Trafic intracellulaire et compartiment cellulaire I - Introduction

Toutes les protines sont fabriques dans le cytoplasme. Elles auront plusieurs destinations possibles : le noyau (facteur de transcription), la mitochondrie, les peroxysomes, les plastes chez les vgtaux. Ici nous parlerons uniquement des protines destines au rticulum endoplasmique granuleux donc destines tre scrtes. Ensuite elles passent dans le Golgi qui est un carrefour pour les protines. Aprs le Golgi, elles peuvent soit emprunter la voie des : Lysosome Membrane plasmique Vsicules de scrtions
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 Excision du peptide signal qui lui permet d'tre engag dans le rticulum endoplasmique. Formation de ponts disulfures entre 2 rsidus cystine (donc ne touche pas toute les protines) qui leurs permettent d'obtenir une conformation spcifique. Glycosylation (soit N-glycosylation ou O-glycosylation), extrmement complexe car dure pendant tout le voyage de la protine mais sera spcifique d'un compartiment un autre. Phosphorylations qui lieu dans le Golgi moyen Sulfatation et protolyse qui coupe les protines en petites parties Centre de tri qui cible les protines vers les 3 voies cites prcdemment Certaines cellules contiennent une deuxime voie de scrtion : la voie de scrtion rgule

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II - Les diffrents organelles impliqus dans la scrtion des protines

1 - Les rticulum

Le rticulum endoplasmique granulaire : il est tapiss de ribosomes. Le rticulum endoplasmique lisse : il n'est pas impliqu dans la transformation des protines mais dans la production de strodes et d'autres constituants.

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a - Adressage au rticulum

Les protines scrtes vont tre soumise une translocation co-traductionnelle : la formation de la protine se fait en mme temps qu'elle rentre dans le rticulum endoplasmique. Les protines intracellulaire et non scrtes vont tre soumise une translocation post-traductionnelle : les protines sont entirement traduite avant d'tre adresses leurs compartiments. Approches exprimentales pour dterminer l'adressage des protines : Pulse chase + autoradiographie : dtermination du lieu de synthse et du trajet de molcules marques radioactivement Fractionnement cellulaire + chromatographie, lectrophorse : prcise aussi la nature des composs et les modifications subies. Immunocytochimie : dtection in situ Gnie gntique (protines de fusion ou chimres) : suivi des dplacements en temps rel

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Hypothse du "signal" d'adressage au RE : G.Blobel et Dobbenstein (1975). Existence d'un translocon : preuve apporte par l'lectrophysiologie (1983). Il existe un signal qui permet au protine de s'adresser aux ribosomes.

Le protine SRP lie le peptide signal et permet larrt de la traduction. Il emmne l'ensemble vers la membrane du RE. La protine SRP s'associe au rcepteur de la SRP (htrodimre) qui entrane une dformation. Cette dformation permet : la dissociation de la SRP au complexe qui retourne ensuite dans le cytosol. au peptide signal de s'engouffrer dans le translocon. En traversant la membrane du rticulum, la traduction va reprendre. Le peptide signal est hydrophobe, c'est pour a qu'il passe la membrane facilement. La signal peptidase va cliver le peptide signal. L'appareil de translocation est compos d'un rcepteur de la particule SRP

b - Biosynthse des protines membranaires

La protines va avoir 2 domaines hydrophobes : le peptide signal et le domaine trans-membranaire. Lorsque la squence trans-membranaire, rentre dans le RE, la traduction sarrte. Parfois le peptide signal ne sera pas cliv et contribuera la partie hydrophobe transmembranaire de la protine.

