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Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique Universit Mentouri Constantine

N dordre : N de srie :

Facult des Sciences de la Nature et de la Vie Dpartement de Biochimie-Microbiologie Mmoire de Fin dEtudes pour lObtention du Diplme de Magistre Option : Biotechnologies Microbiennes

Incidence de Listeria spp. et interaction phylogntique avec la flore bactrienne isole de laits crus
Prsente par : AZIZI Nassima Soutenue le : ../12/2010

Devant le jury :
Prsident : Mr. BOUSSEBOUA H. Professeur. Universit Mentouri Constantine.

Rapporteur : Mr. HAMIDECHI M.A Matre de confrences Universit Mentouri Constantine. Examinateurs: Mr. BERARHI L. Mr. KITOUNI M. Mr. ARHAB R. Matre de confrences Universit Mentouri Constantine. Matre de confrences Universit Mentouri Constantine. Matre de confrences Universit de Tbessa.

Anne Universitaire : 2009-2010

REMERCIEMENTS

Remerciements
En prambule de ce travail, je souhaitais adresser mes remerciements les plus sincres aux personnes qui m'ont apport leur aide et qui ont contribu l'laboration de ce travail universitaire. Je tiens remercier sincrement Monsieur HAMIDECHI M.A. Matre de confrence Universit Mentouri Constantine qui, en tant que Directeur de mmoire, s'est toujours montr l'coute et trs disponible tout au long de la ralisation de ce mmoire, ainsi pour l'inspiration, l'aide et le temps qu'il a bien voulu me consacrer et sans lui ce mmoire n'aurait jamais vu le jour. J'exprime ma gratitude Monsieur BOUSSEBOUA H. Professeur. Universit Mentouri Constantine davoir accept la prsidence du jury de ce travail. Jexprime galement ma reconnaissance Monsieur KITOUNI M. ainsi qu la russite de cette formidable anne

Matre de confrences Universit Mentouri Constantine, Monsieur ARHAB R. Matre de confrences Universit de Tbessa, et Monsieur BERARHI L. Matre de confrences Universit Mentouri Constantine qui ont accept de participer ce jury et davoir bien voulu juger ce travail. Mes remerciements sadressent galement Mr. MAIZI Mdecin Chef de Laboratoire Central de la Wilaya de Skikda, pour sa gnrosit et la grande patience dont il a su faire preuve malgr ses charges professionnelles. Un grand remerciement pour tous nos enseignants pour leurs contribution dans notre cursus universitaire, dans le Dpartement de

Biochimie /Microbiologie, Universit Mentouri Constantine.

Merci tous et toutes

DEDICACES

Ddicace

Je tiens ddier ce modeste travail : Mes trs chers parents pour leur contribution, leur soutien et leur patience ; et qui ont tous sacrifi pour que ce jour arrive Ma trs cher YAMA pour sa tendresse et sa gentillesse Mes surs : KAOUTHER, HOUDA, NOUA Mes frres : WALID, CHAWKI

Mes amies : NASSIMA, WIDAD, MIMI, WASSILA, FATIMA Tous mes collgues de promotion Ma grande famille

Nassima

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES

PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE


INTRODUCTION.........1 CHAPITRE 1: ETUDE DU GERME .3 1 Position taxonomique.....3 2 Caractres bactriologiques..4 2.1 Morphologie et structures.....4 2.2 Caractres biochimiques, mtaboliques et culturaux....4 3 Caractres infra-spcifiques......7 3.1Typage phnotypique......7 3.2 Typage gnotypique...9 4 Caractres physiologiques.....10 4.1Influence de la temprature.....10 4.2Influence du pH.10 4.3Influence de lactivit de leau...10 4.4Influence de teneur en Na Cl..11 4.5Interactions L. monocytogenes et autres microorganismes...11 5 Physiopathologie molculaire et Listriose....12 CHAPITRE 2: CONTAMINATION DES LAITS CRUS PAR Listeria spp....14 CHAPITRE 3 : TAXONOMIE BACTERIENNE ET PHYLOGENIE....15

PARTIE II : MATERIEL ET METHODES


1. Prlvements........18 2. Mthodes danalyses...19 2.1 Analyses microbiologiques .19

PARTIE III : RESULTATS ET DISCUSSION


1. Rsultats...27 2. Discussion.....43

PARTIE IV : CONCLUSION ET PERSPECTIVES...51 PARTIE V : REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES....53 ANNEXES..

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Caractres biochimiques communs au genre Listeria. .5 Tableau 2 : Diffrenciation des espces de Listeria..5 Tableau 3 : Distribution des srovars dans les espces de Listeria.8 Tableau 4: Incidence de Listeria monocytogenes dans le lait cru...14 Tableau5 : Identification des prlvements de laits crus.....18 Tableau 6 : Les tests didentification prsomptive des souches isoles..23 Tableau 7: Dnombrement de FTAM en UFC /ml dans la wilaya de TEBESSA .27 Tableau 8: Dnombrement de FTAM en UFC /ml dans la wilaya de SKIKDA ...28 Tableau 9: Identification prsomptive des souches isoles de la rgion de SKIKDA .......30 Tableau 10: Identification prsomptive des souches isoles de la rgion de TEBESSA .31 Tableau 11: Rpartition des souches isoles selon le Gram....32 Tableau12 : Matrice des distances des souches Gram positif...35 Tableau13 : Matrice des distances des souches Gram ngatif.....36 Tableau14 :Incidence de Listeria spp dans le lait cru de ferme dans lEst algrien (TEBESSA et SKIKDA)..46

Logigramme 1 : La dmarche de la taxonomie numrique 16 Logigramme 2 : Les tapes de recherche de Listeria spp...24

LISTE DES FIGURES


Figure 1: Diffrenciation biochimique des Listeria ......6 Figure 2: Diffrenciation biochimique des Listeria selon Gorski L..6 Figure 3: Les gnes de virulence de L. monocytogenes..13 Figure 4: Etapes pour lisolement des colonies de la FTAM...20 Figure 5: Aspect des colonies de Listeria spp. sur glose Palcam...25 Figure 6: Test CAMP..25 Figure 7: Aspect des colonies de L.cf monocytogenes sur glose au sang frais ....33 Figure 8: Aspect des colonies de Listeria spp. sur glose TSA...33 Figure 9: Arbre UPGMA des souches Gram positif 37 Figure 10: Arbre NJ des souches Gram positif.38 Figure 11: Arbre UPGMA des souches Gram ngatif......39 Figure 12: Arbre NJ des souches Gram ngatif ...39 Figure 13: Arbre UPGMA construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram positif40 Figure 14: Arbre NJ construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram positif ...41 Figure 15: Arbre UPGMA construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram ngatif ...42 Figure 16: Arbre NJ construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram ngatif42 Figure 17: Moyenne mensuelle des tempratures minimales et maximales quotidiennes releves sur Skikda et sur Tbessa..44 Figure 18 : Valeurs moyennes des prcipitations (mm) releves sur la wilaya de Skikda et la wilaya de Tbessa.44

LISTE DES ABREVIATIONS

ADH : Arginine di hydrolase LDC : Lysine dcarboxylase ODC : ornithine dcarboxylase ONPG: 2-nitrophnyl-D-galactopyranoside ONPG: 2-nitrophnyl-D-galactopyranoside TDA : Tryptophane dsaminase

INTRODUCTION

Introduction

Introduction
La scurit sanitaire des aliments a t au centre des proccupations de lhumanit, ds les premires civilisations. Au cours des dernires dcennies, la dcouverte des microorganismes dans lindustrie alimentaire a rendu ncessaire ladoption de diverses mesures de scurit sanitaire des aliments. Un des effets les mieux connus des microorganismes contaminants nos aliments est la dgradation de la qualit hyginique et la qualit marchande. Tous nos produits alimentaires peuvent tre le sige de prolifration microbienne, prolifration dautant plus varie que le produit est riche en lments nutritifs et plac dans des conditions favorables la croissance microbienne, citant lexemple des produits laitiers base de lait cru : Les germes de l'environnement trouvent dans le lait un excellent milieu de culture. Ceci le rend dangereux pour le consommateur, selon les critres d'hygine alimentaire. La recherche dans ce cas portera sur les germes fcaux (entrobactries en gnral) et certains germes particuliers dont Listeria monocytogenes. Lhtrognit phnotypique et gnotypique de L. monocytogenes a t voque pour expliquer la colonisation des niches cologiques dans lesquelles survit cette bactrie. (Gilmour, 2004). Elle est communment trouve dans les sols, leau et dans les vgtaux, particulirement ceux en dcomposition. Cet environnement est considr comme lhabitat naturel du germe (Rocourt et al., 1985). L. monocytogenes est un germe ubiquiste responsable dune maladie invasive rare, mais grave : la listriose ; ses manifestations les plus caractristiques sont une mningite et une septicmie prinatale. L. monocytogenes est considre comme un agent pathogne important en sant publique puisquil est lorigine dpidmie alimentaires travers le monde. De nombreuses tudes ont montr la prsence de L. monocytogenes dans les produits laitiers surtout base de lait cru, avec une incidence qui varie dun pays un autre. Un calcul d'incidence peut tre ralis pour les pays qui disposent d'un systme de surveillance permettant de recenser les cas au niveau national. LItalie recense 30% des cas de listrioses par rapport aux maladies infectieuses ; les tats unis ont une surveillance active sur quelques tats permettant de calculer une incidence extrapole l'ensemble de la population du pays ; lanalyse microbiologique a montr que 3 % des chantillons de laits crus sont contrls positifs concernant la prsence de L. monocytogenes (Lund et al., 1991) ; en Allemagne, 17,6% des chantillons de vgtaux crus contiennent L. monocytogenes
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Introduction

et en Grande-Bretagne, aprs la nette diminution conscutive la fin de l'pidmie en 19871989, l'incidence demeure faible, comprise entre 1,6 et 2,5 cas par million d'habitants. En France, plusieurs enqutes effectues en 1984, 1986, 1987 et 1988 auprs de l'ensemble des laboratoires hospitaliers (Goulet et Brohier 1989) avaient montr que l'incidence variait au cours de ces annes entre 11 et 14 cas/million d'habitants. Notre recherche bibliographique a rvl quil existe peu de donnes algriennes

publies sur lincidence de la contamination des laits crus par Listeria spp., surtout dans les rgions de lEst algrien, bien que le JORADP exige sa recherche dans les produits laitiers, et toutes les denres alimentaires. Des rsultats ont confirm la prsence de L. monocytogenes au taux de 2.61% (Mossadek ; 2007) qui prouve quon nest pas labri dune ventuelle pidmie. Cest par rapport cette situation que nous avons trac les objectifs suivants: Etudier lincidence cologique de Listeria spp. dans deux wilayas de lEst algrien savoir TEBESSA et SKIKDA. Mettre en vidence les interactions phylogntiques de Listeria spp. avec la flore bactrienne isole des diffrents laits crus. Confronter nos rsultats didentification aux squences de DNA r 16S releves sur GenBank. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/ ]

BIBLIOGRAPHIE

CHAPITRE 1: Etude du Germe

CHAPITRE 1 : ETUDE DU GERME 1-Position taxonomique


Cest en Angleterre, Cambridge, en 1926, Murray, Webb et Swann isolrent un petit bacille Gram positif du sang de lapins atteints dune mononuclose sanguine quils nommrent "Bacterium monocytogenes". En outre, le germe a t isol par Pirie partir de gerbille sauvages infects. Pirie a propos le nom de Listerella pour le genre en honneur au chirurgien Lord Lister. Murray et Pirie ralisrent quils ont procd lisolement de la mme espce bactrienne et ainsi ils combinrent les noms pour former Listerella monocytogenes qui sera chang pour des raisons de taxonomie en Listeria monocytogenes (Pirie, 1940). En 1961, Prvot proposa l'appellation de Listeria denitrificans pour une unique souche bactrienne isole en 1948 par Sohier, Benazet et Pichaud partir de sang de buf chauff. Ultrieurement, ont t dcrites les espces Listeria grayi et Listeria murrayi. Ces quatre espces ont t retenues dans les Approved Lists of Bacterial Names mais, depuis la parution de ces listes, la systmatique du genre Listeria a t profondment modifie. Le genre Listeria appartient la branche phylogntique des Clostridium, avec Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Brochothrix et Bacillus. (Bergeys, 1994). Les Listeria font partie des Listeriaceae. Cette position, au sein des bactries Gram positif est devenue vidente avec les rsultats de la Taxonomie numrique, puis sest impose sans ambigit avec ceux du squenage de lARN ribosomique16S. (Larpent, 2000). Depuis, dautres espces de Listeria ont t dcrites et, notamment grce aux mthodes danalyses gntiques, la systmatique du genre Listeria a t affine. En effet, le genre Listeria regroupe six espces : monocytogenes, innocua, ivanovii, welshimeri, seeligerri, grayi. (Farber et Peterkin, 1991)

CHAPITRE 1: Etude du Germe

2-Caractres bactriologiques 2.1- Morphologie et Structures


Listeria sont des bacilles Gram positif. Se prsentent sous forme de btonnets courts et rguliers de 0,4 0,5 m de diamtre sur 0,5 2 m de long, aux extrmits arrondies; certaines cellules pouvant toutefois tre incurves. Elles se prsentent de manire isoles ou groupes en V ou en L, en palissade ou en courte chanette. Les Listeria sont des bactries non acido-alcoolo-rsistantes, non capsules, non sporules, non pigmentes et sans structure extra-cellulaire telle que les fimbriae. Lorsque la culture est ralise 20-25C, elles sont mobiles grce quelques flagelles de type pritriches, mais sont immobiles ou faiblement mobiles 37C.

2.2-Caractres biochimiques, mtaboliques et culturaux


Listeria est une bactrie aro-anarobie facultative. Sur glose nutritive, elle forme en 24-48 h 37C des colonies de 0,5 1,5 mm de diamtre, translucides, reflets bleuts en lumire oblique. Sur glose au sang de mouton ou de cheval, elle donne des colonies hmolytiques. L. monocytogenes se dveloppe bien sur les milieux empiriques riches (milieu cur cervelle, milieu la peptone de casine et de soja additionn d'extrait de levure). En milieux synthtiques, ses exigences de base concernent certains amino-acides, des vitamines, mais pas de bases nucliques (Premaratne et al., 1991). Sur le milieu synthtique de Welshimer (1968), sa croissance est stimule par l'addition de fer (Fe3+) et cet effet stimulant est proportionnel la concentration de fer ajout (Sword, 1966). L'apport d'esculine et de citrate stimule aussi sa croissance. Les caractres biochimiques communs au genre Listeria sont prsents dans le tableau 1.

CHAPITRE 1: Etude du Germe

Tableau 1 : Caractres biochimiques communs au genre Listeria (Larpent, 2004).

Ractions Positives Mobilit 22 C Catalase

Ractions Ngatives ONPG Oxydase = AAF

Acidification du glucose, fructose, mannose, Production de gaz sur glucose amygdaline, salicine, cellobiose, maltose, trhalose, arabitol Rouge de methyle Voges-Proskauer Type respiratoire : aro-anarobie Rduction du lait tournesol Hydrolyse de lesculine Urase Production de lindole Glatinase Production dH2S Xylose , ribose , mannitol

Les espces de Listeria peuvent tre diffrencier sur la base de plusieurs caractres. Le tableau 2 rsume cette distinction.

Tableau 2 : Diffrenciation des espces de Listeria. (Rocourt et Jacquet, 2000).

Hmolyse

CAMP test S. aureus

CAMP test R. equi -

D-xylose

L-rhamnose

D-mannoside

Ribose

Mannitol

L.monocytogenes L. ivanovii (sub.ivanovii) L.ivanovii (sub.iondoni.) L. innocua L. welshimeri L. seeligeri L. grayi

+ +

+ -

+ -

+ -

d d

+ +

+ -

+ -

+ -

+ -

Non define

(+) : positif, (-) : ngatif, (d) : diffrenci

CHAPITRE 1: Etude du Germe

Comme, on peut distinguer les espces en se basant sur la cl dichotomique (figure 1).
+ L. grayi + CAMP-test + L.ivanovii + R.equi D.xylose L.welshimer L. innocua Mannitol

. Hmolyse D.xylose

L.seeligeri

L.monocytogenes

Figure 1 : Diffrenciation biochimique des Listeria. Alors que Gorski L. (2008), quant elle, propose le chemin dichotomique suivant :

Listeria monocytogenes

Figure 2 : Diffrenciation biochimique des Listeria selon Gorski L. (2008)


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CHAPITRE 1: Etude du Germe

3-Caractres infra-specifiques 3.1-Typage phnotypique : Le typage des souches permet de subdiviser les groupes
bactriens un degr infrieur celui de lespce et ainsi de comparer finement les isolats. Il est alors possible de suivre la dissmination des bactries dans lenvironnement et didentifier lorigine des contaminations. Cest un outil indispensable pour une meilleure connaissance de lcologie de la bactrie.

3.1.1-Srotypie : On distingue, au sein du genre Listeria ; 15 antignes somatiques O


(nots de I XV) et 5 antignes flagellaires H (nots de A E). La combinaison de ces diffrents facteurs dans une mme bactrie permet de reconnatre actuellement 17 srovars. (Donker-Voet, 1972 ; Garcia et al., 1990; Larpent, 2004) (tableau 3).

