IMUNOLOGIA

Anticorpos

Prof Cludia Valle

Anticorpos
Definio: so glicoprotenas sricas da
frao gamaglobulina.

ANTICORPOS
DEFINIO / CARACTERSTICAS

- Glicoprotenas solveis produzidas por linfcitos B e clulas plasmticas aps a

estimulao com um antgeno. - Por conveno estabelecida pela OMS, devem ser chamados de imunoglobulinas (abreviado como Ig)

- Pertencem a um grupo de polipeptdeos chamados imunoglobulinas (separao eletrofortica).

- Interao Ag Ac se d atravs de foras no covalentes

(ligaes de hidrognio, atrao eletrosttica e fora de van der Waals).

IMUNOGLOBULINAS

A albumina B alfa-globulina C - beta globulina

D gama-globulina

ELETROFORESE DE PROTENAS PLASMTICAS

PLASMCITO
PATGENOS

Imunidade humoral anticorpos B Plasmcito

EFEITOS PROTETORES DA IMUNIDADE HUMORAL SO MEDIADOS POR UMA FAMLIA DE GLICOPROTENAS DENOMINADAS ANTICORPOS

Anticorpos
Estrutura molecular

Anticorpos (Ac) ou Imunoglobulinas (Ig) - So molculas com receptores especficos para o mesmo antgeno que estimulou a sua sntese, e apresentam a mesma estrutura bsica. - Poro Fab (fragment antigen binding): liga-se ao antgeno e varia segundo a especificidade de cada ly B. - Poro Fc (fragment crystalizable): interage com clulas, principalmente fagcitos, atravs de receptores Fc ou ativa o complemento.

ANTICORPOS
REGIO VARIVEL ( Fab) REGIO CONSTANTE ( Fc) CADEIAS PESADAS CADEIAS LEVES

Anticorpos
Estrutura
Quatro cadeias polipeptdicas ligadas por pontes dissulfeto.
* Cadeias pesadas (55 a 70 Kd) - Zona de dobradia prolina at 180o * Cadeias leves (25 Kd)

* Enzimas proteolticas (papaina)):

- fragmento cristalizvel (Fc) - fragmento que se liga ao antgeno (Fab): variabilidade ext. aminoterminal

ESTRUTURA

- 4 cadeias polipeptdicas

2 leves (L) 2 pesadas (H)

- 2 isotipos de cadeia leve: - 5 isotipos de cadeia pesada:

(kapa),

(lmbida)

(alfa),

(delta) ,

(gama)

(epsilon)

(mi)

* Cada cadeia tem segmentos relativamente estveis ou constantes (C), que

controlam as funes efetoras da molcula. * Zonas onde a sequncia de aminocidos varia enormemente: regies variveis (V).

- Contedo de carboidrato: 2 12% - Ligaes dissulfeto

Seres humanos: * Isotipo apresenta quatro subtipos: 1, 2, 3 e 4. sotipo apresenta dois subtipos: 1 e 2.

O anticorpo constitudo por quatro cadeias polipeptdicas, possuindo dois stios de ligao para o antgeno

Antgeno stios de ligao

cadeias

O anticorpo formado de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas unidas por pontes dissulfeto

PONTES DISSULFETO
N C C C C N N CADEIA LEVE CADEIA PESADA

ESTRUTURA DAS IMUNOGLOBULINAS

Regio amino terminal Cadeia leve
Dobradia aminocidos

Cadeia leve
Ponte dissulfeto

Cadeia pesada

Cadeia pesada
aminocidos aminocidos

Regio Carboxi terminal

ESTRUTURA

Duas pores: Fab: ligao com o Ag. Fc: cristalizvel.

Tratamentos enzimticos Papana: 3 fragmentos (2 Fab, 1Fc). Pepsina: 2 fragmentos Fab.

INTERAO COM O ANTGENO

Afinidade refere-se fora individual da ligao Ac-Ag (um eptopo e um stio combinatrio). proporcional ao grau de complementaridade entre o eptopo e o stio combinatrio.

Especificidade refere-se a especificidade dos stios combinatrios de um Ac. Quando o Ac reage apenas com o Ag A, e no com o B, diz-se que ele especfico. Quando alguns eptopos de um antgeno C so tambm reconhecidos, diz-se que ocorre uma reatividade cruzada.