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 Protines membranaires de type 1 : la partie N-terminale se trouve dans la lumire du rticulum. Protines membranaire de type 2 : la partie C-terminale se trouve dans la lumire du rticulum. Les types 1 et 2 sont dtermin selon la charge des 15 premiers acides amins de part et d'autre la protine. Si du cot C-terminal, on a + 2 en charge globale et du cot N-terminal, on a 0, on fait la diffrence C - N < 0 alors la protine sera de type 2, si C - N > 0 alors la protine et de type 1

c - Modifications des protines

La peptide disulfide isomrase : elle a une activit de correction (certain pont disulfure se font de manire errons) et elle tablie les bons ponts disulfures. Cela permet la protine d'adopter la bonne conformation (folding) 2 types de glycosylation : N-glycosylation : le sucre se lit sur une asparagine mais il faut quand mme une squence consensus (Asn-X) O-glycosylation : le sucre se lie soit une srine ou une thronine

d - Les signaux de localisation dans le RE

Transport rtrograde du Golgi vers le RE : Prsence de signaux de tri "rcupration" par le RE (lorsque les protines ont t trop loin et qu'elles n'ont rien faire en dehors du rticulum) En fait, la rcupration slective des protines rsidentes dans le rticulum leurs permettent de subir des modifications post-traductionnelles Elles reviennent l'aide des vsicules slectives Prison ouverte Protines rsidentes de membrane du RE : Signal KKXX (lysine-lysin-AA-AA) lextrmit C-terminale des protines de la membrane du RE

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 Signal qui se lie directement COP1 emballage dans des vsicules COP1 transport rtrograde vers le RE Protines rsidentes solubles : Signal KDEL (lysine-Asp-Glu-Leu) l'extrmit C-terminale des protines solubles du RE Signal qui ne se lie pas directement COP1 : prsence de protines rceptrices spcialises comme le rcepteur KDEL Rcepteur KDEL : Protine transmembranire plusieurs passages Les rcepteur KDEL Recyclage du rcepteur KDEL : VTC/Golgi Forte affinit pour la squence KDEL Capture des protines rsidentes du RE qui se sont chappes et qui sont faible concentration Milieu lgrement acide liaison Dans le RE Faible affinit pour la squence KDEL Libration du cargo malgr la forte concentration en protines rsidentes du RE portant le signal KDEL Milieu pH neutre libration Se lie toute squence KDEL vsicule COP1 transport rtrograde vers le RE

Trajet rtrograde des protines rsidentes dans le RE :

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Maintient des protines rsidentes du RE dans le RE : KDEL / KDEL rcepteur Protine rsidente sans son KDEL scrtion de la protine, mais scrtion lente KDEL / KDEL rcepteur ne servirait que pour faire revenir les protines qui se sont chappes

Autre mcanisme : agrgation des protines entre-elles trop gros pour une vsicule 2- L'appareil de Golgi Premier organite dcrit par les microscopistes la fin du 19me. Accumulation de petit saccules directement en liaison avec le RE

La face cis : est la plus proche physiquement du RE La partie mdian La face trans : la partie la plus loigne du RE le rseau trans-golgien, vritable car refour de la cellule

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a- Rle du complexe golgien

Synthse de glycoprotines et de protoglycanes

Modifications des chanes N-lies vers des chanes exportables par ajout de nouveaux oses O-glycosylation sur des protines Greffage de sucres sur certains lipides glycolipides Clivages protolytiques

Certaines protines destines la scrtion devront subir plusieurs clivages, ceux-ci, amorcs dans le TGN se poursuivent dans les grains de scrtion Centre de tri

Les saccules du Golgi font l'objet d'changes antrogrades et rtrogrades par des vsicules manteau COP1

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b - Le rseau trans-golgien (TGN) est un centre de tri

Les mannose 6 phosphate : signal de ciblage vers la voie lysosomale

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III Le trafic vsiculaire

Le transport vsiculaire doit permettre : le maintient de la symtrie de la membrane (la composition de la membrane du Golgi n'est pas la mme que la membrane plasmique) Il doit y avoir un ciblage des vsicules, elle doivent se rendre au bon endroit. le transport des molcules solubles qui ne peuvent passer les membranes seules.

