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UNIVERSITE JOSEPH FOURIER GRENOBLE I

MODULE BIO 241



Deuxime anne de LICENCE

(L2, S4)















ANNEE 2012-2013

TRAVAUX DIRIGES DE BIOCHIMIE

TD BIO 241 2012-2013 AVANT-PROPOS
1
AVANT-PROPOS

Ce fascicule est organis de faon illustrer les diffrents thmes abords en cours
magistral et en travaux pratiques. La prparation personnelle des exercices qui
ncessite une matrise pralable du cours est vivement recommande afin de tirer le
meilleur profit des sances de travaux dirigs.

La plupart des thmes sont prcds de quelques rappels thoriques des notions
abordes en cours et qui vous seront utiles pour rsoudre les exercices. En aucun
cas, ces rappels thoriques trs succincts ne remplacent le cours.

Les thmes 1 et 2 sont des rvisions des notions que vous devez avoir acquises en
Licence 1
re
anne dans le module BIO 121. Les thmes suivants illustrent
directement le programme abord en Licence 2
me
anne dans le cadre de ce
module BIO 241.




CONTROLE DES CONNAISSANCES

Dans le cadre du module BIO 241, deux notes de contrle continu et une note
dpreuve terminale nous permettront dvaluer vos connaissances. La premire note
de contrle continu (CC1) sera une note de travaux pratiques. Le deuxime contrle
continu (CC2) sera ralis sous forme dun examen crit (1h), au cours du semestre,
et portera sur des notions abordes en cours magistral et travaux dirigs. Enfin, une
preuve terminale crite (2h) se droulera la fin du module et portera sur
lensemble des connaissances devant tre acquises dans ce module.
La note finale de lUE = CC1(25%) + CC2(25%) + ET (50%)



TD BIO 241 2012-2013 AVANT-PROPOS
2
EQUATIONS UTILES

Equation de Henderson-Hasselbalch
pH = pK
a
+ log ([A
-
] / [AH])

Variation dnergie libre dans les conditions non standard
AG = AG
o
+ RT ln )
[B] [A]
[D] [C]
(

Variation dnergie libre et potentiel redox
AG
o
= - n F AE
0


Potentiel redox dans une raction doxydo-rduction
AE
0
= E
0
(accepteur) E
0
(donneur)

Equation de Michaelis-Menten

KM [S]
[S]
V V
max 0
+
=


QUELQUES UNITES

Masse molaire, poids molculaire, dalton

- Masse molaire : masse dune mole de molcules de la substance, cest--dire
la masse de 6,022.10
23
molcules.
Elle sexprime en g.mol
-1
.

- Poids molculaire : correspond au rapport entre la masse dune molcule de
la substance et le douzime de la masse dun atome de carbone 12.
Cest un nombre sans dimension.

- Dalton : unit introduite pour dfinir la masse de certaines particules
biologiques pour lesquelles le terme de poids molculaire est impropre.
Le dalton est le douzime de la masse dun atome de carbone 12, soit
1/6,022.10
23
grammes.

Les 3 modes dexpression font apparatre la mme valeur numrique pour un
compos donn.
Exemple pour lhmoglobine : on dira que cette protine a un poids
molculaire de 64 000, ou une masse molaire de 64 000 g.mol
-1
, ou encore
quune molcule de cette protine possde une masse de 64 000 Da ou 64
kDa.






TD BIO 241 2012-2013 AVANT-PROPOS
3

TERME


ABBREVIATION

UNITE

Variation dnergie libre
Potentiel redox
Vitesse initiale dune raction
Activit enzymatique
Activit spcifique
Vitesse maximale dune raction
Constante de Michaelis
Constante catalytique
Efficacit catalytique

AG
E
0

V
o

AE
AS
V
max

K
M

k
cat

k
cat
/ K
M


J.mol
-1

Volts (V)
mol.L
-1
.s
-1
(ou M.s
-1
)
nmol.s
-1
(nanokatals, nkat)
nkat.mg
-1

mol.L
-1
.s
-1
(ou M.s
-1
)
mol.L
-1
(ou M)
s
-1

s
-1
.M
-1





TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS
4


THEME N1 : RAPPELS





CONCENTRATIONS

SPECTROPHOTOMETRIE

CONCEPT ACIDES / BASES FAIBLES



TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS
5
CONCENTRATIONS


Notions dj acquises, revoir :

- Concentration massique.
- Concentration molaire.
- Concentration en % (p/v) ou en % (v/v).
- Normalit.
- Prparation dune solution de concentration exacte partir dune
substance solide (solut).
- Produit anhydre, produit hydrat.
- Puret en %.
- Dilutions en cascade.

Exercice n1 :

Vous voulez raliser un dosage des protines suivant un protocole appel mthode
de Lowry. Pour cela, vous devez prparer diffrentes solutions :
A- Solution de NaOH 0,1 M dans leau distille.
B- Solution de CuSO
4
, 5H
2
O 1% (p/v) dans leau distille.
C- Solution de tartrate double de K et Na (C
4
H
4
KNaO
6
) 2% (p/v) dans leau
distille.
D- Solution de Na
2
CO
3
2% (p/v) dans NaOH 0,1 M.

1- Calculer les quantits de produits peser pour prparer 100 mL de chaque
solution, sachant que vous disposez des poudres suivantes :
- NaOH M = 40 g.mol
-1
Puret = 97%.
- CuSO
4
, 5H
2
O M = 249,68 g.mol
-1
Puret = 98%.
- C
4
H
4
KNaO
6
, 4H
2
O M = 282,22 g.mol
-1
Puret = 98%.
- Na
2
CO
3
, 10H
2
O M = 286,14 g.mol
-1
Puret = 99%.

2- En pratique, comment procdez-vous ? Quel type de verrerie devez-vous
utiliser ?

3- A laide de ces diffrentes solutions, vous devez ensuite prparer le ractif
cuproalcalin selon le protocole suivant :
- 1 mL de solution de sulfate de cuivre (B)
- 1 mL de tartrate double de K et Na (C)
- Complter 100 mL avec la solution de carbonate de sodium 2% (p/v)
dans la soude 0,1 M.
Calculer la concentration finale en sulfate de cuivre et en tartrate double de K et Na.

4- Comme vous navez aucune ide de lordre de grandeur de la concentration en
protines de lextrait biologique dont vous souhaitez doser les protines, vous
devez au pralable effectuer une gamme de dilutions en cascades de cet extrait :
1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Comment ralisez-vous ces dilutions en cascades,
sachant que vous devez raliser le dosage de chaque dilution en triplicata pour
tester la reproductibilit de votre manipulation ? (voir le protocole exact du dosage
ci-dessous).
TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS
6
Protocole du dosage des protines par la mthode de Lowry :
- A 200 L dchantillon protique, ajouter 1 mL de ractif cuproalcalin et
agiter.
- Laisser reposer 15 min.
- Ajouter rapidement 100 L de ractif de Folin-Ciocalteu et homogniser.
- Laisser reposer 30 min. et lire labsorbance 750 nm contre un tmoin
sans protines.


Exercice n2 :

A partir des donnes ci-dessous, calculer la molarit et la normalit des deux
solutions. Indiquer comment prparer 1 litre de solution 1 N.
1- Acide actique (CH
3
CO
2
H) M = 60,05 g.mol
-1
d = 1,05 Puret = 99,7%.
2- Acide sulfurique (H
2
SO
4
) M = 98,08 g.mol
-1
d = 1,83 Puret = 95%.


SPECTROPHOTOMETRIE

Notions dj acquises, revoir :

- Absorbance dune substance colore (spectre dans le visible) ou incolore
(spectre dans lUV).
- Loi de Beer-Lambert et ses limites.
- Loi dadditivit.
- Gamme talon.


Exercice n1 :

Le tryptophane prsente une bande dabsorption avec un maximum la longueur
donde de 280 nm. Dans une cuve de trajet optique 1 cm, une solution de
tryptophane 200 M a une absorbance 280 nm de 1,2.

1- Calculer le coefficient dextinction molaire du tryptophane.

Une solution de la protine X, la concentration de 25 M, prsente une absorbance
280 nm de 0,6. La protine X ne contient aucun rsidu tyrosine et phnylalanine.

2- Dterminer le nombre de rsidus tryptophane que contient cette protine X.


Exercice n2 :

Luracile et ladnine sont deux bases azotes qui prsentent un maximum
dabsorption 260 nm. Une solution duracile 20 mol.L
-1
prsente une absorbance
260 nm gale 0,24 dans une cuve de trajet optique 1 cm.

1- Calculer le coefficient dextinction molaire de luracile.

TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS
7
Une solution contenant un mlange duracile et dadnine prsente une absorbance
260 nm gale 0,4 (cuve de 1 cm). Sachant que la concentration molaire en
uracile est le double de celle de ladnine et que le coefficient dextinction molaire de
ladnine 260 nm est de 16000 mol
-1
.L.cm
-1
:

2- Calculer les concentrations molaires en adnine et en uracile dans le mlange.


CONCEPT ACIDES / BASES FAIBLES


Notions dj acquises, revoir :

- Equation de Henderson-Hasselbalch.
- Titration d'un acide faible par une base forte ; courbe de titration.
- Solutions tampon.


Exercice n1 :

Calculer le pH des solutions tampon suivantes :
1- Acide actique (1 M) + actate de sodium (0,5 M).
2- Acide phosphorique (0,3 M) + KH
2
PO
4
(0,8 M).

Donnes : pKa de lacide actique = 4,76 ; pKa de lacide phosphorique = 2,14.


Exercice n2 :

Lacide phosphorique est un triacide. Il se trouve trs souvent associ diverses
molcules biologiques (protines, lipides) sous forme de groupement phosphate.
Son tat dionisation dpend du pH de la solution et des valeurs de ses pKa.

1- Quelles sont les formes prsentes pH physiologique (7,4) ?
2- Sous quelle forme va-t-on lcrire prfrentiellement ?

