1

ndice

I. Introduccin II. Objetivos III. Marco Terico 1. Extraccin del ADN vegetal 1.1 El ADN vegetal 1.2 Por qu funciona as la extraccin de ADN vegetal? IV. Materiales VI. Resultados

3 4 4-5 4 4-5 5 5 6

1. Procedimiento: Flujo grama y representacin grfica para la extraccin del ADN 6 2. Constitucin de ADN 7 3. Utilidad aplicada a la extraccin de ADN 7-8 4. ADN recombinante 8 5. Proceso de reaccin en Cadena de Polimerasa (PCR) 8-10 6. Protocolo casero para la extraccin de ADN 10 VII. Conclusiones VIII. Bibliografa 11 12

Introduccin
La gentica es una disciplina biolgica que ha adquirido gran importancia y relevancia durante las ltimas dcadas del siglo XX. Es as como, en nuestros das los conocimientos que nacen de su desarrollo influyen en el crecimiento de otras disciplinas biolgicas, de la medicina y del avance tecnolgico general, influyendo incluso en la calidad de vida. El cido desoxirribonucleico (ADN) es un cido nucleico que contiene instrucciones genticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus; adems es responsable de su transmisin hereditaria. El papel principal de la molcula de ADN es el almacenamiento a largo plazo de informacin. Muchas veces, el ADN es comparado con un plano o una receta, o un cdigo, ya que contiene las instrucciones necesarias para construir otros componentes de las clulas, como las protenas y las molculas de ARN. Los segmentos de ADN que llevan esta informacin gentica son llamados genes, pero las otras secuencias de ADN tienen propsitos estructurales o forman parte en la regulacin del uso de esta informacin gentica.

Objetivos
1. Realizar la extraccin de ADN de tejidos vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su composicin con tcnicas sencillas. 2. Observar la estructura fibrilar del ADN. 3. Establecer la relacin entre el proceso de extraccin y propiedades qumico-fsicas del ADN.

Extraccin del ADN Vegetal

La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. El estudio del ADN ha llevado a un enfoque molecular y bioqumico de gran impacto en el crecimiento de los conocimientos genticos. El anlisis del ADN y la informacin sobre la estructura gentica de un organismo nos permite visualizar la complejidad de los procesos involucrados en la expresin gentica. El acido desoxirribonucleico es una macromolcula que se encuentra en el ncleo de la clula y que es responsable de almacenar la informacin gentica. Es una doble cadena anti-paralela organizada en una doble hlice. Est formada por unidades llamadas nucletidos que se unen entre s por enlaces qumicos estables. El redescubrimiento de los experimentos de Mendel realizado independientemente por De Vries, Correns y Von Tshermak en 1900, marco el inicio de la gentica como disciplina organizada. Durante el crecimiento y desarrollo de esta ciencia, varios descubrimientos claves han servido de puntos de inflexin, acelerando todos ellos la velocidad a la que crecen los conocimientos en gentica y, a la vez abriendo nuevos campos de investigacin. El ADN Vegetal El ADN vegetal se encuentra en el ncleo celular, especficamente dentro de cromosomas, pero tambin se encuentra en los cloroplastos, ya que este organelo presenta una molcula de ADN circular y arrollada de tipo procarionte y eso le da cierta autonoma parcial con respecto al ncleo, es decir puede realizar sus propias sntesis de protenas. El ADN de la clula vegetal se encuentra dentro del ncleo, pero adems tienen dos orgnulos con su propio material gentico: las mitocondrias y los cloroplastos; ambos tienen una molcula circular de ADN. El ADN que se encuentra en los genes es un componente de todas las clulas; una vez rotas las clulas, todo el
4

material celular queda libre y, en presencia de detergente, se separan los componentes en base a su solubilidad. El ADN se precipita con alcohol y se separa del resto de los componentes. Porqu funciona as la extraccin del ADN vegetal? Funcin de la sal y del agua El agua con una pizca de sal es una mezcla isotnica. Es para que lo que se va a sacar de la semilla "sufra" lo menos posible. Funcin del detergente liquido El detergente rompe las membranas celulares grasosas que rodean el ADN como una burbuja de jabn (parecido), dejndolo libre en el caldo junto con las protenas y los carbohidratos. Funcin de las enzimas El ablandador de carne, zumo de pia o papaya, etc., todos estos son enzimas que cortan las protenas. Se trata de romper lo que hay dentro de la clula dejando intacto el ADN. Funcin del alcohol Al aadir el alcohol se consigue separar el ADN, que tiene ms afinidad con el alcohol que con el agua.

Materiales
Cebolla / Kiwi Dos tubos de Ensayo Etanol 95%(frio) Sal No-Iodada(Cloruro de Sodio) Jugo de papaya o pia fresco o ablandador de carne Beaker de 100 ml Mortero Detergente liquido Fenol

Resultados
1. Procedimiento: Flujo grama y representacin grfica para la extraccin del ADN

1.Preparacin de una solucin Tapn: Se prepara una solucin de sal y detergente y 10g de sal de 90 ml de agua destilada.

