul fimbriilor la suprafaa vilozitilor intestinale, urmate de distrugerea acestora. Din cauza mecanismului patogenetic, aceast grup de colibacili mai este denumit i AEEC (attaching-effacing E.coli). Tulpini de Ecoli enteropatogene pentru copii se izoleaz deseori din laptele vacilor cu mamite i fecalele vieilor cu diaree alb. Laptele pasteurizat i produsele lactate sunt uneori contaminate de persoanele purtatoare de EPEC, care le manipuleaz n condiii necorespunztoare de igien. n prezent, determinarea prezenei i a numrului de bacteriilor coliforme se face cu regularitate att la laptele materie prim ct i la cel pasteurizat .. Bacilii tuberculozei Tuberculoza animalelor productoare de lapte pentru consum uman este determinat de specia Mycobacterium bovis, care este patogen i pentru om Dei bacteria se elimin prin lapte, transmiterea bolii este posibil doar prin consum de lapte crud, deoarece bacteria moare la temperaturi care inactiveaz fosfataza alcalin (63-650C15minute; 700C3 minute). Prin urmare, att pasteurizarea aplicat n unitile de prelucrare a laptelui ct i fierberea efectuat n gospodriile individuale sunt metode eficiente de prevenire a transmiterii tuberculozei pe aceast cale. Bacteria este prezent n smntna, untul i brnzeturile preparate din lapte crud contaminat. Ienitea i col. urmrind timpul de supravieuire a bacilului tuberculozei tip bovin n brnza telemea fabricat din lapte contaminat experimental, au constatat ca bacilul era viu i infectant pentru cobai dup 60 de zile de la fabricarea brnzei. La 76 de zile de la fabricare, bacilul nu a mai putut fi pus n evidena prin inoculri la cobai. Acelai colectiv, civa ani mai trziu, constata c M. bovis era nc viu i infectant pentru cobai dup 240 zile n untul obinut din smntna contaminat experimental. Pentru eradicarea aceastei zoonoze grave, n numeroase ri, printre care se numr i ara noastr, efectivele de taurine sunt controlate prin teste alergice i serologice n scopul depistrii animalelor bolnave i instituirii unor msuri eficiente de prevenire a transmiterii la om.
95

Leptospirele Laptele ar putea constitui un mijloc de transmitere a leptospirozei la om, n special cnd provine de la vaci i capre cu mamite leptospirice i cnd este consumat crud, la scurt timp dupa mulgere. Contaminarea laptelui se poate face de asemenea prin oameni bolnavi sau purtatori de leptospire. Ajunse n lapte, leptospirele dispar odata cu creterea aciditatii i datorit existenei unui factor care determin liza acestora. Acest factor persist n laptele conservat la 4C timp de 2 luni i rezista 5 minute la 80C.. Leptospirele, eventual prezente n lapte, sunt n mod sigur omorte n timpul pasteurizarii deoarece prezint o termosensibilitate crescut. Listeriile Serotipurile de L.monocytogenes patogene pentru animale (bovine, ovine, caprine) sunt n egal msur patogene i pentru om. Investigaiile epidemiologice ale unor episoade de toxiinfecie alimentar cu L.monocytogenes au incriminat consumul de lapte crud nepasteurizat dar i laptele pasteurizat care nu a fost n prealabil centifugat. Deoarece listeriile eliminate prin laptele vacilor bolnave se pot gsi n stare fagocitat, ele rezist n interiorul fagocitelor 33 minute la o pasteurizare la 61,7C, de unde rezult necesitatea unui tratament termic mai sever (Brzoi D., 1999; Apostu S., 2008). La temperatura frigiderului listeriile prezente n lapte i produsele lactate contaminate se pot multiplica deoarece sunt germeni criofili. Rickettsiile Principala boal produs de aceste bacterii la om este febra Q., o zoonoz destul de raspndit, rile indemne fiind foarte rare. Principalele surse de Coxiella (Riekettsia) burneti agentul etiologic al acestei boli sunt animalele de lapte: bovinele, ovinele i caprinele. Potrivit datelor din literatura de specialitate, n zonele unde febra Q exista la animale, laptele crud i chiar pasteurizat este contaminat cu C.burneti ntr-o proporie foarte mare. Animalele infectate elimin bacteria prin lapte pe parcursul a luni de zile, chiar pn la 2 ani. Cantitatea de germeni din lapte variaz de la o zi la alta iar ugerul bolnav i laptele contaminat nu prezint, de obicei, modificri vizibile. C.burnetii este relativ termorezistent (30 minute la 630C i 60 minute la 700C ), motiv pentru care poate fi gsit n produsele lactate fabricate din asemenea materie prim. n produsele lactate pstrate la congelator (de ex. n unt) bacteria supravieuiete foarte mult timp (peste 2 ani la-20C). n privinta supravieuirii acestei bacterii n brnzeturi nu exist date suficiente. Cu toate acestea, brnzeturile preparate din lapte crud trebuie s fie considerate o posibil surs de infecie n febra Q. Procesul de acrire a iaurtului omoar germenul n 24 ore. Brucelele
96

