Université De JIJEL Faculté des Sciences Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire

Immobilisation des enzymes

réalisé par:
Boudjelida .H Bellal. Ch

proposé par:
Dr .Siffour M
Année universitaire 2011-2012

Kaaboub. K

Introduction
la catalyse par les cellules microbiennes est peu efficace en raison de la perte du substrat due au besoin de croissance des microorganismes et de la présence des réactions secondaires gênantes, la possibilité d’extraire des enzymes et de les utiliser pour la conversion du substrat procure des avantages non négligeables quant au rendement et à l’uniformité du produit.
Pour compenser les problèmes liés à l’instabilité et au cout d’extraction des enzymes en solution. On cherche à les immobiliser sur des supports insolubles afin de pouvoir les réutiliser après l’opération, et de faciliter leur séparation du produit de réaction obtenu. Par ailleurs, les enzymes immobilisées se prêtent mieux à leur incorporation dans les réactions ou l’entrée de substrat à un bout permet de récupérer le produit transformé à l’autre bout en flux continu.

Qu’est ce qu’une enzyme immobilisée?

Qu’elles sont les principales techniques d’immobilisation ? Qu’elles sont les domaines d’application d’enzymes immobilisées?

Chapitre I : Généralités sur l’immobilisation des enzymes

I.1. enzyme immobilisée
• Une enzyme immobilisée est une enzyme liée par des moyens physico-chimiques en surface ou à l’intérieur d’un support solide
• On cherche généralement à conserver son activité enzymatique, qui a tendance:  à diminuer après immobilisation du fait de possibles gênes stériques et de limitations dans l’accessibilité au site actif .  à augmenter sa stabilité dans le temps.

I.2.But et principe d’immobilisation
l’ultrafiltration est l’une des méthodes qui permet la réutilisation d’enzyme, mais il semble que celle qui a donné naissance aux plus grands développements consiste à rendre l’enzyme insoluble par un traitement physique ou chimique convenable, suffisamment doux et sélectif pour éviter une perte trop importante d’activité biologique. • On peut combiner les deux méthodes pour assurer une meilleure fixation de lˈenzyme. • La rétention physique

exploite la grande différence de taille entre lˈenzyme et le substrat. Elle peut être un réseau, une capsule ou une membrane

• Le traitement chimique se réalise par:  simple interaction ionique.  création d’une vraie liaison covalente. présente l’avantage de stabiliser la protéine et de permettre une utilisation prolongée.

I.3.Propriétés d’enzymes immobilisées
 Propriétés physico-chimiques

Une des propriétés importantes et caractéristiques de l’immobilisation est :  l’amélioration de la stabilité dans le temps.  la résistance vis-à-vis de la dénaturation.
• La stabilité de l’enzyme immobilisée dépend beaucoup du microenvironnement imposé par le support. On distingue normalement trois types de stabilité pour une enzyme immobilisée: Stabilité de stockage Stabilité opérationnelle Stabilité thermique

Propriétés cinétiques • L’immobilisation des enzymes affecte beaucoup leurs
propriétés cinétiques. • En effet, à la vitesse de réaction enzymatique proprement dite il faut ajouter l’effet du microenvironnement qui conditionne toute l’activité catalytique. • Ainsi, les phénomènes de diffusion limitent l’accès du substrat au niveau du site enzymatique

I.4. Intérêts de l’immobilisation
 Stabilité
liée à une diminution du degré de liberté de la macromolécule et donc à une diminution des variations conformationnelles de l’enzyme. due à une augmentation de la concentration de la protéine locale.

 Fonctionnement catalytique continu
concerne les application préparatives avec les
réacteurs

les développement analytiques avec les biocapteurs.

 Localisation de catalyseur
Il est simple de séparer le catalyseur et les réactants au cours ou en fin de process.  Modulation de microenvironnement des enzymes charge, groupement hydrophobes, concentration locale des substrats et effecteurs.  Intérêt économique conduit à un abaissement des coûts de revient de la production du produit recherché de façon considérable.  Intérêt technologique conduit à un meilleur suivie et contrôle de la réaction catalytique.