1re tape : bourgeonnement partir du compartiment donneur. 2me tape : formation de la vsicule qui doit tre cible vers des compartiments spcifiques (se fait l'aide des protines SNARE) 3me tape : fusion avec la membrane rceptrice

quilibre entre les compartiments : entres = sorties pour les membranes et pour les cargos (ce qui est transport) un aller et un retour slectivit (des cargos transports et des destinations)

Problme : si il y a un change permanent entre les compartiments, il y aura un mlange des molcules et terme, les compartiments finirons par tre identique. La solution : marqueurs molculaires exprims la surface cytosolique des membranes Mthodes d'approches : Systmes sans cellules Protines de fusion avec la GFP Gntique

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1. Les types de vsicules

lments d'approche :

2. Assemblage du manteau (les GTPases) 3. Guidage du transport (les SNARE) 4. Amarrage (protines Rab 5. Fusion

1 Les types de vsicules Le recouvrement de la face cytosolique des vsicules va permettre la bourgeonnement, ensuite ce manteau disparat et il y aura fusion de la membrane. Les 2 rle du manteau :

Concentration de protines membranaires dans un patch qui formera la vsicule permet la slection des molcules transporter Moule la vsicule qui aura ainsi toujours a peu prs la mme taille

Les 3 types de manteau des vsicules recouvertes : clathrine COP1 COP2

On peut les distinguer en microscopie lectronique

Utilisation des diffrents manteaux dans le trafic vsiculaire : Clathrine : partir et partir de la membrane plasmique (au moins 3 types de vsicules clathrine) COP1 et COP2 : partir dur RE et du Golgi beaucoup d'autres 2 - Assemblage du manteau (les GTPases)

a Exemple de la clathrine (cas le plus tudi)

Une sous-unit de clathrine = 3 grosses chanes + 3 petites chanes Une sous-unit = un trisklion
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 Assemblage des triskelions en un panier d'hexagones et de pentagones Les triskelions peuvent s'assembler spontanment en panier mme sans membrane. Le manteau de clathrine ;

Un manteau = 36 trisklion (sans la vsicule) 12 pentagones + 6 hexagones Formation de 2 coquilles :

externe interne : domaine N-terminaux des chanes lourdes ou se fixent les adaptines Sur une vsicule : 12 pentagones + beaucoup plus d'hexagones

L'adaptine : Protine de manteau clathrine Complexe multiprotique Lie la clathrine la membrane Pige les protines transmembranaires dont les rcepteurs qui capturent les cargos solubles Au moins 4 types d'adaptine pour les diffrents rcepteurs de cargo

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Assemblage et dsassemblage d'un manteau de clathrine : Les adaptines se lient la clathrine et au complexe cargo/cargo-r Dynamine = GTPase

Pincement de la membrane : Dynamine + autres protines Fusion des feuillets non cytosoliques (grce la dynamine)

Perte du manteau : La vsicule quitte la membrane Le manteau de clathrine est perdu immdiatement

intervention de chaperonnes de la famille des hsp70 (ATPase) auxilline active l'ATPase

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 La vsicule doit attendre d'tre constitue pour que le manteau se retire Spcificit du manteau : Mcanismes gnraux identiques Mais chaque membrane ses spcificits

membrane plasmique (riche en cholestrol) : ncessite de beaucoup dnergie autres membranes : existence de bourgeonnements Toutes les vsicules ne sont pas sphriques : Membranes contenant des protines fluorescentes Long tubules qui manent des endosomes et rseau trans-golgien (TGN) Ces tubules peuvent servir de transporteurs (grand rapport surface / volume) une vsicule peut tre tubulaire ! L'activation de ce systme marche comme le systme Kinase ou Phosphatase mais avec des protines spcifiques.

b Contrle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel)

Le systme fonctionne comme la signalisation par phosphorylation mais avec la GTP binding protein (donc le schma de droite)

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 GTP binding proteins 2 tats Actif avec liaison de GTP Inactif avec liaison de GDP 2 types Monomrique (= GTPases monomriques) les mieux connues Trimrique (= GTPases trimriques = protines G) Passage d'un tat a l'autre par