 Antgenos - Substncia capaz de induzir e reagir com a resposta imunolgica. Eptopos ou Determinantes antignicos - So fragmentos da molcula do antgeno que induzem ou reagem com a resposta imunolgica. - Poro especfica que liga-se ao anticorpo.

Podem ser: - Determinantes lineares: formados por resduos de aminocidos adjacentes na sequncia covalente. - Determinantes conformacionais: formados por resduos de aminocidos de partes separadas da sequncia linear . Esto justaposos espacialmente na pela estrutura terciria protica.

Modelo para EPTOPO CONFORMACIONAL

EPTOPOS
LINEARES E CONFORMACIONAIS

Diferenas/marcadores (polimorfismo) Isotpicas

- Entre indivduos de espcies diferentes; - Mamferos: 5 tipos de cadeia pesada (, , , e )

Alotipicas
- Entre indvduos da mesma espcie; - Geralmente demonstra diferenas raciais; - Pequenas variaes nas regies constantes.

Iditipos - Regies determinantes de complementaridade (CDR) ;

- Local nos anticorpos complementares para o antgeno; - Na poro Fab - chamadas regies hipervariveis - Existem entre anticorpos de clones diferentes de plasmcitos.

ISTIPOS

ALTIPOS

IDITIPOS

Anticorpos
Funes

1. Na defesa do hospedeiro
marcao de organismos infecciosos; recrutamento, no hospedeiro de mecanismos efetores de destruio; neutralizao de toxinas; remoo de antgenos estranhos da circulao.

2. Na medicina clnica
nveis de Ac especficos antipatgeno usados no diagnstico/monitoramento de uma doena; conjunto de Ac administrados passivamente para a terapia/proteo do hospedeiro.

3. Em laboratrios cientficos
diagnstico e pesquisa.

Funes - Inativao de toxinas e outros agentes qumicos - Inativao de vrus - Lise de bactrias - Citotoxicidade - Transferncia de imunidade para fetos (IgG) - Transferncia de imunidade a lactantes (IgA>IgG) - Fixao do complemento - Regulao da resposta imune - Participao em reaes auto-imunes e alrgicas

AO DOS ANTICORPOS NEUTRALIZAO

Ligao ao patgeno impedido interao deste com a membrana celular.

OPSONIZAO Revestimento do patgeno por protenas sistema imune. AGLUTINAO ATIVAO DO SISTEMA COMPLEMENTO DEGRANULAO

Neutralizao

Neutralizao

Neutralizao

Opsonizao

Opsonizao

Ativao do Sistema Complemento

DEGRANULAO DE MASTCITOS BASFILOS ESOSNFILOS (IgE)

AGLUTINAO (IgM, IgG)

Passagem e proteo em epitlios de mucosas (IgA)

Tabela: FUNES DOS ANTICORPOS

ATIVIDADE
Neutralizao Opsonizao Sensibilizao de NK
Sensibilizao de MASTCITO Ativao de complemento

DISTRIBUIO
Transporte atravs do epitlio Transporte atravs da placenta Difuso extravascular

mg/mL

Anticorpos
Classes

CLASSES DE ANTICORPOS

Ponte dissulfeto Dobradia

Cadeia J

SUBCLASSES DE ANTICORPOS

PONTE DISSULFETO

SUBCLASSES DE ANTICORPOS

IgA1

IgA2

ANTICORPO IgM

A IgM constitui cerca de 5-10% do soro total .

Primariamente nos espaos intravasculares.

o 1 anticorpo a ser produzido na resposta imune primria ATIVA COMPLEMENTO !!

IgM
- Principalmente sob forma de pentmero (cinco monmeros) - Reduo a monmero de peso molecular 180kDa - Principal imunoglobulina da resposta primria aos antgenos - Primeira classe ao elevar-se na fase aguda dos processos imunolgicos -Aglutinante e citoltico -Fixao complemento melhor que IgG3 - Maturao de clula B, atuando como receptor e interagindo com o antgeno quanto ao controle da ativao ou supresso do linfcito -Sintetizada partir do 5 meses de vida fetal - No neutraliza vrus ou toxinas * Nveis elevados de IgM normalmente indicam uma infeco recente ou uma exposio

IgM

ANTICORPO IgG

a Ig mais abundante no sangue (80%), em particular na resposta secundria a um antgeno A IgG1, IgG3 e a IgG4 so capazes de atravessar a placenta A IgG3 a mais eficiente ativadora de Complemento.