Donnes : pKa
1
= 2,1 ; pKa
2
= 7,2 ; pKa
3
= 12,4.


TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES
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THEME N2 : RAPPELS SUR LES PROTEINES





PROPRIETES IONIQUES DES ACIDES AMINES ET PEPTIDES

STRUCTURE ET METHODES DETUDE





TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES
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PROPRIETES DES ACIDES AMINES ET PEPTIDES

Notions dj acquises, revoir :

- Molcules caractre hydrophobe, polaire, apolaire.
- Formule semi-dveloppe des 20 acides amins standard.
- Attribuer chaque fonction ionisable la valeur de pKa correspondant.
- Ecrire les quilibres de dissociation des acides amins et peptides.
- Calcul du pHi dun acide amin et dun peptide.
- Courbe de titration des acides amins et peptides.


Proprits des 20 acides amins rencontrs dans les protines :


Nom Abrviation pKa
o-COOH
pKa
o-NH
3
+

pKa
Chane latrale
Masse molaire
(g.mol
-1
)
Alanine Ala, A 2,3 9,7 89
Arginine Arg, R 2,2 9,0 12,5 174
Asparagine Asn, N 2,0 8,8 132
Aspartate Asp, D 2,1 9,8 3,9 133
Cystine Cys, C 1,7 10,8 8,3 121
Glutamate Glu, E 2,2 9,7 4,3 147
Glutamine Gln, Q 2,2 9,1 146
Glycine Gly, G 2,4 9,6 75
Histidine His, H 1,8 9,2 6,0 155
Isoleucine Ile, I 2,4 9,7 131
Leucine Leu, L 2,4 9,6 131
Lysine Lys, K 2,2 9,0 10,5 146
Methionine Met, M 2,3 9,2 149
Phnylalanine Phe, F 1,8 9,1 165
Proline Pro, P 2,0 10,6 115
Srine Ser, S 2,2 9,2 105
Thronine Thr, T 2,6 10,4 119
Tryptophane Trp, W 2,4 9,4 204
Tyrosine Tyr, Y 2,2 9,1 10,1 181
Valine Val, V 2,4 9,6 117


Les diffrentes classes dacides amins :

En biochimie, la classification gnralement utilise traduit la capacit de lacide
amin interagir avec son environnement (ex : capacit former des liaisons
lectrostatiques, Hydrogne, ou de van der Waals).

1- Acides amins relativement apolaires hydrophobes - :
(Gly), Ala, Pro, (Met), Val, (Tyr), Leu, Ile, Trp, Phe.

2- Acides amins relativement polaires non chargs hydrophiles - :
Ser, Thr, Cys, Asn, Gln.

3- Acides amins plus ou moins ioniss selon le pH hydrophiles - :
Asp, Glu, Lys, His, Arg.

TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES
10
Structure des 20 acides amins rencontrs dans les protines (formes
prpondrantes pH 1) :


Acides amins aliphatiques
Acides amins chane latrale comportant des groupements
hydroxyle ou sulfhydryle
Acides amins acides et les amides drives Acide amin cyclique
Acides amins aromatiques
Acides amins basiques
TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES
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Exercice n1 :

Classer les composs suivants par ordre dhydrophobicit dcroissante pH =7 :
- 1,3-dihydroxypropane
- n-propanol
- srine
- glycrol
- alanine
- propane
- srine phosphoester
- alanylamide


Exercice n2 :

Ecrire les quilibres de dissociation et calculer le pHi des acides amins suivants :
Leucine, Cystine, Histidine.


Exercice n3 :

On tudie le peptide tyrosyl-alanyl-glutaminyl-aspartyl-lysine.

1- Ecrire la formule semi-dveloppe du peptide pH = 1. Indiquer les extrmits N-
terminale et C-terminale. Indiquez les carbones o.
2- Ce peptide comporte 5 fonctions ionisables dont les pKa sont respectivement :
2,2 ; 3,9 ; 9,1 ; 10,1 ; 10,5. Attribuer chaque valeur de pKa chaque fonction
ionisable en justifiant votre rponse (daprs le tableau).
3- Ecrire les quilibres de dissociation et calculer le pHi du peptide.
4- Tracer la courbe de titration de 1 mole du peptide par la soude.


STRUCTURE ET METHODES DETUDE DES PROTEINES

Notions dj acquises, revoir :

- Structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire.
- Interactions non covalentes (liaison hydrogne, liaison ionique, liaison de
van der Waals, interaction hydrophobe)
- Rle des agents dnaturants et des agents rducteurs sur la conformation
des protines.
- Prcipitation des protines par les sels ou les solvants organiques.
- Mthodes chromatographiques.
- Electrophorse sur gel de polyacrylamide en conditions natives ou
dnaturantes.





TD BIO 241 2012-2013 RAPPELS SUR LES PROTEINES
12
Exercice n1 :

Dans des conditions de pH proches des conditions physiologiques, la masse molaire
dune protine P a t dtermine par filtration sur gel. M = 140 000 g.mol
-1
.

1- Rappeler le principe de la chromatographie par filtration sur gel.

Lorsque cette mme protine est tudie par lectrophorse sur gel de
polyacrylamide en prsence de SDS avec ou sans 2-mercaptothanol, les profils
lectrophortiques obtenus sont reprsents sur les pistes A et B de la figure
suivante. La piste C contient les marqueurs de masse molculaire.

A : en absence de 2-mercaptothanol ; B : en prsence de 2-mercaptothanol ; C :
marqueur de masse molculaire.

2- Quest-ce que le SDS et quel est son rle dans cette lectrophorse ?
3- Quel est le rle du 2-mercaptothanol ?
4- Sur quel (s) critre (s) sont spares les protines lors de cette lectrophorse ?
5- A partir de ces donnes, dcrire la protine P native en termes de masse molaire
des sous-units prsentes, de stchiomtrie entre les sous-units et du type de
liaisons (covalentes ou non) existant entre les sous-units.


Exercice n2 :

Dans une protine, identifier quels sont les groupes pouvant former des liaisons
hydrogne ou lectrostatiques avec la chane latrale de larginine pH 7.

A B C
Albumine srique : 67 000 Da
Ovalbumine : 43 000 Da
Anhydrase carbonique : 30 000 Da
Inhibiteur de trypsine : 20 000 Da
Dpts
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
13


THEME N3 : ENZYMOLOGIE





ENERGIE DACTIVATION

CINETIQUE ENZYMATIQUE

INHIBITION

ACTIVITE ENZYMATIQUE

NOTION DE SITE ACTIF










TD BIO 2



Quelqu


Un cata
ce fait,
ractio
droula



La loi e
et la co

Avec :
-
-
-
-


Exercic

La rac
suivant



241 2012-201
ues rappe
LES E
alyseur ag
, il ne mo
n. Les enz
ant dans la
empirique
onstante de
- k = const
- T = temp
- R = cons
- Ea = ne
- A = const
ce :
ction de d
te :
2 H
2
3
ls thoriq
ENZYMES
git en abais
odifie pas
zymes aug
a cellule, et
e dArrhen
e vitesse d
tante de vi
rature ab
tante des g
ergie dactiv
tante.
compositi
2
O
2

E
ENERG
ues :
SONT DE
ssant lne
lquilibre
mentent do
t se retrouv
nius perme
de la ractio
k
tesse de la
bsolue en k
gaz parfait
vation (J. m
ion de lea
2 H
2
ENZYMOLOG
14
IE DACTI
ES CATAL
ergie dac
e, mais au
onc les vit
vent intact
et de relier
on :
k = Ae
- Ea /
a raction.
kelvins.
ts = 8,315
mol
-1
).
au oxygn
2
O + O
2

GIE
IVATION
LYSEURS
ctivation d
ugmente s
esses des
es la fin
r lnergie
RT


J. mol
-1
. K
e (H
2
O
2
) s
BIOLOGIQ
dune ract
seulement
processus
de la ract

dactivatio
K
-1
.
se droule
QUES.
tion chimiq
la vitesse
s biochimiq
tion.
on, la temp
e selon la r
que. De
e de la
ques se
prature
raction
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
15
Cette raction peut avoir lieu sans catalyseur, en prsence dun catalyseur chimique
(le platine collodal), ou en prsence dun catalyseur enzymatique (la catalase).
1- Daprs les donnes du tableau suivant, dterminer le facteur par lequel la
vitesse de la raction est augmente en prsence de chacun des catalyseurs.
2- Quel est le catalyseur le plus efficace ?

Conditions de raction Ea (kJ.mol
-1
) 20C
Aucun catalyseur
En prsence de platine collodal
En prsence de catalase
75
49
8


CINETIQUE ENZYMATIQUE


Quelques rappels thoriques :

1- Relation de Michaelis-Menten :

Le modle de Michaelis-Menten permet de dcrire le comportement dun grand
nombre denzymes. Dans ce modle, une enzyme (E) fixe un substrat (S) pour
former un complexe enzyme-substrat (ES) qui peut se dissocier en E et S ou
conduire la formation du produit de raction (P).
La vitesse de la raction enzymatique est dfinie par : V =
dt
[P] d
dt
[S] d
= .

V =
dt
[P] d
est, pour chaque temps t, la pente de la tangente la courbe [P] = f(t).

Si lon se place en condition de vitesse initiale (V
0
), cest--dire dans des temps de
raction trs courts, nous pouvons supposer que le produit nest pas converti de
nouveau en substrat par la raction inverse.

