UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARAN CENTRO DE CINCIAS MDICAS E FARMACUTICAS

APOSTILA DE AULAS PRTICAS DE BIOQUMICA

ALUNO(A):.................................................................................... CURSO: FARMCIA SRIE: 1 ANO TURMA: 2013 Profa. Dra. Marli Terezinha Frana Cornelius

NDICE 1a AULA: Normas Para o Trabalho no Laboratrio ..............................................................................3 NORMAS PARA REDAO DO RELATRIO DE AULAS PRTICAS DE BIOQUMICA ..........6 2a AULA: Vidrarias e Manuseio de Material de Laboratrio ................................................................8 3a AULA: Clculos Bioqumicos e Preparo de Solues .................................................................... 14 4a AULA: pH e Soluo Tampo........................................................................................................ 16 5a AULA: Verificao do Efeito da Soluo-Tampo ......................................................................... 18 6a AULA: Titulao Potenciomtrica de Aminocidos ....................................................................... 19 7a AULA: Determinao do Ponto Isoeltrico da Casena .................................................................. 21 8a AULA: Reaes Qualitativas para Identificao de Aminocidos................................................... 22 9a AULA: Reaes de Caracterizao e Precipitao de Protenas ...................................................... 25 10a AULA: Caracterizao da Enzima Urease de Soja........................................................................ 28 11a AULA: Cintica Enzimtica da Invertase I ................................................................................... 30 12a AULA: Cintica Enzimtica da Invertase II ................................................................................. 32 13a AULA: Caracterizao de Carboidratos - Reaes Qualitativas .................................................... 33 14a AULA: Caracterizao de Carboidratos Reaes de Redues .................................................. 36 15a AULA: Dilise ............................................................................................................................. 38 16a AULA: Extrao e Caracterizao do Amido ............................................................................... 40 17a AULA: Testes Para Caracterizao de Lipdeos ........................................................................... 42 18a AULA: Prtica de Carotenoides ................................................................................................... 45 19a AULA: Cromatografia de Carboidratos ........................................................................................ 46 20a AULA: Identificao de cidos Nucleicos em Materiais Biolgicos ............................................ 48 21a AULA: Espectrofotometria .......................................................................................................... 50 22a Aula: Seleo da rea Espectral = Espectro de Absoro ............................................................. 53 23a AULA: Preparo da Curva Padro (Curva De Calibrao) ............................................................. 54 24a AULA: Dosagem de Protena no Soro .......................................................................................... 55 25a AULA: Determinao de Glicose no Sangue ................................................................................ 56 26a AULA: Dosagem de Triglicerdeos no Sangue ............................................................................. 58 27a AULA: Determinao de Clcio Srico ........................................................................................ 59 28a AULA: Determinao de Fsforo................................................................................................. 60 29a AULA: Determinao de Magnsio no Soro ................................................................................ 62 Bibliografia ........................................................................................................................................ 64

1a AULA: Normas Para o Trabalho no Laboratrio

O laboratrio um lugar privilegiado para a realizao de experimentos, possuindo instalaes de gua, luz e gs de fcil acesso em todas as bancadas. Possui ainda local especial para manipulao das substncias txicas, denominado capela, que dispe de sistema prprio de exausto de gases. O laboratrio um local onde h um grande nmero de substncias que possuem os mais variados nveis de toxicidade e periculosidade. Este um local bastante vulnervel a acidentes, caso no se trabalhe com as devidas precaues. As regras gerais de segurana em laboratrio resultam de vrios anos de esforos de pessoas preocupadas em tornar o trabalho no laboratrio uma atividade segura, minimizando os riscos de acidentes. Para tirar o mximo de proveito delas, necessrio que todos os usurios as conheam e as pratiquem, desde o primeiro instante em que pretenderem permanecer em um laboratrio. So regras simples, fceis de memorizar e de seguir. I. INSTRUES GERAIS PARA LABORATRIO 01) Lembre-se de que o laboratrio um lugar para trabalhos srios e no para experimentos ao acaso. 02) Comparea pontualmente s aulas nos dias e nos laboratrios designados para sua turma. 03) obrigatrio o uso de JALECO DE MANGAS LONGAS, CALADO FECHADO e CALA COMPRIDA para assistir as aulas prticas, sem essas condies o aluna NO PODER ASSISTIR S AULAS PRTICAS. 04) Os materiais desnecessrios prtica (bolsas, pastas, celulares) devem ser mantidos fora das mesas de trabalho. 05) Os materiais necessrios na bancada so: a Apostila de Aula Prtica, lpis, caneta e borracha. Caso precisar de outro material ser solicitado pelo professor. 06) proibido fumar, comer e beber no laboratrio. 07) Estudar previamente os roteiros de prticas e anotar as observaes e resultados. 08) Realize somente os experimentos indicados ou autorizados. 09) Nunca prove uma droga ou uma soluo. 10) Use somente o material e reagente que estiver sobre sua mesa, precisando de outros solicite ao professor, tcnico ou monitor. 11) Procure no desperdiar nada. 12) No jogue qualquer material slido ou lquido (exceo gua) na pia. 13) Ao lidar com vidrarias, proceda com cuidado para evitar quebras e cortes perigosos. 14) No colocar os dedos ou as mos na boca, no rosto ou em qualquer parte da pele durante as aulas prticas. 15) O trabalho em grupo deve ser encarado com seriedade e no como oportunidade para brincadeiras, todos precisam controlar a altura da voz para no perturbar as aulas nas salas vizinhas. 16) A seriedade e a ordem durante a realizao dos experimentos so fundamentais para evitar acidentes. 17) Se ocorrer qualquer acidente (ferimento, queimaduras) ou quebra de materiais ou aparelhos chame imediatamente o professor. 18) Lembre-se que s voc responde pela sua segurana.

II. PRINCPIOS GERAIS DE TCNICAS A. Antes do Experimento: 1. Leia as prticas com antecedncia para obter melhor aproveitamento das aulas. 2. Vista o avental (guarda-p, bata). 3. Organize o seu campo de trabalho. 4. Verifique se o material est em condio adequada para uso (no utilize material de vidro trincado ou quebrado). B. Durante o Experimento: 1. No troque os reagentes de uma bancada para outra. 2. Leia duas vezes o rtulo dos frascos de reativos, antes de utiliz-los. Nunca utilize um reagente que no esteja identificado ou rotulado. Na dvida solicite ajuda do professor, monitor ou tcnico. 3. No manuseie slidos e lquidos desconhecidos apenas por curiosidade. 4. Identifique imediatamente qualquer reagente ou soluo preparada. 5. Para evitar contaminao das solues: - Antes de introduzir pipetas nas solues, certifique-se de que esto limpas; - Use sempre uma pipeta para cada reagente; - No troque as rolhas ou tampas dos frascos dos reagentes; - Nunca devolva a soluo para o frasco estoque; 6. - No use a mesma vidraria para medir substncias ou solues diferentes. 7. Nunca teste amostras ou reagentes pelo sabor. No leve boca qualquer reagente, nem mesmo o mais diludo. 8. Para verificar o odor da substncia, nunca leve o rosto diretamente sobre o frasco. Os vapores devem ser abanados com uma das mos em direo ao nariz, enquanto se segura o frasco com a outra mo. 9. No leve a mo boca ou aos olhos enquanto estiver manuseando produtos qumicos ou biolgicos. 10. Reagentes volteis ou txicos devem ser manuseados na capela. 11. Nunca deixe ou abra frascos de lquidos inflamveis (ter, lcool, acetona, benzeno, etc.), nas proximidades de chamas. 12. No circule no laboratrio com frascos de lcool ou outros produtos volteis e inflamveis, quando a chama do Bico de Bnsen estiver acesa. 13. No pipetar com a boca, os cidos concentrados e outras substncias perigosas, use pipetador ou pra de suco. 14. Se qualquer substncia cair no cho ou na mesa, avise o professora, monitor ou tcnico para ser imediatamente lavado o local. 15. No utilizar materiais escolares (lpis, caneta) para misturar substncias. 16. Para preparar solues de cidos fortes (sulfrico, clordrico, ntrico, etc.), verter sempre o cido sobre gua, nunca o inverso, porque provoca reao exotrmica violenta. No aspire os vapores desprendidos por esses cidos, so extremamente txicos. 17. Para o preparo das solues alcalinas (NaOH, KOH, etc.) tome bastante precauo, pois a reao exotrmica e corrosiva. Mantenha o frasco em banho de gelo para evitar quebras. No aspire os vapores desprendidos por essas bases, so extremamente txicos. 18. Quando preparar solues alcolicas, o lcool e a gua devem ser medidos separadamente e depois reunidos, porque h diminuio do volume final.

19. O material volumtrico vem calibrado com gua e uma temperatura determinada, conforme vem registrado (15C, 20C, 25C). Estas vidrarias no podem ser secas em estufas a altas temperaturas. C. Depois do Experimento: 1. Descartar os reagentes conforme recomendado em cada aula. 2. Lave os tubos e outros materiais utilizados. MANTER LIMPO TODO O MATERIAL SUA RESPONSABILIDADE. 3. Limpe e organize a bancada. 4. Fechar todos os bicos de gs e torneiras. 5. Lavar as mos APS A AULA PRTICA. III. CUIDADOS NO USO DE SUBSTNCIAS QUMICAS 1. Ao aquecer substncias em tubo de ensaio, dirija a abertura deste para o lado em que no haja nenhum colega. 2. Nunca coloque o rosto muito prximo de um recipiente onde est ocorrendo uma reao qumica. 3. Nunca cheire diretamente qualquer substncia. Mantenha o recipiente que a contm afastado do rosto e, com movimento das mos, dirija os vapores desprendidos para o nariz. 4. Nunca prove qualquer substncia utilizada ou produzida durante os experimentos. 5. Nunca adicione gua a um cido concentrado (reao violenta com produo de calor e borbulhamento intenso), pois o cido poder atingir o seu rosto. Sempre despeje o cido sobre a gua pela parede o frasco ou tubo. No aspire os vapores desprendidos. 6. Para o preparo das solues alcalinas (NaOH, KOH, etc.) mantenha o frasco em banho de gelo para evitar quebras, pois a reao exotrmica e corrosiva. No aspire os vapores desprendidos. 7. Leia com ateno os rtulos dos frascos antes de usar seus contedos. 8. No use quantidades exageradas de substncias. Use sempre as quantidades indicadas no roteiro 9. No misture substncias ao acaso, mas somente de acordo com as instrues. ACIDENTES NO LABORATRIO E SOCORROS DE URGNCIA QUALQUER ACIDENTE QUE OCORRER NO LABORATRIO DEVE SER COMUNICADO AO PROFESSOR. QUEIMADURAS: PELO CALOR: Aplicar gaze com leo ou pomada para queimadura (Picrato de Butesina) ou leite de magnsia. POR CIDOS: Lavar o local abundantemente com gua de torneira e a seguir aplicar algodo embebido em bicarbonato de sdio (NaHCO3) a 5%. POR LCALIS: Lavar o local abundantemente com gua de torneira e a seguir aplicar algodo embebido em cido actico a 1% ou cido ctrico a 1%. POR FENOL: Lavar o local abundantemente com gua de torneira e a seguir com lcool, aplicando gaze com pomada. CORTES: Remover objetos estranhos. Limpar com gaze seca. Aplicar mertiolato ou mercrio cromo. Colocar atadura de gaze ou atadura adesiva.

INTOXICAES: a) POR GAZES OU VAPORES: Respirar ar fresco, afrouxar a roupa e repousar deitado. b) POR SOLUES OU SLIDOS INGERIDOS: Provocar vmito por estmulo com o dedo, ou 10 mL de CuSO4 a 5%. Tomar leite de magnsia. c) POR HIDRXIDO DE SDIO: Lavar a boca com gua em grande abundncia. Lavar a seguir com soluo de cido actico a 1% ou cido ctrico a 1%. Se necessrio ingerir cido ctrico ou actico a 1%. d) POR AMNIA: Se inalar, repousar ao ar livre, sem forar a respirao.

LEIA SEMPRE O ROTEIRO DA PRTICA ANTES DE ASSISTIR A AULA

NORMAS PARA REDAO DO RELATRIO DE AULAS PRTICAS DE BIOQUMICA Somente quem participar de TODA AULA PRTICA PODERA FAZER O RELATRIO. O RELATRIO TEM QUE SER ESCRITO A MO E NO ULTRAPASSAR 5 PGINAS DE PAPEL ALMAO. Sero 25 relatrios cada um atribudo uma nota de 4,0 pontos (25 X 4 = 100,0). Quem fizer todos relatrios de maneira correta ganhar 100,0 pontos para somar na nota da mdia da disciplina. A forma para se redigir o relatrio deve ser respeitada, uma vez que a avaliao do mesmo feita de acordo com esta orientao. Assim todo relatrio devera conter os seguintes itens: CAPA: Devera ter: Nome da UNIOESTE - Universidade Estadual do Oeste do Paran; do Centro de Cincias Biolgicas e da Sade. Curso de Fisioterapia. Relatrio de aulas prticas de Bioqumica. Ttulo da aula. Nome do aluno. Local/Data (d/m/a).

Modelo de capa para relatrio

UNIOESTE - UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARAN CENTRO DE CINCIAS MDICAS E FARMACUTICAS CURSO DE FARMCIA
5 linhas

Relatrio de Aulas Prticas de Bioqumica.

3 linhas

Ttulo da Aula Prtica.

5 linhas

Ana Paula Dias Turetta

5 linhas

Cascavel 18/04/2013
OBJETIVOS: Colocar o(s) objetivo(s) da aula prtica de forma clara e concisa. INTRODUO: Deve conter os fundamentos bioqumicos da metodologia empregada (aspectos tericos da aula prtica encontrados na literatura). MATERIAIS E MTODOS: Descrever os procedimentos executados em laboratrio incluindo todos os reagentes, materiais e equipamentos utilizados. RESULTADOS E DISCUSSO: Colocar todos os dados obtidos (utilizar tabelas, caso julgue necessrio). Os grficos sero aceitos em papel milimetrado. Comentar os resultados obtidos, discutir possveis diferenas obtidas comparando como os dados da literatura. Responder as questes da apostila. CONCLUSO: Comentar quais as concluses da aula prtica. Ser claro e objetivo nas concluses. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou no. BIBLIOGRAFIA: Colocar todos os livros e artigos consultados. Exemplos: ENRICONE, Dlcia. et al. Planejamento de ensino e avaliao. 10.ed. Porto Alegre: Sagra, 1984. 306 p. (Srie Didtica, 3) CARDOSO, Adauto Lucio. Vises da natureza no processo de constituio do urbanismo moderno. Cadernos IPPUR/UFRJ, Rio de Janeiro, v. 14, n. 1, p. 119150, jan./jul. 2000.

2a AULA: Vidrarias e Manuseio de Material de Laboratrio (RELATRIO)

A ANLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA Nas anlises qualitativas o pesquisador procura determinar a qualidade do material a ser analisado, ou seja, a deteco de substncias especficas. Exemplo: Anlise qualitativa de glicose na urina verifica-se ou no a presena de glicose na urina, no importando a quantidade em que ela possa aparecer. Em testes qualitativos pode-se usar vidraria de menor preciso, como por exemplo, pipetas graduadas, bqueres, erlenmeyers, provetas, que do medidas aproximadas. Por outro lado, as anlises quantitativas destinam-se determinao, com maior preciso possvel, da quantidade do material analisado. Nestes casos, interessa ao pesquisador obter a quantidade exata de uma determinada substncia (glicose sangunea), procurando evitar ao mximo, erros e interferncias de outros compostos. Os materiais utilizados em anlises quantitativas incluem aqueles de grande preciso, como pipetas volumtricas, bales volumtricos, buretas, que apresentam medidas mais exatas e permitem chegar o mais prximo possvel dos valores reais. B MATERIAL DE ROTINA NO LABORATRIO O estudante deve conhecer o material que ser utilizado no laboratrio, saber manipula-lo e ter conhecimento dos cuidados relativos sua conservao. VIDRARIAS

Balo de fundo chato: Utilizado como recipiente para conter lquidos ou solues, ou mesmo, fazer reaes com desprendimento de gases. Pode ser aquecido sobre o trip com tela de amianto. Balo volumtrico: Podem ser de vidro comum ou pirex, com diversas capacidades. Medem um volume exato, a uma determinada temperatura, geralmente 20oC, podendo ser utilizados sem erro aprecivel a 20o C 8oC. Utilizados para o preparo de solues. Por se tratar de vidraria volumtrica aferida, no o submetem as altas temperaturas. Bquer: Geralmente de vidro pirex; diversas capacidades. So destinados a conter e no medir volumes e de uso geral em laboratrio. Serve para fazer reaes entre solues, dissolver substncias slidas, efetuar reaes de precipitao e aquecer lquidos. Pode ser aquecido sobre a tela de amianto.