3.1.2 - Lysotypie : fonde sur la sensibilit aux bactriophages et permet de subdiviser


les souches dun mme srovar. Actuellement, 219 phages sont rpertoris. (Larpent, 2004).

3.1.3-lectrophorse disoenzymes: (Multi Locus Enzym Electrophoresis : MLEE).


Elle consiste en lanalyse de la mobilit lectrophortique de plusieurs enzymes mtaboliques. Les diffrents profils lectro phortiques permettent danalyser les variations gntiques au sein dune population bactrienne. Pour L. monocytogenes lanalyse des lectrotypes permet dindividualiser deux grandes subdivisions : une constitue par les srovars 1/2b, 3b, et 4b, comporte au moins 22 lectrotypes diffrents et lautre, constitue par les srovars 1/2a, 1/2c et 3a, comporte au moins 45 lectrotypes diffrents (Euzby, 2000).

CHAPITRE 1: Etude du Germe

Tableau 3 : Distribution des srovars dans les espces de Listeria.

Srotype 1/2a 1/2b 1/2c 3a 3b 3c 4a 4ab 4b 4c 4d 4e 5 6a 6b 7 L.grayi I, II I, II I, II II, IV II, IV II, IV

Antigne O

Antigne H A, B A, B, C B, D A, B A, B, C B, D A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C E

Espces L.monocytogenes, L.seeligeri, L.welshimeri L.monocytogenes, L.seeligeri L.monocytogenes, L.seeligeri L.monocytogenes L.monocytogenes L.monocytogenes L.monocytogenes L.monocytogenes, L.innocua L.monocytogenes, L.seeligeri L.monocytogenes, L.seeligeri, L.welshimeri L.monocytogenes, L.seeligeri L.monocytogenes L.ivanovii L.innocua, L.welshimeri L.innocua, L.seeligeri, L.welshimeri L.monocytogenes L.grayi

(V), VII, IX V, VI, VII, IX V, VI V, VII (V), VI, VIII V, VI, (VIII), (XI) (V), VI, (VIII), X V, (VI), (VII), (IX), XV (V), (VI), (VII), IX, X, XI XII, XIII (III), XII, XIV

Remarque : Les spcificits antigniques O entre parenthses ne sont pas toujours prsentes.

CHAPITRE 1: Etude du Germe

3.2-Typage gnotypique : Les mthodes de typage phnotypiques, trs anciennes, sont


compltes, par des mthodes gnotypiques plus rcentes qui reposent sur la caractrisation du gnome et sappliquent de nombreuses espces bactriennes. Elles ont t particulirement bien dveloppes et rapidement appliques L. monocytogenes en raison de limportance du problme pidmiologique pos par la listriose :

La technique RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism Pattern) : qui consiste analyser le polymorphisme lectrophortique de certains gnes chromosomiques partir dune lectrophorse dADN total coupl un transfert et une hybridation avec certains fragments dADN. (Paillard et al., 2003 in Churchil). Le ribotypage : est une technique fonde sur le mme principe que RFLP. La sonde utilise tant une squence dADN shybridant avec les gnes codant pour lARNr. Cest une technique trs largement utilise pour la caractrisation de nombreuses espces bactriennes (Grimont et Grimont, 1986). La technique de Dtermination du profil de restriction de lADN aprs lectrophorse en champ puls PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): fonde sur llectrophorse de gros fragments dADN gnr aprs laction denzyme de restriction. Cette lectrophorse seffectue selon un procd qui permet la migration de gros fragments dADN. (Murchie et al., 2005), la technique est lune des plus discriminantes pour le typage de L. monocytogenes. (Gianfranceschi et al., 2009) La technique RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) : fonde sur lamplification gnique ; les amorces choisies sont utilises au hasard. Cette mthode est plus rapide mettre en uvre mais manque parfois de reproductibilit. Enfin des mthodes se sont dveloppes telles que la PCR-Ribotyping, la REP-PCR et lERIC-PCR. Ces techniques sont mises en uvre conjointement lors denqute ou dtude en pidmiologie. (Vanegaz et al ., 2009)

CHAPITRE 1: Etude du Germe

4- Caractres physiologiques
4.1 Influence de la temprature Listeria est une bactrie psychrotrophe dont la temprature optimale de croissance est comprise entre 30 et 37C. La croissance est dmontre exprimentalement entre -2C

et +45C (Augustin, 1999). Les tempratures minimales de croissance observables sur glose tripticase-soja dans une dure d'incubation de 10 jours sont comprises entre +0,5C et +3,0C, avec une moyenne de +1,1C (Junttila et al., 1988). Dautre part L. monocytogenes n'est pas considre comme un germe thermorsistant et elle est rapidement dtruite 60C (Brand et al., 1998).

4.2 Influence du pH L. monocytogenes se multiplie entre pH 4,6 et pH 9,6 avec un optimum pH 7,1 l'optimum thermique (Pearson et Marth, 1990). Ces valeurs pH cardinaux dpendent toutefois de la nature et de la concentration de lacide, et de la nature du milieu. L. monocytogenes est rapidement dtruite au-dessus de pH 10 ou aux pH infrieurs au pH min (Vasseur et al., 1999). Elle peut toute fois survivre pendant de trs longues priodes des pH proches de 4 comme c'est le cas dans les ensilages de mas sans que l'on connaisse l'origine gntique ou adaptative du phnomne (Ryser et al., 1997). Un stress alcalin (NaOH, pH 9) est rapidement surmont par L. monocytogenes (Cheroutre-Vialette et al., 1998).

4.3 Influence de lactivit de leau Lactivit de leau (Aw) minimale pour la croissance de L. monocytogenes est de

0,90 (Farber et al., 1992). Le glycrol est utilis pour ajuster ce facteur dans le milieu, de 0,92 ou 0,93 avec du NaCl ou avec du saccharose si le milieu employ est base d'extrait de viande (Nolan et al., 1992). Listeria se dveloppe un optimum de Aw= 0,97, mais elle peut se dvelopper 0,943. Un Aw infrieure 0,939 ne semble pas permettre la croissance. La bactrie reste viable plusieurs jours pour des valeurs d'Aw plus faibles (Larpent 2004).

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CHAPITRE 1: Etude du Germe

4.4 Influence de teneur en Na Cl L. monocytogenes ne se dveloppe en gnral pas dans les solutions contenant plus de 10 % 11 % de Na Cl (Nolan et al., 1992). Toutefois, des souches peuvent survivre dans des saumures de fromagerie contenant de 13 14 % de Na Cl (Farber et al., 1992). La survie dans une saumure 25 % de Na Cl aprs un choc thermique de 1 h 45C a t dcrite (Lou et Yousef, 1997). Kukharkova et al., (1960) ont dmontr que L. monocytogenes survivait plus de 60 jours dans la viande stocke 4C dans une solution de saumure 30 % de

Na Cl qui contenait aussi des nitrates.

4.5 Interactions L. monocytogenes et autres microorganismes De trs nombreuses interactions antagonistes de L. monocytogenes ont t dcrites in vitro ou encore dans des produits laitiers l'chelle du laboratoire. La plupart font appel l'action de bactriocines produites par des ferments lactiques ou par des ferments d'aromatisation, parmi ces bactriocines: la nisine qui est la plus anciennement connue et son efficacit prouve dans le lait (Kim et al., 2008). De nombreuses autres bactriocines ont t dcrites depuis 20 ans: lacticine, helveticine, sakacine, divercine, pediocine. (Huang et al., 2009). Indpendamment des bactriocines, des phnomnes de comptition ont t dcrits, o intervient l'effet inhibiteur propre d'acides organiques issus de la fermentation des sucres ou du pH final des produits (Schaak et Marth, 1988 ; Breidt et al., 1998). Certaines espces de staphylococcus, en particulier Staphylococcus sciuri, semblent freiner la colonisation des surfaces par Listeria sous forme de bio films (Leriche et al., 2000) ; ces effets auraient pour origine la production par ces bactries de surfactants inhibant partiellement l'adhsion de L. monocytogenes la surface des environnements de fabrication.

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CHAPITRE 1: Etude du Germe

5- Physiopathologie molculaire et Listriose


L. monocytogenes est une bactrie intracellulaire facultative .Elle peut se multiplier dans les monocytes et les macrophages rsidants des tissus, mais les polynuclaires neutrophiles lui sont trs bactricides (Czuprynski et al., 1984). Cette bactrie peut aussi envahir et se multiplier dans de nombreuses autres cellules de lhte infect, incluant les cellules pithliales (anthrocytes), les fibroblastes, les hpatocytes et les cellules endothliales (Havell, 1986). Cette multiplication intracellulaire est lorigine de foyers granulomateux dissmins dans les tissus des htes infects, constituant une miliaire infectieuse avec accumulation de cellules inflammatoires (polynuclaires, monocytes, lymphocytes, etc.). A partir des foyers granulomateux, L. monocytogenes peut dissminer par voie sanguine et infecter le systme nerveux central et le placenta. La porte dentre de linfection chez lhomme est digestive ; la suite de labsorption daliments contamins (Farber et Peterkin, 1991). L'existence de Listrioses cutanes dans des mtiers risque (vtrinaires, leveurs) laisse penser que la contamination est dans ce cas, directe lors d'une manipulation d'animal infect. Le cycle de rplication intracellulaire se droule en plusieurs tapes : Les bactries adhrent aux cellules par linternaline qui est une protine de surface de 80 kDa, code par un gne chromosomique, le gne inlA (Gaillard et al., 1991). Cette protine interagit avec des rcepteurs de type E-cadhrine prsents sur les cellules infectes (Mengaud et al., 1996). Cette interaction spcifique induit la phagocytose. Un gne adjacent inlA, appel inlB (Gaillard et al., 1991), codant une protine de surface qui agirait en synergie avec linternaline ; favorisant lentre dans les hpatocytes (Dramsi et al., 1995). Les bactries ne peuvent pas se multiplier et vont tenter dchapper au phagosome, o elles sont exposes l'activit microbicide des cellules. Les bactries accdent au cytoplasme et se multiplient dans cet environnement favorable. Cet chappement se fait par destruction de la membrane du phagosome par laction synergique de la listriolysine O qui est une exotoxine hmolytique de 58 kDa code par le gne hly (Cossart et al., 1989), et d'une phosphatidylinositol phospholipase C code par le gne plcA (Camilli et al., 1993).
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CHAPITRE 1: Etude du Germe

La rplication intracytoplasmique saccompagne dune polymrisation de lactine F en actine G la surface des bactries (Tilney et al., 1990).Cette polymrisation est due la protine bactrienne actA (Kocks et al., 1992). Le mouvement intracellulaire de L. monocytogenes induit par la protine actA entrane la dissmination des bactries aux cellules adjacentes. Les gnes de virulence sont rpartis en un lot chromosomique de pathognicit de part et dautre du gne hly avec, en amont, lopron lcithinase rassemblant les gnes mpl (Poyart et al., 1993), qui code une mtallo protase zinc-dpendante implique dans la maturation de la phosphatidyl-choline phospholipase C, et les gnes actA et plcB ; et en aval, lopron prfA, comprenant le gne prfA et le gne plcA ( Dramsi et al., 1993). Les gnes inlA et inlB se trouvent une certaine distance sur le chromosome. Lensemble des gnes de virulence est contrl positivement par lactivateur transcriptionnel PrfA. (Figure 03)

Figure 03 : Les gnes de virulence de L. monocytogenes


(prfA : opron comprenant le gne prf A- PI-PLC: phosphatidyl-inositol-phospholipase CPC- PLC : phosphatidyl-choline-phosphlipase C - LLO : listeriolysine O - hly : gne codant la LLOmpl : gne codant une mtallo protase - Act A : Actine A- InIA : internaline A- InIB : internaline B- InIC : internaline C)

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CHAPITRE 2: Contamination de laits crus par Listeria spp.

CHAPITRE 2: CONTAMINATION DE LAITS CRUS PAR listeria spp.


Du fait de son caractre ubiquitaire, Listeria peut tre retrouve avec une frquence variable dans toutes les denres alimentaires, brutes ou transformes, prsentes la consommation ltat cru ou peu cuit (produits vgtaux, viandes et produits carns, laits et produits laitiers, poissons et produits de la mer .). (Larpent, 2004) La contamination du lait cru peut tre : Une contamination interne et directe : dans ce cas, la bactrie peut traverser le tractus intestinal de lanimal, passer dans la circulation sanguine et contaminer le lait au moment de son excrtion ; ce cas est rare. Une contamination externe et indirecte : celle-ci, viendra de lenvironnement contamin savoir le paillage, les matires fcales, les trayons souills de la vache, le matriel de traite mal nettoy et mal dsinfect et ce, pendant la traite ou juste aprs ; ce cas est la principale source de contamination du lait cru la ferme. La frquence de L.monocytogenes dans le lait cru de vache est trs variable selon les tudes. Elle est prsente dans 1 45% des chantillons (Jouve et al., 1991) (tableau4). Cette frquence de contamination varie avec la saison do un plus grand nombre de laits crus contamins par L. monocytogenes au printemps et en t (Marth, 1986). Les donnes sur le lait de chvre et de brebis sont plus rares ; la frquence de contamination est denviron 4% pour le lait de chvre et de 1 2% pour le lait de brebis (Rodrigues et al., 1994). Ces frquences peuvent varier selon les modalits dlevage. Tableau 4: Incidence de Listeria monocytogenes dans le lait cru.
pays France USA France Angleterre Trkiye Algrie Iran UK Colombie Nombre dchantillons analyss 349 300 486 18 47 153 88 1819 81 dchantillons positifs 11,7 03 2,4 4,4 00 2,6 1,13 2 25,9 Rfrences Joure et Lahellec, 1991 Lund et al., 1991 Broseta et al., 2003 Gilmour, 2004 Aygun et al., 2006 Taha Mossadek, 2007 Abedi Jalali, 2008 Little et al., 2008 Vanegas et al., 2009 14

CHAPITRE 3: Taxonomie bactrienne et phylognie

CHAPITRE 3:TAXONOMIE MICROBIENNE ET PHYLOGENIE


La taxonomie est ltude de la diversit des microorganismes et les interactions qui peuvent exister entre eux. Elle englobe trois domaines : La classification, La nomenclature, Lidentification. En fonction de la nature des donnes, les diffrentes approches taxonomiques sont : La taxonomie phnotypique: sintresse aux donnes anatomiques,

histologiques, morphologiques.. La taxonomie numrique: concerne les patterns binaires (prsence, nombre, 1,0). Chimio-taxonomie: lexamen des structures des acides gras, des acides amins et autres; constituent les principaux caractres utiliss. La taxonomie molculaire: concerne les squences dADN et des protines. La taxonomie numrique est une dmarche utilise pour : Dcrire un individu et le situer relativement dautres. classifier des groupes systmatiques peu tudis. inclure des espces nouvelles dans des classifications anciennes.

Selon Anderegg (1973), les tapes qui composent la dmarche de la taxonomie numrique sont les suivantes :

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CHAPITRE 3: Taxonomie bactrienne et phylognie

1-Choix des objets dtude: ce sont les taxons concerns par lanalyse. Ils ne doivent pas tre trs diversifis sur le plan systmatique.

2-Choix des caractres qui servent la description des objets : les paramtres choisis dcrivent bien les individus quelque soit leur position systmatique. Ils doivent prsenter deux tats de caractres (1,0)
Ex. : on ne choisit pas le paramtre production de mthane pour des taxons strictement arobies

3-Codification des donnes et laboration de la matrice : les tats des paramtres pralablement choisis, sont affects du symbole 1 ou 0 pour coder leur prsence ou leur absence.

4-Choix de lalgorithme de classification : en fonction des objectifs et des donnes, le microbiologiste tranchera pour lun ou lautre algorithme de construction de larbre

5-Calcul du graphe arborescent (le phnogramme) : une fois lalgorithme choisis, la construction de larbre est ralise sur un logiciel appropri (Mega, Phylowin, Phylogen)

6-Interprtation des rsultats : linterprtation de larbre est base sur la topologie obtenue.

Logigramme 1 : La dmarche de la taxonomie numrique (Anderegg, 1973). Remarque : lenracinement de larbre nest pas une obligation absolue, mais une ncessit par rapport la qualit des clades obtenus.

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CHAPITRE 3: Taxonomie bactrienne et phylognie

Il existe plusieurs mthodes pour calculer des arbres phylogntiques ; ces mthodes peuvent se regrouper en deux catgories :

Mthodes de construction darbres

Bases sur les distances qui peuvent tre le nombre de substitutions entre deux squences ou sur la similitude globale.