Bruceloza este un exemplu de zoonoza clasic. Agenii etiologici Br.melitensis i B.,abortus se pot transmite la om prin consum de lapte dei cile obinuite de infecie sunt contactul cu esuturile i secreiile animalelor infectate i inhalarea prafului contaminat cu brucele. Specia cea mai periculoasa pentru om este Br.melitensis, care nu a fost depistat n ara noastr. Bacteria este prezent n efectivele de capre din regiunea mediteranean, din zona de sud a Rusiei, vestul Asiei, America Latin i alte zone. 3. CULTURILE SELECTIONATE FOLOSITE LA FABRICAREA PRODUSELOR LACTATE 3.1 Scopul folosirii culturilor selectionate la prepararea brnzeturilor i laptelui fermentat Scopul principal al folosirii culturilor selectionate de bacterii lactice este acela de a produce acid lactic din lactoza prezent n lapte. n laptele fermentat, prezena acidului lactic previne dezvoltarea microorganismelor nedorite i i d aroma acid. n alte produse cum sunt crema de brnz, smntna fermentat, untul i altele, aciditatea produs de bacteriile lactice este necesar pentru dezvoltarea compuilor aromatici. Astfel, speciile de Leuconostoc i Streptococcus lactis subsp.diacetylactis produc substane aromatice (diacetil, acid acetic) din acidul citric prezent n mod normal n lapte. La brnzeturi, bacteriile lactice inhib dezvoltarea microorganismelor nedorite, care pot da produsului finit diferite defecte de arom, structur i aspect sau sunt duntoare sntii omului. n plus, aciditatea grbete aciunea pepsinei i favorizeaz eliminarea zerului din coagul. Scderea coninutului n ap mrete capacitatea de pstrare a brnzei. Flora lactic are i o activitate proteolitic moderat, transformnd proteinele n aminoacizi i ali compui, contribuind n acest mod la mbuntirea aromei i texturii produsului finit. nafara bacteriilor lactice amintite se mai folosesc bacteriile propionice, care transform acidul lactic n acid propionic, acid acetic i dioxid de carbon. Ele se folosesc n special la fabricarea brnzei Schweizer. Acizii propionic i acetic contribuie la formarea aromei caracteristice acestui sortiment ("de nuc"), iar dioxidul de carbon formeaz gurile sau "ochiurile" caracteristice. Pentru fabricarea unor brnzeturi se folosesc anumite specii de mucegaiuri. Astfel, la fabricarea brnzei Camembert se foloseste Penicillium camemberti, care se dezvolt numai la suprafa dar produce enzime proteolitice extracelulare care invadeaz interiorul brnzei i produc nmuierea pastei. Prin metabolizarea de ctre acest mucegai a acidului lactic i prin descompunerea proteinelor are loc o cretere a pH-ului i apariia unor componeni amoniacali ce confer produsului aroma caracteristic. Unele tulpini de P.camemberti pot produce micotoxine (acid ciclopiazonic), motiv pentru care se impune verificarea lor nainte de a le introduce n producie.
97

Penicillium roqueforti se folosete la prepararea brnzei Roquefort n asociaie cu bacteriile lactice. Sporii acestor mucegaiuri se adaug ca i bacteriile lactice n lapte nainte de coagularea lui. Dup formarea i ntrirea brnzei, aceasta se perforeaz n numeroase locuri cu ace speciale pentru a permite patrunderea aerului necesar dezvoltarii sporilor de mucegai din masa produsului. Pentru dezvoltare, mucegaiul folosete o parte din acidul format n brnz iar pH-ul acesteia crete pn la neutralitate. Dezvoltarea mucegaiului este nsotit de formarea gustului i aromei caracteristice datorit proceselor proteolitice i lipolitice induse de enzimele acestuia. nafara efectelor menionate mai sus, culturile folosite pentru fabricarea produselor lactate mresc i capacitatea lor de conservare prin concurarea eficient a microflorei de alterare datorit scderii pH-ului i prin producerea de perhidrol (H2O2), n special de unele specii de lactobacili. 3.2 Efectul culturilor selectionate asupra calitii nutritive a produselor lactate In general, se admite c produsele lactate preparate cu adaos de culturi bacteriene selectionate au calitatea nutritiv aproximativ egal cu aceea a laptelui materie prima din care sunt obinute. Aceast prere este real numai n parte, deoarece prin aciunea florei lactice asupra laptelui, acesta i amelioreaz calitile nutritive. S-a constatat c iaurtul i smntna fermentat conin cantiti mult mai mari de acid folic i acid nicotinic n comparaie cu laptele i smntna materie prim din care provin. Cantitatea altor componente ale materiei prime ramne neschimbat sau scade uor n produsele fermentate aa cum este cazul unor vitamine din complexul B , care sunt consumate de bacteriile lactice ca factori de cretere. Proteina din iaurt este de doua ori mai digestibil dect cea din laptele crud, sporul n greutate al obolanilor alimentai cu iaurt n scop experimental fiind mai mare dect al celor hraniti cu lapte crud. Unele sortimente de lapte obinute utiliznd culturi selecionate de lactobacili sunt folosite ca alimente dietetice i terapeutice. Astfel, consumul de lapte acidofil duce la popularea tractului intestinal cu Lactobacillus acidophilus, care concureaz flora patogen din tractusul intestinal, fiind indicat n combaterea tulburrilor gastro-intestinale. Mai mult, sa demonstrat c dezvoltarea tumorilor induse experimental n cavitatea peritonal a oarecilor hrnii cu iaurt este inhibat. 6.1.2 Microbiota crnii n sens strict, carnea reprezint tesutul muscular al mamiferelor cu "carne rosie". Muschiul este format din elemente miofibrilare contractile i proteine sarcoplasmatice solubile. Tesutul conjunctiv reprezint mai mult de un sfert din greutatea muschiului iar grsimea, aproximativ o treime. n sens larg, aa cum este denumit legal i comercial, carnea include pe lng
98

esutul muscular, oasele pe care se inser i organele comestibile Compozitia chimica aproximativ a musculaturii mamiferelor adulte, dup ce a intrat n rigiditate, este urmatoarea: - ap 75% - proteine 19% - grsime 2,50/0 - hidrai de carbon 1,2% (glicogen 0,1%, glucoza+fosfat 0,2%, acid lactic 0,9%) - diferite substane solubile ....l,65% (aminoacizi, creatina, P, K s.a.) - vitamine (majoritatea vitaminelor din grupa B). Coninutul mare n ap i prezena tuturor elementelor biogene confer crnii calitile unui bun mediu de cultur, n special pentru bacterii. Din acest cauz carnea este un produs perisabil, fiind foarte sensibil la alterarea microbian i este implicat n rspndirea unor boli infecioase i declanarea toxiinfeciilor alimentare. Dei carnea reprezint un mediu favorabil multiplicrii microorganismelor, unele modificri fizico-chimice care au loc dup tierea animalelor, inhib aceasta multiplicare o perioada de timp. Valoarea pH-ului crnii variaz n mod natural de la 7,0 ct este imediat dup tiere pan la 5,0. Valorile mai mici de 5,5 sunt nefavorabile dezvoltarii microbiene prin ele nsele. pH-ului crnii este invers proporional cu cantitatea de acid lactic produs n urma glicolizei musculare ce are loc post mortem. La rndul ei, cantitate a de acid lactic depinde de cantitatea de glicogen din muschi n momentul morii. Muchiul nesupus efortului nainte de tierea animalului conine o cantitate apreciabil de glicogen, care va fi convertit treptat in acid lactic, datorit cruia va avea un pH n jur de 5,5, iar textura, culoarea, aspectul i consistena lui vor fi normale. Dac nainte de tiere animalele au fost stresate sau supuse unor eforturi susinute, cantitatea de glicogen din muchi este mai mic, iar pH-ul crnii, rezultat n urma glicolizei, va fi relativ mare (mai mare de 6,2). n acest caz, muschiul va oferi condiii propice multiplicrii microorganismelor fiind impropriu pentru conservare. Potenialul oxido-reductor al crnii influeneaz, de asemenea, n mare masur microorganismele ce o contamineaz. Sacrificarea animalului este urmat de suprimarea aportului de oxigen la nivelul musculaturii i, ca urmare, coninutul n oxigen i potenialul oxido-reductor scad treptat. Din aceast cauz, la cteva ore dup sacrificare masa de carne devine anaerob n profunzime . Ca urmare, n straturile superficiale ale crnii, n care care patrunde oxigenul din mediu, se va dezvolta o microflor aerob iar n interiorul ei, o microflor anaerob sau facultativ anaerob. Exist o relaie strns ntre numrul iniial de microorganisme ce polueaz carnea i momentul apariiei alterarii; cu ct numarul acestora este mai mare, cu att alterarea apare ntr-un timp mai scurt. Astfel, carnea de bovine
99