Nous voulons tablir une expression qui relie la vitesse de catalyse avec les
concentrations en substrat et enzyme. Notre point de dpart est :
V
0

E + S ES E + P
k
1
k
-1
k
2
[P]
Temps
V = cte = V
0

V = cte = 0
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
16
[ES] k V
2 0
= (1)

Nous avons maintenant besoin dexprimer [ES] en termes de concentrations
connues. Les vitesses de formation et de disparition de ES sont donnes par :

Vitesse de formation de ES : k
1
[E] [S] (2)
Vitesses de disparition de ES : k
-1
[ES] + k
2
[ES]
Ou (k
-1
+ k
2
) [ES] (3)

Pour simplifier, nous allons nous placer dans lhypothse de ltat stationnaire,
cest--dire un tat dans lequel la concentration en ES reste constante. Cet tat
stablit dans les tous premiers temps de la raction. La vitesse de formation de ES
est donc gale sa vitesse de disparition :

k
1
[E] [S] = (k
-1
+ k
2
) [ES] (4)

En rarrangeant lquation (4), on obtient :


1
2 1
k
k k
[ES]
[S] [E] +
=

(5)

Lquation (5) se simplifie en dfinissant une nouvelle constante, K
M
, appele la
constante de Michaelis :


1
2 1
M
k
k k
K
+
=

(6)

Lquation (5) devient alors :


M
K
[ES]
[S] [E]
= ou
M
K
[S] [E]
[ES] = (7)

Il faut maintenant exprimer [E] en termes de concentrations connues.

Examinons alors la loi de conservation de lenzyme :

[E]
T
= [E] + [ES] (8)

Ou encore : [E] = [E]
T
[ES] (9)

Lquation (7) devient alors :


M
T
K
[S] [ES]) ([E]
[ES]

= (10)

Do lon tire :
M
T
K [S]
[S]
[E] [ES]
+
= (11)
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
17
En revenant lquation (1) V
0
= k
2
[ES] et en substituant [ES] par son expression
dans lquation (11), on obtient :


KM [S]
[S]
[E] k V
T 2 0
+
= (12)

La vitesse maximale tant atteinte lorsque toute lenzyme est sature en substrat et
donc quand [E]
T
= [ES], on obtient :

V
max
= k
2
[E]
T
(13)

Lquation (12) devient ainsi la relation de Michaelis-Menten:


KM [S]
[S]
V V
max 0
+
= (14)

2- Reprsentations graphiques :

2.1- Reprsentation de Michaelis-Menten :

En fixant [E] et en faisant crotre [S], on constate que la vitesse crot et tend vers une
limite V
max
quand toute lenzyme est sature de substrat, cest--dire quand toute
lenzyme est sous forme de complexe ES.
Ainsi, si [S] devient trs grande, K
M
<< [S] et V
0
= V
max
.














2.2- Reprsentation de Lineweaver et Burk :

La reprsentation graphique de Michaelis-Menten ntant pas suffisamment prcise
pour dterminer K
M
et V
max
, cest le plus souvent la reprsentation en double inverse
1/V
0
= f(1/[S]
0
) qui est utilise.
La reprsentation graphique de Michaelis-Menten ntant pas suffisamment prcise
pour dterminer K
M
et V
max
, cest le plus souvent la reprsentation en double inverse
1/V
0
= f(1/[S]
0
) qui est utilise.
V
max
/ 2
V
max

[S]
0

V
0

S = K
M

TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
18

3- Signification de K
M
, k
cat
et k
cat
/K
M
:

- La reprsentation de Michaelis-menten montre que K
M
est gal la concentration
en substrat avec laquelle la raction atteint la moiti de sa vitesse maximale.
La constante de Michaelis K
M
est souvent associe laffinit de lenzyme pour
son substrat. Cependant, cette relation nest valable que pour les ractions dans
lesquelles k
2
est trs petit devant k
-1
, ce qui conduit :

K
M
=
1
1
k
k
= Ks = constante de dissociation du complexe ES

- La constante catalytique k
cat
est gale k
2
. Elle reprsente le nombre de
molcules de substrat transformes par une molcule denzyme en une seconde.
Lunit de k
cat
est donc s
-1
. Elle traduit lefficacit cintique de lenzyme.

- Cest en fait le rapport de ces 2 valeurs (k
cat
/ K
M
) qui traduit le mieux lefficacit
catalytique dune enzyme.

4- Les effecteurs de lactivit enzymatique :

Les effecteurs sont des substances chimiques qui modifient l'activit des enzymes.
On distingue :
- les activateurs qui augmentent l'activit catalytique. Ex : certains cations
augmentent l'activit des enzymes (Mg
2+
pour les kinases, Zn
2+
pour les
phosphatases alcalines).
- les inhibiteurs qui diminuent l'activit catalytique.

Nous ne dtaillerons ici que les inhibiteurs.
Nous nous intresserons 2 types dinhibitions rversibles, cest--dire
caractrises par une dissociation rapide du complexe enzyme-inhibiteur EI.
Dune faon gnrale, un inhibiteur est li lenzyme mais nest pas transform par
elle.



1 / V
0

1 / [S]
0

1 / V
max

- 1 / K
M

TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
19
4.1- Inhibition comptitive :

Lorsque linhibiteur possde une structure voisine de celle du substrat (on parle alors
danalogue de substrat), il peut se fixer lenzyme sur le mme site que le substrat.
Inhibiteur et substrat ne peuvent donc pas se trouver ensemble dans le site actif de
lenzyme : il sagit dune inhibition comptitive.
Un inhibiteur diminue la vitesse de catalyse en rduisant la proportion de molcules
denzyme lies au substrat.
Une inhibition comptitive peut tre leve par un excs de substrat.
La constante dinhibition K
i
est galement la constante de dissociation du complexe
EI : K
i
=
[EI]
[I] [E]

La reprsentation de Lineweaver et Burk suivante montre quun inhibiteur comptitif
ninduit pas de variation de la V
max
, mais augmente la valeur du K
M
. Le K
M
apparent
devient alors : K
M
app. = K
M
(1 +
i
K
[I]
)

4.2- Inhibition non comptitive :

Dans une inhibition non comptitive, le substrat et linhibiteur peuvent se lier
simultanment lenzyme sur des sites distincts. Un inhibiteur non comptitif agit en
diminuant la constante catalytique plutt que la proportion de molcules de substrat
lies lenzyme. Contrairement linhibition comptitive, une inhibition non
comptitive ne peut pas tre leve par un excs de substrat.

E + S
+
I
ES E + P
EI
K
i

x
+ Inhibiteur
- Inhibiteur
1 / [S]
0
1 / V
0

1 / V
max

- 1 / K
M
- 1 / K
M
app.
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
20
La reprsentation de Lineweaver et Burk suivante montre quun inhibiteur non
comptitif ninduit pas de variation du K
M
, mais diminue la valeur de V
max
. La V
max

apparente devient : V
max
app. =
) K / [I] ( 1
V
i
max
+
(dans le cas simple ou K
i
= K
i
)


Exercice n1 :

Les affirmations suivantes sont-elles vraies ?

1- V
0
et V
max
sont des vitesses initiales.
2- On peut calculer V
max
et K
M
partir des cintiques d'apparition du produit en
fonction du temps obtenues partir de plusieurs concentrations en substrat.
3- Si l'on exprime V
0
en fonction de [S]
0
, on obtient une parabole.
4- Il est possible de dterminer V
max
et K
M
en reprsentant 1/V
0
en fonction de 1/[S]
0
.
5- K
M
est la concentration en enzyme qui donne la moiti de V
max
.
6- Pour une enzyme et un substrat donns, les valeurs de K
M
et V
max
sont
invariables.
7- La vitesse initiale d'une raction enzymatique :
- Prsente une relation linaire en fonction de quantits croissantes d'enzyme.
- Prsente une relation hyperbolique en fonction de quantits croissantes
d'enzyme.
- Peut tre sensible aux variations de temprature.
- Est maximale pH 7.
- Est sensible la prsence d'autres ligands que le substrat.




1 / V
max
app.
E + S
+
I
ES
+
I
E + P
EI + S EI
x
K
i
K
i

1 / V
max

1 / V
0

+ Inhibiteur
- Inhibiteur
- 1 / K
M

1 / [S]
0

TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
21
Exercice n2 :

Les mesures des constantes de vitesse dune raction enzymatique simple, avec une
enzyme E obissant la cintique de Michaelis-Menten, donnent les valeurs
suivantes :

k
1
= 2 x 10
8
M
-1
sec
-1

k
-1
= 1 x 10
3
sec
-1

k
2
= 5 x 10
3
sec
-1

1- Calculer la constante de Michaelis K
M
de lenzyme.
2- Quelle est la valeur de la constante catalytique (k
cat
) de lenzyme ?
3- Dterminer lefficacit catalytique de lenzyme.
4- Indiquer si cette enzyme est proche de la perfection cintique.


Exercice n3 :
1/Vo
[So] 1 / [So]
[ P ]
t e mp s
Vo
1
2
3
Les figures suivantes reprsentent :
courbe 1 [P] = f ( t )
courbe 2 Vo = f ( [ So ] )
courbe 3 1/Vo = f ( 1/[So] )


1- Que peut-on dterminer partir de chacune des courbes ci-dessus ? Complter
les graphiques (flches).
2- A partir de la courbe 2, donner l'expression de la vitesse de la raction pour les
concentrations en substrat :
- Infrieures K
M
/ 10.
- Comprises entre K
M
/ 10 et 10 K
M
.
- Suprieures 10 K
M
.
3- A quelle partie de la courbe correspond :
- Une raction d'ordre 1.
- Une raction d'ordre 0.
- Une raction dordre intermdiaire.
E + S ES E + P
k
1
k
-1
k
2
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
22
4- Une enzyme E qui obit une cintique michaelienne a un K
M
= 1 M vis--vis de
son substrat S. Pour une concentration de [S] = 100 M, la vitesse initiale V
0

mesure est de 0,1 M.min
-1
. Quelle sera la valeur de V
0
dans les conditions
suivantes :
a- [S] = 1 mM
b- [S] = 1 M
c- [S] = 2 M
5- Les figures 4 et 5 reprsentent : )
[S]
1
( f
V
1
0
= en prsence d'un inhibiteur
comptitif (IC) et non comptitif (INC).

a- Indiquer sur les graphiques lequel reprsente linhibition comptitive et lequel
reprsente linhibition non comptitive. Justifier.
b- Complter les graphiques en prcisant ce que chaque flche indique.




