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Apontamentos de Enzimologia, Licenciatura em Bioqumica

Aula 2 Introduo o conceito de enzim. Breves nots histo rics

Aspectos Histricos Enzimas


Os enzimas so catalisadores aceleram a velocidade das reaes sem que eles prprios sofram qualquer alterao permanente. Cada reaco que tem lugar na clula catalisada pelo seu prprio enzima, logo, numa dada clula, existe um grande nmero de enzimas. Na ausncia de enzimas a maior parte das reaces do metabolismo celular no ocorreriam, nem mesmo num perodo de vrios anos e a vida como ns a conhecemos, poderia nem existir. Pode-se por a questo: Quantos enzimas existem numa clula?

1878 in Yeast Kuhne 1897 Filtrados de extractos cell free Buchner 1894 Hiptese chave-fechadura Emil Fischer

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1926 Primeiro enzima (urease) a ser cristalizado Summer 1920s Desenvolvimento da ultracentrfuga Svedberg 1960 Sequncia do ribonuclease enzima que catalisa a hidrlise do cido ribonucleico 1965 Estrutura tridimensional (cristalografia de Raio-X) do lisosima enzima de clivagem 50s-60s Flexibilidade estrutural 1958 induced-fit (Teoria do encaixe induzido) Koshland

1961

Modelo

alostreo

(actividade

modulada

por

modificaes

fisiolgicas) Monod 1968 (Kempner e Miller) O meio celular heterogneo com elevado contedo em protenas (100-300mg/ml em eucariotas), abundncia de superfcies membranares e citoesqueleto 1969 sntese qumica do ribonuclease Merrifield 1973/74 Kacser e Burns/Heinrich e Rapoport O estado estacionrio de fluxos metablicos e de concentraes de metabolitos na clula so propriedades do sistema

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Aula 3 Outrs moleculs com ctividde ctl tic. Proprieddes dos enzims.

Molculas com actividade cataltica Ribozimas


Molcula de RNA com capacidade autocataltica. Tal como os enzimas proteicos, possuem um centro activo que se une especificamente a um substrato e que facilita a sua converso num produto. Os ribozimas so menos versteis que os enzimas proteicos. Exemplos: Ribozimas cabeas de martelo

Potencial teraputico Biossensores Genmica funcional Descoberta de genes

Anticorpos Catalticos
Anticorpos que podem catalisar uma ampla variedade de reaces qumicas. So caracterizados pela elevada especificidade para os substratos, compartilhando muitos aspectos mecansticos com os os enzimas. Exploram a capacidade de ligao (reconhecimento molecular) modulao do substrato (tipo de relao antignio-anticorpo) Construo de um anlogo do estado de transio So bons em reaces simples mas so limitados por: preciso e separao. Aplicaes: destoxificao por cocana

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Enzimas Artificiais
Servem para reproduzir a funo do enzima, mimetizar uma reaco qumica: 1. Transformao qumica ligao covalente; 2. Reconhecimento molecular Mimic binding (H, hidrfoba, inica) 3. Recriao do centro activo de um enzima. A ter em conta: Tem de ser um passo inicial de ligao Dimenso: importante para a ligao e libertao do produto

Exemplos: Ciclodextrinas Criptandos ligandos multi-dentados que ligam caties Anticorpos catalticos

Propriedades dos Enzimas Elevado poder cataltico


Grande aumento da velocidade da reaco. Velocidades na ordem de 1017 em relao reaco no catalisada.

Especificidade
A maioria dos enzimas so bastante especficos tanto para a natureza do substrato que utilizam, tanto para a reaco que catalisam. As reaces catalisadas enzimaticamente raramente do origem a produtos alternativos. A especificidade varia de enzima para enzima. Uma especificidade mais baixa, por exemplo, comumente observada em enzimas de degrao.

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Existem vrios tipos de especificidade: Especificidade de ligao baixa (peptidases, fosfatases) Especificidade de molcula intermdia (hexocinase) Especificidade de grupo absoluta (urease)

Regulao
A actividade cataltica de muitos enzimas pode variar em resposta s concentraes de outras substncias que no os seus substratos. Estes processos regulatrios incluem o controle alostreo, modificao covalente e variao da quantidade de enzima utilizado.

Aula 4 Nomencltur e clssifico de enzims. Exemplos.

Nomenclatura
Em geral, adiciona-se o sufixo ase ao substrato sobre o qual actua (ex: urease catalisa a decomposio da ureia), ou ao nome da reaco que o enzima catalisa (ex: lcool desidrogenase catalisa a desidrogenao do lcool). No entanto existem excepes. Por exemplo pepsina e tripsina enzimas digestivos.

Classificao
Os nomes dos enzimas so dados seguindo certas regras bem definidas. Os seis tipos principais de reaces catalisadas por enzimas so: EC 1 Reaces de oxidao-reduo, catalisadas por oxidoreductases; EC 2 Reaces de transferncia de grupo, catalisadas por transferases; EC 3 Reaces hidrolticas, catalisadas por hidrolases; Pgina 5 de 84

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EC 4 Reaces de eliminao nas quais formada uma dupla ligao, catalisadas por liases; EC 5 Reaces de isomerizao, catalisadas por isomerases; EC 6 Reaces nas quais duas molculas se juntam custa de energia (normalmente ATP), catalisadas por ligases.

O nome sistemtico completo de um enzima no s mostra o tipo de reaco catalisada, mas descreve se o substrato(s) adicionou qualquer outra informao importante.

Exemplos: EC 2.3.1.17 (Aspartato N-acetiltransferase) 2 transferase 2.3. acetiltransferase 2.3.1. transferncia de grupo sem ser aminoacetil 2.3.1.17 17 enzima com estas caractersticas EC 1.1.1.1 (lcool desidrogenase) 1 Oxidoreductase 1.1 dador (lcool) 1.1.1 aceitador (NAD+) Nome sistemtico: lcool: NAD+ oxidoreductases (dador:aceitador) Nome trivial (a usar): lcool desidrogenase
Enzima

ATP + Glu

6-P-Glucose

ATP: Glucose 6-fosfato transferase Classificao dos enzimas do tipo EC a.b.c.d. onde: a) O primeiro nmero indica o tipo de reaco catalisada e pode tomar valores entre 1 e 6, de acordo com a classificao feita anteriormente. b) O segundo nmero indica a subclasse, que normalmente especifica o tipo de substrato ou, mais precisamente, a ligao clivada. Pgina 6 de 84

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c) O terceiro nmero indica a sub-subclasse, permitindo uma definio ainda mais precisa da reaco catalisada em termos do tipo de aceitador de electres (no caso dos oxidoreductases, por exemplo) ou do tipo de grupo removido (nas liases, por exemplo). d) O quarto nmero indica o serial number do enzima na sua sub-subclasse.

Sistemas multienzimticos
Multienzimas so protenas que exibem mais do que uma actividade cataltica. Para efeitos de nomenclatura, a recomendao que, quando est a ser atribuda mais do que uma nica actividade cataltica, deve-se referir a um sistema multienzimtico. Assim, enzimas multifuncionais tero mais de um nmero de EC e posio no esquema de classificao.

Aulas 5 a 8 Estrutur dos enzims. Estrutura dos enzimas


O principal objectivo de uma investigao estabelecer a estrutura tridimensional completa de um enzima a nvel atmico (ou quase atmico). Esta informao fornece as bases necessrias no s para perceber as propriedades detalhadas do enzima, especialmente a sua actividade cataltica, mas tambm para vrias aplicaes: testar modelos de estruturas

macromoleculares, para propor um mecanismo de catlise, para explorar Pgina 7 de 84

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semelhanas entre enzimas, para o desenho racional de drogas e para a explorao do enzima para fins industriais. Supondo que est disponvel uma fonte de enzima, as principais etapas de trabalho so: 1. Determinao da massa molecular relativa, Mr; 2. Determinao aminocidos; 3. Determinao das estruturas secundria e terciria; 4. Determinao da estrutura quaternria. da estrutura primria e composio em

O termo estrutura primria refere-se sequncia de aminocidos numa cadeia polipeptdica. Este tipo de estrutura contm apenas informao unidimensional e diz-nos pouca coisa acerca da estrutura tridimensional. Os termos estrutura secundria e terciria referem-se a diferentes aspectos da estrutura tridimensional: a estrutura secundria refere-se a elementos regulares da estrutura, tais como a hlice- e a folha-, nas quais esto envolvidas interaces entre regies prximas. A estrutura terciria refere-se ao folding de uma cadeia, no qual pores da molcula bem separadas na sequncia so trazidas para mais prximo uma da outra. O termo estrutura quaternria refere-se ao arranjo de subunidades individuais num enzima que contm mais do que uma subunidade.

Determinao de Mr

Enzimas so macromolculas com valores de Mr que esto num intervalo de cerca de 10 000 at alguns milhes. As determinaes dos valores de Mr dos enzimas nos dias so feitas, hoje em dia, recorrendo a uma destas tcnicas: 1. Ultracentrifugao; 2. Filtrao em gel; 3. Electroforese SDS Page; 4. Espectrometria de massa.

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Destes mtodos, (2) e (3) so semi-empricos e possveis comparaes so feitas com molculas standard de massa molecular conhecidas. No entanto, no mtodo (1), Mr pode ser calculada usando equaes derivadas de princpios prvios. As tcnicas recentes da espectrometria de massa (4) podem fornecer valores de M r extremamente precisos. A massa molecular relativa de um enzima uma pea de informao fundamental uma vez que nos permite converter a concentrao de uma soluo de unidades de massa por volume (mg.cm-3 por exemplo) para unidades de molaridade. Esta informao pode ento ser utilizada de vrias maneiras, tais como: consideraes de composio (quantos aminocidos de um dado tipo esto presentes por molcula de enzima?), actividade cataltica (quantas molculas de substrato so formadas por uma molcula de enzima por segundo?), e ligao do ligando (quantas molculas de ligando esto ligadas por molcula de enzima?). Medies de Mr feitas na ausncia e presena de agentes desnaturantes iro mostrar se o enzima ou no composto por subunidades e pode indicar o nmero de subunidades. Por exemplo, o lactato desidrogenase da levedura tem uma Mr de 140 000 numa filtrao em gel, mas numa electroforese em SDS-Page a Mr perto de 35 000, indicando que este enzima um tetrmero (4 subunidades).

