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Annales des falsifications, de l’expertise chimique et toxicologique, 2 ème Semestre 2004-N°965-pp.169-196

Article original

Analyse de la fraction phénoliques des huiles d’olive vierges

Denis Ollivier 1 , Estelle Boubault 1 , Christian Pinatel 2 , Sylvie Souillol 1 , Michel Guérère 1 , Jacques Artaud 3

1 Laboratoire de Marseille, Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la Répression des Fraudes, 146 traverse Charles-Susini, 13388 Marseille cedex 13 (denis.ollivier@dgccrf.finances.gouv.fr)

2 Association Française Interprofessionnelle de l’Olive (AFIDOL), Maison des Agriculteurs, 22 avenue Henri-Pontier, 13626 Aix-en-Provence cedex 1

3 Laboratoire de Chimie Analytique de l’Environnement, UMR CNRS 6171, IFR 112, Eutôpole de l’Arboit, Bâtiment Villemin, BP80 Aix-Marseille III.

Titre abrégé : Phénols dans les huiles d’olive vierges

Résumé : Ce travail est une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiométrique dans le visible des composés phénoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des ortho-diphénols dans les huiles d’olive vierges. Nous avons étudié l’influence de certains paramètres analytiques sur ces dosages. Une détermination par chromatographie liquide des composés phénoliques d’huiles d’olive vierges a été réalisée pour caractériser des conditions de stockage de l’huile et des états de maturation des olives. Ce travail a été réalisé avec notamment le soutient financier de la Commission européenne (programme de recherche et développement « Qualité de la vie et management des ressources ») dans le cadre du programme européen OLIV-TRACK (QLK1-CT-

2002-02386).

Mots clés : Phénols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphénols, huile d’olive vierge, chromatographie liquide.

Title : Phenols analysis in virgin olive oils

Abstract : This work focuses on the colorimetric determination of total phenols with the Folin- Ciocalteu and ortho-diphenols with bibliographic data. Different analytical methods by colorimetric determinations and liquid chromatography were developed to analyze the stability during olive ripening and the oil storage. This study has been carried out with financial support from the Commission of the European Communities, specific RTD programme "Quality of Life and Management of Living Resources", QLK1-CT-2002-02386, "Traceability of origin and authenticity of olive oils by combined genomic and metabolomic approaches (OLIV-TRACK)".

Keywords : Phenols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphenols, virgin olive oils, liquid chromatography.

Introduction

L’huile d’olive vierge est obtenue uniquement par des procédés physiques (lavage, broyage,

malaxage, centrifugation, décantation

pas d'altération de l'huile. Ces procédés la différencient des autres huiles alimentaires qui, pour la

grande majorité d'ente elles, sont raffinées. Les procédés mis en œuvre lui confèrent une composition originale avec environ 98% de triglycérides et 2% de composés mineurs. Ces derniers appartiennent à des familles très diverses telles que : hydrocarbures (avec une prépondérance du squalène de 0,3 à 1,2 g/100g), tocophérols, stéroïdes, alcools aliphatiques, composés volatils, composés phénoliques … Les composés phénoliques, improprement appelés souvent « polyphénols », sont responsables de la bonne stabilité à l’oxydation des huiles d’olive vierges. Outre leur propriété anti-oxydante, ils

)

dans des conditions notamment thermiques qui n'entraînent

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possèdent d’intéressantes propriétés nutritionnelles et organoleptiques. Les principaux composés des huiles d’olive vierges sont représentés dans les figures 1, 2 et 3.

La détermination de la teneur en composés phénoliques des huiles d’olive devient une analyse importante bien que non réglementaire à ce jour. Elle fait cependant partie du cahier des charges de quelques huiles italiennes de dénomination d’origine protégée (DOP, équivalent à nos AOC ) avec une teneur minimale en phénols totaux à respecter.

La teneur en composés phénoliques des huiles d'olive vierges dépend :

de la variété de l'olive ;

du degré de maturité des olives (la teneur baisse avec la sur-maturation des olives) ;

du niveau d’infestation des olives par la mouche Dacus oleae [1] ;

du climat ;

de la qualité du sol ;

du procédé d'extraction utilisé pour séparer la phase huileuse de la phase aqueuse ;

des conditions de conservation de l'huile…

Diverses techniques ont été mises en œuvre pour l’analyse qualitative et quantitative des composés phénoliques :

- l’absorptiométrie dans le visible selon la méthode de Folin-Ciocalteu (FC) [2] ;

- la chromatographie en phase liquide (HPLC) avec détection spectrophotométrique ou électrochimique [3,4] ;

- la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse [5] ;

- l’enzymologie [6] ;

- la spectrométrie de masse avec ionisation chimique à la pression atmosphérique (ACPI- MS) [7].

