Mtodos de Reconocimiento, Identificacin e Individualizacin de manchas de semen

Por: Iris Catherine Ca rma

Resumen
El estudio de las manchas de semen constituye una prueba precisa y til en la resolucin de casos asociados a delitos que afectan las buenas costumbres y el buen orden de las familias. Existen en el semen una serie de sustancias que ayudan al investigador a presumir o confirmar la presencia de manchas de ste fluido en el sitio del suceso, victima(s) y/o victimario(s). Entre los mtodos de reconocimiento, identificacin e individualizacin del semen tenemos: la ubicacin de las manchas con diferentes fuentes de luz, identificacin de la muestra mediante la aplicacin de los ensayos cristalogrficos (Florence y Barberio), la bsqueda de clulas espermticas con diferentes mtodos de tincin, el marcaje del ncleo del espermatozoide humano por inmunofluorescencia, la deteccin de la enzima fosfatasa cida prosttica, y la deteccin mediante inmunocromatografa del antgeno prosttico (PSA P30) y la protena semenogelina (SG). En cuanto a la individualizacin de manchas de semen, en la actualidad estn disponibles una serie reactivos para la maceracin y extraccin del ADN de la muestra, adems una gama muy amplia de kits que permiten la amplificacin y posterior secuenciacin de fragmentos del material gentico. INTRODUCCIN El estudio de las manchas de semen tiene gran importancia en la criminalstica, pues al igual que la sangre, constituye una prueba muy precisa. Debido a su procedencia, su estudio generalmente se encuentra asociado a delitos que afectan las buenas costumbres y el buen orden de las familias, por ejemplo; casos de violacin, actos lascivos, acto carnal con menores y el ultraje al pudor, entre otros. En todos los casos, el informe pericial que emite el experto adquiere fundamental importancia para la investigacin, dilucidacin del hecho punible y calificacin legal. Qu es el semen? El semen o esperma es un lquido viscoso, ligeramente alcalino, blanquecino a amarillento, de olor sui generis, que es expulsado a travs del pene en la eyaculacin . El semen se forma por el aporte de los testculos, el epiddimo, la vescula seminal, la prstata, las glndulas de Cowper, las glndulas de Litre y los vasos deferentes . Menos del 10% del volumen total del semen corresponde a
3 2,7 1

Lcda. En Biologa (UCV), Esp. En Criminalstica (IUPOLC).

Los espermatozoides son clulas haploides que constituyen el gameto masculino de los animales, su funcin es la formacin de un cigoto al fusionarse su ncleo con el del gameto femenino (ovulo)1. La funcin del plasma seminal es aportar un medio nutritivo con osmolalidad y volumen apropiado para el transporte y sobrevivencia de los espermatozoides en el aparato genital femenino4. En caso de infecciones, el semen puede llegar a contener altas concentraciones de virus o grmenes, por ejemplo, el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), que provoca el SIDA , por lo tanto, el tcnico que colecta evidencias de tipo biolgico y el analista de laboratorio deben extremar las medidas de bioseguridad durante su manipulacin. Las normas de bioseguridad indican al
5

manipulador de la evidencia cmo hacer para cometer menos errores y sufrir pocos accidentes y, si ellos ocurren, cmo minimizar sus consecuencias. Son prcticas, fciles de entender y de aplicar. En este sentido, se recomienda revisar el Manual de Capacitacin de Analistas de ADN y Laboratorios

los

espermatozoides, el otro 90% al lquido seminal .

DISPONIBLE EN: http://es.wikipedia.org/wiki/Semen M.Castieiras, X.Fuentes & J.Queralt (1999) Bioqumica clnica y patologa molecular, Editorial Reverte, 2da ed., Vol. 2, pg. 628. 3 Polica Federal Argentina, Manual de Criminalstica, Tomo II, pg.; 265-340. Buenos Aires, Argentina.

OMS (1999) Who laboratory manual for the examination of human th semen and sperm-cervical mucus interaction. 4 edition. Suiza. 5 Disponible en: http://www.infecto.edu.uy/prevencion/bioseguridad/bioseguridad.htm

Forenses, de la Iniciativa Presidents DNA , la gua de Recomendaciones para la recogida y envi de muestras con fines de identificacin gentica, del grupo Espaol y Portugus de la ISFG , y la Gua de Capacitacin y Directrices 8 7

Funcin de las secreciones de los rganos anexos: La mayora las secreciones de los rganos accesorios protegen el tracto urinario de agresiones de patgenos, secreciones
5

Evidencias

interceptndolos o bloquendolos. lavado de un la uretra establece del medio hostil su a