Bases sur les caractres qui prennent plusieurs tats

UPGMA

NJ

Parcimonie

Maximum de Vrais semblance

Mthodes drives des mthodes de distances

FITCH

KITSCH

Les mthodes de distances sont bases sur lutilisation dune matrice o sont consignes les distances calcules pour toutes les combinaisons deux par deux des OTUS (operationnal taxonomic units). Lapplication des algorithmes plus ou moins complexes permet de dduire, partir de la matrice de distance, les relations phylogntiques des OTUS sous forme de dendrogrammes et de rassembler dans un mme clade de similitude les espces les plus rapproches. On peut citer deux principales mthodes de construction darbres : La mthode UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) La mthode de Neighbor-Joining (NJ)

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MATERIEL ET METHODES

Matriel et mthodes

1. Prlvements Nous avons rcolt le lait de vache partir de huit fermes situes dans deux wilayas de lEst algrien : SKIKDA (28 prlvements) et TEBESSA (22 prlvements) ; soit un total de 50 chantillons dont la description est porte sur le tableau 5. Tableau5: Identification des prlvements de laits crus.
REGION
WILAYA

DATE DE PRELEVEMENT 19/12/2009 24/12/2009 15/03/2010 14 /03/2010 19/03/2010 31/03/2010 30/03/2010 20/03/2010

COMMUNE BENI BECHIR HAMMADI KROUMA RAMDANE DJAMEL SIDI MAZGHICHE MEDJAZ DECHICHE GUESSABA SIDI MAZGHICHE KOUIF

NOMBRE DECHANTILLON 01 09 06 03 03 02 04 22 50

SKIKDA SKIKDA SKIKDA SKIKDA SKIKDA SKIKDA SKIKDA TEBESSA

Nombre de prlvements

Notre travail a t ralis, dans sa totalit, au laboratoire central de la wilaya de SKIKDA. Le lait est prlev aseptiquement partir dun pis propre : nettoy leau savonneuse, rinc leau strile. Les premiers jets de laits sont rejets, car ils sont gnralement plus contamins par les microorganismes. Le lait est rcolt dans des flacons de 250 ml pralablement striliss et tiquets. Il est ensuite transport dans une glacire et conserv 4C au rfrigrateur du laboratoire. (Norme ISO 7218 : des indications prcises de transport des chantillons et les tempratures requises). La dure de transport de nos chantillons na pas dpass les deux heures entre les prlvements et les analyses effectues.

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Matriel et mthodes

2. Mthodes danalyses 2.1-Analyses microbiologiques


Notre objet, aprs avoir achemin tous les prlvements au laboratoire, est deffectuer un ensemble danalyses microbiologiques visant : Un dnombrement de la flore totale arobie msophile (FTAM). Isolement et identification prsomptive des bactries. Enrichissement des chantillons dans un milieu appropri pour la recherche de Listeria spp. a) Dnombrement de la FTAM Le dnombrement de la FTAM est ralis sur glose standard pour numration PCA (plate count agar) par ensemencement dans la masse de 1ml des dilutions de 10-2 10-4. Les dilutions sont faites par leau physiologique. Les boites ensemences sont incubes couvercles en bas 30C pendant 72h avec : Premire lecture 24h. Deuxime lecture 48h. Troisime lecture 72h. Le comptage des colonies ayant pouss sur les boites a t effectu en tenant compte des facteurs suivants : Ne dnombrer que les boites contenants entre 30 300 colonies. Multipliant toujours le nombre trouv par linverse de dilutions. Faire ensuite la moyenne arithmtique des colonies entre les mmes dilutions. Sur la base de laspect macroscopique, les colonies bactriennes ont t prleves partir de dilutions et repiques sur la glose TSA (tripticase soja agar) (cette glose permet la croissance abondante de la plupart des bactries arobie et anarobie, sans adjonction de substances nutritives) et sont places ltuve 30C pendant 48h.

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Matriel et mthodes

Lait cru ensemenc : 1ml aux dilutions 10-2, 10-3, 10-4

PCA

72 h / 30C

TSA

Chaque colonie est repique sur TSA 48h / 30C Figure 4 : Etapes pour lisolement des colonies de la FTAM

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Matriel et mthodes

La puret des souches sest effectue sur trois jours successifs en phase alternative entre milieu solide et milieu liquide. Lensemencement a t ralis par la mthode de stries dpuisement; dont les trois repiquages successifs assurent la puret des souches (Guy leryral et al., 2007) sur lesquelles les tests didentifications seront raliss (Norme de techniques de base pour avoir une culture pure (ISO : 7218)). b) Isolement et identification prsomptive des bactries Base sur plusieurs tests concernant leurs caractres morpho-physio- biochimiques. (tableau 6). 1. Tests Prliminaires: se basent sur lobservation macroscopique et microscopique dont le but est dtudier les caractres morphologiques. LAspect Macroscopique : se basent sur les caractres des colonies : forme, surface, contour, lvation, consistance, opacit, taille et pigmentation. LAspect Microscopique : un examen ltat frais a t fait pour examiner la mobilit, la forme des bactries, larrangement des cellules suivi dune coloration de Gram. Recherche de : la Catalase, lOxydase et lONPG. 2. Tests dIdentifications : Caractres Physiologiques : pour la dtermination du caractre thermophile; des tests de croissance des souches pures 10C et 42C pendant 24 48 h ont t raliss.

Caractres Biochimiques : les bactries ont t identifies de manire prsomptive au niveau de lespce laide de galeries biochimiques API 20 ainsi que les galeries classiques selon la disponibilit, une comparaison des rsultats obtenus avec les donnes de la littrature a t faite pour classer les diffrents taxons.

i)

Mtabolisme des Hydrates de Carbone

cette tude est ralise sur un milieu semi solide M.E.VA.G (milieu pour ltude de la voie dattaque des glucides) en utilisant les diffrentes sources de carbones testes savoir : D- mannitol, D-glucose, mannose, inositol, sorbose, rhamnose, saccharose, melibiose, amylose, arabinose, D-ribose, D-xylose et le lactose.

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Matriel et mthodes

Aprs chauffage du milieu au bain-marie, lajout des substrats carbons a t ralis avec une concentration de 1 , puis, le milieu solidifi au rfrigrateur, puis ensemenc par piqure centrale et incub trois sept jours 30C. Le virage de couleur des tubes positifs se fait du rouge au jaune. ii) LUtilisation du citrate comme une seule source de carbone

La pente du milieu (Citrate de Simmons) est ensemence avec une strie sur toute la surface et lincubation seffectue 37C, pendant plusieurs jours. Les autres tests biochimiques effectus sont mentionns dans lannexe. 3. Conservation des isolats La conservation des souches pures est effectue sur milieu solide inclin et dans des gloses de conservations de lIPA (Institut Pasteur dAlger). Aprs croissance, les cultures sont maintenues 4C dans un rfrigrateur et le renouvellement des souches se fait par repiquage toutes les quatre semaines sur milieu Muller Hinton. 4. Codification des rsultats Une fois tous les tests raliss, un codage numrique a t attribu chaque caractre : Le code 1 pour un rsultat positif. Le code 0 pour un rsultat ngatif. 5. Codification des Souches Les souches isoles ont t codes en utilisant une lettre qui dsigne la wilaya de prlvements: (S) pour SKIKDA et (T) pour TEBESSA, et un chiffre qui dsigne le numro de lchantillon (numro dordre de la souche).

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Matriel et mthodes

Tableau 6: Les tests didentification prsomptive des souches isoles. Caractres morphologiques
macroscopiques microscopiques surface contour forme coloration de Gram

Caractres biochimiques
Capacit de mtaboliser une molcule recherche de lUrase production dindole rduction des nitrates production dacetoine raction du rouge de mthyle production dH2S hydrolyse de la glatine hydrolyse de lesculine ODC1 LDC1 ADH1 TDA1 Substrats carbons citrate mannitol inositol sorbose rhamnose mannose saccharose melibiose amylose arabinose ribose xylose lactose Glucose2

Caractres physiologiques
temprature Prsence denzymes Oxydase

10C

lvation mobilit consistance prsence dendospores

37C

O.N.P.G*

opacit arrangements des cellules

42C

Catalase

taille pigmentation

(1) : Voir listes des abrviations. (2) : pour tester le dgagement de gaz.

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Matriel et mthodes

c) Enrichissement des chantillons dans un milieu appropri pour la recherche de Listeria spp. : mthode AFNOR : V08.055 La recherche de Listeria spp. sest faite en trois tapes, selon le logigramme suivant :

ETAPE 01

Pr-enrichissement: mthode denrichissement froid (mthode de Gray) se base sur le caractre psychrophile de Listeria. Le lait est conserv 4C (dans un tampon phosphate de pH =7.3 avec Na Cl en raison de manque de bouillon Fraser (le milieu slectif denrichissement de Listeria) pendant 08 semaines ou la temprature tant llment slectif (Lammerding et Doyle, 1989) Prendre 1ml de lait conserv froid dans un tube contenant 9 ml deau pepton tamponne. Bien mlanger et incuber 37C pendant 24h. Puis un isolement sur glose Palcam (modifie) 37C pendant 24 48 h.

ETAPE 02

Prendre un isolement et repiquer sur glose TSA-YE (modifi) (annexe) pendant

ETAPE 03

24 48 h 37C Lecture des isolats et identification biochimique.

Logigramme 2 : Les tapes de recherche de Listeria spp. Lecture : observation des colonies verdtres luisantes entoures dun halo noir (hydrolyse de lesculine) incrustes dans la glose (dpression centrale) caractristiques des colonies de Listeria spp. sur glose Palcam (figure 5) puis effectuer les tests suivants : Identification du genre Listeria : coloration de Gram et recherche de la catalase. Identification des espces du genre Listeria Mobilit : Observation ltat frais entre lame et lamelle de petits bacilles ciliatures pritriches ou encore sur glose mannitol-mobilit en culture 25C pendant 24 48 h. Test dHmolyse : utilisant deux mthodes

1. Sur Glose au Sang de Mouton : aprs avoir isol une colonie de glose TSA-YE, puis incub 37C pendant 24h, lhmolyse obtenue traduit par une formation dune zone claire autour des colonies.

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Matriel et mthodes

Figure 5: Aspect des colonies de Listeria spp. sur glose Palcam

Figure 6 : Test CAMP

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Matriel et mthodes

2. Test CAMP (Christie, Atkins et Munch-Petersen): ce test est ralis avec une seule souche disponible rfrence : Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Ce test met en vidence la diffrentiation entre une souche hmolytique et une autre non hmolytique. Le CAMP test est ralis sur glose TSA (tripticase soja agar) additionn de 5 de sang de cheval, dans une boite de ptri avec une premire strie de la souche Staphylococcus aureus puis deux stries de la souche tester perpendiculairement par rapport au

premire strie en se mfiant que les stries ne se touchent pas et restent une distance au minimum de 2mm. Puis incuber pendant 24 48h 37C. Une observation daccentuation de lhmolyse autour de la zone adjacente

perpendiculairement la strie de Staphylococcus sous forme dune pelle confirme lespce de L. monocytogenes (figure 6).

Identification Biochimique

En utilisant lAPI-20, sur le plan biochimique Listeria est : arobie-anarobie facultative. Catalase (+), Oxydase (-), H2S (-), Gaz (-) Esculine(+), ure-indole (-), TDA (-), VP (+), RM (+) (Hitchins, 1995).

La position phylogntique de Listeria spp. avec le reste de la flore bactrienne isole de laits crus a t effectue par le logiciel MEGA 4.0 en utilisant les deux mthodes de construction savoir UPGMA et NJ.

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RESULTATS ET DISCUSSION

Rsultats et discussion

1. RESULTATS
1.1 FTAM: Les colonies se prsentent sous forme lenticulaire en masse. Nous avons slectionn les boites ou le nombre de colonies (n) varie entre 30 et 300. Le dnombrement a concern les dilutions de 10-2 10-4. Les calculs ont t faits selon la loi ; N= nd o d : le facteur de dilution et N: le nombre de bactries en UFC/ml. Les rsultats des dnombrements sont mentionns dans les tableaux 7 et 8 : Tableau 7: Dnombrement de FTAM en UFC /ml dans la wilaya de TEBESSA Code de lchantillon T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T 12 T 13 T 14 T 15 T 16 T 17 T 18 T 19 T 20 T 21 T 22 (UFC/ml)*103 05 24 64 18 32 13 09 15 39 33 09 35 10 11 236 12 10 46 38 10 19 30 La valeur maximale Observation La valeur minimale

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Rsultats et discussion

Tableau 8: Dnombrement de FTAM en UFC /ml dans la wilaya de SKIKDA Code de lchantillon S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S 10 S 11 S 12 S 13 S 14 S 15 S 16 S 17 S 18 S 19 S 20 S 21 S 22 S 23 S 24 S 25 S 26 S 27 S 28 (UFC/ml)*103 18 06 18 59 34 19 31 16 58 22 36 35 142 200 241 43 257 120 150 102 88 62 12 103 94 96 150 112 La valeur maximale La valeur minimale Observation

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Rsultats et discussion

1.2 Identification des bactries Les rsultats morpho-physio- biochimiques obtenus sont reprsents dans une matrice binaire (Annexe 2) qui a concern tous les chantillons rcolts dans les deux rgions. Les observations des examens macroscopiques et microscopiques des 50 chantillons sont mentionnes dans une matrice dans lannexe. Lidentification prsomptive des bactries a t effectue en comparant nos rsultats avec ceux relevs sur des rfrences de systmatiques bactriennes (Bergeys, 1994 ; Joffin J.N, 1998). La FTAM (42 souches) est compose de 59% de bactrie Gram positif et de 41 % de bactries Gram ngatif. La flore Gram positif renferme les Bacillaceae et les Micrococcaceae ainsi que des souches dorigine fcale ou pathogne appartenant aux genres Staphylococcus et Streptococcus. Lidentification de la flore Gram ngatif souligne une concentration

importante en Enterobactriaceae dont le pourcentage de 27.8 % par rapport au 42 souches isoles et particulirement la prsence de Klebsiella ,Proteus,Serratia. Une prsence majoritaire de bacilles par rapport aux coccis a t note (74% et 26% respectivement). Tous les rsultats sont mentionns dans les deux (tableaux 9 et 10): tableaux suivants

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Rsultats et discussion

Tableau 9: Identification prsomptive des souches isoles de la rgion de SKIKDA N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Code des souches S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S 10 S 11 S 12 S 13 S 14 S 15 S 16 S 17 S 18 S 19 S 20 S 21 S 22 S 23 S 24 S 25 S 26 S 27 S 28 S 29 S 30 Espces bactriennes prsomptives Staphylococcus epidermis Bacillus cereus 01

Lactococcus lactis cremoris Neisseria meningitidis Campylobacter fetus Bacillus cereus 01 Bacillus capsul

Serratia biogroupe 1 Serratia polymuthica intermedius

Enterobacter

Salmonella ser pollurum Staphylococcus capitis Bacillus cereus 01 Chromobacterium violaceum Listeria murrayi Bacillus pasteurii Citrobacter freundii Bacillus pasteurii Escherichia coli 2 Aerococcus viridans 2 Streptococcus adjacen Escherichia coli 2 Bacillus megatherium Citrobacter freundii Bacillus sphaericus Bacillus cereus 01 Bacillus cereus 02 Corynebacterium bovis Staphylococcus aureus Micrococcus lylae

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Rsultats et discussion

Tableau 10: Identification prsomptive des souches isoles de la rgion de TEBESSA.


N Code des souches Espces bactriennes prsomptives

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T 12 T 13 T 14 T 15 T 16 T 17 T 18 T 19 T 20 T 21 T 22 T23 T24 T25 T26 T 27

Proteus Neisseria Pseudomonas

mirabilis meningitidis aeruginosa

Leuconostoc mesenteroides Serratia marcescens

Campylobacter fetus Corynebacterium jeikeium Lactococcus lactis lactis Klebsiella Lactobacillus Salmonella oxytoca rhamnosus ser.parathyphi

Lactococcus lactis cremoris Bacillus sphaericus Salmonella ser pollurum

Bacillus pasteurii Brevibacillus brevis Lactobacillus fermenticus Listeria cf. monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Enterococcus faecium Bacillus brevis Listeria murrayi Edwardsiella Bacillus circulans Serratia liquefaciens tarda

Aeromonas hydrophila G2 Enterobacter intermedius

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Rsultats et discussion

En liminant les individus rpts (ayant les mmes tats de caractres), les isolats (au nombre de 42) identifis sont reprsentes dans le tableau suivant : Tableau 11: Rpartition des souches isoles selon le Gram. Gram Familles ou Genres Entrobactries
BACTERIES A GRAM NEGATIF

Pseudomonas Chromobacterium et Neisseria Campylobacter Aeromonas Staphylococcus et Micrococcus Bactries lactiques

Genre et espces Proteus, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter. Pseudomonas aeruginosa C.violaceum, N.meningitidis Campylobacter fetus Aeromonas hydrophila S.epidermis,S.aureus,S.capitis, M.lylae. Leuconostoc , Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Aerococcus B.sphaericus, B. brevis, B. circulans, B. pasteurii, B. cereus, B. megatherium C. jeikeium, C.bovis B. brevis L. murrayi, L. cf. monocytogenes

27.8 2.4 4.8 2.4 2.4 9 19 19 4.8 2.4 6

BACTERIES A GRAM POSITIF

Bacillus Corynebacterium Brevibacterium Listeria

1.3 Isolement de Listeria spp. 1.3.1 Aspect des colonies sur les diffrents milieux
Glose Palcam : les colonies de Listeria sont de couleur vert marron fonc, leurs centres apparaissent enfoncs dans la glose et elles sont entoures d'un halo noir (hydrolyse de l'esculine) (figure 5). Glose au sang frais: les colonies sont entoures dune zone claire troite due lhmolyse des hmaties (figure 7). Glose TSA-YE : les colonies obtenues sont de petite taille de 1 2 mm, translucides et bord irrgulier. Lexamen granuleuses (figure 8). montre des colonies bleutes et

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Rsultats et discussion

Figure7: Aspect des colonies de L.cf monocytogenes sur glose au sang frais.