Le but du présent travail est de :

- réaliser une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiométrique dans le visible des composés phénoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des o-diphénols présents dans les huiles d’olive vierges ;

- d’étudier l’influence de certains paramètres analytiques sur ces dosages ;

- d’effectuer une étude en chromatographie liquide (CLHP) des composés phénoliques des huiles d’olive vierges. Ce travail a été effectué avec notamment le soutient financier de la Commission européenne (programme de recherche et développement « Qualité de la vie et management des ressources ») dans le cadre du programme européen OLIV-TRACK (QLK1-CT-2002-02386).

1. Les composés phénoliques

Les huiles d’olive vierges sont riches en composés phénoliques appartenant à diverses familles :

).

Certains composés phénoliques confèrent aux huiles vierges une saveur amère et une sensation de piquant.

(phénols et hydroxyphénols, acides et alcools phénols, sécoïridoïdes, lignanes, flavonoïdes,

L'oléuropéine et le ligstroside sont les sécoïridoïdes majoritaires de l’olive [8]. Leur aglycone, lipophile, sont présents dans l’huile d’olive. Leurs formules sont représentées figure 2.

Au cours de la maturation du fruit, les glucosides sont hydrolysés pour donner des aglycones qui confèrent à l'huile d'olive sa saveur si particulière. Des phénomènes d’oxydation se produisent

2

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également lors de la trituration des olives et entraînent la formation de composés qui contribuent aux arômes et à la saveur de l'huile.

En général, les huiles d'olives « fruité vert » obtiennent les notes les plus fortes en dégustation car elles ont des fruités plus intenses et des arômes plus complexes que les huiles « fruité mûr » et « fruité noir ». Ces caractéristiques sont dues à leur forte teneur en composés phénoliques, aldéhydes, alcools, alcènes… Cependant, une trop grande concentration en phénols donne une amertume excessive et déplaisante, généralement peu appréciée par les consommateurs bien qu’il s’agisse d’un critère de "qualité" pour l’huile.

Les alcools phénoliques OH OH OH CH 2 -CH 2 -OH CH 2 -CH 2
Les alcools phénoliques
OH
OH
OH
CH 2 -CH 2 -OH
CH 2 -CH 2 -OH
Hydroxytyrosol
Tyrosol
2-(3,4-dihydroxyphényl)-éthanol
2-(4-hydroxyphényl)-éthanol
Les acides phénoliques
OH
OH
OCH 3
COOH
CH=CH-COOH
Acide vanillique
acide 4-hydroxy-3-méthoxybenzoïque
Acide p-coumarique
acide para-hydroxycinnamique
OH
OH
OCH 3
OH
CH=CH-COOH
CH=CH-COOH
Acide férulique
acide 4-hydroxy-3-méthoxycinnamique
Acide caféique
acide 3,4-dihydroxycinnamique
Les flavonoïdes
OH
OH
OH
HO
O
HO
O
HO
O
OH
O
Lutéoline
Apigénine

Figure 1 : formules de quelques alcools, acides phénols et flavonoïdes

3

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Composés hydrophiles

 

Composés lipophiles

 
 

fruits,

feuilles

huile

 

COOCH 3

O O OH O
O
O
OH
O

HO

COOCH 3

 

HO

O O O OH O HO O
O
O
O
OH
O
HO
O

OH OH

 

HO

OH

 

Oléuropéine,

 

Oléuropéine aglycone

 
 

COOCH 3

HO

O O O O HO O HO
O
O
O
O
HO
O
HO

OH OH

O O O
O
O
O

HO

COOCH 3

OH

 
 

Ligstroside

 

Ligstroside aglycone

Figure 2 : Les sécoïridoïdes de l’olive, des feuilles et de l’huile.

HO

OMe O R O
OMe
O
R
O

OMe

R= H

R= OCOCH 3

Pinorésinol

1-acétoxypinorésinol

OH

Figure 3 : Les lignanes de l’huile d’olive

LLeess ccoommppoossééss pphhéénnoolliiqquueess eett llaa ssaannttéé hhuummaaiinnee [9, 10]

Activité antioxydante

Les composés phénoliques de l'huile d'olive vierge ont des propriétés antioxydantes qui réduisent les risques de maladies cardiovasculaires. Ceci est surtout vrai pour les ortho-diphénols comme l'hydroxytyrosol et l'oléuropéine aglycone.

Leurs propriétés antioxydantes sont dues à leur capacité à former une liaison hydrogène intramoléculaire entre l'hydrogène libre du groupement hydroxy et l'hydroxyle du radical phénoxy pour conduire à la formation d’une quinone [11].

Interférence avec les enzymes

L'oléuropéine aglycone agit sur l'activité immunitaire des macrophages [12]. En effet, il a un effet positif sur la formation de bactéricides et de l'enzyme oxyde nitrique synthétase. Cette enzyme joue un rôle d'anti-inflammatoire.