El los

Biolgicas, del Grupo Cientfico de Trabajo sobre Mtodos y Anlisis de ADN (SWGDAM) , para adquirir informacin sobre los protocolos, directrices, seguridad y riesgo en el manejo de evidencias biolgicas y reactivos qumicos que se utilizan frecuentemente en un laboratorio de tipo biolgico y de biotecnologa. En la eyaculacin podemos distinguir diferentes fracciones del volumen total del semen con diferente composicin qumica : 1) La Fraccin Pre-eyaculatoria (10% al 15% del volumen total): Procede de las secreciones de las glndulas de Cowper este y Litr, no es presenta de gran espermatozoides, hecho
3

mecanismo de

por estas

patgenos . Estas secreciones tambin facilitan la maduracin espermatozoide desarrollo, movilidad y supervivencia. Sustancias que ayudan al investigador a ubicar y confirmar la presencia de manchas de semen: La colina es una base orgnica presente en todas las clulas, que interviene en el transporte de lpidos y en su metabolismo al contribuir a formar los fosfolpidos. La Colina proveniente de la vescula seminal, se origina a partir de la escisin del grupo fosfato de la fosforil-colina por la accin de la enzima fosfatasa. El semen contiene una elevada proporcin de sustancias fosforadas, entre las que se encuentra el di-fosfato de espermina. La espermina se produce en la prstata y los testculos. Esta base se ha encontrado tambin en otros rganos ajenos al aparato genital masculino, desconocindose su significancia biolgica. Conjuntamente tambin existe en el semen otra base, la espermidina, que puede considerarse el producto de la hidrlisis parcial de la espermina. El olor sui generis del semen se debe principalmente a esta base. La fosfatasa cida (PA) es una enzima secretada por la prstata, que est presente en grandes cantidades en el lquido seminal, pero tambin se puede encontrar en otros lquidos biolgicos, incluyendo la sangre y las secreciones vaginales9.

relevancia pericial, ya que es probable al examinar una mancha de naturaleza seminal, no hallar espermatozoides. 2) La Fraccin Previa o prosttica (13% al 33% del volumen total): Proviene de la prstata, es fluida, tiene un pH cido, no presenta espermatozoides y contiene una elevada concentracin de fosfatasa cida y cido ctrico. 3) La Fraccin Principal (5% al 10% del volumen total): Procede del epiddimo y de los conductos deferentes, presenta elementos lquidos y gelatinosos. Es la fraccin que contiene la mayor cantidad de espermatozoides. 4) Fraccin Terminal (50% al 60% del volumen total): Procedente de las vesculas seminales. Tiene un pH alcalino, es de consistencia gelatinosa o coloide y contiene una considerable cantidad de fructosa.

isfg.org/documentos/Recogida%20de%20evidencias.pdf
8

President`s DNA initiative (2004) DNA Analyst Training Laboratory Training Manual. Protocol 2.02 Clean Technique, Disponible en: http://static.dna.gov/lab-manual/pdi_lab_userguide.pdf 7 Grupo Espaol y Portgus de la ISFG (2000), Recomendaciones para la recogida y envi de muestras con fines de identificacin gentica. Pgs. 6-8, Disponible en: http://www.gepGrupo de Trabajo Cientfico sobre Mtodos de Anlisis de ADN (SWGDAM) (2001) Gua para anlisis de la evidencia biolgica, disponible en: http://www.nfstc.org/pdi/Subject02/pdi_s02.htm

El antgeno prosttico (PSA P30) es una proteasa producida por la prstata, y se puede hallar en
9

el

fluido

seminal,

fluido

prosttico,

sangre

Dale L. Laux, (2205) Forensic Detection of Semen I. The Acid Phosphatase Test, Ohio Bureau of Criminal Identification.

masculina y orina masculina y/o femenina . Se ha detectado una baja concentracin de PSA en la leche materna y algunos tumores de mama. Aunque la PSA se encuentra en estos fluidos, es utilizada como indicador de la presencia de semen en muestras de casos penales. La Semenogelina (SG) es una protena que proviene de la vescula seminal, un sustrato para el antgeno prosttico especfico (PSA) y un marcador til para la identificacin de semen. La SG I y SG II son dos de las principales protenas secretadas por la vescula seminal al semen humano, ellas interactan, o no, covalentemente a travs de puentes disulfuro de forma instantnea formando un cogulo en la eyaculacin. El cogulo es licuado despus de unos minutos debido a la accin de una proteasa srica prosttica, la PSA, que rompe a la SG en fragmentos. La SG I y la SG II se han encontrado en varios tejidos: las vesculas seminales, el conducto deferente, la prstata, el epiddimo, el msculo esqueltico, el rin, el colon, la trquea y en tumores en el pulmn . Los contenidos de Zinc y cido Ctrico permiten determinar la funcin de la prstata . En 1983 Suzuki sugiri que la alta concentracin de zinc en plasma seminal podra ser una herramienta valiosa para la deteccin cualitativa de manchas de semen . Sin embargo, los experimentos de Suzuki no tienen comparacin con el ensayo de fosfatasa cida, que es visto como un estndar de oro en la mayora de pases occidentales. El ensayo del Zinc ha sido desarrollado por varios autores y ha mostrado una sensibilidad menor que la prueba de la fosfatasa cida, pero es ms especfica para el semen. Adems, un estudio en muestras vaginales tomadas luego de diferentes perodos de abstinencia sexual, demostr una alta correlacin entre resultados positivos para
H. Yu, E. Diamandis (1994), Immuno reactive prostate test specific antigen levels in female and male breast tumors and its association with steroid hormone receptors and patient age, Clin. Biochemist 27(7579). & H. Yu, E.F. Diamandis (1995), Prostatespecific antigen in milk of lactating women, Clin. Chem. 41 (5458). 11 A. Bjartell, J. Malm, C. Moller, M. Gunnarsson, A. Lundwell, H. Lilja (1996), Distribution and tissue expression of semenogelin I and II in man as demonstrated by in situ hybridization and immunocytochemistry, J. Androl. 17:1726. 12 Suzuki, A. Kido and M. Oya (1983), Zinc test as a new tool for identification of human seminal stains.Forensic Sci. 22:231- 235.
10