Determinao da estrutura primria


A estrutura primria caracterizada pelo nmero de aminocidos componentes da sua cadeia e a ordem em que eles se encontram. A estrutura primria responsvel pelas estruturas de ordem superior que a protena exibe na sua forma celular ou nativa. Duas estratgias distintas so empregues para determinar a estrutura primria de uma protena ou enzima. O mtodo directo opera a nvel da protena. O mtodo indirecto opera ao nvel do gene (DNA) e usa o cdigo gentico para traduzir a sequncia do cido nucleico no seu produto correspondente. Pgina 9 de 84

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Mtodo directo

Mtodo indirecto

Determinao da estrutura secundria e terciria


O conhecimento da estrutura primria de um enzima no nos permite explicar propriedades como poder cataltica e especificidade. Temos tambm de considerar como que a cadeia polipeptdica se dobra. A cristalografia de raio-X tem sido, de longe, a tcnica mais utilizada para a determinao da estrutura tridimensional dos enzimas. No entanto, a tcnica de ressonncia magntica nuclear de alta resoluo (RMN) tem sido desenvolvida ao longo dos anos e agora capaz de fornecer informaes acerca da dinmica das protenas, especialmente aquelas com M r superior a 25 000. A estrutura secundria caracterizada por estruturas especficas: Hlice- Consiste num hlice direita formada e estabilizada por ligaes de hidrognio.
Hlice-

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Folha- Estrutura tambm mantida por ligaes de hidrognio entre as unidades peptdicas. Neste caso, as ligaes so estabelecidas diferentes, entre cadeias e

polipeptdicas

distendidas

paralelas, ou entre segmentos distantes e distendidos de uma mesma cadeia.


Folha-

estrutura

terciria

descreve

conformao tridimensional que a molcula assume em soluo, explicando o dobramento da cadeia peptdica com os enrolamentos, dobras e voltas que a compem e que a levam a uma forma geral globular.
Estrutura terciria

As interaces responsveis pela estrutura tridimensional dos enzimas so todas as foras fracas: ligaes de hidrognio, foras electrostticas, foras de Van der Waals e ligaes hidrfobas.

Determinao da estrutura quaternria


A estrutura quaternria diz respeito

organizao presente nas protenas e descreve quantos e quais monmeros compem a molcula e como esto associados. A maior parte dos enzimas consistem num nmero de subunidades mantidas juntas por foras no covalentes so oligmeros.
Estrutura quaternria

Podem-se fazer vrias questes acerca dos enzimas oligomricos: 1. Quantas subunidades existem? E de que tipo? 2. Como esto as subunidades organizadas? 3. Que foras esto envolvidas? 4. Qual o significado, para o enzima, de ter mltiplas subunidades?

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1. Quantas subunidades existem? E de que tipo? a. Estudos de Massa Molecular Uma indicao de que um enzima consiste em mltiplas subunidades fornecido por resultados de massa molecular realizados na ausncia e presena de agentes desnaturantes (exemplo: cloreto de guanidina). O lcool desidrogenase de levedura, por exemplo, por ultracentrifugao apresenta um Mr de 145 000. No entanto, sob condies desnaturantes, obtido um valor de Mr de 36 000, sugerindo que este enzima consiste em 4 subunidades (145/36 ~ 4) provavelmente idnticas. b. Estudos de Cross-Linking Outro dos mtodos utilizar um agente de cross-linking, como o dimetilsuberimidato. Este composto reage com os pares de cadeias laterais de Lisina, que praticamente se encontram superfcie do enzima, para criar ligaes cruzadas que desnaturantes. Digamos que fazemos reagir um enzima com 4 subunidades com um agente de cross-linking: ser formada uma mistura de espcies que podem ser separadas por electroforese em gel de poliacrilamida, dando um so estveis na presena de agentes

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total de 4 bandas. O nmero de bandas corresponde ao nmero de subunidades. c. Estudos de ligao de ligandos O nmero de stios de ligao num enzima para um substrato ou outro ligando pode ser utilizado para indicar o nmero de subunidades. Por exemplo, o lcool desidrogenase de levedura liga 4 mol de NADH, enquanto o de fgado liga 2 mol de NADH, o que indica que o primeiro um tetrmero (4 subunidades) e o segundo um dmero (2 subunidades).

d. Estudos de Simetria O tipo de simetria de um dado enzima, deduzida por cristalografia de raio-X pode, por vezes, ser usada para determinar o nmero de subunidades num enzima, ou pelo menos, usada para excluir vrias estruturas de subunidade propostas.

2. Como esto as subunidades organizadas? A disposio das subunidades num enzima oligomrico podem ser usualmente deduzidas pelo tipo de simetria que as molculas possuem (atravs da cristalografia de raio-X). No geral, o arranjo das subunidades tal que permite o mximo de contacto entre subunidades. Assim, para um enzima tetramrico, como o lactato desidrogenase, o arranjo geomtrico preferencial o tetradrico. Para um enzima hexamrico, o arranjo preferido ser o octadrico.

3. Que foras esto envolvidas? As foras envolvidas na associao de subunidades so as fracas (no-covalentes) ligaes de hidrognio, foras electroestticas, foras de van der Waals e foras hidrfobas. As superfcies envolvidas na associao de subunidades so, na sua grande maioria (+ de 67%) nopolares.

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4. Qual subunidades?

significado,

para

enzima,

de

ter

mltiplas

H, pelo menos, 4 possveis razes que explicam que vantajoso para um organismo possuir enzimas com mltiplas subunidades: a) A presena de mltiplas subunidades confere

possibilidades adicionais ao enzima de regulao da actividade cataltica; b) A combinao de diferentes tipos de subunidades num largo complexo permite uma variao nas propriedades catalticas; c) Aumento da estabilidade; d) Associaes geram grandes estruturas com determinada simetria que podem dar origem a funes biolgicas especficas com economia gentica (menos probabilidade de erro).

"Economia gentica"

Porque so os enzimas to grandes?

O enzima tem de ter rea superficial suficiente para se ligar a mltiplos locais na clula e para se integrar nas suas funes metablicas

Necessidade de mltiplas interaes fracas para dirigir a catlise

Flexibilidade estrutural (Enzima em soluo)


Fenmeno crucial para funo (alosteria e cooperatividade). Esta mudana conformacional pode ser monitorizada por RMN e outras tcnicas, tais como: CD, Raios-X e fluorescncia.

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As rotaes ocorrem em torno de ligaes simples, levando a alteraes conformacionais que se tornam no passo limitante.

Caractersticas Estruturais dos Enzimas


Estruturas globulares empacotadas; Poucas cavidades preenchidas com H2O; Alguns Asp no interior e Leu no exterior; Mltilplos domnios; Mr = 30 000 enzima com uma cadeia polipeptdica ou subunidade Mr > 50 000 enzimas com vrias cadeias polipeptdicas ou subunidades

Classificao de Estruturas
Entre os vrios sistemas de classificao para os elementos estruturais em protenas inteiras ou em domnios individuais, o mais utilizado tem sido o sistema de quatro classes introduzido por Levitt e Chothia. As quatro classes de estrutura da protena so os seguintes: 1. Enzimas s tm estrutura em hlice- (Exemplos: regio varivel das imunoglobulinas); 2. Enzimas tm, maioritariamente, estrutura em folha- (Exemplos: regio fixa e varivel das imunoglobulinas);

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3. Enzimas / tm segmentos mistos ou alternados de hlice- e folha- (Exemplos: cinases e desidrogenases); 4. Enzimas + tm estruturas em hlice- e folha- que esto separadas ao longo da cadeia polipeptdica (Exemplos:

termolisina, lisozima e ribonuclease).

Famlias de folds
Existem 9 superfolds (30% das protenas)

Dependendo da funo, os cinases tm um arranjo de folds caractersticos.

Folding e Unfolding Unfolding de Enzimas


A 60 kJmol-1). forma enrolada compacta de um enzima geralmente termodinamicamente mais estvel que um enzima modificado (diferena de 20-

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Assim, a maioria dos enzimas podem ser facilmente desenrolados (unfolded) e dissociados (no caso de enzimas com mltiplas subunidades) por uma variedade de condies: valores de pH extremos, calor, adio de solventes orgnicos, agentes caotrpicos e altas concentraes de ureia e cloreto de guanidina. A perda da estrutura tridimensional de um enzima enrolado conhecida como desnaturao. A desnaturao de um enzima pode ser seguida pela perda de actividade, ou alterao de parmetros-CD e fluorimetria.

Folding de Enzimas
Em 1960, Anfinsen realizou uma experincia importante que mostrou que um enzima desnaturado podia ganhar de volta a sua estrutura folded quando o agentes desnaturante era removido experincia com mercaptoetanol (para quebrar ligaes persulfureto) e ureia (enzima reduzido). Esta experincia levou concluso de que a estrutura primria de um enzima contm toda a informao necessria para o levar estrutura tridimensional. Dogma de Anfinsen nas condies ambiente (temperatura, concentrao de solvente) s quais ocorre o folding, a estrutura nativa estvel e cineticamente acessvel com um mnimo de energia livre.

O folding de enzimas explica a especificidade de ligandos. Deficincia de folding leva ao estudo da 2 metade do cdigo gentico

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Enzimas em Sequncia (e Regulao)

Mr = 50 000

massa elevada

interaes adicionais

Canalisao ("channeling") de substratos

estaro ligadas regulao

Channeling processo de transferncia directa de um intermedirio metablico entre os centros activos dos enzimas que catalisam duas reaces sequenciais numa via biossinttica: o produto de uma reaco serve de substrato para a reaco seguinte.

Aula 9 Cofctores. Mecnismos de Ctlise Enzimtic.