pstrat la 100 C se altereaza n 16 zile cnd este contaminat cu 10 3 germeni/cm2 i n 8 zile cnd contaminarea este de 105 germeni/cm2 . Profunzimea maselor musculare este, de regul, contaminat cu un numr foarte mic de bacterii, dintre care semnificaia cea mai mare pentru conservabilitatea i salubritatea crnii o prezint bacteriile din genul Clostridium. n mod normal, numarul de clostridii pe 1g carne din profunzime este de l germene la 10-100 g. Cu ct starea sanitar a animalului nainte de taiere este mai bun i procesul de tiere se face n condiii mai igienice, cu att numrul de clostridii din carne este mai mic. Speciile de clostridii mai frecvent ntlnite n carne sunt: C.perfringens, C.oedematiens, C.bifermentans, C.hystolyticum si C sporogenes. Prin urmare, se impune aplicarea unor mijloace de conservare care s previn alterarea crnii prin multiplicarea microflorei de contaminare. Conservarea se impune i pentru instalarea unor caracteristici organoleptice ale crnii, absente imediat dup taierea animalului: frgezimea, suculena, savoarea. Procesele biochimice care stau la baza acestor transformri constituie ceea ce numim ,,maturarea crnii, adic transformarea muchiului n carne. Principalele metode de conservare, care previn multiplicarea majoritaii bacteriilor de contaminare implicate in procesul de alterare a crnii sunt: - pstrarea crnii la temperaturi joase: refrigerare, congelare; - tratarea termic a crnii i introducerea ei n recipiente nchise ermetic, realizndu-se conserve de carne, - tratarea chimic prin folosirea unor substane sau amestec de substane cu efect conservant: clorura de sodiu, nitritul, ascorbaii, polifosfaii s.a.; - deshidratarea: - afumarea. Progresele nregistrate n ultimele decenii n privina tehnologiei de prelucrare, conservare i manipulare nu au nlaturat dect parial posibilitile de contaminare a crnii cu microorganisme de alterare sau patogene. n acelai timp, preteniile consumatorilor privind calitile organoleptice ale crnii au crescut, fiind mai ateni la modificrile de miros, arom, culoare, astfel nct calitatea microbiologic a crnii a devenit un factor de mare important n comercializarea ei. Sursele de contaminare a crnii Carnea conine o flor microbian foarte variat, dependent de posibilitile de contaminare n timpul vieii animalului i dup sacrificare Carnea destinat consumului public trebuie sa provin numai de la animale sntoase, cunoscut fiind faptul c o serie de boli infecioase ale animalelor se pot transmite la om prin contactul sau/i consumul de carne. n acest scop animalele destinate abatajului sunt supuse n prealabil unui examen sanitarveterinar de triere. Carnea animalelor sntoase, steril n timpul vieii acestora, sufer un un proces de contaminare n timpul tierii animalelor, a
100

depozitrii i manipularii carcaselor, prin contactul ei cu murdaria ongloanelor, prul, pielea, coninutul tubului digestiv, utilajele, ustensilele i suprafeele de lucru din unitatea de tiere i prelucrare, minile i mbrcmintea personalului, apa folosit la splarea carcaselor, aerul din spaiile de lucru i de depozitare. Contaminarea cea mai intens, cu semnificaie pentru conservabilitatea i salubritatea crnii are loc n timpul prelucrarii primare: sngerare, jupuire, splare, rcire i tranare. esutul muscular al carcaselor provenite de la animale sacrificate n condiii igienice este n general lipsit de microorganisme n profunzime sau este foarte slab contaminat (o celula microbian la l0g sau la 100g). Aceste microorganisme provin din tubul digestiv prin trecerea barierei intestinale n faza de agonie sau imediat dup sacrificare, urmat de vehicularea lor prin snge pn la nivelul maselor musculare i a diferitelor organe (ficat, rinichi, splin etc.) . Este ceea ce specialitii numesc "bacteriemia de abataj". Limfonodulii regionali (ganglionii limfatici) constituie o barier n calea microorganismelor de aceea sunt adesea contaminai, motiv pentru care nu se dau n consum uman. Invadarea musculaturii i a organelor cu bacterii din tubul digestiv, la nivele superioare celor mentionate mai sus, este favorizat de stresarea animalelor nainte de sacrificare, eviscerarea tardiv i sngerarea cu instrumente neigienizate. Animalele sunt supuse stresului n urmtoarele situaii: - transport pe distane mari de la unitatea de cretere-ngrare pn la abator cu mijloace de transport necorespunztoare, pe timp nefavorabil (caldur excesiv, ploaie, ger), fr opriri n scopul adprii; - stabulaia prelungit n padocurile abatoarelor, n condiii neadecvate sau, dimpotriv, nerespectarea repausului i a dietei nainte de sacrificare; - bruscarea animalelor pe parcurs i folosirea unor metode brutale de asomare. Factorii stresani constituie stimuli ce declaneaz o succesiune rapid de evenimente neuroendocrine prin care organismul ncearc s se adapteze la noile condiii. n faza incipient a stresului are loc o hipersecreie de adrenalin, urmat de stimularea circulaiei sanguine la nivelul musculaturii i reducerea glicogenului muscular. Totodat are loc reducerea circulaiei sanguine la nuvelul aparatului digestiv, care are drept consecin diminuarea imunitii locale (capacitatea de protecie antiinfecioas a diferitelor structuri anatomice i funcii) i ptrunderea microorganismelor din tubul digestiv n circulaia general, nainte, n timpul i imediat dup sacrificarea animalelor stresate . Bacteriile, ajunse pe aceast cale la nivelul musculaturii cu un coninut redus de glicogen, vor gsi un pH optim pentru multiplicare (6,4 - 7,0),. Prin urmare, carnea provenit de la animalele stresate este predispus alterrii rapide. Eviscerarea tardiv sau neigienic favorizeaz invadarea esutului muscular i organelor cu microorganismele prezente n coninutul tubului digestiv. Din aceast cauz eviscerarea trebuie executat n maximum 30 minute
101