I.5.choix de technique
Le choix dépend:
 du type d’enzyme utilisée ,  du transducteur et de l’environnement dans lequel le biocapteur fonctionne.  aussi des stabilités mécaniques et chimiques de la matrice et de son coût.  de l’application finale donnée à l’enzyme

Chapitre II : Principales techniques d’immobilisation

II.1. les méthodes d’immobilisation :

II.1 Immobilisation d’enzyme par inclusion
Les molécules d’enzyme sont retenues dans le réseau tridimensionnel d’un polymère insoluble dans l’eau « réseau tridimensionnel d’une matrice », ou emprisonnées dans des microcapsules délimité par une membrane semi perméable dont les pores sont suffisamment larges pour permettre le passage des molécules du substrat ou des produits de la réaction.

II.1.1 inclusion dans une matrice

Figure1 : Inclusion dans un réseau de polymère insoluble.

 Inclusion dans un gel
 L’enzyme est incorporée dans un gel insoluble. Ce gel peut être constitué d’une matrice organique (polymère) ou inorganique (argiles). La maille de la matrice assure de manière purement physique la rétention de l’enzyme tout en permettant la diffusion du substrat jusqu’au site actif de l’enzyme grâce à une porosité du gel suffisante.

 Le choix du type de polymères va être dépend de :
 Propriétés mécaniques du gel : compression, forces de cisaillement  Propriétés chimiques : toxicité, condition de stabilité en fonction de pH ;  Propriétés physiques : perméabilité du gel.

Figure2 : inclusion dans un gel

 On utilise comme matrice pour l’inclusion plusieurs
polymères :  Gel à partir des polymères naturels: l’alginate , Carraghénane, Chitosane……  Gels à partir des polymères synthétiques:  le gel de polyacrylamide.

Figure 3 : inclusion dans le gel de polyacrilamide

fibres de polyacétate de cellulose  On réalise une solution de triacétate de cellulose dans le chlorure de méthylène.  on ajoute sous agitation une solution d’enzyme dans l’eau froide ou dans un tampon contenant de glycérol  émulsion obtenue est ensuite extrudée sous pression d’azote dans un bain de coagulation contenant de toluène.  La fibre obtenue est séchée sous vide pour éliminer les solvants et conserver à 5°C.

Figure 4 : inclusion dans des fibres de polyacétate de cellulose.

II.1.2. Inclusion à l’aide une matrice II.1.2.1 Microcapsulation
La méthode consiste à inclure l’enzyme à l’intérieur de la membrane semi-perméable obtenue en copolymérisant un monomère hydrophobe, dessous dans la phase organique, et un monomère hydrophile, dessous dans la phase aqueuse en émulsion dans la phase organique.

Figure 5 : Inclusion dans des microcapsules. Les micro-capsules emprisonnant l’enzyme sont recueillies par centrifugation.Leur diamètre peut varier de quelques microns à une centaine de microns.

II .2.2. Membrane semi- perméable
 assure la rétention des molécule d’enzyme dans un volume déterminé en vue d’une utilisation continue (les hydrolase).  Sont utilisées dans la dégradation des macromolécules (amidon, protéine).  Les produits obtenus après l’hydrolyse peuvent franchir les membranes, ce que permet de les récupérer dans l’effluent selon la figure suivante :

Figure7 : Inclusion à l’aide d’une membrane semi-perméable A: membranes planes, B:fibres creuses

 Avantages et inconvénients d’immobilisation par inclusion
 Avantage • Réaction de polymérisation et de gélification bien connues. • Réaction chimiques avec l’enzyme limitée (inclusion dans des gels naturels). • Application à toutes les enzymes (utilisation de mélanges). • Obtention de supports de forma adaptables (films, billes, fibre…) • Risque de fuite prévenue par réticulation du support après immobilisation.

