Tecnologa Industrial

Fabricacin de productos estriles (y II)

Esterilizacin y esterilidad

JUAN PEDRO ITURRALDE

Farmacutico

11. ESTERILIZACION POR FORMALDEHIDO Y VAPOR A BAJA TEMPERATURA

La esterilizacin por formaldehdo y vapor a temperatura baja se usa como alternativa al xido de etileno para esterilizar una amplia gama de dispositivos mdicos incluyendo tubos de nefrostoma, laparoscopios, dispositivos de fibra ptica y electrodos. Como con cualquier otro agente gaseoso, la Farmacopea Europea slo la admite cuando no existe otra alternativa de esterilizacin adecuada. El formaldehdo (HCHO) es un gas incoloro de olor caracterstico. No es explosivo ni inflamable en el aire. Tiene un poder de penetracin bajo, alta afinidad por el agua y se polimeriza fcilmente sobre superficies a temperaturas por debajo de 80C. El formaldehdo gaseoso es txico para el hombre pero su olor, a diferencia del xido de etileno, puede detectarse a concentraciones muy por debajo
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de los niveles txicos. Los sntomas de intoxicacin aguda son iritacin respiratoria y conjuntival. El formaldehdo gaseoso, a diferencia de las disoluciones acuosas de formaldehdo, no induce hipersensibilidad retardada de tipo IV mediatazada por clulas Ty no constituye un sensibilizador cutneo potente. El fomaldehdo es un mutgeno de accin directa y posiblemente un carcingeno humano. El nivel mximo de exposicin admitido en el Reino Unido es de 2 ppm durante 8 horas. El formaldehdo es un agente alquilante activo frente a todos los tipos de microorganismos incluyendo esporas bacterianas. Su actividad se ve influenciada por el contenido en agua de los organismos y se requieren niveles de humedad relativa entre el 75% y el 100% para una actividad ptima. La actividad se ve tambin influenciada por la temperatura, concentracin gaseosa y tiempo de exposicin y se ve marcada-

mente reducida en presencia de materia orgnica. La adicin de vapor saturado seco a presin subatmosfrica potencia la actividad esporicida del formaldehdo y produce condiciones esterilizantes. Se han utilizado ciclos de esterilizacin con formaldehdo y vapor a baja temperatura con concentraciones de formaldehdo de 3 mg/l a 100 mg/l, temperaturas de 60C a 80C y tiempos de exposicin de 1 a 6 horas. En el Reino Unido el ciclo recomendado emplea 14 mg/l de formaldehdo en combinacin con vapor saturado seco a 73C 2C (35 3 kPa). Los esterilizadores de formaldehdo y vapor a temperatura baja son de diseo y construccin similares a los de carga porosa. Se prefieren los ciclos de esterilizacin automticos que emplean pulsos de formaldehdo y vapor a los de inyeccin nica de formaldehdo seguida de un perodo de
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exposicin. La cmara se somete primeramente a vaco para eliminar el aire de la carga y ayudar a la penetracin del gas. La carga se calienta inicialmente mediante vapor fIuente. A continuacin se admite en la cmara formaldehdo, generado por vaporizacin de formalina en un vaporizador con camisa de vapor, y se deja difundir por toda la carga durante unos dos minutos. Esto va seguido de una inyeccin de vapor hasta la temperatura de trabajo y de una re-evacuacin de la cmara. Se pueden introducir durante el perodo de esterilizacin hasta veinte pulsos de formaldehdo y vapor. El formaldehdo se elimina de la cmara mediante arrastre con vapor y la carga se seca y airea mediante varios pulsos de vaco/aire estril. El British Standard 3970: Parte 6:1993 detalla las especificaciones de los esterilizadores de formaldehdo y vapor a temperatura baja. No se requiere prehumidificacin de la carga antes de la esterilizacin por formaldehdo y vapor a temperatura baja. La configuracin de la carga es crtica para asegurar una distribucin homognea del esterilizante dentro de la cmara del esterilizador. Debe tenerse especial cuidado en asegurar la ausencia de agua libre ya que el formaldehdo gaseoso tiene alta afinidad por el agua. De acuerdo con la Ph. Eur., el indicador biolgico de eleccin para contrastar los ciclos de esterilizacin con formaldehdo debe tener ms de 5 x 105 esporas viables de Bacillus subillis var . niger. El Pharmaceutical Codex seala, para verificar la eficacia de penetracin del gas, indicadores con ms de 106 esporas de Bacillus stearothermophilus en un dispositivo helicoidal Line-Pickerill. Aunque se produce absorcin del formaldehdo por los materiales, los niveles residuales son mucho ms bajos que los del xido de de etileno por lo que el perodo de desgasificacin es por tanto reducido.

pleado. La causa de la mortalidad bacteriana por este mtodo es la lesin gentica causada por coagulacin de una protena celular (ADN), a travs de una reaccin unimolecular o bimolecular de primer orden. Los autoclaves comercializados existentes funcionan en su mayora con vapor sobresaturado o agua sobrecalentada a presin (autoclaves de inmersin), o en ciertas circunstancias con mezclas vapor-aire (vapor bajo presin parcial) o utilizando condensado pulverizado bajo presin. La mayora de las farmacopeas definen la esterilizacin por vapor en trminos de tiempo a 121C (250F). La Farmacopea Europea establece que las condiciones de calentamiento para preparaciones acuosas deben ser de un mnimo de 121C durante 15 minutos siempre que se demuestre satisfactoriamente que el proceso elegido proporciona un nivel de l e t a l i dad adecuado y reproducible, cuando se opere rutinariamente dentro de los niveles de tolerancia establecidos. El principio bsico de funcionamiento es el desplazamiento del aire de la cmara de esterilizacin por vapor saturado, lo que se consigue empleando purgas y condensadores. El ciclo de esterilizacin puede incluir fases de evacuacin de aire y vapor para desplazar el aire ms eficazmente de la cmara y del interior de los artculos. Es fundamental que la cmara del autoclave quede ocupada por vapor sin que se formen bolsas de aire que creen subcompartimentos que se comporten como cmaras parciales de esterilizacin incompleta por calor seco. El aire caliente a 121C requerir de 10 a 12 horas para ejercer un efecto letal sobre las esporas. Los tiempos programados para ciclos de vapor son totalmente insuficientes. Los recientes desarrollos han mejorado grandemente Ia eliminacin del aire mediante una variedad de prevacos y de sistemas de vaco pulsante o de pulsos de vapor-vaco. Estos sistemas encuentran su aplicacin ms especfica en la eliminacin del aire de productos porosos (aqullos que lo son o que van rodeados de envoltorios que los asimilan a poro-