Figure 8 : Aspect des colonies de Listeria spp. sur glose TSA

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Rsultats et discussion

1.3.2 Aspect Microscopique : La coloration de Gram a rvl des petits bacilles, courts,
rguliers, Gram positif, aux extrmits arrondies, certaines cellules pouvant toutefois tre incurves. Elles se prsentent de manire isoles ou groupes en V ou en L, en palissades ou en courte chanettes.

1.4 Analyse Phylogntique 1.4.1 Calcul du Coefficient de Jaccard (IS) : Indice non symtrique, quantifie la
similitude pour chaque couple bactrien selon lquation suivante :

IS=

(1,1) (1,1)+(1,0)+(0,1)

(1,1) =les deux tats sont prsents dans les deux bactries. (1,0) =ltat est prsent dans la premire bactrie et absent dans la deuxime. (0,1) = ltat est absent dans la premire bactrie et prsent dans la deuxime. Cet indice permet de calculer la matrice de similitude. Une fois calcule, cette matrice servira pour le calcul de la matrice des distances selon lquation :

d= 1-IS

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Tableau12 : Matrice de distances des souches Gram positif

1 [1] B. cereus1 [2] E. faecium [3] M. lylae [4] L. murrayi [5] L. lactis cremoris [6] B. capsule [7] Listeria spp [8] Brevi. Brevis [9] L. fermenticus 82.80

10

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24

25

62.50 66.67 53.60 76.93 61.54 50.00 31.82 58.34 61.54 65.60 56.00 54.55 81.48 68.00 62.07 74.10 57.69 45.84 72.00 60.00 47.40 44.50 56.00 50.00 51.90 64.00 77.78 72.50 53.57 54.55 40.00 65.52 63.64 70.84 77.80 47.83 58.62 72.42 57.69 50.00 70.37 60.87 76.47 78.95 56.00 67.86 69.23 74.08 75.00 66.67 52.38 77.78 77.78 61.29 64.00 50.00 69.60 60.87 26.09 69.57 54.55 85.72 78.95 67.74 52.00 57.20 58.62 69.00 62.50 55.60 52.38 58.34 64.29 86.37 60.00 61.55 58.62 58.62 52.00 52.00 75.00 33.40 63.64 47.37 66.67 66.67 42.31 54.55 70.00 68.18 48.15 52.40 61.54 59.30 51.86 59.09 71.50 71.50 68.75 64.52 62.97 64.00 69.57 56.00 67.86 60.80 62.50 56.00 67.86 62.50 87.00 86.40 16.67 42.86 64.00 73.08 60.87 54.55 65.39 62.50 52.00 48.00 67.86 60.00 72.50 74.40 77.27 69.00 70.00 60.87 62.50 71.43 66.67 50.00 51.61 74.20 45.84 23.81 62.50 61.54 66.67 80.95 81.82 64.80 55.60 62.50 70.84 65.00 66.67 57.15 65.72 56.67 59.26 42.86 68.00 59.26 47.83 71.43 83.34 84.21 63.64 84.62 60.87 69.23 80.00 72.00 76.47 68.75 67.74 58.34 51.86 65.52 68.97 57.69 61.54 70.37 81.82 82.61 44.83 85.19 62.50 68.00 81.25 68.97 77.78 56.25 40.74 64.52 75.00 61.54 59.26 65.39 68.00 57.90 80.77 80.95 81.82 68.75 74.00 38.10 61.90 68.97 45.46 67.75 51.62 63.64 74.20 70.00 66.67 36.00 75.00 62.50 68.97 65.40 56.00 76.47 77.78 48.39 57.70 63.64 82.76 47.37 60.87 60.87 64.52 57.15 66.67 76.00 76.19 68.18 68.20 65.52 68.20 65.39 45.46 65.39 81.82 82.61 50.00 57.69 59.09 59.09 60.00 62.50 47.37 48.39 63.40 72.30 80.77 71.43 58.83 66.67 67.90 60.00 67.90 68.00 69.23 65.22 78.95 80.00 53.57 56.00 76.47 61.91 43.50 66.67 67.90 53.34 80.77 72.00 76.19 80.96 68.42 75.00 72.23 61.54 71.50 71.43 52.18 63.64 71.43 84.21 84.21 51.62 72.00 77.78 75.00 54.17 68.00 53.80 80.00 81.50 65.22 76.00 65.00 63.64 47.06 63.16 66.67

35

[10] S. capitis [11] L. mesenteroides [12] L. lactis lactis [13] B. circulans [14] S. epidermis [15] Cory. Jeikeium [16] S. aureus [17] B. pasteurii [18] A. viridians [19] S. adjacent [20] B. megatherium [21] L. rhamnosus [22] B. cereus2 [23] Cory. bovis [24] B. sphaericus [25] B. brevis

Tableau13 : Matrice de distances des souches Gram ngatif.

1 [1] P. mirabilis [2] N. meningitidis [3] P. aeruginosa [4] C. fetus 66.70

10

11

12

13

14

15

16

17

67.90 58.40 35.00 60.00 61.80 54.90 61.30 48.30 84.00 63.00 56.70 52.70 53.00 53.90 59.40 69.30 51.70 57.20 30.40 53.20 63.40 65.70 53.00 60.00 57.60 40.00 56.70 19.40 51.80 55.60 59.30 51.60 73.10 69.60 45.50 70.40 59.40 38.50 40.70 62.10 61.60 62.50 52.20 66.70 68.20 66.70 64.80 60.80 54.20 53.60 71.90 58.40 57.20 50.00 68.00 64.60 60.80 54.60 72.50 54.60 48.50 46.50 39.20 59.40 59.30 65.40 57.20 60.90 62.50 64.60 53.60 65.00 65.30 70.60 63.00 50.00 60.90 61.60

36

[5] S. marcescens [6] K. oxytoca [7] S. ser parathyphi [8] E. coli2 [9] S. liquefaciens [10] E. tarda [11] A. hydrophila G2 [12] S. biogroupe1 [13] S. polymuthica [14] E. intermedius [15] C. violaceum [16] C. freuindii [17] S. ser pullorum

77.00 57.60 71.50 57.90 60.80 51.80 48.30 41.20

56.70 60.80 46.20 46.90 60.80 45.20 45.50 57.70 64.00 60.00 57.70 54.90 64.00 59.40 53.20 33.40 62.50 46.20

71.90 70.00 25.90 72.50 54.60 69.00 39.30 50.00 56.00 73.10 69.00 66.70 65.30 65.60 50.00 59.40 41.20 51.80

54.30 77.50 42.20 70.40

41.40 67.70 38.50 70.90

53.40 50.00

61.60 72.80 54.60

Rsultats et discussion

1.4.2 Reconstruction des arbres phylogntiques: les deux matrices de distances


(Gram positif et Gram ngatif) ont t traites par le logiciel de construction des arbres phylogniques MEGA 4.0. Les mthodes UPGMA et NJ utilises ont donn les arbres suivants :
18.000 18.000

9.150 2.921 1.780 0.933

Bacilluscereus1 Bacillus cereus 1

Bacillus cereus 2 Bacilluscereus2 Bacillus brevis Bacillusbrevis Corynebacterium jeikeium Corynebacteriumjeikeium


Corynebacteriumbovis Bacilluscapsule

27.150 23.685 6.386 23.685 29.400 2.451 7.650 6.198 21.750 21.750

Corynebacterium bovis Bacillus capsul

Bacillus circulans Bacilluscirculans Bacillus sphaericus Bacillussphaericus Enterococcus faecium Enterococcusfaecium


Lactococcuslactiscremoris Lactococcus lactis cremoris

20.455 1.646 13.045 7.410 26.653 1.373 8.257 21.155 21.155 19.050 10.362 18.453 19.050 11.905 11.905 8.335 8.335 20.370 7.341 9.025 2.485 20.370 22.920 22.920 13.045

4.383

Lactococcus lactis lactis Lactococcuslactislactis Streptococcus adjacen Streptococcusadjacen Staphylococcus capitis Staphylococcuscapitis
Staphylococcusepidermis

Staphylococcus epidermis

1.624 0.374

Leuconostocmesenteroides Leuconostoc mesenteroides

Lactobacillus rhamnosus Lactobacillusrhamnosus


Micrococccuslylae Micrococcus lylae Aerococcusviridans Aerococcus viridans Lactobacillusfermenticus Lactobacillus fermenticus

2.052 2.647

19.376

Staphylococcus aureus Staphylococcusaureus Bacillus pasteurii Bacilluspasteurii


Bacillusmegatherium Bacillus megatherium Listeriamurrayi Listeria murrayi

Listeria cf. monocytogenes Listeriaspp Brevibacillus brevis Brevibacillusbrevis

31.945

Figure 9: Arbre UPGMA des souches Gram positif

37

Rsultats et discussion

6.859 2.060 0.753

23.123 19.187 18.058

Staphylococcuscapitis

Staphylococcus capitis

Staphylococcusepidermis Staphylococcus epidermis Leuconostocmesenteroides Leuconostoc mesenteroides

11.761

20.042

Lactobacillus rhamnosus Lactobacillusrhamnosus Corynebacterium bovis Corynebacteriumbovis


Lactobacillusfermenticus Lactobacillus fermenticus Staphylococcusaureus Staphylococcus aureus Corynebacteriumjeikeium Corynebacterium jeikeium Bacillusbrevis Bacillus brevis Bacilluscereus1 Bacillus cereus 1 Bacilluscereus2 Bacillus cereus 1 Micrococccuslylae

24.705 0.906 5.267 16.155 24.945 30.014 0.947 3.948 2.060 6.286 16.125 1.320 15.540 20.460 10.622 13.188 18.138 11.140 5.275 22.602 15.886 26.974 8.642 9.970 6.048 4.244 17.448 19.061 26.779 8.740 7.930

Micrococcus lylae Aerococcus viridans Bacillus pasteurii

Aerococcusviridans Bacilluspasteurii

2.937

Bacillusmegatherium

5.803

Bacillus megatherium Enterococcus faecium Streptococcusadjacen Streptococcus adjacen Lactococcus lactis cremoris Lactococcuslactiscremoris Lactococcus lactis lactis
Enterococcusfaecium Lactococcuslactislactis Listeriamurrayi Listeria murrayi

Listeria cf. monocytogenes Listeriaspp Brevibacillus brevis Brevibacillusbrevis


Bacilluscapsule

34.922 0.207 2.870 8.322 28.728 18.448 25.052

Bacillus capsul Bacilluscirculans Bacillus circulans Bacillus sphaericus Bacillussphaericus

Figure 10: Arbre NJ des souches Gram positif

38

Rsultats et discussion

3.913 2.000 1.508 1.390

20.600 20.600 9.700

Neisseriameningitidis

Neisseria meningitidis

Aeromonas hydrophila G2 AeromonashydrophilaG2 Campylobacter fetus Campylobacterfetus


Enterobacterintermedius Edwardsiellatarda Escherichiacoli2

14.813 26.513 28.020

9.700

Enterobacter intermedius Edwardsiella tarda Escherichia coli 2 Proteus mirabilis Chromobacterium violaceum Salmonella ser. Paratyphi Salmonella ser. Pollurum

0.800 2.550

25.000 25.000 19.250

Proteusmirabilis

Chromobacteriumviolaceum Salmonellaserparathyphi Salmonellaserpullorum Serratiamarescens Serratia marcescens

1.860 8.300 2.350 3.271

19.250 22.750 22.750 25.100

Serratia polymuthica Serratiapolymuthica Serratia liquefaciens Serratialiquefaciens


Pseudomonasaeruginosa Pseudomonas aeruginosa Serratiabiogroupe1 Serratia biogroupe 1 Klebsiellaoxytoca Klebsiella oxytoca Citrobacterfreuindii Citrobacter freuindii

1.839 0.933

14.488

12.950 12.950 23.100

4.337

23.100

Figure 11 : Arbre UPGMA des souches Gram ngatif


12.367 13.533 21.991 5.019 24.209 26.647 2.043 3.977 0.803 19.728 25.772 31.155 0.011 0.329 13.095 7.711 11.689

13.806 0.423 2.924

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonasaeruginosa Serratia biogroupe 1 Serratiabiogroupe1 Klebsiella oxytoca Klebsiellaoxytoca Citrobacter freuindii Citrobacterfreuindii Serratia liquefaciens Serratialiquefaciens
Serratiamarescens Serratia marcescens Serratiapolymuthica Escherichiacoli2

Serratia polymuthica Escherichia coli 2

Campylobacter fetus Campylobacterfetus Enterobacter intermedius Enterobacterintermedius Edwardsiella tarda Edwardsiellatarda


Neisseriameningitidis Neisseria meningitidis AeromonashydrophilaG2 Aeromonas hydrophila G2 Proteusmirabilis Proteus mirabilis Chromobacteriumviolaceum

25.843 3.654 2.707 5.635 22.163 19.038 27.750 22.250 16.433 5.215 22.067

Chromobacterium violaceum Salmonella ser. Paratyphi Salmonella ser. Pollurum

2.217

Salmonellaserparathyphi Salmonellaserpullorum

Figure 12 : Arbre NJ des souches Gram ngatif

39

Rsultats et discussion

1.4.4 Reconstruction par la Phylognie Molculaire


Les squences de lARNr 16S des genres identifis suites une tude phntique ont t rcupres a partir dune banque de donne molculaire : GenBank. Les squences partielles de lARNr 16S des genres ont t portes sur le tableau (Annexe).

0.0468 0.0118 0.0519

0.5419 0.5419

Staphylococcus capitis Lactococcus lactis subsp. lactis Brevibacillus brevis Lactobacillus rhamnosus Bacillus cereus 1 Micrococcus lylae Enterococcus faecium Bacillus brevis Corynebaterium bovis Streptococcus adjecen Corynebacterium jeikeium Bacillus cereus 2 Aerococcus viridans Lactobacillus fermentum Bacillus circulans Bacillus sphaericus Listeria monocytogenes Listeria cf. monocytogenes Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis Bacillus megatherium Saphylococcus aureus Leuconostoc mesenteroides Listeria murrayi Lactococcus lactis subsp. cremoris Bacillus pasteurii

0.5887 0.5480 0.0525 0.1837 0.3643 0.3643 0.5568

0.0317

0.0067

0.0956 0.0641

0.5568 0.5962 0.5962 0.5419 0.1184 0.5775 0.5568 0.5419

0.0227

0.0238

0.0177

0.1134 0.0206 0.5568 0.1089

0.0000 0.0000 0.5881 0.5881 0.5801 0.5801 0.6259

0.0166 0.0458

0.0711

0.0252 0.0214 0.7312

0.6045 0.6045

Figure13: Arbre UPGMA construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram positif

40

Rsultats et discussion

0.1791 0.0529 0.0063 0.0346 0.0097

0.4187 0.3202

Lactobacillus rhamnosus Bacillus cereus 1 Micrococcus lylae Brevibacillus brevis

0.5423 0.5952 0.5260 0.0406 0.5578 0.5269

Staphylococcus capitis Lactococcus lactis subsp. lactis Enterococcus faecium Bacillus brevis Aerococcus viridans Lactobacillus fermentum Bacillus circulans Bacillus sphaericus Listeria monocytogenes Listeria cf. monocytogenes Staphylococcus epidermis Staphylococcus epidermis Corynebaterium bovis Streptococcus adjecen Corynebacterium jeikeium Bacillus cereus 2 Bacillus pasteurii

0.0144

0.1347 0.5704

0.5868

0.5554 0.0093 0.1063 0.0251 0.5582 0.0264 0.1408 0.0684 0.0000 0.0000 0.5731 0.6030 0.5820 0.6105 0.5231 0.1142 0.7293 0.0544 0.0348 0.0372 0.0445 0.0412 0.5384 0.6217 0.5894 0.6237 0.6021 0.5607

0.0181

Bacillus megatherium Saphylococcus aureus Lactococcus lactis subsp. cremoris Leuconostoc mesenteroides Listeria murrayi

Figure 14: Arbre NJ construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram positif

41

Rsultats et discussion

0.0221 0.0392 0.0122 0.0165

0.5827 0.5827

Salmonella ser parathyphi Edwardsiella tarda Chromobacterium violaceum Serratia biogroupe1 Proteus mirabilis Serratia marcescens Aeromonas hydrophila G2 Enterobacter intermidius

0.6048 0.6440 0.6312

0.0117

0.0250 0.3733 0.6727

0.2580 0.2580

0.0220

0.6409 0.0436 0.0935 0.0425 0.0564 0.5474 0.5474 0.5951 0.5951

Salmonella ser pullorum peudomonas aeruginosa Serratia plymuthica

Klebsiellaoxytoca oxytoca Klebsiella


Citrobacter Citrobacterfreundii freuindii Campylobacter fetus Serratia liquefaciens Escherichia coli2 Neisseria meningitidis

0.6375 0.0125 0.0313 0.0419 0.6626 0.6207 0.6207

Figure 15: Arbre UPGMA construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram-

0.3817 0.0174 0.0111

0.2666 0.2493 0.6366

Serratia marcescens Aeromonas hydrophila G2 Enterobacter intermidius Proteus mirabilis Salmonella ser parathyphi Edwardsiella tarda Chromobacterium violaceum Serratia biogroupe1

0.0383

0.6315

0.5799 0.0134 0.0435 0.0346 0.0112 0.6294 0.6455 0.0472 0.0889 0.0412 0.0648 0.5594 0.5354 0.6045 0.5856 0.5842 0.5935

Salmonella ser pullorum peudomonas aeruginosa Serratia plymuthica Klebsiella Klebsiellaoxytoca oxytoca Citrobacter Citrobacterfreundii freuindii Campylobacter fetus Serratia liquefaciens Escherichia coli2 Neisseria meningitidis

0.6388 0.0176 0.0293 0.0458 0.6588 0.6277 0.6137

Figure 16: Arbre NJ construit partir des squences dARNr 16S des souches Gram -

42

Rsultats et discussion

2. DISCUSSION
Les 42 souches isoles partir des 50 chantillons de laits crus rcolts partir des deux wilayas (Tbessa et Skikda) ont t identifies sur la base de leurs caractres morpho-physiobiochimiques. La prsence de Listeria cf. monocytogenes a t ralise selon trois procds : Sur glose PALCAM, Sur Glose au sang, Sur glose TSA-YE.