Cofactores
Muitos enzimas requerem um componente no-proteico para apresentarem actividade esse componente denomina-se cofactor.

derivados de vitaminas

Orgnicos

flavina

Cofactores

heme Mg2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+

Inorgnicos

Ies metlicos

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Grupo prosttico componente de origem no proteica essencial para a actividade do enzima. Cofactores parte integrante do enzima (no saem: ligam-se permanentemente). Orgnicos Coenzimas metalo-orgnicos complexos participam orgnicos realmente ou na

que

catlise. Podem ser dadores ou aceitadores de

Grupos prostticos

Coenzimas

protes ou agentes nuclefilos que participam em reaces de transferncia de grupo. Ligam-se fraca e no permanentemente aos enzimas.

Um enzima contendo um cofactor ou grupo prosttico denominado holoenzima. Quando o cofactor removido, passa a denominar-se apoenzima. Metalo-enzima enzima que inclui na sua estrutura proteica, ies metlicos. Neste caso o metal, com funes catalticas e/ou estruturais, est geralmente no centro cataltico.

Mecanismos de Catlise Enzimtica O que ?


uma sequncia de complexos com enzima durante a converso de substratos a produtos. Pgina 19 de 84

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Uma cintica de converso entre esses produtos. Tem de se ter em conta a estrutura de cada um dos complexos.

Estratgias de Catlise

Efeito de proximidade

Efeito de orientao

Permite interaes entre os substratos e grupos funcionais para a reaco

H um aumento de velocidade cerca de 5 vezes

Permite sobreposio de orbitais electrnicas

H um aumento de velocidade cerca de 100 vezes

Catlise: cido-base: resduos de aminocidos intervenientes dependem do pKa da cadeia lateral. Este pKa no microambiente do centro activo pode ser diferente do aminocido isolado. Covalente: h um complexo intermedirio com ligao covalente entre o enzima e o substrato. As cadeias laterais funcionam como nuclefilos. Por estabilizao do Estado de Transio: interaces electroestticas, ligaes de hidrognio e organizao geomtrica do centro activo podem favorecer associao com estado de transio (mais forte do que com substratos). Exemplo: anticorpos catalticos.

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Aula 10 e 11 Purifico de Enzims. Exemplo

Porqu purificar enzimas?


A compreenso detalhada do comportamento de um enzima num sistema complexo (num organelo subcelular ou na clula) passa pelo estudo das suas propriedades num sistema mais simples. A purificao de enzimas pode ter desvantagens em alguns enzimas, como por exemplo os que se encontram ligados membrana e que na ausncia de fosfolpidos ou detergente ficam inativos. Os estudos com enzimas purificados permitem estudar: A especificidade para o substrato; Os parmetros cinticos da reao; Modos de regulao da atividade enzimtica; E determinar a estrutura; O mecanismo de catlise; Aplicaes em medicina, indstria e investigao (por ex. desenho de drogas).

Objectivos da purificao de Enzimas


Mximo rendimento (baseado na percentagem de atividade do enzima purificado comparada com a atividade total do extrato inicial) Mximo de atividade cataltica (o enzima no dever estar inativo ou degradado) Mximo de pureza (no deve conter outros enzimas ou

macromolculas) Antigamente pensava-se que a cristalizao era uma prova da pureza do enzima. Hoje sabe-se que alguns enzimas, mesmo na forma cristalina, no se encontram puros. Na maior parte dos processos de purificao, a cristalizao no includa, a no ser que se pretenda determinar a estrutura tridimensional do enzima. Pgina 21 de 84

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Estratgia

O procedimento a ser adotado para um dado enzima envolve escolhas como: i) ii) iii) A fonte do enzima Mtodos de homogeneizao Mtodos de separao

O progresso de purificao deve ser registado numa tabela. i) Fonte do enzima (Tecidos animais; Plantas; Microrganismos bactrias, leveduras; Clulas em cultura; Fraes subcelulares mitocndrios, membranas, entre outros)

a. Abundncia do enzima A fonte deve possuir o enzima em grandes quantidades. Se no for possvel obter grandes quantidades pode-se manipular as condies de uma dada cultura de forma que a produo do enzima seja aumentada. Apesar de em alguns casos ser necessrio utilizar a espcie WT, tambm se pode utilizar tecnologias de DNA recombinante e produzir o enzima pretendido,

independentemente da fonte. A produo de enzimas de clulas eucariotas em clulas procariotas pode apresentar problemas, uma vez que as clulas procariotas no tm a Pgina 22 de 84

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maquinaria necessria para que ocorra transformaes pos-traducionais. Assim, o ideal ser produzir o enzima numa clula eucariota mais simples, como as leveduras, que apresentam crescimento rpido e no precisam de muitos nutrientes.

b. Disponibilidade Uma fonte com abundancia razovel de enzima pode no existir e portanto, nestes casos necessrio haver um compromisso entre a disponibilidade e a abundncia do enzima.

c. Estudos comparativos Pode-se estudar o enzima numa espcie diferente da pretendida. Para tal necessrio o conhecimento das propriedades dos isoenzimas.

d. Localizao subcelular Se a reao catalisada por um dado enzima apenas ocorrer numa dada localizao da clula necessrio haver, na purificao desse enzima, um passo de homogeneizao ou de extrao. Quando o enzima existe em mais do que um lugar na clula necessrio proceder a um fracionamento celular. O fracionamento celular normalmente conseguido atravs de centrifugaes sucessivas (velocidade de rotao cada vez maiores), em que os organitos maiores (ncleo, mitocndrio,) sedimentam primeiro

ii)

Mtodos de homogeneizao Existem diversos mtodos para homogeneizar clulas e libertar o seu contedo; Dependem do tipo de tecido ou organismo utilizado como fonte de enzima; A utilizao de uma soluo tampo de extrema importncia.

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a. Tecidos de mamferos A falta de uma parede celular rgida permite uma fcil homogeneizao do tecido que utilizado como fonte do enzima. A extrao tem de ser efetuada com uma soluo isotnica (quando importante evitar a rotura de organelos, como os vacolos) ou com uma soluo hipotnica. Em alguns casos pode ser necessrio adicionar inibidores de proteases ou agentes redutores como o ditiotreitol. b. Plantas, fungos e bactrias As clulas tm uma parece celular rgida e portanto so necessrios mtodos mais abrasivos como areia, congelao/ descongelao, presso mecnica prolongada (com ou sem esferas de vidro). Tambm podem ser utilizados enzimas hidrolticos Nas plantas a homogeneizao pode criar alguns problemas pois, durante este processo, pode ocorrer a libertao do contedo dos vacolos (que so acdicos e contm proteases), que poder danificar o enzima pretendido. A adio de um tampo apropriado e de inibidores de proteases pode evitar tal danificao. iii) Mtodos de separao As principais propriedades dos enzimas que podem ser exploradas nos mtodos de separao so: Tamanho ou massa Polaridade (carga ou hidrofobicidade) Solubilidade (pH, fora inica) Locais de ligao especfica a outras molculas

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Como avaliar o processo de purificao?


Anlise da pureza do enzima Avalia-se o processo de separao atravs de mtodos de separao, mas numa escala analtica. Exemplos: eletroforese, cromatografia (HPLC), espectrometria de massa, cristalografia, Anlise da atividade cataltica o Testar a atividade do enzima nas diferentes fraes; o Testas cofatores e inibidores o Construir uma tabela de purificao: em cada passo da purificao, medir o volume da soluo de enzima, a concentrao de protenas e a atividade do enzima (velocidade de converso do substrato em produto em condies timas de temperatura e pH, com concentraes saturantes de substrato e cofatores necessrios). Exemplo:

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A bioinformtica no planeamento da purificao de um enzima


i) A informao na sequncia de aminocidos a. Massa molecular do enzima b. Carga versus pH, ponto isoeltrico (Importante na escolha do tampo, da resina numa cromatografia de troca inica ou numa precipitao no ponto isoeltrico) c. Coeficiente de absoro molar (a 280 nm, a absorvncia de uma protena devida absoro dos seus resduos de Trp, Tyr e Cys; mtodo utilizado na determinao da concentrao de uma protena purificada ((280nm) = (Trp x 5500) +(Tyr x 1490) +(Cys x 125)) d. Contedo em cistenas (enzima com muitas Cys adio de DTT nos tampes previne a formao de ligaes persulfureto, intra- e intermoleculares e. Estabilidade ( possvel estimar o tempo de semivida de uma protena in vivo e o ndice de instabilidade in vitro: se um enzima previsivelmente instvel in vitro necessrio baixas temperaturas e inibidores na sua purificao f. Hidrofobicidade e regies membranares (a previso de regies membranares num enzima afeta a estratgia de purificao do mesmo) g. Semelhana na sequncia sugere homologia e possvel afinidade para cofatores (a semelhana do enzima em estudo com outros j caracterizados permite inferir a homologia com membros da mesma famlia e a dependncia de determinados substratos e cofatores) h. Potenciais locais de modificaes ps-traducionais (PTM) - H motivos conhecidos de PTM: glicosilao (NXS ou NXT); biotinilao (AMKM); zinc finger (lig. metais) (F/YXCX2-4CX3 FX5 LX2HX3-4HX5)... Se um enzima glicosilado (ex. invertase) pode ser purificado por afinidade com uma coluna de lectina i. Solubilidade na sobre-expresso em E. coli (Alguns estudos propem a previso da solubilidade de um enzima aps sobre-expresso em E.

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coli; no entanto, manipulao das condies de crescimento permitem alterar esta solubilidade)

ii)

O que (ainda) no se pode prever a partir da sequncia de aminocidos a. Multi-subunidades; homomultmeros, heteromultmeros? Mesmo

com previso da estrutura do enzima impossvel prever se o mesmo existe em soluo como monmero ou como um multmero (ex. hexmero). Muitos enzimas existem na clula como multi-complexos e a sua purificao depende em muito da ligao aos seus interatuantes b. Propriedades de precipitao (Ainda no possvel prever que

concentrao de sulfato de amnio deve ser utilizada na precipitao de determinada protena)

iii)

Recursos bioinformticos. Exemplo: ProtParam, do ExPASy

(Expert Protein Analysis Software)

Como selecionar o mtodo de purificao?