Exercice n4 :

Les vitesses initiales d'une raction enzymatique sont donnes pour cinq
concentrations en substrat (Tableau ci-dessous).
1- Dterminer K
M
graphiquement.
2- Calculer la concentration d'un inhibiteur comptitif, ayant une constante de
dissociation K
i
= 2,4.10
-4
M, qui aurait pour effet de doubler la valeur du K
M
.

[S] (mol.L
-1
) V
0
(mol.L
-1
min
-1
)
1,0 x 10
-4

1,5 x 10
-4

2,0 x 10
-4

5,0 x 10
-4

7,5 x 10
-4

28
35
42
63
75



[ I ]
[ I ] = 0
1/Vo
1/ [S]
[ I ]
[ I ] = 0
1/Vo
1/ [S]
4
5
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
23
Exercice n5 :

Le tableau ci-dessous traduit la cintique de la transformation d'un substrat S par
une dcarboxylase en prsence et en l'absence d'une substance F.

1- Sans construire la courbe, dterminer la vitesse maximale et la constante de
Michaelis en l'absence et en prsence de F ; en dduire le rle prcis de F.

[S] (mM) 1 1,5 2 3 4 8 16 20
V
0
(mM.min
-1
)
0,15

0,21

0,25

0,30

0,33

0,40

0,42

0,42
V
0
en prsence de F
(mM.min
-1
)

0,06

0,08

0,10

0,12

0,13

0,15

0,16

0,16

On mesure la vitesse de transformation du substrat S en prsence de 3 substances
M, N et P. On obtient les courbes 1, 2 et 3 ci-aprs.

2- Dduire de ces courbes si M, N et P sont des activateurs ou des inhibiteurs.
Justifier.
3- Dans le cas d'un inhibiteur, prciser le type d'inhibition. Justifier les rponses.






1/Vo
1/ [S]
[M]= 2 mmol/ml
Vo
1
2
3
[S]
[M]= 0 mmol/ml
[N]= 2 mmol/ml
[N]=0 mmol/ml
[P]=O mmol/ml
[P]= 2 mmol/ml
1/ [S]
0
0 0
1/Vo
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24
Exercice n6 :

Pour caractriser une enzyme nouvellement purifie, un biochimiste a mesur les
vitesses de raction en prsence de concentrations croissantes de substrat et cela
dans trois conditions :
a) En prsence de l'enzyme seule.
b) En prsence de l'enzyme et d'un analogue non mtabolisable du substrat
(compos A) une concentration de 150 M.
c) En prsence de l'enzyme et d'un compos qui inhibe l'enzyme en se liant hors du
site actif de l'enzyme (compos B), une concentration de 60 M.

A partir des rsultats exprimentaux, il a trac les diagrammes de Lineweaver et
Burk reprsents dans la figure ci-dessous.

1- Indiquer la correspondance entre les expriences a, b, c et les symboles
employs (losanges, cercles, triangles). Justifier la rponse.
2- Dterminer graphiquement K
M
, K
M
app., V
max
et V
max
app.
3- Calculer les constantes d'inhibition pour les composs A et B (cest--dire les
constantes de dissociation des complexes EI).



ACTIVITE ENZYMATIQUE


Quelques rappels thoriques :

1- Lactivit enzymatique : elle sexprime en nanokatals.

Un nanokatal mesure lactivit dune solution enzymatique qui catalyse la
transformation dune nanomole (10
-9
mole) de substrat en une seconde dans les
conditions optimales de la raction (pH, temprature, concentration saturante en
substrat) dans un volume ractionnel donn.

0
1
2
-5,00E+03 0,00E+00 5,00E+03 1,00E+04
1 / [S]
0
(M
-1
)
1 / V
0
(min.M
-1
)
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
25
AE (nkat) =
(s) raction de temps
es transform substrat de nanomoles de nombre


Lactivit enzymatique se rapporte toujours un volume de solution enzymatique
donne. Par convention, on ramne souvent le rsultat 1 mL de solution
enzymatique non dilue.

2- Lactivit spcifique :

Elle correspond lactivit enzymatique ramene 1 mg de toutes les protines
prsentes dans lchantillon (et non pas lenzyme seule).
AS (nkat.mg
-1
) =
(mg) protines de masse
e enzymatiqu activit


3- Evaluation dune purification enzymatique :

Un extrait enzymatique brut est constitu de la protine laquelle on sintresse
mais aussi dun grand nombre de protines indsirables dites contaminantes.

Une purification russie implique :
a- De rcuprer le maximum dactivit enzymatique par rapport ce que contenait
lextrait brut initial ; ceci est traduit par la valeur du rendement de purification.
b- Dliminer le maximum de protines contaminantes prsentes dans lextrait brut
initial ; ceci est traduit par la valeur du facteur de purification.

Aprs chaque tape de purification, plusieurs paramtres doivent ainsi tre
mesurs :
a- La masse totale de protines (mg) : elle est obtenue en dterminant la
concentration (en mg.mL
-1
) dune partie de lchantillon et en multipliant par le
volume total de la fraction.
b- Lactivit enzymatique totale (nkat) : elle est obtenue en mesurant lactivit
enzymatique (en nkat.mL
-1
dextrait enzymatique) dun volume dchantillon et en
multipliant par le volume total de lchantillon.
c- Lactivit spcifique (nkat.mg
-1
) : ce paramtre est obtenu en divisant lactivit
enzymatique totale par la masse totale de protine. Elle est gnralement
exprime en nkatals.mg
-1
de protines.

Ces trois paramtres permettent ensuite de calculer :
a- Le rendement de la purification = 100 x
brut extrait l' de totale AE
purifi extrait l' de totale AE
(%)
b- Le facteur de purification =
initial brut extrait l' de AS
purifi extrait l' de AS


4- Notion de vitesse et dactivit Units :

- Une vitesse de raction en phase liquide est conventionnellement exprime en
variation de la concentration de produit (ou substrat) en fonction du temps car
ce sont les concentrations qui dterminent les quilibres ractionnels. La vitesse
caractrise donc laspect cintique de la raction enzymatique.
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
26

- Lactivit enzymatique est exprime en variation du nombre de moles de
produit (ou substrat) en fonction du temps. Le volume denzyme utilis pour
raliser le test enzymatique doit alors tre obligatoirement prcis. Lactivit
enzymatique caractrise ainsi le pouvoir catalytique de lchantillon enzymatique.


Exercice n1 :

La glucose-6-phosphate-dshydrognase (G-6-P-D) catalyse la raction :

D-glucose-6-phosphate + NADP
+

6-phosphoglucono-o-lactone + NADPH + H
+


Le coefficient d'extinction molaire du NADPH 340 nm est 6220 M
-1
.cm
-1
. Les autres
composs n'absorbent pas 340 nm.
On se propose de purifier la G-6 P-D de Bacillus subtilis. Pour tester le degr de
puret de la prparation, aprs chaque tape de purification, on ajoute une partie de
la prparation enzymatique une solution de D-glucose-6-P et de NADP
+
qui restent
en excs pendant tout le temps de la mesure dans la cuve de spectrophotomtre. La
longueur du trajet optique est 1cm. Le volume total final est 1mL.

1- Aprs une tape de purification, on ajoute au mlange ractionnel une partie de
prparation enzymatique contenant 100 g de protines (doses par la mthode
de Lowry). Aprs 5 min., la variation d'absorbance 340 nm est de 0,3.
Calculer l'activit spcifique (AS) de la prparation de G-6-P-D ce stade de
purification.
2- Aprs de nouvelles oprations de purification, une partie de la prparation
enzymatique contenant 1 g de protines entrane aprs 1 min. un accroissement
de l'absorbance de 0,36.
2.1- Calculer l'AS de la prparation de G-6-P-D ce stade de purification.
2.2- Par rapport au stade prcdent, combien de fois lenzyme a telle tait
purifie ?
3- Aprs de nouvelles tapes de purification, on ne parvient pas obtenir une
activit spcifique plus leve. Qu'en dduire ?


Exercice n2 :

Plusieurs tapes de purification sont utilises pour obtenir une enzyme :
- tape 1 : prcipitation par le sulfate d'ammonium
- tape 2 : chromatographie par change d'ions
- tape 3 : chromatographie par filtration sur gel

1- Rappeler le principe des diffrentes techniques utilises pour purifier lenzyme.

2- Les mesures effectues au cours de cette purification sont donnes dans le
tableau suivant. Calculer pour chaque tape l'activit enzymatique totale (AT),
l'activit spcifique (AS), le rendement (Rdt) et le facteur de purification (Fp ).


TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
27
Fraction Volume de
solution (mL)

Masse de
protines (mg)

Activit enzymatique
mesure sur 0,1 mL de
solution protique
(nmol.sec
-1
)

Extrait cellulaire brut 100 50000 20
tape 1 10 500 20
tape 2 1 50 100
tape 3 1 5 50


Exercice n3 : Etude de transaminases sriques

Les 2 principales enzymes de transamination prsentes dans le srum sont :
- La glutamate oxaloactate transaminase (GOT).
- La glutamate pyruvate transaminase (GPT).

1- Ecrire la raction catalyse par ces 2 enzymes.
Donnes : l'o-ctoglutarate est l'o-ctoacide dicarboxylique driv de Glu et
l'acide oxaloactique est l'o-ctoacide dicarboxylique driv de Asp.

On dispose des ractifs suivants :
- ractif 1 : alanine 0,08 M, lactate dshydrognase 10 mg.L
-1
et NADH
2.10
-4
M dans le tampon phosphate 0,1 M pH 7,4.
- ractif 2 : solution 0,1 M d'acide o-ctoglutarique.