Enfin, une phylognie numrique des isolats obtenus a t construite selon les deux algorithmes NJ et UPGMA.

2.1Concernant les Rsultats de Dnombrement


La FTAM nous renseigne sur la qualit hyginique du lait cru. Cest la flore la plus recherche dans les analyses microbiologiques. Lensemble des rsultats obtenus rapports dans les tableaux 7 et 8 montrent la prsence de variations notables entre les diffrents chantillons de laits crus analyss. Notons que les chantillons de la rgion de Tbessa se caractrisent par une FTAM plus rduite comparativement Skikda (Tbessa = 3,3 x 104 UFC/mL et Skikda = 8,3 x 104 UFC/ mL). Les rsultats de cette tude montrent la variabilit significative de la qualit du lait cru entre les deux rgions. Cette diffrence de charge microbienne serait due :

1 limpact de leffet climatique (situation gographique) ; dont le degr dhumidit favorise la prolifration et la multiplication bactrienne Skikda qui est une rgion humide loppos de Tbessa (figures 17 et 18) qui est une rgion semi aride, comme signal par Welshimer (1960).

43

Rsultats et discussion

Figure 17: Moyenne mensuelle des tempratures minimales et maximales quotidiennes releves sur Skikda et sur Tbessa.

Figure 18 : Valeurs moyennes des prcipitations (mm) releves sur la wilaya de Skikda et la wilaya de Tbessa 2 la pratique dhygine adopte pour chaque rgion : Tbessa est moins charge que

Skikda. Ceci serait d au respect des conditions hyginiques pendant la traite et les bonnes conditions de transport. En effet, la ferme de Tbessa suit une mthode de traite mcanique et le lait obtenu est immdiatement rfrigr aprs la traite dans une glacire isotherme munie dun accumulateur de froid (chane de froid respecte). 3 la variabilit de type dalimentation de vaches laitires entre les deux rgions : la qualit de lensilage qui joue un rle primordial dans lapparition de bactries chez les animaux.

Les charges maximales tolres par les deux rglementations (Normes Franaises ou Amricaines dvaluation de la qualit du lait cru) sont respectivement 5*105 UFC/ml et 5*104 UFC/ml (Alais, 1985), Les Normes Algriennes tolrent jusqu 105 UFC/ml

(JORADP n 35/98)

44

Rsultats et discussion

Donc, par rapport nos rsultats, nous pouvons dduire que le lait prlev a une bonne qualit hyginique selon les Normes mentionnes ci-dessus. Cependant, Richeter et al., (1992), notent que le lait cru rcolt dune vache saine doit contenir une charge microbienne inferieure 1000 UFC /mL.

2.2Concernant les tests didentifications


Lidentification prsomptive des souches a t effectue aprs avoir compar les caractres tudis de nos souches avec ceux des espces de rfrence relevs sur le Bergeys (1986) et Joffin J. N. et al. (2001).

Les 42 souches isoles et identifies ont t classes en 11groupes bactriens selon Madigan M. (2007). (Tableau 11). Une distribution htrogne et une grande variabilit phnotypique ont t observes,

La prsence de Staphylococcus, Micrococcus, Aeromonas, Campylobacter, Pseudomonas, Neisseria et Chromobacterium est corrobore par les tudes de Little et de Louvois (1999).

Le taux lev des Bactries lactiques et des Bacillus sexpliquerait par la relation qui existe entre ces bactries et la composition du lait cru. (Sawaya et al., 1984) car, la priode de chaleur rend les conditions propices pour une augmentation dacidit favorisant ainsi la prolifration des germes suscits, une hygine insuffisante de lopration de traite (mamelle non lave) et les premiers jets non limins.

45

Rsultats et discussion

2.3Concernant Listeria
Listeria spp. est prsente dans trois chantillons sur 50 laits analyss ; soit un taux de 6 (Tableau 14). Lidentification microbiologique a rvl la prsence de Listeria murrayi avec des taux de 3,5 Skikda et 4,5 Tbessa.

Tableau 14 : Incidence de Listeria spp. dans le lait cru de fermes dans lEst algrien (Tbessa et Skikda). Wilaya TEBESSA SKIKDA TEBESSA et SKIKDA Nombre dchantillons 22 28 50 Frquence de L. murrayi () 1/22 (4,5) 1/28 (3,6) 2/50 (4) Frquence de L. cf. monocytogenes () 1/22 (4,5) 0/28 (0) 1/50 (2) et Incidence de Listeria spp. 9% (2/22)

3,6 % (1/28) 6% (3/50)

Le pourcentage de contamination de lait cru par Listeria spp. (6) sur les deux wilayas est en accord avec les rsultats publis dAbou-Eleinin et al., 2000 ; Harvey et Gilmour, 1992 ; Jayaro et Henning, 2001 ; dont le pourcentage varie entre 0 et 22 selon leurs situations gographiques. Cependant, il reste relativement proche de celui not par Kozak et al.,( 1996) (3 4) ; mais loign des rsultats de Vitas et al., (2004) (1) (Espagne) ; de FSAI,(2004) (0,2) (Irlande) ; de Gilmour et Kells (2004) (44,4). Ces diffrences seraient dues : aux variations des mthodes danalyses, aux diffrences des milieux dchantillonnages (gographie), le nombre dchantillons (reprsentativit statistique), et aux mthodes didentification gnotypique (PCR et PFGE) employe par les auteurs suscits plus approfondies par rapport lidentification classique utilise durant ce travail (base sur les seuls caractres morpho-physio-biochimiques).

46

Rsultats et discussion

L. monocytogenes, en Algrie, ressort dans les travaux de : Bellouni (1990) : 3,2 , de Lebres (2000) : 1,9 et de Mossadek et al. (2007) : 2,61 .

Leurs rsultats sont en accord avec les ntres (2). Lidentification biochimique adopte durant notre travail au laboratoire a montr ses limites pour une confirmation dfinitive de la souche hmolytique obtenue de Listeria spp. suite limpossibilit de raliser le test du caractre DIM (fond sur lhydrolyse dun substrat naphtymide par une arylamidase) qui diffrencie lespce monocytogenes (enzyme absente) de linnocua. La raret de la prsence de Listeria monocytogenes dans nos chantillons (avec un pourcentage de 2 : une souche TEBESSA et aucune SKIKDA) peut tre justifi par les conditions dfavorables pour sa multiplication : Un ensilage acide bien conserv (Bemrah et al., 1998). Fluctuations saisonnires (Fenlon et al., 1995). Conditions climatiques (Desmasures et al., 1997). La composition et la concentration de la microflore autochtone prsente dans le lait en grande teneur empchent la prolifration de Listeria spp. par leffet de comptition (Jay, 1999 ; Carr et al., 2002 ; Augusto et al., 2009) Conditions hyginiques respects pour certains prlvements. (Oteng-Cyang, 1984).

Bien que la listriose soit rare en Algrie, non diagnostique et peu investigue, les rsultats obtenus montrent la prsence de ce germe ubiquitaire, et confirment aussi sa raret et le danger impos pour la sant humaine et animale la fois, surtout dans les circuits de vente de laits crus non contrls qui imposent un vritable risque sur la sant du consommateur et pour les immunodprims et les femmes enceintes. En Algrie, les donnes pidmiologiques sur le profil de lincidence de Listeria spp. sont rares (Taha Mossadek, 2004). Lors dune investigation ralise par nos soins lhpital de Tbessa et lhpital de Skikda, aucun cas de listriose na t dtect (LCR et pus) aux laboratoires de microbiologie. Ceci serait d aux conditions particulires de croissance de Listeria et au manque des milieux slectifs pour Listeria qui ne sont pas disponibles.

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Rsultats et discussion

En fin, lincidence de Listeria spp. isole de laits crus est rare dans notre pays mais les conditions non respects de : La dure de conservation des aliments (laits, viandes..). Lintgrit de la chaine de froid. Lhygine et les mthodes de traites. Le transport jusquaux consommateurs.

augmentent le risque dune pidmie mme si elle reste rarement investigue.

2.4 Concernant la Phylognie


Linteraction phylogntique de listeria spp. avec le reste de la fore bactrienne sest base sur : Les tests biochimiques dont la fermentation des diffrents sucres. Les caractres morphologiques. Les caractres physiologiques.

Le calcul du coefficient de Jaccard est bas sur 44 caractres utiliss dans cette tude qui restent insuffisants pour pouvoir aboutir une identification prcise de lespce, car le principe de base de la taxonomie numrique oblige la comparaison sur un plus grand nombre de caractres. Concernant les bactries Gram positif (25 souches), la mthode UPGMA donne deux groupes distincts spars par une distance de 2,485 + 1,646 = 4,131. La liaison de Brevibacterium brevis avec les Listeria est acceptable du fait quils appartiennent au mme ordre des Bacillales. Groupe 1 = (Brevibacillus brevis, (Listeria cf. monocytogenes, Listeria murrayi)) Groupe 2 = Reste des clades

Au sein du groupe 2, seuls Lactobacillus fermenticus et Aerococcus viridans, (Orde : Lactobacillales) sont mal placs ; ils font partie du mme clade que Micrococcus lylae, Staphylococcus aureus, Bacillus pasteurii, Bacillus megatherium (Orde : Bacillales).

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Rsultats et discussion

La construction phylogntique par lalgorithme NJ a rvl deux principaux groupes une distance de 0,207 + 1,320 = 1,527 : Groupe 1 = (((Listeria murrayi, Listeria cf. monocytogenes), Brevibacillus brevis), Bacillus capsule, (Bacillus circulans, Bacillus sphaericus)). Groupe 2 = Reste des clades

Notons que le groupe (Bacillus capsule, (Bacillus circulans, Bacillus sphaericus)) a conserv sa structure cladistique dans les deux arbres.

Les diffrences non significatives pourraient sexpliquer par le fait qu la base, la thorie de calcul des arbres est totalement diffrente pour les deux mthodes. En effet, UPGMA dmarre du principe de regrouper ds le dpart les deux premiers individus (bactries) dont la distance est la plus petite, cependant la mthode NJ regroupe les deux individus ayant la plus faible divergence par rapport au total des individus.

Les 42 squences de lADNr 16S, releves sur GenBank qui reprsentent les mmes espces isoles ont comparative. permis de dresser des arbres phylogntiques, pour une tude

Les arbres UPGMA et NJ regroupent Staphylococcus avec Listeria cf. monocytogenes. (Figure 13 et 14). Cependant, Listeria reste proche de Brevibacterium dans le cas dUPGMA mais sont loigns dans larbre NJ. Il ressort que les interactions des Listeria spp. avec le reste de la flore bactrienne de lait cru est difficilement mesurable cause du nombre de caractres (n=42) qui reste notre avis infrieur voire insuffisant pour prononcer des conclusions relatives au comportement social des Listeria spp. par rapport au reste de la flore. Cependant, Listeria spp. sont restes apparentes des Bacillales dans le cas des deux arbres et loignes des Lactobacillales ; ce qui donne une certaine crdibilit systmatique aux deux arbres. De manire globale, les arbres construits partir des bactries Gram ngatif conservent la mme topologie. En effet, les regroupements des bactries Neisseria meningitidis, Aeromonas hydrophila G2, Campylobacter fetus, Chromobacterium violaceum et Pseudomonas aeruginosa sont rests conservs.

49

Rsultats et discussion

Pour le cas des entrobactries, les regroupements ont galement t conservs. Par exemple le clade form par la paire Klebsiella oxytoca et Citrobacter freuindii est rest li dans les deux structures (UPGMA et NJ). En fin, lanalyse phylogntique reprsente par les diffrents phnogrammes prsente une diversit microbiologique et une interrelation entre Listeria et la flore bactrienne isole de la mme niche cologique et dmontre, la grande complexit trancher pour une phylognie dfinitive. La systmatique diffre selon les variations des comportements des souches pour des raisons dadaptation avec les contraintes de lenvironnement et les conditions de vie qui fait matre chaque fois des interrelations phylogntiques diffrentes.

2.5 Concernant la qualit hyginique du lait rcolt


La plupart des germes identifis durant ce travail sont saprophytes et/ou commensaux, en gnral ubiquistes et pathognes occasionnels. Ils sont opportunistes dans des conditions bien particulires (Larpent, 2004). La prsence de Listeria, Campylobacter, Staphylococcus aureus, Salmonella, Neisseria meningitidi, et Bacillus cereus dans les chantillons des laits crus est un risque majeur pour le producteur et le consommateur et oblige un plan dpidmiosurveillance et un veil microbiologique pour protger ces individus (Reyser, 1998). Les Pseudomonas sont des microorganismes cologiquement importants. Mais lespce isole partir de nos chantillons (Pseudomonas aeruginosa) reste associe des infections graves chez lhomme et cause elle aussi un risque microbiologique suite la consommation du lait cru. (Brock, 2000 ; Cousin, 1982). Dans tous les laits rcolts, lincidence des contaminants fcaux (Streptococcus adjacen (SKIKDA) et Enterococcus faecium (TEBESSA)) est faible (2/50 chantillons soit 0,04%) Nous notons galement la prsence d'Escherichia coli et de Klebsiella oxytoca qui sont cites dans les affections mammaires (Ounine, 2001). De plus, leur prsence avec Enterobacter intermidus et Citrobacter freuindii rvle une prsence en coliformes fcaux dans les chantillons analyses. E. coli en particulier peut se fixer sur le matriel et s'y dvelopper, crant ainsi une source constante de pollution si on ne procde pas une strilisation efficace entre les oprations de traite.

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CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Conclusion et perspectives

Conclusion et Perspectives
La prsence de Listeria cf. monocytogenes dans les laits crus a confirm le caractre ubiquiste de cette espce. Nanmoins des mesures dhygines tous les niveaux de la filire agroalimentaire et des recommandations alimentaires auprs des consommateurs, en

particulier auprs des populations risque, contribuent rduire lincidence des listrioses humaine et animale. Au terme de ce travail, il ressort que : La qualit bactriologique des laits crus analyss (FTAM) est acceptable. Les trois mthodes disolement des Listeria spp. ont aboutit. Les topologies des arbres (NJ + UPGMA) ont fait ressortir chaque fois des regroupements monophyltiques et polyphyltiques dpendantes de lenvironnement bactrien immdiat. Lidentification microbiologique a permis de mettre en vidence les germes suivants : Proteus, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, significatifs dinteractions

Citrobacter, Pseudomonas aeruginosa, Chromobacterium violaceum, Neisseria meningitidis, Campylobacter fetus, Aeromonas hydrophila, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis, Micrococcus lylae, Leuconostoc , Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Aerococcus, Bacillus sphaericus, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus pasteurii, Bacillus cereus, Bacillus megatherium, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium bovis, Brevibacterium brevis, Listeria cf. monocytogenes et L. murrayi. Cependant, il reste que lapprciation des caractres morpho-physio-biochimiques pour lidentification bactrienne montre ses limites, en particulier dans le cas des micro-organismes exigeants. En fin, les rsultats de nos travaux devront apporter une contribution pour un veil microbiologique au sein des producteurs et des consommateurs daliments non traits et permettent dentrevoir de nouvelles perspectives :

51

Conclusion et perspectives

i.

Lintgration des outils molculaire et bioinformatique pour une phylognie plus prcise et plus fiable dans la version suivre de ce travail,

ii.

lintgration de nouveaux paramtres dpidmiosurveillance dans les investigations venir,

iii.

un travail sur des chantillons plus importants que les ntres et sur des rgions plus diversifies pour mieux mesurer limpact de Listeria spp.