sos) ms que en la eliminacin del aire de la cmara de esterilizacin en s. El mtodo de esterilizacin con prevaco implica la rpida evacuacin de la cmara a 15 mm de Hg antes de aadir el vapor. Otras modificaciones utilizan una rpida eliminacin del aire seguida de presiones de vapor mayores y, por tanto, temperaturas ms altas. Esto puede reducir sustancialmente el tiempo de exposicin-requerido a la esterilizacin. As pues, Ios ciclos de esterilizacin clsicos ms habitualmente usados en trminos de temperatura-tiempo son los siguientes: 1) Material no poroso 121C (250F), 15 minutos (Ph. Eur/USP) 2) Material poroso 121C (250F), 17 minutos (UNE 111-750-89). 126C (258,8F), 11 minutos (UNE 111-750-89). 134C (273,2F), 3 minutos (UNE 111-750-89). Respecto a los agentes causantes de las encefalopatas espongiformes, la Directriz III/3298/91-EN FINAL establece, como procedimiento de inactivacin ms eficaz, aunque sin total garanta, ciclos de 134-138C (273,2-280,4F) durante 18 minutos para cargas porosas. En el caso de autoclaves de desplazamiento-gravedad se recomiendan tratamientos a 132C (269,6F) durante 1 hora. Posteriormente, la Decisin 97/534/CE ha fijado 133C, a 3 bares (3,06kg/cm2 2,96 atmsferas) de presin, durante 20 minutos, para garantizar la inocuidad de la harina de carne y huesos, si bien este sistema no puede garantizar totalmente la completa eliminacin del agente patgeno de la encefalopata espongiforme transmisible presente en el material que vaya a tratarse si ste posee una gran capacidad infectiva. En cuanto a los requerimientos de letalidad, las farmacopeas son unnimes al requerir que los ciclos se diseen de manera que el nivel de supervivencia (nivel de garanta de la esterilidad-NGE) se site en 1 x 10-6. La recientemente publicada (borrador) directriz (CPMP/QWP/ 054/98
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12. ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO

El calor hmedo en forma de vapor saturado es el mtodo de esterilizacin considerado ms eficaz y el ms universalmente em60

fija el requerimiento de Fo (temperatura de referencia 121C y valor Z = 10C) en 15 minutos. Por su parte, la americana Parenteral Drug Association seala que es deseable que el ciclo aporte un Fo que proporcione, como mnimo, una reduccin de 12 ciclos logartmicos de grmenes con un valor D de 1 minuto. El diseo de un proceso de esterilizacin a Ia medida requiere la determinacin previa del valor D del contaminante habitual del producto de mayor resistencia. El tiempo de esterilizacin necesario vendr dado por: t = D (log a- log b) En donde los trminos de la ecuacin son ya conocidos y b se asume, de acuerdo con las farmacopeas, como 10-6; t ser as el F0 a determinar dentro del producto en el punto ms fro del autoclave durante la esterilizacin. La contrastacin de los ciclos de esterilizacin en autoclave se realizar mediante el empleo de indicadores fsico-qumicos, biolgicos o mixtos. C.W. Bruch divide los indicadores fsico-qumicos en dos clases: intrnsecos, esto es, los construidos con el autoclave (manmetros, termmetros, registradores grficos), y extrnsecos, esto es, los que se aaden a la carga para indicar que ciertas variables del proceso estn dentro de un rango mnimo o mximo. Los indicadores extrnsecos suelen ser fundamentalmente tiras, tarjetas o cintas impregnadas en tintas sensibles a las condiciones de esterilizacin. Aunque son tiles por su facilidad de empleo sus indicaciones son excesivamente groseras. Sin embargo, existen otros indicadores que merecen una mencin especial. 1) Hojas para prueba de BowieDick. Se utilizan en la llamada prueba de Bowie Dick, preceptiva segn la norma espaola UNE 111-750-89 para la verificacin de la eliminacin del aire en la esterilizacin de material poroso. Consisten en una hoja de fondo blanco de 270 5 mm x 200 5 mm, con una permeabilidad al aire superior a 5 m /Pa.s) (300 cm3/mm). Deben contar con un indicador de color sensible que
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detecte si se ha expuesto el producto a vapor saturado seco. La prueba de Bowie-Dick mide el llamado efecto de pequea carga. Se prepara un pequeo paquete con la hoja de prueba en el centro geomtrico y se coloca junto a la lnea de drenaje de la cmara del autoclave. 2) Indicadores Steam-Clox. Son tiras indicadoras que viran del morado al verde en cuatro fases progresivas. Sus condiciones son 121C durante 30 minutos y humedad apropiada. 3) Indicadores Thermolog-S. Consisten en tiras de color blanco de 72 mm de longitud conteniendo en un extremo un depsito con un compuesto qumico coloreado de azul que avanza sobre una lnea blanca en una escala graduada en unidades de Fo (F12110). El rango de utilizacin es entre 115C - 132C, (algunos autores sugieren no exceder de 123C). La contrastacin biolgica se realiza con tiras de esporas (5 x 105 esporas/tira de Bacillus stearothermophilus ). Hay dispositivos que incorporan la tira junto con el medio de cultivo y un indicador de crecimiento. Concluida la esterilizacin, se mezcla todo apretando el dispositivo y se incuba a 55C. En 48 horas se tiene una respuesta sobre la eficacia en la esterilizacin bastante aproximada, si bien el perodo de incubacin reglamentario es de 7 das. 4) Hay finalmente un dispositivo llamado Chemspor que incorpora indicador de color y tira de esporas con medio de cultivo e indicador de pH. Sin embargo la mejor aproximacin a la esterilidad se consigue verificando el valor Fo establecido a travs de las tomas de temperatura del producto dentro de su envase empleando sondas termopares unidas a un registrador. La validacin de la esterilizacin por calor hmedo abarca aspectos funcionales y de calibracin de Instrumentos y de validacin del propio ciclo en sucesivas series con cmara vaca y llena empleando sondas termopares dentro y fuera de los envases as como indicadores biolgicos. Se verificar el grfico de esterilizacin, correlacin entre elementos de control, Fo medio y mnimo y ta durante el enfriamiento.