Cada enzima necessita de uma estratgia especfica de purificao. O mtodo a utilizar depende da escala de preparao, do rendimento exigido, do tempo disponvel (e custos associados) e do equipamento e recursos disponveis.

Desenhar uma estratgia de purificao


i) Definir objetivos (pureza, atividade, quantidade rendimento); ii) desenvolver ensaios de atividade (para rpida deteo do enzima recuperado em cada passo); iii) Minimizar o uso de aditivos (podem requerer um passo adicional de remoo ou interferir com a atividade); iv) Remover (atempadamente) contaminantes que possam degradar ou inativar os enzimas, por exemplo, proteases;

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v) Utilizar

tcnicas

diferentes

em

cada

passo

(tirar

partido

das

caractersticas da protena para a purificao (tamanho, carga, hidrofobicidade, especificidade para ligandos...) vi) Minimizar o n de passos (evitar perda de rendimento) vii) Combinar passos de maneira lgica (reduz o tempo de purificao, sem comprometer a qualidade do produto final)

Exemplo
A purificao de enzimas um processo dispendioso e nem todos os enzimas podem ser purificados. necessrio, portanto, uma investigao bsica sobre a biologia celular e as vias metablicas em que os enzimas participam, a identificao do gene (e da sua sequncia) que codifica para o enzima.

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Aula 12 Cinetic Enzim tic. Introduo.

Classificao de uma Reaco


Molecularidade: define o nmero de molculas que so alteradas na reao, ou seja, o nmero de molculas que reagem. o Reao unimolecular AP o Reao biomolecular A+ B P o Reao trimolecular (raro) A+ B +C P Ordem: descrio cintica da reao que define o nmero de termos de concentrao que devem ser multiplicados para obter a velocidade da reao o Reao de 1ordem: a velocidade apenas proporcional a uma concentrao (V [A]); o Reao de 2 ordem: a velocidade proporcional multiplicao de duas concentraes ou ao quadrado de uma concentrao (V [A][B] ou V [A]2); o Reao de 3 ordem: () V [A][B][C]. Para uma reao que ocorre num nico passo, a ordem, geralmente, igual molecularidade. Numa reao que ocorre em vrios passos, a ordem igual molecularidade em cada passo.

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Cintica de Reaes de 1 ordem


A velocidade, expressa por: [ ] Integrando:

, de uma reao de 1 ordem ( [ ] [ ]

) pode ser

[ ]

[ ]

[ ]

Obtm-se:
[ ] [ ]

ou

[ ] [ ]

Como [A]0 = constante Representando

[ ]

[ ] em funo de

[ ] [ ]

o Vida mdia,

: tempo necessrio para reduzir a concentrao de [ ] [ ]

reagente a 50%

Cintica de Reaes de 2 ordem


A velocidade, expressa por: [ ] Se [ ] [ ] [ ] [ ][ ] , de uma reao de 2 ordem ( ) pode ser

[ ] esta reao complicada.

Assim, considera-se [ ]

, logo [ ]

[ ]

e[ ]

[ ] Pgina 30 de 84

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A velocidade dada, ento, por: [ ] [ ][ ] [ ] Integrando:


[ ]
[ ] [ ]

[ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ]

[ ]

[ ]

em funo do tempo uma reta com coeficiente angular

[ ]

[ ]

Casos especiais
o [ ] o [ ]
[ ] cintica de pseudo 1ordem [ ]

[ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ]

Integrando:
[ ]
[ ] [ ]

[ ]

em funo do tempo uma reta com coeficiente

angular

Reaes reversiveis
Por exemplo:

No inicio, t=0, [ ] Quando t=t, [ ]


[ ]

[ ] e[ ] [ ]

e[ ]
[ ]

[ ]

[ ] Integrando: [ ] [ ] Pgina 31 de 84

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No equilbrio, a velocidade global nula, logo [P] t constante, ou seja:


[ ] [ ]

A constante de equilbrio (global) : [ ] [ ] [ ] [ ] ( )

Combinando as equaes anteriores, obtm-se:

Velocidade para uma reao de 1 ordem

Pode determinar-se representando e atraves de [ ]

: Obtm-se em funo do tempo;


( )

duas duas

equaes incgnitas

com

Sistema possvel e

Pr-equilibrio

determinado!

Trata-se de uma cintica complexa, a menos que se admita que [AB] constante
durante um perodo suficientemente longo da reaco (aproximao de estadoestacionrio) [ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ]

A velocidade de reao dada por: [ Existem duas possibilidades: ]

[ ][ ]

Quebra rpida de

[ ][ ]

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Quebra lenta de

[ ][ ]

[ ][ ]

[ ][ ]

Influncia da Temperatura na velocidade de reao


A temperatura deve ser sempre controlada em ensaios cinticos, no entanto a sua variao pode ser informativa.

Equao de Arrhenius

Cada reao dever ultrapassar uma barreira de eneria: o estado de transio (TS, X). Quando a temperatura elevada, o
nmero de molculas que ultrapassam essa barreira maior. Resolvendo a equao em ordem a k: Para determinar Ea, basta medir a duas temperaturas ( ( ( )) )

Teoria da Coliso
( )

Onde P o factor de probabilidade (uma vez que nem todas as colises so eficazes) e Z o nmero de colises por segundo.

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Teoria do estado de transio

Para determinar os parmetros de ativao: Determinar k a diferentes temperaturas; Atravs do grfico ln(k/T) em funo de 1/T obtm-se H; Atravs da expresso:

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Obtm-se Sabendo

; e , calcula-se .

Interpretao dos parmetros de ativao


, Energia livre de ativao de Gibbs: determina a que velocidade uma certa


reaco ocorrer a uma dada temperatura; Medida da quantidade de energia de ligao que perdida no estado de transio em relao ao estado fundamental (incluindo efeitos de solvente) Medida da diferena na (des) ordem entre o estado de transio e o estado fundamental o o Para reaes monomoleculares: Para uma reao bimolecular (duas partculas tem de encontrar-se no estado de transio para formar uma partcula, o que exige muito maior grau de ordem)

Cintica enzimtica
A cintica enzimtica no prova nada em termos de mecanismos. No entanto, no precisa de enzima puro. Estes estudos fornecem informaes sobre grupos ativos e tipos de intermedirios envolvidos na reao. Os estudos cinticos devem ser anteriores a quaisquer outros no estudo do mecanismo.

Mecanismos de catlise enzimtica representaes


Ex. Transferncia de grupos

Wong e Hanes (1962) A espcie que entra para a reao encontra-se por cima da seta, a espcie que sai encontra-se por baixo da seta. Pgina 35 de 84

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Cleland (1963) mais utilizada A linha horizontal representa o enzima; as espcies que entram para a reao apresentam uma seta no sentido do enzima, as que saem apresentam uma seta no sentido oposto.

Ainsworth (1975) Esta forma de representao no mostra os intermedirios formados. O numero 1 corresponde ao enzima e o numero 11 corresponde a isomerizao. O simbolo significa que a reao reversvel.

Mecanismo Theorell-Chance (1951) Utiliza-se este mecanismo quando o composto intermedirio no detetado experimentalmente.

Aula 13 a 16 Cinetic Enzimtic (cont.) Michaelis e Menten (Hiptese do Equilbrio Rpido)

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Van Slyke e Cullen (hiptese do estado estacionrio para [EA])

Briggs e Haldane (hiptese do estado estacionrio para [EA])

Equao comum
[ ] [ ] [ ] Sendo que [ ] substrato, [ ]
[ ]

[ ].

Como os ensaios so realizados em concentraes saturantes de


[ ] , no inicio a concentrao de produto insignificante em [ ] . Obtm-

relao concentrao de substrato, portanto, inicialmente [ ] se ento: [ ] [ ] [ ]

Como geralmente a concentrao de enzima inicial no conhecida, sabendo que a velocidade limite, V, dada por: [ ] Pgina 37 de 84

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Pode obter-se a seguinte equao: [ ] [ ] Pode determinar-se os parmetros cinticos realizando um grfico de velocidade inicial em funo da concentrao de substrato:

Grandezas e unidades
[ ] Velocidade limite (mM s-1); Constante cataltica ou nmero turnover (min -1) Constante de Michaelis concentrao de substrato para a qual a velocidade inicial metade da velocidade mxima (mM) Constante de especificidade (mM-1 min-1), determina a preferncia do enzima para os diferentes substratos, uma medida da eficincia catalitica Unidades enzimticas U quantidade de enzima que catalisa a formao de 1mol de produto por minuto (mol min-1) Katal (kat) quantidade de enzima que catalisa a formao de 1 mol de produto por segundo (mol s-1)

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Formas alternativas da equao de Michaelis Menten


Pode-se variar a equao de Michaelis Menten de forma a obter as constantes que pretendemos calcular:

Efeito da concentrao do enzima


Quanto maior a concentrao de enzima mais difcil ser medir a velocidade inicial da reao

Grficos de 2 fases cinticas


Nestes grficos observa-se a diminuio da concentrao de substrato e de enzima livre, o aumento da concentrao de produto e da concentrao do complexo enzima substrato. Observa-se um tempo inicial que corresponde ao estado de pr-equilbrio, e posteriormente a este tempo observa-se o estado estacionrio. Para se observar o estado estacionrio a diferena de concentrao entre o enzima e o substrato dever ser da ordem 10 2.

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Eficincia
A razo (unidade: s-1mM-1) permite saber a eficincia do enzima em

relao a um substrato. Quanto maior a razo, maior a eficincia. Quando a razo da ordem 108 (que a velocidade de difuso dos metabolitos da clula) o enzima denomina-se wonderful enzyme

Significado de Km
O valor de Km depende do substrato particular e das condies do meio, como o pH, fora inica, temperatura, entre outros. O K m indica a afinidade do complexo EA quando Km dado por: for maior que .

Enquanto a constante de dissociao, Kd dada por:


[ ][ ]

[ Km igual a Kd se

] . Um Km elevado indica weak

for menor que

binding, enquanto um K m baixo indica strong binding

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Parmetros cinticos
Os parmetros cinticos so: Qual o substrato mais especifico? Um maior indica uma reao mais rpida para baixas concentraes Kcat Km

de substrato Um maior Kcat indica uma reao mais rpida quando a concentrao de substrato elevada

Constante de especificidade,
o melhor parmetro para comparar substratos que competem. Quando esta constante muito semelhante para dois substratos

coloca-se os dois substratos a competir experimentalmente.