de la sngerare. Ea trebuie facut cu cea mai mare atenie pentru a se evita ruperea stomacului, intestinelor i vezicii urinare. Sngerarea (njunghierea) cu instrumente neigienizate. Cutitele de sngerare neigienizate pot conine pe lam milioane de microorganisme. Ele pot ptrunde n snge n timpul njunghierii, ajungnd astfel n masele musculare unde iniiaz alterarea profunda a carnii, dac nu se iau msuri pentru racirea ei rapid. Contaminarea superficiala a carcase lor esteinevitabil, nivelul acestei contaminari fiind variabil n raport de condiiile de sacrificare. n condiii igienice corespunzatoare, carcasele au un nivel de contaminare superficial de ~103 104 microorganisme/cm2. Contaminarea superficiala a carcaselor are loc in timpu1 jupuirii, apoi prin atingerea lor cu diferite suprafee de lucru, ustensilele de tranare, minile muncitorilor, echipamentul de protecie al acestora, neigienizate. O parte din microf1ora prezent pe suprafaa carcaselor poate proveni din aerul contaminat al ncperilor de lucru sau depozitare. Condiiile de mediu, n special temperatura crescut i umiditatea, permit microflorei existente s se multiplice i s produc, ntr-un timp relativ scurt, alterarea (putrefacia) crnii prin proteoliz enzimatic. Putrefactia superficiala este tipul de alterare cel mai frecvent. Ea se manifesta printr-un miros dezagreabil, ntepator, amoniacal, ihoros, produs de amestecul mai multor produi volatili ce iau nastere. La scurt timp dup apariia mirosului (mai multe ore - cteva zile) apare pe suprafaa crnii un mucus lipicios caracteristic (mzga) sub forma unui film fin, de culoare albicioas, albgalbuie sau alb-verzuie. Microorganismele care iau parte la procesul de putrefacie se succed n funcie de condiiile favorabile multiplicrii, existente la un moment dat. Astfel, bacteriile aerobe i anaerobe facultativ, cum sunt micrococii, streptococii, speciile aparinnd genurilor Pseudomonas, Proteus, Achromobacter, bacilii sporulai aerobi (Bacillus subtilis, Bacillus mycoides) intervin primele, consumnd oxigenul de la suprafa i crend condiii favorabile dezvoltrii bacteriilor anaerobe din genul Clostridium, responsabile de alterarea profund a crnii.. Putrefacia crnii poate avea loc i la temperaturi sczute, cnd intervin bacteriile psihrofile (criofile) i mucegaiurile din genurile Mucor, Penicilium, Aspergillus, Cladosporium etc. Prin intermediul crnii contaminate se pot transmite la om numeroase boli infecioase (antraxul, tuberculoza, salmoneloza, rujetul, bruceloza, tularemia, morva i altele) i se pot declana episoade de toxiinfecii alimentare, n principal, cu .Salmonella spp., S. aureus, Y.enterocolitica, Campylobacter jejuni, C.perfringens . Pentru prevenirea lor se impun urmatoarele msuri: - controlul sanitar veterinar atent al animalelor nainte i dup tiere, - asigurarea condiiilor de igien la tierea animalelor i la manipularea crnii,
102

- refrigerarea rapid i continu a carcaselor, de preferat la temperaturi apropiate de OC, deoarece majoritatea bacteriilor patogene care se pot transmite la om prin consumul de carne nu se pot multiplica la temperaturi mai mici de 5C. 6.6.3 Microflora oulor La depunere, oule psrilor sntoase sunt sterile. Ele se contamineaz ulterior cu microorganismele din cuibare sau de pe grtare i n timpul manipulrii. De pe coaja oulor proaspete se izoleaz frecvent bacterii din genurile Proteus, Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Escherichia, etc. Ca o consecin a nvechirii oulor, aceste bacterii ptrund n interior determinnd alterarea coninutului prin putrefacie (Grecianu Al., 1986; Mnescu S., 1989). Alterarea prin mucegire apare sub form de pete colorate pe faa intern a cojii i pe glbenu. Mai frecvent implicate n mucegirea oulor sunt genurile: Cladosporium, Penicillium, Sporotrichum i Mucor. n albuul oului proaspt, microorganismele sunt absente sau n numr foarte redus, datorit aciunii bactericide a lizozimului (ferment glucidolitic activ fa de bacteriile Gram pozitive), care se gsete n cantitate apreciabil. Dintre bacteriile patogene pentru om, mai frecvent vehiculate prin ou sunt salmonelele, deoarece pot fi transmise pe cale vertical de psrile purttoare, in principal palmipedele (raa, gasca). Consumul de ou contaminate cu salmonele, ca atare sau sub form de preparate neprelucrate sau insuficient prelucrate termic, constituie o cauz frecvent a toxiinfeciilor alimentare.

6.7.2.1 ASPECTE ALIMENTARE

GENERALE

PRIVIND

TOXIINFECIILE

Principalele relaii conflictuale macro-microorganism sunt boala infectioasa (infecia) (lat. inficere = a otrvi, a deteriora) i toxiinfecia alimentar. Att boala infecioas ct i toxiinfecia alimentar constituie interrelaii dinamice, la apariia i evoluia crora particip activ ambii parteneri: microorganismul prin mecanismele sale de patogenitate i organismul-gazd prin mecanisme de aprare antiinfecioas. Numeroi factori endogeni i de mediu pot influena aceast relaie de tip conflictual n favoarea unuia sau a celuilalt partener. n sens larg, prin infecie se nelege ptrunderea pe diverse ci (respiratorie, digestiv, cutanat) i multiplicarea microorganismelor patogene n
103