10

zinc y el hallazgo microscpico de espermatozoides luego del coito . Ubicacin de las manchas de semen: Las primeras pruebas utilizadas en el anlisis de manchas de semen fueron organolpticas y algunas reacciones qumicas, sin embargo, estas manchas eran confrontadas con sustancias como el moco y la grasa cruda de origen animal, cuyas apariencias son similares . En 1826, Olliver dAngers y Barruel
15 14 13

informaron de

un caso de agresin sexual donde se sospechaba que ciertas manchas en la ropa de la victima fueron hechas intencionalmente con grasa animal. Los expertos analizaron las ropas con respecto a su solubilidad en agua, naturaleza, color y conducta en alcohol absoluto. Ambos concluyeron que la mancha no haba sido hecha con grasa animal y que eran manchas de semen. Las Sobre manchas tejido de semen presentan algunas etc.),

11

caractersticas en razn al soporte donde se asientan9. absorbente (sbanas, ropas,

5

exhiben un color blanco-amarillento, la forma de sus bordes es irregular, similar a los mapas topogrficos. (Ver Figura 1). Estas manchas producen efecto de apergaminamiento y almidonamiento del soporte. Sobre superficies no absorbentes rugosas (pared), el semen formar costras o escamas ms o menos grandes de color blanquecino transparente. Sobre superficies lisas (pisos pulidos) el semen se extiende formando una mancha grande, delgada y casi transparente, poco visible en superficies oscuras.

12

Fig. 1.- Mancha de semen sobre gasa (soporte poroso). Fotografa Tomada por la Lcda. Iris C. Carma. P. Hooft, H. Van De Voorde (1992) A More sensitive modification of the Zinc test for seminal traces suitable for stable test paper strip Forensic Science International, 53 (1992) 131-133. 14 Stuart James (2005), Forensic science: an introduction to scientific and investigative techniques. 2nd ed. Boca Raton. 15 Olliver dAngers and Barruel. De taches observes sur un linge dans un cas de mdecine legale. J.Chim. Med. Pharm. Toxicol. 2: 565-568. 1826.
13

Fuentes de Luz: En 1919 el Dr. Wood public un artculo en Francia y seal la posible utilizacin de la lmpara de Luz ultra violeta (UV) para el anlisis de fluidos del cuerpo, con el tiempo, esta fuente luz ha tomado la denominacin de "lmpara de Wood", Luz negra. Bajo la accin de las radiaciones UV las manchas de semen presentan una fluorescencia la intensidad blancodel tono amarillenta, aumentando

Calloway

aconseja
3,9

examinar

las

manchas

sospechosas de ser semen por su

fluorescencia y

fosforescencia . La Fosforescencia es el fenmeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energa y almacenarla, para emitirla posteriormente en forma de luz. El mecanismo fsico que rige este comportamiento es el mismo de la fluorescencia, no obstante la principal diferencia con sta, es que hay un retraso temporal entre la absorcin y la reemisin de luz. Calloway recomienda la siguiente secuencia de observacin con luz UV : 1. Examen directo a (P365 nm) y temperatura ambiente: en general se observan las manchas de
9

amarillo con el paso del tiempo (ver figura 3).

Fig. 2.- Lmpara de Wood

semen

por

la

fluorescencia

caracterstica,

excepto cuando el tejido presenta tratamiento de blanqueado ptico. 2. Examen directo a (P 365 nm) previa refrigeracin el material puede ser colocado sobre hielo seco, cuya temperatura de volatilizacin es de -78,5 C:
Fig.3.- Mancha de semen bajo luz UV. Fotografa Tomada por la Lcda. Iris C. Carma.

La fosforescencia de las manchas persiste 20 segundos despus de retirada la fuente de luz UV.

Diferentes tipos de longitudes de onda pueden inducir la fluorescencia en los diferentes fluidos corporales excepto la saliva y la sangre . La fluorescencia es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a radiaciones UV, rayos catdicos o rayos X. Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano), son transformadas en luz visible. La luz puede ser apreciada mientras la superficie es irradiada con la fuente de luz. El espectro de excitacin de las muestras de semen tiene longitudes de onda (P) que van de 350 nm (luz UV) a 500 nm (luz Azul-verde)17. La fluorescencia del semen est relacionada con la presencia de los aminocidos tirosina y triptfano, una base nitrogenada llamada flavina y la presencia de la bacteria P. fluorenscens. El semen tambin contiene pequeas cantidades de una molcula fluorescente llamada colina .
16

Otros fluidos del cuerpo como la orina, sudor y fluido vaginal producen fosforescencia a baja temperatura, por lo que la tcnica de Calloway es de orientacin y no de certeza. Calloway y cols. no reportaron fosforescencia en saliva ni sangre. Cuando las manchas de semen estn sobre algodn blanco, la optima condicin de observacin con una fuente de luz es utilizando una P de 505-555 nm, y cuando la tela tiene un satinado rosa, una Pde 450-530 nm, tambin debe considerarse el uso de filtros. En este tipo de telas se utilizan frecuentemente los llamados blanqueadores pticos, que son en realidad tintes fluorescentes. Estos tintes convierten determinadas longitudes de onda de radiacin UV, en luz azul o azul verdosa, con una longitud de onda que hace que aumente la intensidad total de luz visible reflejada. Como los blancos azulados dan la impresin de ser ms puros, los tintes fluorescentes pueden hacer que los tejidos y otros materiales parezcan ms luminosos.