GEFs (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) GDP GTP GAPs (GTPase-Activating Proteins) GTP GDP

c - Protines autres que la clathrine

Cop1 : 7 sous-units protiques (analogies avec l'adaptine) - bourgeonnement partir du Golgi Cop2 : 4 sous-units protiques - Bourgeonnement partir du RE

GTPases de recrutement du manteau : la squence - Une vsicules COP2 est sur le point de bourgeonnement -.......
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GTPases de recrutement du manteau : les acteurs : Membrane du RE Sar 1 GDP (= GTPases de recrutement du manteau) forte concentration, cytosolique, inactive GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factor) GTPases de recrutement du manteau : la squence : Une vsicule COPII est sur le point de bourgeonner (du RE). Une GEF spcifique (protine de membrane du RE appele Sec 12) se lie a la Sar 1 du cytosol et remplace le GDP de la Sar 1 par du GTP. La Sar 1 GTP libre une queue d'acide gras lui permettant de se fixer dans la membrane du RE puis recrute des sous-units de COPII. La membrane bourgeonne en incluant des protines membranaires slectionnes

Dsassemblage du manteau : GTPases de recrutement du manteau Hydrolyse du GTP en GDP La queue est exclue de la membrane dsassemblage du manteau C'est le temps qui finit par dclencher l'hydrolyse

3. Guidage du transport (les SNARE)

Abrviations - SNAREs : SNAP receptors - SNAPs : Soluble NSF Attachement Proteins - NSF : N-ethyl
Reconnaissance vsicule de transport membrane cible Toutes les vsicules de transport ont des marqueurs de surface spcifiques de leur origine et de leur cargo Les membranes cibles ont des rcepteurs complmentaires

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Reconnaissance vsicule de transport membrane cible : 1. SNAREs Spcificit Catalyseur de la fusion 2. Rabs (GTPases cible) Amarrage initial Fixation de la vsicule En collaboration avec d'autres protines SNAREs Au moins 20 espces diffrentes Protines trans-membranaires Marchent par 2 : v-SNAREs (vesicle) clef

t-SNAREs (target = cible) serrure

Domaine hlicodale qui s'enroule l'un dans l'autre complexe trans-SNARE qui contribue

Rle des SNAREs dans le guidage des vsicules de transports

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Complexe trans-SNARE : Toujours 4 hlice alpha 3 formes par t-SNARE 1 forme par v-SNARE Ici 3 protines v-SNARE 1 hlice (synaptobrvine) t-SNARE 1 hlice (syntaxine) t-SNARE 2 hlices (Snap 25 : protine priphrique) Dsassemblage du complexe trans-SNARE pres fusion le complexe SNARE est stable dans la membrane Doit tre dsassemble NSF (Nethylmaleimide-sensitive-fusion-protein) NSF : Cycle entre les membranes et le cytosol Catalyse le dsassemblage ATPase Ressemble a une chaperonne cytosolique qui solubilise et aide a replier correctement les protines dnatures Droule les hlices des SNAREs en collaboration avec des protines adaptatrices

NSF + des protines adaptatrices hydrolyse ATP + sparation des SNAREs La dissociation regule quand et ou les membranes vont fusionner

Dissociation d'une paire v-SNARE t-SNARE par NSF une fois le cycle de fusion termin

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4. Ammargage (protines Rab) Rle important des protines Rab dans la spcificit du transport vsiculaire Protines Rab : GTPases monomriques Plus de 30 membres la plus grande sous-famille de GTPases monomriques Distribution caractristique sur les membranes cellulaires Chaque organite a au moins une protine Rab sur sa face cytosolique Facilitent et rgulent : Le taux d'amarrage des vsicules et l'appariement des v- t- SNAREs Comme les GTPases de recrutement du manteau elles cyclent entre la membrane et le cytosol Comme les GTPases de recrutement du manteau, 2 tats : Inactif avec liaison de GDP dans le cytosol Actif avec liaison de GTP associe une membrane Les protines Rab sont diffrentes selon les compartiments sub-cellulaires