4

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2. Dosage des phénols

La quantification des composés phénoliques est le plus souvent réalisée par absorptiométrie dans le visible ou par chromatographie en phase liquide (HPLC) avec une détection spectrométrique dans l’ultraviolet. La méthode absorptiométrique est facile à mettre en œuvre mais n’est pas spécifique et ne permet pas une analyse fine des différents composés phénoliques présents dans l’huile. En revanche, la chromatographie en phase liquide est sensible, spécifique mais demande un appareillage coûteux et se heurte à l’absence de composés commerciaux de référence pour les identifications.

2.1. Méthode de Folin-Ciocalteu

Récemment, Singleton et al [13] ont réalisé une mise au point importante sur le dosage des phénols selon Folin-Ciocalteu (FC). La méthode de FC a été très utilisée pour le dosage des phénols dans les vins et les spiritueux mais aussi dans divers substrats dont les huiles d’olive. Les échantillons de composés phénoliques, traités avec le réactif de FC (hétéropolyphosphotungstates-molybdates) (mélange d’acides phosphotungstinique et phosphomolybdique) (réactif commercial, Prolabo ref : 31 360.264), en milieu alcalin (carbonate de sodium), développent une coloration bleue dont l’absorption est mesurée à 760 nm. La température et le temps de réaction influent sur le développement de la coloration. Les conditions expérimentales proposées par différents auteurs [13, 14] sont données ci-dessous :

« 1 ml d’échantillon (de blanc ou d’étalon) est ajouté à au moins 60 ml d’eau distillée dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter 5 ml de réactif de FC et mélanger. Après une minute et avant huit minutes, ajouter 15 ml de carbonate de sodium à 20 %. Ajuster le volume à 100 ml. Mesurer l’absorbance de la solution au bout de 2 heures à environ 23°C (760 nm ; cuve de 1 cm) ». La préparation de l’échantillon peut se faire en diminuant les quantités d’un facteur 5 :

« 2 ml d’un échantillon dilué au 1/10 ;10 ml de réactif de FC dilué au 1/10 ; 8 ml de carbonate de sodium (7,5 g/100 ml d’eau) pour un volume final de 20 ml ».

Les mesures sont effectuées par rapport à un composé de référence qui pour l’analyse des phénols dans les vins est le plus souvent l’acide gallique. Une liste de composés, susceptibles d’interférer sur les mesures d’absorbance, est donnée [12] avec leur absorptivité molaire.

L’huile d’olive

La teneur en composés phénoliques totaux dans les huiles d’olive a été très souvent déterminée en utilisant la méthode de FC (Tableau 1). Blekas et al. [14] indiquent que dans l’huile d’olive, il n’y a que peu de composés susceptibles d’interférer sur les mesures (absence de sucres réducteurs, d’acide ascorbique, d’ions ferreux ou zinc). Les résultats sont exprimés par rapport à une substance de référence qui varie selon les auteurs (Tableau 1). Il est donc très difficile de comparer les résultats en raison d’une part des différences d’absorptivité des composés de référence utilisés et d’autre part de la variation des conditions expérimentales dans lesquelles la réaction de FC est réalisée. Pour le même échantillon, les valeurs extrêmes trouvées pour les phénols totaux avec 12 étalons différents, varient de 70 mg/kg pour l’acide 3,4-dihydroxyphénylacetique à 380 mg/kg avec l’acide p-hydroxybenzoïque [14]. Les valeurs [14] sont respectivement de 92 et 105 mg/kg avec l’acide caféique et l’acide gallique qui sont les étalons les plus utilisés (Tableau 1). La méthode manque de spécificité, le dosage ne permettant pas de distinguer les phénols simples des phénols complexes [15, 16, 17, 18]. Les résultats obtenus par absorptiométrie selon FC diffèrent de ceux obtenus par chromatographie en phase liquide [17, 19, 20].

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La stabilité à l’oxydation, évaluée par le test de Swift avec le Rancimat, ne serait pas corrélée avec la teneur en composés phénoliques pour Pirisi et al. (18) ce qui est contraire aux résultats d’autres auteurs qui trouvent que la stabilité des huiles est bien corrélée avec la teneur en phénols totaux [21,

22].

Malgré ces problèmes et les divergences de la littérature, Blekas et al. [14] considèrent que le dosage des phénols des huiles d’olive selon FC constitue une bonne analyse de routine.

Tableau 1 : Étalons, λ de mesure, domaine de variation

Ref.