On met incuber 2,2 mL de ractif (1) avec 0,5 mL de srum pendant 5 min. 25C.
On ajoute alors 0,3 mL de ractif (2) et, trs rapidement, le mlange est transvas
dans la cuve d'un spectrophotomtre rgl 340 nm. L'paisseur de la cuve est de 1
cm. On relve l'absorbance toutes les minutes pendant 5 minutes, ce qui donne les
rsultats suivants :

temps (min.) 0 1 2 3 4 5
A
340
0,558 0,452 0,348 0,245 0,142 0,070

2- Quelle est la transaminase dose ?
3- Calculer l'activit transaminasique en nkat par mL de srum.
Donne : c
NADH
340 nm = 6220 M
-1
.cm
-1
.
4- Les valeurs physiologiques sont comprises entre 5 et 15 mU.mL
-1
de srum
(milliunits internationales). Commenter la valeur trouve dans l'exprience
propose.
Donne : Une unit internationale est l'activit enzymatique qui transforme 1
mole de substrat par minute dans les conditions optimales de pH, de force
ionique et de concentration en substrat.


Exercice n4 :

La glutamate dshydrognase (GDH) catalyse la raction suivante :

TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
28

Cette enzyme permet la dsamination de l'acide glutamique en prsence de NAD
+
.

On mesure l'activit de la GDH dans le sens de formation de l'acide glutamique dans
les conditions suivantes :
- 0,2 mL de sulfate d'ammonium 5 M
- 2,4 mL d'une solution tampon pH 8
- 0,1 mL d'une solution de NADH 6,5 mg.mL
-1
(M = 709 g.mol
-1
)
- 0,2 mL d'une solution 1 M d'acide o-ctoglutarique
- Pr-incubation 5 min. 25C
- Addition de 0,1 mL de solution de GDH contenant 1,6 mg.mL
-1
de
protines (doses par la mthode de Lowry) pour dmarrer la raction.

On mesure l'absorbance du milieu ractionnel (maintenu 25C) 340 nm en
fonction du temps dans une cuve de trajet optique de 1 cm. On obtient les rsultats
suivants :

Temps (min.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A 340 nm 1,760 1,718 1,675 1,635 1,595 1,550 1,510 1,476 1,450 1,430


1- Expliquer le rle des diffrents constituants du milieu ractionnel.
2- Tracer la courbe A = f(t). Commenter l'allure de cette courbe, en expliquant
notamment lapparition dun dbut de plateau.
3- Donner la vitesse initiale V
0
de la raction en M.min
-1
.
4- Calculer l'activit enzymatique de 1mL de solution de GDH dans les conditions du
test.
5- Calculer l'activit spcifique de la solution de GDH.

Donne : c
NADH
340 nm = 6220 M
-1
.cm
-1
.


Exercice n5 :

On souhaite tudier une nouvelle protase P isole du tube digestif d'un insecte
amazonien. Cette protase existe sous deux formes P
i
et P
a
ayant des squences en
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
29
acides amins identiques. Seule la forme P
a
possde une activit protasique. Pour
lucider le mode d'activation de la protine P
i
(forme inactive) en protine P
a
(forme
active), une exprience l'aide de DIFP a t ralise.

La dcouverte de la neurotoxicit du DIPF (diisopropylphosphofluoridate) a conduit
utiliser ce ractif comme agent inactivateur d'enzyme. Le DIPF ragit avec une
srine du site actif de lenzyme, selon la raction suivante :



1. Les deux protases P
a
et P
i
sont incubes sparment en prsence de
32
P-DIPF
pendant 30 minutes 37C, puis dialyses pour liminer l'excs de ractif
radiomarqu. Les deux protases sont alors analyses par lectrophorse sur gel de
polyacrylamide, en prsence de SDS (sodium dodecyl sulfate) avec ou sans 2-
mercaptothanol.

Aprs coloration au bleu de Coomassie, la photographie du gel obtenu donne le
rsultat suivant :


















Les marqueurs de masse molaire dposs dans la piste 1, sont les suivants : -
galactosidase 120 000 g.mol
-1
; albumine du srum de buf 70 000 g.mol
-1
;
ovalbumine 42 000 g.mol
-1
; trypsine 25 000 g.mol
-1
; myoglobine 16 000 g.mol
-1
;
Enzyme
Enzyme
Piste 1 Piste 2 Piste 3 Piste 4 Piste 5
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
30
peptone 9 000 g.mol
-1
. La protine P
i
est dpose sur les pistes 2 et 3,
respectivement en absence et en prsence de 2-mercaptothanol. De mme, la
protine P
a
est dpose sur les pistes 4 et 5, respectivement en absence et en
prsence de 2-mercaptothanol.

1- Que pouvez-vous tirer de l'analyse de cette lectrophorse sur le mode
d'activation de la protine P ?

Aprs autoradiographie du gel, les bandes radioactives sont rvles sur un film
photosensible par une coloration noire. Le rsultat est le suivant :





















2- Complter votre analyse prcdente (question 1) de l'lectrophorse, par l'tude
des rsultats obtenus par autoradiographie pour affiner vos conclusions sur le
mode d'activation de la protine P.

2. L'tude enzymatique de la protine P s'effectue sur un substrat artificiel, le para-
nitrophnylactate (pNPA) dont le produit d'hydrolyse absorbe 410 nm avec un
coefficient d'extinction molaire 410 nm de 4 000 M
-1
.cm
-1
.

1- Ecrire la raction catalyse par la protine P sur le substrat artificiel.

2- Lextrait enzymatique est trop concentr en activit pour tre utilis en ltat. Une
dilution au 1/300 est ncessaire. Quels sont les volumes respectifs en solution
tampon et en extrait enzymatique que vous devez prendre pour effectuer cette
dilution sachant qu'un volume minimum de 600 L d'extrait dilu est ncessaire
pour la suite de vos manipulations ?

Le protocole exprimental pour mesurer l'activit enzymatique de l'enzyme P est le
suivant. Le spectrophotomtre est programm pour faire une cintique pendant 3
minutes 410 nm. Le zro dabsorbance est fait 410 nm laide d1 mL de tampon
phosphate de sodium 0,1 M pH 7.
Dans une cuve de 1 mL, 450 L de tampon phosphate 0,1 M, pH 7, et 500 L de
pNPA 1 mM sont mis en prsence de 50 L dextrait enzymatique dilu et
homogniss rapidement avant de dmarrer la cintique.
Piste 1 Piste 2 Piste 3 Piste 4 Piste 5
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
31

3- Quelle critique apportez-vous au choix du contenu de la cuve utilis pour faire le
zro d'absorbance ?

Le rsultat exprimental obtenu est le suivant :

4- Calculer l'activit enzymatique de 1mL de l'extrait enzymatique de dpart dans les
conditions exprimentales proposes. Dtailler vos calculs.

Le dosage selon la mthode de Bradford des protines prsentes dans l'extrait
enzymatique est effectu selon le protocole suivant :
A 100 L dchantillon protique dilu, ajouter 1 mL de ractif de Bradford.
Laisser 20 min. temprature ambiante.
Lire labsorbance 595 nm contre un tmoin ne contenant pas de protines.

5- Donner le contenu du tube tmoin.

L'extrait enzymatique est pralablement dilu au 1/10me.
Les rsultats exprimentaux obtenus sont les suivants :

Tube 1 2 3 4 5 6
Tampon phosphate de sodium
0,1 M pH 7 (L)
50 50 50 0 0 0
Extrait enzymatique dilu (L) 50 50 50 100 100 100
Ractif de Bradford (mL) 1 1 1 1 1 1
A 595 nm 0,102 0,098 0,101 0,199 0,200 0,200


6- Quel est l'intrt de faire plusieurs mesures ?
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
32
7- Calculer la concentration en protines de l'extrait enzymatique laide de la
courbe dtalonnage suivante, effectue avec de la srum albumine bovine.


8- Calculer l'activit spcifique de l'extrait enzymatique.


NOTION DE SITE ACTIF


Quelques rappels thoriques :

Le site actif est une zone de l'enzyme o se fixe le substrat et o intervient l'effet
catalytique. Les acides amins prsents dans cette zone, ainsi que les molcules
non protiques (dites cofacteurs) qui y sont galement localises, participent
directement l'action catalytique.

On distingue les acides amins qui participent la fixation du substrat par
lintermdiaire de liaisons non covalentes (essentiellement ioniques, hydrophobes et
hydrogne) et les acides amins catalytiques participant la transformation du
substrat en produit.

NB : Les protines sont des molcules dformables ; il en rsulte que les ligands qui
se fixent en un autre point de l'enzyme que le site actif, et souvent fort loin, peuvent
modifier la conformation du site actif et ainsi changer les valeurs des constantes
cintiques de l'enzyme.

Principe de l'tude exprimentale d'un site actif :

Toutes les mthodes physicochimiques d'tude des protines sont utilises pour
dterminer le mcanisme d'action d'une enzyme. Nanmoins, de nombreuses
mthodes sont bases sur le principe suivant : modification lgre soit de la structure
d'un ligand soit de celle de l'enzyme et mesure des variations d'activit et d'affinit
correspondantes. Si les constantes caractristiques K
M
ou k
cat
sont nettement
modifies, on en dduit que la zone concerne du ligand ou de l'enzyme participe
la fixation du substrat ou sa transformation.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Absorbance 595 nm
Masse de SAB (en g / tube)
TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
33
Exercice n1 :

La carboxypeptidase est une mtalloenzyme qui assure l'hydrolyse de la liaison
peptidique liant le dernier acide amin du ct COOH terminal au reste des peptides
et des protines substrats.
La fixation du peptide L-alanyl-L-tyrosine sur le site actif de cette enzyme, est donne
dans le schma ci-dessous :

OH
C H
2
H C C O
-
O NH
C O
C
H
N
H
H
O
H
+ N C
NH 2
N
H
COO
-
Zn
++
Tyr 248
H
H
Arg 145
Glu
Poche apolaire


NB : Cette reprsentation donne une image plane de la structure spatiale du site
actif : deux groupes positionns au voisinage l'un de l'autre sur ce schma, sont
supposs l'tre dans la structure relle, tridimensionnelle de l'enzyme. Les traits
hachurs reprsentent les liaisons enzyme-substrat.