16

Auvdel. M.J. (1987) Comparison of Laser and UV Technology used in the Detection of Body Secretions J. For. Sci., Vol.32, p.362. 17 Hilton Kobus y Cols. (2002) Improving the effectiveness of fluorescence for the detection of semen stains on fabrics, J Forensics Sci.; 47: 1-5.

longitudes de ondas que pueden ser graduadas y que oscilan entre 310 y 650 nm. Tiene aplicacin en la deteccin de huellas digitales latentes, saliva, sangre y semen . En este sistema tambin se utilizan sistemas de filtro para la visualizacin de las manchas y su principio es el mismo que el de la lmpara de Bretton18. (Ver figura 5, 6 y 7) Lmpara de Bretton: La luz forense, luz azul o Lmpara Bretton, tiene un principio y uso similar a la lmpara de Wood, pero toma en cuenta la fluorescencia de fondo, por lo que el observador debe usar gafas con un filtro especial para eliminarla y dejar pasar slo la luz fluorescente proveniente de la mancha de semen . La capacidad de bloqueo de los filtros (calidad) es directamente proporcional a la sensibilidad del sistema para detectar cantidades muy pequeas de semen.
18 20

Fig. 5.- Mancha de semen sobre algodn blanco y rosado, visualizada con el PoliligthPL500s.

Fig. 6.- Mancha de semen sobre algodn blanco y rosado, visualizada con el PoliligthPL500s.a 450 nm de excitacin, 18 utilizando lentes naranja .

Fig. 4.- Lmpara de Bretton o luz Azul .

17

En la tcnica de Bretton hay dos sistemas pticos a considerar; la fuente de excitacin y el filtro de luz (Ver figura 4)19. Es esencial que el bloqueo de luz por los filtros sea alto, de lo contrario la luz fluorescente sobre el fondo de la mancha pasar por el filtro de barrera inundando la fluorescencia real. La mancha de semen al ser irradiada con la fuente de luz azul, absorber parte de la misma y re-emitir en el espectro de luz amarillo-naranja-rojo. Con la ayuda de un filtro (lentes) naranja, se observan las manchas fluorescentes de color naranja. En este sistema hay que tomar en cuenta tambin la fluorescencia de algunas cremas o aceites, especialmente las que contienen tocoferol.
Fig. 7.- Mancha de semen sobre algodn visualizada con el PoliligthPL500sc a 450 nm de excitacin, utilizando lentes 18 naranja .

Ensayos cristalogrficos El primer artculo escrito sobre estos ensayos apareci en 1896, y estas pruebas se siguen utilizando hoy da en algunos laboratorios. Consisten en la aplicacin de reactivos que inducen la formacin de cristales que pueden ser observados bajo el microscopio.
Stoilovic, M., 1991 Detection of Semen and blood stains using the Polilight as a light source, Forensic Sci Int, 51;; p.289-96. 18 Hilton J. Kobus ; Edmund Silenieks ; Jordana Scharnberg (2002) Improving the Effectiveness of Fluorescence for the Detection of Semen Stains on Fabrics Journal of Forensic Sciences Volume:47 Issue:4 Dated:July 2002 Pages:819 to 823
20

Polilight PL500s: El Poliligth PL500sc es un sistema porttil de fuente de luz de alta intensidad que produce diferentes
Marshall, Bennett y Fraval (2001), Locating Semen on Live Skin Using Visible Fluorescence, Melbourne Australia.
Disponible en: http://www.bvda.com/EN/prdctinf/semen_fluo.html
18

19

Ensayos de Florence y Barberio: En 1895 y 1896, el Dr. Florence

21

entre 11.2 y 14.4 mg de colina/100 ml de semen, en Lyon public tambin hacen mencin sobre que cualquier tejido o material biolgico, como por ejemplo la sangre, que tuviera concentraciones de colina suficientemente altas daran positivo en el test de Florence . Los cristales de Florence no se forman a partir de moco nasal o vaginal, orina, sudor, saliva, lgrimas, leche materna, ni algunas muestras de semen de animales. Para obtener su protocolo visite la pgina:
24

una serie de documentos refiriendo sus estudios en fluidos seminales y su aplicacin mdico-legal. Para la poca, el test de Florence presuntivo, fue se introducido y considerado como recomienda

practicarlo antes de una bsqueda cuidadosa de clulas espermticas u otro elemento en manchas sospechosas de semen. En esta reaccin, el Yodo contenido en el reactivo se une a la colina
22

formndose un cristal en forma de aguja de reloj color marrn denominado peryoduro de colina . (Ver figura 8). Generalmente se necesitan varios minutos para observar los cristales. Este ensayo es de orientacin, no de certeza.
Fig. 8: Cristales de peryoduro de Colina, 40X. Fotografa Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma. Colina