Auteurs

Étalons

λ mesure

Teneurs en phénols en mg/kg d’huile

 

nm

[22]

Singleton, (1965)

Ac gallique

765

 

FC

[23]

Montedoro, (1969)

Gallotanin

 

76-442

FC

[24]

Montedoro, (1972)

Ac gallique

765

 

FC

[25]

Ragazzi, (1973)

Tyrosol

 

34,90-271,04 mg/l

FC

[26]

Vazquez, (1978)

Ac caféique

 

50-500

FD

[27]

Gutfinger, (1981)

Ac caféique

725

44-157

FC

[28]

Cortesi (1983)

   

180-454

 

[29]

Solinas, (1987)

   

260-665

 

[30]

Nergiz, (1991) selon [21]

Ac caféique

725

35-355

FC

[3]

Montedoro, (1992)

Ac gallique

765

50-1000

FC

[15]

Tsimidou, (1992)

Ac caféique

725

18,7-242,5

FC

[31]

Favati, (1994)

Tyrosol

 

98-458

FC

[32]

Stefanoudaki, (1995)

Ac caféique

725

153-400

FD

190-500

[21]

Baldioli selon [3], (1996)

Ac gallique

765

 

FC

[33]

Poiana selon [3], (1996)

Ac gallique

765

85-195

 

110-180

[19]

Cioni, (1998)

Ac gallique

765

119-139

 

[34]

Caponio (1999)

Ac gallique

765

175-490

FC

[35]

Ranalli (1999)

Ac caféique

725

99-203

FC

[36]

Beltran (2000)

Ac caféique

725

100-904

 

[37]

Capannesi (2000)

Ac gallique

765

   

[38]

Giacometti (2001)

Ac caféique

725

52-356

FC

[39]

Lo Curto 2001)

Ac caféique

725

59-255

FC

[40]

Pellegrini selon [22], (2001)

Ac gallique

765

73-265

FC

[41]

Ranalli

Ac caféique

 

115-159

 

[42]

Salvador (2001)

Ac caféique

725

19-380

FC

[43]

Tasioula selon [27]

Ac caféique

725

 

FC

[14]

Blekas (2002)

Ac caféique

725

20 à 339

FC

[44]

Gimeno (2002)

Ac caféique

765

42-124

FC

[45]

Gomez-Alonso (2002)

Ac caféique

725

130-170

FC

[46]

Psomiadou (2002)

Ac caféique

 

98-209

FC

[47]

Bendini (2003)

Ac gallique

750

   

FC : Folin-Ciocalteu ; FD : Folin-Denis [13]

Protocoles expérimentaux

Les tableaux 2 et 3 résument les différents protocoles expérimentaux décrits dans la littérature en ce qui concerne l’extraction des phénols et les conditions expérimentales de réalisation de la réaction de FC.

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Tableau 2 : Extraction des phénols

Réf.

Huile

Solvant / ml

 

Solvant extraction

Tween 20

Lavage

 

g

 

v/v

 

g

 

ml

[27]

10

Hexane/50

3x20ml ;MeOH/H 2 O; 6/4

non

 

-

[3]

10

 

non

3x10ml ;MeOH/H 2 O; 8/2

 

oui

 

-

[15]

50

Hexane/50

3x30ml ;MeOH/H 2 O; 6/4

non

Hexane 3x50

[19]

2

Hexane/1

3x2ml ;MeOH/H 2 O; 6/4

non

Hexane 2x2

[37]

2,5

Hexane/2,5

3x2,5ml ;MeOH/H 2 O; 8/2

non

 

-

[38]

50

Hexane/50

3x30ml ;MeOH/H 2 O; 6/4

non

Hexane 3x50

[39]

40

 

non

20ml ;MeOH/H 2 O; 8/2

non

 

-

[14]

30

Hexane /30

3x30ml ;MeOH/H 2 O; 6/4

non

Hexane 1x50

[48]

10

 

non

2x10ml ; MeOH/H 2 O; 8/2

 

0,2

Hexane* 10

   

puis 2x5ml

*Hexane saturé en MeOH/H 2 O (8/2)

 

Tableau 3 : Conditions de la réaction de Folin-Ciocalteu

 

Réf.

Huile départ

Volume final

 

Prise essai

Folin

Na 2 CO 3

V. final

Temps

λ

g

Extrait MeOH

   

ml

 

ml

min

nm

[27]

10

1ml

 

100µl

0,5

1ml ; 35%

10

60

725

[3]

10

np

 

np

np

np

np

np

np

[15]

50

5ml

 

2ml

0,5

1ml ; sat

25

60; obs

725

[19]

2

100µl

 

100µl

2,5

5ml ; 7,5%

50

-

765

[37]

2,5

np

   

- 2,5

5ml ; 7,5%

50

1 nuit

765

[38]

50

-

   

- 0,5

1ml; saturé

25

60

725

[39]

40

200µl

 

200µl

10ml à 10%

8ml ; 7,5%

20

60

725

[14]

30

aliquote

 

5ml/25 puis

0,5

1ml ; 35%

25

60

725

2ml

[48]

10

50 ml

 

2ml

1,0

5ml ; 10%

20

90, obs

750

np : non précisé; obs : obscurité

La très grande diversité des conditions d’extraction et des conditions de réactions sont probablement une des causes de la variabilité des teneurs en phénols données dans le tableau 1. Il devient donc nécessaire de définir avec précision l’ensemble des conditions expérimentales du dosage pour évaluer les teneurs en phénols dans les huiles d’olive.