2. Coloque un pedazo de cebolla/kiwi de unos 2 cm en un mortero y agregue 10 ml de la solucin tapn. Macere la cebolla/kiwi

3. Decante el lquido de la mezcla en un tubo de ensayo limpio y agregue 1 ml de jugo enzimtico (jugo de pia).

4.Cuidadosament e agregue 10 ml de Etanol fro resbalando por las paredes del tubo de ensayo. Deje reposar unos tres minutos hasta que se forme una zona turbia.

5. Utilizando un palillo de madera, extraer una maraa de fibras mucosas blancas de ADN y colcalas en un tubo de ensayo limpio con una solucin salina al 4%.

6. Agregue 5 gotas de Fenol a la solucin que contiene el ADN.

* Solucin de Sal y detergente; esta concentracin debido a su alta concentracin de iones positivos provoca que los iones negativos de la membrana fosfolipdica se rompa liberando el citosol. * Maceramiento de el kiwi; esta accin mecnica contribuye al rompimiento de la membrana nuclear y celular. * Jugo enzimtico (jugo de pia): contiene enzimas que desnaturalizan las protenas que contaminan el ADN. * Mezcla de ADN y Fenol, el fenol es un indicador que en presencia de ADN se torna rosado oscuro, tambin se puede usar azul de metileno.

2. Constitucin del ADN El ADN est constituido por unidades llamadas nucletidos, unidas entre s formando largas cadenas. A su vez, cada nucletido est formado por tres partes: Un fosfato. El azcar desoxirribosa. Una base nitrogenada. Estas ltimas se dividen en dos grupos: Las bases puricas (adenina y guanina) y Las pirimidinicas (timina y citosina). Llamadas as porque se derivan de dos compuestos, la purina y la pirimidina.

3. Qu utilidad se le puede aplicar a la extraccin del ADN? Existe un sin nmero de utilidades que puede drsele a la extraccin del ADN; puesto que a partir de aqu es que se forman las estructuras moleculares que regulan y mantienen en buen o mal estado el funcionamiento de nuestro cuerpo, dependiendo de la eficacia que tenga la produccin de protenas.
7

Entre algunas de las utilidades tenemos: Encontrar relaciones de parentesco. Detectar enfermedades que sean o no hereditarias. Identificar las causas a ciertas afecciones. Buscar solucin a estas afecciones.

4. ADN Recombinante El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molcula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unin de secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se produce una modificacin gentica que permite la adicin de un nuevo ADN al organismo, conllevando a la modificacin de rasgos existentes o la expresin de nuevos rasgos. La produccin de una protena no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman protenas recombinantes. El proceso consiste en tomar una molcula de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresin de un gen, para producir protenas en el tratamiento de una enfermedad gentica, vacunas o con fines econmicos y cientficos. 5. Definir y describir el proceso de PCR La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Ciclo de amplificacin Inicio Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se
8

mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor. Desnaturalizacin En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin. Alineamiento o unin del cebador A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada. Extensin o elongacin de la cadena Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto del ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto. Elongacin final Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 515 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. Conservacin Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de
9

acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR. 6. Protocolo Casero para extraer ADN Ingredientes necesarios - Alcohol - Detergente lquido - Enzimas (ablanda carne) (Si no tienes, usa jugo de pia o solucin limpia lentillas) - Sal - Agua - Fuente de ADN (vegetales, carne, etc.) - Vasos - Licuadora - Colador - Tubo de ensayo de vidrio Instrucciones 1) Sacar la licuadora. 2) Vierte una taza de agua fra (200 ml), junto con taza del ADN elegido y sal 3) Lica todo eso a mxima velocidad durante 15 segundos 4) Filtra la mezcla resultante con un colador de casa 5) Ahora debes echarle el detergente a ese lquido que has obtenido de la licuadora. El detergente debe ser un 1/6 de la cantidad del lquido. 6) Djalo reposar 10 minutos 7) Psalo a un tubo de ensayo de vidrio hasta 1/3 de su capacidad 8) Aadir una pizca de enzima al tubo de ensayo 9) Agitar suavemente para no romper el ADN (qu frgil el muchacho) 10) Agregar alcohol hasta llenar la mitad del tubo de ensayo 11) El ADN se elevar hasta la interfase y con un palito por fin podrs extraerlo

10

Conclusiones

1. El ADN vegetal se encuentra en el ncleo celular, pero tambin se encuentra en los cloroplastos, ya que estos organelos presentan una molcula de ADN circular. 2. La estructura fibrilar del ADN se puede observar fcilmente una vez rotas las clulas, quedando as todo el material celular libre. 3. Las propiedades fsico-qumicas del ADN permiten que al aadir el alcohol (fenol) se consigue separar el ADN, que tiene ms afinidad con el alcohol que con el agua.

11

Bibliografa

1. Protocolos de Laboratorio de Biologa molecular. Corbin. L. Ghislain. M. Dapeng .Z. 2da ed. 1998. CIP. Per. Lima. Pg. 1-8

12