Basto (ou baqueta) de vidro um instrumento feito em vidro alcalino, macio, utilizado em transportes de lquidos e agitao de solues. Geralmente usado em conjunto com o bquer.

Erlenmeyer: Geralmente de vidro pirex; diversas capacidades. So destinados a conter volumes. Utilizado em titulaes, aquecimento de lquidos e para dissolver substncias e proceder reaes entre solues.

Funil: De diversos dimetros, com ou sem ranhuras. Usados para filtrao simples ou na transferncia de lquidos para recipiente de boca estreita.

Pipeta de Pasteur: Pipetas simples, no possuem abertura superior, apenas a inferior para entrada de lquido. Possuem na ponta um balo que quando pressionado expele o ar para fora. Da mergulha-se a ponta no lquido e em seguida soltando o balo, trazendo o lquido para a pipeta. Geralmente so feitas de vidro ou plstico (descartveis). Foi criada pelo mdico francs Louis Pasteur em suas pesquisas.

Pipeta graduada: Utilizada para medir pequenos volumes. Mede volumes variveis. No pode ser aquecida. Deve ser lavada e enxaguada com gua destilada logo aps o uso, principalmente quando se medir lquidos viscosos.

Pipeta volumtrica: Usada para medir e transferir volume de lquidos. No pode ser aquecida por possuir grande preciso de medida. Deve ser lavada e enxaguada com gua destilada logo aps o uso, principalmente quando se medir lquidos viscosos. Nota: Atualmente so muito utilizadas nos laboratrios as pipetas automticas, que podem ter volumes variveis e possibilitam a transferncia de quantidades muito pequenas de lquidos, da ordem de microlitros. Pipeta automtica ou micropipeta: Micropipetas so aparelhos designados para a transferncia de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 l) com mxima preciso. A construo das micropipetas consiste em um corpo anatmico de polipropileno (autoclavvel) equipado com um boto dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartveis na parte inferior. Existem vrios tipos de micropipetas: - pipetas monocanal ou multicanal - pipetas com volume fixo ou com volume varivel - pipetas com deslocamento de ar ou com deslocamento positivo Proveta: Pode ser de vidro comum ou pirex com diversas capacidades. Serve para medir e transferir volumes de lquidos com preciso de at 0,5% (Mais preciso que um bquer ou erlenmeyer, porm menos preciso que a pipeta graduada). No pode ser aquecida.

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Tubo de ensaio: De vidro pirex comum, de diversos tamanhos. Empregado para fazer reaes em pequena escala, principalmente em testes de reao em geral. Pode ser aquecido com movimentos circulares e com cuidado diretamente sob a chama do bico de Bnsen. Quando aquecidos devem ser agitados continuamente para evitar borbulhamento intenso. Existem tubos especiais para centrfugas, utilizados em reaes qumicas, que formam substncias insolveis, e que necessita de uma precipitao rpida por meio de um centrifugador.

Bureta: aparelho utilizado em anlises volumtricas para dispensar lquidos com grande exatido. Pode-se livrar-se de quantidades de volume variveis, devido s marcas de graduao e extenso.

Almofariz com pistilo: usado na triturao e pulverizao de slidos.

Cadinho: pea geralmente de porcelana cuja utilidade aquecer substncias a seco e com grande intensidade, por isto pode ser levado diretamente ao bico de Bnsen.

Cpsula de porcelana: pea de porcelana usada para evaporar lquidos das solues.

Condensador: utilizado na destilao, tem como finalidade condensar vapores gerados pelo aquecimento de lquidos.

Dessecador: usado para guardar substncias em atmosfera com baixo ndice de umidade.

Vidro de relgio: pea de vidro de forma cncava. usada em anlises e evaporaes. No pode ser aquecida diretamente.

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OUTROS EQUIPAMENTOS

Anel ou argola: usado como suporte do funil na filtrao.

Balana digital: para a medida de massa de slidos e lquidos no volteis com grande preciso.

Bico de Bnsen: Possuem uma entrada de gs ajustvel que permite regular a composio de mistura de gs com ar. Ao acender o bico de gs, ter o cuidado de no abrir a entrada de gs antes de ter a mo chama para acend-lo. a fonte de aquecimento mais utilizada em laboratrio, mas contemporaneamente tem sido substitudo pelas mantas, chapas de aquecimento e banho-maria.

Estante para tubo de ensaio: usada para suporte de os tubos de ensaio.

Garra de condensador: usada para prender o condensador haste do suporte ou outras peas como bales, erlenmeyers etc.

Pina de madeira: usada para prender o tubo de ensaio durante o aquecimento.

Pina metlica: usada para manipular objetos aquecidos.

Pisseta ou frasco lavador: usada para lavagens de materiais ou recipientes atravs de jatos de gua, lcool ou outros solventes.

Suporte universal: utilizado em operaes como: filtrao, suporte para condensador, bureta, sistemas de destilao etc. Serve tambm para sustentar peas em geral.

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Tela de amianto: suporte para as peas a serem aquecidas. A funo do amianto distribuir uniformemente o calor recebido pelo bico de Bnsen.

Trip: sustentculo para efetuar aquecimentos de solues em vidrarias diversas de laboratrio. utilizado em conjunto com a tela de amianto.

C MANIPULAO DO MATERIAL RECEBIDO Objetivo: 1. Medir solues em pipetas graduadas, volumtricas e automticas. 2. Medir volumes em bales volumtrico e provetas. Materiais: 1. Bquer com gua destilada; 2. Ponteiras para pipetas automticas; 3. Recipiente para descarte de ponteiras; 4. Pipetas graduadas de 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, e 10,0 mL; 5. Pipetas volumtricas; 6. Pipetas automticas 7. Papel absorvente; 8. Pipetador ou pera de suco; 9. Tubos de ensaios; 10. Estante para tubos de ensaio. PROCEDIMENTO GERAL PARA USO DE PIPETAS Os cilindros graduados podem ser calibrados para conter (TC) ou para ceder (TD) o lquido. Se for calibrado para ceder, o cilindro na realidade conter um volume ligeiramente maior do que o lido, para compensar a fina camada de lquido que fica nas paredes quando seu contedo derramado. Portando pipetas com duplo risco ou marcadas TC so de sopro e as que possuem somente a tarja e um risco ou marcadas TD no devem ser sopradas pois isso j se considera na calibrao do volume. importante, antes do incio do trabalho, verificar se as pipetas esto limpas e livres de qualquer avaria. Quando usar uma pipeta (graduada ou volumtrica), coloque um pipetador adequado na parte superior do tubo de suco. Nunca use a boca para encher as pipetas, e jamais coloque uma pipeta nos lbios, seja qual for o lquido que esteja sendo medido. Pipetagem com pipetas graduadas e volumtricas: 1. Acoplar o pipetador ou pera de suco na pipeta. 2. Introduzir a pipeta na gua destiladas. 3. Antes de medir o volume do lquido, lave a pipeta com uma pequena quantidade do lquido. 4. Encha a pipeta com o lquido, levando-o at 1 a 2 cm acima da marca da graduao. 5. Remover a pipeta da gua destilada. 6. Com o auxlio de um papel absorvente, remova todo o lquido que aderiu parte externa da haste inferior. 7. Mantenha a pipeta na posio vertical e a marca no nvel dos seus olhos.

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8. Deixe o lquido escorrer lentamente at que a parte inferior do menisco fique na posio correta. 9. Encoste a ponta da pipeta na parte interna do recipiente de trabalho (tubo de ensaio, proveta ou balo volumtrico) e deixe o lquido escoar. 10. Remova a pipeta e lave-a sob gua corrente ou conforme recomendaes especficas. Pipetagem com pipetas automticas: 1. Ajustar o volume a ser pipetado. 2. Colocar a ponteira indicada para a pipeta. 3. Pressionar o mbolo da pipeta at a primeira trava e aspirar a amostra dentro da ponteira. 4. Pressionando o boto, ele funcionar como um mbolo. Pressione at o primeiro estgio para sugar o lquido e at o segundo para dispens-lo. 5. Limpar com papel absorvente, tomando o cuidado de no tocar no fluido da ponta. 6. Levar a pipeta at o tudo de ensaio e apertar o mbolo at o final para descartar o lquido. 7. Dispensar a ponteira utilizada e um recipiente. 8. Proceder limpeza e organizao da bancada.

Questes: 1) Qual a importncia do conhecimento das vidrarias para o trabalho em laboratrio? 2) Existe diferena entre pipetagem com pipeta graduada e volumtrica? 3) Discutir a confiabilidade na medida de cada um dos frascos utilizados.

3a AULA: Clculos Bioqumicos e Preparo de Solues (RELATRIO)

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1) Preparar uma soluo de NaCl 0,9% (soro fisiolgico) em um volume final de 50 mL. 2) Preparar uma soluo de amido 1% em um volume final de 50 mL. Dissolver o amido com aquecimento. 3) Preparar soluo de frutose 1% em um volume final de 50 mL. 4) Preparar solo de maltose ou lactose 1% em um volume final de 50 mL. 5) Preparar soluo de NaCl 2% em um volume final de 100 mL. 6) Preparar soluo de NaCl 1% a partir de NaCl 2% em um volume final de 50 mL. 7) Preparar soluo tampo de fosfato monobsico de sdio 100 mM (0,1 M) em um volume final de 200 mL. 8) Preparar 100 ml de soluo tampo fosfato monobsico de sdio 50 mM a partir da concentrao de 100 mM, pH 6,9. 9) Preparar soluo tampo acetato de sdio 200 mM (0,2 M) pH 5,4 em volume final 100 mL. 10) Preparar NaOH 2 M em um volume final de 200 mL, diluir esta para concentrao 1M em um volume final de 100 mL. 11) Preparar uma soluo de NaCl 0,9 %. 12) Preparar uma soluo de sacarose 0,2 M. 13) Preparar uma soluo de glicina 0,1 M. 14) Preparar uma soluo de cido asprtico 0,1 M. 15) Preparar uma soluo de soro glicosado a 10% e 7,5%, 5%. Utilizar soluo de glicose hipertnica de 25% e 50%. 16) Qual o volume de H2SO4 18 mol/L necessrio para preparar 500 mL de uma soluo a 0,15 mol/L? 17) Dissolve-se 81 g de glicose (C6H12O6) em volume suficiente de gua para se obter 500 mL de soluo. Qual a molaridade da soluo assim obtida? (C-12 H-1 O-16) 18) Qual a massa de HNO3 que devemos dissolver na gua para preparar 250 mL de soluo 5 mol/L desse cido? (H-1 N-14 O-16) 19) Determinar a molaridade de uma soluo de NaOH que foi obtida dissolvendo-se 60 g dessa base em volume suficiente de gua para se obter 350 mL de soluo. (O-16 H-1 Na-23) 20) Qual a massa de H2SO4 necessria para preparar 600 mL de soluo 1,4 mol/L?(H-1 S-32 O-16) 21) Um laboratorista tem a sua disposio uma soluo estoque de NaOH 2 mol/L e deseja preparar 500 mL de soluo 1,5 mol/L. Qual o volume de soluo estoque que dever tomar? 22) Em um recipiente h uma soluo de NaCl de concentrao 300 g/L. Desse recipiente retirado 125 mL dessa soluo. Qual a massa de sal contida nessa poro retirada? 23) Em uma proveta colocado 350 mL de uma soluo de AgNO3 de concentrao 200 g/L. A seguir adicionado 150 mL de gua destilada. Qual a nova concentrao da soluo assim obtida? 24) Num recipiente encontra-se 5 L de H2SO4de concentrao 3,5 mol/L. Ao adicionarmos 2000 mL de H2O, qual ser sua nova molaridade? 25) Adicionou-se 100 mL de H2O a 400 mL de uma soluo de salmoura 80 g/L. Qual ser a concentrao da soluo resultante? 26) Determinar a concentrao em porcentagem de uma soluo onde se dissolvem 5 g de soluto por 200 mL de soluo. 27) Qual o volume de gua que devemos adicionar 600 mL de soluo 2 mol/L de HCl para se obter uma soluo 1,5 mol/L desse cido? 28) Numa soluo de volume 400 mL de concentrao 3 mol/L, foi adicionado 100 mL de H2O. Qual a sua nova molaridade? 29) Uma substncia apresenta massa molecular = 500 g. Se 50 g dessa substncia foi dissolvida para 200 mL de H2O, qual a molaridade da soluo assim preparada? 30) Como voc expressaria em porcentagem uma soluo de concentrao 40 mg/2 L?

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I - PREPARO DE SOLUES A PARTIR DE SUBSTNCIAS SLIDAS Para preparo de solues proceda conforme esquema mostrado na figura abaixo. Prepare a soluo indicada pela professora em balo volumtrico de 50 mL.

1 - Dissolver o slido (usar cerca de 10 mL de gua destilada). 2 - Transferir para o balo volumtrico. 3 - Lavar o bquer (executar trs lavagens com aproximadamente 10 mL de gua destilada cada uma) 4 - Lavar o funil e retir-lo. 5 - Completar o volume do com gua destilada at prximo o trao de referncia do balo (utilize uma pipeta Pasteur para acertar o menisco). 6 - Homogeneizar a soluo.

4a AULA: pH e Soluo Tampo (RELATRIO) 1 Prtica: Determinao colorimtrica de pH

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Fundamentao: O mtodo colorimtrico baseia-se no conhecimento dos pKs dos indicadores, os quais podem ser considerados como cidos ou bases fracas. A dissociao de um indicador cido em forma simplificada a seguinte: HIn
cido (cor A)

In-

H+

base (cor B)

A adio de cido soluo de indicador aumenta a concentrao de H+, reprime a dissociao do indicador e h predominncia da cor cida (cor A). A adio da base diminui a concentrao de H+, a equao se desloca para a direita, produzindo mais indicador In- e predominncia da cor bsica (cor B). A cor do indicador , portanto, uma funo do pH da soluo. Matematicamente, o pH definido como o valor negativo do logaritmo (log) da concentrao do on hidrognio: pH = pKIn + log. In-/HIn sendo o intervalo mais eficiente de ao de um indicador, em torno de seu pK. Para determinar o pH de uma soluo, adiciona-se algumas gotas de soluo de um dos indicadores mencionados e compara-se a cor desenvolvida com a cor de uma srie de tampes de pH conhecidos e contendo a mesma quantidade de indicador. Objetivo: -Conhecer a utilidade dos indicadores de pH; -Observar o efeito tampo de uma soluo; -Determinar o pH. Procedimento: a) Colocar em tubos de ensaio identificados, 2 mL de substncia a ser analisada (gua de torneira, gua de sabo, vinagre, suco de limo e outras) b) Adicionar 2 gotas de cada indicador. Anotar a cor e verificar o pH c) Repetir as operaes tantas vezes, quantas forem os indicadores a serem utilizados. Tabela: Indicadores com cor e zona de pH 1) Fenolftalena 2) Metil orange 3) Vermelho de metila 4) Azul de bromofenol 5) Azul de bromotimol 6) Prpura de bromocresol 7) Verde de bromocresol 8) Vermelho de clorofenol 2a Prtica: Uso de indicador universal Fundamentao: Indicadores universais so misturas de vrios indicadores, a fim de abranger um intervalo mais amplo de pH. Este indicador abrange a faixa de pH 3,0 at 11,0 que so os seguintes: pH 3,0 ou < 3,0 = vermelho; pH 4,0 = alaranjado forte; pH 5,0 = laranja; pH 6,0 = amarelo; pH 7,0 = verde amarelado; pH 8,0 = verde azulado, pH 9,0 = azul; pH 10,0 = violeta; pH 11 ou > 11,0 = prpura.