Otros aspectos relacionados con la seguridad en la esterilizacin por vapor se deben centrar en el control de carga microbiana admisible en la preesterilizacin, carga microbiana en el agua de enfriamiento de los autoclaves que incorporan este tipo de ciclos ( 10 grmenes/l), diseo del cierre e integridad del envase.

13. ESTERILIZACION POR CALOR SECO

Algunos productos no pueden esterilizarse por calor hmedo y se esterilizan mejor con calor seco. Ejemplo de ello son los derivados del petrleo, aceites minerales, grasas, ceras, polvo de talco, materiales textiles impregnados, tiles de acero y material de vidrio (ampollas, viales). La accin letal del calor seco se debe fundamentalmente a un proceso de oxidacin de los componentes celulares. Debido a que el calor seco es menos eficaz que el calor hmedo, se requieren temperaturas y tiempos de exposicin ms altos. Aunque la esterilizacin por calor seco es uno de los mtodos conocidos ms antiguos, el establecimiento exacto y correcto de los ciclos de temperatura-tiempo no es nada rutinario. Se ha establecido un amplio rango de tiempos de inactivacin a diferentes temperaturas basados en los indicadores de esterilidad utilizados, las condiciones de humedad y otros factores. Es un hecho conocido que el contenido en agua de la clula microbiana influencia su resistencia a la destruccin por calor seco. Generalmente se acepta que las clulas microbianas extremadamente desecadas muestran resistencia incrementada a la inactivacin por calor seco. Es claro, pues, que debe tenerse cuidado en el diseo de los ciclos de esterilizacin y que debe practicarse la validacin de la esterilidad por algn mtodo estandarizado aceptado. Las estufas utilizadas en la esterilizacin por calor seco se controlan generalmente termostticamente y pueden ser calentadas por gas o elctricamente. Deben construirse para proporcionar una circulacin adecuada de aire que evite la estratificacin del aire callente que puede causar sobrecalentamiento en unas zonas y temperaturas subesterilizantes en otras. En algunos modelos se emplean ven61

Tabla III 170C Endotoxinas (LPS) de Escherichia coli Esporas de Bacillus xerothermodurans 6,96 min 20,5 min (D1) 170 min (D2) 250C 0,53 min (D1) 5,6 min (D2) 32 x 10-6 min

tiladores que hacen circular el aire caliente mientras que en otros la uniformidad de la distribucin trmica se consigue empleando dispositivos de desviacin de la corriente de aire (generadores de turbulencia). Debido a la variada naturaleza de los productos a esterilizar por calor seco no es posible establecer una nica relacin temperatura-tiempo para los productos farmacuticos y materiales hospitalarios. Sin embargo, algunos de los pares de temperatura-tiempo ms utilizados son los siguientes: 140C (285F) 3 horas. 150C (300F) 2,5 horas. 160C (320F) 2 horas (Ph.Eur). 170C (340F) 1 hora. 180C (356F) 30 minutos > 220C (428F) (Ph. Eur) 250C (482F) (U.S.P); 30 minutos (The Pharmaceutical Codex) Muchas preparaciones farmacuticas, sin embargo, no pueden someterse a esas temperaturas. Por tanto, se han establecido otros ciclos de esterilizacin por calor seco. Los agentes quimioteraputicos, polvos con bajos puntos de fusin, ciertos lquidos en aceite (por ejemplo: dimercaprol ) y cierta variedad de otras sustancias requieren ciclos especialmente diseados que utilizan temperaturas ms bajas durante tiempos ms largos. La evaluacin biolgica de cualquier mtodo de esterilizacin por calor seco debe contrastarse empleando indicadores biolgicos adecuados (105 esporas/tira de Bacillus sutilis var. niger). Los indicadores fsico-qumicos existentes en forma de tiras o tarjetas nicamente sealan que el producto ha sido sometido a esterilizacin. La validacin de los ciclos puede obtenerse tambin a travs del establecimiento de algn valor F, aqu denominado FH, y la comprobacin mediante el empleo de son62

