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Utilisation des marqueurs molculaires dans les tudes de diversit des plantes module denseignement
Les technologies bases sur lADN

Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction ou RFLP
(RFLP pour restriction fragment length polymorphism)
Copyright: IPGRI and Cornell University, 2003 Traduction franaise: Cirad & SupAgro, 2006
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Sommaire
f La technologie RFLP
Extraction de lADN Digestion par des enzymes de restriction et lectrophorse Transfert de lADN selon la mthode Southern Hybridation de lADN quipement
f f f f
La technologie RFLP en images Interprtation des profils RFLP Avantages et inconvnients des RFLPs Applications
Mas Bl Pin sylvestre
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La technologie RFLP
La dtection de RFLP repose sur la possibilit de comparer des profils de bandes, gnres aprs digestion dun ADN cible par des enzymes de restriction. Les tapes exprimentales sont les suivantes: f Extraction de lADN f Digestion par enzyme de restriction et lectrophorse sur gel f Transfert dADN selon la mthode de Southern f Hybridation dADN
La procdure La sonde ADN Les sources de sondes
f quipement
Copyright: IPGRI and Cornell University, 2003 Traduction franaise: Cirad & SupAgro, 2006 RFLPs 3
Lanalyse de polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP pour Restriction fragment length polymorphism) a t lune des premires techniques tre largement utilise pour dtecter de la variation au niveau de la squence dADN. Le principe sous-jacent de cette technologie rside dans la possibilit de comparer des profils de bandes, gnres aprs digestion de molcules dADN dindividus diffrents par des enzymes de restriction. Diverses mutations peuvent avoir affect de faon variable les molcules dADN, produisant des fragments de longueurs variables. Ces diffrences dans les longueurs de fragments peuvent tre vues aprs lectrophorse sur gel, hybridation et visualisation.
Extraction dADN
f LADN gnomique total est extrait des cellules vgtales f Alternativement, lADN des chloroplastes ou mitochondries peut tre utilis f LADN doit tre propre et de haut poids molculaire f Complications:
Cassures pendant lextraction Dgradation de lADN par des nuclases Extraction conjointe de polysaccharides Extraction de mtabolites secondaires vgtaux
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Lextraction dADN est la premire tape pour beaucoup de technologies bases sur lADN. LADN se trouve soit dans les chromosomes nuclaires, soit dans les organites (mitochondries et chloroplastes). Pour extraire lADN de son emplacement, plusieurs techniques de laboratoire sont requises pour casser les parois cellulaires et les enveloppes nuclaires, et galement sparer de faon adquate lADN des autres composantes de la cellule. Quand on fait cela, il faut prendre soin de ne pas endommager la molcule dADN que lon doit rcuprer sous la forme dun long filament.
Digestion par enzyme de restriction et lectrophorse sur gel
+
Hybridation ncessaire pour dtecter des fragments spcifiques
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LADN extrait est digr avec des enzymes de restriction spcifiques, soigneusement choisies. Chaque enzyme de restriction, dans des conditions appropries, va reconnatre et couper lADN de faon prdictible, produisant ainsi un ensemble de fragments dADN (les fragments de restriction) de diffrentes longueurs. Les millions de fragments de restriction produits sont gnralement spars par lectrophorse sur gel dagarose. Comme les fragments seraient vus comme une trane continue par coloration au bromure dthidium, la coloration seule ne permet pas de dtecter des polymorphismes. Lhybridation doit pour cela tre utilise pour dtecter des fragments spcifiques.
Transfert d ADN par Southern blotting

Poids
Membrane Gel
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Le transfert dADN est appel Southern blotting, en rfrence E.M. Southern (1975), qui inventa la technique. Dans cette mthode, le gel est tout dabord dnatur dans une solution basique et plac dans un bac. Une membrane poreuse de nylon ou de nitrocellulose est tale sur le gel, et un poids pos sur lensemble. Tous les fragments de restriction prsents dans le gel se transfrent sur la membrane sous forme simple brin par capillarit. Rfrence Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.
Hybridation dADN : La procdure