52

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Abou-Eleinin A.A., Ryser E.T., Donnelly C.W. (2000). Incidence and seasonal variation of Listeria species in bulk tank goats milk. J. Food Protec. 63 : 1208-1213. -Afif A., Faid M. et Najimi M. (2008). Qualit microbiologique du lait cru dans la rgion de Tadha au Maroc. Rev. Biol. Biotech.7: 2-7. -Arques J.L., Rodrguez E., GayaP., Medina M. and Nunez N. (2005). Effect of combinations of high-pressure treatment and bacteriocin-producing lactic acid bacteria on the survival of Listeria monocytogenes in raw milk cheese. Int. Dairy J. 15: 893900. -Augustin J.C. and Carlier V. (1999). Mathematical modeling of the growth rate and lag time for Listeria monocytogenes. Inter. J. Food Microbiol. 56: 29-51. -Aurora R., Parakash A. and Parakash S. (2009). Genotypic characterization of Listeria monocytogenes isolated from milk and ready-to-eat indigenous milk products. Food Control. 20: 835-839. - Avril J.L. (2000). Bactriologie Clinique. 3me dition. Ellipse. pp. 140-150. -Aygun O. and Pehlivanlar S. (2006). Listeria spp. in the raw milk and dairy products in Antakya, Turkey. Food Control. 17: 676-679. -Bellouni R. (1990). Listeria monocytogenes: bactriologie et pidmiologie. Thse doctorat en sciences mdicales. INESM. Universit Houari Boumediene dAlger. 165 p. -Bermudez-Aguire D., Corradini M.G., Mawson R. and Barbosa-Canovas G. (2009). Modeling the inactivation of Listeria innocua in raw whole milk treated under thermosonication. Innov. Food Sci. Emerg. Tech. 10: 172-178. -Best M., Kennedy M.E. and Coates F. (1990). Efficacy of a variety of desinfectants against Listeria spp. Appl. Environ. Microbiol. 57: 377-380. -Beuchat L.R., Berrang M.E. and Brackett R.E. (1990). Presence and public health

implications of Listeria monocytogenes on vegetables. In: Miller A.L., Smith J.L., Somkuti G. A. (Eds.), Food borne Listeriosis. Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division). pp. 175181. -Bibb W.F., Gellin B.G., Weaver R., Schwartz B., Plikaytis B.D., Reeves M.W., Pimer R.W., Broome C.V. (1990). Analysis of clinical and food-borne isolates of Listeria monocytogenes in the United States by multilocus enzyme electrophoresis and application of the method to epidemiologic investigations. Appl. Environ. Microbiol. 56 (7): 2133-2141.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Blaszyk M. et Holley R.A. (1998). Interaction of monolaurin, eugenol and sodium citrate on growth of common meat spoilage and pathogenic organisms. Inter. J. Food Microbiol. 39 : 175-183. -Bourgeois C.M., Mescle J.F. et Zucca J. (1996). Microbiologie alimentaire : aspect microbiologique de la scurit et de la qualit des aliments. Tome: 1. Lavoisier. France. 672 p. -Brand S., Fardel G., Flandrois J.P., Rosso L. and Tomassone R. (1998). Model of the influence of time and mild temperature on Listeria monocytogenes nonlinear survival curves. Inter. J. Food Microbiol. 40: 185-195. -Breidt F. et Fleming H.P. (1998). Modeling of the competitive growth of Listeria monocytogenes and Lactococcus lactis in vegetable broth. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3159-3165. -Camilli A., Portnoy A., Youngman P. (1993). Insertional mutagenesis of Listeria monocytogenes with a novel tn 917 derivative that allows direct cloning of DNA flauking transposon insertions. J. Bacteriol. 172: 3738-3744. -Chaume R.R. (1975). Les mthodes de taxonomie numrique. Boissiera. 24 : 369-381. -Cheftel J.C et Culioli J. (1997). Review: effects of high pressure on meat. Meat Sci. 3: 211-236. -Chen H., Neetoo H., Ye Mu and Joerger R.D. (2009). Differences in pressure tolerance of Listeria monocytogenes strains are not correlated with other stress tolerances and are not based on differences in Cts R. Food Microbiol. 26: 404-408. -Cheroutre-Vialette M., Lebert I., Hebraud M., Labadie J.C. and Lebert, A. (1998). Effects of pH and aw stress on growth of L. monocytogenes. Inter. J. Food Microbiol. 42: 71-77. -Churchill R. L.T., Lee H. and Hall C.J. (2006). Detection of Listeria monocytogenes and the toxin listeriolysin O in food. J. Microbiol. Meth. 64: 141-170. -Cossart P., Vicente M.F., Mengaud J., Baquero F., Perez Diaz J.C., Berche P. (1989). Listeriolysin O is essentiel for virulence Listeria monocytogenes: direct evidence obtained by gene complementation. Infect. Immun. 57: 3629-3636. -Czuprynski C.J. and Balish E. (1984). Pathogenesis of Listeria monocytogenes for gnotobiotic rats. Infect. Immun. 32: 323.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Delarras C. (2007). Microbiologie pratique pour le laboratoire danalyses ou de contrle sanitaire. Edition: Tec et Doc. Paris.476 p. - Dragomirescu L., Serban M. et Banarescu P. (1984). Quelques problmes concernant lapplication de la taxonomie numrique en zoologie systmatique. Extrait de travaux du Musum dHistoire naturelle Grigore Antipa . XXV: Bucharest. -Dramsi S. et Cossart P. (1995). Entry of Listeria monocytogenes into hepatocytes requires the expression of InlB, a surface protein of the internalin multigene family. Mol. Microbiol. 16: 251. -Donker-voet J. (1972). Listeria monocytogenes: some biochemical and serological aspects. Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 19: 287-291. -El-baradei G., Delacroix-Buchet A. and Ogier J.C. (2008). Bacterial biodiversity of traditional Zabady fermented milk. Int. J. Food Microbiol. 121: 295-301. -El-Gazzar F.E. and Marth E.H. (1991). Listeria monocytogenes and listeriosis related to milk, milk products and dairy ingredients: A review II: Listeria monocytogenes and dairy technology. Milchwissens chaft. 46: 82-86. -Escriu R. and Mor-Mur M. (2009). Role of quantity and quality of fat in meat models inoculated with Listeria innocua or Salmonella typhimurium treated by high pressure and refrigerated stored. Food Microbio. XXX: 1-7. -Euzby J.P. (2000). List of bacterial names with standing in nomenclature genus Listeria. [En ligne]. Cr le 25 octobre 2002. Dernire mise jour le 05 juillet 2008. http: //www. bacterio.ciet.fr//Listeria.html. (Consult le 31/10/2010). -Farber J.M. and Peterkin P.I. (1991). Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbial Rev. 55: 476-511. -Farber J.M. (1992). Prevention and control of foodborne listeriosis. Dairy Food Environ. Sanit. 12 : 334-340. -Federighi M. (2005). Bactriologie alimentaire. Compendium dhygine des aliments. 2me dition. Economico. 250 p. -Gaillard J.L., Berche P., Frehel C., Grouin F., Cossart P. (1991). Entry of Listeria monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from Gram positive cocci. Cell. 65: 1127-1141.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Garcia J.A., Dominguez L., Briones V., Blanco M., Fernandez-Garayzabal J.F, Suarez G. (1990). Revision of the antigenic structure of genus Listeria. FEMS Microbiol. Lett. 67:113-120 -Germini A., Masola A., Carnevali P. and Marchelli R. (2009). Simultaneous detection of Escherichia coli O175:H7, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes by multiplex PCR. Food control. 20: 733-738. -Gianfranceschi M.V, Dottavio M.C, Gattuso A, Bella A and Aureli P. (2009). Distribution of serotypes and pulsotypes of Listeria monocytogenes from human, food and environmental isolates (Italy 2002 -2005). Food Microbiol. 26: 520- 526. -Gilmour A. and Kells J. (2004). Incidence of Listeria monocytogenes in two milk processing environments, and assessment of Listeria monocytogenes blood agar for isolation. Int. J. Food Microbiol. 91: 167-174. -Grimont F. and Grimont P.A.D. (1986). Ribosomal ribonucleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools. Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 137 B: 165-175. -Guiraud J.P. (1998). Microbiologie alimentaire. Dunod. Paris. 652p. -Guiraud J.P. et Rosec J.P. (2004). Pratique des normes en microbiologie alimentaire. AFNOR. Paris. 300p. -Hamdi T.M., Naim M., Martin P. and Jacquet C. (2007). Identification and molecular characterization of Listeria monocytogenes isolated in raw milk in the region of Algiers (Algeria). Int. J. Food Microbiol. 116: 190-193. -Hao Y.Y., Brackett R.E. and Doyle M.P. (1998). Inhibition of Listeria monocytogenes and Aeromonas hydrophila by plant extracts in refrigerated couled beef. J. General. Microbiol. 134: 2917-2924. -Harakeh S., Saleh I., Zouhairi O., Baydoun E., Barbour E. and Alwan N.(2009). Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes isolated from dairy-based food products. Sci. Total Environ. 407: 4022-4027. -Harvell E.A. (1986). Listeria monocytogenes-induced interferon-gamma primes the host for production of tumor necrosis factor and interferon-alpha/beta. J. Infect. Dis. 167: 1364. - Harvey J., Gilmour A. (1992). Occurrence of Listeria species in raw milk and dairy products produced in Northern Ireland. J. App. Bacteriol. 72: 119-125.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Herrero M., Mayo B., Gonzalez B and Suarez J. E. (1996). Evaluation of technologically important traits in lactic acid bacteria isolated from spontaneous fermentation. Bacteriol. 81: 565-570. -Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A. et al. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th Edition. Williams and Wilkins. USA. 787 p. -Huang Y., LuoY., Zhai Z., Zhang H., Yang C. and TiamH. (2009).Characterization and application of an anti-Listeria bacteriocin produced by Pediococcus pentasaceus 05-10 isolated from Sichuan pickle, a traditionally fermented vegetable produced from China. Food control. 20:1030-1035. -International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). (1996). Campylobacter In Microorganisms in Food 5. Microbiological Specifications of Food Pathogens. Blackie Academic and Professional, London. pp. 45-65. -Isabella M.M.S., Almeida R.C.C., Alves M.A.O and Almeida P.F. (2003). Occurrence of Listeria spp. in critical control points and the environment of Minas Frescal cheese processing. Int. J. Food Microbiol. 81: 241 248. -Jalali M. and Abedi D. (2008). Prevalence of Listeria species in food products in Isfahan, Iran. Int. J. Food Microbiol. 122: 336-340. -Jawetz, Metnick and Adelbergs. (1995). Medical Microbiology. 20th Edition. Appleton. USA. 656 p. -Jayaro B.M. and Henning D.R. (2005). Prevalence of food-borne pathogens in bulk tank milk. J. Dairy Sci. 84: 2157-2162. - Joffin J. N. et Leyral G. (1998). Microbiologie Technique: Documentation Technique. Tome: 2. 2me dition. Paris. 299 p. - Journal Officiel de la Rpublique Algrienne N 35. 01 Safar 1419, 27 mai 1998. Critres microbiologiques des laits et des produits laitiers. [En ligne]. www. joradp.dz. (Consult le 20/10/2010). -Journal Officiel de la Rpublique Algrienne N 70. 24 Ramadhan 1425, 7 novembre 2004. Mthode de contrle microbiologique pour le lait pasteuris. [En ligne]. www. joradp.dz. (Consult le 13/09/2010). J. Appl.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Jouve J. L. et Lahellec C. (1991). Incidence des Listeria dans les denres alimentaires. In compte-rendus de la confrence internationale. Listeria et scurit alimentaire . 13-14 Juin 1991. Laval. France. ASEPT. pp. 89-104. -Junttila J.R., Niemela S.I. and Him J. (1988). Minimum growth temperatures of Listeria monocytogenes and non-haemolytic Listeria. J. Appl. Bacteriol. 65: 321-327. -Kalmokoff M. L. et al. (2001). Identification of a new plasmid-encoded sec-dependent bacteriocin produced by Listeria innocua 743. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4041. -Karakolev R. (2009). Incidence of Listeria monocytogenes in beef, porc, raw-dried and rawsmoked sausages in Bulgaria. Food Control. 20: 953955. -Kim L.E., Choi N.H., Bajpai V.K. and Kang S.C. (2008). Synergistic effect of nisin and garlic shoot juice against Listeria monocytogenes in milk. Food Chem. 110: 375-382. - Kocks C., Gouin E., Tabouret M., Berche P., Ohayon H. and Cossart P. (1992). Listeria monocytogenes induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68: 521 531. -Kozak J., Balmer T., Byrne R. and Fisher K. (2009). Prevalence of Listeria monocytogenes in foods: incidence in dairy products. Food Control. 7: 215-221. -Kukharkova L.L, Boyarshinov P.K., Adutskevich V.A. and Perova P.B. (1960). Data on the hygienic judgement of meat in case of listeriosis. Veterinariya. 37: 74-79. -Lammerding, A.M. and Doyle, M.P. (1989). Evaluation of enrichment procedures for recovering Listeria monocytogenes from dairy products. Inter. J. Food Microbiol. 9: 249268. -Larpent J.P. (1997).Microbiologie alimentaire : Techniques de Laboratoire. Tech et Doc. Lavoisier. Paris. 1037 p. -Larpent J.P. (2004). Listeria. 3me dition. Tech et Doc. Paris. 165p. -Lebres E. (2002). Manuel des travaux pratiques : Microbiologie des laits et des produits laitiers. Cours national dhygine et de microbiologie des aliments. Institut Pasteur dAlgrie.19 p. -Lebres E. (2005). Manuel des travaux pratiques analyses des aliments. Sminaire de recyclage: laboratoires dhygine des wilayas de lEST. Institut Pasteur dAlgrie.5 p.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Lecointre G. et Le Guyarder H. (2006). Classification phylogntique du vivant. 3me Edition Belin. France. 559 p. - Le minor L. et Vron M. (1990). Bactriologie mdicale. 2me dition. Flammarion. Paris. 1107 p. -Leriche V., Chassaing D. and Carpentier B. (2000). Behaviour of Listeria monocytogenes in an artificially made biofilm of a nisin-producing strain of Lactococcus lactis. Inter. J. Food Microbiol. 51: 169-182. -Linton M., Mackle A.B., Upadhyay V.K., Kelly A.L. and Patterson M.F. (2008).The fate of Listeria monocytogenes during the manufacture of Camembert-type cheese: A comparison between raw milk and milk treated with high hydrostatic pressure. Innov. Food Sci. Emerg. Tech. 9: 423-428. -Little C.L and De Louvois J. (1999). Health risks associated with unpasteurized goats and ewes milk on retail sale in England and Wales. Epidemiol. Infect. 122: 403-408. -Little C.L., Rhoades J.R., Sagoo S.K., Harris J., Greenwood M., Mithani V., Grant K. and McLauchin J. (2008). Microbiological quality of retail cheeses made from raw, thermized or pasteurized milk in the UK. Food Microbiol. 25: 304-312. -Lou Y. and Yousef A.E. (1997). Adaptation to sublethal environmental stresses protects Listeria monocytogenes against lethal preservation factors. App. Environ. Microbiol. 63: 1252-1255. -Lourenco A., Neves E. and Bristo L. (2009). Susceptibility of Listeria monocytogenes from traditional cheese-dairies to in-use sanitizers. Food control. 20: 585-589. -Luchetta P, Maurel Mc, Higuet D. et al. (2005). Evolution molculaire. Dunod. Paris. 334p. -Madigan M., et Martinko J. (2007). Brock : Biologie des microorganismes. 11me dition. Pearson Education. 1047 p. -Marth E.H. (1986). Listeria in dairy foods. Cheese Rep. 111: 1. -Mengaud J. (1996). E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of Listeria monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84: 923. -Meyer-Broseta S., Diot A., Bastian S., Riviere J. and Cerf O. (2003). Estimation of low bacterial concentration: Listeria monocytogenes in raw milk. Int. J. Food Microbiol. 80: 1-15. -Millet L., Saubusse M., Didienne R., Tessier L. and Montel M.C. (2006). Control of Listeria monocytogenes in raw-milk cheeses. Int. J. Food Microbiol. 108: 105-114.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Mossel D.A. and Van Netten A.P. (2009). Harmful effects of selective media on stressed micro-organisms: nature and remedies In Escriu R., Mor-Mur M. Role of quantity and quality of fat in meat models inoculated with Listeria innocua or Salmonella typhimurium treated by high pressure and refrigerated stored. Food Microbiol. XXX: 1-7. -Murchie L.W, Cruz-Romeo M., Ferry J.K., Linton M., Patterson M.F., Smiddy M., Kelly A.L. (2005). High pressure processing of shellfish: a review of microbiological and other quality aspects. Innov. Food Sci. Emerg. Tech. 6: 257-270. - Murray E. D. G., Webb R. A. and Swann M. B. R. (1926). A Disease of Rabbits characterized by a large mononuclear leucocytosis, caused by a hitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes. J. Path. Bacteriol. 28. p.407. -Nero A.L., DE Mattos M.R., Barros M.A.F., Beloti V. and Melo Franco B.D.G. (2009). Interference of raw milk autochthonous microbiota on the performance of conventional methodologies for Listeria monocytogenes and Salmonella spp. Detection.