Hektoen y McNally en 1923 consideraron que un test de Florence positivo

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Perioduro de Colina

poda

entraar

una En 1905, Barberio public un test cristalogrfico para fluido seminal, el test de Barberio, que empleaba una solucin saturada de cido pcrico25. Se dice que esta reaccin es muy sensible y podran obtenerse resultados positivos con material seminal parcialmente descompuesto26. El moco vaginal, moco nasal y saliva no dan positivo para la reaccin. Barberio pens que la sustancia en el semen responsable para la reaccin era orgnica y diferente de la sustancia reactiva en el test de Florence, esta sustancia se hallaba presente en plasma seminal, incluso en muestras de azoosprmicos. En 1913 Baecchi sugiri que los cristales vistos por Barberio podan ser de picrato de espermina27. Rosenhein en 1924 mencion tambin, que los cristales de Barberio eran de picrato de espermina .
Kahane, E. and J. Levy. (1937). Recherches sur la biochimie de la choline et de ses drivs Apparition de la choline dans les substances biologiques.. Bul. Soc. Chim. Biol. 19: 959-975. 25 Baecchi, B. (1913). Sulla genesi della reazione del Barberio. Arch. Farmacol. Sper. Sci. Affini 14: 527-541. 26 Barberio, M. A new microchemical reaction of the sperma and its application in medicolegal investigations. Medico-legal J. (NY) 23(3): 383-393. 1905b. 27 Baecchi, B. (1913). Sulla genesi della reazione del Barberio. Arch. Farmacol. Sper. Sci. Affini 14: 527-541. 28 Rosenheim, 0. (1924). The insolation of spermine phosphatase from semen and testes. Biochem. J. 18: 1253-1262.
24

posibilidad, pero un test negativo indicaba la ausencia de semen inequvocamente . Sin embargo, se conoce que la positividad de la reaccin depende de la presencia de colina libre. Kind S. realiz algunos experimentos donde no observaba resultados con este test, notando que al disolver la muestra en agua destilada e incubar a 37 C por 30 min. obtena resultados positivos, la razn de este comportamiento se debe a que en la mancha seca se detiene la actividad hidroltica de la fosfatasa, por lo tanto no se puede tener la colina en su forma libre, sino como fosforil colina. Kahane y colaboradores en 1937, llevaron a efecto un nmero de estudios sobre la bioqumica, metabolismo y distribucin tisular de colina, ambos cientficos sealan que el semen humano contiene

28

Florence A., (1896), Du sperme et des taches de esperme en mdecine legale. Arch. Anthropol. Crim. Criminol. 11: 37-46 and 146-165 and 249-265. 22 Imran Sabri (2002), Detection of Semen & Seminal Fluid Stains, Department of Forensic Medicine and Toxicology, JN Medical College, AMU, Aligarh. 23 Hektoen, L. and W.D. McNally.(1923).Medico-legal examination of seminal stains in: F. Peterson, W. Haines, Legal Medicine and Toxicology, 2nd ed. Pp. 941-948. W.B. Saunders Co., Philadelphia.

21

H2N=(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3=NH2
ESPERMINA

Un tipo muy singular de ncleo celular es el de los espermatozoides de los mamferos. En ellos el ADN no se une a las histonas, sino a otras protenas llamadas protaminas. Las protaminas son ms

En este ensayo, el cido pcrico se une a la espermina presente en el semen, formndose un cristal amarillo en forma de arroz denominado picrato de espermina. (Ver figura 9).

pequeas que las histonas y ms bsicas, con lo que la atraccin entre ellas y el ADN es ms fuerte y el empaquetamiento mayor. Esta unin del ADN a las protaminas se llama estructura cristalina (ver figura 10). Las protaminas inducen arreglos lineales lado a lado y no enrollamiento como las histonas . Los espermatozoides de muchas especies de mamferos son similares en tamao y forma. Los
32

Fig. 9: Cristales de picrato de Espermina a 40X. Fotografa Tomada por la Lcda. Iris Catherine Carma.

perros tienen espermatozoides muy parecidos a los del humano, pero tienen aproximadamente un tercio de su tamao (ver Figura 11).

Tincin de clulas espermticas: Los espermatozoides fueron vistos por primera vez en 1677 por el entonces estudiante de medicina holands Johan
29

Hamm,

que

los

denomin

animaculae . Hamm relat esta observacin a Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) que un par de aos ms tarde realiz la primera descripcin de los espermatozoides humanos, considerndolos como un componente normal del semen de cualquier animal30. Los espermatozoides son las clulas que consisten de un ncleo, una pieza media y una cola 10). En los seres humanos, el
31

(Ver figura tiene

Fig. 11: Diferencias en los ncleos de los espermatozoides de diferentes mamferos.

ncleo

aproximadamente 4,5 micras de largo y 2,5 micras de ancho, en l, se conserva el ADN. La cola tiene aproximadamente 40 micras de largo y su funcin es hacer que el espermatozoide se desplace por movimiento flagelar.