2.2. Dosage des ortho-diphénols

Les o-diphénols sont les anti-oxydants les plus puissants (hydroxytyrosol, acide caféique…). Différents étalons ont été utilisés en fonction des auteurs. Le tableau 4 donne les étalons utilisés, la longueur d’onde de mesure et le domaine de variation des teneurs.

Tableau 4 : Étalons, λ de mesure, domaine de variation

Réf.

Référence

Étalons

λ mesure

Teneurs en o-diphénols (mg/kg)

nm

[27]

Gutfinger, 1981

Ac. caféique

350

5-15

[49]

Ranalli 1997

Ac. caféique

 

61-194

[50]

Mateos, 2001

 

370

 

[51]

Salvador, 2001

Ac. caféique

370

7,8 ± 5,5

[14]

Blekas, 2002 (méthode A)

Ac. caféique Ac. 3,4-di OHPhénylAcé

350

7-24

450

42-168

[14]

Blekas, 2002 (méthode B)

Ac. caféique Ac. 3,4-di OHPhényl Acé

350

12-186

450

6-87

[45]

Gomez-alonso, 2002

Ac. caféique

370

6,45-9,07

[47]

Bendini, 2003

Ac. gallique

370

66,7-90,0

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Les deux méthodes les plus utilisées ont été étudiées. Ces méthodes d’après la littérature seraient spécifiques des o-diphénols. La méthode A est basée sur la formation de complexes entre les o-diphenols et les ions molybdate, Les o-diphénols réagissent avec le molybdate pour former un complexe jaune. La méthode B est basée sur la nitration des o-diphénols avec le nitrite de sodium en présence d’ions molybdate. Ces derniers augmentent l’intensité de la couleur des dérivés nitrés probablement par formation de complexes. Le tableau 5 rassemble les différentes conditions analytiques de ce dosage.

Tableau 5 : Conditions de la réaction de dosage des o-diphénols.

Réf.

Huile

Extrait

Prise

Eau

Phosphate

Na 2 MoO 4

Temps

λ

départ

MeOH

essai

pH=6,5

5%

Min

g

ml

 

ml

ml

0,1 M, ml

ml

nm

[27]

10

1

0,2

1

1 2

 

15

350

[49]

             

np

[50]

2,5

10

1

4

   

1

15

370

[51]

             

370

[14]

30

2

2

0,2

1

1 2

   

350

[14] 3

30

2

2

0,2

1

     

450

[45]

             

370

[47]

             

370

1 MeOH/H 2 O (1/1) ; 2 2ml fraction polaire dans 5 ml méthanol puis ajusté à 25 ml avec H 2 O 3 méthode B différente basée sur la nitration en présence de molybdate

3. Matériels et méthodes

3.1. Les échantillons

Les analyses ont porté sur :

- Une huile d’olive vierge d’origine espagnole ;

- Une huile monovariétale de Picholine a été conservée au laboratoire à différentes températures (- 18°C, +4°C et T°C ambiante) depuis 2001 et à l’abri de la lumière, les analyses ont été effectuées après 36 mois de stockage;

- Quatre huiles issues d’olives de la variété Tanche à des états de maturité différents ;

- Deux huiles mono-variétales (Bouteillan et Salonenque) en vue de déterminer des profils spécifiques.

3.2. Dosages absorptiométriques

Extraction des composés phénoliques

10 g d'huile d'olive (à 0,01 g près) et 10 ml de solution méthanolique (méthanol/eau; 80/20, v/v) sont placés dans un tube à centrifuger. On agite pendant 10 minutes au Vortex. Après centrifugation, pendant 15 min à 3800 rpm, la phase méthanolique est récupérée et transférée dans une fiole jaugée de 50 ml. L’opération est reconduite 2 fois et on complète au trait de jauge avec la solution méthanol/eau (80/20).

Dosage absorptiométrique Folin-Ciocalteu

Une solution mère de tyrosol (Extrasynthèse, 4834) à 1mg/ml dans le mélange méthanol/eau (80/20, v/v) est utilisée pour préparer des solutions filles à 10, 20, 80 et 200 µg/ml. À 2 ml de solution extraite sont ajoutés 5 ml d’eau distillée, 1 ml de réactif et 5 ml d’une solution aqueuse de Na 2 CO 3 (à 10%, p/v). Après agitation, la solution est laissée à l’obscurité avant la mesure de l’absorbance à 750 nm. Des quantités de réactifs de 1 à 5 ml de réactifs ont été utilisées, des temps de contact de

8

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30, 60 et 90 min ont été utilisés. Le dosage a été ensuite réalisé avec 2 autres étalons l’acide syringique (Fluka, 86230) et l’acide 4-hydroxyphénylacétique (Fluka, 56140).