Mtodo de Lineweaver-Burk
Faz-se a inverso da equao de Michaelis Menten, obtendo-se: [ ] Representando em funo de
[ ]

obtm-se uma

reta que, atravs do coeficiente angular, ordenada na origem e abcissa na origem permite calcular os parmetros cinticos.

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Mtodo de Hanes
Mtodo a utilizar em caso de dvida, pois o mais correto. Obtm-se a equao de Hanes multiplicando a equao de LineweaverBurk (que o inverso da equao de MM) por [A]. [ ] [ ]

Mtodo de Eadie-Hofstee
Caso o grfico obtido seja linear, o enzima segue uma cintica Michaeliana.

Mtodo da Regresso No Linear


Mtodo iterativo; Ajuste direto equao da hiprbole, sem transformao dos erros; Requer estimativas iniciais; Requer meios computacionais. Este mtodo, no grfico seguinte sobrepe-se ao do mtodo de Hanes.

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Mtodo da Regresso Hiperblica


Aplicao do critrio dos mnimos quadrados equao da hiprbole, tal como a regresso no linear, mas deduzindo frmulas explcitas.

Critrio dos mnimos quadrados Fornece as melhores estimativas (menor varincia), se: 1. Os erros nas medidas esto distribudos segundo uma normal; 2. S uma varivel (varivel dependente) est sujeita a erro (em cintica enzimtica a velocidade); 3. Os pesos adequados so conhecidos; 4. Os erros no esto correlacionados, ou seja, a grandeza ou sinal de um erro no tem influncia na grandeza ou sinal de outro erro. 5. Erro sistemtico pode ser ignorado, ou seja, a curva de distribuio para cada erro tem mdia 0.

Mtodos no paramtricos
Na prtica, no possvel verificar a satisfao das condies de 1 a 5: pouco se sabe sobre a distribuio dos erros. Os mtodos da estatstica no paramtrica (ou "independentes da distribuio") s exigem a satisfao da condio 5. A regresso no paramtrica baseada na generalizao da noo de mediana a espaos n-dimensionais. (2D no caso da equao de Michaelis-Menten)

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Mtodo direto (Eisenthal e Cornish-Bowden)


No requer nenhum modelo do erro; um mtodo simples e direto pois no requer clculos, requer apenas o grfico baseado nas retas do tipo: [ ] Experimentalmente, no se obtm uma nica interseo devido aos erros experimentais associados aos valores. Faz-se ento uso da mediana das intersees As intersees fora do primeiro quadrante no so consideradas. Vantagens No requer clculos; No implica ideias abstratas ou difceis como distribuio normal do erro; No necessita de saber qual o nmero de observaes que se deve fazer para cada concentrao utilizada; Insensvel a outliers.

Mecanismo reversvel de Michaelis Menten

No estado estacionrio, a variao de x (concentrao do complexo EA) ao longo do tempo nula:

A velocidade global da reao dada pela equao:

E para quando a concentrao de produto igual a 0:

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A equao pode ser particularizada para quando a concentrao de substrato igual a 0 (tem sinal negativo porque foi definido em termos de variao de produto ao longo do tempo):

Comparando esta equao com a do sentido direto:

Obtm-se assim uma nova equao de velocidade geral, reversvel:

Relao de Haldane
Sabe-se que no equilbrio a velocidade de reao nula, a concentrao de substrato variou desde o tempo inicial bem como a concentrao de produto, e que a constante de equilbrio a razo entre a concentrao de produto e a concentrao de substrato:

Assim, da equao de velocidade geral reversvel obtem-se:

A relao de Haldane uma relao entre as constantes de especificidade e constantes de equilbrio:

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One way enzymes


Se o centro ativo do enzima for feito para complementar estritamente o estado de transio, isto otimizar o enzima como catalisador para ambas as direes. Contudo, se s uma direco tiver significado fisiolgico, a eficincia nessa direo pode ser aumentada custa da outra, desenvolvendo um centro cataltico que reconhea melhor um reagente em detrimento do estado de transio.

Aula 17 Inibio d tividde enzim tic (inibidores reversveis e irreversveis)


O melhor inibidor o que tem como alvo o estado de transio do enzima, ou seja, o complexo enzima-substrato. Inibidores reversveis: substancias que formam complexos dinmicos com o enzima Inibio completa ou inibio linear: os parmetros variam linearmente com o inibidor. Inibio hiperblica ou inibio parcial: o complexo enzimasubstrato tem sempre atividade residual e os parmetros cinticos variam de forma no linear com o inibidor

Classificao da inibio reversvel


Competitiva (ou especfica) A velocidade limite mantm-se constante, o Km aumenta (diminui a afinidade ao substrato) e a razo diminui.

O enzima liga-se ao substrato (formando EA) ou ao inibidor (EI) mas no a ambos (EAI) O inibidor estruturalmente semelhante ao substrato. A inibio pode desaparecer aumentando a concentrao de substrato. Neste tipo de inibio o complexo enzima-substrato-inibidor (EAI) no se dissocia no complexo enzima-substrato (EA), por isso a constante de dissociao de EAI infinita (Kii=) Pgina 46 de 84

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Mista A velocidade limite diminui, o Km mantm-se constante e a razo diminui.

A inibio mista em geral a inibio por produto. Neste modelo no existem equilbrios.

o Inibio no competitiva pura mista: um tipo de inibio mista, rara, em que a constante de inibio, Ki, igual constante de dissociao de EAI, Kii.

Anti-competitiva (cataltica) A velocidade limite diminui e o Km diminui (aumenta a afinidade ao substrato) e a razo mantm-se constante.

Neste tipo de inibio o inibidor s se liga a uma espcie de enzima modificada, como por exemplo o complexo EA. Na presena de inibidor o enzima passa a apresentar uma maior afinidade para o substrato.

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O inibidor ao ligar-se ao EA impede a sada de substrato uma vez que este no se liga ao enzima diretamente (s sua forma modificada). Assim, como a espcie enzimtica EI no existe, no h libertao de substrato e portanto a constante de inibio infinita (, K i=) Equaes de velocidade da inibio reversvel

Anlise da Inibio (e clculo de K i e Kii)


Na determinao do tipo de inibio, os vrios mtodos de linearizao podem ser usados. Grfico de Hanes Com inibidor, numa componente competitiva, aumenta o valor da ordenada na origem. Numa componente anti-competitiva, aumenta o declive da reta traada.

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Grfico linear direto Num tipo de inibio competitiva, no grfico observa-se o aumento de Km atravs da abcissa dos pontos de interseo. Na inibio mista

observa-se tanto o aumento do K m como a diminuio da velocidade limite. No caso da inibio no competitiva pura (caso particular da inibio mista), o K m mantm-se constante enquanto a velocidade limite diminui. Na inibio anti-competitiva observa-se uma diminuio tanto do Km como da velocidade limite. Clculo de K i e K ii Os grficos de Dixon e de Cornish-Bowden complementam-se na determinao do tipo de inibio. Atravs do grfico de Dixon pode-se determinar o Ki, enquanto pelo grfico de Cornish-Bowden pode-se determinar Kii.

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Inibio pelo substrato


A utilizao de concentraes elevadas de substrato pode levar inibio do enzima. A ligao do substrato a um segundo centro resulta em inibio mista. Para que o substrato no iniba o enzima, a concentrao deste deve estar entre 1/3 Km e 3 Km.

Inibio e ativao de enzimas


Inibio irreversvel ou veneno cataltico: o inibidor liga-se covalentemente ao enzima e a atividade deste diminui at ser nula. Este tipo de inibio permite elucidar sobre grupos funcionais de centros ativos.

Reagentes com especificidade de grupo


Reagem com as cadeias laterais dos resduos de aminocidos. Exemplo: Diisopropilfluorfosfato, iodoacetamida.

Marcadores de afinidade
Apresentam uma semelhana estrutural com o substrato e so mais especficos que os reagente com especificidade de grupo. Exemplo: TosilL-fenilalaninil quimiotripsina. clorometilcetona, que anlogo ao substrato para o

Inibidores suicidas
Mecanismo de ao: so substratos modificados que inicialmente seguem o mecanismo cataltico normal, mas depois h a formao de um intermedirio reativo que inativa o enzima por modificao covalente. Assim, o enzima participa na sua prpria inibio irreversvel.

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Inibio Base do desenho de drogas


A maior parte das drogas no so inibidores competitivos apesar de ser aparentemente fcil desenh-los. A inibio deve ser comparada a velocidades constantes e no a concentraes de substrato constantes; O efeito do inibidor competitivo facilmente retirado por pequenas concentraes de substrato. O anticompetitivo potenciado Molcula drug-like Regras dos 5 de Lipinski: resumo do que faz uma molcula atravessar uma membrana por difuso passiva.

1. No ser grande (massa molecular inferior a 500 Da); 2. No ser lipfila (coef. partio etanol/agua 105) 3. No ter grande capacidade de formar lig de H (mximo: 5 H dadores e 10 OH aceitadores) O transporte mediado no deve ser considerado uma exceo!