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Les effecteurs de Rab : Reconnaissance de Rab (Lie, GTP) par un Rab effecteur Gros complexe protique Trs variable d'une protine Rab a une autre Parfois longues protines filamenteuses qui limitent le mouvement des vsicules entre des citernes golgiennes adjacentes Se lient a Rab et empchent l'hydrolyse prmature du GTP D'autres sont des moteurs qui dirigent les vsicules vers leur destination Protines Rab (suite) Agissent sur les protines de contrle des SNAREs Acclrent le processus de reconnaissance des SNAREs entre elles Achvent le verrouillage de la vsicule a sa cible par appariement des SNAREs qui sera prte pour la fusion pres la fusion, la protine Rab hydrolyse son GTP lie et retourne dans le cytosol 5. Fusion Distinguer amarrage de fusion Fusion ne fait pas toujours suite a amarrage : ex : exocytose rgule Amarrage : les protines des membranes interagissent et adhrent Fusion : les couches lipidiques peuvent se joindre ncessite d'extrusion d'eau protines de fusion pour rsoudre le problme nergtique ( dynamine au cours du bourgeonnement des vsicules a clathrine) Modle de concentration des protines SNAREs au cours de la fusion de membrane Des liposomes (in vitro) v-SNAREs + des liposomes t-SNAREs fusion lente Intervention (dans la cellule) d'autres protines : pour initier la fusion ou pour retirer des protines inhibitrices

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Importance des phnomnes de fusion de membrane : Transport vsiculaire Fcondation (fusion oolemme spermatozode) Fusion des myoblastes Maintien de lidentit des cellules Maintien de lidentit des compartiments intracellulaires Mode dentre des virus a enveloppe dans les cellules DISCRIMINATION ENTRE VOIE CONSTITUTIVE ET VOIE RGULE ? C'est dire : quelles sont les mcanismes qui vont faire que les protines vont emprunter la voie constitutive ou rgule

Les diffrentes tapes : a. Agrgation b. Concentration c. Maturation d. Exocytose

A. Agrgation des molcules Grce des signaux inconnus mais probablement communs toute une classe de protines. Les candidats potentiels sont les chromogranines (prsente dans uniquement dans les cellules scrtion rgule) Toutes les chromogranines, ont un point isolectrique trs acides. Si on prend un tube, on met des chromogranines avec le pH du Golgi et la concentration adquat en calcium, elles vont s'agrger spontanment. Certaines familles de chromogranines possdent des ponts disulfures qui permettent le ciblage des protines vers les voies de scrtions rgule, cela dit, toutes les protines de la voie rgule ne possdent pas de pont S-S

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B. Concentration Au dpart simple bourgeonnement du TGN appel : vsicules scrtoires immature Puis concentration : Par retour de membrane vers les endosomes Acidification du contenu de la lumire Toutefois concentration modre par rapport celle qui survient la sortie du RE

C. Maturation Se fait souvent par protolyse pendant la formation de la vsicule Activation des prcurseurs inactifs en molcules actives par protolyse (hormones polypeptidiques et neurohormones) Ou ? Dbute dans le TGN continue dans le granule immature et dans lespace extra cellulaire
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 Amidation (ajout dun groupement amide en C-terminal par la PAM (peptidyl alpha amidating monooxygenase). La glycine est un donneur damidation X-X-Gly X-XNH2 Ajout dun groupement pyroglu par la pyroglutamyltransferase (Gln pGlu). Exemple de la TRH pGlu-His-Pro-NH2 Ajout dun groupement acetyl en N-terminal (acetyltransferase). Alpha MSH acetylee active en priphrie mais pas dans le cerveau Une protolyse spcifique a la voie rgule Toutes ces modifications vont moduler lactivite des proteines formees D. Exocytose

Conclusion Le trafic intracellulaire est ncessaire a la bonne localisation des protines et permet de moduler leur activit biologique Les modifications post-traductionnelles rgulent lactivit des protines Elles sont spcifiques dun compartiment donn Le trafic intra-cellulaire seffectue dans les deux sens pour maintenir larchitecture de la cellule
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