Dosage absorptiométrique des ortho-diphénols à partir de la méthode A [14, 50]

Une solution mère d’acide caféique (Extrasynthèse, 6018) à 2,617 mmol -1 dans le mélange méthanol/eau (1/1, v/v) est utilisée pour préparer des solutions filles comme définies dans le tableau 6. À 2 ml de solution extraite sont ajoutés 0,5 ml d’une solution de molybdate de sodium dihydraté (à 5%, p/v, dans un mélange éthanol/eau, 1/1, v/v). Le mélange est agité vigoureusement et après 15 minutes, l'absorbance des solutions phénoliques est mesurée à 370 nm. On observe une coloration jaune plus ou moins intense.

Tableau 6 : Solutions étalons

 

E1

E2

E3

E4

E5

Sol. mère d'acide caféique (ml)

0,4

1

2,1

3,2

4,2

Volume fioles jaugées (ml)

20

20

20

20

20

Sol. méthanolique (1:1)

 

Compléter au volume

 

Concentration en acide caféique (10 -3 mmol.l -1 )

52,33

130,83

274,75

418,67

549,51

3.3. Dosage par chromatographie liquide

Extraction des composés phénoliques [50]

On introduit 2,5 g d'huile dans un ballon auquel on ajoute 200 µl de chaque solution étalon (acide para-hydroxyphénylacétique dans MeOH à 4,64.10 -2 mg/ml et/ou de l’acide syringique à 9,6.10 -3 mg/ml). On évapore au rotavapor à une température inférieure à 40°C le solvant de l’étalon. On reprend le résidu dans 6 ml d'isooctane pour passage sur SPE.

Extraction sur phase solide (SPE) [50]

L’extraction est réalisée avec une cartouche de phase diol Supelclean LC-DIOL (500 mg/3ml) SUPELCO (greffage polymérique: 2,3-dihydroxypropoxypropyl (7% C)). On conditionne les cartouches avec 6 ml de méthanol puis 6 ml d'isooctane. On élue l’extrait précédent, puis on lave une 1 ére fois avec 2×3 ml d'isooctane, puis une 2 e fois avec 4 ml d'un mélange d'isooctane/acétate d'éthyle (90/10, v/v). L’élution des composés phénoliques s’effectue avec 10 ml de méthanol que l'on transfère dans un ballon conique. On évapore à sec à une température inférieure à 40°C. Le résidu est extrait avec 100 µl de méthanol/eau (1/1, v/v) à 40°C. On injecte 10 µl de la solution obtenue.

Analyse par chromatographie liquide [52]

L’analyse de la fraction phénolique est réalisée sur une chaîne Lachrom (MERCK). Le solvant d’élution est un gradient binaire A= H 2 O/ CH 3 COOH (98/2, v/v), B= CH 3 OH/CH 3 CN (50/50, v/v) suivant un gradient dont les conditions sont reprises dans le tableau 7. L'appareil utilisé est un système avec un détecteur spectrophotométrique UV2000 (Spectra-Physics) fonctionnant à 2 longueurs d’onde. Le système de séparation est un ensemble de deux colonnes Chromolith TM Performance RP-18e MERCK (4,6 mm x 100 mm) montées en série précédé d’une pré-colonne Chromolith TM Guard Cartrridge RP-18e MERCK (4,6 mm x 5 mm). L’analyse est réalisée a un débit constant de 4 ml/min.

9

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Tableau 7 : Gradient d'élution

Temps

A (en %)

B (en %)

0

95

5

6

90

10

30

60

40

35

50

50

37

0

100

40

0

100

42

95

5

45

95

5

4. Résultats-Discussion

4.1 Étude des conditions expérimentales du dosage absorptiométrique selon Folin-Ciocalteu

4.1.1 Influence du temps de contact et des quantités de réactifs

La figure 4 montre la variation de l’absorbance d’un étalon de tyrosol en fonction du temps de contact avec le carbonate de sodium en présence de 0,5 ml de réactif de Folin et 1 ml de Na 2 CO 3 7,5%, p/v).

Etalonnage TYROSOL

0,35 T = 9 0 min 0,3 0,25 T = 6 0 min 0,2 0,15
0,35
T
= 9 0
min
0,3
0,25
T
= 6 0
min
0,2
0,15
T
= 3 0
min
0,1
0,05
0

0

50

100

Teneur en ppm

150

200

Figure 4 : Variation de l’absorbance à 765 nm en fonction du temps de contact des réactifs

Le complexe coloré est vert. On constate qu’il n’y a pas linéarité des réponses en fonction de la teneur en tyrosol et cela quel que soit le temps de contact à l’obscurité avec le carbonate de sodium.

La figure 5 montre la variation de l’absorbance d’un étalon de tyrosol en fonction du temps de contact avec le carbonate de sodium et une augmentation de la quantité des réactifs à savoir 1 ml de réactif de FC et 5 ml de Na 2 CO 3 (à 7,5%, p/v).