Microbiol Res. 164: 529-535. -Neves E., Laurenco A., Carla Silva A., Coutinho R. and Brito L. (2008). Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis of Listeria monocytogenes isolates from different sources and geographical origins and representative of the twelve serovars. Syst. App. Microbiol. 31: 387-392. -Noemia Gameiro , Suzana Ferreira-Dias , Mass Ferreira and Luisa Brito. (2007). Evolution of Listeria monocytogenes populations during the ripening of naturally contaminated raw ewes milk cheese. Food Control. 18: 12581262. -Nolan D.A., Chamblin D.C. and Troller J.A. (1992). Minimal water activity levels for growth and survival of Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Inter. J. Food Microbiol. 16: 323-335. -Nufer U., Stephan R. and Tasara T. (2007). Growth characteristics of Listeria monocytogenes, Listeria welshimeri and Listeria innocua strains in broth cultures and a sliced bologna-type product at 4 and 7C. Food Microbiol. 24: 444-451. -Orth R. and Mrozek H. (1989). Is the control of Listeria Campylobacter, and Yersinia a disinfection problem ? Fleischwirtschaft. 69: 1575-1576. -Osterholm M.T. and Potter M.E. (1997). Irradiation pasteurization of solid foods: taking food safety to the next level. Emerg. Inf. Dis. 3: 575-577.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Paillard D., Dubois V., Duran R., Nathier F., Guittet C., Caumette P., et al. (2003). Rapid identification of Listeria species by using restriction fragment length polymorphism of PCRamplified 23 rRNA gene fragment. Appl. Environ. Microbiol. 69: 6386-6392. -Parks L.C. (1997). Hand Book of Microbiological Media.2nd Edition. ATLAS. Londre. 1706 p. -Pearson L.J. and Marth E.H. (1990). Listeria monocytogenes: Threat to a safe food supply: a review. J. Dairy Sci. 73: 912-928. -Pedro L., Rui R., MASS F., Grac R., Christine J., Paul M. and Luisa B. (2006). Comparative characterization of Listeria monocytogenes isolated from Portuguese farmhouse ewes cheese and from humans. Int. J. Food Microbiol. 106: 111 121. -Piffaretti J.C., Kressebuch H., Aeschbacher M., Bille J., Bannerman E., Musser J.M., et al. (1989). Genetic characterization of clones of the bacterium Listeria monocytogenes causing epidemic disease. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 86: 3818-3822. -Pirie J. H. H. (1927). A New Disease of veld rodents, Tiger River Disease. Publ. S. Afr. Inst. Med. Res. 3. p.163. - Pirie J. H. H. (1940). Listeria. Change of name for a genus of bacteria. Nature. 145. p.264. -Poyart-Salmeron C., Carlier C., Trieu-Cuot P., Courtiey A.L., Courvalin P. (1993).

Transferable plasmid-mediated antibiotic resistance in Listeria monocytogenes. Lancet. 335: 1422-1428. -Premaratne R.J., Lin W.J. and Johnson E.A. (1991). Development of an improved

chemically defined minimal medium for Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3046-3048. -Richeter R.L., Ledford R.A., Murphy S.C. (1992). Milk and milk products In: Vanderzant C., Splittstoesseur D.F. Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 3rd Edition. American Public Health Association. USA. p. 837-838. - Rocourt J., Audurier A., Courtieu A.L., Durst J., Ortel S., Schrettenbrunner A. and al. (1985). A multi-centre study on the phage typing of Listeria monocytogenes. Zentralbl. Bacteriol. Microbiol. Hyg. 259: 489-497 -Rodrigues J.L., Gaya, P., Medina, M., and Nunez, M. (1994). Incidence of Listeria monocytogenes and other Listeria spp in ewes raw milk. J. Food Prot. 57: 571-575.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Ross T., Rasmussen S., Fazil A., Paoli G.and Sumner J. (2009).Quantitative risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat meats in Australia. Int. J. Food Microbiol. 128-137. -Ryser E.T. (1998). Public health concerns In Appl. Dairy Microbiol. Marcel Dekker, Inc, USA. p. 263-403. - Sawaya, W.N., Safi, W.J. and Shalhat A.F. (1984). Chemical composition and nutritive value of goats milk. J. Dairy. Sci. 67: 1655-1659. -Scifo G.O., Randazzo C.L., Restuccia C.,Fava G. and Caggia C.(2009). Listeria innocua growth in fresh cut mixed leafy salads packaged in modified atmosphere. Food Control. 20: 611-617. -Schaak M.M. and Marth E.H. (1988). Behavior of Listeria monocytogenes in skim milk and yogurt mix during fermentation by thermophilic lactic acid bacteria. J. Food Pr. 51: 607-614. - Sword C.P. (1966). Mechanisms of pathogenesis in Listeria monocytogenes. Influence of iron. J. Bacteriol. 92: 536-542. -Thevenot D., Delignette-Muller M.L., Christieans S., Leroy S., Kodjo A. et Vernozy-Rozand C. (2006). Caractrisation srologique et molculaire disolats de Listeria monocytogenes collects dans 13 charcuteries salaisons et leurs produits. Science et Technique. Viandes Prod. Carns. 26 : 27-31. -Thomas S.B and Griffiths J.M. (1960). Psychrophilic bacteria in pasteurised milk. Dairy Eng. 77 (12): 438-444. -Tilney L.G., Portnoy D.A. (1990). Actin filaments and the growth, movement and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. J. Cell. Biol. 109: 1597-1608. -Vanegas M.C, Vasquez E, Martinez A.J and Rueda A.M. (2009). Detection of Listeria monocytogenes in raw whole milk for human consumption in Colombia by real-time PCR. Food Control. 20 : 430432. - Vasseur, C. (2001). Combined effects of NaCl, NaOH, and biocides (monolairin or lauric acid) on inactivation of Listeria monocytogenes and Pseudomonas spp. J. Food Prot. 64: 1442. - Wagner M. and McLauchlin J. (2008). Handbook of Listeria monocytogenes : Biology. CRC Press. Boca Raton. Floride. USA. ISBN :13-978-1-4200-5140-7. p.3-25. 131:

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

-Welshimer H.J. (1968). Isolation of Listeria monocytogenes from vegetation. J. of Microbiol. 95:300-301. -Yee Chye F., Abdullah A. and Mohd Khan A. (2004). Bacteriological quality and safety of raw milk in Malaysia. Food Microbiology. 21: 535-541. -Ynte P.V., Luc M.H., Atmadja R.D. (2005). Deletion of sig B in Bacillus cereus affects spore properties. FEMS Microbiol. Letters. 252 : 169-173.

ANNEXES

ANNEXES

Annexe 1 Lecture et interprtation des caractres ports sur la galerie biochimique. Tests Catalase Oxydase ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP NR RM ESC GEL Mannitol GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA RIB XYL LAC
Composants actifs

Ractions/enzymes Dis mutation Cytochrome-oxydase -galactosidase Arginine di hydrolase Lysine dcarboxylase ornithine dcarboxylase Utilisation de citrate Production dH2S Urease Tryptophane dsaminase Production dindole Production dacetoine Rduction des nitrates R alcalinisation Esculinase Gelatinase Fermentation /oxydation Fermentation /oxydation Fermentation /oxydation Fermentation /oxydation Fermentation /oxydation Fermentation /oxydation Fermentation /oxydation

Peroxyde dhydrogne =H2O2 N-N dimthyl paraphnylne diamine 2-nitrophnyl-Dgalactopyranoside L-arginine L-lysine L-ornithine Tri sodium citrate Sodium thiosulfate Ure L-tryptophane L-tryptophane Sodium pyruvate Nitrate rductase Rouge de mthyle Esculine Glatine D-mannitol D-glucose D-mannitol Inositol D-sorbitol L-rhamnose D-saccharose D-melibiose Amygdaline L-arabinose Ribose D-xylose Lactose

Rsultats Ngatif (0) Positif (1) Absence de Prsence de bulle dair bulle dair Incolore Violet Incolore Jaune Jaune Jaune Vert pale Incolore Jaune Jaune Incolore Incolore Incolore Jaune incolore Non diffusion Rouge Bleu /bleu-vert Bleu /bleu-vert Bleu /bleu-vert Bleu /bleu-vert Bleu /bleu-vert Bleu /bleu-vert Jaune Violet /rougeorang Violet /rougeorang Violet /rougeorang Bleu-vert/bleu Dpt noir Rouge/orang Marron rougetre Rose/rouge Rose/rouge Rose/rouge rouge Noirtre Diffusion du pigment noir jaune jaune jaune jaune jaune jaune jaune jaune jaune jaune jaune jaune jaune

Fermentation /oxydation Bleu /bleu-vert Fermentation /oxydation Bleu /bleu-vert Fermentation /oxydation Bleu/bleu-vert Fermentation /oxydation Bleu /bleu-vert Fermentation /oxydation Bleu /bleu-vert Fermentation /oxydation Bleu /bleu-vert

ANNEXES

Annexe 2 Code des caractres pour les Matrices Binaires.

caractre
Forme Gram Surface Contour Elvation Consistance Opacit Taille Pigmentation Catalase Oxydase ONPG Urease Indole Mannitol Mobilit ADH LDC ODC Citrate de simmens H2 S TDA VP RM NAR Esculinase Gelatinase Sucres Tests physiques Spores CO2

1
Bacille + Lisse Rgulier Bombe Crmeuse Opaque Petite (< 2mm) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + pousse Prsence +

0
Coque Rugueux Dentel Plate Sche Transparente Grosse (>2mm) Pas de pousse absence -

ANNEXES

Annexe 3 Formule des milieux de culture


Glose PALCAM -Composition pour 1 litre- : 23,0 g 15,0 g 20,0 g 10,0 g 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,8 g 0,5 g 0,5 g 0,08 g 10,0 mL

Peptone LiCl Agar-agar Mannitol NaCl Extraits de levure Amidon Esculine Citrate de fer ammoniacal Glucose Rouge de phnol Supplment PALCAM pH : 7,2 0,2 25 C Supplment PALCAM : Cefotaxime Chibroxine Colistine Eau distille Glose TSAYE (modifie)

20,0 mg 5000 ui/l 20,0 mg 10,0 ml

Bouillon tryptone soja Extrait de levure Agar-agar Eau Digestat enzymatique de caseine Chlorure de sodium Hydrognophosphate dipotassique

30g 6.0g 9 18 g 1000ml 17g 5.0g 2.5g

ANNEXES

Glucose PH=7.3 Glose au Sang de Cheval

2.5g

Extrait de levure Agar-agar Eau Digestat enzymatique de tissus animaux Digestat enzymatique de foie Chlorure de sodium PH=7.3

5.0g 9 18 g 1000ml 15g 2.5g 5.0g

ANNEXES

Annexe 4 Les squences partielles de lARNr 16S des bactries Gram positif et des bactries Gram ngatif releves sur Genbank
TAXON ID /pb SEQUENCE
gaacgaacggaggaagagcttgctcttccaaagttagtggcggacgggtgagtaacacgtgggcaa cctgcctgtaagttggggataactccgggaaaccggggctaataccgaatgataaagtgtggcgca tgccacgcttttgaaagatggtttcggctatcgcttacagatgggcccgcggtgcattagctagtt ggtagggtaatggcctaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgg gactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagt ctgacggagcaacgccgcgtgtatgaagaaggttttcggatcgtaaagtactgttgttagagaaga

Listeria monocytogenes

AJ5 357 01

acaaggataagagtaactgcttgtcccttgacggtatctaaccagaaagccacggctaactacgtg ccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgcgcgca ggcggtcttttaagtctgatgtgaaagcccccggcttaaccggggagggtcattggaaactggaag actggagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagatatgtggagga acaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaa acaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgc cccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactc aaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaa ccttaccaggtcttgacatcctttgaccactctggagacagagctttcccttcggggacaaagtga caggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgca acccttgattttagttgccagcatttagttgggcactctaaagtgactgccggtgcaagccggagg aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggat agtacaaagggtcgcgaagccgcgaggtggagctaatcccataaaactattctcagttcggattgt aggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgtggatcagcatgccacggtgaat acgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtag ggtaacctttatggagcc

Leuconostoc mesenteroides

GQ 856 136. 1

Aerococcus viridans

DQ3 7123 9.1

Caacgtgcttgccctttcagctgagtggcgaacgggtgagtaacacgtggacaacctgc ctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaacttagtgtcg catgacacaaagttaaaaggcgcttcggcgtcacctagagatggatccgcggtgcatta gttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgagagactg atcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtagggaa tcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctttcg ggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaacagctagaataggaaatgattttagtttga cggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatg tcccgagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagactgtttattaagtct gatgtgaaagcccggagctcaactccagaatggcattggaaactgggttaacttgagtg caggagaggtaagtgggaactcccagtgtagcggtggaatgcgtagatgtattaagaac accagtggcgaaagcgggcttactggactgcactgacgttgaggctcgaaagtgtgggg tagcggacatgattagataccctggtagtgcacacgtagacgatgatcactaagtgcta ggagcttcgactctagtgcggaggcgtacgcataatgtcgtctgggcgagtacgtacga catgattgcaagctgcataagggac ctggcggctgcctaatactcgcagtccagcgaacagatgaagtgcttccacttctgacg ttagcggcgaacgggtgagtaacacgtaaggaatctacttttcccgcgggggaaagaaa acagaaacgggtgctaataccgcataatatcttcttccgcatggaagaagattgaaaga cggctctgctgtcacttatagatgaccttgcggtgcattagttagttggtggggtaacg gcctaccaagacgatgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacattgtgactg agacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcctttaatgggcgaa

ANNEXES

Brevibacillus brevis

GQ 3757 94.1

Staphylococcus capitis

HM 4395 09.1

Staphylococcus epidermis

DQ8 7074 0.1

agcctgacggagcaatgccgcgtgagtgaagaaggccttcgggtcgtaaaactctgttg ttagagaagaacaaattgtagagtaactgctacagtcttgaccgtatcttatcagaaag ccacggctaactacgtgccagcagccgcgggtaatacgtaggtgggcagccctggccgg atttantgggcggtaaagggagcccaagtggctttcttaagnnctgatgnngaaagccc cacggcctnnaccntgggagggccattggaaactggcnaaacntgantnncngaacana aatgnggnanntggaancgngggantgcgtnnncttcncnnaagaacaccagctngnna aggctaatccggnctgctccaacaggattagataccctggtagtccacccccgtaaaag atgagtgctaggtgtggggggttttccgccattcngggcggcagttaangcnttaaaac actccgcctggggggtacgcccccaaggttgaaattcaaaggaattgtcggggcccgcc caacgggtgggagcatgtgttttaatttgaagcaacgcgaagaaccttcccaagtcttg acatcctttgaccaccctagagatagggctttcccttcggggacaaagtgacaggtggt gcatggttgttgtcacctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccncaacgagcgcna cccctattattagttgccagcattcagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaa ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcancatgccccttatgacttgggctacacac ctggtacaatggatggtacaacgagtngcaaacccncgagggnnagcaaatctnttaaa accnttntcagttcggantgcaggntgcaactnncctgcangaanccggaatcgctagt aatcgtggatcagcatgccccggggaatacgttcccgggtcttgtacacaccccccgtc acaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgc cgaaggtggacagagatggggag taatacatgcaagtcgagcgagggtcttcggaccgctagcggcggacgggtgagtaaca cgtaggcaacctgcctctcagaccgggataacatagggaaacttatgctaataccggat aggtttttggatcgcatgatccgaaaagaaaagatggcttcggctatcactgggagatg ggcctgcggcgcattagctagttggtggggtaacggcctaccaaggcgacgatgcgtag ccgacctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacggg aggcagcagtagggaattttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtga acgatgaaggtcttcggattgtaaagttctgttgttagggacgaataagtaccgttcga atagggcggtaccttgacggtacctgacgagaaagccacggctaactacgtgccagcag ccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgcgcgca ggcggctatgtaagtctggtgttaaagcccggggctcaaccccggttcgcatcggaaac tgtgtagcttgagtgcagaagaggaaagcggtattccacgtgtagcggtgaaatgcgta gagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttctggtctgtaactgacgctgagg cgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgat gagtgctaggtgttgggggtttcaataccctcagtgccgcagctaacgcaataagcact ccgcctggggagtacgctcgcaagagtgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcaca agcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgaca tcccgctgaccgctctggagacagagcttcccttcggggcagcggtgacaggtggtgca tggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccc ttatctttagttgccagcattcagttgggcactctagagagactgccgtcgacaagacg gaggaaggcggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtg ctacaatggttggtacaacgggatgctacctcgcgagaggacgccaatctcttaaaacc aatctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaat cgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca ccacgggagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaaccgcaaggagccagccgccgaa ggt Taatacatgccagtcgagcgaacagacgaggagcttgctcctctgacgttagcggcgga cgggtgagtaacacgtggataacctacctataagactgggataacttcgggaaaccgga gctaataccggataacatgttgaaccgcatggttcaacagtgaaagacggtcttgctgt cacttatagatggatccgcgccgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggc aacgacgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactggaactgagacacggtcca gactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagc aacgccgcgtgagtaaagaaggtcttcggatcgtaaaactctgttattagggaagaaca aatgtgtaagtaactatgcacgtcttgatggtacctaatcagaaagccacggctaacta cgt cgaggagcttggtcctctggcgtgagcgggggacgggtgagtaacacgtggataaccta cctatgngagggggatnacctcgggaaaccggagctaaaacccgataacaagttgaagc agagggtgcggctctgaaagacctccttgntgtcacttatagatggatccgctccgtag tgggtggttggtaaggtaacggcttacccnggcaatgatgcgtatccgacctgaaaggg tgatcggccgaccgggaactgagacacagtccagactcctacgggaggcagcaataggg aatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggtctt cggatcgtaaaactctgttattagggaagaacaaatgtgtaagtaactatgcgcgtctt gacggtacctaatcacaaagccacggctaactacctgccagcagccgcggtaatacgta