organismele cu organizare superioar, precum i reacia de rspuns pe care o provoac acestora. Majoritatea bolilor provocate de ingerarea alimentelor i apei contaminate cu microorganisme i/sau toxinele lor sunt considerate toxiinfecii alimentare (TIA) i reprezint o problem major de sntate public n ntreaga lume. n general, TIA sunt definite ca boli de natur microbian i origine alimentar , cu manifestri predominant gastrointestinale acute (grea, vom, diaree) i, uneori i neurologice, care apar ntr-un interval scurt de timp (1-72 ore) la dou sau mai multe persoane care au consumat din acelai aliment sau aceeai butur. n noiunea de TIA sunt incluse urmtoarele grupe de boli: a. Infeciile alimentare produse de ageni infecioi ingerai prin intermediul alimentelor i care se multiplic la nivelul epiteliului intestinal determinnd leziuni nsoite de tulburri gastrointestinale. De exemplu, gastroenterita acut viral. b. Toxiinfeciile alimentare propriuzise, produse de bacterii i parazii care i exercit aciunea patogen n acelai timp prin invazie i toxinele pe care le elaboreaz att n aliment ct i n organismul bolnavilor. Exemple: gastroenteritele produse de Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, toxoplasmoza, trichineloza .a. c. Intoxicaiile de origine microbian n care tulburrile sunt determinate de prezena n alimentul ingerat a toxinelor preformate ca urmare a multiplicrii n aliment a unor bacterii (Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) i micei productori de micotoxine sau a acumulrii n esuturile comestibile ale unor vieuitoare marine (peti, molute etc.) a toxinelor prezente n organismul unor protozoare cu care acestea se hrnesc (intoxicaia cu pete ciguateric, intoxicaia paralitic cu molute bivalve), sau ca urmare a aciunii asupra propriilor esuturi a unor enzime bacteriene (intoxicaia scombriod ,tetrodointoxicaia). n ambele situaii, toxinele incriminate sunt produse de microorganisme i ajung n organismul omului prin ingerarea alimentelor n care se gsesc, ceea ce justific includerea acestor mbolnviri n grupa toxiinfeciilor alimentare. Bolile de origine alimentar de natur nemicrobian, cum sunt intoxicaiile cu metale grele, cu substane pesticide, nitrii, ciuperci otrvitoare nu sunt incluse n grupa TIA , prezena substanelor toxice implicate n asemenea cazuri neavnd nici o legtur cu factorul microbian.
104

Unele boli infecioase ale animalelor ca antraxul, leptospiroza, bruceloza, tuberculoza, ricketsiozele .a., dei se pot transmite la om prin consum de alimente de origine animal nu sunt considerate TIA deoarece transmiterea lor se realizeaz n mod obinuit pe alte ci (contactul direct cu animalele bolnave sau produsele lor, leziunile cutanate, mucoasele respiratorii), tabloul clinic este mult mai complex i cuprinde manifestri specifice fiecrei boli. Poarta de intrare digestiv este una mai puin obinuit pentru agenii microbieni care detrmin aceste boli deoarece carnea i laptele acestor animale nu ajung, de obicei, n consum uman; animalele sunt diagnosticate n prealabil i produsele lor, excluse din consumul public. Spre deosebire de bolile infecioase amintite, TIA nu apar prin simplul contact al omului cu alimentul contaminat ci, numai prin ingerarea acestuia. Ali factori care condiioneaz apariia TIA, pe lng calea oral de ptrundere a microorganismelor sau toxinelor microbiene, sunt cantitatea mare de germeni i/sau toxin din aliment i ingerarea unei cantiti relativ mari din alimentul contaminat. n aceste situaii aciditatea gastric, care distruge microorganismele ingerate n mod obinuit, nu mai este eficient. Pe lng aciditatea gastric, la nivelul stomacului i intestinului indivizilor sntoi acioneaz i unele bariere fizice i biologice antimicrobiene, cum sunt: - integritatea mucoaselor i stratului de mucus, sistemul de protecie antiinfecioas local (sistemul imun) reprezentat de anticorpii de tip IgA i celule imune, care se opun invazivitii microorganismelor; motilitatea intestinal, care realizeaz ndeprtarea continu a microorganismelor enterice i a toxinelor; microbiota intestinal autohton, care, n condiii fiziologice antagonizeaz eficient microorganismele alohtone patogene prin colonizarea mucoaselor i prin produii lor de metabolism; Majoritatea germenilor patogeni de origine alimentar colonizeaz numai n condiii anormale aprute la nivelul diferitelor segmente ale tubului digestiv. Prin urmare, TIA sunt favorizate de disfunciile acestor bariere, n principal de reducerea aciditii gastrice i disbiozele intestinale - dezechilibrele n structura microbiotei autohtone, cum sunt cele create de administrarea dozelor mari i prelungite de antibiotice pe cale oral, care distrug o parte din microflora intestinal normal. Un alt factor important dependent de gazd, care condiioneaz apariia TIA , este prezena receptorilor din mucoasa intestinal, care permit ataarea specific a germenilor microbieni i toxinelor. Persoanele lipsite de asemenea receptori nu contracteaz infecia specific receptorului. Imunodeficiena de diferite tipuri reprezint, de asemenea, un factor de risc major dependent de gazd. Persoanele afectate de SIDA (Sindromul Imunodeficienei Dobndite) sunt primele victime i fac forme clinice grave n cazul multor TIA. Factorii de risc microbieni n apariia TIA sunt reprezentai de capacitatea microorganismelor de a coloniza mucoasa intestinal (de a se fixa pe
105