Inconvénients
• Certaines polymérisations font appel à des agents dénaturants ou à des radicaux. • Problème de transfère de masse (inaccessibilité de certains substrats) • Risque de fuite de l’enzyme (micropores) • Propriétés mécaniques des gels insuffisantes.

II.2.Immobilisation par adsorption
 C’est la méthode la plus simple et la plus rentable.  elle consiste à assurer la rétention de la molécule enzymatique à la surface d’un support insoluble, par interaction faible entre les groupes fonctionnels de l’enzyme et du support.  L’interaction enzyme-support pourra impliquer l’ensemble des liaisons non covalentes ou secondaires de bas niveau énergétique tel que les liaisons de Vander Waals, les liaisons hydrogène, les liaisons ioniques et le transfert de charge.

Figure 8 : immobilisation par adsorption

 Les supports utilisés
 Les supports organiques Comprennent les polyosides comme l’acétate de cellulose, nitrate de cellulose, dextrane, agarose, alginate et les polymères comme le polystyrène, le polyéthylène…  Les supports inorganiques (support minéraux) sont généralement plus stables, résistent l’usure, aux agents chimiques et aux bactéries mais la fixation covalente sur ces support est difficile à cause de leurs faible réactivité.

les matériaux actifs peuvent être des : * Les argiles * Verre poreux et silice poreuse

Figure 9 : les supports inorganiques

Autres supports : le nylon, oxyde céramique, cellulose, collagène et charbon actif.

Les paramètres qui influencent l’adsorption
 La concentration de l’enzyme  Le temps de contacte

 Le pH  Composition du milieu  La température (effet positif)

 Avantages et inconvénients de l’immobilisation par adsorption  Avantages
• Très grande facilité de mise en œuvre.
• Possibilité de régénérer les complexes enzyme-support (si l’enzyme perd son activité en cours de son fonctionnement, il est possible de la désorber et de la remplacer par une préparation active) • Fixation rapide du support et immobilisation simple et non dénaturante.

 inconvénients :
• Malgré sa simplicité de mise en œuvre, elle demeure peu utiliser pour la conception des bioréacteurs (risque de désorption) • La fragilité de la fixation (les enzymes peuvent facilement se désorber sous l’action de variation de pH, température…

• L’orientation de l’enzyme et mauvaise accessibilité au site actif.

Figure 10: mauvaise accessibilité au site actif.

II.3.Immobilisation par liaison covalentes
On peut diviser les méthodes d’immobilisation d’enzymes par liaison covalente en deux groupes :

II.3.1. Immobilisation par liaisons covalentes sur support :
 Elle est réalisée par l’intermédiaire de liaisons irréversibles et covalentes entre les groupements fonctionnels de l’enzyme et les groupes réactifs du support  Ces groupes, en général insuffisamment réactif, nécessiteront une activation préalable. A priori, il faut activer soit l’enzyme, soit le support.  l’activation des groupes fonctionnels de l’enzyme peut conduire à la dénaturation de l’enzyme.

• L’activation du support se fait par :

 Greffage de composé bifonctionnel (bras espaceur) qui comporte une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions portées par l’enzymes
* Ce composé permet de fixer l’enzyme à une certaine distance du support et d’avoir une meilleure accessibilité de l’enzyme à son substrat.  L’apparaition des fonctions chimiques réactives sur le support par réaction directe .ex: cellulose +BrCN .

Figure 9: immobilisation par liaison covalente
étap1: activation du support , étape 2: fixation de l’enzyme

Figure10: immobilisation au bromure de cyanogène BrCN
étap1: activation du support , étape 2: fixation de l’enzyme

II.3.2. Immobilisation par réticulation ( sans support)  c'est un procédé d'association des différentes unités
biocatalytiques ou de protéines à l'aide d'un agent réticulant masse molaire élevée
Elle peut être effectuée après inclusion ou adsorption afin de stabiliser l’enzyme immobilisée et limiter les phénomènes de fuites ou de désorption.

Figure 11: Immobilisation par réticulation.