8,0 incolor- 10,0 vermelho 3,1 vermelho- 4,4 amarelo 4,2 vermelho- 6,3 amarelo 3,1 amarelo- 4,7 azul 6,1 amarelo- 7,7 azul 5,4 amarelo- 7,0 prpura 3,8 amarelo- 5,4 azul 5,1 amarelo- 6,7 vermelho

17

Preparo do indicador universal: metil orange 0,05 g, vermelho de metila 0,15 g, azul de bromotimol 0,30 g fenolftalena 0,35 g e lcool etlico a 65% 1 litro. Bateria de escala padro de pH com uso do indicador universal Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 tampo pH 3 (mL) 0,5 tampo pH 4 (mL) 0,5 tampo pH 5 (mL) 0,5 tampo pH 6 (mL) 0,5 tampo pH 7 (mL) 0,5 tampo pH 8 (mL) 0,5 tampo pH 9 (mL) 0,5 tampo pH 10 (mL) 0,5 gua destilada (mL) 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 indicador universal (gotas) 3 3 3 3 3 3 3 3 Agitar bem os tubos e anotar as cores desenvolvidas. Esta bateria ir constituir a escala padro de pH, para comparao. Prtica: a) Adicionar cerca de 2 mL de cada substncia a ser analisada (gua de torneira, suco de limo, refrigerante, vinagre, etc.) em tubos diferentes e identificados. b) Adicionar 5 gotas de indicador universal e agitar. c) Anotar a cor e verificar o pH com a bateria de escala padro de pH. 3a Prtica: Determinao potenciomtrica do pH Fundamentao: Este o mtodo mais preciso para a determinao do pH. Usa-se, geralmente, o aparelho chamado potencimetro que consiste de um eletrodo de vidro, um eletrodo de calomelano e um sistema para medida de voltagem. O potencial dado pelo eletrodo de calomelano mercuroso em contato com soluo saturada de KCl. O eletrodo de vidro compe-se de um bulbo de vidro especial contendo HCl 0,1 N mais um fio de platina revestido de AgCl. Quando o eletrodo de vidro imerso em uma soluo de concentrao hidrogeninica desconhecida, cria-se um potencial entre as solues interna e externa. Como a voltagem do eletrodo de calomelano constante, a diferena de potencial entre os dois eletrodos diretamente relacionada com a concentrao de ons hidrognio da soluo desconhecida. a) Determinem no potencimetro os pHs do leite, suco de limo, suco de laranja, refrigerante, vinho, cerveja, gua de torneira, gua destilada, etc.

Abertura lateral para enchimento c/ tampa Haste de prata recoberta com cloreto de prata (Ag/AgCl) Eletrlito: HCl 0,1 M Eletrodo de referncia: calomelano mercuroso em soluo saturada de KCl Juno Elemento sensor de pH

5a AULA: Verificao do Efeito da Soluo-Tampo (RELATRIO) Procedimento: a) Utilizar mesma bateria de escala padro de pH. b) Preparar outra bateria de 4 tubos de ensaio e numer-los de 1 a 4. Tubos 1 2 Indicador universal (gotas) 3 3 gua destilada (mL) 5 4,5 Soluo tampo pH 7,0 (mL) - 0,5 Anotar pH NaOH 0,1M (gotas) 1 1 Anotar pH Soprar o ar expirado com uma pipeta dentro da soluo (segundos) 15 60 Anotar pH HCl 0,1 M (gotas) Anotar pH c) Continuar a adio de HCl ao tubo 4, gota a gota. Determinar quantas gotas de adicionadas at que se obtenha a mesma colorao do tubo 3. 1. 2. 3. 4. 3 4 3 3 5 4,5 - 0,5 2 2

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HCl devem ser

Analise os resultados de cada etapa do trabalho, faa um breve comentrio e concluso. Discuta o possvel efeito da soluo tampo depois da adio de cada substncia, com base nos resultados obtidos. Qual a funo das solues-tampo na prtica? Ao consideramos a necessidade de manuteno do pH sanguneo pelo organismo, qual a importncia dos conhecimentos adquiridos nesta atividade prtica?

6a AULA: Titulao Potenciomtrica de Aminocidos (RELATRIO) Objetivo: Estudar o fenmeno de dissociao por tcnica potenciomtrica Fundamentao terica: Um aminocido neutro apresenta dois grupos ionizveis, o NH2 e o COOH. Em soluo eles se apresentam dissociados, formando o on dipolar.
H R C COO NH3
-

19

A sua titulao cido-base pode ser compreendida nos seguintes termos:

H R C COOH +H+ pK 1 H R C COO
-

NH3 (+1)

NH3 (0)

+OHpK 2

H R C COO -

NH2 (-1)

A forma dipolar de um aminocido neutro tem carga total nula. O pH no qual existe esta forma conhecido como pH isoeltrico (pHi) ou ponto isoeltrico (pI). O pI a mdia aritmtica dos 2 pKs, um anterior e outra posterior a forma isoeltrica. A forma dissociada de um aminocido cido, por exemplo, o cido asprtico a seguinte:
COO H3N C CH2 COO
-

Pela adio de cido ou base ele vai adquirir as seguintes formas inicas:
COOH H3N C H CH2 COOH (+1) OH H
-

COO CH2

H3N C H COOH (0)

OH H

COO CH2

H3N C H COO (-1)

-

OH H

COO CH2

H2N C H COO(-2)

Portanto levarmos um mol de cido asprtico do meio cido para o alcalino necessitamos de 3 equivalentes qumicos de base. A forma dissociada de um aminocido bsico, por exemplo, a lisina a seguinte:
COO H3N C
-

(CH2)4 NH3

Pela adio de cido ou base ele vai adquirir as seguintes formas inicas:
COOH H3N C H OHH+ COOH3N C H OHH+ COO H2N C H OHH+ COOH2N C H (CH2)4 NH2 (-1)

(CH2)4 NH3 (+2)

(CH2)4 NH3 (+1)

(CH2)4 NH3 (0)

Para levarmos um mol de lisina do meio cido para o alcalino necessitamos de 3 equivalentes qumicos de base.

20

1. Titulao potenciomtrica de um aminocido neutro (Glicina 0,1 M) Procedimento: a) Pipetar 10 mL da soluo de glicina 0,1 M (c/ HCl 0,1 M) em um copo de Becker. b) Retirar o eletrodo da soluo e lav-lo com gua destilada, secar suavemente com papel absorvente. c) Mergulhar o eletrodo num bquer c/ soluo tampo de pH conhecido (pH 7,0) e em seguida com (pH 4,0) e ajustar o aparelho ao pH dos tampes. d) Retirar o tampo, lavar o eletrodo com gua destilada, secar com papel absorvente. e) Mergulhar o eletrodo de vidro na soluo de glicina com cuidado, adicionar gua destilada at cobrir totalmente o bulbo do eletrodo (em torno de 10 mL). f) Misturar e proceder primeira leitura do pH e anotar. g) Titular com NaOH 0,1 M, anotando os valores de pH para cada mL de soda adicionados. 2. Titulao potenciomtrica de um aminocido cido (cido asprtico ou cido glutmico 0,1 M em HCl 0,1 M) a) Pipetar 10 mL de cido asprtico ou glutmico 0,1 M em um bquer. b) Repetir os itens de b e f da experincia anterior (01). c) E titular com NaOH 1 M anotar cada do os valores de pH para mL de soda adicionados. 3. Titulao potenciomtrica de um aminocido bsico (lisina ou arginina 0,1 M em HCl 0,1 M) a) Pipetar 10 mL de cido asprtico ou glutmico 0,1 M em um bquer. b) Repetir os itens de b e c da experincia anterior (02). Resultados: 1) Construir o grfico da curva de titulao de cada aminocido, tendo nas ordenadas (Y) pH e nas abscissas (X) mL de NaOH adicionados. 2) Determinar os valores de pKs e ponto isoeltrico (pI), graficamente e comparar com os valores encontrados nas bibliografias. 3) Apresentar as formas inicas predominantes nestes pontos. Tabela das propriedades e convenes associadas com os aminocidos encontrados nas protenas
Aminocido Abreviao/ smbolo Mr Valores de pKa pK1 (CO2H) pK2 (NH3+) pKr (grupo R) pI ndice de Hidropatica1 -0,4 1,8 1,6 4,2 3,8 4,5 1,9 2,8 -1,3 -0,9 -0,8 -0,7 2,5 -3,5 -3,5 -3,9 -3,2 -4,5 Ocorrncia nas protenas (%)2 7,2 7,8 5,2 6,6 9,1 5,3 2,3 3,9 3,2 1,4 6,8 5,9 1,9 4,3 4,2 5,9 2,3 5,1

Grupos R alifticos, no polares Glicina Gly G 75 2,34 9,60 5,97 Alanina Ala A 89 2,34 9,69 6,01 Prolina Pro P 115 1,99 10,96 6,48 Valina Val V 117 2,32 9,62 5,97 Leucina Leu L 131 2,36 9,60 5,98 Isoleucina Ile I 131 2,36 9,68 6,02 Metionina Met M 149 2,28 9,21 5,74 Grupos R aromticos Fenilalanina Phe F 165 1,83 9,13 5,48 Tirosina Tyr Y 181 2,20 9,11 10,07 5,66 Triptofano Trp W 204 2,38 9,39 5,89 Grupos R no carregados polares Serina Ser S 105 2,21 9,15 5,68 Treonina Thr T 119 2,11 9,62 5,87 Cistena Cys C 121 1,96 10,28 8,18 5,07 Asparagina Asn N 132 2,02 8,80 5,41 Glutamina Gln Q 146 2,17 9,13 5,65 Grupos R carregados positivamente Lisina Lys K 146 2,18 8,95 10,53 9,74 Histidina His H 155 1,82 9,17 6,00 7,59 Arginina Arg R 174 2,17 9,04 12,48 10,76 Grupos R carregados negativamente Aspartato Asp D 133 1,88 9,60 3,65 2,77 Glutamato Glu E 147 2,19 9,67 4,25 3,22 1 Umas escala combinada hidrofobicidade e hidrofilia grupos R; ela pode ser usada para medir procurar um ambiente aquoso (valores -) ou uma ambiente hidrofbico (valores +). 2 Ocorrncia mdia em mais de 1.150 protenas.

-3,5 5,3 -3,5 6,3 a tendncia de um aminocido para

7a AULA: Determinao do Ponto Isoeltrico da Casena

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Fundamento: Adiciona-se soluo de casena em um tubo contendo meios de pH decrescentes (de 5,9 a 3,5) e observa-se a turvao. O pH do meio em que ocorre mxima turvao representa o pI da protena. Solues: 1. Soluo de casena em soluo 0,1 M de acetato de sdio: colocar em um frasco volumtrico de 50 mL 0,25 g de casena pura, 20 mL de gua destilada e exatamente 5 mL de soluo de NaOH 1 M. Agitar at a dissoluo completa da casena, e, ento adicionar exatamente 5 mL de cido actico 1M. Completar o volume com gua destilada. 2. Soluo de cido actico 1M. 3. Soluo de cido actico 0,1M. 4. Soluo de cido actico 0,01M. Tcnica: Numerar nove tubos de ensaio e transferir para os mesmos os volumes das solues indicadas na tabela. Misturar a cada um dos tubos 1 mL da soluo de casena e agitar imediatamente. Tubos H2O destilada (mL) cido Actico 0,01 M (mL) cido Actico 0,1 M (mL) cido Actico 1 M (mL) pH Turvao imediata Turvao aps 30 min. 1 8,38 0,62 5,9 2 7,75 1,25 5,6 3 8,75 0,25 5,3 4 8,50 0,50 5,0 5 8,00 1,00 4,7 6 7,00 2,00 4,4 7 5,00 4,00 4,1 8 1,00 8,00 3,8 9 7,4 1,6 3,5

Verificar o grau de turvao eventualmente presente, logo aps a mistura e 30 min. Depois. Inscrever os resultados na tabela por meio de sinais (+; ; -). Observar em qual tubo ocorre precipitao mxima que corresponder ao ponto isoeltrico da casena.

8a AULA: Reaes Qualitativas para Identificao de Aminocidos (RELATRIO) Objetivo: Identificar e caracterizar diferentes aminocidos atravs de reaes especficas. 1. Reao de Ninidrina

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Fundamento terico: A ninidrina um agente oxidante que reage com grupos amino livres de aminocidos, peptdeos e protenas desde que o pH da soluo esteja entre 4 e 8, dando origem a prpura de Ruhemann, de cor arroxeada (a intensidade da cor proporcional a concentrao de aa livres). A reao tambm ocorre com aminas primrias e amnia, porm sem liberao de CO2.
O OH OH O
H2 O NH2

R N C CO2H H

O O

RCHCO2H

O ninidrina

O O

O - CO2 O O

H N=CHR

H2 O

H NH2 + R C

O H

O O

O O
H2O

O N=

H + NH2 O

O azul prpura de Ruhermann

Os aminocidos (prolina e hidroxiprolina) tambm reagem com a ninidrina, porm neste caso, por possurem o grupo -amino substitudo obtm-se um produto de cor amarela. Reativos: ninidrina 1% ( txica) ou ninidrina a 0,2% em tampo fosfato 7,0, soluo de protena (albumina, leite, clara de ovo), soluo de aminocidos 0,05 M (glicina, prolina, hidroxiprolina, etc.). Tcnica. Tubos Amostra/Concentrao Volume (mL) Soluo de ninidrina (0,2%) 1 gua destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Prolina 0,05 M 1,0 1,0 mL 4 Hidroxiprolina 0,05 M 1,0 1,0 mL 5 Soluo de protena 1,0 1,0 mL Aquec-los em banho-maria 100 C por 3 minutos. Compare os resultados com o tubo 1. Anote os resultados e explique-os. Questes: 1) Em que se fundamenta a reao da ninidrina e que classes de substncias reagem positivamente? 2. Reao Xantoprotica Fundamento terico: As protenas que possuem grupamentos fenil reagem com HNO3, formando nitro-derivado fortemente coloridos em meio alcalino. Os aminocidos como a tirosina e triptofano do teste positivo com o aparecimento de cor amarelo-alaranjado, o anel simples de benzeno da no tem capacidade de positivar a reao.

23

Reativos: HNO3 concentrado, NaOH 20%, soluo de protena (albumina, leite, clara de ovo), soluo de aminocidos 0,05 M (tirosina, triptofano, fenilalanina e glicina). Tcnica. Tubos Amostra/Concentrao Volume (mL) HNO3 concentrado 1 gua destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Tirosina 0,05 M 1,0 1,0 mL 4 Triptofano 0,05 M 1,0 1,0 mL 5 Fenilalanina 0,05 M 1,0 1,0 mL 6 Soluo de protena 1,0 1,0 mL Ferver todos os tubos e acrescentar 3 mL de NaOH 20%. Anote os resultados e explique-os.
COOH3N C H CH2 COO H3N C H CH2 COOH3N C H C CH NH

fenilalanina

OH tirosina triptofano

3. Reao de Millon Fundamento terico: Reao devido a presena do grupamento hidroxifenil (C6H5-OH) nas molculas de protenas e peptdeos. Reao positiva para tirosina com o aparecimento de cor avermelhada com ou sem precipitado. As protenas so precipitadas pelos cidos minerais fortes (HNO3) e pelo mercrio, os quais com aquecimento apresentam uma colorao avermelhada. Com soluo de aminocidos, sob as mesmas condies produz somente uma colorao avermelhada. Reativo: Reativo de Millon (Hg + HNO3), soluo de protena (albumina, leite, clara de ovo), soluo de aminocidos 0,05 M (glicina tirosina e triptofano). Tcnica. Tubos Amostra/Concentrao Volume (mL) Reativo de Millon 1 gua destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Tirosina 0,05 M 1,0 1,0 mL 4 Triptofano 0,05 M 1,0 1,0 mL 5 Soluo de protena 1,0 1,0 mL Aquec-los em banho-maria 100C por 3 minutos. Compare os resultados com o tubo 1. Anote os resultados e explique-os.

24

4. Reao para Aminocidos Sulfurados Fundamento terico: O enxofre que nas protenas se apresenta na forma de grupos sulfidrilas ou dissulfetos (cistena e cistina), em meio alcalino e a quente liberam o enxofre que aparece na forma de sulfeto de sdio (Na2S). Este reage com acetato de chumbo (CH3COO)2Pb, formando o sulfeto de chumbo (PbS).
COO cistena H3N C SH SH CH2 cistena H C NH3 COO
-

COO 2H + 2e
+ -

H3N C H CH2 S S

COO H3N C S CH2

CH2

2H + 2e

CH2 H C NH3 COO cistina

-

CH3 metionina

O enxofre da metionina no lbil em meio alcalino. Um precipitado fino castanho ou preto, de sulfeto de chumbo, indicar a presena de cistena ou cistina. Reativos: NaOH 2,0 M, acetato de chumbo, soluo de protena (clara de ovo, leite, albumina), soluo de aminocidos 0,05 M (cistina, cistena, 5 fios de cabelo, glicina e metionina). Tcnica: Tubos Amostra/Concentrao Volume 1 gua destilada 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 mL 3 Cistena 0,05 M 1,0 mL 4 Cistina 0,05 M 1,0 mL 5 Metionina 0,05 M 1,0 mL 6 Fios de cabelo 5 fios 7 Soluo de protena 1,0 mL Anote os resultados obtidos e explique-os.
COOH H2N C R S R Aminocido com enxofre Hidrxido de sdio Sulfeto de sdio Aminocido sem enxofre H NaOH Na2S

Reativo de NaOH 2,0 M 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Aquecer em banhomaria 100C 1 minuto 1 minuto 1 minuto 1 minuto 1 minuto 1 minuto 1 minuto

Acetato de chumbo (CH3COO)2Pb 5 gotas ou 0,5 mL 5 gotas ou 0,5 mL 5 gotas ou 0,5 mL 5 gotas ou 0,5 mL 5 gotas ou 0,5 mL 5 gotas ou 0,5 mL 5 gotas ou 0,5 mL

COOH H2N C H R (1)

Na2S Sulfeto de sdio

(CH3COO)2Pb Acetato de chumbo

PbS Sulfeto de chumbo

2CH3COONa Acetato de sdio

(2)

Cite os aminocidos que contm enxofre, com suas respectivas frmulas estruturais.