1- Quels types d'interactions interviennent dans la fixation du substrat ?
2- Prciser priori si le K
M
est modifi si on remplace le L-alanyl-L-tyrosine par les
substrats suivants :
L-alanyl-L-phnylalanine ; L-alanyl-L-aspartate ; L-aspartyl-L-tyrosine.


Exercice n2 :

La glycraldehyde-3-phosphate-deshydrognase catalyse l'oxydation du
glycraldehyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycrate :


Si on fait ragir de l'iodoactate sur cette enzyme, on constate que le
glycraldehyde-3-phosphate continue se fixer sur l'enzyme modifie mais ne
s'oxyde plus. Que peut-on conclure ?

TD BIO 241 2012-2013 ENZYMOLOGIE
34
Donne : l'iodoactate ICH
2
COO
-
est un agent alkylant qui ragit avec les thiols (-
SH) pour former de faon irrversible des groupements -S-CH
2
COO
-
.


Exercice n3 :

Les paramtres V
max
et K
M
d'une raction enzymatique sont tudis en fonction du
pH et donnent les rsultats suivants :



1- Que reprsentent les paramtres V
max
et K
M
pour une enzyme michaelienne ?
Que permettent-ils dtudier chez cette enzyme ?
2- Quel est le type d'acides amins qui apparat comme essentiel pour le
fonctionnement du site catalytique, et quel est l'tat de protonation de ce (ou ces)
acide(s) amin(s) dans l'enzyme active ?
3- Mme question en ce qui concerne le site de fixation du substrat sur l'enzyme.


pH
V
max
(units arbitraires)
4
8 6 10
0
10
20
pH
K
M
(mM)
4
8 6 10
0
40
80
K
M
= 1mM
TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE
35

THEME N4 : BIOENERGETIQUE





ENERGIE LIBRE SENS DES REACTIONS EQUILIBRE

POTENTIELS REDOX FORMULE DE NERNST




TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE
36
ENERGIE LIBRE SENS DES REACTIONS - EQUILIBRE


Quelques rappels thoriques : Variation dnergie libre et constante dquilibre

Considrons la raction chimique suivante, se droulant au sein d'un systme pH =
7 ( ce pH, les grandeurs thermodynamiques classiques sont affectes du signe
"prime").
o A + | B C + o D

Bien que la raction puisse voluer dans les 2 sens, nous avons crit C et D
droite ; nous les appellerons donc produits . A et B sont alors appels substrats .

Nous voulons calculer la variation dnergie libre lorsque o moles de A et | moles de
B sont converties en moles de C et o moles de D, chacun une concentration
donne. Pour la raction inverse, nous avons seulement besoin de changer le signe
de lnergie libre que nous aurons calcule.

Dans une raction chimique, la variation dnergie libre (AG), exprime en kJ.mol
-1
,
dpend de la variation dnergie libre dans les conditions standard (AG
o
) et de la
concentration des substrats et produits.
AG = AG
o
+ RT ln )
[B] [A]
[D] [C]
(


(1)

Avec : - Conditions standard : Concentrations molaires des ractants autres
que H
+
, 298K, pH = 7.
- R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol
-1
. K
-1
.
- T = temprature absolue en kelvins (K).
- [A], [B], [C], [D] : concentrations dans les conditions initiales.

Signification de AG :

- Si AG > 0 : la transformation nest pas spontane, et il faut lui fournir de
lnergie pour quelle se fasse (cest la raction inverse qui est alors
spontane) : elle est dite endergonique.
- Si AG < 0 : la transformation est spontane et elle est susceptible de
fournir de lnergie : elle est dite exergonique.
- Si AG = 0 : la transformation na tendance se faire ni dans un sens ni
dans lautre : elle est lquilibre.

Lorsque le systme est lquilibre, les concentration dans le facteur entre
parenthses de lquation (1) ne sont plus les concentrations initiales mais les
concentrations lquilibre. De ce fait, ce facteur entre parenthses est appel la
constante dquilibre K de la raction :
K =
eq
)
[B] [A]
[D] [C]
(
| o
o
(2)

TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE
37
Lquation (1) devient donc : 0 = AG
o
+ RT ln
eq
)
[B] [A]
[D] [C]
(
| o
o
(3)
ou : AG
o
= - RT ln K (4)


Exercice n1 :

La variation d'nergie libre standard de la raction :

D-glucose-1-phosphate D-glucose-6-phosphate

considre de gauche droite, est de : - 7270 J.mol
-1
( 25C et pH = 7).
Dans quel sens la raction tend-elle se faire spontanment dans les 3 cas
suivants :

D-glucose-1-phosphate (mM) D-glucose-6-phosphate (mM)
72 72
7,2 137
5,55 555


Exercice n2 :

La variation d'nergie libre standard de la raction :

pyruvate + aspartate oxaloactate + L-alanine

considre de gauche droite, est nulle 25C, pH = 7.
On incube du pyruvate, de l'aspartate et de la L-alanine dont les concentrations
initiales sont 1 x 10
-3
M, l'oxaloactate tant initialement absent.

Calculer la molarit des diffrents composs l'quilibre.


Exercice n3 :

Le tableau suivant donne les variations dnergie libre standard d'hydrolyse de
quelques composs phosphoryls.

Composs AG
o
(kJ.mol
-1
)
Phosphonolpyruvate
Carbamyl-phosphate
Actyl-phosphate
Cratine-phosphate
Pyrophosphate
ATP
Glucose-1-phosphate
Glucose-6-phosphate
Glycrol-3-phosphate
- 61,7
- 51,4
-43,0
- 43,0
- 33,4
- 30,4
- 20,8
- 13,8
- 9,1
TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE
38
1- Quest-ce que le potentiel de transfert de groupement phosphate ?
2- Quel est le compos qui a le potentiel de transfert le plus lev ?
3- Quel est le sens de chacune des ractions suivantes lorsque les ractifs sont
initialement prsents en quantits quimolaires (1M) ?

ATP + cratine cratine-phosphate + ADP

ATP + pyruvate phosphonolpyruvate + ADP

4- Quel est llment de couplage absolument indispensable ?

Exercice n4 :

La raction de biosynthse de la L-glutamine chez l'homme est catalyse par la L-
glutamine synthtase. On peut la rsumer de la manire suivante :

ATP + glutamate + NH
3
ADP + phosphate + glutamine

AG
o
de cette raction est de -16,3 kJ.mol
-1
(de gauche droite).

1- Prciser la signification de cette dernire donne.
2- Cette raction peut tre considre comme la somme de deux ractions
composantes, l'une exergonique, l'autre endergonique.
Ecrire ces deux ractions composantes et valuer AG
o
de la raction
endergonique.
3- Plus gnralement, quelles sont les conditions thermodynamiques ncessaires
pour qu'une raction endergonique puisse se produire ?

Donne : AG
o
de lhydrolyse de lATP = - 30,4 kJ.mol
-1
.


POTENTIELS REDOX FORMULE DE NERNST


Quelques rappels thoriques :

Le transport des lectrons dans les systmes biologiques consiste en une srie de
ractions doxydation et rduction couples entre elles (encore appeles ractions
redox).
Une oxydation = perte dlectrons ; une rduction = gain dlectrons.

Un rducteur est un compos ayant tendance fournir un (ou des) lectron(s).
Un oxydant est un compos ayant tendance capter un (ou des) lectron(s).

Oxydant + n e
-
Rducteur

Les formes rduite et oxyde dun mme compos constituent un couple redox.

Le pouvoir rducteur dun couple redox est dfini par le potenteil redox (E). Plus ce
potentiel redox est ngatif, plus le couple a un pouvoir rducteur.
TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE
39

Il est possible de calculer les potentiels redox grce la relation de Nernst :

E = E
0
+
[red]
[ox]
ln
F n
T R

Avec : - E = potentiel redox en volts pH 7.
- E
0
= potentiel standard redox pH 7, 298K, [ox] = [red] = 1 mol.L
-1
.
- R = constante des gaz parfaits = 8,315 J. mol
-1
. K
-1
.
- T = temprature absolue en kelvins.
- n = nombre dlectrons impliqus.
- F = faraday = 96 500 J.V
-1
.mol
-1
= 96 500 C. (Coulombs).
- [ox] et [red] = concentrations des formes oxyde et rduite.

Une raction doxydo-rduction fait intervenir 2 couples redox : la forme rduite dun
premier couple transfre ses lectrons la forme oxyde du second couple. On
obtient alors la forme oxyde du premier couple et la forme rduite du second
couple.
Ox
1
+ n e
-
Red
1
E
0
(1)

Red
2
Ox
2
+ n e
-
E
0
(2)

Si E
0
(2) < E
0
(1), le couple 2 est le plus rducteur.
Spontanment, les lectrons sont transfrs de la forme rduite du couple 2 la
forme oxyde du couple 1 et donc le systme 2 rduit le systme 1 :

Red
2
+ Ox
1
Ox
2
+ Red
1


Il est possible de calculer la variation dnergie libre des ractions redox dans les
conditions standard grce la relation suivante :

AG
o
= - n F [ E
0
(1) E
0
(2) ] = - n F AE
0


Quelques potentiels redox standard E
0
utiles en biochimie :

E
0
(Volt)
O
2
+ 2 H
+
+ 2 e
-

NO
3
-
+ 2 H
+
+ 2 e
-


2 cyt c (ox) + 2 e
-

2 cyt b (ox) + 2 e
-


Pyruvate + 2 H
+
+ 2 e
-


NAD
+
+ 2 H
+
+ 2 e
-


Actoactate + 2 H
+
+ 2 e
-

H
2
O

NO
2
-
+ H
2
O

2 cyt c (red)

2 cyt b (red)

Lactate

NADH + H
+


|-hydroxybutyrate

+ 0,81

+ 0,42

+ 0,25

+ 0,08

- 0,19

-0,32

- 0,35

TD BIO 241 2012-2013 BIOENERGETIQUE
40
Exercice n1 :

En vous aidant du tableau prcdent, dterminer le sens de chacune des ractions
suivantes. Justifier les rponses (on suppose que les conditions sont les conditions
standard et que le milieu contient l'enzyme catalysant la raction considre).