ANNEXES

Lactobacillus rhamnosus

HM 5853 68.1

Lactobacillus fermentum

HM 4624 28.1

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ANNEXES

Corynebacterium bovis

AF5 3759 0.1

Corynebacterium jeikeium

AB4 7061 5.1

Bacillus cereus 1

HM 5692 25.1

Bacillus cereus 2

HM 2298

aaagtttttcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcc taccaaggcggcgacgggtagccggcctgagagggtgtacggccacattgggactgaga cacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcc tgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggttgtaaacccctttcggcag ggacgaagcttttgtgacggtacctgcataagaagcaccggctaactacgtgccagcag ccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgta ggtggtttgtcgcgtcgtctgtgaaatcccggggcttaactccgggcgtgcaggcgata cgggcataacttgagtgctgtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcg cagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcaggtctctgggcagtaactgacgctga ggagcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacg gtgggcgctaggtgtggggatcttccacgatttccgtgccgtagctaacgcattaagcg ccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgca caagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttga catgggcaggaccggcgtggagacacgtcttcccttttgggcttgttcacaggtggtgc atggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacc cttgtcttgtgttgccagcacgtaatggtggggactcgcgagagactgccggggttaac tcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtccagggcttcacac atgctacaatggtcggtacagtgggttgcgatgccgcgaggctcagctaatcccttaaa gccggtctcagttcggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggagtcgctagt aatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt cacgtcatgaaagttggtaacacccgaagccggtggcccaaactcgttagggagccgtc gaaggtgggatcggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaagg Tgcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgtaggtggtttgtcgcgtcgt ctgtgaaatcccggggcttaacttcgggcgtgcaggcgatacgggcataactagagtgc tgtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaaca ccgatggcgaaggcaggtctctgggcagttactgacgctgaggagcgaaagcatgggta gcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacggtgggcgctaggtgtggg ggttttatttacgattcccgtgccgtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagta cggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatg tggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatacaccggatcgct gcagagatgtagtttcccttgtggctggtgtacaggtggtgcatggttgtcgtcagctc gtgtcgtgagatgt agagtttgatcatggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgag cgaatggattgagagcttgctctcaagaagttagcggcggacgggtgagtaacacgcgg gtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacat tttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatggaccc gcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgac ctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggca gcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgat gaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataag ctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcg gtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtgg tttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggg agacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagaga tatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcg aaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagt gctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgc ctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcg gtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcct ctgaaaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggt tgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttga tcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggagg aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccctcatgacctgggctacacacgtgctac aatggacggtacaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttc tcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcg gatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccac gagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaacctttttggagccagccgcctaaggt gggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtaacc Agtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaact acgtgccagcagacgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgt aaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggag

ANNEXES

03.1

Bacillus pasteurii

X60 631. 1

Micrococcus lylae

FN8 1346 1.1

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Enterococcus faecium

HM 4462 62.1

Bacillus circulans

FR6 7141 9.1

ANNEXES

L.murrayi

X56 154. 1

cacgtgggcaacctncctgtaagattgggataactccgggaaaccggagctaataccga ataataatcactccgcatggagcaggtttgaaaggcggcttcggctgtcacttacagat gggcccgcggtgcattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatgcata gccgacctgagagggtnatcggccacactgggactgagacacggcccaggctcctacgg gaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtg tgtgaagaaggttttcggatcgtaaagcactgttgttagagaagaacaaggataagagt aactgcttgtcccttgacggtatctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcag ccccggtaatacgtaggtggcnagcgttgtccggaattattgggcgtnaagcgcgcgca ggcggtttcttaagtctnatgtgaaagcccccggctgaaccgggnngggtcattggaaa ctgggagacttagagtgcagaagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcg tagatatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctga ggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacg atgagtgctnagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagca ctccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggccgcac aagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgac atcctttgaccactctggagacagagctttccttcggggacaaagtgacaggtggnnca tggttgtcgtcagctagtgtcgtgagatgttgggtnaagtcccgcaacgagcgcaaccc ttgattttagttgccagcatttagttgggcactctnaagtgactgccggtgcaagccgg aggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgc tacaatggatgatacaaagggtcgcgaagccgcgaggtgnagctaatcccataaaatta ttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctngtaatc gcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggcctngtacacaccgcncgtcacac cacgagagttngtaacacccgaagtcggtagggtaacctttatggagccagctgccgaa ggtgggacagatnatgggg tggctccaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggtt ggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcct

Lactococcus lactis subsp. lactis

HM ttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataacaactttaaacaca 5816 agttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagc 56.1


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Lactococcus lactis subsp. Cremoris

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ANNEXES

ggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgg atggtacaacgagtcgcgagacagtgatgtttagctaatctcttaaaaccattctcagt tcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatca gcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgggag ttgggagtacccgaagtaggttgcctaaccgcaaggagggcgcttcctaaggtaagacc gatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacct cctt ggcggcgtgcctaatacatgcaagtagaacgctgaaggaagtgcttgcacttctggacg agttgcgaacgggtgagtaacgcgtaggtaacctgcctggtagcgggggataactattg gaaacgatagctaataccgcataacaatggatattgcatgatatctatttgaaagatgc aactgcatcactaccagatggacctgcgttgtattagctagtaggtgaggtaaaggctc acctaggcgacgatacatagccgacctgagagggtgaacggccacactgggactgagac acggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatgggggcaaccct gaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtaaga gaagaacgggtatgagagtggaaagttcatactgtgacggtatcttaccagaaagggac ggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttatccggattta ttgggcgtaaagcgagcgcaggcggttagataagtctgaagttaaaggctgtggcttaa ccatagtatgctttggaaactgtttgacttgagtacagaaggggagagtggaattccat gtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctg gtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctgg tagttcacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttaggccctatccggggcttagtgccg cagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaagg aattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaatttgaagcaacgcgaag aaccttaccaggtcttgacatcccagtgaccgtcctagagatagggttttccttcggaa cactggtgacaggtggtgcatggttgttgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaag tcccgcaacgagcgcaacccttattgttagttgccatcattaagttgggcactctagcg agactgccggtaataaaccggaggaaggtggggaagacgtcaaatcatcatgcccctta tgacctgggctacacacgtgctacaatggctggtacaacgagcggcaagtcggtgacgg caagcaaatcttttaaaaccagtctcagttcggattgtaggctgcaacttgcctacaag aagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcccgccgcggtgaatacgttcccgggcct tgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtacct tttaggagccagccgcctaag actcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagca acgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaa gtaccgttcgaacagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaacta cgtgccagcagccgcggtaataca

Streptococcus adjacen

HM 7760 56.1

Bacillus megatherium

HM 7490 36.1

atagtgtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcg agcgcgggaagcaggcagatcccttcggggtgaaacctgtggaacgagcggcggacggg tgagtaacacgtgggcaacctgcctgaaagtccgggataaccccgggaaaccggagcta

Bacillus sphaericus FR6

ataccggatgggcccatcgaccgcctggtcgatggggaaaagcggggatcttcctcgcg

7141 ctttcagatgggcccgcggcgcattagctggttggtggggtaagagcctaccaaggcaa 9.1 cgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccaga


ctcctacgggaggcagcagtagggaatcatccgcaatgggcgaaagcctgacggtgcaa cgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttatccgagaagaacaag gaccggtcgaagaggccggttccatgacggtaccgatcagaagacctagacttccat

Staphylococcus aureus

GU3 0234 8.50 6

Aggtgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcga acagacgaggagcttgctcctctgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtggata acctacctataagactgggataacttcgggaaaccggagctaataccggataataatat tgaacccgcatggttcaatagtgaaagacggttttgctgtcacttatagatggatccgc gccgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcaacgatgcgtagccgacct gagagggtgatcggccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagc agtagggaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccgcgtgagtgatga

ANNEXES

Bacillus brevis

GU0 4887 6.1

Proteus mirabilis

HM 5853 75.1

Neisseria meningitidis

GU5 6141 6.1

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ANNEXES

Pseudomonas aeruginosa

HM 7525 79.1

Serratia marcescens

HM 5908 92.1

aaaccgatcgtagtccggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagtcggaatcgcta gtaatcgcaggtcagcatactgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccg tcacaccatgggagtgggggataccagaagtaggtaggataaccgcaaggggtccgcta ccacggtatgctc atgggaagaggcggccaagtctaacacattgcaagtcgagcggatgaagggagcttgct cctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggat aacgtccggaaacgggcgctaataccgcatacgtcctgagggagaaagtgggggatctt cggacctcacgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaaaggcc taccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgaga cacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcc tgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttg ggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataagcacc ggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaatta ctgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcagcaagttggatgtgaaatccccgggctcaa cctgggaactgcatccaaaactactgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcc tgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacct ggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctg gtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcg cagctaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatg aattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaag aaccttacctggccttgacatgctgagaactttccagagatggattggtgccttcggga actcagacacaggtgcgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt cccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaagg agactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggccctta cggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggt ggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtg aagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggcct tgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaacc gcaagggggacggtacccacgaattattacca agagtttgatcatggctcagcttgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgag cggtagcacaggggagcttgctccctgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtct gggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacg tcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatggga ttagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagagg atgacagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggg aatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggtaggtggtgaacttaatacgttcatcaatt gacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacgga gggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagt cagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagctagagt ctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaa taccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggg gagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggt tgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtac ggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgt ggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttcc agagatggattggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagct cgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgcc agcggttcggccgggaactcaaaggagactgccagtgacaaactggaggaaggtgggga tgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatat acaaagagaagcgacctcggagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggat tggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgc tacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggtt gcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgac tggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggctggatcacctcctt ggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccct ggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctg gtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccg gagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatg aattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaag aaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcggga

ANNEXES

Serratia biogroupe 1

GU8 2611 8.1

Serratia polymuthica

HM 5964 29.1

Serratia liquefaciens

HM 7564 89.1

actctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaag tcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttcggccgggaactcaaag gagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggccctt acgagtagggctacacacgtgctacaatggcgtatacaaagagaagcgacctcgcgaga gcaagcggacctcataaagtacgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccat gaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggcc ttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaac cttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatga caggcctaacacatgcaagtcgagcggtagcacargagagcttgctctctgggtgacga gcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactgga aacggtagctaataccgcataacgtctacggaccaaagtgggggaccttcgggcctcac gccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcg acgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccag actcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcc atgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggg ttcagtgttaatagcactgtrcattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactcc gtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaa agcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgcgcttaacgtgggaact gcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcgg tgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagac tgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacg ctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgc gttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacggg ggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacct actcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgagac aggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacg agcgcaacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccg gtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtaggg ctacacacgtgctacaatggcgtatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggac ctcataaagtacgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaa tcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacac cgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagg gcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaaca tgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataac tagatggctgcgtctacggaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgt gcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagc tggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacggga ggcttagttggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtg tgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaagggttctgtgttaat agcactgtgcattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagcc gcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcagg cggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgcgcttaacgtgggaactgcatttgaaact ggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtag ggatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggt gcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccccgctgtaaacgatg tcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgacc gcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaag cggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccagtacctactcttgacat ccagagaattcgctagagatagcttgtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatg gctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctt atcctttgttgccagcgcgtaatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccg gaggaaggtggggatgacgtcttagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgg ctacaatggcgtatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagta cgtcgtagtccggatcggagtctgcaactcgactccgtttagtcggaatcgctagtaat cgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcaatgccgggccttgtacacaatg gagagcttgctcttttaatacttagtggcgcacgggtgagtaatgtatagttaatctgc cctacactggaggacaacagttagaaatgactgctaatactccatactccttcttaaca taagttaagtcgggaaagtttttcggtgtaggatgagactatattgtatcagctagttg gtaaggtaatggcttaccaaggctttgacgcataactggtctgagaggatgatcagtca cactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtagggaatattgctc aatgggggaaaccctgaagcagcaacgccgcgtggaggatgacacttttcggagcgtaa

ANNEXES

Campylobacter fetus

GQ 1676 74.1

actccttttgttagggaagaaccatgacggtacctaacgaataagcaccggctaactcc gtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttactcggaatcactgggcgtaa aggacgcgtaggcggattatcaagtcttttgtgaaatctaacagcttaactgttaaact gcttgagaaactgataatctagagtgagggagaggcagatggaattggtggtgtagggg taaaatccgtagagatcaccaggaatacccattgcgaaggcgatctgctggaactcaac tgacgctaatgcgtgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacg ccctaaacgatgtatactagttgttgctgtgctagtcacggcagtaatgcacctaacgg attaagtataccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaatagacggg gacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagatacgcgaagaaccttacct gggcttgatatccaactaatctcttagagataagagagtgctagcttgctagaaagttg agacaggtgctgcacggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc aacgagcgcaacccacgtatttagttgctaacagttcggctgagcactctaaatagact gccttcgcaaggaggaggaaggtgtggacgacgtcaagtcatcatggcccttatgccca gggcgacacacgtgctacaatggcatatacaatgagatgcaatatcgcgagatggagca aatctataaaatatgtcccagttcggattggagtctgcaactcgactccatgaagccgg aatcgctagtaatcgtagatcagccatgctacggtgaatacgttcccgggtcttgtact caccgcccgtcacaccatgggagttgatttcactcgaagtcggaatgctaaactagcta ccgcccacagtggaatcagcgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggagaac ctgcggttggatcacctcct ctgatggagggggaattctaactactggaaacggtagctaataccgcattgattcgtaa acgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatg ggattagctagtaggtggggtaacggctcacctagattcggatccctagctggtctgag aggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagt ggggaggctagcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaagg ccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggggataaggttaataaccttgtc cattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaata cggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtc aagtcggatgtgaaatccccgggattcgcctgggaactgcattcgaaactggcaggctg

Klebsiella oxytoca

HM gagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgga 7564 ggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcg 96.1


tggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttgg aggttgttcccttgaggagtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctgggga gtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacggatgctcgcacaagcggtggagc atgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaact tagcagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtc agctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgt tgccagcgattcggccgggaactcaaaggagactgcatgctgtaaactggaggaaggtg gggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggc atatacaaagagaagcgacctcgcgagagctgaaagcggacctcataaagtatgtcgta gtatgctttggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggat catgctggctgccacggt

Salmonella ser. Paratyphi Salmonella ser. Pollurum

HM 6357 65.1 AY3 7382 9.2

ggggataactactggaaacggtggctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggg gaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagcttgttggtgaggta acggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaa ctgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcg caagcctgatgcagccatgccgcgtgt gggatctgccatgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacg tcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgaacccagatggga ttagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagagg atgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggg gaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggcct

ANNEXES

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Edwardsiella tarda

HM 2226 43.1

Aeromonas hydrophila G2

GU2 0496 5.1

agtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcg gcagcgggaaagtagcttgctacttttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgcct gggaaattgcccagtcgagggggataacagttggaaacgactgctaataccgcatacgc cctacgggggaaagcaggggaccttcgggccttgcgcgattggatatgcccaggtggga ttagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagagg atgatcagccacacggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggg aatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggttgatgcctaatacgtatcaactgt gacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacgga gggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggttggataagt tagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatttaaaactgtccagctagagt cttgtaganggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggagga ataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtgg ggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggagg ctgtgtccttgagacgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccncctggggagt cggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctcttgggtgacg agtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactgg aaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctca caccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggc gacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtcca gactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagc catgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcgaggaggaagg

ANNEXES

Enterobacter intermedius

AF3 1021 7.1

Chromobacterium violaceum

GU3 0014 6.1

Citrobacter freundii 6400


09.1

HM

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Escherichia coli 02 4789


5/10 89

GU9

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RESUME Durant cette tude, la prsence de Listeria spp. a t investigue dans 50 chantillons de laits crus de deux wilayas : SKIKDA et TEBESSA. Listeria spp. ont t isoles aprs un enrichissement froid puis identifies par des mthodes classiques bases sur les caractres morpho-physio-biochimiques. Les Listeria spp. ont t retrouves dans 2 cas / 22 chantillons TEBESSA et 1 cas / 28 chantillons SKIKDA. Une tude dinteraction phylogntique de 42 souches isoles a t ralise sur le logiciel MEGA4.0 par les deux mthodes UPGMA et NJ. Les rsultats prsents dans cette tude montrent, le risque potentiel de consommation de lait cru non pasteuris, et dmontrent une interrelation entre Listeria et la flore bactrienne isole de la mme niche cologique et la grande complexit trancher pour une phylognie dfinitive. Mots cls : Lait cru, Listeria spp., Phylognie.

50 : . - - . 22 / 2 28 / 1 42 . MEGA4.0 UPGMA .NJ

, .

: , ,

ABSTRACT

In this study, Listeria spp. was investigated in 50 samples of raw milk collected in two wilayas: SKIKDA and TEBESSA. Listeria spp. was isolated after cold enrichment and identified by conventional methods based on morpho-physio-biochemical tests. Listeria spp. was found in 2 / 22 samples in TEBESSA and 1 / 28 samples in SKIKDA. A phylogenetic study of interaction of 42 isolates was performed on the software MEGA4.0 by both UPGMA and NJ methods.

The results presented in this study indicate the potential risk for consumption of raw unpasteurized milk, and demonstrate an interrelationship between Listeria and the bacterial flora isolated from the same ecological niche and the big difficulty to determine a definitive phylogeny.

Key- words: raw milk, Listeria spp., phylogeny.