9a AULA: Reaes de Caracterizao e Precipitao de Protenas (RELATRIO)

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Objetivo: No final desta aula o aluno(a) estar familiarizado com as propriedades fsico-qumicas das protenas, bem como com as tcnicas de reaes de identificao das mesmas. 1. Reao de Biureto: Fundamento terico: O sulfato de cobre em meio alcalino reage com as substncias que contm duas ou mais ligaes peptdicas dando um complexo de colorao caracterstica (prpura). O on fornecido por uma soluo diluda e alcalina de CuSO4 se complexa com os grupos (-NH) das ligaes peptdicas. A intensidade da cor obtida proporcional ao nmero de ligaes peptdicas.
R O C HN R CH O=C NH R CH R
_ _

R H2O C O NH Cu
++

HC R C=O NH

H2O

HC_R R

Tcnica: Tubos Amostra/Concentrao Volume (mL) Reativo de Biureto 1 gua destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Soluo de protena (clara de ovo diluda) 1,0 1,0 mL Agitar bem os tubos e observe os resultados obtidos e explique-os. 2. Reaes de precipitao de protenas Objetivo: Verificar a influncia dos sais, cidos e solventes orgnicos sobre solues de protenas. 2.1 Reaes de precipitao com desnaturao: Fundamento terico: A exposio das molculas proteicas a agentes como calor, extremos de pH, metais pesados, cidos, detergentes, solues concentradas de ureia, solventes orgnicos, radiaes ultravioleta, etc., faz com que a maioria delas apresente modificaes fsicas conhecidas como desnaturao. O calor pode desnaturar a maioria das protenas. Os cidos como cido pcrico, cido tnico, cido fosfotngstico, cido sulfossaliclico, podem precipitar as protenas que possuem cargas positivas formando complexos insolveis. Solventes orgnicos como o etanol, ter etlico e acetona abaixam a constante dieltrica das solues aquosas de protenas, diminuem tambm sua capacidade de solvatao, causando perda de solubilidade, as protenas sofrem um ao desidratante. Em pH situado no lado alcalino do seu ponto isoeltrico, algumas protenas combinam-se com ctions de metais pesados, como acetato de chumbo e nitrato de prata formando derivados proteicos insolveis. Material e Reagentes: Soluo de protena (clara de ovo) sem diluir para item 1 e diluda 10x com salina (NaCl 0,9%) para itens 2, 3, 4 e 5 cido tricloroactico a 10% Acetato de chumbo a 5% ou nitrato de prata 0,1 M lcool etlico absoluto cido pcrico

26

Tcnica: Tubo s 1 2 3 4 5 2.2

Amostra/Volume Protena (clara de ovo in natura) 2 mL Soluo de protena diluda 1 mL Soluo de protena diluda 1 mL Soluo de protena diluda 1 mL Soluo de protena diluda 1 mL

Procedimento/reagente Aquecer em banho-maria100 C. 1 mL de cido tricloroactico 1 mL de acetato de chumbo 3 mL ou mais de lcool etlico (etanol) 1 mL de cido pcrico

Resultado Observar e concluir. Observar e concluir. Observar e concluir. Observar e concluir. Observar e concluir.

Reaes de precipitao sem desnaturao: Fundamento terico: as protenas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturao em funo do pH, fora inica, temperatura e propriedades dieltricas. Estas variveis podem ento ser usadas para separar protenas em mistura, uma vez que cada protena tem uma composio caracterstica (quali e quantitativa) de aminocidos que determina seu comportamento como um poli-eletrlito. A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas uma funo de sua fora inica (precipitao por alterao de fora inica), depende tanto da sua concentrao como da valncia de ctions e nions que formam o sal (nmeros de cargas eltricas do sal). Salting in ou solubilizao por salificao: a solubilizao das protenas pela adio de um sal neutro de fora inica baixa. Em concentraes reduzidas, os sais aumentam a solubilidade de muitas protenas. Os sais de ons divalentes, tais como MgCl2 e o (NH4)2SO4, so mais eficientes na solubilizao por salificao do que os sais de ons monovalentes como NaCl e KCl. Os efeitos da salificao na solubilidade so ocasionados por alteraes na tendncia ionizao dos grupos R (cadeias laterais dos aminocidos) dissociveis da protena. Salting out ou precipitao por salificao: a precipitao reversvel das protenas pela adio de sal de fora inica elevada [MgCl2 e (NH4)2SO4]. Um dos fatores que promovem esse efeito que a concentrao elevada de sais pode remover a gua de hidratao das molculas proteicas, reduzindo, dessa maneira sua solubilidade, porm outros fatores podem estar envolvidos. Os precipitados proteicos resultantes da precipitao por salificao mantm sua conformao nativa e podem ser dissolvidos novamente, em geral sem haver desnaturao. Consequentemente, a funo da protena pode ser recuperada aps o trmino do processo e remoo do sal. O sal mais utilizado nessa tcnica o sulfato de amnio que, devido sua alta solubilidade, permite a precipitao em solues de elevada fora inica. Qualquer que seja sua base fsica salting in e salting out so processos para a separao de misturas proteicas, uma vez que as diferentes concentraes de sais neutros. Material e Reativos: clara de ovo in natura. cloreto de sdio 1 M soluo saturada de sulfato de amnio pipetas tubos de ensaio, suporte para tubos, bquer, etc.

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Tcnica: a) Pipetar 3 mL de clara de ovo in natura em um pequeno bquer. Diluir com gua destilada, mexendo com um basto de vidro, at notar o aparecimento do precipitado de globulinas. Juntar em seguida, uma soluo de cloreto de sdio 1 M, gota a gota, at a redissoluo do precipitado anterior de protena no desnaturada. Esta redissoluo se deve restaurao da fora inica original e corresponde ao fenmeno da salting in. b) Da soluo da clara de ovo na experincia anterior de salting in, pipetar 2 mL em um tubo de ensaio. Juntar a seguir 2 mL de soluo saturada de sulfato de amnio e observar a formao de precipitado protico, o que corresponde ao fenmeno de salting out. Pipetar a seguir 4 a 6 mL de gua destilada a fim de recompor a fora inica anterior e como consequncia, redissolver o precipitado. Questes: 1) Em que se fundamenta a reao de biureto e que grupos nas protenas so responsveis por esta reao? 2) Qual a importncia do biureto? 3) Fale sobre a solubilidade das protenas. 4) O que determina a estrutura terciria das protenas e de que forma os agentes desnaturantes interferem com as mesmas? 5) Quais as formas inicas que os aminocidos podem assumir em soluo (baseando-se no pH das mesmas)? 6) Qual a importncia das reaes de precipitao de protenas por sais de metais pesados? Explique o mecanismo da precipitao. 7) Explique os mecanismos que levam uma protena a dissolver-se em um pequeno aumento da fora inica da soluo e os mecanismos que levam uma protena a precipitar por um grande aumento da fora inica da soluo.

10a AULA: Caracterizao da Enzima Urease de Soja (RELATRIO) Fundamento terico: A urease uma enzima que catalisa a hidrlise da ureia em amnia e dixido de carbono. Reaes:

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H2N C O H2N Uria Ureia

Em meio aquoso: 2NH3 + 2H2O CO2 + H2O 2NH4OH hidrxido de amnio H2CO3 cido carbnico (NH4) 2CO3 carbonato de amnio + 2H2O

H2O

Urase Urease

CO2 Dixido de carbono

2NH3 Amnia

H2CO3 + 2NH4OH

A atividade da enzima pode ser verificada pela formao de carbonato de amnio, que um sal de reao bsica e cuja presena pode ser revelada por meio de um indicador cido bsico como o vermelho de fenol (VF), por exemplo (VF em meio bsico = rosa; VF em meio cido ou neutro = amarelo). A urease existe em algumas bactrias e plantas e pode ser extrada com facilidade de soja. Objetivo: observar a atividade da enzima urease e a ao dos agentes desnaturantes sobre a enzima. Extrao: pesar cerca de 15 g de farinha de soja e dissolver em 100 mL de gua destilada. Deixar agitando durante 30 minutos. Filtrar com algodo. Desprezar o resduo. O filtrado contm a urease. Conservar em baixa temperatura. Reativos: Soluo de urease, reativo de biureto; soluo de ureia 1% em tampo fosfato 0,01 M; soluo de tioureia em tampo fosfato 0,01 M; soluo vermelho de fenol; soluo de cloreto de mercrio 5%; cido ntrico concentrada. Procedimento: 1) Reao do Biureto: Substncias que contm duas ou mais ligaes peptdicas do reao de Biureto positiva. O on cprico fornecido pela soluo de CuSO4 se complexa com os grupos (NH) das ligaes peptdicas desenvolvendo colorao violeta. Teste: Tubo 1: 2 mL de gua dest. + 10 gotas da soluo de urease + 2 mL do reativo biureto. Tubo 2: 2 mL de gua destilada + 2 mL do reativo biureto. Agitar os tubos e comparar a cor nos dois tubos e concluir o resultado. 2) Reao de Heller: Esta reao baseia-se na precipitao de protenas por cido forte. Teste: Tubo 3: Colocar 5 gotas de soluo de urease e 2 mL de gua destilada. Agitar. Manter o tubo inclinado e juntar pela parede 1 mL de cido ntrico concentrado, sem agitar e de modo que se formem duas fases. Observar se houve formao de anel branco na interfase e concluir o resultado.

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3) Teste de atividade da enzima: Neste teste utiliza-se o indicador vermelho de fenol que, passa de cor amarela em meio cido ou neutro, para cor vermelha em meio bsico. Teste: Tubo 4: Colocar 3 mL de soluo de ureia + 5 gotas de soluo de urease. Tubo 5: Colocar 3 mL de gua destilada + 5 gotas de soluo de urease. A ambos os tubos adicionar uma gota de soluo vermelho de fenol. Agitar e colocar em banho-maria a 37 C. Observar se h mudana de cor nos prximos 5 minutos. Concluir o resultado. 4) Desnaturao da enzima pelo calor: Teste: Tubo 6: Colocar 2 mL de gua destilada + 5 gotas de soluo de urease. Agitar e colocar em banho-maria a 100 C por 2 minutos. Em seguida adicionar 3 mL de soluo de ureia e 1 gota da soluo de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 minutos em banho-maria a 37 C. Observar se houve modificao de cor em relao aos tubos do Teste 3. 5) Inibio de enzima por meio de mercrio: Teste: Tubo7: Colocar 2 mL de gua destilada + 5 gotas da soluo de urease. Agitar e juntar 5 gotas de cloreto de mercrio 5%. Agitar e adicionar 3 mL de soluo de ureia + 2 gotas da soluo de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 minutos em banho-maria a 37 C. Observar se houve mudana de cor em relao aos tubos do Teste 3. 6) Especificidade da enzima: Teste: Tubo 8: Colocar 3 mL de sol. de ureia + 5 gotas de soluo de urease. Tubo 9: Colocar 3 mL de tioureia + 5 gotas de soluo de urease. A ambos os tubos adicionar 1 gota de soluo vermelho de fenol. Agitar e manter em banho-maria a 37 C. Observar se h mudana de cor nos prximos 5 minutos. Concluir o resultado. A tioureia um composto com a seguinte estrutura.

H2N C O H2N
Ureia Uria

H2N C H2N
Tiureia Tiouria

Questes: 1) Qual a reao catalisada pela urease? 2) Qual a fonte de urease utilizada nos experimentos? 3) Como pode ser evidenciada a natureza proteica da enzima? 4) Explique o uso do indicador cido-base vermelho de fenol no teste de atividade da enzima. 5) Explique o resultado obtido quando a enzima foi previamente fervida. 6) Explique os resultados obtidos no teste de sais de mercrio e especificidade da enzima.

11a AULA: Cintica Enzimtica da Invertase I

30

Invertase uma enzima que catalisa a hidrlise da molcula da sacarose. A sacarose um dissacardeo formado por -D-glicose e -D-frutose, ligados por ligao glicosdica do tipo 12. Como ambas unidades de hexoses esto unidas pelo grupo redutor respectivo, a sacarose um dissacardeo no redutor. A ao da invertase sobre a sacarose ocasiona a hidrlise do substrato, liberando como produtos da reao a D-glicose e a D-frutose que so redutoras. Os acares redutores reduzem o reagente 3,5-dinitrosalicilato (DNS), produzindo uma colorao alaranjada que ser tanto mais intensa, quanto maior for concentrao do acar redutor presente no meio de reao. A cor lida em espectrofotmetro em 540 nm.
CH2OH O H OH H H OH H H
5

H
1

OH

O HOH2C

OH H

pH 4,7 25 C Invertase

CH2OH OH

OH

CH2OH O H OH H H OH

H
1

OH
2

OH

OH H

H H
5

HOH2C

CH2OH OH D-frutose

Sacarose

D-glicose

Isolamento da enzima invertase de levedura: Pesar 50 g de levedura seca e suspender em 250 mL de bicarbonato de sdio 0,15 M e deixar em banho-maria a 37 C durante 24 horas com agitao ocasional. Centrifugar por 20 minutos a 3500 rpm. Desprezar o sedimento, coletando-se o sobrenadante que se apresenta de cor amareloavermelhada, o qual contm a enzima invertase na forma ativa, alm das enzimas da via fermentativa. Conservando em geladeira a 4 C apresenta atividade enzimtica por alguns meses. Para realizar os ensaios de cintica enzimtica diluir o sobrenadante (1:100).

1) INFLUNCIA DO TEMPO NA AO DA INVERTASE Reativos: Invertase (0,1 mg/mL) Tampo acetato 0,05 M; pH 4,7 Sacarose 0,02 M Reativo 3,5 dinitrosalicilato
Ateno: A enzima sempre a ltima a ser adicionada. Fazer um grfico em papel milimetrado: Tempo em minuto (abscissa X) X Absorbncia (ordenada Y) e Interpretar os resultados. Reativos/Tubos Tampo acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) Sacarose 0,02 M (mL) Invertase (mL) Tempo (min.) 3,5 dinitrosalicilato (mL) Branco 1 2 3 4 5

0,25

0,2 0,125 0,05 0 0,25

0,2 0,125 0,05 5,0 0,25

0,2 0,125 0,05 10 0,25

0,2 0,125 0,05 20 0,25

0,2 0,125 0,05 30 0,25

Incubao: 100 C durante 5 minutos

gua destilada (mL) Leitura a 540 nm (Absorbncia)

2,5 -

2,1

2,1

2,1

2,1

2,1

31

4) INFLUNCIA DE CONCENTRAO DA ENZIMA

Ateno: A enzima sempre a ltima a ser adicionada. Reativos/Tubos Tampo acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) Sacarose 0,02 M (mL) Branco 1 2 3 4 5 6

0,62 0,25

0,25 0,12 0,25 0,25

0,25 0,12 0,20 0,05 0,25

0,25 0,12 0,15 0,10 0,25

0,25 0,12 0,10 0,15 0,25 1,6

0,25 0,12 0,05 0,20 0,25 1,6

0,25 0,12 0,25 0,25 1,6

gua destilada (mL) Invertase (mL) 3,5 dinitrosalicilato (mL) gua destilada (mL) Leitura a 540 nm

Incubao: 25 C durante 5 minutos Incubao: 25 C durante 5 minutos 1,6 1,6 1,6 1,6 -

Fazer um grfico em papel milimetrado: Concentrao da enzima em g/mL (abscissa) X Absorbncia (ordenada) e interpretar os resultados.