Inibidor tight-binding molcula que se liga fortemente mas de forma reversvel Inibidor irreversivel molcula que reage irreversivelmente levando perda de atividade do enzima Inibidor mechanism-based ou inibidor suicida substrato que leva o enzima a reagir formando um estado inativado irreversvel em vez de produtos

Aula 18 Deduo d equo de velocidde de estdo estcionrio (me todo de King e Altmn)
As concentraes das diversas espcies enzimticas no variam ao longo do tempo no estado estacionrio, ou seja:

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Sendo

Concentraes das diversas formas enzimticas do , , ,

mecanismo de catlise (incluindo a forma livre do enzima, que o somatrio de todas as espcies enzimticas envolvidas). Pelo mtodo de King e Altman obtm-se expresses para ,

em funo das constantes de velocidade dos vrios passos do mecanismo. Nestas expresses os denominadores so iguais em todas as espcies enzimticas e so a soma de todos os numeradores (de todas as espcies enzimticas). A equao de velocidade derivada a partir destas expresses, considerando a formao do produto a partir de algumas das formas enzimticas. Tome-se como exemplo o seguinte mecanismo:

1 passo

Desenhar o padro principal, onde

cada espcie de enzima corresponde ao vrtice de um polgono (como no exemplo apenas existem 3 espcies enzimticas, o polgono obtido um tringulo). Neste passo tambm se deve identificar os processos que levam transformao entre cada espcie enzimtica (por exemplo para transformar E em EA o processo k 1A). 2 passo Desenhar todos os padres possveis contidos no

padro principal. Regras: i. Tm de conter todas as formas enzimticas; ii. No existem ciclos (ou seja, os lados do polgono, n, so reduzidos para n-1); iii. No tm em considerao a reversibilidade da

interconverso entre as duas formas. Para o exemplo em estudo:

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Assim, para chegar espcie enzimtica E, os caminhos possveis so: EP EA E, o que corresponde a k-2k-1 EP E EA, o que corresponde a k-1k3 EAEPE, o que corresponde a k2k3 Logo a equao ser: Para chegar espcie enzimtica EA, os caminhos possveis so: EP EA E, o que corresponde a k-1Ak-2 EP E EA, o que corresponde a k1Ak3 EEPEA: no existe porque a via EEP irreversvel Logo a equao ser: Para chegar espcie enzimtica EP, os caminhos possveis so: E EA EP, o que corresponde a k1Ak2 E EP EA, no existe porque a via EEP irreversvel EAEEP: no existe porque a via EEP irreversvel Logo a equao ser:

3 passo

Escrever a equao de velocidade, tendo em conta os

passos da formao do produto. Neste caso o produto s se forma a partir da espcie enzimtica EP, na reao de k 3:

Dividindo toda a equao pela concentrao de E 0, obtm-se:

Como

j conhecido, substituindo obtm-se:

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Concluindo:

Esta equao est na forma de Michaelis-Menten reversvel

4 passo

Agregar constantes, aplicando smbolos apropriados.

Sabendo que:

Obtm-se a seguinte equao:

Aula 19 Cinetic com 2 substrtos (ou mis) Introduo


As reaces multi-substratos seguem equaes complexas que descrevem como se ligam os substratos e em que sequncia. A anlise destas reaces muito mais simples se a concentrao de um substrato A for mantida constante e a concentrao de um substrato B for variada. Nestas condies, o enzima comporta-se como um enzima de um s substrato e o grfico de v vs. [S] fornece o Km e V aparentes para o substrato B. Se for realizado um conjunto destas medies a diferentes

concentraes fixas do substrato A, estes dados podem ser utilizados para descobrir qual o mecanismo da reaco.
A maioria das reaces inclui 2 substratos e dois produtos (reaces bi-bi): As reaces bi-bi podem ser descritas cineticamente pelo modelo michaeliano aplicado s reaces uni-uni, considerando a concentrao de um dos substratos constantes (saturante).

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Mecanismos Reaccionais com 2 substratos


Podemos dividir as reaces com dois substratos em duas categorias principais: 1. Aquelas que envolvem um complexo ternrio Neste caso a reaco ternrio do tipo EAB e EPQ, onde: , prossegue via complexo e .

Esta categoria pode tambm ser dividida: a. Reaces onde o complexo ternrio formado por um mecanismo sequencial, ou seja, reaces onde o substrato B s se pode ligar ao enzima depois do substrato A j estar ligado. Segue-se um exemplo:

b. Reaces onde o complexo ternrio formado por um mecanismo random, ou seja, qualquer um dos substratos se pode ligar primeiro. Segue-se um exemplo:

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c. Mecanismo de Theorell-Chance, onde existe uma ligao ordenada de substratos e libertao ordenada de produtos. No entanto, o tempo de vida do complexo ternrio extremamente curto, pelo que se torna cineticamente insignificante. 2. Aquelas que no envolvem um complexo ternrio a. Mecanismo ping-pong, onde formada uma forma modificada do enzima, E, juntamente com o primeiro produto, antes do secundo substrato se ligar:

Elucidao do mecanismo
1. Estudos na ausncia de produtos (mantendo alternadamente um dos substratos constantes);

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a. Sequencial, com B constante e A a variar

b. No sequencial, com B constante e A a variar

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2. Estudos

de

inibio

por

um

dos

produtos

(supondo

mecanismos reversveis).

A adio de um s dos produtos s altera as equaes de velocidade por adio de termos ao denominador. O produto actua como inibidor: pelo tipo de inibio elucida-se o mecanismo.

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Equao de Dalziel
Em Enzimologia, a equao formal para reaces com 2 substratos.

Mecanismos Reaccionais com 3 ou mais substratos Estes mecanismos so raros, mas importantes. Um exemplo de enzimas que apresentam este tipo de mecanismos so os aminoacil-tRNA sintetases. No entanto, 3 substratos no implicam 3 produtos (em geral TerBi).

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Exemplo de mecanismo TerTer


BiUniUniBi

Aula 20 Simulo de mecnismos enzimticos Simulao do mecanismo


Objectivo: Obter as variaes das concentraes ao longo do tempo. - Todas: A, P, E, EA, mesmo aquelas que so difceis de medir. - Com as concentraes podem-se calcular velocidades Motivao: Explorar diferentes cenrios: mudar o mecanismo, mudar constantes cinticas, mudar concentraes iniciais. Vantagem: No se parte de hipteses sobre a variao dos complexos EA, EP (equilbrio ou estado estacionrio) Verificamos posteriori se essas hipteses so razoveis.

Princpios da simulao cintica


Relao fundamental entre as velocidades das reaes e as variaes das concentraes ao longo do tempo: Por aplicao da lei de conservao da massa durante um intervalo t e passagem ao limite quando t 0, obtm-se a Equao diferencial ordinria (ODE).

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Onde os fatores que levam ao consumo de A tm sinal negativo e os que levam sua formao tm sinal positivo.

Estado estacionrio e perodo pr-estado estacionrio


Cintica de estado-estacionrio (steady-state) * concentrao das espcies intemedirias EXi constante * velocidade de formao aproximadamente a velocidade de converso * podem ser feitas medidas em espectrofotomtricas convencionais Cintica de pre-steady-state * Perodo inicial da reao durante o qual a formao de um intermedirio especfico excede a sua converso * Medidas com espectrofotometria stopped-flow com dispositivo mistura-rpida e um dead time para anlise de dados de ~1 ms

Aula 21 Enzimologi in situ.

Determinaes
In situ significa no lugar. Em termos de Enzimologia in situ refere-se ao estudo de enzimas no local onde eles se encontram (no seu habitat natural); In vivo refere-se experimentao feita dentro ou no tecido vivo de um organismo vivo, em oposio a um parcialmente ou totalmente morto. Pgina 61 de 84

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In vitro processos biolgicos que tm lugar fora dos sistemas vivos, no ambiente controlado e fechado de um laboratrio.

A concentrao de protena, dissolvida, in vivo de 100 mg/mL !

Enzimologia in situ
O objectivo desta rea estudar enzimas no seu habitat natural. In vitro: [protena] [substrato]

In vivo: [protena] [substrato] Utilizando-se NMR consegue medir-se a concentrao de quase tudo. necessrio preservar a concentrao celular dos enzimas. Como permeabilizar a clula de um modo suave? necessrio ter em conta a concentrao de protena exposta ao meio reaccional. O azul de Comassi constitudo por trs espcies principais e por nove espcies secundrias. A digitonina insolvel em gua temperatura ambiente. Tambm um composto termoestvel. Assim, na preparao da digitonina deve aquecer-se a gua e adicionar-se a digitonina em gua quente para que seja solvel. Tem de se utilizar agitao. Caso contrrio, h sedimentao da levedura na cuvette.

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Aula 22 e 23 Bioctlisdores & Enzims mbientis


Biocatlise: rea fundamental da biotecnologia a utilizao de um catalisador biolgico (biocatalisador) numa reaco qumica especfica Biocatalisador inclui no s enzimas, mas tambm clulas, organitos celulares, ribozimas, ou anticorpos catalticos

Cooperao interdisciplinar:

Enzimas como biocatalisadores


1. A tecnologia de enzimas uma alternativa mais limpa que os processos qumicos, que so menos amigos do ambiente 2. Usados diretamente no tratamento de desperdcios 3. Ferramentas analticas na monitorizao ambiental biossensores 4. Transformam substratos naturais em produtos de elevado valor acrescentado 5. Os enzimas podem ser naturais ou recombinantes, livres ou imobilizados

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Clulas intactas como biocatalisadores


1. No requerem regenerao de cofatores 2. Podem ocorrer reaes secundrias 3. Necessitam de equipamento dispendioso, tempo de otimizao das condies operacionais, controlo preciso do metabolismo 4. Podem ser usadas clulas intactas livres ou imobilizadas

Enzimas ou clulas?

Vantagens do uso de enzimas como biocatalisadores

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Custo (elevado?) dos enzimas Preos dependem de: Pureza Do tipo de enzima Prprio custo de produo do enzima, mas tambm da sua contribuio para o produto final No diferem muito do custo de outros catalisadores O preo do enzima deve ser comparado com o valor do produto final.

Estabilidade de um enzima: Muitos so instveis a temperaturas elevadas ou valores extremos de pH Outros em soluo podem perder actividade temperatura ambiente

fundamental que o enzima seja estvel nas condies de operacionais do processo de fabrico. Regenerao de cofactores em sistemas com enzimas: Cofatores como o NAD(P) ou NAD(P)+ nem sempre so fceis de regenerar Se o enzima for dependente de cofatores, tem que existir no meio um sistema de regenerao dos cofatores, de forma econmica e eficiente. Exemplos de como regenerar os cofatores:

1. Usar uma reao acoplada! - O NADH necessrio na reao de


reduo regenerado com o enzima lcool desidrogenase e etanol (um reagente barato, logo o processo econmico) 2. Usar um cofator macro-molecularizado num reator de

membrana! - O NADH ligado ao PEG (NADH-PEG), aumentando a massa molecular do cofator. Isto permite que o cofator fique retido dentro do reator (dentro da membrana) com os enzimas, enquanto que o substratos e os produtos passam pela membrana livremente.