L’augmentation de réactifs permet d’obtenir la linéarité de la réponse à partir d’un temps de contact de 60 min Cette durée correspond au temps moyen de la plupart des méthodes décrites dans le tableau 3.

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Etalonnage TYROSOL

1,20 T = 9 0 min 1,00 T = 6 0 min 0,80 0,60 T
1,20
T
= 9 0
min
1,00
T
= 6 0
min
0,80
0,60
T
= 3 0
min
0,40
0,20
0,00

0

50

100

Teneur en ppm

150

200

Figure 5 : Variation de l’absorbance à 765nm en fonction du temps de contact et après augmentation de la quantité des réactifs.

4.1.2 Influence du choix de l’étalon pour établir la courbe de calibration

Figure 6 : Influence du choix de l’étalon

Courbe d'Etalonnage

Réactif de FOLIN-CIOCALTEU

1,4 A c id e 4 -hyd ro xyp hényla cé t iq ue y
1,4
A c id e 4 -hyd ro xyp hényla cé t iq ue
y = 0,0061x + 0,0309
1,2
1
Tyro so l
y = 0,0059x - 0,0159
0,8
0,6
A cid e S yring iq ue
y = 0,0038x + 0,0054
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
Absorbance

Teneur en m g/l

La figure 6 montre l’influence du choix de l’étalon sur la réponse. Les réponses diffèrent en fonction de l’étalon choisi. La tendance actuelle des négociants est de demander une valeur minimale en phénols totaux aux producteurs. Cette étude montre que cette exigence doit être associée à un protocole précis d’analyse de la teneur en phénols spécifiant la nature de l’étalon utilisé Nous proposons d’utiliser le tyrosol comme étalon car d’une part il donne une réponse satisfaisante avec le réactif de FC et d’autre part parce qu’il est un des constituants de la fraction phénolique dans les huiles d’olive alors que celles-ci ne contiennent ni l’acide 4-hydroxy phényl acétique ni l'acide syringique.

4.2 Analyse chromatographique

La figure 7 montre un chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge. L’identification des différents pics a été réalisée à l’aide de composés de référence (tyrosol, vaniline, ac. vanillique, ac. caféique, ac. p-coumarique, ac. férrulique, quercétine, lutéoline) et par rapport aux données de la littérature [45, 47, 50, 53,54]. Certains composés n’ont pas été identifiés

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tandis que d’autres n’ont pas une identification certaine en raison de l’absence de composés de référence.

en raison de l’ab sence de composés de référence. Figure 7 : Chromatogramme de la fraction

Figure 7 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge d’origine espagnole (étalon 1 :

ac. syringique, étalon 2 : ac. 4-hydroxy phényl acétique)

4.2.1 Influence des conditions de stockage sur la teneur en phénols d’une huile d’olive (Picholine) La figure 8 montre les variations des principaux phénols d’une huile de Picholine conservée à trois températures différentes pendant 36 mois.

W + S O + R Apigénine N 90.00 (+)-pinorésinol T ambiante Lutéo line 80.00
W
+ S
O
+ R Apigénine
N
90.00
(+)-pinorésinol
T ambiante
Lutéo
line
80.00
4°C
K
70.00
-18°C
Quercétine
G
60.00
D+E+F
50.00
C
Tyrosol
40.00
Hydroxytyrosol
30.00
20.00
10.00
0.00
Teneur en mg/Kg

Figure 8 : Évolution de la composition phénolique d’une huile de Picholine en fonction des conditions de stockage, détermination effectuée par HPLC.

Les phénols évoluent différemment suivant leur nature :

- L’hydroxytyrosol et le

tyrosol augmentent en fonction de l’élévation de la température de

stockage ;

- Les phénols complexes (C et D notamment) diminuent lorsque la température de stockage augmente.

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Lors du vieillissement des huiles, les phénols complexes (secoïridoïdes…) se décomposent en libérant de l’hydroxytyrosol et du tyrosol. L’hydroxytyrosol est un anti-oxydant qui protège l’huile de l’oxydation. Dans une huile fraîche et non dégradée, les teneurs en hydroxytyrosol et en tyrosol sont très faibles car ils se trouvent principalement sous forme complexe (secoïridoïdes) et très faiblement sous forme libre.

Les phénols totaux des trois échantillons de l’huile de Picholine, déterminés par la méthode de FC et par HPLC, sont comparés figure 9. La méthode de FC donne des résultats toujours très supérieurs à la méthode HPLC. Les deux méthodes donnent des résultats qui varient peu avec la température toutefois la figure 8 montre des variations quantitatives entre les différents phénols. En conclusion, si l’analyse des phénols totaux permet d’approcher le potentiel anti-oxydant d’une huile, seule une analyse par HPLC permettra d’évaluer sa capacité à la résistance à l’oxydation.