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12a AULA: Cintica Enzimtica da Invertase II (RELATRIO JUNTO COM CINTICA DA INVERTASE I)

3) EFEITO DO pH Ateno: A enzima sempre a ltima a ser adicionada. Reativos/Tubos 1 2 3 4 5 6 Tampo acetato pH 2 (mL) 1,0 1,0 Tampo acetato pH 4 (mL) 1,0 Tampo acetato pH 5 (mL) 1,0 Tampo fosfato pH 6 (mL) 1,0 Tampo fosfato pH 7 (mL) 1,0 Tampo fosfato pH 8 (mL) Tampo bicarbonato pH 9 (mL) Sacarose 0,02 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 gua destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 Invertase (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Incubao: 25C durante 5 minutos Dinitrosalicilato (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Incubao: 100C durante 5 minutos gua destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 Leitura a 540 nm * Zerar o aparelho com o tubo n 1 Fazer um grfico em papel milimetrado: Variao de pH X Absorbncia (ordenada) e resultados. 4) EFEITO DE CONCENTRAO DO SUBSTRATO
Reativos/Tubos Tampo acetato pH 4,7(mL) gua destilada (mL) Sacarose 0,02 M (mL) Sacarose 0,04 M (mL) Sacarose 0,06 M (mL) Sacarose 0,1 M (mL) Sacarose 0,2 M (mL) Invertase (mL) 1 2 3 4 1,0 1,0 1,0 1,0 1,4 0,9 0,9 0,9 0,5 0,5 0,5 0,1 0,1 0,1 0,1 Incubao: 25C durante 5 minutos Dinitrosalicilato (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 Incubao: 100C durante 5 minutos gua destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 Leitura a 540 nm * Zerar o aparelho com o tubo n 1 Fazer um grfico em papel milimetrado: Concentrao do substrato em Absorbncia (ordenada) e interpretar os resultados. 5 1,0 0,9 0,5 0,1

7 1,0 0,5 0,8 0,2

8 1,0 0,5 0,8 0,2

1,0 6,5

1,0 6,5

interpretar os

6 1,0 0,9 0,5 0,1

1,0 6,5

1,0 6,5

g/mL (abscissa) X

Exerccios: 1. Descreva a reao enzimtica da invertase. 2. Como se pode determinar a concentrao dos produtos da reao catalisada pela invertase? 3. Qual o Km obtido para a invertase? Qual o seu significado? 4. Qual o pH timo determinado para a invertase? Qual o seu significado?

13a AULA: Caracterizao de Carboidratos - Reaes Qualitativas (RELATRIO) 1.

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Reao de Molish A ao desidratante do cido sulfrico (H2SO4) concentrado, sobre molculas de monossacardeos, provoca a formao do furfural (para pentoses) e 5-hidroximetilfurfural (para hexoses). Estes aldedos podem condensar com -naftol formando um produto de condensao de cor prpura (anel). Esta reao positiva para todos os carboidratos (mono-, oligo- ou polissacardeo) livres ou combinados.
OH CH2OH OH H H OH H H OH pentose (D-xilose) + H2SO4 conc. furfural 3 H2O O O C H + 2 -naftol CH O composto violeta OH H OH CH2OH O H OH H H O OH H + H2SO4 conc. 3 H2O HOH2C O C H + 5-hidroximetilfurfural 2 CH -naftol O HOH2C composto violeta OH OH OH OH

OH hexose (D- glicose)

Portanto: Carboidrato
H2SO4

furfural ou hidroximetilfurfural + -naftol (Molish)

produto colorido

a) Reativos: cido sulfrico concentrado Reativo de Molish: 5 g de -naftol em 100 mL de etanol b) Tcnica:

Em 4 tubos de ensaio marcados A, B, C e D colocar: Tubo A: 2 mL de soluo de glicose 1% Tubo B: 2 mL de soluo de sacarose 1% Tubo C: 2 mL de soluo de amido 1% Tubo D: 2 mL de soluo de gua destilada A cada tubo adicionar 2 gotas de reativo de Molish e misturar bem. Inclinar o tubo de ensaio e fazer escorrer pelas paredes do tubo, lentamente, 1 mL de cido sulfrico concentrado. Caso a reao seja positiva, na interfase da soluo haver formao de um anel prpura, resultante da condensao do furfural ou do hidroximetilfurfural com o -naftol. Explique os resultados.

34

2) Reao de Seliwanoff Esta reao utilizada para diferenciar entre aldose e cetoses. As cetoses, por ao do HCl, originam um derivado furfrico que se condensa com resorcinol produzindo um complexo de cor vermelha. Com as aldoses, somente um aquecimento prolongado, que transforma parte de glicose em frutose por epimerizao, catalisada por HCl, pode simular um teste positivo. De modo geral, esta reao positiva com as cetoses e negativa com as aldoses.
OH O CH2OH H H OH D-frutose (cetose) O OH OH + HCl CH2OH H 3 H2O HOH2C O C H + 5-hidroximetilfurfural HO 2 resorcinol OH HO CH O HOH2C composto vermelho OH OH

a) Reativos: Solues de frutose, sacarose e glicose 1% Reativo de Seliwanoff: 0,5 g de resorcinol em 100 mL de etanol HCl 8,4 M b) Tcnica: Em tubos de ensaios marcados A, B, C colocar: Tubo A: 1 mL de soluo de frutose 1% Tubo B: 1 mL de soluo de sacarose 1% Tubo C: 1 mL de soluo de glicose 1% A cada tubo adicionar 1 mL do reativo de Seliwanoff. Aquecer em banho-maria fervente e marcar o tempo at o aparecimento de cor vermelha que indica a reao positiva. Explique os resultados. 3. Reao de Bial Esta reao especifica para pentoses e serve para diferenciar a pentose de hexoses. Pentoses quando aquecidas com HCl concentrado produzem furfural que se condensa com o orcinol. O produto resultante, em presena do sal frrico, adquire uma cor azul ou verde-azulada caracterstica.
CH2OH OH H H O OH H H + HCl conc. OH pentose (D-xilose) furfural 3 H2O O O C H + HO 2 CH3 orcinol CH3 O composto verde [bis(3,5-dioxi-metil-fenil) furfuril-metano] OH HO OH HO CH CH3 OH

b) Reativos: HCl concentrado, xilose 1% . soluo de glicose 1%, ribose 1%, soluo de amido. Reativo de Bial: Orcinol 1,5 g + HCl conc., 500 mL + Cloreto Frrico 10% 30 gotas. c) Tcnica: Em tubos de ensaios marcados A, B, C colocar: Tubo A: 1 mL de soluo de xilose ou ribose 1% Tubo B: 1 mL de soluo de glicose 1% Tubo C: 1 mL de soluo de amido Adicionar 10 gotas do reativo de Bial. Misturar e aquecer em banho-maria fervente. O aparecimento de cor verde indica reao positiva. Explique os resultados.

35

4.

Reao com Iodo

Este teste utilizado para a pesquisa do amido, que em soluo forma um complexo azul com o iodo. Este complexo sofre dissociao com aquecimento e torna-se a formar quando a soluo resfriada.
a) Reativos: Soluo de amido 1%; Soluo de glicose 1%, Soluo de lugol (Iodo) b) Tcnica: Tubo A: 1 mL de soluo de glicose 1% + uma gota de lugol Tubo B: 1 mL de soluo de amido + uma gota de lugol

Observar o aparecimento de cor azul. Aquecer em banho-maria fervente. Observar. Resfriar o tubo em gua corrente. Observar. Explique os resultados.

14a AULA: Caracterizao de Carboidratos Reaes de Redues (RELATRIO)

36

1) Reao de Fehling (reao em meio alcalino) Diversos reativos so utilizados para demonstrar a presena de grupo redutor em acares. Justamente por possurem grupo aldedico livre ou grupo cetnico, os acares so capazes de se oxidarem em solues alcalinas de ons de determinados metais (Cu, Bi, Hg, Fe, Ag). Todos os monossacardeos se comportam como acares redutores. Com alguns dissacardeos como a sacarose, isto no acontece por no possurem grupo redutor livre. A reao de Fehling baseia-se no uso de solues cuproalcalinas capazes de oxidarem o grupo aldedo e cetonas dos acares. O reativo de Fehling fortemente alcalino e contm ons cpricos formando um complexo on cprico tartarato de sdio e potssio. Nestas condies o cobre reduzido por ao de acares redutores formando-se xido-cuproso. a) Reativos: Solues de carboidratos Soluo de Fehling: Sol. A: CuSO4.............................35 g H2SO4..............................05 g gua dest.........................100 mL Sol. B: Tartarato K e Na............150 g NaOH 40%....................300 mL gua dest.......................1000 mL b) Tcnica: Tubo Solues Volume Reativo de Fehling (2 mL) 1A Soluo de glicose 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B 1B Soluo de lactose 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B 1C Soluo de sacarose 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B 1D Soluo de amido 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B Misturar. Aquecer em banho-maria fervente. A reao positiva quando h formao de um precipitado avermelhado de xido-cuproso. Explique os resultados. 2) Reao de Benedict (reao em meio alcalino) a reao de diferenciao entre acares redutores e no redutores. O reagente de Benedict constitudo por uma soluo de CuSO4 e citrato de sdio. Esta soluo, fortemente alcalina possibilita a formao de um complexo on cprico-citrato. Nestas condies o on cprico reduzido pela ao de acares redutores, formando-se um precipitado de xido-cuproso. As cores verde, amarela e vermelho refletem quantidades crescentes de acares redutores no meio de reao. a) Reativos: Solues de carboidratos Soluo de Benedict: Sol. A: Citrato de sdio (Na3C6H507.H2O)........173 g Carbonato de sdio (NaCO3).................90 g gua dest. quente (80 oC)....................600 mL Dissolver os sais por agitao Filtrar e completar com gua destilada at 850 mL Sol. B: Sulfato de cobre (CuSO4).......................17,3 mL gua dest...............................................100 mL Dissolver por agitao. Colocar a Soluo A em um balo volumtrico de 1.000 mL e adicionar lentamente a Soluo B, com agitao constante. Completar com gua destilada at a marca de 1.000 mL.

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b) Tcnica: Volume Reativo de Benedict Tubo Solues 2A Soluo de glicose 1% 10 gotas 3 mL 2B Soluo de frutose 1% 10 gotas 3 mL 2C Soluo de sacarose 1% 10 gotas 3 mL 2D Soluo de amido 1% 10 gotas 3 mL 5E gua destilada 10 gotas 3 mL Misturar bem e aquecer (3 minutos) em banho-maria fervente. Deixar esfriar espontaneamente. Observar a cor e eventual formao de precipitado. Interpretar. O tubo E serve para testar o reagente de Benedict. A reao positiva quando h formao de um precipitado, cuja colorao, varia de verde amarelado ao vermelhado. Explique os resultados. 3) Reao de Barfoed (reao em meio cido) Distingue monossacardeos de dissacardeos redutores, pela velocidade com que se forma xido-cuproso a partir da reao entre o acetato cprico e o carboidrato. Em meio cido, predominam as cetnicas, em detrimento das enlicas, assim, os dissacardeos redutores reagiro mais lentamente do que as oses, como consequncia da maior estabilidade das formas moleculares mais complexas. Os dissacardeos com um grupo aldedo livre, daro reduo somente depois de prolongado aquecimento com o reagente.

a) Reativos: solues de carboidratos; Reativo de Barfoed: Acetato de cobre 13,3g; gua dest. 200 mL e cido actico glacial 1,8 mL.
b) Tcnica: Tubo Solues Volume Reativo de Barfoed 3A Soluo de glicose 1% 2 mL 2 mL 3B Soluo de frutose 1% 2 mL 2 mL 3C Soluo de lactose 1% 2 mL 2 mL 3D Soluo de sacarose 1% 2 mL 2 mL Aquecer em banho-maria fervente durante 1 minuto. Sob estas condies somente os monossacardeos daro reao positiva com formao de xido-cuproso. Explique os resultados. Questes 1) Como podemos pesquisar acares redutores? 2) E qual o fundamento da Reao de Barfoed? 3) Porque a sacarose no um acar redutor? 4) A lactose um acar redutor? Justifique?

15a AULA: Dilise (RELATRIO)

38

A dilise uma tcnica usada para a separao tanto de molculas grandes como de molculas pequenas e depende do fato de que molculas pequenas (at 15.000 de PM) passam livremente atravs de uma membrana, enquanto que as molculas grandes (de PM mais elevado) ficam retidas. Cientificamente esta ponderao muito simplificada, porque tanto grupos especficos como cargas existentes nas molculas afetam a velocidade de difuso, particularmente com molculas de tamanho intermedirio. A velocidade de dilise tambm sofre influncia pela temperatura, de tal forma que quanto mais elevada for temperatura, maior ser a velocidade da dilise. Em temperaturas elevadas a viscosidade do solvente maior e a velocidade de difuso aumentada. Por outro lado, muitas molculas so sensveis temperatura, desta forma, a dilise de protenas (enzimas) geralmente executada em geladeiras. O solvente afeta a velocidade de dilise em diversas formas, necessitando portanto de uma escolha cuidadosa. Em geral, a velocidade de dilise maior usando gua como solvente, mas um controle cuidadoso da fora inica e pH so frequentemente necessrios para estabilizar as molculas sob investigao. A presena de sais reduz a velocidade de dilise, provavelmente, por alterar a forma e a carga da molcula. Qualquer reagente no solvente, que possa desnaturar as molculas, tambm pode reduzir consideravelmente a velocidade de dilise. As membranas mais primitivas usadas para dilise so as tripas de porco. Atualmente, tambm so usadas membranas de celofane. Um comprimento suficiente e cortado, embebido em gua e uma das extremidades amarrada com um n e o material a ser dialisado colocado no interior do saco e sua extremidade superior amarrada ou presa por um grampo ou pina o material submetido dilise. Depois de umedecido o saco de dilise pode ser reutilizado, porm torna-se susceptvel ao ataque por microrganismos, devendo portanto serem conservados em gua contendo traos de cido benzoico. REMOO DE MOLCULAS PEQUENAS Existem inmeros exemplos durante isolamentos bioqumicos, onde a CONCENTRAO de sais ou outros materiais de BAIXO PM devem ser retirados ou diminudos antes de executar um novo estgio de separao. Em tais casos, a dilise o mtodo mais conveniente. O saco de dilise contendo a mistura colocado em um grande recipiente (bquer, cuba, etc.), contendo gua ou soluo tampo, e submetido agitao magntica (dispensvel). No caso de protenas ou outras molculas sensveis, o sistema todo colocado em geladeira ou cmara fria. O saco de dilise deve ser completamente enchido, caso contrrio, a gua penetra para o interior do saco por osmose, causando aumento no volume. Isto em geral indesejvel e deve ser evitado. EXPERIMENTO: PASSAGEM DE MOLCULAS ATRAVS DA MEMBRANA DE DILISE DILISE X HIDRLISE ENZIMTICA

PRINCPIO: O amido constitudo por dois polissacardeos a AMILOSE e a AMILOPECTINA (PM de 50.000 e 1.000.000) os quais devido a seus elevados pesos moleculares, no passam atravs da membrana do saco de dilise. Hidrlise enzimtica do amido: As amilases so enzimas que ocorrem na saliva e no pncreas. Hidrolisam ligaes glicosdicas do tipo (14). Atuam no meio da macromolcula, produzindo na clivagem inicial, oligossacardeos de seis ou sete unidades de glicose, que so posteriormente

39

degradadas a maltotriose e maltose. A ao prolongada da -amilase salivar sobre a maltotriose produz maltose e glicose livre.
AMILOSE e /ou AMILOPECTINA -amilase salivar 37 C
0

Oligossacardeos

MALTOTRIOSE + MALTOSE + GLICOSE

O curso da reao pode ser acompanhado pela degradao dos polissacardeos (IODO) ou pelo aumento do poder redutor (ANTRONA ou BENEDICT). MATERIAIS: 1- Tubos de dilise 2- NaCl (0,1% tamponado com 0,02 M tampo fosfato, pH 6,8) 3- Amido solvel (2%) 4- Saliva 5- Soluo de Iodo (0,005 N em 3% KI, contendo 5% TCA) 6- Reativo de Antrona. 7-Tubos de ensaios: 18 MTODO: Preparar dois sacos de dilise (BRANCO, TESTE) BRANCO: 5 mL da soluo de amido + 4 mL de sol. tampo + 1 mL de gua destilada TESTE: 5 mL da soluo de amido + 4 mL de sol. tampo + 1 mL de saliva a) b) c) d) e) f) No tempo zero (adio da enzima) retirar imediatamente 1 mL do interior de cada saco (BRANCO e TESTE) e teste com uma gota IODO. Colocar cada saco de dilise em um bquer contendo 50 mL de soluo tampo. Repita a operao (tempo zero) para o saco de dilise BRANCO e TESTE retirando 1 mL, porm da soluo tampo no bquer, externo ao saco de dilise e faa o Teste de IODO e BENEDICT. Em intervalos de 5, 10, 15 minutos aps o tempo zero, abra os sacos de dilise e retire 1 mL do lquido de dentro do saco (BRANCO e TESTE) e teste com BENEDICT. Aps 20 minutos, retire 1 mL (DENTRO E DE FORA DO SACO DA DILISE) e teste com IODO, tanto para o saco de dilise TESTE como para o BRANCO. Repita a operao, porm retirando 1 mL do lquido de dilise (fora) e teste com BENEDICT, tanto para o saco de dilise TESTE como para o BRANCO.