ADN fix la membrane
Hybridation avec une sonde Sonde hybride
Excs de sonde limin par lavage Daprs Griffiths et al. 1996
Exposition avec un film autoradiographique
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La membrane avec lADN cible est incube avec la sonde ADN. Les conditions dhybridation sont telles que si des brins sur la membrane sont complmentaires de ceux de la sonde, lhybridation se produira et des duplex marqus se formeront. Quand les conditions sont trs stringentes, lhybridation avec des ADN trs distants ou non homologues ne se produit pas. Ainsi donc, la sonde ADN accroche des squences qui sont complmentaires et idalement homologues elle mme, parmi les milliers ou millions de fragments non dtects qui migrent dans le gel. Les fragments dsirs peuvent tre dtects aprs exposition simultane de la membrane hybride et dun film autoradiographique.
Hybridation dADN : La sonde ADN

ADN total ou ADNc Les clones recombinants sont slectionns et cultivs plus avant
ADN digr
+
fragments d ADN selectionns daprs leur taille Fragment dADN cible Les clones poussent sur une boite de culture
Vecteur extrait dune bactrie et ouvert
Le fragment dADN est insr dans le vecteur
Le vecteur recombinant est introduit dans une bactrie et clon
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Pour dtecter un sous-ensemble de fragments dADN dintrt parmi tous les fragments gnrs par digestion enzymatique, il faut une sonde. La sonde ADN gnralement provient dune banque dADN (gnomique ou ADNc), collection de vecteurs (par exemple des plasmides) qui contiennent une repsentation dune molcule dADN originale coupe en morceaux. Les vecteurs peuvent tre transforms dans des bactries et peuvent multiplier le morceau dADN quils contiennent plusieurs fois. La sonde ADN est galement convertie en une molcule simple brin, convenablement marque, en utilisant une mthode standard (p.e. un radioisotope ou la digoxignine), et hybride avec lADN cible, qui est fix sur la membrane.
Hybridation dADN: les sources de sondes (1)

f ADN nuclaire:
Banques gnomiques ADNc
f ADN cytoplasmique f La spcificit despce de beaucoup de sondes simple-copie ncessite quune banque soit construite quand on tudie une nouvelle espce. Cependant, des sondes issues de taxons voisins peuvent souvent tre utilises.
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Les sources de sondes ADN comprennent: Des banques gnomiques lADN total de la plante est digr par des enzymes de restriction et les fragments individuels clons dans un vecteur bactrien ou viral. Les sondes convenables sont slectionnes partir de cette banque anonyme pour lanalyse RFLP. Des banques dADNc (ADN complmentaires) LARNm est isol et transcrit en ADN, en utilisant lenzyme transcriptase rverse. LADNc ainsi obtenu est clon dans des vecteurs et utilis comme une banque de sondes dans lanalyse RFLP. De lADN cytoplasmique des banques dADN mitochondrial et chloroplastique
Du fait de la spcificit despce montre par beaucoup de sondes simple-copie, des banques gnomiques ou dADNc doivent souvent tre construites pour les tudes portant sur de nouvelles espces. Cela peut tre trs consommateur en temps. Cependant, vu les connaissances actuelles sur des squences et gnes communs, on peut souvent utiliser des genres proches.
Hybridation dADN: les sources de sondes (2)