das trmopares y la ecuacin siguiente, de que ha sido alcanzando dicho FH. T1 - T2 FH = t antilog Z En donde: F H : Letalidad a un intervalo de tiempo dado, expresada en trminos del tiempo equivalente en minutos a una temperatura de referencia (por ejemplo, 170C) con respecto al valor Z de los microorganimos contaminantes. t: Intervalo de tiempo entre dos medidas de las temperaturas de prueba. T 1 : Temperatura del producto (C) en el tiempo t. T2: Temperatura de referencia del proceso (por ejemplo: 170C). Z = Aumento o descenso de temperatura (C) que provoca un cambio en el valor D de 10 (un ciclo logartmico). Generalmente F H se expresa en trminos F20170. Los requerimientos de probabilidad de supervivencia (nivel de garanta de esterilidad-NGE) estn en 1 x 10-6 en la Ph. Eur. y en 1 x 10 -12 en la USP. La validacin de la esterilizacin por calor seco abarca aspectos funcionales y de calibracin de instrumentos y de validacin del propio ciclo en sucesivas series con la cmara llena empleando sondas termopares dentro y fuera de los envases as como indicadores biolgicos. Se verificarn en el grfico de esterilizacin, la correlacin entre elementos de control, FH medio y mnirno y ta durante el enfriamiento. Pero la esterilizacin por calor seco encuentra otra faceta de aplicacin en la despirogenacin de material a utilizar en la fabricacin y envasado

de productos parenterales. Los pirgenos son sustancias de origen bacteriano productoras de fiebre. Pueden ser exotoxinas de bacterias Gram-positivas (termolbiles) o endotoxinas de bacterias Gram-negativas (termorresistentes). Estas ltimas constituyen el objetivo de nuestra preocupacin. El control de pirgenos se ha venido realizando histricamente a travs del bioensayo con conejos (inespecfico). Ultimamente las farmacopeas han adoptado para la mayora de sus productos inyectables el ensayo de determinacin de endotoxinas mediante la prueba del lmulo reemplazando as el tradicional ensayo de pirgenos. La prueba del lmulo permite determinar el contenido en endotoxinas bacterianas en forma cuantitativa o semicuantitativa permiendo as establecer lmites de aceptabilidad en trminos de concentracin lmite de endotoxina expresada en unidades internacionales de endotoxinas por ml y por mg. La aparicin del ensayo del lmulo de cuantificacin del contenido en endotoxinas bacterianas ha permitido adems progresar en los estudios de cintica de inactivacin de lipopolisacridos. La destruccin de endotoxinas bacterianas (lipopolisacridos) por calor sigue una cintica de segundo oden que se expresa mediante la ecuacin siguiente: log Y = A + B 10Cx En donde: Y: % de LPS que permanece tras el proceso. A,B,C: Constantes a una temperatura determinada. X: Tiempo de calentamiento, en minutos. La representacin grfica del porcentaje de LPS en ordenadas, frente al tiempo en minutos, de aplicacin de la temperatura despirogenante, genera dos lneas de primer orden con dos valores diferentes (D1 y D2). A partir de la anterior ecuacin se deduce la siguiente: log Y - A log = Cx B

Si representamos el primer miembro de esta ecuacin en ordenadas frente al tiempo X en abscisas obtenemos una lnea recta cuya penINDUSTRIA FARMACEUTICA - MARZO/ABRIL 1999

diente es C, de modo que aparece un nuevo valor D3, tal que: D3 = 1/ICI Las endotoxinas bacterianas son extraordinariamente ms resistentes al calor seco que las esporas bacterianas. La Tabla III que compara los valores D es suficientemente autoexplicativa. En cuanto a los valores Z, los correspondientes a los LPS de E. coli. son de 46,8C y 53,7C frente a 15C para las esporas de B. xerothermodurans. Este modelo matemtico ha sido muy discutido y otros investigadores han propuesto nuevas ecuaciones tales como: 1/At = 1/Ao + Kt En donde: t = Tiempo en minutos. k = Constante de velocidad de segundo orden (min-1). A o = Cantidad de endotoxina (UE) en tiempo cero. At = Cantidad de endotoxina (UE) en tiempo t. Adems, se utiliz otro modelo matemtico para ajustar los datos a la suma de dos exponenciales: At = A1 e-kt + A2e-K't En donde: t = tiempo en minutos. At = Cantidad de endotoxina (UE) en tiempo t. A1 y A2 = Coeficientes (UE). k y k = Constantes de velocidad (min-1). La aproximacin al concepto de despirogenacin permite tambin la utilizacin del concepto F, aqu denominado FENDO o FT trminos de F 54 250 F 250 46,4 . Sin embargo, deber tenerse en cuenta que parece ser que no es aplicable a la despirogenacin el concepto de que las letalidades son aditivas con respecto a la variacin de temperaturas, base de los clculos de los valores F usados para comprobar los procesos de esterilizacin. Todavia queda bastante por investigar sobre las cinticas de destruccin de LPS, considerando aspectos como el origen microbiano, mecanismo de destruccin, etc., para poder desarrollar un modelo de integracin de la destruccin letal de LPS que facilite
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Fig. 2. Procedimiento de esterilizacin. Formulaciones acuosas. Esquema de toma de decisiones para escoger el proceso de esterilizacin (Directriz CPMP/QWP/054/98)
ESTERILIZACION EN AUTOCLAVE A 121C/15 MIN No AUTOCLAVE CON Fo = 8 MIN (NGE 10-6) No S AUTOCLAVE A 121C/15 MIN S

FILTRACION ESTERILIZANTE No

AUTOCLAVE CON Fo = 8 MIN S FILTRACION ESTERILIZANTE + PROCESADO ASEPTICO

PROCESADO ASEPTICO

Fig. 3. Procedimientos de esterilizacin. Formulaciones lquidas no acuosas o productos en polvo seco. Esquema de toma de decisiones para escoger el proceso de esterilizacin (Directriz CPMP/QWQ/054/98)
ESTERILIZACION POR CALOR SECO A 160C/120 MIN No OTRA COMBINACION DE TEMPERATURA/TIEMPO (CON NGE 10-6) No S