TESTE DE BENEDICT: A cada tubo adicionar 3 mL do reagente de Benedict. Misturar bem e aquecer (3 minutos) em banho-maria fervente. A reao positiva quando h formao de um precipitado, cuja colorao, varia de verde amarelado ao vermelhado. Teste com IODO/Tempo BRANCO - Sol. dentro do saco dial. (BDI) TESTE - Sol. dentro do saco dial. (TDI) BRANCO Sol. fora do saco dial. (BFI) TESTE - Sol. fora do saco dial. (TFI) Teste de BENEDICT/Tempo BRANCO - Sol. dentro do saco dial. (BDB) TESTE - Sol. dentro do saco dial. (TDB) BRANCO Sol. fora do saco dial. (BFB) TESTE - Sol. fora do saco dial. (TFB) TI.0 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL TB.0 1 mL 1 mL TI.5 TB.5 1 mL 1 mL TI.10 TB.10 1 mL 1 mL TI.15 TB.15 1 mL 1 mL TI.20 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL TB.20 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Questes: 1) Cite exemplos de patologias nas quais a dilise tem aplicao clnica.

16a AULA: Extrao e Caracterizao do Amido (RELATRIO)

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01) EXTRAO DO AMIDO DA BATATA: - Homogeneizar uma batata de tamanho mdio com 100 mL de gua destilada em liquidificador. - Filtrar a suspenso em gaze dobrada, recolhendo o filtrado em um bquer. - Deixar o amido depositar no fundo do bquer durante 15 minutos. Depois de decorrido o tempo, remover cuidadosamente o lquido sobrenadante, evitando a suspenso do amido. 02) PREPARO DE UMA SOLUO DE AMIDO: - Ao depsito de gros de amido obtido na experincia 01, adicionando aproximadamente 10 mL de gua destilada fria. Misturar. A esta suspenso de amido, adicionar 100 mL de gua fervente, lentamente e com constante agitao. A soluo de amido dever adquirir um aspecto opalescente. Caso no forme uma soluo opalescente aquecer. Esta soluo ser utilizada para as reaes de caracterizao. 03) REAES DE CARACTERIZAO DO AMIDO: 3.A) Reao de Molish: Tubo A: 2 mL da soluo de amido + 3 gotas do reativo de Molish e misturar. Inclinar o tubo e deixar escorrer pela parede 2 mL de H2SO4 concentrado. Reao positiva: formao de um anel violeta na interfase.
3.B) Reao com o Iodo (lugol): Tubo B: 2 mL da soluo de amido + 1 gota de lugol. Observar e anotar. Aquecer o tubo, sem ferver, e anotar o efeito. Em seguida, esfriar o tubo em gua corrente, observar e anotar o efeito. 3.C) Precipitao do Amido: Tubo C: 5 mL da soluo de amido + 5 mL de soluo saturada de sulfato de amnio. Agitar fortemente e deixar em repouso por 10 minutos. Filtrar e pesquisar o amido pelo teste de iodo, separadamente no filtrado e no precipitado. Tubo D: 2 mL da soluo de amido + 10 mL de lcool etlico. Agitar. Filtrar e pesquisar o amido pelo teste de iodo, separadamente no filtrado e no precipitado. Reao positiva do iodo, nos filtrados, indica precipitao incompleta do amido. Explicao terica: O amido encontra-se amplamente distribudo no reino vegetal, sendo encontrado em sementes, tubrculos, etc. Dentro das clulas encontram-se na forma de grnulos, estes diferem na forma de acordo com as diferentes fontes. Os principais constituintes do grnulo de amido so a amilose e a amilopectina, os quais diferem na estrutura molecular.

-1,4 CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH

...O

O...

Estrutura qumica da Amilose unidas por ligaes -1,4

41
-1,4 CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H -1,4 CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH CH2OH O H H H 4 OH H 1 H OH O CH2 H H 4 OH H O H H 1 OH

...O

-1,6

...O

O...

Estrutura qumica da amilopectina com ligaes -1,4 e -1,6 nas ramificaes. Soluo de amido: o amido insolvel em gua fria. Embora possua grupos funcionais polares (OH), este polmero da glicose apresenta uma fraca polaridade, devido complexidade de suas molculas (cadeias longas e ramificadas). Reao com o iodo: neste caso, no ocorre uma reao qumica propriamente dita, entre o iodo e o amido. O amido adsorve o iodo, formando uma espcie de complexo bastante lbil. A consequente distribuio do iodo causa o fenmeno fsico do aparecimento de colorao azul-intensa (amilose) ou violcea (amilopectina).

O complexo iodo-amilose se torna instvel por ao do calor, mas se refaz ao esfriar. O complexo de adsoro no se forma em meio alcalino, no qual os grupos polares do amido so bloqueados pelos ons hidroxilas presentes. Pela mesma razo, o complexo no se forma em meio alcolico.

Exerccios 1. Qual o princpio da reao de Molisch e o que acontece quando aplicada a um polissacardeo? 2. Por que ocorre a precipitao do amido quando, em soluo aquosa, tratado com etanol ou sulfato de amnio?

17a AULA: Testes Para Caracterizao de Lipdeos (RELATRIO)

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1) SAPONIFICAO DO TRIACILGLICEROL Os leos e gorduras, quando tratados por solues alcalinas concentradas, se hidrolisam, produzindo glicerol e os sais alcalinos dos cidos graxos que os constituam (sabes).
H2C O CO R HC O CO R H2C O CO R triglicerdeo H2C OH HC OH H2C OH glicerol + 3 R_COO- K+ sal de cido graxo

Tcnica: - Em um tubo de ensaio grande, colocar 20 gotas de leo vegetal e 10 mL de potassa alcolica (5,0 ml de KOH 40% mais 5,0 mL de etanol). - Aquecer em banho-maria fervente durante 30 minutos. Nestas condies o leo saponificado, obtendo-se uma soluo opalescente de sais de potssio de cidos graxos (sabes) e glicerol. Usar esta soluo na experincia seguinte. 2) SOLUBILIDADE Tcnica: - Preparar uma srie de 6 tubos de ensaio. Colocar 2 gotas de leo de soja em todos eles. A seguir, acrescentar os solventes de acordo com a tabela abaixo: Tubos Solventes (3 mL) Resultados * 01 gua destilada 02 HCl 0,5 M 03 NaOH 0,5 M 04 etanol 05 ter etlico 06 clorofrmio * aps adicionar os solventes, agitar, observar e anotar o resultado. Resultado: (solvel ou insolvel)

ESTABILIZAO DE UMA EMULSO Em presena de gua, agitando, o leo se torna finamente dividido, formando uma emulso instvel, no permanente. Logo se separa e flutua, ao ser deixado em repouso. As protenas possuem zonas hidrfobas em sua estrutura, as quais podem fixar os lipdeos; e consequentemente estabilizam as emulses. Em presena de solues alcalinas, os cidos graxos livres so neutralizados e os sais resultantes so agentes estabilizadores das emulses dos leos e gorduras em gua este fenmeno mais intenso em leo ranoso.
3) VERIFICAO DA ACIDEZ EM LEO OU GORDURA RANOSA Os leos e gorduras no muito purificados contm pequenas quantidades de cidos graxos livres (palmtico, esterico, olico, etc.). Quanto maior for o grau de impureza destes lipdeos ou quanto mais tempo forem deixados em contato com o ar, temperatura ambiente, maior ser a quantidade de cidos graxos livres. Da, a reao cido do leo ou gorduras ranosas.

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Tcnica: Tubo 1: 2 mL de etanol + 2 gotas de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftalena. Observar. Adicionar leo ranoso gota a gota, at descorar. Contar o nmero de gotas adicionadas. Tubo 2: 2 mL de etanol + 2 gotas de NaOH 0,1 M + uma gota de fenolftalena. Observar. Adicionar o mesmo nmero de gotas de experincia anterior de leo fresco. Observar, comparar e interpretar. 4) FIXAO DO IODO Os cidos graxos insaturados caracterizam-se pela existncia de uma ou mais duplas ligaes na molcula, o que explica a sua maior reatividade. A dupla ligao pode adicionar oxignio, hidrognio e halognios. O grau de saturao pode ser determinado na presena de iodo. Quanto maior o teor de cidos graxos insaturados na composio, menor a quantidade de iodo livre na soluo que observado pela reao de amido do iodo.
I R COOH COOH + I2 R I

Tcnica: 1) Numerar dois tubos de ensaio e proceder conforme a tabela abaixo: Reagentes Tubo 1 Tubo 2 leo de soja fresco 5 mL gua destilada 5 mL Lugol 10 mL 10 mL

2) Aquecer em banho-maria fervente at o desaparecimento da cor. 3) Deixar esfriar em temperatura ambiente e adicionar trs gotas de soluo de amido. 4) Observar e comparar os resultados obtidos em ambos os tubos.
5) PROPRIEDADES DOS SABES -Repartir a soluo de sabo obtida da Prtica 1: 0,5 mL em 4 tubos de ensaio e realizar os seguintes testes: Tubo 1: abaixamento da tenso superficial - acrescentar 0,5 mL de gua destilada e agitar a soluo de sabo at formao de espumas. Tubo 2: liberao de cidos graxos - adicionar, gota a gota, cido actico concentrado, at o aparecimento de turbidez, resultante da liberao dos cidos graxos que sobrenadam. Tubo 3: precipitao de sabes de clcio insolveis - adicionar, gota a gota, soluo de CaCl2 a 10%, at o aparecimento de um precipitado branco de sabes de clcio. Tubo 4: precipitao por excessivo de eletrlitos - adicionar um volume igual de soluo saturada de NaCl. Observar a formao de um precipitado de sabo por excesso de eletrlitos.

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EXPLICAO TERICA: - Abaixamento da tenso superficial: com a agitao da soluo (sabo), as interaes (pontes de hidrognio) ficam mais sensveis com isto s micelas penetram entre os mols de H2O fazendo com que haja um espao maior entre elas, o ar penetra ocupando o espao vazio, como ele menos denso ele sobe e fica interagindo com a H2O e micelas. - Liberao de cidos graxos: a turbeis observada resultado da liberao dos cidos graxos, os quais sendo insolveis em gua e menos densos, sobrenadam. CH3(CH2)14COO- K+ + CH3COOH ---------------> R1-COOH + CH3COO- K+ palmitato de potssio cido actico cido palmtico acetato de potssio -Precipitao de sabes de clcio: Os sais de cidos graxos com clcio formam um precipitado de sabes de clcio insolveis. CH3(CH2)14COO Ca+ CH3(CH2)14COO palmitato de potssio cloreto de clcio palmitato de clcio (insolvel) cloreto de potssio + 2 KCl

CH3(CH2)14COO -K + + CaCl2

- Precipitao por excesso de eletrlitos: Os sais de cidos graxos precipitam em presena de excesso de eletrlitos, devido ao efeito do on comum, com diminuio da dissociao do sal.
CH3(CH2)14COO K palmitato de potssio
+

NaCl (sat.)

CH3(CH2)14COO Na palmitato de sdio

KCl

cloreto de sdio

cloreto de potssio

REAGENTES: - leo de soja fresco - HCl 0,5 M; NaOH 0,5 M; NaOH 0,1 M - Etanol, ter etlico, clorofrmio, cido actico concentrado - Soluo de fenolftalena - KOH 40%; CaCl2 10%; NaCl saturada (35%)

Exerccios: 1) O que lipdeo? 2) O que cido graco? 3) O que um leo? D exemplos. 4) Escreve a frmula estrutural do cido palmitoleico. 5) Escreva a reao de hidrlise alcalina de um triacilglicerol. 6) Por que se utiliza etanol na reao de saponificao? 7) Explicar a ao detergente dos sabes

18a AULA: Prtica de Carotenoides (RELATRIO)

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Introduo: Os carotenoides so substncias coloridas presentes em diversos vegetais, que servem como precursores de vitamina A para muitos animais, incluindo o homem, sendo que a degradao enzimtica de -caroteno (carotenoide) gera 2 molculas de vitamina A, segundo a equao:
enzimas CH2OH 2 Vitamina A caroteno

Assim como outras substncias orgnicas que contm duplas ligaes, os carotenoides tambm so atacados por agentes oxidantes fortes, como o KMnO4, segundo a equao:
R`` R``` 3R C C R` + 2 KMnO 4 + 3 H2O R`` R``` 3R C C OH OH R` + K2O + 2 MnO2

O KMnO4 apresenta cor bord-escuro e solvel em gua, enquanto que o MnO2 marrom e insolvel em meio aquoso. Sendo assim, a mudana de cor de bord para marrom e a formao de um precipitado escuro, indicam que ocorreu reao do KMnO4 com materiais orgnicos oxidveis.
Procedimento: 1) Bater no liquidificador 1 cenoura mdia com 250 mL de gua. Filtrar. O filtrado a soluo de cenoura. 2) Bater no liquidificador 1 tomate mdio com 100 mL de gua. Filtrar. O filtrado a soluo de tomate. 3) Misturar bem 10 mL de extrato de tomate com 50 mL de gua. Filtrar bem. O filtrado a soluo de extrato. 4) Colocar 10 g de urucum em p em um bquer, e acrescentar 30 mL de gua. Agitar eventualmente e, aps 20 minutos, filtrar. O filtrado a soluo de urucum. Tubo KMnO4 (5mg/mL) mL 1 1 1 1 1 Sol. de cenoura (mL) 5 Sol. de tomate (mL) 5 Sol. extrato de tomate (mL) 5 Sol. de urucum (mL) 5

1 2 3 4 5

Anotar as observaes e explicar.

19a AULA: Cromatografia de Carboidratos (RELATRIO) CROMATOGRAFIA EM PAPEL (Ascendente) Fundamentao terica:

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A cromatografia uma ferramenta de grande importncia em trabalhos cientficos, sendo til devido facilidade de separar e identificar misturas de difcil resoluo. Na cromatografia em papel, utiliza-se um tipo de papel de filtro especial. Existem diversos tipos de papis para cromatografia e podem ser obtidos comercialmente em espessuras variveis. O mais comum deles o WHATMAN. O papel em si, constitudo por um agregado de fibras de celulose. Estas fibras de celulose (polmero de glicose) esto dispostas em forma aproximadamente paralela e esto fortemente ligadas entre si em algumas regies, atravs de pontes de hidrognio o que gera na estrutura do papel, regies de estruturas cristalinas e regies de estruturas parcialmente amorfas. Nas regies amorfas, a gua e outros solventes hidroflicos so adsorvidos pela celulose, o que conduz a formao de pools de lquidos.
Objetivo: identificao qualitativa de carboidratos atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana. Material: - Papel cromatogrfico - Amostra: Solues aquosas (10 mg/10 mL) de: 1. glicose 2. xilose 3. frutose 4. maltose 5. Mistura - Revelador para carboidratos - Cmara cromatogrfica - Tubos capilares Solventes: butanol normal/piridina/gua (6:4:3). Tcnica: 1. Cortar o papel cromatogrfico com 16 a 24 cm. 2. Traar com lpis uma linha de 2 cm da borda inferior. 3. Marcar sobre a linha traada, pontos para a aplicao das amostras e padres conservando entre eles a distncia de 2 cm. 4. Aplicar as solues de carboidratos com tubos capilares. Secar com secador. A mancha no deve exceder 5 mm de dimetro. 5. Mergulhar o cromatograma em uma cuba contendo o solvente de corrida, tomando o cuidado para que a altura do solvente no alcance a linha de aplicao das manchas. 6. Deixar que o solvente corra at 1 cm da extremidade superior do papel e marcar a linha de frente do solvente com um lpis. 7. Retirar o cromatograma e deixar secar a temperatura ambiente. 8. Revelar com revelador de carboidratos 9. Identificar os carboidratos da mistura por comparao com os padres. 10. Medir o Rf de cada substncia.

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Em cromatograma de papel e em camada delgada, usa-se como referncia o Rf.

Rf =

distncia percorrida por uma substncia distncia percorrida por um solvente

O Rf caracterstico para cada substncia, quando as condies forem estabelecidas. utilizado para identificar os componentes de uma amostra. Nota: Evite contato com dedos na poro do papel que contm as amostras e os padres.
Temas de aplicao: 1) Quais as aplicaes da cromatofrafia? 2) Qual a finalidade de calcularmos o Rf de cada amostra? 3) Qual a funo de cromatografia numa mistura de amostras?

