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EXTRACCIN DE DROGAS CIDAS Y BSICAS, SEPARACIN POR CROMATOGRAFA DE CAPA DELGADA CON DETECCIN POR REVELADO

RESUMEN Durante la prctica se analizaron dos muestras de orina identificadas como A y B, con el fin de conocer en cul de ellas haba presencia de drogas cidas o bsicas. Para lo anterior se realiz la extraccin y posterior secado de las muestras, obtenindose una pequea fraccin de la muestra. Continuamente se realiz Cromatografa en Capa delgada (CCD) para el extracto de droga bsica y extracto de drogas acidas/neutras, empleando como sistema eluente cloroformo/acetona (4:1) para drogas acidas/neutras y metanol/amoniaco (100:15) para drogas bsicas, al revelar las cromatoplacas no se observ ninguna mancha en stas y por tanto no fue posible identificar la presencia de alguno de los tipos de droga bajo, el resultado fue atribuible a errores de tipo personal. Palabras claves: Extraccin lquido-lquido, Cromatografa capa delgada, drogas bsicas, drogas acidas/neutras. INTRODUCCION El anlisis de drogas es una parte importante del trabajo toxicolgico. En la orina se puede encontrar la mayora de estas y sus metabolitos, para el caso de este laboratorio fenobarbital, fenitoina, herona, cocana y morfina, puesto que el rin es uno de los principales rganos a travs del cual se da el proceso de eliminacin. Adems la obtencin de este fluido se puede realizar de manera no invasiva sin intervenir el cuerpo de una persona. (1) Las mediciones se enfocan a determinar la concentracin de la droga libre, que es la forma activa metablicamente, para ello se requiere realizar procedimientos de extraccin y/o de limpieza de los dems componentes del fluido biolgico. Para el anlisis de drogas, el primer y paso ms relevante es la extraccin, pues de ella depender que logre o no obtenerse el analito o compuesto de inters. La extraccin lquido-lquido de drogas y otros txicos lipoflicos a partir de la muestra con un solvente orgnico apropiado, inmiscible con el agua, normalmente a un pH controlado, es ampliamente usada en toxicologa analtica. Los txicos orgnicos fijos pueden tener carcter cido (barbitrico, hidantona, primidona, salicilatos), neutro (meprobamato) o bsico (benzodiacepinas, anorexgenos, alcaloides, neurolpticos, antidepresivos). El procedimiento permite la extraccin del analito de su matriz original y lo transfiere a una fase orgnica fcil de manejar y evitando las interferencias. En este proceso de extraccin o aislamiento se trata de concentrar el analito para que est se encuentre dentro del rango de sensibilidad con que opera el sistema de identificacin (2) OBJETIVOS Emplear la extraccin liquido-liquido para obtener la fraccin de la muestra que contena la(s) drogas de inters. Aplicar tcnicas cromatogrficas como la CCD para identificar la presencia de drogas acidas/neutras o bsicas; y espectrofotomtricas como UV-Vis para el reconocimientos de bandas

correspondientes a la muestra y droga de inters (herona). Reconocer la importancia del pH en la extraccin de drogas cidas y bsicas. RESULTADOS El caso que se abord durante la prctica fue: Paciente que entra en estado de coma al hospital Los Chorros, y muere. De acuerdo con la historia clnica y versiones de los hechos, estaba consumiendo alcohol desde hace 1 da, presenta antecedentes de adiccin a los depresivos; se qued dormido en la silla de su casa, con frecuencia respiratoria disminuida. Se enva muestra de orina para el estudio de drogas de abuso y psicofrmacos. Con lo anterior se procede a realizar el anlisis toxicolgico utilizando la tcnica de cromatografa de capa delgada para identificar qu tipo de droga de abuso o psicofrmaco genero la muerte del paciente.
Figura 1. (a) Placa con drogas bsicas (b) Placa con drogas cidas.

En la figura 1, se muestra la placa (a) donde placa donde se sembraron los estndares de herona y cocana, no se observa la muestra a nivel de alguna de las manchas de las drogas; en la placa (b) se observ la presencia de Fenobarbital y la muestra pero con una pequea diferencia en la distancia recorrida.

Cromatografa Capa delgada (placas reveladas).

Figura 2: Revelado de CCD para droga bsica.

Cromatografa de (placas sin revelar).

Capa

delgada

(a)

(b)
Figura 2: Revelado de CCD para droga cida.

ANALISIS DE RESULTADOS Durante la prctica, con el fin de analizar drogas cidas y bsicas y su presencia en las muestras provistas, se inicia realizando una extraccin lquido-lquido con el fin lograr extraer el analito de su matriz original y transferirlo a una fase orgnica; de esta manera y despus de realizar el secado de la muestra, se logra concentrar el analito y estabilizarlo dado que en su matriz original (orina) puede ser degradado qumica o enzimticamente.

