Transcripcin

2007 Mnica Marn Seccin Bioqumica, Facultad de Ciencias, UdelaR

Replicacin
retrotranscripcin

ADN

ARN

PROTEINAS
Traduccin

Transcripcin

ARN

ARNm (ARN mensajero) ARNt (ARN de transferencia) ARNr (ARN ribosomal)

Pequeos ARNs reguladores

Dificultad para mostrar la existencia del ARNm

ARNm (ARN mensajero) 1- 3 % del ARN total celular ARNt (ARN de transferencia) ARNr (ARN ribosomal)

ARN

ARNm es muy inestable

ARN ribosomales bacterianos 5S 16S y 23S enmascaraban al ARNm S: unidades Svedberg. se refiere a la velocidad de sedimentacin en la centrifugacin

Transcripcin: sntesis del ARN, ADN dependiente

Siempre

Requiere un molde de ADN Enzima: la ARN polimerasa Tres etapas: - Iniciacin - Elongacin - Terminacin

Transcripcin en procariotas:
Una nica ARN polimerasa Todos los promotores son reconocidos por la misma enzima Los ARNm tienen:
Extremo 5ppp (tri fosfato) Extremo 3 : estructura de un terminador o nada en particular Principal modificacin post transcripcional de los ARNm: su propia degradacin (vida media 2-3 min)

Burbuja de la transcripcin

La reaccin de polimerizacin:
Inicialmente se identific una enzima capaz de polimerizar ARN in vitro, pero sin molde!! Mas adelante se encontr la ARN polimerasa ADN dependiente:
Mg++

(NMP) n

(NMP) n+1 + PPi

los metales en la reaccin de polimerizacin

Estructura de la ARN polimerasa de E. coli

Holoenzima:
PM (kDa)

2, , , , : reconoce
promotor el

Sintetiza los 3 tipos de ARNs

ARNm ARNt ARNr

Iniciacin de la transcripcin
Requiere:
Reconocimiento de la seal especfica en el ADN que indique el inicio. Formacin del complejo cerrado en una determinada orientacin (determinacin de la hebra molde) Separacin de las hebras, (formacin del complejo abierto) Inicio de la sntesis del ARN

Promotor: seal de iniciacin de la transcripcin en el ADN

Cmo identificar y aislar los promotores? ADN purificado + ARN polimerasa + DNAsa (exonucleasa)

Inicio de la transcripcin: formacin del complejo ARNpol - promotor

Complejo Cerrado

Complejo Abierto

ADN

promotor

Elongacin

Anlisis comparativo de la secuencia de los promotores aislados ( 80 pb)

No hay una homologa de secuencia significativa entre ellas Solo hay 2 pequeas regiones mas conservadas (consenso) :
Situadas en - 10 y - 35

- 35

- 10

+1

4 elementos comunes identificados en promotores de E. coli :

+1: En 10 : En 35: una purina, G o A T80 A95 T45 A60 A50 T96 T82 T84 G78 A65 C54 A45 1

Separacin entre ambos sitios: 17

Protena de unin al ADN

Huella (Footprinting)
Localizacin de los sitios de unin de protenas en el ADN puede ser precisa

Efecto de mutaciones

Promotores fuertes y dbiles, segn cunto ARN se sintetice a partir de ellos. Los dbiles constitutivos inducibles, regulados por activadores y represores

Sobre la terminacin de la transcripcin:

No es tan exacta como la iniciacin

Hay dos formas de terminacin: independiente dependiente

Terminador

independiente
Poli A

Repetidos invertidos

Terminadores independientes del factor

Se caracterizan por : -la presencia de una regin rica en AU / AT y - la formacin de una estructura en horquilla, en el ARN recin sintetizado

Terminacin

-dependiente

Transcripcin en clulas eucariotas

3 ARN polimerasas que dan diferentes productos: ARN pol I : ARN r ARN pol II : ARNm ARN pol III : ARN pequeos: ARNr 5S y ARNt Con diferente sensibilidad a la alfa amanitina Importante procesamiento de los transcriptos modificaciones post transcripcionales

Alfa-amanitina: inhibidor diferencial de ARN polimerasas eucariotas

amanita

Otros inhibidores de la transcripcin

Cordicepina

Actinomicina D

Principales modificaciones postranscripcionales en el ARNm de clulas eucariotas En los ARNm :

En el extremo 5 En el extremo 3 Eliminacin de intrones

Modificacin del extremo 5 del ARNm en eucariotas

Trifosfato 7 metil guanosina

7mG

Modificacin del extremo 3 del ARNm en eucariotas

ADN

AATAAA TTATTT AAUAAA AAUAAA

(poliA-polimerasa) 3 (endonucleasa)

ARNm 5

AAUAAA

AAAAAAAAAAAA....A

3: poliadenilacin en eucariotas
Factor specificidad de clivaje, CPSF Activador de clivaje, Cstf CTD, dominio C terminal

Poliadenilacin del ARNm en eucariotas

PAP (pA polimerasa)

poliA binding proteins

ARN

200 adeninas en cola poli A

Y la terminacin de la transcripcin? 2 modelos:

1) Extremo 5 sin cap desestabiliza el complejo ADN- ARNp 2) La disociacin de los factores de poliadenilacin del CTD (ARNp) favorecen la disociacin.

Procesamiento de ARNr y ARNt

El ~1% del genoma de E. coli codifica para estos ARNs, pero constituyen el 99% del ARN total de la bacteria Ambos se transcriben como transcriptos largos (pre-ARNr)

Estructura de un transcripto pre-ARNr en E. coli

RNasa III libera los ARNr 16S y 23 S

Procesamiento postranscripcional del ARNt Tyr

Ribonucleasa P : una ribozima

Crea el extremo 5 de los tRNAs Su estructura consiste en: Una molcula de ARN de 377 nt Una cadena polipeptdica de 20 kDa Ambos componentes son necesarios para una actividad cataltica completa En condiciones no fisiolgicas el ARN puede cortar esas secuencias con precisin.

Intrones y exones
Experimentos de hibridacin ADN / ARNm analizados por microscopa electrnica

Ovoalbmina de pollo protena: 386 aa gen: 7700 pb

Intrones y exones de la hemoglobina

Cmo se eliminan los intrones sin alterar las secuencias codificantes?

Cules son las seales en los cidos nucleicos, en el ARN, que indican los lmites de los intrones? cul es el mecanismo que lo asegura?

Intrones del Grupo II Intrones procesados por el espliceosoma

ramificacin

Spliceosoma
150 protenas (snRNP y proteinas) 5 ARNs (snRNAs)

Complejo temprano

Corte y empalme alternativo

Sub-grupo de exones es conservado en la maduracin del ARNm, los otros son procesados como si fueran intrones.

7 formas de la -tropomiosina (rata)

(sistema contrctil de diversos tipos celulares)

RESUMEN Modificaciones en los ARNm eucariotas:

En eucariotas: Iniciacin de la transcripcin por la ARNpol II

Para la sntesis de ARNm y algunos snRNAs Las 12 subunidades de la ARNpol II son insuficientes para iniciar la transcripcin Se necesitan al menos 5 factores adicionales: TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH (expresin basal) Participan otros factores para regular la transcripcin

Complejo mnimo de iniciacin de la transcripcin en eucariotas (expresin basal)

Factor subunidades kDa

Estructura de un promotor eucariota

Potenciador

GC

CAAT

-100

-80

-20

+1

Iniciacin de la transcripcin por la ARNpol II en eucariotas

TBP+TAF=TFIID CTD: dominio Ctl de una subunidad de la ARNpol II

CTD es fosforilado