La visualizacin de un espermatozoide en una muestra es prueba de que la misma est constituida, total o parcialmente por semen. Tal reconocimiento es fcil en manchas de semen de reciente data, pero se complica al pasar el tiempo . Si los espermatozoides han perdido la cola, puede ser difcil reconocerlos con la ayuda del microscopio, sobre todo si las muestras estn contaminadas con bacterias u hongos. Si el sujeto donante de la mancha es asprmico, la identificacin de la mancha se complica an ms. En 1839, Bayard public un documento sobre el uso del microscopio en el anlisis de manchas
29

Fig. 10: Espermatozoide humano y estructura cristalina (compactacin del ADN en el ncleo).
29 30

seminales

para

comprobar

la

presencia

de

Disponible en: http://idd0073h.eresmas.net/public/artic06/artic06_2.html Marcelo Miranda C. Johannes Vermeer and Anthon van Leeuwenhoek: Delft Art and Science together during the golden Dutch century, Rev Md Chile 2009; 137: 567-574. Disponible en:
31

http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0034-98872009000400017&script=sci_arttext http://www.nfstc.org/pdi/Subject02/pdi_s02_m02_04.htm

Siobhan McCarthy, W. Steven Ward, Interaction of exogenous DNA with the nuclear matrix of live spermatozoa, Molecular Reproduction & Developm ent: Volume 76, Issue 10.

32

espermatozoides . Brouardel revis estas tcnicas en 1879 . No obstante, en ausencia de espermatozoides no se poda concluir que el semen estuviera ausente, porque era conocido que los hombres podran ser azoosprmicos. La aspermia es una condicin que se caracteriza por una ausencia total de espermatozoides en la eyaculacin35. En la vasectoma se rompen ligan los conductos que transportan el semen hasta el pene, as, los hombres vasectomizados no tendrn espermatozoides en el fluido seminal . El trmino azoosprmico se refiere a que los espermatozoides maduros no estn presentes en el fluido seminal . Los espermatozoides son demasiado pequeos para observarse a simple vista, es por ello que el criminalista utiliza diferentes mtodos de tincin, y luego realiza una observacin al microscopio. En la tincin de clulas espermticas ocurren una combinacin de fenmenos fsicos y qumicos: la absorcin, capilaridad y smosis participan en cierto grado. El fundamento de la prueba se basa en la afinidad de los colorantes alcalinos por los elementos celulares cidos y de los colorantes cidos por elementos celulares alcalinos. La tincin ms conocida en los laboratorios criminalsticos a nivel mundial es la denominada rbol de Navidad . Usando el microscopio, los cientficos buscan los espermatozoides en lminas preparadas a partir macerados desde hisopos, ropa, sabanas, etc. Las lminas se colorean con la tincin de Kernechtrot-Picro-indigo-carmine, o "rbol de navidad", en la que los ncleos de los espermatozoides se tien de rojo carmn brillante y las colas de color verde-azulado (ver figura 11). Para obtener el protocolo consulte la siguiente bibliografa: Laboratory Training Manual, Protocolo 2.04, para la Identificacin de clulas espermticas de la Presidents DNA Initiative. La tincin histolgica
Bayard, H. 1839. Examen microscopique du sperme dssech sur le linge, sur les tissue de nature et de coloration diverses. Ann. Hyg. Publique Med. Leg. 22: 134-170. 34 Brouardel, (P). 1879. Des taches spermatiques. Le Practicien 2(28): 332-336. 35 Pollack, 0. J. 1948. Azoospennia and aspermia. Am J. Clin Pathol. 18: 542-547. 36 National Institute of Justice (1983), Sourcebook in Forensic Serology, Immunology, and Biochemistry Unit II.
33

33

tradicional de hematoxilina y eosina (H & E) tambin es ampliamente utilizada, as como la tincin Giemsa.

34

36

Fig. 11: Tincin Chistmas tree (rojo rpido nuclear y cido pcricondigo.

La tincin de rbol de Navidad provee excelentes detalles morfolgicos y una buena discriminacin entre espermatozoides y clulas epiteliales. Esto es importante a la hora de determinar los tipos de clulas en muestras problemas con mezclas. Testsimplets El test consiste en una lmina portaobjetos dotada de una capa coloreada. Esta capa consta de dos colorantes: acetato de violeta de cresilo y nuevo azul de metileno. La afinidad especfica de las estructuras celulares con los colorantes conduce a tinciones que permiten proceder a una clasificacin (Ver figura 12). La intensidad del color y la proporcin de mezclado de los colorantes en el recubrimiento del portaobjetos son constantes y estn estandarizados, con lo cual se obtienen tinciones fiables.

35

Fig. 12.- Tincin con lminas Testsimplets , a 100X. Fotografas Tomadas por la Lcda. Iris Catherine Carma.

Marcaje del ncleo del espermatozoide humano por inmunofluorescencia: En este ensayo, se realiza el marcaje del ncleo del espermatozoide humano con un pool de 448 anticuerpos monoclonales anti-humanos extrados del

ratn, derivados del semen humano, y detectados por un microscopio de fluorescencia . La prueba puede detectar un solo ncleo de espermatozoide humano en una mezcla de clulas epiteliales y semen de otras especies. Este ensayo es de certeza para semen humano. Para obtener el protocolo consulte la siguiente bibliografa: SPERM HY-LITER Staining
test.com/pdf/shl_protocol.pdf.
37

Adems del reactivo especfico para espermatozoides humanos, el Sperm Hy Liter incorpora un segundo tinte fluorescente (fluorescena), que tie todos los ncleos de las clulas presentes en la muestra. La visualizacin de los ncleos fluorescentes no es necesaria para la deteccin de espermatozoides, pero se recomienda en la bsqueda de semen donde existen mezclas (ver figura 14). Determinacin de la Enzima Fosfatasa cida Prosttica: La prueba de la fosfatasa cida es una de las ms conocidas y utilizadas para la identificacin del semen aparte de la identificacin de clulas espermticas. Se basa en la presencia de niveles altos de una fosfatasa en el semen humano y la inhibicin de la misma con el cido tartrico. Esta fosfatasa cida (EC 3.1.3.2) es de origen prosttico y a veces se abrevia "PA". En 1935, Kutscher y Wohlbergs informaron que la

Protocol,

de la empresa
http://www.ifi-

Independent Forensics, disponible en:

La deteccin fluorescente de

semen humano puede ser acoplada a los actuales procedimientos de los laboratorios criminalsticos para el anlisis de ADN.