Squences rptitives ou de type minisatellite:
Motif de base de 10 60 pb en tandem Trs variables entre tres humains Des polymorphismes dans le nombre dunits de rptition (VNTR pour variable number of tandem repeat )
Chez les plantes, des sondes issues dune rptition interne du gne de la protine III du bactriophage M13 ont t utilises pour rvler des squences de type minisatellite
Des squences rptitives de type minisatellite ont galement une application particulire dans lanalyse RFLP. Ce sont des squences rptes dun motif de base. Ces motifs mesurent de 10 60 pb, se trouvent en tandem (c.a.d. la queue leu leu) et se produisent en de nombreux locus du gnome. Le travail sur les marqueurs minisatellites vgtaux rsulte dtudes pionnires sur le gnome humain par Jeffreys et al. (1985a, b), montrant que les marqueurs minisatellites taient trs variables chez les hommes. Comme les polymorphismes sont lis au nombre dunits rptes, les squences sont aussi appeles VNTR pour variable number of tandem repeats (Nakamura et al., 1987). Une sonde soigneusement slectionne peut dtecter des fragments de restriction qui reprsentent un grand nombre de locus. Les profils des fragments de restriction portant des minisatellites (encore appeles empreintes gntiques, ou DNA fingerprint en anglais) permettent de discriminer clairement diffrents individus.
References Jeffreys, A.J., V. Wilson and S.L. Thein.1985a. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature 314:67-73. Jeffreys, A.J., V. Wilson and S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of human DNA. Nature 316:76-79. Nakamura, Y., M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E. Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin and R. White. 1987. Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622. Rogstad, S.H., J.C. Patton, II and B.A. Schaal. 1988. M13 repeat probe detects DNA minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:9176-9178. Ryskov, A.P., A.G. Jincharadze, M.I. Prosnyak, P.L. Ivanov and S.A. Limborska. 1988. M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms. FEBS Lett. 233:388-392.
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Equipement
f Ressources:
Eau distille et/ou dsionise Ractifs
f Equipement:
Rfrigerateur et conglateur Hotte flux laminaire Centrifugeuse Gnrateurs Plaque chauffante ou micro-onde pH mtre Balance standard units delectrophorse sur gel Chambre noire Transilluminateur UV
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La technologie RFLP en images
Les diapositives suivantes illustrent les procdures de la technique RFLP
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Aprs avoir coul la solution dagarose dans le portoir de gel, on insre immdiatement des peignes, pour former des puits, et on laisse le gel se durcir. Les peignes sont alors enlevs et le gel est plac dans une chambre dlectrophorse.
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Les chantillons dADN digr, additionns de bleu de Bromophnol, sont chargs dans les puits avec une pipette automatique.
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Aprs llectrophorse, le gel est trait avec du NaOH pour rompre les ponts de la double hlice et la rendre simple-brin. Cela permet par la suite lhybridation avec une sonde simple-brin.
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Le bac de transfert est dabord prpar en saturant les ponges avec du NaOH. Il est indispensable de porter des lunettes de scurit et une blouse de laboratoire est fortement recommande. Les rgles de scurit du laboratoire doivent tre suivies.
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Du papier absorbant est plac au dessus des ponges pour viter le contact direct avec le gel.
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On limine les bulles entre le papier absorbant et les ponges en roulant une pipette ou une baguette de verre sur la surface du papier. Cela permet le transfert complet de la solution sur la totalit du gel.
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Les espaces restant entre les ponges et le bac sont couverts avec des bandes de feuilles plastiques pour viter lvaporation, ce qui rduirait lefficacit du transfert.
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Le gel dagarose trait est plac au dessus du papier absorbant.
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On dplace les bulles entre le gel et le papier avec une baguette de verre.
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La membrane est coupe la taille approprie.
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La membrane est place la surface du gel, puis couverte avec un feuillet de papier absorbant.
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Une couche de papier poreux tel que des serviettes en papier ou du papier journal est place sur le papier absorbant protgeant la membrane.
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Lensemble du dispositif est surmont dune charge (ici, une bouteille deau pose sur une plaque de verre) pour favoriser un bon tranfert. Le transfert est complet au bout de quelques heures, le papier de transfert est limin, et la membrane stocke jusqu son utilisation avec la sonde.
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Le processus dhybridation commence. Un ADN de blocage (qui minimise lhybridation de fond avec la membrane) est port bullition pour le dnaturer sous forme simple brin.
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La membrane est place dans un rcipient plastique avec une solution dhybridation approprie et lADN de blocage, puis pr-incube.
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La sonde marque est ajoute dans le rcipient avec la solution dhybridation et la membrane, et incube toute la nuit dans un four hybridation. Le jour suivant, la membrane est sortie du dispositif dhybridation, et lave avec une solution de stringence approprie. (Note: Les institutions peuvent diffrer pour ce qui concerne les rgles de scurit requises; veuillez vrifier avec votre institution hte.)
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La membrane est ensuite sche sur une feuille de papier et place dans une cassette d autoradiographie.
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Dans une chambre noire, un film autoradiographique est insr dans la cassette.
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La cassette est enveloppe, ou scelle avec de ladhsif, et stocke dans un conglateur jusqu ce que le film soit suffisamment expos, gnralement de un quatre jours.
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Ceci est un autoradiogramme de RFLP.
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Le RFLP en images: Rsum