• L’agent réticulant le plus utilisés est le glutaraldéhyde (OHC-(CH2)3-CHO).

Figure12: Réticulation au glutaraldéhyde

 Avantages et inconvénients d’immobilisation par liaison covalente  Avantages
• Stabilité accrue à cause de la liaison covalente • Grand choix de méthodes différentes • Grande variété de support minéraux (verre, silice, céramique…) et organiques (cellulose, polymère synthétiques…) • Possibilité d’effectuer l’immobilisation en présence de substrat pour éviter l’inactivation (protection du site actif).

 Inconvénients
• Mise en œuvre de réactions chimiques souvent complexes • Longueur des expériences (étape de l’activation du support) • Rendements de fixation inferieurs à 100% • Risques de modifications chimiques de l’enzyme (perte d’activité) • Nécessite de purifier l’enzyme préalablement • Investissement important

Chapitre III : Cinétique enzymatique hétérogène et applications des enzymes immobilisées

• III.1.Cinétique enzymatique hétérogène

Figure13 : la catalyse homogène.

Figure 14 : catalyse hétérogène

III.2.L’application des enzymes immobilisées dans quelques procédés industriels

 L’agro-alimentaire
• Production d’acides aminés (pénicilline amidase )

• Production du glucose, sirop
• Production de fructose en utilisant glucose isomérase

• Amélioration des propriétés de boissons alimentaires : viscosité, clarification, digestibilité, goût, etc • Amélioration de procédé de panification • Amélioration de la production de produits lactés.

La chimie industrielle et pharmaceutique
• Production d’acides divers (lipase, pénicilline amidase) • Modification de la structure d’antibiotique.

Autres secteurs
• Textile • Blanchissage • Tannerie

Exemples d’application
 Lactase immobilisé par inclusion
• C’est une enzyme utilisée pour l’hydrolyse du lactose du lait. • Elle est produite par Saccharomyces lactis. • L’immobilisation se fait par inclusion dans des fibres de triacétate de cellulose. • Les fibres ainsi obtenues sont mise en œuvre dans un réacteur fonctionnant en batch alimenté avec du lait écrémé stérilisé.

 Les lipases immobilisées  Dans la réaction d’hydrolyse  l’hydrolyse du triglycéride en acide gras et en glycérol.  l’hydrolyse du suif de bœuf la lipase de Condida cylindracea immobilisée par liaison covalente sur des billes de Chitosane  Applications dans le domaine de détergents  Entrent dans la composition des lessives  développement des aromes des fromages lors de la maturation

 Dans la réaction de synthèse  synthétiser des esters la lipase de C. rugosa
immobilisée sur du nylon a permis la synthèse d'oléyl butyrate à partir d'acide butanoïque et de n-butanol en présence de n-hexane

 Transestérification

la production des équivalents du beurre de cacao, des huiles de basse valeur calorique aussi dans l’industrie cosmétique et la production de biodiesel .

 Interestérification

La lipase de Pseudomonas sp. immobilisée sur de la célite et celle de Rhizomucor miehei immobilisée sur une résine échangeuse d'anions

pour l'interestérification de l'huile de palme, l'huile de palmiste .

Conclusion
L’application de la catalyse enzymatique aux processus chimiques diminue l’utilisation de produits nocifs dans l’environnement et réduit ainsi le coût de traitement Les enzymes offrent un avantage distinct dû à leur spécificité, la biodégradabilité et la limitation de la formation de sous-produits. L’enzyme doit être compatible et stable. Au niveau fonctionnel, la stabilité d’une enzyme limite souvent son application pratique dans des processus médicinaux et biotechnologiques.
Une approche possible pour stabiliser des enzymes est leur immobilisation sur une matrice appropriée. Du point de vue industriel, les biocatalyseurs immobilisés présentent une stabilité augmentée, des changements dans l’activité enzymatique, le pH optimum et l’affinité pour le substrat ont été observés. Ces changements dépendent de la source de l’enzyme, du type de support et de la méthode d’immobilisation.

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