Fig. 13.- Kit de Sperm Hy Liter

para el marcaje del ncleo del espermatozoide humano por inmunofluorescencia.

TM

eyaculacin masculina contiene una enzima que hidroliza diferentes esteres de fosfato a un pH cido. Su origen se estableci como de la glndula prosttica y la enzima se llam "fosfatasa de la prstata" . El origen prosttico de la enzima fue confirmado por Gomori en 1941 .
39 38

En

1936,

Gutman

cols.

encuentran que la actividad de la fosfatasa cida es bastante elevada en tejido esqueltico metstatico y en pacientes que sufren cncer de prstata . En 1945, Lundquist, sugiere que las altas
40

cantidades de fosfatasa cida prosttica en el semen humano se utilicen como base para su identificacin en situaciones mdico legales .
Fig. 14.- Mezcla de clulas epiteliales y espermticas de humanos y anim ales, observadas al microscopio de fluorescencia con la fase de contraste, luego con el filtro FITC, donde se observa slo el ncleo de los espermatozoides humanos y con el filtro DAPI donde se observan todos los ncleos de todas las clulas.
41

Las laminas portaobjetos preparadas con el ensayo Sperm Hy Liter

TM

pueden ser visualizadas en cualquier

microscopio de fluorescencia equipado con la fuente de luz apropiada y filtros de emisin DAPI y FITC.

37

http://www.spermhy-liter.com/pdf/shl_tech.pdf

Independent Forensics (2008), SPERM HY-LITER PLUS Technical Information Sheet, Estados Unidos. Disponible en:

Kutscher, W. (1935), fjber Harnphosphatase. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 235: 62-73. 39 Gomori, G. (1941), Distribution of acid phosphatase in the tissues under normal and pathological conditions. Arch. Pathol. 32: 189199. 40 Gutman, A. B. and E. B. Gutman, (1938). "Acid" phosphatase occurring in the serum of patients with metastasizing carcinoma of the prostate gland J. Clin Invest. 17: 473-478. 41 Lundquist, F. (1945). forensisk paavisning af sperma or spermaplatter. Nord. Med. ZS:2131-2132. Rasmusren, M. P. S. 1945. Un nouveau principe pour le diagnostic des taches de sperme sur la ttoffes. Ann Med. Leg. Criminal. Police Sci. 25: 110-117.

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Rasmussen llev a cabo ensayos cuantitativos de PA en semen, saliva, orina y secreciones vaginales . Los valores ms bajos observados en muestras conocidas de semen superaron casi 200 veces los valores ms altos observados en otras muestras. Rasmussen recomienda el ensayo como un medio til para identificar manchas de semen en medicina legal, especialmente en muestras de azoospermicos. Un estudio importante sobre la fosfatasa cida prosttica fue realizado por el Dr. Ove Riisfeldten en 1946, quin encontr valores bajos de actividad de la enzima en sujetos prostatomizados . Kind en 1964 dijo que no poda afirmarse la presencia de semen en una mancha basndose solo en el test de la fosfatasa cida, y que sera necesaria la corroboracin mediante hallazgos de espermatozoides, o con un test Florence positivo .
44 43 42

de control, para un resultado negativo. La lnea de control debe aparecer para que la prueba sea vlida.

Antgeno Prosttico Especfico (PSA o P30) y Semenogelina (SG): En un estudio realizado por Pang & Cheung en el ao 2006
45

Figura 5: Resultados positivos y negativos obtenidos a partir del Test RSID-Semen y el Test ABAcard p30. 20 QL de la muestra se mezclan con 80 Ql de Buffer TB, luego se aplica la cantidad de 20 Ql a la ventana del dispositivo del test RSID-Semen y ABAcard p30. Un resultado positivo se pone de manifiesto por la presencia de dos lneas, una en la regin prueba y otra en la regin control. Un resultado negativo se indica con una sola lnea en la zona control. El fabricante de RSID-semen afirma que puede ser detectado 1 Ql de fluido seminal humano con su test, mientras que el fabricante del test ABAcard p30 afirma que se pueden detectar hasta 4 ng/ml de PSA con su dispositivo de prueba. En un ensayo practicado por YING A YANG
E.F. Diamandis, D.J.A. Sutherland (1994) 7 H. Yu,

se evaluaron los tests RSID-Semen (de la

empresa Independent Forensic) y ABAcard P30 (de la empresa Abacus Diagnostics, West Hills, CA, USA). La prueba RSID-Semen P30 utiliza utiliza anticuerpos anticuerpos monoclonales anti-humanos de SG, mientras que la prueba ABAcard monoclonales anti-humanos de PSA. Ambas pruebas utilizan la inmunocromatografa en papel de filtro. Las muestras fueron extradas en un buffer 2 horas antes de ser aplicada en la ventana al final del test, ver figura 5. Los resultados de las pruebas fueron ledos pasados 10 min. Si el resultado es positivo aparecen dos lneas en el dispositivo y aparece solo una lnea