Sonde Site de restriction
A
Digestion
B A B
Transfert
Mutation = un nouveau site de restriction
Electrophorse
Hybridation
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Interprtation des profils RFLP (1)

Une mutation cre un nouveau site de restriction dans la rgion cible. Deux bandes plus courtes sont alors dtectes sur le film autoradiographique
Site de restriction Nouveau site de restriction
A B
Sonde
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La technologie RFLP, idalement, produit partir dun gel une srie de bandes qui vont pouvoir tre cribles soit pour la prsence ou labsence de bandes particulires, soit comme des marqueurs codominants. Les diffrences entre les gnotypes sont gnralement visualises comme des profils de fragments de restriction diffrents. Cette diapositive et les suivantes prsentent les diffrents vnements mutationnels responsables de polymorphismes dtects par lanalyse RFLP. Dans ce diagramme, une mutation cre un nouveau site de restriction dans le segment A, exactement au niveau du site de reconnaissance de la sonde. En consquence, la sonde va hybrider simultanment les deux segments crs par lenzyme. Dans le segment B, o aucune mutation ne sest produite, un seul segment shybride avec la sonde. Pendant llectrophorse, les deux segments de A vont migrer plus vite dans le gel que le segment hybrid en B et, de ce fait, le polymorphisme sera observ sur le gel comme montr dans lencart ( droite).
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Une mutation cre un nouveau site de restriction entre deux sites de restrictions flanquants, produisant ainsi un fragment de restriction plus court.
Site de restriction Nouveau site de restriction
A B
Sonde
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Dans ce cas, un nouveau site de restriction est encore cr par mutation dans le segment A. Cependant, le nouveau site apparait sur un cot du site de reconnaissance de la sonde. En consquence, un seul fragment va shybrider dans le segment A et un seul dans le segment B. Le polymorphisme se manifeste par un fragment plus court en A quen B. Le fragment le plus court migrera aussi plus vite dans le gel (voir encart).
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Une insertion dune squence dADN entre deux sites de restrictions flanquants produit un fragment de restriction plus grand
Site de restriction Evnement dinsertion
A B
Sonde
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Si un vnement insertionnel se produit entre deux sites de restriction (segment A), le fragment hybrid sera plus long. De ce fait, on pourra observer un polymorphisme entre les individus A et B: le fait que le fragment hybrid en A sera plus long quen B et sa distance de migration plus courte (voir encart).
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Une dltion dune squence dADN entre deux sites de restrictions flanquants produit un fragment de restriction plus court
Site de restriction vnement de dltion
A B
Sonde
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Si une dltion se produit entre des sites de restriction, la sonde shybridera un fragment plus court. On observera ceci comme un polymorphisme dans le gel avec un fragment qui migre davantage dans le gel pour lindividu A (voir encart).
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Un des sites de restriction flanquants est chang ou perdu par mutation ou dltion. En consquence, le fragment de restriction est modifi
Site de restriction Site perdu
A B
Sonde
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Sil reste un seul site de restriction, aucun fragment de restriction nest gnr, et lhybridation ne peut avoir lieu dans cette gamme de taille. Si un nouveau site a t cr par le changement, le nouveau fragment shybridera et montrera un profil de bandes diffrent dun individu nayant pas subi le changement.
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Avantages des RFLP

f Mthodologie trs robuste, bien transfrable entre laboratoires f Hrit de faon codominante et, de ce fait, permet destimer lhtrozygotie f Pas dinformation de squence requise f Puisque base sur une homologie de squence, fortement recommande pour des analyses phylogntiques entre espces apparentes f Bien adapte pour la construction de cartes de liaison gntique f Marqueurs spcifiques de locus, ce qui permet des tudes de syntnie f Pouvoir discriminant au niveau de lespce ou de la population (sondes simple copie), ou au niveau individuel (sondes multicopies) f Simplicit condition davoir des sondes adaptes disponibles, la technique peut facilement tre applique nimporte quelle plante
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Inconvnients des RFLP