ESTERILIZACION POR CALOR SECO A 160C/120 MIN S

OTRO PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACION COMO RADIACION IONIZANTE CON UNA DOSIS MINIMA ABSORBIDA 25 kGy No RADIACION IONIZANTE CON UNA DOSIS MAS BAJA (ref. ISO 11137) No

ESTERILIZACION POR CALOR SECO A XC/Y MIN CON NGE 10-6

S RADIACION IONIZANTE CON UNA DOSIS MINIMA ABSORBIDA 25 kGy S RADIACION IONIZANTE CON UNA DOSIS MAS BAJA VALIDADA S FILTRACION ESTERILIZANTE + PROCESADO ASEPTICO

FILTRACION ESTERILIZANTE No

PROCESADO ASEPTICO

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Tabla IV Probabilidades del ensayo de esterilidad con niveles asumidos de contaminacin Probabilidad de encontrar el nmero de positivos indicados en las 10 muestras analizadas 0 0,990 0,904 0,599 0,349 0,028 0,001 1 (total = 0,010) 0,091 0,315 0,387 0,121 0,010 0,001 0,103 0,246 0,001 5 10

Contaminacin real en % 0,1 1,0 5,0 10,0 30,0 50,0

cin alternativos y el procesado asptico y filtracin esterilizante cuando se demuestre que el producto no puede ser esterilizado por el procedimiento ms seguro. No se aceptarn razones comerciales ni material de envasado inadecuado termolbil como justificacin para no aplicar el procedimiento de esterilizacin terminal ms seguro. El proceso de seleccin de mtodo de esterilizacin presentado por la directriz, ofrece para los diferentes tipos de productos mencionados, diversas alternativas de esterilizacin que van en orden decreciente de seguridad en la eficacia de esterilizacin. As pues tenemos: 1. Formulaciones acuosas Autoclave a 121/15 minutos > Autoclave con un Fo = 8 minutos (nivel de garanta de esterilidad 10 -6) > Filtracin esterilizante + Procesado asptico > Procesado asptico (Fig. 2). 2. Formulaciones lquidas no acuosas o productos en polvo seco. Calor seco a 160C/120 minutos > Calor seco a XC/Y minutos (nivel de garanta de esterilidad 10-6)> Radioesterilizacin con una dosis mnima absorbida de 25 kGy > radioesterilizacin con dosis ms bajas (ref. ISO 11137) > Filtracin esterilizante + Procesado asptico > Procesado asptico (Fig. 3). Debe dotarse en esta directriz la falta de mencin alguna a la esterilizacin por gas lo cual est en en consonancia con la posicin de la Farmacopea Europea y las Directrices III/9261 /90 - EN y CPMP/QWP /486/95 de que este procedimiento de esterilizacin debe reservarse cuando no haya alternativa alguna posible.

la comprensin del proceso de despirogenacin. A la vista de ello, la Ph. Eur. y la USP sealan que, puesto que el calor seco se utiliza frecuentemente para despirogenar envases o material de vidrio as como para destruir microbios viables, deber establecerse, como parte integral del programa de validacin, un contraste pirognico, por ejemplo, inoculando una o ms de las unidades a tratar con 1.000 o ms unidades de endotoxina bacteriana (U.S.P. o B.R.P.). Podr utilizarse el ensayo con lisado del lmulo (LAL) para demostrar que la sustancia endotxica ha sido inactivada hasta un valor de por lo menos 1/1000 de la cantidad original (reduccin de 3 ciclos logartmicos). Para que el ensayo sea vlido deber determinarse la cantidad de

endotoxina inicial y la sobrante tras una inactivacin aceptable.

14. CRITERIO DE SELECCION DEL PROCEDIMIENTO IDONEO DE ESTERILIZACION

Recientemente, con fecha 25-299, el Grupo de Trabajo de Calidad del Comit de Especialidades Farmacuticas, ha dado a luz para consulta un borrador de directriz CPMP/QWP/054/98 Decision Trees for the Selection of Sterilisation Methods que pretende orientar en la seleccin del procedimiento ms idneo de esterilizacin de un producto concreto. En principio se pretende exigir siempre que sea posible un mtodo de esterilizacin terminal por calentamiento, reservndose los procedimientos de esteriliza-

Tabla V Relaciones de probabilidades de aceptacin de lotes de diferentes grados de contaminacin para diferentes tamaos de muestra Probabilidad de ningn crecido positivo % real de contaminacin en un lote 0,1 0,99 0,98 0,95 0,91 0,74 0,61 1 0,91 0,82 0,61 0,37 0,05 0,01 5 0,60 0,36 0,08 0,01 10 0,35 0,12 0,007 0,00 15 0,20 0,04 20 0,11 0,01

15. ENSAYO DE ESTERILIDAD

El ensayo de esterilidad es la prueba oficial de determinacin del grado de contaminacin de un lote. Deber aplicarse a sustancias, preparaciones o productos para los que la farmacopea, la autoridad correspondiente o el fabricante indique su condcin de estril. No obstante, un resultado satisfactorio slo indica que no se han encontrado microorganismos contaminantes en la muestra examinada en las condiciones del ensayo. El nvel de seguridad proporcionado por la ausencia de unidades
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Nmero de muestras analizadas 10 20 50 100 300 500 64

contaminadas en la muestra es extrapolable a la calidad del lote en funcin del plan de muestreo adoptado. La extensin del resultado del ensayo a la totalidad del lote de un producto, requiere la seguridad de que el producto se haya fabricado bajo condiciones homogneas. Esto depende claramente de las precauciones tomadas durante la fabricacin. Se podr utilizar una aprobacin paramtrica cuando se utilice un mtodo de esterilizacin terminal por vapor, calor seco o radiacin ionizante, completamente validado, esto significa que la liberacin de un lote de productos esterilizados con estos procedimientos podr hacerse en funcin de los datos del proceso en vez de en los resultados del ensayo de esterilidad, siempre que la autoridad sanitaria competente est conforme con esta prctica. Existe un consenso casi universal de que en el caso de productos esterilizados en envase final cerrado, las pruebas fsicas, contrastadas biolgicamente y documentadas automticamente, propocionan mayor seguridad que el ensayo de esterilidad siempre que se demuestre que se ha aplicado el tratamiento correcto en la totalidad del lote durante la esterilizacin Esto es