receptori celulari specifici ), de a invada structurile pereilor intestinali i de a sintetiza toxine. Factorii de ataare i colonizare sunt reprezentai de fimbriile bacteriene, unele lipopolizaharide i proteine din structura membranei externe a peretelui celular la bacteriile Gram negative, acizii lipoteihoici la bacteriile Gram pozitive (vezi cap. Noiuni de bacteriologie general), IgA proteazele (enzime care asigur colonizarea prin clivarea anticorpilor IgA), .a. Colonizarea mucoasei intestinale este o condiie obligatorie a patogenitii microorganismelor enterale, deoarece mpiedic eliminarea acestora odat cu coninutul intestinal sub aciunea peristaltismului. Invazivitatea este capacitatea unor virusuri enterice (rotavirusurile), a unor bacterii (Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC) i enteropatogen (EPEC), Shigella spp., Salmonella spp..a.) , i a unor parazii (Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. .a.) de a invada i de a distruge epiteliul intestinal, alternd asfel absorbia normal a lichidelor i producerea de enzime digestive. Toxinele cele mai importante produse de microorganismele implicate n TIA sunt enterotoxinele i neurotoxinele. Enterotoxinele constituie un grup particular de toxine, implicate n majoritatea toxiinfeciilor alimentare (Brzoi B., Meica S., Negu S., 1999). Ele sunt elaborate de specii bacteriene Gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium sordellii), dar mai ales de bacterii Gram-negative: Escherichia coli enterotoxigen (ETEC) i enterohemoragic (EHEC), Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp., Shigella dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Campylobacter jejuni etc. n general, enterotoxinele acioneaz direct asupra mucoasei intestinale, determinnd fenomene citotoxice i distructive (liza i descuamarea enterocitelor) sau tulburri funcionale, care modific fluxul apei i ionilor prin bariera epitelial. Dereglrile funcionale sunt cauzate de activarea enzimelor adenilatciclaza sau guanilat-ciclaza din membrana celular, urmat de creterea cantitilor de AMPc (adenozin-monofosfat ciclic), respectiv GMPc intracelular. Consecina acestei acumulri este inversarea polaritii funcionale a enterocitului, care, din celul absorbant devine celul excretoare de ap i electrolii (Na+, Cl-). Alterrile histologice i funcionale produse de enterotoxine se traduc, din punct de vedere clinic, printr-o diaree abundent. Neurotoxinele sunt exotoxine cu tropism pentru esutul nervos, determinnd tulburri n transmiterea influxului nervos ctre organele efectoare. Principalele specii implicate n TIA, productoare de neurotoxine sunt Clostridium botulinum (toxina botulinic) i Shigella dysenteriae (toxina shiga).

106

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

BRZOI D., MEICA S., NEGU M., 1999 Toxiinfeciile alimentare. Editura Diacon Coresi, Bucureti. BUIUC D.,NEGU M., 1999 Tratat de microbiologie clinic. Editura Medical. CARP-CRARE M.,1991 Microbiologie. Curs. Institutul Agronomic ,,Ion Ionescu de la Brad Iai. CARP-CRARE M., 2001 Microbiologie veterinar. Virusologie. Casa de Editur Venus. Iai. COMAN I.,BRHAL HELENA-MARIA, FLORESCU RODICA, 1997 Decontaminarea. Vol.I. Editura Satya. Iai. DUCA EUGENIA, 1974 Microbiologie medical. Editura Didactic i Pedagogic. Bucureti. DUCA EUGENIA, DUCA M., FURTUNESCU G., 1979 Microbiologie medical. Editura Didactic i Pedagogic. Bucureti. GRECIANU Al., 1986 Microbiologie general i imunologie. Curs. Institutul Agronomic ,,Ion Ionescu de la Brad Iai. HART T., SHEARS P., 1997 Atlas de poche de microbiologie. Mdicine Sciences. Flamarion. Paris. IVANOF A., CIUPE M., SAC C., VANCEA DOINA, 1982 Microbiologie. Editura Didactic i Pedagogic. Bucureti. LARPENT J. P., 2000 Listeria. Technique & Documentation Lavoisier. Paris. LARPENT J. P. , LARPENT GOURGAUD M., 1990 Mmento technique de microbiologie. Technique & Documentation Lavoisier. Paris. MNESCU S., 1989 Microbiologie sanitar. Editura Medical. Bucureti. MZREANU C., 1999, - Microbiologie general. Editura Alma Mater. Bacu. RAICU P., STOIAN V., 1989 Gene i cromozomi. Editura tiinific i enciclopedic. Bucureti. RPUNTEAN GH., RPUNTEAN S., 1999 Bacteriologie special veterinar. Tipo Agronomia Cluj-Napoca. STAMATIN N., 1965 Microbiologie i imunologie veterinar. Editura Didactic i Pedagogic. Bucureti.
107

TMA V., ERBAN M., COTRU MARIA, 1981 Biochimie medical veterinar. Editura Didactic i Pedagogic. Bucureti. TOPAL D. N., 1978 Microbiologie general. Vol.II. Universitatea ,,Al. I. Cuza Iai. TORTORA J.,G., FUNKE R., B., CASE L. CHRISTINE, 1997 Microbiology. An introduction. Sixth edition. Benjamin/ Cummings Publishing Company. California. ZARNEA G., 1963 Microbiologie. Editura Didactic i Pedagogic. Bucureti. ZARNEA G., 1970 Microbiologie general. Editura Didactic i Pedagogic. Bucureti. ZARNEA G., 1983 Tratat de microbiologie general. Vol.I. Editura Academiei Republicii Socialiste Romnia. ZARNEA G., 1984 Tratat de microbiologie general. Vol.II. Editura Academiei Republicii Socialiste Romnia. ZARNEA G., 1986 Tratat de microbiologie general. Vol.III. Editura Academiei Republicii Socialiste Romnia. ZARNEA G., 1994 Tratat de microbiologie general. Vol. V. Editura Academiei Romne.

108

NTREBRI RECAPITULATIVE CAPITOLUL I 1. Care este obiectul de studiu al microbiologiei ? 2. Care sunt caracterele distinctive ntre principalele categorii de microorganisme? 3. Care este poziia microorganismelor n sistematica biologic? 4. Cine este considerat fondatorul medicinei raionale i de ce? 5. Cine a efectuat primele obsrvaii i descrieri ale microorganismelor, bazate pe examenul microscopic? 6. Care sunt meritele savanilor Louis Pasteur i Robert Koch n constituirea microbiologiei ca tiin i progresele ei? 7. Cine este fondatorul colii romneti de microbiologie i n ce const aportul su la dezvoltarea microbiologiei? 1. CAPITOLUL II Care sunt formele de existen a bacteriilor n natur? 2. Ce semnificaie are conceptul de specie bacterian? 3. Ce forme pot avea bacteriile I cum se grupez celulele bacteriene la unele specii? 4. ntre ce limite variaz dimensiunile celulelor bacteriene? 5. Care sunt prile componente ale celulei bacteriene? 6. Care sunt structura i funciile membranei citoplasmatice? 7. Ce elemente morfochimice ale peretelui celular condiioneaz modul de colorare a bacteriilor prin metodele Gram I Ziehl-Neelsen? 8. Care este semnificaia biologic (rolul) peretelui celular? 9. Ce rol ndeplinete capsula bacterian ? 10. Ce structuri conine citoplasma celulei bacteriene i care este rolul lor? 11.Din ce se compune materialul genetic al bacteriilor? 12. Ce sunt cilii (flagelii) bacterieni i ce rol ndeplinesc? 13. Ce sunt pilii bacterieni, de cte feluri sunt i care este semnificaia lor biologic?
1. 109