Pyruvate + |-hydroxybutyrate Lactate + Actoactate (1)

Actoactate + NADH + H
+

|-hydroxybutyrate + NAD
+
(2)

2 cyt c (ox) + 2 cyt b (red) 2 cyt c (red) + 2 cyt b (ox) (3)


Exercice n2 :

Une bactrie dnitrifiante A est anarobie stricte. Elle possde nanmoins une
chane transporteuse d'lectrons lui permettant de respirer . L'accepteur final
d'lectrons, au lieu d'tre l'oxygne molculaire comme dans l'arobiose est le nitrate
(NO
3
-
) rduit en nitrite (NO
2
-
). Les lectrons sont introduits dans la chane des
transporteurs d'lectrons par le nicotinamide adnine dinuclotide rduit (NADH +
H
+
).

1- Ecrire le bilan global des ractions ralises par cette bactrie.
2- Calculer la variation d'nergie libre standard correspondante.
3- La respiration nitrate est-elle thoriquement plus ou moins exergonique que la
respiration arobie ? Justifier par le calcul.



TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
41


THEME N5 : METABOLISME GENERAL





GLYCOLYSE

CYCLE DE KREBS

PHOSPHORYLATION OXYDATIVE

|-OXYDATION DES ACIDES GRAS


TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
42
Exercice n1 : Fermentation des bactries lactiques.

La plupart des bactries lactiques sont dpourvues de cytochromes. Elles peuvent
dgrader le glucose par 2 voies :
- La voie de la glycolyse
- La voie htro-fermentaire.

Le bilan de la voie de la glycolyse en conditions anarobie peut s'crire :

1 glucose

2 acides lactiques

1- On laisse se dvelopper la souche bactrienne sur un milieu contenant du
glucose dont le C1 est radioactif (
14
C). Sur quel atome de carbone de quel produit
retrouvera-t-on la radioactivit au terme de la glycolyse ?
2- Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consomm ?
On prcisera quelles sont les tapes au cours desquelles il y a consommation ou
production d'ATP.
3- La transformation de glucose en acide lactique s'accompagne-t-elle globalement
d'une rduction de nicotinamide-adnine-dinuclotide ? Expliquer votre rponse.
4- Quel serait le bilan en ATP et en NADH de la dgradation dune mole de
saccharose par la voie de la glycolyse ?
5- La voie de la glycolyse comprend plusieurs ractions couples.
Dcrire celles qui correspondent des ractions de phosphorylation lie au
substrat.

La voie htro-fermentaire d'une bactrie lactique comporte la squence de
ractions donne dans la figure 1.
Le 3-phosphoglycraldhyde form est transform en lactate par une squence de
ractions commune avec celle de la voie de la glycolyse.

6- Quel est le gain net en moles d'ATP par mole de glucose consomm par la voie
htro-fermentaire, lorsque cette voie donne les produits de fermentation figurant
dans le bilan suivant :

1 glucose 1 CO
2
+ 1 acide lactique + 1 thanol

7- Etablir le bilan de NADH + H
+
participant aux ractions de cette voie.

Une tude prcise des produits forms donne les rsultats regroups dans le tableau
ci-dessous. Toutes les valeurs sont exprimes en mmol. de produits forms partir
de 10 mmol. de glucose ferment.

Acide lactique
Ethanol
Dioxyde de carbone
Acide actique
10,2
9,7
9,5
0,0

8- Etablir la balance carbone de cette fermentation (rapport exprim en
pourcentage entre le nombre de moles d'atomes de carbone rcupres en
TD BIO2

prod
Com

Figure



Exercic

La pre
possd

1- Ecr
Ecr
Haw
2- On
con



Montre



241 2012-2013
duits et le
mmenter la
1 : Schm
ce n2 : C
emire ta
de une vari
ire cette r
ire les for
worth.
suppose
ditions de
[glu
[AD
er que dans
3
nombre d
a valeur ret
ma de la v
Changemen
ape de la
iation dne
action. N
rmules du
que les
concentra
cose] = 10
P] = 10
-4
M
s ces cond
METAB
e moles d
trouve.
oie htro
nt de sens
dgradati
ergie libre
ommer l'e
D-glucose
conditions
tions suiva
0
-5
M
M
ditions, X se
BOLISME GE
43
d'atomes d
ofermenta
d'une rac
on du D-g
standard
enzyme im
e et du p
s initiales
antes :
[A
[X
e transform
ENERAL
e carbone
aire d'une
ction bioch
glucose pa
gale - 1
plique. N
produit X
de la r
ATP] = 10
-
X] = 10
-1
M
me en gluc
e de glucos
bactrie la
imique
ar la voie
3,4 kJ.mol
Nommer le
selon la r
action co
-3
M
M
cose.
se consom
actique
e de la gl
l
-1
25C.
e produit X
reprsenta
orresponde
mmes).

ycolyse
X form.
ation de
ent aux
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
44
Exercice n3 :

Lenzyme aldolase catalyse la raction suivante dans la voie de la glycolyse :

Fructose-1,6-bisphospate Dihydroxyactone phosphate
+ Glycraldhyde-3-phosphate

Le AG
o
' de la raction est + 5,7 kcal.mol
-1
(T = 25C), alors que le AG dans la cellule
est 0,3 kcal.mol
-1
. Calculer le rapport entre produits et substrat lquilibre et dans
les conditions intracellulaires. A laide de vos rsultats, expliquer comment la raction
peut tre endergonique dans les conditions standard et exergonique dans les
conditions intracellulaires.

Rappel : 1 cal = 4,18 J.


Exercice n4 :

Un tre humain consomme environ 2800 kcal par jours en s'alimentant. Si on
considre que les voies mtaboliques qui conduisent la production d'ATP oprent
avec une efficacit thermodynamique de 50%. Calculer le poids d'ATP qui est produit
par le corps humain en une journe sachant que l'nergie libre produite par
l'hydrolyse d'une mole d'ATP = 50 kJ et masse molaire de l'ATP = 551 g/mol.


Exercice n5 :

Quelle quantit dATP, exprime en moles, une cellule musculaire peut-elle produire :

1.1- en condition arobie partir :
a- dune mole de glucose
b- dune mole dacide gras palmitique (C
16
) (donner seulement lordre de
grandeur)
1.2- en condition anarobie prolonge partir :
a- dune mole de glucose
b- dune mole dacide gras palmitique (C
16
)

Donnes : Utilisez pour le calcul les valeurs P/O suivantes : 2 moles ATP formes
par mole de FADH
2
re-oxyd et 3 moles ATP formes par mole de NADH,H
+
re-
oxyd (quelle que soit son origine cytosolique ou mitochondriale)


Exercice n6 :

Un fragment de muscle squelettique humain dans lequel une lectrode a t
implante est plong dans une solution physiologique contenant du glucose.
Lorsquil est stimul par un courant lectrique, le fragment de muscle consomme 76
moles dATP par minute. La concentration initiale en glucose de la solution
physiologique est de 3,6 g/L. Le volume total est de 10 ml. Dans ces conditions
exprimentales, tout lATP consomm par le fragment de muscle provient
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
45
uniquement de loxydation du glucose prsent dans la solution physiologique, en
condition arobie. En vous aidant des rsultats de la question prcdente,
dterminer le temps ncessaire pour que la quantit de glucose prsente dans la
solution initialement soit totalement puise. Dtailler votre raisonnement et vos
calculs.

Donne : la masse molaire du glucose est de 180 g/mol








TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
46


THEME N6 : METABOLISME GENERAL





SPECIFICITES MICROBIENNES




TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
47
Remarque prliminaire :
Tous les exercices qui suivent impliquent le calcul de temps de gnration (Tg) et de
taux de croissance (v). Il sagit de notions que vous avez abordes au cours de lUE
BIO231, et il vous suffira donc de vous reporter au polycopi de TD de cette UE pour
vous remmorer leur mode de calcul.
v =
Tg
1
(v est exprim en divisions.min
-1
ou divisions.h
-1
, et Tg en min ou h)
log N = (
Tg
log2
x At ) + log N
0
avec N = population un temps t
N
0
= population initiale
At = t t
0
Exercice n1 :
Dans le cadre d'un travail sur le catabolisme des sucres chez Escherichia coli, vous
avez voulu tudier l'influence de la nature des sources de carbone sur la croissance.
Vous avez effectu trois cultures parallles, inocules avec la mme pr-culture une
DO
600
initiale gale 0,7, en variant la composition du milieu comme suit : A, milieu
minimum + glucose 0,25% + lactose 0,1% ; B, milieu minimum + glucose 0,15% +
lactose 0,2% ; C, milieu minimum + glucose 0,07% + lactose 0,28%. Les rsultats sont
prsents dans la figure ci-dessous.

1- Dcrivez lallure gnrale de la courbe (A, B ou C).
2- Calculez (aussi prcisment que possible) les diffrents temps de gnration et taux
de croissance horaires.
3- Interprtez les diffrences observes entre les 3 courbes, en faisant rfrence vos
connaissances thoriques sur le sujet.
4- Comment pourriez-vous faire pour tester votre interprtation du phnomne mis en
vidence ?
5- Si vous aviez remplac le glucose par du maltose, qu'auriez-vous vu ?