particularmente importante para productos como los radiofrmacos, los cuales a causa del rpido descenso radiactivo no podran aquardar hasta la terminacin del ensayo de esterilidad. El ensayo de esterilidad es el nico medio disponible para productos preparados bajo condiciones aspticas o esterilizados por filtracin. La Farmacopea Europea exige en el caso de la esterilizacin por gas que se contraste cada carga del esterilizador con indicadores biolgicos y que se remitan muestras para el ensayo de esterilidad. Desde el punto de vista legal, el ensayo de esterilidad es el nico medio analtico que tiene a su disposicin la autoridad competente para examinar la esterilidad de un producto. Un ensayo de esterilidad negativo (sin crecidos) no garantiza por si slo que un lote est estril. Las limitaciones del ensayo de esterilidad son de dos clases: - Bidgicas: Los medios de cuitivo prescritos slo recuperan un espectro amplio aunque limitado de bacterias, hongos, levaduras, aerobios y/o ancerobios, psicrfilos y/o mesfilos, sacarolticos y/o proteolticos. Adems, los ensayos de filtracin por membrana de

0,45 m limitan el tamao de los grmenes recuperables a este tamao de poro. - Probabilsticas: Estadsticamente se demuestra que no es posible detectar pequeos niveles de contaminacin por mucho que se aumente el tamao de la muestra. Las Tablas IV y V demuestran lo afirmado. Matemticamente tenemos: P = Cnx (p)x (1 - p)n-x En donde: P = Valor que multiplicado por 100 dara el porcentaje de veces que se detectaran los positivos designados para una contaminacin real (Tabla IV), o valor que multiplicado por 100 dara el porcentaje de veces que un lote pasara con una contaminacin determinada igual a 100 x p sin detectarse en las condiciones del ensayo de esterilidad (Tabla V) n = Nmero de unidades del tamao de la muestra. x = Nmero de unidades de muestra que presentan crecimiento. p = Probabilidad de tomar una unidad contaminada (tanto por uno real de contaminacin).

Tabla VI Clasificacin de ambientes controlados (Anexo de 5-VI-1996 a las normas de correcta fabricacin de medicamentos en la UE) UFC/placa UFC/4 horas (placas de (placas 90mm) contacto 55mm) UFC/guante (impresin 5 dedos)

Clase A+ (Clase 100)* D F B+ (Clase 100)* D F C+ (Clase 10000)* D F D (Clase 100000)* D F

Nmero mximo de partculas/m3 3.500 0,5 m 3.500 0,5 m 3.500 0,5 m 350.000 0,5 m 350.000 0,5 m 3.500.000 0,5 m 3.500.000 0,5 m 0 5 m 0 5 m 0 5 m 2.000 5 m 2.000 5 m 20.000 5 m 20.000 5 m

UFC/m3

<1

<1

<1

<1

10

100

50

25

-----

En funcin de las operaciones que se realicen

200

100

50

-----

*: Segn el US Federal Standard 209E. D: En descando. F: En funcionamiento. +: Se exigen filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) INDUSTRIA FARMACEUTICA - MARZO/ABRIL 1999

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Tabla VII Tcnicas de siembra a utilizar en los diferentes productos considerados en las respectivas farmacopeas Filtracin a travs de membrana U.S.P.
Lquidos miscibles con vehculos acuosos. Lquidos inmiscibles con vehculos acuosos (envases con menos de 100 ml). Pomadas y aceites solubles en miristato de isopropilo Slidos filtrables (slo si no se produce bloqueo del filtro).

Inoculacin directa U.S.P.

Lquidos.

Ph. Eur.
Disoluciones acuosas.

Ph. Eur.
Lquidos oleosos.

Productos slidos solubles. Aceites y disoluciones oleosas. Pomadas y cremas.

Pomadas y aceites insolubles en miristato de isopropilo.

Pomadas y cremas.

Slidos.

Apsitos quirrgicos*.

Puesto que la cantidad mnima de contaminacin que el ensayo de esterilidad puede detectar es de una clula microbiana (10) el nivel de garanta de esterilidad que este procedimiento proporciona es de 10-1. El riesgo de contaminacin durante el ensayo de esterilidad no achacable al producto (contaminacin secundaria), est estimado en alrededor de 10-3, nivel similar al de una operacin asptica y comparable a la probabilidad de supervivencia microbiana de productos procesados aspticamente. Este nivel de probabilidad es significativamente mayor que el generalmente exigido a los procesos de esterilizacin terminal de uno en un milln o probabilidad de supervivencia (nivel de garanta de esterilidad - NGE) de 10-6. El ensayo de esterilidad se debe llevar a cabo bajo condiciones equivalentes a las requeridas para la fabricacin asptica de productos farmacuticos, empleando, por ejemplo, una cabina de aire de flujo laminar clase A situada en un cuarto de ambiente controlado de clase B o un aislador (burbuja) (Tabla VI). Los sistemas de aire de flujo laminar deben proporcionar una velocidad homognea del aire de 0,30 m/s para el flujo vertical y de 0,45 m/s para el flujo horizontal. Peridicamente se llevarn a cabo ensayos de esterilidad con controles negativos. No deber admitirse una frecuencia de falsos positivos superior al 2%. Tambin se introducirn durante las operacin de siembra placas Petri con agar de soja y casena digeridas dentro de la unidad de flujo laminar para controlar el nivel ambiental de contaminacin. De acuerdo con lo anteriormente expuesto procedemos a continuacin a describir el ensayo de esterilidad. 1. Instalaciones para el ensayo de esterilidad Debe disponerse de un cuarto de preparaciones, cuarto de incubacin y cuarto de siembra. Particular atencin debe darse a ste ltimo. Se instaurarn normas de restriccin de personal, de vestimenta, de acceso de los materiales y de desinfeccin.
INDUSTRIA FARMACEUTICA - MARZO/ABRIL 1999

Apsitos quirrgicos*.