20a AULA: Identificao de cidos Nucleicos em Materiais Biolgicos (RELATRIO)

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Introduo Os cidos nucleicos encontrados em diferentes fraes celulares sero evidenciados num homogeneizado de tecido heptico, atravs de reaes caractersticas para as pentoses que os compe (Riboses e Desoxirriboses).
H C O H H C O

H C

H C OH H C OH H C OH CH2OH ribose (acar do RNA)

H C OH H C OH CH2OH 2-desoxiribose (acar do DNA)

Os cidos nucleicos so precipitados com cido Tricloroactico (TCA) a 20%, juntamente com as protenas e posteriormente extrados com TCA a 5%, a quente. A hidrlise cida branda dos cidos nucleicos remove seletivamente todas as bases pricas (hidrolise de ligaes N-glicosdicas entre pentoses e as base pricas) sem afetar as ligaes Nglicosdicas entre as bases pirimdicas e as pentoses ou ligaes de fosfodister do esqueleto nucleotdico. Portanto, pela hidrlise temos como produto os cidos nuclicos sem bases pricas. Com este material parcialmente purificado, sero efetuadas as reaes de caracterizao.
Reativos: - TCA 20%; TCA 5%; cido Ctrico 2% - Reativo de difenilamina: Difenilamina...........................................1 g cido actico gl.......................................100 mL cido sulfrico conc...............................2,75 mL

- Reativo de orcinol: Orcinol.....................................................0,2 g HCl conc.................................................60 mL Cloreto frrico 10%..................................0,2 mL

Tcnica 1. Preparo do Homogeneizado: Colocar, em um gral de porcelana, aproximadamente 5 g de fgado finamente cortado. Adicionar 10 mL de cido ctrico 2% e triturar com o auxlio de um pistilo at completa homogeneizao.

2. Extrao dos cidos Nucleicos: a) Filtrar o homogeneizado obtido utilizando-se de gaze dobrado at 4 vezes. Em um tubo de centrfuga colocar 2 mL do filtrado e adicionar 1 mL de TCA 20%. Misturar e deixar de repouso por 15 minutos. b) Centrifugar a 2000 rpm por 3 minutos, desprezar o sobrenadante e suspender o sedimento com 5 mL de TCA 5%. Aquecer em banho-maria por 10 minutos. c) Centrifugar a 2000 rpm por 3 minutos. Retirar o sobrenadante coletando-o em tubo de ensaio. Este extrato deve conter todo o DNA e RNA.

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Reaes de Caracterizao

a) Caracterizao do DNA: A 2-desoxipentoses ou derivados que apresentam grupamento aldedicos livres, por hidrlise cida branda, tais como apurino desoxiribonucleotdeo, reagem com a difenilamina, dando um produto de cor azul. Esta reao ir caracterizar indiretamente a presena de DNA no extrato em anlise.
Tcnica: Tubo A: 1 mL do extrato de cidos nucleicos + 2 mL do reativo de difenilamina Tubo B: 1 mL de gua destilada+ 2 mL do reativo de difenilamina Misturar e aquecer em BM fervente por 10 minutos. Esfriar e observar a cor azul no tubo A, caracterstica da presena de desoxirribose.

b) Caracterizao do RNA: O RNA pode ser evidenciado pela reao com orcinol para pentoses. Como o reativo de orcinol fortemente cido, as ligaes fosfodister e N-glicosdicas sofrero hidrlise, liberando riboses na forma livre. As riboses formaro furfurais que iro condensar com orcinol, dando um produto de cor verde azulada que revela a presena de RNA no extrato.
Tcnica: Tubo A: 1 mL do extrato de cidos nucleicos + 2 mL do reativo de orcinol Tubo B: 1 mL de gua destilada + 2 mL do reativo de orcinol Misturar e aquecer em BM fervente por 10 minutos. Esfriar e observar a cor verde no tubo A, caracterstica da presena de ribose. Questes: 1) Equacione as reaes que ocorrem com o DNA e RNA com a difenilamina e o orcinol. 2) Qual o papel do T.C.A. no processo?

21a AULA: Espectrofotometria (RELATRIO)

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FUNDAMENTOS A anlise fotomtrica uma das maneiras mais usadas para determinar a concentrao de solues de compostos qumicos ou biolgicos. Ela , talvez, o mtodo mais comumente empregado nas anlises qumicas em laboratrios clnicos. Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo. A absoro de luz pela matria envolve a incorporao da energia contida no fton da estrutura das molculas absorventes. Quando isso acontece, as molculas absorventes passam do estado fundamental (estado energtico mais baixo) para o estado excitado (estado energtico mais alto). Contudo, a durao do estado excitado normalmente breve, e a molcula retorna ao estado fundamental libera energia na forma de calor. O fenmeno de absoro implica que o contedo energtico do fton seja igual quantidade de energia necessria para que a molcula ou tomo passe do estado fundamental para o excitado. Quando o contedo energtico do fton for maior ou menor do que a quantidade de energia necessria para o composto passar do estado fundamental para o excitado, o fenmeno de absoro no ocorre. Assim, deve-se utilizar um feixe de luz monocromtica de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado. Espectrofotmetros so instrumentos que medem a absoro de energia magntica radiante em solues. Os espectrofotmetros utilizam prismas ou grades de difrao para selecionar determinadas faixas do espectro (ultravioleta at 380 nm, visvel 381-700 nm ou infravermelho acima de 700 nm). A figura abaixo apresenta os componentes bsicos de um espectrofotmetro.

1-Fonte de luz

5-Cubeta com 3-Monocromador amostra (prisma ou grade de difrao) 2-Colimador 4-Seletor de (fenda)

6-Clula fotoeltrica

7-Galvanmetro

1. Fonte de luz: capaz de emitir uma mistura de comprimentos de onda (lmpada de tungstnio para luz visvel e lmpada de hidrognio para luz ultravioleta). 2. Colimador ou dispositivo de focalizao: transmite um intenso feixe retilneo de luz. 3. Monocromador (prisma ou grade de difrao): utilizado na resoluo da radiao emitida pela fonte luminosa em seus vrios comprimentos de onda (). 4. Fenda: dispositivo para selecionar o comprimento de onda desejado. 5. Porta cubeta e cubeta: local apropriado onde se coloca a cubeta contendo a soluo a ser medida. 6. Detector com clula fotoeltrica: utilizado para receber a energia radiante transmitida atravs da soluo e transform-la em energia eltrica. 7. Medidor eltrico (galvanmetro): registra a intensidade de energia captada pelo detector e apresentando-a ao operador sob forma de leitura de TRASNMITNCIA (T) ou ABSORBNCIA (A).

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Quando um raio de energia radiante atravessa uma soluo, a energia INCIDENTE (Io) ser sempre mais intensa que a energia EMERGENTE (I). Esta atenuao da intensidade da energia atribuda a: 1) Reflexes nas interfaces entre o ar e a parede da cubeta e entre a soluo e a parede da cubeta. 2) Disperso por partculas presentes na soluo. 3) Absoro da energia pela soluo. Nas aplicaes da fotometria, a absoro da energia (I) o fator primrio na reduo da energia incidente (Io). ABSORBNCIA: significa a relao logartmica entre a ENERGIA INCIDENTE (Io) e a ENERGIA TRANSMITIDA (I) pela soluo.

A = log

Io I

TRANSMITNCIA: a relao entre a energia transmitida (I) e a energia incidente (Io).

T=

I Io

Se uma determinada soluo no absorve energia, I e Io tem o mesmo valor e portanto I/Io ser igual a 1. Conclui-se desse modo, que qualquer soluo que absorva energia ter transmitncia menor que 1 (porque I , neste caso, menor que Io). Para evitar operaes com decimais, recorreu-se ao artifcio da multiplicao por 100. Assim quando I e Io so iguais, logo T = 1 + 100% LEI DE LAMBERT: estabelece que quando a energia radiante atravessa uma soluo, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente em relao ao aumento da espessura atravessada. Assim: Io: intensidade da luz incidente Io I: intensidade da luz transmitida Log = .l (eq.1) I : Constante caracterstica da soluo 1: Espessura da camada atravessada pela luz. Partindo da Lei de Lambert, BEER estabeleceu que: quando a energia radiante atravessa uma soluo, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da concentrao da soluo. Assim: Io: intensidade da luz incidente Io I: intensidade da luz transmitida Log = .c (eq.2) : constante caracterstica da soluo I c: concentrao da soluo atravessada pela luz. LEI DE LAMBERT-BEER: Combinando as equaes 1 e 2

Log
Substituindo-se a equao 1 em 3 teremos:

Io I

= .l.c (eq.3)

A = .l.c (eq. 4) onde: A = absorbncia definida pela reao seguinte: A = -log. I/Io, que por ser uma razo, no possui unidade (Io intensidade de luz incidente; I intensidade de luz transmitida); = absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)-1; l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm; c = concentrao da substncia em mol/L.

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CURVA DE CALIBRAO: A principal finalidade de uma dosagem espectrofotomtrica avaliar quantidades. Portanto extremamente importante efetuar uma rigorosa calibrao, visando obteno de resultados exatos. SOLUO PADRO: parte integrante da anlise quantitativa no laboratrio e usada nas dosagens de amostras de concentrao desconhecidas. Uma soluo padro apresenta uma concentrao exata de uma substncia conhecida, que servir como referncia na determinao fotomtrica de CONCENTRAES DESCONHECIDAS desta MESMA SUBSTNCIA. USO DE BRANCO: Quando usamos o BRANCO em fotometria, para estabelecer o zero de absorbncia ou 100% de transmitncia, estamos simplesmente usando um sistema para eliminar: - Absorbncia dos reagentes e das cubetas - Perdas por reflexes e refrao - Compensao do efeito de lente produzido pelas cubetas redondas. Usamos ponto zero de ABSORBNCIA ou 100% TRANSMITNCIA, porque, desta forma eliminaremos a necessidade de clculos, pois neste ponto a energia incidente (Io) torna-se igual a 100. SELEO DA REA ESPECTRAL = ESPECTRO DE ABSORO Quando realizamos uma medida fotomtrica, devemos usar a faixa do espectro na qual a energia radiante seja ABSORVIDA AO MXIMO. O melhor processo para avaliar corretamente a regio espectral para ser utilizada numa medida fotomtrica preparar uma curva ou espectro de absoro, onde obtm-se uma relao entre as absorbncias e os respectivos comprimentos de onda. PROBLEMAS: erros de leitura. a) Impurezas na amostra. b) Bolhas de gs, sujeiras na cubeta (parede), riscos nas paredes da cubeta.
Exerccios: 1. Qual a finalidade e o fundamento da tcnica espectrofotomtrica? 2. Determine a composio e defina a importncia dos tubos branco e padro na determinao da concentrao de um composto pela tcnica espectrofotomtrica.

22a Aula: Seleo da rea Espectral = Espectro de Absoro (RELATRIO)

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Quando uma soluo de um dado composto submetida a leituras de absorbncia ao longo de uma faixa de comprimentos de onda eletromagntica, passamos a ter informaes referentes capacidade do composto em absorver luz. Quando realizamos uma medida fotomtrica, devemos usar a faixa do espectro na qual a energia radiante seja ABSORVIDA AO MXIMO. O melhor processo para avaliar corretamente a regio espectral para ser utilizada numa medida fotomtrica preparar uma curva ou espectro de absoro, onde obtm-se uma relao entre as absorbncias e os respectivos comprimentos de onda. A representao grfica dos valores de comprimento de onda () versus absorbncia denominado espectro de absoro. Como a interao da luz com a matria depende da estrutura qumica dos compostos, o espectro de absoro uma forma de caracterizao que permite verificar qual a faixa de comprimento de onda em que um dado composto apresenta sua maior afinidade de absoro.
ESPECTRO DE ABSORO DO COMPLEXO PROTENA/BIURETO Procedimento Experimental: Determinao do mx do produto da reao de biureto Tubo A (amostra): 1,0 mL de padro de albumina (1 mg/mL) + 4 mL de reagente de biureto Tubo B (branco): 1,0 mL de gua dest. + 4 mL de reagente de biureto Agitar e incubar os tubos por 10 min. a 37 oC. Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as absorbncias nos comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Traar um grfico, colocando na abscissa (X) os comprimentos de onda [ (nm)] e na ordenada (Y) s absorbncias. Estabelecer qual o mx do produto da reao de biureto. (nm) 400 420 450 470 500 520 550 580 600 630 650 680 700 Abs. Questo: 1. Qual a importncia da determinao do espectro de absoro? 2. Conceitue: faixa de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico?

23a AULA: Preparo da Curva Padro (Curva De Calibrao)

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EXECUO DE UMA CURVA DE CALIBRAO 1) Preparar uma srie de padres (concentrao conhecida da substncia que se quer quantificar) e que cubram a faixa de trabalho desejada, ou seja a concentrao mnima e a mxima possvel de ser medida dentro da sensibilidade do mtodo. 2) Verificar a absorbncia de cada uma destas concentraes (da sol. padro). Fazer as leituras usando o BRANCO APROPRIADO para acertar ZERO DE ABSORBNCIA ou 100% de TRANSMITNCIA. Usar tambm o COMPRIMENTO DE ONDA RECOMENDADO PELA LITERATURA OU O OBTIDO PELA CURVA DE ABSORO ESPECTRAL PREVIAMENTE REALIZADA. 3) Fazer grfico em papel milimetrado, relacionando a absorbncia (ordenadas) com as concentraes dos padres (ou diluies dos padres) na abscissa. Examinar os pontos obtidos e verificar se eles sero cobertos por uma linha reta, partindo da origem. Se isto no acontecer, traar a curva de tal modo que se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva no deve ser traada ponto a ponto, mas sim por interpolao atravs dos pontos. Desta forma, mantendo-se o caminho ptico constante, a absorbncia torna-se diretamente proporcional concentrao da substncia no respectivo mx. Nestas condies, podemos utilizar uma soluo de concentrao conhecida do composto a ser analisado (ou outra substncia de caractersticas qumicas semelhantes) para construir um diagrama de absorbncia em funo da concentrao da substncia em questo. Com este diagrama, denominada curva padro, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentrao desconhecida, pela simples medida de suas absorbncias desde que, estas estejam nas mesmas condies utilizadas para a construo da curva padro (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc.). Um exemplo de uma curva padro:

Tcnica:
Padro mL H2O Reagente de Fator de Absorbncia (1mg/mL) dest.(mL) biureto (mL) calibrao (f) 1(branco) 1,0 4,0 0,0 0,0 2 0,2 mL 0,8 4,0 3 0,4 mL 0,6 4,0 4 0,6 mL 0,4 4,0 5 0,8 mL 0,2 4,0 6 1,0 mL 4,0 Deixar os tubos em repouso por 10 minutos antes de fazer a leitura. Leitura: 540 nm. Faa um grfico e avalie o fator de calibrao. Tubos

Fator de calibrao (f) = concentrao absorbncia Determinando a concentrao da amostra pelo fator de calibrao: Amostra [mg/mL] = f x Abs. Tudo 6 Concentrao do padro: 1 mg/mL

24a AULA: Dosagem de Protena no Soro (RELATRIO)

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Objetivo: Determinar a concentrao de protenas sricas utilizando-se a reao de biureto. Reagente: Soluo padro: 1mg/mL de albumina bovina. Conservar ente 15 e 25 oC. Reativo de biureto. Amostra: soro ou plasma podem ser usados, mas prefere-se soro. Amostras hemolisadas no devem ser analisadas. As amostras bem fechadas de soro so estveis, por 1 semana temperatura ambiente, e por 1 ms a 2 a 4 oC. Mtodo: Princpio: O cobre do reativo de biureto reage com as protenas, em meio alcalino, formando um complexo cobre protena de cor roxa, que absorve luz em 540 nm. A intensidade de cor produzida proporcional ao nmero de ligaes peptdicas que esto reagindo e, portanto, quantidade de protena presente. Aminocidos e dipeptdios no reagem, mas tripeptdios, oligopeptdios e polipeptdios reagem e produz produtos de cor rosa a violeta avermelhada. Reao do biureto com a estrutura da protena.
R O C HN R_CH O=C NH R CH R
_

R H2O C O NH Cu++ HC _R C=O NH H2O HC R R

_

Tcnica: Diluir a amostra: Em um tubo de ensaio, pipetar 1,9 mL de gua destilada e 0,1 mL do soro a ser testado (dil. 1:20). Soro Padro de albumina H2O dest. Reagente biureto Absorbncia (mL) (1 mg/mL) (mL) (mL) 1(branco) 1,0 2,0 0,0 2(padro) 1,0 (mL) 2,0 3(amostra) 1,0 2,0 Tubos

Deixar todos os tubos em repouso por 10 minutos. Efetuar a leitura em 540 nm. Clculo

absorbncia da amostra absorbncia do padro Valores normais: 60 a 80 mg/mL. Amostra [mg/mL] =

X concentrao do padro [mg/mL]

Resultados e concluso: Compare o valor encontrado na sua dosagem com os valores de referncia para dosagem de protenas totais. Verifique se a concentrao de protenas totais est dentro da faixa de referncia, se indica hipoproteinemia ou hiperproteinemia. E quais as principais causas de alteraes dessas concentraes. Questes: 1. Quais as fraes proteicas que compem as protenas totais? 2. Em quais lquidos biolgicos podemos determinar protenas totais?