cloroformo es apolar y las diferencias de polaridad adems de las interacciones de tipo desfavorable que puedan presentarse entre ambos no permitirn la extraccin de la droga de inters. Se realiz la extraccin lquido-lquido a ambas muestras. Para la muestra A, se esperaba que en la fase orgnica se encontrara Fenobarbital o Fenitoina, (dado el caso de que el paciente hubiese fallecido por el abuso de drogas cidas) y para lograr identificarlo, posterior a la extraccin, se procedi a retirar la fase inorgnica (orina) y dejar solo la fase orgnica, sin embargo en esta parte se present dificultad para eliminar la orina de la muestra ya que no haba los implementos que facilitaran su separacin, solo se contaba con un tubo de ensayo y un gotero que dificultaba la eliminacin de la pequea cantidad de orina que quedaba en contacto con la fase orgnica. En el momento de realizar el secado tambin se presentaron dificultades debido a la presencia de orina en la muestra, lo que llevo a la prdida de parte de la fase orgnica en el intento de eliminar la orina; as se obtuvo solo una pequea cantidad de muestra que se reconstituyo con 2 gotas de metanol. Tras la extraccin, se realiz Cromatografa de Capa fina, sabiendo que realmente no es la idnea, pues solo brinda informacin acerca de la presencia o no de Fenobarbital o Fenitoina en la muestra, es decir la identificacin es solo de tipo cualitativo. Teniendo en cuenta la estructura qumica de las drogas acidas y la polaridad que esta le confiere es posible hacer separaciones por sus propiedades fisicoqumicas; as a partir del principio de cromatografa se logr hacer separaciones de acuerdo a la afinidad que existe entre la fase mvil y estacionaria. Para lo anterior se coloc una placa que contena la muestra A y fenobarbital y fue llevada a la cmara de

Para realizar el anlisis de la muestra de orina, se trata una fraccin de la muestra con cido sulfrico (Muestra A), y otra fraccin de la muestra con hidrxido de sodio. Es importante mencionar que las muestras A y B fueron tratadas con cido sulfrico o hidrxido de sodio en cada caso, con el objetivo de efectuar una adecuada extraccin, pues debe tenerse en cuenta que el pH es de elevada importancia en la extraccin de drogas cidas y bsicas. Las muestras deben ser tratadas de forma, que se logr obtener un valor de pH en el cual la droga no se encuentra ionizada para as favorecer su solubilidad en el solvente orgnico empleado, en este caso cloroformo. De esta manera las drogas cidas deben encontrarse en un medio cido y las bsicas a un pH bsico para lograr su separacin. Otro aspecto a mencionar, es que la ionizacin de las drogas depende adems del pH del pKa de sta, pues cuando la droga se encuentre en un medio con pH mayor a su pKa, predomina su forma ionizada. As por tanto las drogas cidas se trataron con cido sulfrico porque de haberse tratado con NaOH, sta se hubiese ionizado y as su solubilidad se incrementara, lo que no es adecuado pues el solvente

elucin, donde se emple con cloroformo: acetona (4:1) como fase mvil. Finalmente se dejo secar la placa y se observo en la cmara UV-Vis, donde no se evidencio la presencia de droga acida en la muestra. Tambin se realiz el revelado de estas drogas con solucin de cloruro mercrico de difenilcarbazona, donde se esperaba observar manchas violetas en la placa que seran el indicativo de barbitricos o compuestos relacionados; sin embargo no fueron visibles stas manchas. Para el anlisis de las drogas bsicas, se realiz igualmente CCD, y para ello se disolvi el extracto en 50 ul de cloroformo y se sembraron distintos estndares de drogas bsicas, en el orden en que se nombran aparecen en la cromatoplaca (ver fig. 1): -Herona -Cocana -Morfina -Amitriptilina Continuamente se llevaron las placas a una cmara de elucin, y se emple como fase mvil metanol: amoniaco 100:1.5; se dej secar la placa y se observ bajo luz UV, pero solo se evidenciaron 2 manchas correspondientes a dos de los estndares sembrados, no se observo la aparicin de dos manchas al mismo nivel (igual distancia recorrida en la placa) que deberan corresponder a la muestra y al estndar, y lo que por tanto permitira conocer cul fue la droga que caus la muerte. Despus se procedi a realizar el revelado de la placa, empleando una solucin acidificada de yodoplatino para las bandas correspondientes a herona, cocana y morfina, lo que se esperaba observar eran manchas de color violeta o azul que indicaran la presencia de drogas bsicas; para amitriptilina se emple como revelador una solucin de

Mandelins, donde la presencia de varios colores indica la presencia de drogas bsicas. Sin embargo fue posible identificar la droga presente en la muestra. Es oportuno mencionar que no se logr obtener un resultado o dar correspondencia a la muestra con una droga cida o bsica, no por errores de mtodo, si no por errores introducidos por las personas que realizaron el anlisis en cuanto a la manipulacin de las muestras, orden de trabajo y falta de un poco de destreza. Lo anterior se menciona, dado que fue posible observar durante la prctica aspectos como: inadecuado manejo de las cmaras de elucin (pues sta no debe permanecer abierta cuando se est llevando a cabo la elucin, pues es necesario que sta se encuentre saturada), tambin se evidenci que algunos procesos de extraccin fueron realizados a la ligera, lo cual puede llevar a que la separacin de las drogas no sea completa. CONCLUSIONES La muestra de orina no contena drogas acidas confirmando este resultado con una prueba cualitativa que era la CCD. No fue posible determinar la presencia de drogas cidas en la muestra de orina, a cusa de errores introducidos durante la realizacin del anlisis; razn por la cual se sugiere la realizacin de la prueba nuevamente y as lograr dar correspondencia a la muestra con algn tipo de droga cida.

REFERENCIAS (1) Gua de laboratorio de Toxicologa: Extraccin de drogas cidas y bsicas, separacin por cromatografa de capa delgada con deteccin por revelado. Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales.

(2) http://www.ataonline.org.ar/bibliotecavirtu al/documentos_utilies/toxicologia_libro_a nalitica.pdf. Visitado: Marzo 03 de2012.