Algodn purificado, gasa, apsitos quirrgicos, suturas y productos asociados. Sistemas y equipos de administracin estriles. Jeringas vacas o precargadas estriles.

Catgut y otras suturas quirrgicas*.

Sistemas y equipos de administracin estriles. Jeringas vacas o precargadas estriles.

Equipos para transfusin de sangre y hemoderivados. Jeringas estriles de plstico de un solo uso.

Equipos para transfusin de sangre y hemoderivados. Jeringas estriles de plstico de un solo uso.

*: No aparecen en el suplemento 1998 de la Ph. Eur.

1-p = Probabilidad de tomar una unidad no contaminada (tanto por uno real sin contaminacin). En la Tabla IV estn calculados los datos de probabilidad para lotes con varios grados de contaminacin asumida cuando se analizan 10 unidades. Por ejempto, un lote que tenga 1 de cada 1.000 unidades contaminadas (0,1% de contaminacin) podr pasar como satisfactorio (sin mostrar crecido positivo en las 10 unidades analizadas) en 99 pruebas de cada 100. Incluso con un nivel de contaminacin del 10%, sta slo sera detectada 2 de cada 3 veces. La Tabla V muestra la dificultad de intentar mejorar la adecuabilidad de los ensayos de esterilidad aumentando el tamao de la muestra. Para niveles de contaminacin tan bajos como el 0,1%, el aumento del tamao muestral de 10 a 100 tiene un efecto relativamente pequeo en la mejora de la capacidad de deteccin de la contami66

nacin. Incluso un tamao muestral de 500 provocara la aceptacin equivocada de un lote 6 de cada 10 veces. Por otro lado, con un lote contaminado en un 10%, el anlisis de 100 muestras dara una probabilidad de aceptacin del lote de tericamente cero. La Tabla V puede tener tambin la siguiente interpretacin. Si se selecciona el valor que se aproxima al nivel de confianza del 95% (P= 0,05) para los valores de probabilidad mostrados para cada diferente tamao muestral, queda claro que la utilizacin de 20 muestras discriminar clamente slo nveles de contaminacin del 15% o superiores. Si las 20 unidades del ensayo de esterilidad no presentan crecimiento, el lote podria, naturalmente, estar estril, pero no hay modo de saberlo con seguridad plena a partir del ensayo de esterilidad. Lo nico que se podria afirmar es que no es probable que el lote est contaminado a un nivel superior del 15%.

2. Medios de cultivo Los medios oficiales de esterilizacin son bsicamente dos: medio lquido al tioglicalato, o caldo de tioglicolato (FTM), y medio de casena y soja digeridas o caldo. La USP incorpora, adems, el medio alternativo digerido de casena y soja lquido de tioglicolato (ATM) en sustitucin del FTM para recoger posibles contaminantes en trayectorias de fluido de equipos de administracin de disoluciones inyectables. El Cdigo de Regulaciones Federales (CFR) presenta varios medios a base de FTM y TSB adicionados con penicilinasa, sustancias tensoactivas o pH modificado. El FTM debido a su graduacin de la tensin de oxgeno, descendente desde arriba hacia abajo, permite la recuperacin de bacterias anaerobias y grmenes aerobios e incorpora un indicador, la resazurina de sodio, que permite visualizar la adecuada oxigenacin del medio. El TSB se destina a la recuperacin de bacterias y hongos aerobios. Los medios de cultivo debern superar los siguientes controles bsicos: - pH. - Esterilidad. - Promocin de crecimiento (propiedades nutritivas) - Validacin (ausencia de bacteriostasis o fungistasis). 3. Tcnicas de siembra - Filtracin por membrana. - lnoculacin directa. La Tabla VlI recoge las tcnicas de siembra a utilizar en ios diferentes productos considerados en las distintas farmacopeas. 4. Tamao muestral Los requerimientos varan segn las Farmacopeas, por lo que deber acudirse a las mismas. Generalmente se sealan 20 unidades para lotes grandes o 40 si no hay. cantidad de producto suficiente para ambos medios. 5. Tamao de alcuota por envase Totalmente variable segn el tipo de producto y formacopea que se utllice. Debern consultarse dichos formularios. 6. Incubacin La Tabla VIII recoge las condicioINDUSTRIA FARMACEUTICA - MARZO/ABRIL 1999

Tabla VIII Incubacin Medio de cultivo

FTM FTM TSB TSB ATM

Tcnica siembra
FILT. MEMBR. INOCULACION FILT. MEMBR. INOCULACION INOCULACION

Temperatura incubacin
30-35C/30-32C 30-35C/30-32C 20-25C/22-25C 20-25C/22-25C 30-35C

Condiciones incubacin
AEROBIAS AEROBIAS AEROBIAS AEROBIAS ANAEROBIAS

Duracin incubacin (das)

14+7 (FE)/7 (USP)/7 (CFR) 14+7 (FE)/14 (USP)/7 (CFR) 14+7 (FE)/7 (USP)/7 (CFR) 14+7 (FE)/14 (USP)/7 (CFR) 14 (USP)

nes de incubacin sealadas en las farmacopeas. En inoculacin directa el CFR establece 7 das de incubacin. En caso de enturbiamiento del medio en inoculacin directa, la USP seala subcultivos entre los das 3 7. El perodo de incubacin cuenta desde el primer da. En la Far. Eur. el subcultivo se realiza el da 14 y el producto se incuba otros 7 das ms. 7. Interpretacin de los ensayos de esterilidad Los criterios de repeticin de ensayos que presentan crecimien-

tos no atribuibles a fallos encontrados son distintos en la Ph. Eur. con respecto la USP. Las figuras 4 y 5 recogen las diferencias. Cabe sealar el criterio ms restrictivo de la Ph. Eur. en el sentido de forzar a un mayor control de las buenas prcticas de siembra.