f f f f f f f f f f Grandes quantits dADN ncessaires Automatisation impossible Faible niveau de polymorphisme chez certaines espces Peu de locus sont dtects par exprimentation Ncessite une banque de sondes approprie Consommateur en temps, spcialement avec des sondes simple-copie Coteux Ncessite la distribution de sondes entre des laboratoires en collaboration Technicit demande modre Peut ncessiter diffrentes combinaisons sonde / enzyme
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Applications
f Diversit gntique f Apparentements gntiques f Histoire de la domestication f Origine et volution des espces f Drive gntique et slection f Cartographie du gnome et cartographie compare f tiquetage de gnes f Rvlation de gnes intressants dans des espces sauvages f Construction de banques exotiques
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Les rfrences prcdes de * sont discutes en dtail dans les diapositives suivantes.
Ahn, S. and S.D. Tanksley. 1993. Comparative linkage maps of the rice and maize genomes. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 90(17):7980-7984. Autrique, E., R.P. Singh, S.D. Tanksley and M.E. Sorrells. 1995. Molecular markers for four leaf rust resistance genes introgressed into wheat from wild relatives. Genome 38(1):75-83. de Vicente, M.C. and S.D. Tanksley. 1993. QTL analysis of transgressive segregation in an interspecific tomato cross. Genetics 134(2):585-596. de Vicente, M.C., M.J. Truco, J. Truco, J. Egea, L. Burgos and P. Ars. 1998. RFLP variability in apricot (Prunus armeniaca L.). Plant Breed. 117:153-158. * Dubreuil, P. and A. Charcosset. 1999. Relationships among maize inbred lines and populations from European and North American origins as estimated using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 99:473-480. * Enjalbert, J., I. Goldringer, S. Paillard and P. Brabant. 1999. Molecular markers to study genetic drift and selection in wheat populations. J. Expl Bot. 50(332):283-290. Lagercrantz, U. and D.J. Lydiate. 1996. Comparative genome mapping in Brassica. Genetics 144(4):1903-1910. * Sinclair, W.T., J.D. Morman and R.A. Ennos. 1999. The postglacial history of Scots pine (Pinus sylvestris L.) in western Europe: evidence from mitochondrial DNA variation. Mol. Ecol. 8:83-88. Sun, C.Q., X.K. Wang, Z.C. Li, A. Yoshimura and N. Iwata. 2001. Comparison of the genetic diversity of common wild rice (Oryza rufipogon Griff.) and cultivated rice (O. sativa L.) using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 102:157-162. Tanksley, S.D., M.W. Ganal, J.P. Prince, M.C. de Vicente, M.W. Bonierbale, P. Broun, T.M. Fulton, J.J. Giovannoni, S. Grandillo, G.B. Martin, R. Messeguer, J.C. Miller, L. Miller, A.H. Paterson, O. Pineda, M.S. Rder, R.A. Wing, W. Wu and N.D. Young. 1992. High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. Genetics 132:1141-1160. Tanksley, S.D. and S.R. McCouch. 1997. Seed banks and molecular maps: unlocking genetic potential from the wild. Science 277:1063-1066. Zamir, D. 2001. Improving plant breeding with exotic genetic libraries. Genetics 2:983-989.
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Exemple: Mas
f Titre:
Relationships among maize inbred lines and populations from European and North American origins as estimated using RFLP markers. Theor. Appl. Genet. 1999. 99:473-480
f Objectif:
Examiner les relations gntiques entre des lignes fixes de groupes htrotiques connus et des varits de pays dune grande importance historique dans le dveloppement du matriel lite
f Matriel et mthodes:
62 lignes fixes de groupes htrotiques connus et 10 populations de mas (environ 30 individus par population) sont gnotypes 28 locus RFLP (29 combinaisons sonde / enzyme)
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(suite diapositive suivante)
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Exemple: Mas (suite)