600 500 400 300 200 100 0 Tamb 4°C -18°C Teneur en phénols totaux en
600
500
400
300
200
100
0
Tamb
4°C
-18°C
Teneur en phénols totaux
en mg/kg
Folin-Ciocalteu HPLC/UV
Folin-Ciocalteu
HPLC/UV

Figure 9: Évolution de la teneur en phénols totaux en fonction des conditions de stockage et de la méthode de dosage.

IInnfflluueennccee ddee llaa mmaattuurriittéé ddeess oolliivveess ddee llaa vvaarriiééttéé TTaanncchhee ssuurr llaa tteenneeuurr eenn pphhéénnoollss ddeess

hhuuiilleess La figure 10, montre les résultats des dosages des phénols totaux selon FC et des o-diphénols déterminés par absorptiométrie sur quatre échantillons d’huiles provenant d’olives de la variété Tanche. Ces résultats sont comparés aux teneurs en phénols totaux et en ortho-diphénols déterminés par HPLC. En ce qui concerne les phénols totaux, déterminés selon FC, les quatre échantillons présentent des teneurs qui varient en sens inverse de celles déterminées par HPLC. Les variations observées peuvent être dues à la différence de maturité des olives. Plus la maturité des olives augmente, plus la teneur en phénols déterminée par HPLC diminue ce qui est en accord avec la littérature. Le fait que la teneur en phénols, déterminée par FC, augmente montre qu’il y a formation de composés secondaires d’oxydation qui réagissent avec ce réactif dans les conditions précédemment décrites. En ce qui concerne les o-diphénols, les dosages par absorptiométrie ou par HPLC donnent des teneurs faibles mais du même ordre de grandeur. Ces déterminations qui présentent peu de variation, ne sont pas très significatives pour évaluer l’état de maturité des olives.

44 22 22

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300 250 Phénols par Folin-Ciocalteu 200 Phénols totaux par HPLC 150 O -diPhénols par 100
300
250
Phénols par
Folin-Ciocalteu
200
Phénols totaux
par HPLC
150
O
-diPhénols par
100
colorimétrie
O
-diPhénols par
50
HPLC
0
Ech 1
Ech 2
Ech 3
Ech 4
Teneurs en mg/kg

Figure 10 : Évolution des différentes fractions phénoliques en fonction de la maturité des olives (Tanche).

44 22 33

La figure 11 montre l’analyse de la fraction phénolique par HPLC d’une huile de la variété Bouteillan qui a une teneur en phénols totaux importante (349 mg/kg). Cette teneur a été déterminée par étalonnage interne en chromatographie liquide. On constate que cette huile a un fort potentiel de conservation. En effet, c’est une huile qui possède un important pouvoir anti-oxydant car elle contient beaucoup de phénols dits « complexes » (temps de rétention des composés entre 16 et 32 min).

CCaarraaccttéérriissaattiioonn dduunnee hhuuiillee ppaarr ssoonn pprrooffiill cchhrroommaattooggrraapphhiiqquuee

r r o o m m a a t t o o g g r r

Figure 11 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge de la variété Bouteillan.

D’autre part, cette huile est peu oxydée car les teneurs en tyrosol et en hydroxytyrosol sont faibles ( temps de rétention entre 1 et 6min).

En revanche, nous pouvons remarquer sur la figure 12 que l’huile de la variété Salonenque analysée, a subi une oxydation importante puisque sa teneur en phénols totaux est faible (118 mg/kg)

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Salonenque Phénols totaux: 117,90 mg/kg
Salonenque
Phénols totaux:
117,90 mg/kg

Figure12 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge de la variété Salonenque.

De plus, les teneurs en tyrosol et hydroxytyrosol sont importantes par rapport aux taux des phénols complexes. Cette huile peut être issue d’olives trop mûres, d’un stockage des olives avant trituration trop important ou de mauvaises conditions de stockage de l’huile.

Conclusion

Les méthodes absorptiométriques d’analyse de la fraction phénolique des huiles peuvent apporter des informations sur le potentiel anti-oxydant aux producteurs, aux négociants à des coûts intéressants. Il convient de prendre avec circonspection les résultats issus de ces mesures tant que ces méthodes ne seront pas normalisées tant d’un point de vue méthodologique que d’un point de vue de l’expression des résultats. Les résultats préliminaires concernant le dosage de la fraction phénolique par HPLC permettent de montrer qu’en plus d’une teneur totale en phénols, on peut observer le "potentiel antioxydant de l’huile" par la présence de phénols dits complexes alors que souvent le potentiel anti-oxydant d’une huile n’était évalué qu’à partir de composés simples comme le tyrosol et l’hydroxytyrosol qui sont en fait des composés secondaires, anti-oxydant, déjà issus d’une dégradation de l’huile.

Remerciements à Frédérique Franceschi et Muriel Richard pour leurs collaborations techniques.

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