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Fonte dos enzimas Plantas Animais Microrganismos Enzimas recombinantes A produo poder no conseguir

responder s necessidades de mercado

Imobilizao de enzimas Limitao do movimento, atravs de processos qumicos ou fsicos: Mtodo eficiente, fcil, barato e universalmente aceite para aplicaes na indstria alimentar e em medicina A velocidade de reaco e o rendimento dependem de vrios parmetros: tipo de suporte, pH, temperatura, concentrao de substratos Optimizao emprica Mtodo mais comum: ligao a suportes (carriers) porosos necessrio o conhecimento das propriedades na superfcie do enzima: hidrofobicidade, grupos inicos, grupos funcionais Pode ser necessrio fazer engenharia da superfcie do enzima Introduo de grupos funcionais de forma a aumentar as ligaes, a estabilidade e a actividade Alterao do ponto isoelctrico

Vantagens da imobilizao de enzimas Reutilizao do enzima aps remoo dos produtos (reduz os custos) Facilidade de isolamento do produto Uso em processo contnuo (devido reutilizao) Aumento da estabilidade do enzima

Limitaes da imobilizao de enzimas Custo dos carriers e da imobilizao Alteraes das propriedades Problemas com a regenerao de cofatores Pgina 66 de 84

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Problemas com sistemas multienzimticos Perda de atividade durante a imobilizao

A imobilizao de enzimas pode ser feita de vrias formas:

1. Cross-link Mtodo barato, mas no muito usado na imobilizao de enzimas solveis com objetivo de biocatlise: So poucos os enzimas imobilizados que apresentam elevada atividade Os agentes de cross-link podem desnaturar o enzima Usado com sucesso em cristais de enzimas

Cross-link de protenas com glutaraldedo:

2. Ligao a um suporte (carrier) Mtodo bastante utilizado na imobilizao de enzimas O suporte deve ser inerte e estvel Classificao do carrier (material de que feito, origem ou estrutura): Pgina 67 de 84

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o Inorgnico (Ex. slica, vidro, argilas) o Orgnico de fontes naturais (Ex. derivados da celulose, dextrano, polisacridos, agarose) o Orgnico de materiais sintticos (Ex. poliestireno, polmeros acrlicos) Caractersticas do carrier: o Qumicas - hidrofobicidade, estabilidade qumica e microbiolgica o Morfolgicas - dimetro da partcula, tamanho do poro, capacidade da superfcie para adsoro o Mecnicas resistncia presso e

compressibilidade, elasticidade o Gerais - custo, food or pharma grade Mtodos mais utilizados Adsoro Os enzimas so adsorvidos superfcie (interna ou externa) de um suporte atravs de interaces fracas (electrostticas, inicas, de hidrognio, van der Waals) Com o passar do tempo os enzimas podem perder-se, uma vez que as interaces envolvidas so fracas Como se processa: Misturar o enzima com o material adsorvente, em condies adequadas de pH e fora inica Incubar Lavar os enzimas no adsorvidos ou fracamente ligados Mtodos mais utilizados Ligao covalente Os enzimas so ligados covalentemente a uma matriz utilizada em gamas alargadas de pH, fora inica e outras condies variveis, por ser muito estvel Os grupos mais reativos no enzima so: amina e hidroxilo. No entanto, os resduos de lisina so os mais utilizados o Elevada abundncia superfcie da protena o Elevada reatividade Pgina 68 de 84

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o Geralmente no esto envolvidos no centro ativo dos enzimas o Elevada estabilidade da ligao com o suporte As ligaes dependem do suporte e do grupo envolvido na reao. Os enzimas podem ser inativados se a ligao promover alteraes no centro ativo. O sucesso deste mtodo para a biocatlise depende da correta conformao do enzima e acessibilidade do centro ativo Este mtodo pode ser combinado com um cross-linker, como o glutaraldedo, de forma a formar agregados de protena:

3. Entrapment ou encapsulamento Entrapment: Os enzimas so misturados com o precursor do

gel ou com os monmeros de gel; o gel forma-se (ou polimeriza a partir do monmero) e o enzima fica preso no seu interior O tamanho do poro do gel crucial e depende do

tamanho do enzima que se pretende imobilizar Encapsulamento: interior ou nylon do enzima. Mtodo barato e fcil, mas a sua eficcia depende da estabilidade de A soluo contendo os enzimas encapsulada no uma estrutura que contm uma membrana

semipermevel (cpsula) A membrana geralmente de nitrato de celulose

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Aplicaes com enzimas imobilizados Biorreatores produo de L-aminocidos por amino ciclases (catalisam a desacetilao dos aminocidos); Biossensores deteo e quantificao de diversos compostos em amostras complexas; Biorremediao remoo e desintoxicao de contaminantes;

Imobilizao de clulas
Alternativa imobilizao de enzimas A caracterstica mais importante a atividade e estabilidade dos enzimas de interesse No relevante se as clulas esto vivas ou mortas (permeabilizadas), desde que os enzimas estejam ativos Os mtodos utilizados so os mesmos descritos para a imobilizao de enzimas: Adsoro Ligao covalente Cross-link de clulas Encapsulamento ou aprisionamento (entrapment)

Aula 24 Engenhri de prote ns


O catalisador ideal: Maior estabilidade Maior seletividade Maior gama de substratos

Como obter novos e melhores biocatalisadores? Screening clssico o A partir de colees de culturas o Recolha de amostras de ambientes Biblioteca ambiental de genes (environmental gene library) Pgina 70 de 84

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o Metagenoma ambiental: genomas combinados de todos os microrganismos de um dado meio ambiente o Screening das bibliotecas (ex. procurar clones com determinada atividade) Pesquisa em bases de dados o Projectos de sequenciao de genomas e de sequenciao massiva o Muitos enzimas (ainda) no caracterizados Melhoramento de um biocatalisador conhecido o Desenho racional (engenharia baseada na estrutura, site-directed mutagenesis) o Evoluo dirigida (mutagnese aleatria, gene shuffling)

Aula 25 Engenhri de vis metbo lics Bioengenharia


Uma estirpe que produz um determinado produto de interesse pode ser manipulada para produzir mais e novos produtos: a. Combinao de substratos naturais com anlogos do substrato (precursor-directed biosynthesis); b. Manipulao gentica do enzima para utilizar anlogos do substrato com maior rendimento; c. Engenharia de vias metablicas, expressando genes heterlogos para a obteno de um novo produto; d. Engenharia de vias metablicas atravs da combinao de diferentes vias biosintticas (de diferentes organismos) num nico organismo, dando origem a um hbrido e novos produtos naturais e. Sntese enzimtica a partir de enzimas purificados, manipulados geneticamente ou no, livres ou imobilizados, utilizando diferentes substratos;

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Engenharia de vias metablicas


Envolve a construo e a manipulao do metabolismo celular atravs da alterao das actividades e nveis de enzimas, endgenos ou heterlogos, para atingir a biosntese ou a biocatlise dos compostos de interesse. Vantagens: Aumento do rendimento o Novos enzimas mais eficientes o Utilizao de menor quantidade de matria-prima o Menor produo de desperdcios o Aumento dos nveis de produo Maior eficincia relativamente aos processos qumicos Menor dependncia de recursos naturais

Tcnicas analticas mais utilizadas: Genmica Transcriptmica Protemica Metabolmica

Depende ainda da engenharia de enzimas, da descoberta de novos enzimas, da biologia e bioqumica de sistemas (cataloga novas vias, novas redes metablicas e as estratgias de regulao de diferentes organismos com interesse para desenvolver novas funes celulares) e da biologia sinttica (desenvolve novas estratgias para perturbar as redes metablicas endgenas, permitindo a obteno de dados de sistemas em condies de celulares no fisiolgicas).

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Simulao combinatria (in silico)


Anlise in silico (simulao cintica) na optimizao metablicas: Depende de modelos, o mais prximos possvel da realidade, de vias

baseados em parmetros obtidos experimentalmente Permite perceber os circuitos moleculares que controlam sistemas

biolgicos complexos Permite reduzir o tempo e os custos associados com os mtodos

tradicionais experimentais Permite simular o comportamento de determinados sistemas

metablicos por alterao dos componentes do sistema

Passos que envolvem a simulao:

1 passo Abstrao do modelo: Seleo de vias metablicas que incluam os principais componentes que controlam os fluxos metablicos. 2 passo Construo do modelo: Desenvolvimento de um modelo computacional (de referncia) das vias metablicas selecionadas, baseado no conhecimento existente dos parmetros do sistema (concentrao de enzimas, parmetros dos enzimas,). 3 passo Otimizao do modelo: Perturbao do modelo de referncia (por ex. a deleo do gene ou a sobre-expresso do enzima) em posies selecionadas (nicas ou mltiplas) de forma a aumentar a produo de um determinado composto. 4 passo Teste experimental: Desenho de novas experincias (novas estirpes, melhoradas) com base nos resultados das simulaes. 5 passo Iterao do modelo: Otimizao do modelo at o

comportamento experimental do sistema ser satisfatrio, num processo cclico. 6 passo Produo industrial: Scale-up das culturas com o objetivo de produo do composto escala industrial

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Biologia sinttica e engenharia gentica


Envolve a engenharia gentica das vias biossintticas naturais para a produo de novos compostos utilizando vias metablicas de outros organismos. A estratgia mais utilizada a produo de pequenas molculas em hospedeiros microbianos atravs da expresso de vias biossintticas heterlogas.