5 4 3 2 1 0 5 4 3 2 1 0 5 4 3 2 1 0 t (h)
DO
600


A B C
0,1
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
48
Exercice n2 :

Vous tudiez le catabolisme du glycrol chez une bactrie. Vous avez ralis
diffrentes cultures en milieu minimum en variant uniquement la concentration en
glycrol, sachant quil sagit l de la seule source de carbone disponible. A : [glycrol] =
400 mg.L
-1
, B : [glycrol] = 100 mg.L
-1
, C : [glycrol] = 40 mg.L
-1
, D : [glycrol] = 10
mg.L
-1
. Le milieu de culture ne contient que des nutriments, le glycrol rentre dans la
cellule par diffusion facilite.
1- Calculez les temps de gnration des diffrentes courbes.
2- Comment interprtez-vous le fait que les courbes de croissances A et B soient
identiques ? Quelle exprience complmentaire vous permettrait de tester votre
hypothse quant la culture A (proposez un protocole succinct, et analysez les
probables rsultats exprimentaux) ?
3- Pourquoi la culture C entre-t-elle en phase stationnaire avant les cultures A et B, et
une DO plus faible ? Quelle exprience complmentaire vous permettrait de tester
votre hypothse (proposez un protocole succinct, et analysez les probables rsultats
exprimentaux) ?
4- Comment expliquez-vous les diffrences entre les courbes C et D ?



















Exercice n3 :

On tudie la croissance d'une bactrie dans un milieu dfini, contenant un tampon de
rgulation du pH (Na
2
HPO
4
: 3,8 g.L
-1
, KH
2
PO
4
: 1,5 g.L
-1
), des sels minraux (MgSO
4
:
200 mg.L
-1
; CaCl
2
: 20 mg.L
-1
). Le glucose (2 g.L
-1
) est la seule source de carbone et
dnergie ; la source dazote est soit du nitrate de potassium (KNO
3
) (culture A), soit du
chlorure dammonium (NH
4
Cl) (culture B). Aprs 3 h de culture, on fait buller de lazote
(N
2
) dans le milieu de culture dans le seul but de chasser rapidement loxygne
dissous. Toutes les 30 minutes, une aliquote de la culture est prleve, sur laquelle on
effectue une mesure de DO
600
(le 0 est rgl avec le milieu de culture non inocul).
5 4 3 2 1 0 t (h)
DO
600


A
B
9 8 7 6 13 12 11 10 17 16 15 14 19 18
C
D
x
0,1
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
49
1- Calculez temps de gnration et taux de croissance (expliquez brivement vos
calculs).
2- Commentez l'aspect des deux courbes. A quel(s) phnomne(s) biologique(s) peut-
on imputer lorigine des diffrences observes : avant et aprs le bullage ; entre les
cultures A et B (justifiez vos rponses).
3- On sintresse deux mutants (M1, M2) drivs de la bactrie tudie. Daprs les
courbes de croissance obtenues, quelle(s) hypothse(s) pourriez-vous mettre qui
puisse expliquer, pour chaque mutant, la diffrence de comportement : par rapport
la souche sauvage ? entre les deux cultures A et B ?
4- Pour chacune des trois souches tudies, que se passerait-il si, aprs avoir lanc
une culture dans le milieu A en absence doxygne, on injectait de loxygne dans la
culture t = 3 h (esquissez la courbe de croissance) ?




















2,5 2 1,5 1 0,5 0 t (h)
DO
600

M1-A
4,5 4 3,5 3 6,5 6 5,5 5 8,5 8 7,5 7 9,5 9
M1-B
M2-A
M2-B
bullage
dazote
0,1
2,5 2 1,5 1 0,5 0 t (h)
DO
600


A
4,5 4 3,5 3 6,5 6 5,5 5 8,5 8 7,5 7 9,5 9
B
bullage
dazote
0,1
TD BIO241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
50
Exercice n4 :

Des chercheurs sintressent au comportement de bactries du genre Shewanella
quand on ajoute dans leur milieu de culture de lADN. Ils ont ralis diffrentes cultures
dont les rsultats sont prsents dans les deux figures ci-dessous.



Figure 1 : Cultures en arobie des bactries
Shewanella oneidensis MR-1 (A), Shewanella
putrefaciens CN32 (B) et Shewanella sp. souche
W3-18-1 (C) dans un milieu de culture
contenant : du PIPES (solution tampon) ; de lacide
lactique ; NH
4
Cl, NaCl, MgCl
2
, KCl, CaCl
2
et
Na
2
SeO
4
; des traces de vitamines et de minraux ;
et NaH
2
PO
4
(carrs noirs) ou ADN de sperme de
hareng (carrs blancs). Les donnes prsentes
correspondent la densit optique, c.a.d. la
biomasse totale.


Figure 2 : Cultures en anarobie de Shewanella
oneidensis MR-1 dans un milieu contenant : du
PIPES (solution tampon) ; de lacide lactique ;
NH
4
Cl, NaCl, MgCl
2
, KCl, CaCl
2
et Na
2
SeO
4
;
Fe(III)-NTA (= Fe
3+
complex de lacide
nitriloactique) ; des traces de vitamines et de
minraux. Dans la figure 2A, les chercheurs ont
ajout au milieu de culture du NaH
2
PO
4
; dans la
figure 2B, du NaH
2
PO
4
et de lADN de sperme de
hareng. Les carrs noirs reprsentent la quantit de
cellules en suspension ; les ronds blancs
reprsentent la concentration en Fe
2+
.
1- Au vu des rsultats prsents dans la Figure 1, que pouvez-vous dire du rle jou
par lADN (justifiez votre rponse) ?
2- Quels autres rles pourrait-il jouer (et quelles incidences pourrait-on en tirer quant
la composition des milieux de culture) ?
TD BIO 241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
51
3- Quel rle le Fe(III)-NTA joue-t-il dans les cultures de la Figure 2, et quelles
conclusions pouvez-vous en tirer quant aux capacits mtaboliques des bactries
du genre Shewanella ?
4- Pouvez-vous expliquer labsence de croissance bactrienne dans la Figure 2C ?


TD BIO 241 2012-2013 METABOLISME GENERAL
52
CORRIGES valeurs numriques


Thme n1 : Rappels

Concentrations
Ex 1
1: 0,41 g NaOH - 1,02 g CuSO
4
, 5H
2
O - 2,73 g tartrate de K et Na, 4H
2
O - 5,44 g Na
2
CO
3
, 10 H
2
O

3: Sulfate de cuivre :0,01 % - Tartrate de K et Na 0,02%

Ex 2
1: 17,4 M - 17,4 N - 57 mL acide actique concentr + H
2
O qsp 1L
2: 17,7 M - 35,4 N - 28 mL acide concentr + H
2
O qsp 1L

Spectrophotomtrie
Ex 1
1:
trp
= 6000 M
-1
.cm
-1

2: 4 rsidus Trp

Ex 2
1:
ura
= 12 000 M
-1
.cm
-1

2: [Ade] = 10
-5
M - [Ura] = 2 .10
-5
M

Acides/Bases faibles
Ex 1
1: pH = 4,46 2: pH = 2,56


Thme n2 : Rappels sur les protines

Ex 2
Leu pH
i
= 6 - Cys pH
i
= 5 - His pH
i
= 7,6

Ex 3
pH
i
peptide = 6,5

Thme n3 : Enzymologie

Energie dactivation
1 : Aucun catalyseur : k = 4,27.10
-14

Platine collodal : k= 1,84.10
-9

Catalase : k = 3,75.10
-2


2 : Platine collodal : 4,3.10
4
- catalase env 10
12


Cintique enzymatique
Ex 2
1 : K
M
= 3.10
-5
M
2 : k
cat
= 5.10
3
s
-1

3 : k
cat
/K
M
= 1,67.10
8
s
-1
.M
-1


Ex 3
4a : V
o
= 0,1 M.mn
-1

4b : V
o
= 0,05 M.mn
-1

4c : V
o
= 0,066 M.mn
-1


Ex 4
1: K
M
= 2,86.10
-4
M
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53
2 : [I] = Ki

Ex 6
2 : compos A Ki = 150 M - compos B Ki= 60 M

Activit enzymatique
Ex 1
1 : AS
1
= 1,6 nkat.mg
-1
protines
2 : AS
2
= 965 nkat.mg
-1
protines - F
p
~ 600

Ex 3
3 : pour 1 mL de srum, AE = 1,67 nkat.mL
-1


Ex 4
3 : V
o
= 6,7.10
-6
M.mn
-1

4 : 1 ml sol GDH, AE = 3,3 nkat.mL
-1

5 : AS = 2,1 nkat.mg
-1


Ex 5
4 : AE : 20000 nkat.mL
-1

7 : conc. Protines = 0,04 mg.mL
-1

8 : AS = 5.10
4
nkat.mg
-1


Thme n4 : Bionergtique

ENERGIE LIBRE SENS DES REACTIONS - EQUILIBRE
Ex 2
[oxaloactate] = 3,33.10
-4
M.
[L-alanine] = 1,33.10
-3
M.
[pyruvate] = [aspartate] = 6,67.10
-4
M.

POTENTIELS REDOX FORMULE DE NERNST
Ex 2
2 : respiration nitrate AG
o
= -142,8 KJ.mol
-1

3 : respiration arobie AG
o
= -218 KJ.mol
-1


Thme n5 : Mtabolisme gnral

Ex 1
8 : Balance carbone de la voie htrofermentaire = 99,2%

Ex 3
A lquilibre : [dihydroxyactone-P] [glycraldhyde-3-P] = 6,7.10
-5
[fructose-1,6-BP]
Conditions intra-cellulaires : [dihydroxyactone-P] [glycraldhyde-3-P] = 4.10
-5
[fructose-1,6-BP]

Ex 4
Le poids dATP produit est : = 64,5 kg

Ex 6
Temps dpuisement du glucose : = 100 min soit 1h 40 min

Thme n6 : Mtabolisme - spcificits bactriennes

Ex 1
2 :
1re phase de croissance : Tg = 1h ; = 1 division.h
-1

2me phase de croissance : Tg = 2h30 ; = 0,4 division.h
-1


Ex 2
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54
1 : A - B - C : Tg = 2,5 h - D : Tg = 4,5 h

Ex 3
1:
Avant bullage : Tg = 0,75 h (45 min) - = 1,32 divisions.h
-1

Aprs bullage - A : Tg = 1,25 h (75 min) - = 0,8 divisions.h
-1

Aprs bullage - B : Tg = 3,4 h (205 min) - = 0,3 divisions.h
-1