16. APROXIMACION AL CONCEPTO DE ESTERILIDAD

La Tabla IX resume el parmetro de mejor aproximacin al concepto de esterilidad para cada uno de los procedimientos de esterilizacin.

Fig. 4. Interpretacin de los resultados segn la Ph. Eur. 1 SIEMBRA RESULTADO POSITIVO INVALIDADO RESULTADO NEGATIVO RESULTADO POSITIVO 2 SIEMBRA IGUAL NUMERO DE UNIDADES QUE LA 1

APROBADO

RECHAZADO

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO

APROBADO

RECHAZADO

67

1 SIEMBRA

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO

RESULTADO POSITIVO INVALIDADO

APROBADO

2 SIEMBRA IGUAL N DE UNIDADES QUE LA PRIMERA

2 SIEMBRA IGUAL N DE UNIDADES QUE LA PRIMERA

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO

RESULTADO POSITIVO INVALIDADO

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO

APROBADO

RECHAZADO 3 SIEMBRA DOBLE N DE UNIDADES QUE LA PRIMERA

APROBADO

3 SIEMBRA IGUAL N DE UNIDADES QUE LA PRIMERA

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO

RESULTADO POSITIVO INVALIDADO

APROBADO APROBADO RECHAZADO

RECHAZADO 4 SIEMBRA DOBLE N DE UNIDADES QUE LA PRIMERA

Fig. 5. Interpretacin de los resultados segn la U.S.P.

RESULTADO NEGATIVO

RESULTADO POSITIVO

APROBADO

RECHAZADO

Tabla IX Mejor aproximacin al concepto de esterilidad Procedimiento de esterilizacin Procesado asptico Filtracin estril + Procesado asptico Radiacin ionizante Oxido de etileno Calor hmedo Calor seco Despirogenacin Parmetro de mejor aproximacin al concepto de esterilidad Ensayo de esterilidad Ensayo de esterilidad Dosmetros de radiacin (25 kGy) Bacillus subtilis var. niger (106 esporas/tira) Fo 15 minutos y/o Prob. supervivencia 10-6 Prob. supervivencia 10-12 Reduccin de 3 log de producto inoculado con 1.000 unidades USP o BRP de endotoxina de Escherichia coli

17. ESTERILIZACION/ ESTERILIDAD. RESUMEN DE LA SITUACION LEGAL ACUTAL

La situacin legal actual con respecto al papel y necesidad del ensayo de esterilidad en el contexto de la seguridad en la esterilidad, queda claramente definida en la tercera y ltima edicin de la Farmacopea Europea, asumIda por la Real Farmacopea Espaola 1 edicin, del modo que a continuacin se expone: - Todas las preparaciones calificadas, declaradas o exigidas como estriles debern satisfacer el ensayo formacopeico de esterilidad. - No se exigir el ensayo de esterilidad rutinario en el caso de productos sometidos a esterilizacin terminal, debidamente valiINDUSTRIA FARMACEUTICA - MARZO/ABRIL 1999

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dada, por vapor, calor seco o radiacin ionizante. - Se admite la autorizacin paramtrica basada en el nivel de garanta de esterilidad de 10-6 (nmero de supervivientes 1 organismo/106 unidades) en la radioesterilizacin, esterilizacin por calor hmedo y esterilizacin por calor seco. Para este ltimo la USP-NF exige un nivel de garanta de esterilidad de 10 -12 (nmero de supervivientes 1 organismo/1012 unidades). En este momento el grupo de Trabajo de Calidad del Comit de Especialidades Farmacuticas est desarrollando una directriz de regulacin de la liberacin paramtrica. - El ensayo de esterilidad rutinario es obligatorio para productos procesados aspticamente, esterilizados por filtracin o esterilizados por gas. - La esterilizacin por gas requiere la contrastacin rutinaria de cada ciclo de esterilizacin con indicadores biolgicos adecuados. - Se propone el empleo de valo-

res F en la esterilizacin por vapor. - La esterilizacin por gas slo se utilizar cuando no haya otra alternativa.

sion Trees for the Selection of Sterilisation Methods (Annex to Note for Guidance on Development Pharmceutics CPMP/QWP/155/96. Febrero (1999). [8] Pharmeuropa. Vol. 10, n 3 Biological Tests-2.6.1 Sterility, pg. 407, septiembre (1998). [9] Iturralde, J.P. Problemas resueltos de termobacteriologa. INDUSTRIA FARMACEUTICA. mayo-junio, pg. 53, julioagosto, pg 33 (1994). [10] Iturralde, J.P. Nuevas ecuaciones para el diseo y verificacin de los procesos de esterilizacin por calor (El retorno de Arrhenius). INDUSTRIA FARMACEUTICA. julio/agosto, pg. 57, septiembre-octubre, pg. 81 (1995). [11] CPMP/QWP/2431/98. Concept Paper on the Development of a Comittee for Proprietary Medicinal Products (CPMP) Note for Guidance on Parametric Release. Esta publicacin forma parte de las lecciones impartidas en el curso del MASTER EN INDUSTRIA FARMACEUTICA organizado por el CENTRO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE LA INDUSTRIA FARMACUTICA (CESIF).

18. BIBLIOGRAFIA
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