ellos reportan que

si bien el test RSID-Semen puede detectar semen humano en una dilucin de hasta 1/100.000, el test ABAcard p30 puede detectar el antgeno prosttico en una dilucin de hasta 1/50.000 veces (Tabla 1). Una dilucin de 1/50.000 del fluido seminal estndar equivale a 2 ng/ml de PSA. La sensibilidad de la prueba para ABAcard p30 es un poco mejor en este estudio que el anunciado por el fabricante y es comparable a la sensibilidad de otros dos kits comerciales, el PSA Seratec y PSAcheck-Semiquant [7]. La sensibilidad de la prueba de RSID-semen es equivalente a la de otro Kit de deteccin de SG recientemente comercializado llamado Nanotrap SG [20]. Con ambas pruebas capaces de detectar semen humano y fluido seminal en la norma de 1/50.000, se

Rasmusren, M. P. S. (1945), Un nouveau principe pour le diagnostic des taches de sperme sur la ttoffes. Ann Med. Leg. Criminal. Police Sci. 25: 110-117 43 Riisfeldt Ove. 1946. Acid phosphatase employed as a new method of demonstrating seminal spots in forensic medicine . Acta Pathol. Microbiol. Scand., Suppl. 58, 80 Pp. 44 Kind, S.S. 1964. The acid phosphatase test. in: A. 5. Curry (ed.) Methods of Forensic Science . Tomo III, PP. 267-288, Interscience, New York and London. 45 Pang & Cheung (2006) Identificacin de la semenogelina y el antgeno prosttico P30 por inmunocromatografia Forensic Science Internacional,

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considera que ofrecen pruebas muy sensibles para la deteccin de semen. Muestras de orina de 10 hombres y 10 mujeres fueron probados con los dos dispositivos de prueba. Todas las muestras de orina para sexo masculino y ninguno de los femeninos fueron positivos para PSA. La deteccin de PSA en orina de varones se esperaba, porque pequeas cantidades de lquido de la prstata pueden estar presentes en la orina masculina [1]. Ninguna de las muestras de orina de los 10 hombres y 10 mujeres fueron positivo en la prueba del SG. Las 10 muestras de orina de hombres sobre tela secada al aire, fueron extradas y analizadas con PSA, sin embargo, ninguno de los cortes de tela (25 o 2 100 mm ), de las 10 muestras dieron resultados positivos para la deteccin SG. Resultados negativos para la deteccin SG tambin se obtuvieron de estos cortes de tela. Otros fluidos corporales, incluidos sangre, saliva, sudor y muestras de heces de cada tres hombres y tres mujeres, as como leche materna y secreciones vaginales de tres mujeres, tambin se analizaron con los dos dispositivos de prueba. Los dos ensayos no dieron resultados falsos positivos con cualquiera de estas muestras. Luego estas muestras fueron mezcladas con semen humano para la extraccin y anlisis. SG y PSA dieron positivo para todas estas mezclas de fluidos corporales o materiales con el esperma. No hubo falsos negativos debido a la interferencia de estos fluidos corporales con el semen. Muestras de orina de hombres y mujeres tambin se mezclaron con esperma humano. Los extractos probados con SG para mezclas con orina de hombres dio positivo porque el semen humano estaba presente en el extracto y la orina de hembra no interfiri con la deteccin SG. 3.3. Lubricantes y espermicidas El lubricante en s y el lubricante recuperado de condn fueron negativos para ambos mtodos SG

y PSA. Adems, estos materiales no interfieren en la deteccin de semen humano por SG y PSA porque los extractos de las manchas preparadas con lubricante y semen humano han dado resultados positivos para ambas pruebas SG y PSA. Los espermicidas nonoxinol-9 y menfegol se utilizan como mtodos anticonceptivos. Nonoxinol-9 se usa a menudo con el preservativo, mientras que menfegol se utiliza como anticonceptivo en tableta para realizar lavados vaginales para la mujer. Hisopos tomados desde un condn con nonoxinol-9 y una disolucin de 20 l de menfegol se extrajeron por separado. El extracto de los dos espermicidas, nonoxinol-9 o menfegol fueron negativos para ambos SG y PSA. Las manchas de semen/nonoxynol-9 y semen/menfegol fueron positivas para la prueba del PSA y SG. La deteccin, especificidad y sensibilidad de la SG y PSA no se vieron afectadas cuando el semen humano se mezclo con los dos espermicidas. Nonoxinol-9 y menfegol se sabe que matan e inmovilizan los espermatozoides. Los resultados indicaron que el nonoxinol-9 y menfegol no tiene ningn efecto adverso sobre la lectura de las pruebas SG y PSA. 3.4. Especies especificidad Muestras de semen de animales, incluidos el pollo, cerdo, toro, caballo, gato y perro se utilizaron en este estudio. Todos ellos dieron resultados positivos para espermatozoides. Entre estas muestras de semen de animales slo el esperma de pollo resulto positivo para la actividad fosfatasa cida, aunque las seales son muy dbiles en comparacin con las detectadas por semen humano. Todos estos animales se pusieron a prueba con los test para SG y PSA dando todos negativos.