Produo de protenas recombinantes


H uma grande procura de elevados nveis de produo de protenas por parte das indstrias farmacutica e biotecnolgica. As culturas de clulas de mamferos so ideais para a expresso e produo de protenas humanas, mas: So caras No permitem a produo de protenas em larga escala

Produo de protenas recombinantes em clulas de insetos, fungos ou bactrias com maior rendimento e baixo custo. Utilizao da via secretria de forma protena sair da clula medida que expressa (facilidade de isolamento)

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Aul 26 e 27 Regulo d tividde enzimtic


Porqu que necessrio haver regulao?
Manter homeostase; Adaptao a mudana ambientais (de nutrientes); Catalisar vias metablicas em sentidos diferentes (ciclos de substrato); Capacidade de grandes mudanas de fluxos metabolitos com pequenas variaes de concentrao dos metabolitos envolvidos. Cintica Michaeliana insuficiente Se a concentrao de substrato for muito superior ao Km, ao variar a concentrao de substrato a atividade do enzima no vai ser alterada. Se a concentrao de substrato for igual ou inferior ao Km, a variao da concentrao de substrato leva a uma variao moderada da atividade enzimtica. Para que a velocidade da reao varie de 10% para 90% da velocidade mxima da reao, a concentrao de substrato tem de aumentar 81 vezes.

Modos de regulao
Quantitativos (escala de tempo lenta) coarse control Regulao da sntese proteica (em vrios passos possveis) Regulao da protelise Neste tipo de regulao existe uma modificao na espcie enzimtica inicial. [ ] [ ]

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Qualitativos (escala de tempo rpida) fine control Modificao covalente irreversvel Modificao covalente reversvel Modificao conformacional induzida por ligando Neste tipo de regulao pode ocorrer uma modificao covalente que leva alterao da constante de velocidade, conformacionais que alteram a funo do enzima. , ou modificaes de

Modificaes covalentes irreversveis


Protena precursora inactiva (zimgeno) Activada por aco de proteases Comum em proteases com actividade extracelular Digesto/coagulao complemento) sangunea/resposta imune (sistema do

Modificaes covalentes reversveis


Fosforilao/desfosforilao (muito comum): integradas em vias de sinalizao amplificao de sinal o Cinases de protena fosforilam resduos de: Serina/Treonina (geralmente regulao de metabolismo) Tirosina (geralmente crescimento e diferenciao celular) mais raras: histidina, lisina, arginina, glutamato e aspartato Outras modificaes: Adenilao Ribosilao

Modificaes Conformacionais
Observaes experimentais: Muitos enzimas do primeiro passo da via eram inibidos por produtos do final da via estruturalmente distintos dos seus substratos e produtos; Pgina 76 de 84

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Cinticas sigmoidais; Oligmeros; Era possvel interferir com ligao do inibidor sem afectar ligao de substratos. Alosteria Propuseram que inibidores (ou activadores, efectores) se ligassem noutro local do enzima que no o centro activo; Este centro poderia estar distante do centro activo e ter forma diferente centro alostreo; Ligao do efector poderia induzir modificaes conformacionais que teriam impacto no centro ativo.

O centro alostreo pode ativar ou inibir o enzima:

Cooperatividade
Propriedade de enzimas e protenas que respondem com grande sensibilidade a variaes de concentrao de substratos ou efetores Variao de velocidade com concentrao de substrato (ou efector) no hiperblica maioria dos casos apresentam cinticas sigmides Pgina 77 de 84

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A cooperatividade pode ser: o Homotrpica (se o ligando for semelhante para todos os centros ativos) ou heterotrpica (se os ligandos tiverem naturezas diferentes) o Pode ser positiva (se a ligao de um ligando promove a ligao dos outros o enzima pode deixar de apresentar sigmoicidade), negativa (se a ligao de um ligando impede a

ligao dos outros) ou mista (se a ligao de um ligando promove ou impede a ligao dos outros dependendo da concentrao a que se encontra).

Exemplo mais conhecido: hemoglobina. Protena oligomrica com cooperatividade homotrpica positiva Ligao do substrato a uma subunidade induz aumento de afinidade nas restantes subunidades

AlosteriaCooperatividade Oligomeria
Um enzima pode: Ter centros alostreos sem apresentar cooperatividade e sem ser oligomrico Ter cooperatividade sem ser oligomrico e sem ter centros alostreos Ser oligomrico sem ter alosteria nem cooperatividade

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Para ajustar ligao da hemoglobina ao oxignio, Hill formulou a seguinte equao: [ ] [ ] Em que Y a frao de protena ligada, [A] a concentrao de substrato, a constante de semi-saturao, e [ ] [ ] Na equao de Michaelis Menten o coeficiente de Hill igual a 1, ou seja, no existe cooperatividade. Quando a cooperatividade positiva, h > 1; quando a cooperatividade negativa, h < 1. o coeficiente de Hill.

Para enzimas a equao a seguinte:

Modelos explicativos
Modelo de Hill No modelo de Hill a cooperatividade extrema, ou seja, ou no h ligao de substrato ou todos os centros tm substrato ligado. O ndice de cooperatividade apenas indica o nmero de centros de ligao para o ligando na situao limite. O grfico de Hill obtm-se atravs da seguinte equao: ( ) [ ] a ordenada na origem. ) Razo entre as concentraes de

Onde h o declive da reta e

ndice de cooperatividade ( ligando para as quais e

Quando o h diminui, o Quando o h aumenta, o

aumenta e tem-se cooperatividade negativa. diminui e tem-se cooperatividade positiva.

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Modelo de Adair Supe-se que existem dois centros de ligao no enzima. um modelo geral para interao entre protena e mltiplos ligandos, assumindo associao/dissociao em equilbrio.Este modelo soluciona o problema do modelo de Hill, ou seja, a cooperatividade no extrema. So as constantes de cooperatividade intrnseca que ao variarem permitem explicar a cooperatividade. Se o valor de K, constante de dissociao microscpica, aumentar, tem-se cooperatividade negativa. Se o valor de K diminuir, tem-se cooperatividade positiva.

As definies de cooperatividade por Hill e Adair no so totalmente equivalentes mas so quantitativamente idnticas (ambos definiram um ndice de cooperatividade: se se observar cooperatividade positiva pela equao de Hill tambm se observar em Adair mas o valor ser diferente, consoante a equao que se aplique). A equao de Adair (quando aplicvel) tem maior significado fsico dado que mais adequado pensar-se que os ligandos se ligam a tempos diferentes, mas no permite calcular Induced-fit Surge o conceito de flexibilidade e desaparece o conceito de proximidade. Segundo este modelo uma alterao conformacional no enzima e posteriormente ocorre a ligao do ligando: o centro ativo tem o potencial Pgina 80 de 84 .

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para ligar o substrato mas s adota a conformao correta quando este se liga (alterao conformacional conseguida pela ligao dos diferentes grupos do substrato com o enzima). Este modelo permitiu explicar a alosteria e a cooperatividade como efeitos distncia.

Modelos modernos de cooperatividade


Modelo MWC Monod, Wyman,Changeux(1965)

Modelo Concertado ou Simtrico: Enzimas oligomros em que, na ausncia de ligando, cada subunidade pode estar em duas conformaes: R (relaxada representada por um circulo) e T (tensa representada por um quadrado)

Substrato tem maior afinidade para a forma relaxada (Kr<Kt) No oligmero, todas as subunidades tm a mesma conformao, ou esto todos na forma relaxada ou todos na forma tensa. Aforma tensa, Tn, est em equilbrio com a forma relaxada, Rn, com constante de equilbrio constante alostrea.

A equao para geral dada por:

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Casos particulares: 1. Quando n=1, apenas existe um centro de ligao por enzima, logo:

2. L= 0, da equao

retira-se que T=0, ou seja, no existe a

forma tensa do enzima. No existe cooperatividade. A equao dada por:

3. L, da equao

retira-se que R=0, ou seja, no existe

a forma relaxada do enzima. No existe cooperatividade. A equao dada por:

Resumindo, segundo este modelo: Para haver cooperatividade so necessrias 2 conformaes (pelo menos) Essas formas tem de ser funcionalmente diferentes (K R KT ) Explica modificadores alostreos (efeitos heterotrpicos): o Ativador tem maior afinidade pela forma relaxada o Inibidor tem maior afinidade pela forma tensa.

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Modelo KNFKoshland, Nmethy,Filme r A protena s pode ter diferentes conformaes na presena de ligandos. Assim, as diferentes conformaes no esto implcitas na protena e s ocorrem se houver ligandos. A presena de ligandos induz uma alterao conformacional que perpetuada s outras subunidades. Este modelo permite ultrapassar os problemas do modelo MWC, pois admite a existncia de formas hbridas e permite explicar a cooperatividade negativa. Quando A se liga ao enzima na forma T, a forma T passa forma R. Este modelo permite explicar diferentes tipos de fenmenos de cooperatividade das cincias da vida. Ambos os modelos existem porque admitem que as protenas so oligmeros. No entanto, pode haver cooperatividade em protenas s com uma subunidade. Resumindo, este modelo: Gera expresses de y vs a complexas, por exemplo:

A forma da curva determinada pela relao entre K R:R e KR:T K0.5 depende de KT, KA e KR:R Consegue explicar cooperatividade positiva e negativa consoante relao entre KR:R e KR:T o o Cooperatividade positiva (R:R mais estvel que R:T) Cooperatividade negativa (R:T mais estvel que R:R)

enzima

encontra-se

inicialmente na sua forma tensa e vai passando para a forma ativa, relaxada, conforme seja necessrio.

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Modelos de associao dissociao Cooperatividade pode resultar de equilbrio entre formas de protena em diferentes estados de agregao (no h relao entre cooperatividade e alteraes conformacionais) O ligando tem afinidades diferentes para as diferentes formas Semelhanas com o modelo de simetria mas nas equaes aparece concentrao de protena (o que constitui uma vantagem prtica)

Modelos cinticos Modelo de Ferdinand e Rabin A cooperatividade pode surgir por motivos cinticos.

Consequentemente, uma nica cadeia pode ter cooperatividade sem ter uma estrutura quaternria.

Modelo de Rabin o substrato que provoca alteraes conformacionais no enzima (EA) e s assim que vai ser possvel dar o produto.

O enzima tem memria e lembra-se da conformao que tinha quando o substrato estava em baixas concentraes. A este fenmeno designa-se por histerese (tendncia de um material ou sistema de conservar suas propriedades na ausncia de um estmulo que as gerou)

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