Cte tipuri de bacterii exist n raport cu sursele de energie i carbon pe care le utilizeaz? 15. n ce constau catabolismul, respiraia i anabolismul la bacterii? 16. Pe ce cale se multiplic majoritatea speciilor bacteriene? 17. Care sunt fazele multiplicrii bacteriilor n mediile de cultur i particularitile generate de starea de agregare a mediului (lichid, solid)? 18. Care sunt particularitatilebiochimice, fiziologice si biologice ale sporului bacterian? 19. Cum se clasifica microorganismele in funcie de preferinele termice ? 20.Ce particularitate prezinta bacteriile osmofile (halofile, zaharofile)? 21.In ce consta plasmoliza si plasmoptiza bacteriilor? 22. Cum se clasifica bacteriile in funcie de comportamentul lor n raport cu valoarea presiunii hidrostatice ? 23.Ce efecte au asupra microorganismelor radiatiile UV si radiatiile ionizante si care sunt domeniile de aplicabilitate? 24.Pr ice se diferentiaza substantele antiseptice (antisepsia) de cele dezinfectante (respectiv, dezinfectia)?
14.

CAPITOLUL III Care sunt particularitile structurale ale celulei micotice, raportate la structura celulei bacteriene? 2. Care este structura fungilor filamentoi i care sunt prile distincte din punct de vedere morfo-fiziologic? 3. Prin ce se deosebesc levurile de fungii filamentoi? 4. Care sunt modalitile de multiplicare ale ciupercilor microscopice? 5. Ce rol ndeplinesc n natur miceii saprobioi? 6. Care sunt efectele favorabile ale ciupercilor microscopice valorificate in industria alimentelor? 7. Cum se clasific bolile produse de micei? 8. Care sunt cele mai importante micotoxine prin efectul lor asupra sanatatii omului si a animalelor ?
1.

CAPITOLUL IV 1. Care sunt formele de existen a virusurilor n natur i caracteristicile lor? 2. Ce forme i ce dimensiuni pot avea particulele virale? 3. Care sunt prile componente ale unui virus? 4. Pe ce ci ptrund i disemineaz virusurile n organism? 5. n ce const tropismul virusurilor i cum se clasific virusurile n funcie de tropism? 6. Care sunt etapele multiplicrii particulelor virale?
110

7. Care sunt efectele multiplicrii intracelulare a virusurilor ? 8. Cum se comport virusurile fa de temperatur, pH, radiaii i substanele dezinfectante? CAPITOLUL V Cum se clasific microorganismele dintr-un habitat lund drept criteriu prezena constant i numrul lor? 2. Care este provenienta microorganismelor din lapte? 3. Care sunt sursele de contaminare a laptelui dup recoltare ? 4. Care sunt microorganismele patogene transmisibile prin lapte ? 5. In ce scop sunt utilizate culturile selectionate si care sunt efectele acestora asupra calittiilor nutritive ale produselor lactate ? 6. Cum variaz pH-ul crnii dup sacrificarea animalelor i care sunt factorii care il influenteaz ? 7. Care sunt principalele metode de conservare, care previn multiplicarea majoritaii bacteriilor de contaminare implicate in alterarea carnii ? 8. Care sunt sursele de contaminare microbiologic a carnii ? 9. Cand are loc contaminarea cea mai intens, cu semnificaie pentru conservabilitatea i salubritatea crnii ? 10.Ce reprezint bacteriemia de abataj i care sunt factorii care o pot inflena ? 11.Care sunt msurile de prevenire a bolilor infecioase i toxiinfeciilor alimentare prin consum de carne contaminat cu microorganisme patogene? 12. Care este conditia microbiologica a oualor la depunere si cum evolueaza in timp? 13. Care sunt bacteriile patogene transmise frecvent prin intermediul oualor ? 14.Ce sunt toxiinfectiile alimentare si care boli sunt incluse in notiunea de TIA ? 15.Care sunt barierele chimice, fizice si biologice existente la nivelul stomacului si intestinelor care se opun colonizarii si multiplicarii microorganismelor patogene vehiculate de alimente si implicit, producerii de infectii si TIA ? 16. Care sunt factorii de risc microbieni n apariia TIA ?
1.

TEST (exemplificare)
111

1. Teoria miasmatic a infeciilor a fost elaborat de: a.Hipocrat b.Leeuwenhoeck c.Linee 2. Demonstreaz natura microbian a fermentaiilor i a infeciilor; a. Eduard Jenner b. Louis Pasteur c. Joseph Lister 3. Fondatorul colii romneti de microbiologie a fost: a. Ioan Cantacuzino b. Nicolae Stamatin c. Victor Babe 4. Bacteriile sunt microorganisme: a. unicelulare b. pluricelulare c. eucariote d. procariote 5. Nucleul celulei bacteriene este format: a. dintr-un singur cromozom b. 2-4 cromozomi 6. Capsula protejeaz bacteriile fa de: a. fagocitoz b. radiaiile ultraviolete c. desicaie (uscciune) 7. Mobilitatea bacteriilor se datoreaz: a. cililor b. pililor c. plasmidelor 8. Sediul sintezei proteinelor n celula bacterian l constituie: a. vacuolele b. ribozomii c. nucleul 9.Bacteriile autotrofe (litotrofe) utilizeaz ca surs de carbon: a. compuii organici ai carbonului b. compuii anorganici ai carbonului 10. Bacteriile chimioorganotrofe utilizeaz: a. energia luminoas b. energia rezultat din reaciile de oxidoreducere 11.Respiraia la bacterii const n: a. sinteza structurilor celulei bacteriene b. reacii de oxidoreducere prin care bacteriile i procur energia c. preluarea oxigenului din aer i eliminarea bioxidului de carbon 12. n funcie de natura chimic a ultimului acceptor de hidrogen, respiraia la bacterii este de trei tipuri:
112