Rsultats:
La comparaison des allles spcifiques de chaque type de ressource gntique montre un dficit dallles dans les lignes, qui reprsente environ 22% de la richesse alllique de la population:
Les associations entre lignes et populations sont consistantes avec les donnes de pedigree des lignes et donnent de nouvelles informations sur les bases des groupes htrotiques Les lignes dentes europennes se rvlent aussi proches des populations dentes du NE des tats Unis tudies que les populations europennes
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Exemple: Mas (suite)

f Discussion:
Les populations reprsentent des rservoirs de diversit significatifs, et le pool gntique lite ne peut contenir lui seul les allles utiles Question: Comment le groupe htrotique europen peut-il tre plus proche des populations dentes du NE des tatsunis comptons early que des autres populations?
f Conclusions:
Les rsultats suggrent quun ensemble plus large de populations devrait tre tudi avec laide des marqueurs molculaires, afin de dvelopper des stratgies appropries pour lutilisation efficace de ces ressources gntiques dans les programmes de slection.
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Exemple: Bl
f Titre:
Molecular markers to study genetic drift and selection in wheat populations. J. Exp. Bot. 1999. 50(332): 283-290
f Objectif:
Comparer des frquences allliques dans des populations de bl qui ont t soumises la slection naturelle
Deux populations initiales et six sous-populations drives, cultives pendant 10 ans dans des sites environnement contrast, sont tudies sur 30 locus
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Exemple: Bl (suite)
f Rsultats et discussion:
La diffrenciation entre sous-populations base sur la diversit RFLP est hautement significative
La variation de frquence alllique identifie est bien plus grande que celle attendue sous la seule drive gntique. La slection influence considrablement lvolution des populations Certains locus rvlent une diffrenciation plus grande que les autres. Cela pourrait indiquer quils sont lis gntiquement dautres locus polymorphes impliqus dans ladaptation
f Conclusions:
Les variations de frquences allliques observes pour les marqueurs RFLP ne peuvent sexpliquer par lvolution sous la seule drive gntique, mais par une influence directe ou indirecte des effets de slection.
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Exemple: Pin sylvestre

f Titre:
The postglacial history of Scots pine (Pinus sylvestris L.) in western Europe: evidence from mitochondrial DNA variation. Mol. Ecol. 1999. 8:83-88
f Objectif:
Explorer la structuration gographique des variants de lADN mitochondrial dans des populations de pin sylvestre de lEurope de lOuest.
Vingt populations de pin sylvestre dEcosse et 18 dEurope continentale (en moyenne 21 individus par population) sont tudies en utilisant des analyses RFLP de lADN total.
(suite diapositive suivante))
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Exemple: Pin sylvestre (suite)

Trois profils RFLP de lADN mitochondrial (mitotypes a, b et d) ont t dtects
En Espagne, les 3 mitotypes ont t dtects. La diversit gntique est leve, distribue principalement entre plutt que dans les populations. Le mitotype d tait prsent seulement dans la population situe le plus au sud (Sierra Nevada, Espagne) Les populations italiennes sont fixes pour le mitotype b. Les populations du nord de la France, de lAllemagne, de la Russie et le sud de la Sude sont fixes pour le mitotype a. Les populations de Fennoscandie (Norvge, Sude et Finlande) sont fixes pour le mitotype b En cosse, le mitotype a a t fix largement. Le mitotype b tait prsent dans quelques populations polymorphes
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Exemple: Pin sylvestre (suite)

f Discussion:
La dtection de diffrents mitotypes constitue une preuve irrvocable de diffrences gntiques dans le gnome mitochondrial. La diversit des mitotypes dans les populations espagnoles indique que ces individus i) soit descendent de pins ayant survcu dans des zones refuge lors de la dernire glaciation ii) soit reprsentent des reliques tertiaires qui ont survcu dans des populations isoles En Europe, aprs la glaciation, P. sylvestris a apparemment commenc dvelopper trois directions volutives, chacune avec une origine diffrente Espagne, Europe centrale du Nord et Fennoscandie du Nord
f Conclusions:
Les tudes de marqueurs molculaires hrits de faon maternelle peuvent fournir un aperu utile de lhistoire des espces et aider dfinir des rgions gographiques prsentant un pool de ressources gntiques conserver.
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En rsum:
f La technologie RFLP dtecte des changements de longueur dans des molcules dADN cibles aprs digestion par une enzyme de restriction f Les bandes RFLP sont dtectes en hybridant lADN cible par une sonde ADN f Les profils de bandes RFLP refltent diffrents vnements mutationnels au site dhybridation de la sonde ou sa rgion avoisinante f Le RFLP est une technique trs robuste, mais consommatrice en temps et qui demande un investissement technique
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A ce stade vous devez savoir:

f Les principales tapes ncessaires pour dtecter des RFLPs f Les diffrentes sources de sondes f Leffet de diffrents vnements mutationnels dans la dtection de profils de bandes RFLP f Les avantages et inconvnients de la technologie RFLP pour les analyses de diversit gntique
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Rfrences de base
Botstein, D., R.L. White, M. Skolnick and R.W. Davis. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Human Genet. 32:314-331. Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin and W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman and Co., NY. Jeffreys, A.J., V. Wilson and S.L. Thein.1985a. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature 314:67-73. Jeffreys, A.J., V. Wilson and S.L.Thein.1985b. Individual-specific "fingerprints" of human DNA. Nature 316:76-79. Nakamura, Y., M. Leppert, P. O'Connell, R. Wolff, T. Holm, M. Culver, C. Martin, E. Fujimoto, M. Hoff, E. Kumlin and R. White. 1987. Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622. Rogstad, S.H., J.C. Patton, II and B.A. Schaal. 1988. M13 repeat probe detects DNA minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:9176-9178. Ryskov, A.P., A.G. Jincharadze, M.I. Prosnyak, P.L. Ivanov and S.A. Limborska. 1988. M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms. FEBS Lett. 233:388-392. Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517. Copyright: IPGRI and Cornell University, 2003 Traduction franaise: Cirad & SupAgro, 2006
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Suite Les technologies bases sur lADN

Les technologies bases sur la PCR
Notions de base sur la PCR
f Technologies bases sur lADN Technologies bases sur la PCR

PCR avec des amorces alatoires Amplified fragment length polymorphism (AFLP) Sequences-tagged sites (STS) Les stratgies les plus rcentes
f Technologies complmentaires f Considrations finales f Glossaire

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Utilisation des marqueurs molculaires dans les tudes de diversit des plantes module denseignement

Les technologies bases sur lADN

Digestion par enzyme de restriction et lectrophorse sur gel

Transfert d ADN par Southern blotting

Hybridation dADN : La procdure

Hybridation avec une sonde Sonde hybride

Excs de sonde limin par lavage Daprs Griffiths et al. 1996

Exposition avec un film autoradiographique

Hybridation dADN : La sonde ADN

Vecteur extrait dune bactrie et ouvert

Le fragment dADN est insr dans le vecteur

Le vecteur recombinant est introduit dans une bactrie et clon

Hybridation dADN: les sources de sondes (1)

Hybridation dADN: les sources de sondes (2)

La technologie RFLP en images

Les diapositives suivantes illustrent les procdures de la technique RFLP

Le gel dagarose trait est plac au dessus du papier absorbant.

La membrane est coupe la taille approprie.

Ceci est un autoradiogramme de RFLP.

Le RFLP en images: Rsum

Interprtation des profils RFLP (1)

Interprtation des profils RFLP (2)

Interprtation des profils RFLP (3)

Interprtation des profils RFLP (4)

Interprtation des profils RFLP (5)

Avantages des RFLP

Inconvnients des RFLP

(suite diapositive suivante)

Exemple: Mas (suite)

(suite diapositive suivante)

Exemple: Mas (suite)

(suite diapositive suivante)

Exemple: Pin sylvestre

(suite diapositive suivante))

Exemple: Pin sylvestre (suite)

(suite diapositive suivante)

Exemple: Pin sylvestre (suite)

A ce stade vous devez savoir:

Suite Les technologies bases sur lADN

f Technologies bases sur lADN Technologies bases sur la PCR

f Technologies complmentaires f Considrations finales f Glossaire

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