25a AULA: Determinao de Glicose no Sangue (RELATRIO) Mtodo: Teste fotomtrico enzimtico: "GOD-POP". Objetivo: Determinar a concentrao de glicose em uma amostra com concentrao desconhecida, utilizando o mtodo enzimtico da glicose oxidase/peroxidase (GOD/POP).\

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Indicao: A medio da concentrao da glicose em soro ou plasma principalmente usada no diagnstico e monitoramento do tratamento de Diabetes Mellitus. Outras aplicaes so na deteco de hipoglicemia neonatal, excluso de clulas cancergenas pancreticas bem como na avaliao do metabolismo de carboidratos em varias doenas. Princpio: Determinao da glicose aps oxidao enzimtica pela glicose oxidase. O indicador colorimtrico a Quinonimina, o qual gerado a partir da 4-aminoantipirina e fenol pelo perxido de hidrognio sob ao cataltica da peroxidase (Reao Trinder -1969).
H O
-

H C OH HO C H H C OH H C OH CH2OH glicose

H C OH

+ O2

GOD

HO C

H C OH H C OH CH2OH cido glicnico

H2O 2 perxido de hidrognio O

OH 2 H2O2

H3C N H3C

NH2 H3C N

POD H3C

4H2O

perxido de hidrognio

fenol

4-aminoantipirina

quinonimina

Reagentes: Reagentes prontos para uso. Padro: 100 mg/dL (5,55 mmol/L) Amostra: Soro humano Cuidados e precaues: Este reagente possui azida sdica e classificado pelas diretrizes aplicveis da comunidade Europia como nocivo (Xn). Procedimentos para o teste: Tubos Soro Padro de glicose H2O dest. Reagente (mL) Absorbncia 1(branco) 10,0 L 1,0 0,0 2(padro) 10,0 L 1,0 3(amostra) 10,0 L 1,0 o Misturar, incubar por 10 min. a 37 C. Fazer leitura em comprimento de onda de 500 nm

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Clculo:

Glicose [mg/dL] =

absorbncia da amostra absorbncia do padro

X concentrao do padro [mg/dL]

Fator de converso: Glicose [mg/dL] x 0,05551 = Glicose [mmol/L] Valores Normais:

[mg/dL] [mmol/L
Recm Nascidos Cordo Umbilical 1h 2h 5-14 h 10-20 h 44-52 h Crianas 1-6 anos 7-19 anos Adultos Soro/Plasma

63 - 158 36 - 99 36 - 89 34 - 77 46 - 81 48 - 79

3,5 - 8,8 2,0 5,5 2,2 4,9 1,9 4,3 2,5 4,5 2,7 4,7

74 - 127 4,1 7,0 70 - 106 3,9 5,9 70 - 115 3,9 - 6,4

Resultados e concluso: Compare o valor encontrado na sua dosagem com os valores de referncia para dosagem de glicose. Verifique se a concentrao de glicose est dentro da faixa de referncia, se indica hipoglicemia ou hiperglicemia. E quais as principais causas de alteraes dessas concentraes. Questo: 1. Em quais lquidos biolgicos podemos determinar glicose?

26a AULA: Dosagem de Triglicerdeos no Sangue (RELATRIO)

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1) FINALIDADE: Teste enzimtico e colorimtrico para o doseamento de triglicrides no soro ou plasma usando reagente lquido pronto para uso. 2) AMOSTRA: Soro humano 3) IMPORTNCIA CLNICA: A determinao dos triglicerdeos possui um vasto significado clnico, especialmente em se tratando de doenas coronarianas e arterosclerticas. O doseamento importante tambm para avaliao de quadros que envolvem diabetes mellitus, obstrues biliares, nefroses e vrios outros distrbios do metabolismo endcrino. 4) PRINCPIO DE TCNICA
H2C O CO HC O CO R R
lipases

H2C OH 3 R COOH + cidos graxos

_

H2C OH + ATP
glicerolquinase

HC OH H2C OH glicerol

ADP +

HC OH OH H2C O P OH O glicerol 3-fosfato O

H2C O CO R triglicerdeo H2C OH HC OH OH H2C O P OH O glicerol 3-fosfato + O2

GPO

H2C OH C O H2C O OH P OH + H2O2 O

O S

OH Cl

H3C N

NH2

H3C POD N H3C N

OH Cl

O diihidroxiacetona fosfato perxido de hidrognio

+ H3C

+ 2H2O

4-diclorofenol sulfonato (DHBS)

4-aminoantipirina

quinonimina

A quantidade de Quinonimina formada (medida entre 500-550 nm) proporcional concentrao de triglicrides na amostra analisada.
5) PROCEDIMENTO TCNICO Tubos Soro Padro(200 mg/dL) H2O dest. Reagente (mL) Absorbncia 1(branco) 10,0 L 1,0 0,0 2(padro) 10,0 L 1,0 3(amostra) 10,0 L 1,0 Misturar suavemente e incubar 5 minutos a 37oC. Fazer leitura em comprimento de onda de 500 nm. 6) CLCULOS Para se determinar a concentrao de triglicrides na amostra analisada, usar a seguinte frmula: Triglicrides em mg/dL = (Absorbncia do teste/Absorbncia do padro) x 200 Pode-se alternativamente recorrer ao uso do fator de calibrao para se determinar a concentrao de triglicrides na amostra analisada, porm, recomendvel a aferio ao menos diria deste fator por meio de padro ou calibrador. 7) VALORES DE REFERNCIA Adultos: 40-200 mg/dL Crianas: 30-125 mg/dL 8) QUESTES: a) Quais as fontes de triglicerdeos para o organismo? b) Discuta duas condies nas quais podemos alterar os nveis de triglicerdeos sricos.

27a AULA: Determinao de Clcio Srico (RELATRIO) Ca-Color AA: Mtodo colorimtrico direto para a determinao de clcio srico

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SIGNIFICADO CLNICO O clcio um elemento muito importante na maioria das reaes da coagulao sangunea e a regulao da excitabilidade das fibras musculares. Sua concentrao em soro e urina est regulada pela ao de fatores tais como nveis de paratormnio, vitamina D e fsforo; observando-se variaes fisiolgicas devidas: idade, sexo, gravidez, atividade fsica, mudanas de estao (pela ao da luz solar). A hipercalcemia est relacionada com diferentes patologias: hipertireoidismo, neoplasias sseas, intoxicao com vitamina D. A hipocalcemia associa-se com alteraes tais como hipotireoidismo, deficincia de vitamina D e deficincia na absoro de clcio. FUNDAMENTOS DO MTODO O clcio reage com a o-cresolftalena complexona (o-CPC) em pH 10,8 produzindo um complexo cor vermelho escuro que se mede em espectrofotmetro 570 nm.
HO2C HO2C HO H3C CO2H N N O CH3 CO2H CO2H

o-cresolftalena complexona

REAGENTES FORNECIDOS Reagente de Cor: soluo de o-cresolftalein complexona e 8-hidroxiquinolina. Tampo: soluo de aminometil propanol (AMP), pH final 10,8. Padro: soluo de clcio 10 mg/dL. AMOSTRA: Soro. PROCEDIMENTO Em trs tubos de ensaio marcados B (Branco), P(Padro) e A (Amostra) colocar: Reagentes/Tubos B P A gua destilada 50 L Tampo 50 L Amostra 50 L Reagente nico 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL Misturar, incubar 5 minutos a temperatura ambiente Absorbncia em 570 nm CLCULOS DOS RESULTADOS: absorbncia da amostra Clcio srico [mg/dL] = absorbncia do padro VALORES DE REFERNCIA: Soro: 8,5 - 10,5 mg/dL. RESULTADOS E CONCLUSO: Compare o valor encontrado na dosagem de clcio com os valores de referncia. Verifique se a concentrao de clcio srico est dentro da faixa de referncia, se indica hipocalcemia ou hipercalcemia. E quais as principais causas de alteraes dessas concentraes.

X concentrao do padro [mg/dL]

28a AULA: Determinao de Fsforo (RELATRIO) FINALIDADE Mtodo para a determinao do Fsforo. Teste colorimtrico, somente para uso diagnstico in vitro.

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ESPECIFICIDADE DIAGNSTICA A homeostase do fsforo mantida principalmente pela funo renal, absoro intestinal, metabolismo sseo e funo da glndula paratireoide. O fsforo possui funo na composio ssea, no equilbrio cido-bsico, no metabolismo de gorduras e carboidratos, alm de estar presente na formao de compostos como os cidos nucleicos. Podemos observar valores aumentados de fsforo nas seguintes condies: insuficincia renal (tuberculose renal, glomerulonefrite crnica, hidronefrose, pielonefrite), hipoparatireoidismo, excesso de vitamina D. A diminuio do nvel de fsforo provm de diversas causas como: hipovitaminose D (raquitismo, osteomalcia), ingesto de anticidos, doenas do fgado, sndrome de Fanconi, hiperparatireoidismo, uso de diurticos tiazdicos. PRINCPIO O fsforo inorgnico reage com molibdato em meio cido, formando um complexo fosfomolibdato. A adio de uma soluo alcalina permite que esse complexo seja reduzido pelo cido Ascrbico, dando origem a um novo complexo fosfomolibdato de cor azul. Paralelamente, as protenas anteriormente precipitadas se dissolvem. REAGENTES Nmero 1 - Redutor - conservar entre 15 e 30 C. Contm: cido ascrbico 55 mmol/L e estabilizante. Nmero 2 - Molibdato - conservar entre 15 e 30 C. Contm: Molibdato de amnio 20 mmol/L. Nmero 3 - Reagente Alcalino - conservar entre 15 e 30 C. Contm: Hidrxido de sdio 8 mol/L. Nmero 4 - Padro - conservar entre 15 e 30 C. Contm: Fsforo 5,0 mg/dL AMOSTRAS Soro obtido livre de hemlise, plasma colhido com heparina e urina de 24 horas. A amostra estvel por 7 dias entre 2 e 8 oC. O soro ou plasma devem ser separados at uma hora aps a colheita, devido a liberao de fsforo hemtico. A acidificao com HCl conserva a urina por 15 dias em temperatura entre 2 e 8 oC. DESCRIO DO PROCESSO TCNICA Marcar 3 tubos de ensaio: B (Branco), A (Amostra), P (Padro) e proceder como a seguir:

Tubos gua destilada Amostra Reagente No 4 Reagente No 1 Reagente No 2

Branco 2,5 mL ---------1 gota 1 gota

Padro 2,5 mL ----100 L 1 gota 1 gota

Amostra 2,5 mL 100 L 1 gota 1 gota

Homogeneizar bem e aguardar 2 minutos. Adicionar: Reagente No 3 2 gotas 2 gotas 2 gotas Absorvncia -----Agitar deixar em repouso por 5 minutos (cronometrar). Efetuar as leituras a 650 nm (640 - 670), acertando o zero com o tubo B (Branco). A reao de cor estvel por 5 minutos.

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DESCRIO DOS CLCULOS Soro Fsforo ( mg/dL ) = Absorbncia da amostra Absorbncia do padro

x 5

LIMITAES DO PROCESSO O desenvolvimento de cor azulada no tubo Branco indica que a gua utilizada de m qualidade, devendo ser analisada com critrio. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Deve ser prtica rotineira do Laboratrio Clnico o uso de soro controle para checar a preciso e exatido das dosagens. Deve ser de 5% o erro mximo permitido em relao aos valores pr-estabelecidos para os controles. VALORES DE REFERNCIA Os valores de referncia em mg/dL, para o presente mtodo foram obtidos atravs da determinao de fsforo em populaes sadias do sexo masculino e feminino. Soro Adultos........................2,5 a 4,8 mg/dL NMERO DE TESTES 140 Testes/100 L de amostra RESULTADOS E CONCLUSO: Compare o valor encontrado na dosagem de fsforo com os valores de referncia. Verifique se a concentrao de fsforo srico est dentro da faixa de referncia, se indica hipofosfatemia ou hiperfosfatemia. E quais as principais causas de alteraes dessas concentraes. QUESTO: 1. Quais os hormnios responsveis pela regulao dos nveis de fsforo?

29a AULA: Determinao de Magnsio no Soro (RELATRIO) FINALIDADE Mtodo para a determinao do Magnsio. Teste colorimtrico, somente para uso diagnstico in vitro.

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ESPECIFICIDADE DIAGNSTICA O magnsio um eletrlito encontrado principalmente nos lquidos intracelulares e ossos. Participa como cofator em vrios sistemas enzimticos, no metabolismo dos carboidratos, contrao muscular, coagulao sangunea e indispensvel na preservao da estrutura molecular do DNA, RNA e ribossomos. Nveis de magnsio diminudos no plasma esto associados com tetania, fraqueza, desorientao e sonolncia, que refletem a deficincia do magnsio ionizado. Quadros clnicos de convulses associados hipocalcemia e hipomagnesemia, atribudos a um defeito seletivo de absoro intestinal do magnsio, acentuam a importncia da dosagem deste on em pediatria. As causas mais frequentes de concentraes baixas de magnsio so: diarria crnica, pancreatite aguda, alcoolismo, hepatite crnica, diabetes mellitus, hipoparatireoidismo, hipertireoidismo, hiperaldosteronismo. A hipermagnesemia, embora rara, pode ser registrada nos casos de insuficincia renal, desidratao grave, tratamento intensivo com sais de Magnsio. PRINCPIO DE AO Metodologia: Mann Yoe. O corante de Mann e Yoe, em pH alcalino e em presena de magnsio desenvolve colorao vermelha. A intensidade de cor vermelha do complexo proporcional concentrao de magnsio. O mtodo no requer desproteinizao, sendo mais sensvel do que o mtodo do Amarelo de Titan, permitindo assim o uso de somente 20 microlitros da amostra a ser analisada, o que torna esta tcnica excelente para uso em pediatria. Alm de sua simplicidade, o mtodo no sofre interferncia do Gluconato de clcio. A presena de agentes tensoativos elimina a interferncia de soros lipmicos. REAGENTES Nmero 1 - Tampo - conservar entre 15 e 30 C. Contm: Tetraborato de sdio 30 mmol/L e conservador. Nmero 2 - Reagente de Cor - conservar entre 15 e 30 C. Contm: Magon sulfonado 2,8 mmol/L e solubilizante. Nmero 3 - Padro - conservar entre 15 e 30 C. Aps o manuseio conservar entre 2 e 8 C para evitar evaporao. Contm Magnsio 2 mg/dL AMOSTRA: Soro obtido livre de hemlise. DESCRIO DO PROCESSO Marcar 3 tubos de ensaio: B (Branco), A (Amostra), P (Padro) e proceder como a seguir:

B P A Reagente No1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL Reagente No 2 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL Homogeneizar bem Amostra 20 L o Reagente N 3 20 L Absorbncias em 500 nm -

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CLCULOS

Magnsio [mg/dL] =

absorbncia da amostra absorbncia do padro

X 2

VALORES DE REFERNCIA Os valores de referncia em mg/dL, para o presente mtodo, foram obtidos atravs da determinao de magnsio em populaes sadias do sexo masculino e feminino. Soro ou plasma: 1,6 a 2,4 mg/dL Para converter os valores de mg/dL em mmol/L (SI) multiplicar por 0,41. RESULTADOS E CONCLUSO: Compare o valor encontrado na dosagem de magnsio com os valores de referncia. Verifique se a concentrao de magnsio srico est dentro da faixa de referncia, se indica hipermagnesemia ou hipermagnesemia. E quais as principais causas de alteraes dessas concentraes. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1 - MANN, C. K. & Yoe, J. H.: Ann. Chem. 28:202, 1956. 2 - MANN, C. K. & Yoe, J. H.: Anal. Chim. Acta. 16:155, 1957. 3 - RICE, E. W. & LAPARA, C. Z.: Clin. Chim. Acta. 10:260, 1964. 4 -WEISSMANN, N. & PILEGGI, V. J. (1974) in Clinical Chemistry Principles and Techinics 2nd. Ed. Henry R., Cannon, D. C. e Winkelman, J. W. p. 678. Haper and Row Publishers. 5 - TONKS, D. B., Clin. Chem. 9:217, 1963.

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