1. 2. 3. 13. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplic prin: a. diviziune direct (sciziparitate) b. nmugurire c. spori 14. Fazele multiplicrii bacteriilor n mediile de cultur sunt: 1.. 2... 3. 4 15. n faza staionar a multiplicrii bacteriilor are loc: a. o multiplicare activ la fiecare 15-20 minute b. moartea logaritmic a bacteriilor c. o multiplicare de nlocuire 16. Sunt alctuii din celule care prin nmugurire generaz pseudomicelii: a. fungii levuriformi b. fungii filamentoi 17. Ciupercile microscopice se inmulesc prin: a. spori sexuai b. spori asexuai c. poriuni de miceliu 18. Sunt spori asexuai: a. bazidiosporii b. ascosporii c. blastosporii d. artrosporii e. conidiosporii 19. Asigur conservarea miceilor n condiii de mediu nefavorabile: a. ascosporii b. clamidosporii 20.Bolile produse de micei poart denumirea generic de ..iar cele produse de toxinele acestora , . 21. Virusurile au dimensiuni de ordinul: a. micrometrilor b. nanometrilor c. milimetrilor 22. Formele de existen a virusurilor n natur sunt: 1 2 3 23. Prile componente ale unui virus sunt: a. citoplasma
113

b. capsida c. membrana citoplasmatic d. genomul ADN sau ARN 24. Virusurile: a. dispun de echipament enzimatic i metabolism propriu b. nu dispun de enzime metabolice, din care cauz sunt parazite obligatoriu ntr-o celul vie 25. n funcie de histotropism, virusurile pot fi grupate astfel: 1.. 2.. 3... 4... 26. Virusurile : a. se multiplic prin diviziune direct (sciziparitate) b. sunt multiplicate de celulele n care paraziteaz 27. Multiplicarea virusurilor parcurge urmtoarele 4 etape: 1.. 2.. 3.. 4... 28. Efectul citopatic al multiplicrii virusurilor n celule const n : a. degenerare i moarte celulular b. multiplicarea anarhic a celulelor infectate c. apariia unor incluzii intracitoplasmatice sau intranucleare 29. Incluziile Babe - Negri din neuronii piramidali situai n cornul lui a. Amon apar n: a. turbare b. grip c. variola aviar 30. Substanele care acioneaz distructiv asupra virusurilor sunt: a. hidroxidul de sodiu b. formaldehida c. glicerina d. majoritatea antibioticelor 31. Microorganismele care populeaz n mod constant un biotop (habitat) constituie: a. microbiota autohton a biotopului b. microbiota alohton a biotopului 32. Glanda mamara a animalelor de lapte este contaminate cu microorganism, la nivelul: a. tesutului glandular b. mucoasei din treimea inferioara a canalelor galactofore

114

33. ncrctura microbian a laptelui este mai mare: a. n primele jeturi de lapte b. n ultimele jeturi de lapte 34. Microbiota normal a unui lapte igienic se compune din urmatoarele microorganisme : a. Lactobacillus (L. acidophilus, L.casei .a. ) i Streptococcus (S. lactis, S. cremoris, S. thermophilus etc.) b. Mycobacterium bovis, Brucella abortus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes 35.Laptele recoltat de la animalele sntoase : a. este steril b. conine 300-500 celule bacteriene /ml 36.Microflora normal a unui lapte igienic cuprinde bacterii aparinnd speciilor : a. Staphylococcus aureus, , Escherichia coli, Mycobacterium bovis b. Streptococcus lactis, S. Cremoris, Lactobacillus acidophilus, L. casei 37. Enterotoxina produsa de Staphylococcus aureus: a. este termostabila (termorezistenta) b. este inactivata prin pasteurizare 38 Specii lede fungi (mucegaiuri):utilizate pentru obinerea brnzeturilor Cammembert i Roquefort aparin genului: a. Aspergillus b. Penicillium c. Mucor 39. Invadarea musculaturii i a organelor cu bacterii din tubul digestiv, la nivele superioare bacteriemiei de abataj, este favorizat de: 1.. 2.. 3 40. Alterarea (putrefacia) crnii determinat de microorganisme poate avea loc: a. numai la temperaturi crescute i umiditate b. la temperaturi sczute 41. Oule proaspete conin microorganisme: a. la suprafaa cojii b. n albu c. n glbenu 42. Dintre bacteriile patogene pentru om, mai frecvent vehiculate prin ou sunt : a. salmonelele b. stafilococii c. bacilii tuberculozei
115

43. n noiunea de toxiinfecie alimentar (TIA) sunt incluse urmtoarele grupe de boli? a. infectiile produse de agenti microbieni ingerati odata cu alimentele si care se multiplica la nivelul epiteliului intestinal, nsoite de tulburri gastrointestinale; b. intoxicatiile de origine microbiana; c. intoxicatiile produse de ingerarea unor substante chimice (metale grele, pesticide etc.) d. intoxicatiile produse de ciupercile otrvitoare. 44. TIA sunt favorizate de: a. reducerea aciditii gastrice b. aciditatea gastric crescut 45.Favorizeaz TIA produse de bacterii: a. aciditatea gastric; b. aclorhidria i peristaltismul intestinal diminuat; c. microflora intestinal normal; 46. Microflora patogen poate coloniza tractusul digestiv: a. n prezena microbiotei normale b. n niele ecologice abandonate de microflora autohton; 47.Enterotoxinele bacteriene: a. acioneaz direct asupra mucoasei intestinale determinnd fenomene distructive i tulburri de absorbie; b. acioneaz n exclusivitate asupra SNC; c. acioneaz asupra musculaturii striate. 48. Care dintre metodele de sterilizare enumerate mai jos, realizeaz o sterilizare complet? a. fierberea b. autoclavarea c. pasteurizarea joas, medie i nalt d. ultrapasteurizarea (UHT) 49. Pasteurizarea UHT (Ultra High Temperature) const n: a. nclzirea lichidelor de sterilizat la 70-75 grade C, timp de 10-20 minute b. nclzirea lichidelor de sterilizat la 80-85 grade C, timp de cteva secunde c. nclzirea instantanee la 150 grade C prin injectarea vaporilor de ap supranclzii 50. Autoclavarea se realizeaz la urmtorii parametri: a. 180 grade C,; 1h; b. 1 atm , 120 grade C ; 30 minute; c. 100 grade C; 30 minute 51. Recoltarea probelor de alimente n scopul efecturii examenului microbiologic, se efectueaz:
116

a. n recipiente sterile, folosind instrumente sterile b. n cantitate de 100 grame sau mililitri, indiferent de mrimea lotului de alimente 52 NTG se calculeaz nmulind numrul coloniilor dintr-o plac cu ......................... 53. Mediile de cultur uzuale pentru bacteriile aerobe sunt:........................................................ 54. Bacteriile Gram pozitive se coloreaz n: a. rou b. violet c. verde

117