IgG
Principal Ig sintetizada na resposta secundria Neutraliza toxinas bacterianas, vrus Opsonina Liga-se aos microorganismos para facilitar a fagocitose Responsvel pela memria imunolgica

- Atravessa a barreira placentria humana - Monmero: 4 subclasses IgG1, 2, 3 e 4

(constituem 70, 20, 8 e 2%, respectivamente, do total de IgG)

IgG3 fixa complemento com mais eficincia PM 160kD Geralmente forma monomrica

IgG

ANTICORPO IgA

Estrutura da IgA secretora Cadeia J

Componente secretor

a imunoglobulina presente em maior quantidade (10-15%) nas secrees externas como leite, saliva e lgrimas onde existe na forma de dmero.

ANTICORPO IgA secretora

Formao da IgA secretria
Submucosa

Plasmcito

Submuco sa

Dmero IgA

IgAs

IGA
2 mais abundante no soro (monomerica) Ocorre como monmero e como dmero IgA secretora (mais encontrada secrees excrinas) Principal Ig secretada para superfcies externas (mucosas)
lgrimas, saliva, leite, suco gstrico e secrees pulmonares confere imunidade local-barreira contra vrus, micrbios, alrgenos

No fixa complemento Neutraliza vrus Bactericida contra Gram-negativas, na presena de lisozima PM 160kDa (monmero) ou 360kDa (dmero) Importante papel impedindo a penetrao, no organismo de substncias alergnicas e de partculas microbianas

IgA

ANTICORPO IgE

A IgE est presente em baixas concentraes no soro (0,004%), mas tem um papel significante no incio da resposta inflamatria aguda, na proteo contra parasitas e nas reaes alrgicas.

ANTICORPO IgE

IgE
Monmero longo com 4 domnios CH Baixa concentrao no soro Liga via poro Fc em basfilos e mastcitos No requer a presena do antgeno para se ligar

Reaes alrgicas - Nveis aumentam na resposta a parasitas ou pacientes com reaes alrgicas (hipersensibilidade do tipo I) Interao mastcito / IgE / Ag, causa a ativao do mastcito com efeitos vasculares potentes localizados Infeces parasitrias (helmintos) Ligao via Fc aos eosinfilos No fixa complemento

IgE

ANTICORPO IgD

uma imunoglobulina presente em baixas concentraes na circulao ( 0,3mg/ml), cuja funo primria o de receptor da clula B.

No possui funes biolgicas conhecidas.

IgD
Concentraes sricas baixas Meia-vida curta Menos caracterizada das imunoglobulinas do ponto de vista funcional Sensvel protelise Est na superfcie do linfcito B No liga complemento Forma monomrica PM 160kDa Sensvel a lise (lbil degradao) Existe como receptor na superfcie de todo linfcito B em determinado momento de sua ontogenia

Switching / Troca de classe

Inicialmente linfcitos B expressam IgM Durante a resposta imune, ocorre liberao de citocinas por clulas T que induzem a troca de isotipo para IgG, IgA ou IgE; Recombinao somtica na clula B.

GERAO DE DIVERSIDADE NA RESPOSTA HUMORAL

O Papel das Citocinas

Citocina

Inibe

Inibe

Induz

Inibe

Induz

Aumenta produo

Inibe

Induz

Inibe

Induz

Inibe

Inibe

Inibe

Induz

Induz

Anticorpos
Resposta Imune Primria e Secundria

Resposta primria e secundria Primeiro contato com Ag - Estimulo para linfcitos B que se diferenciam em plasmcito e liberam Ac - produo de Ac

Segundo contato (mesmo Ag) - Clulas receptoras (clulas de memria) - Resposta imunolgica mais rpida - produo de Ac

RESPOSTA IMUNE PRIMRIA E SECUNDRIA

Resposta humoral

Declnio

ed o a rt nec no C op r oc it n A

Tempo(dias)

Resposta secundria (maturao de afinidade)

Resposta primria

a rt nec no C op r oc it n A

Tempo(dias)

Anticorpos monoclonais

Anticorpos Monoclonais
Produzidos pelo mesmo clone de linfcito B (mesma especificidade) Produo de Ac especfico para um determinado eptopo (tecnologia dos anticorpos monoclonais)

ANTICORPO MONOCLONAL - PRODUO

Imunizao com antgeno X Clulas de bao ativadas

Linhagem de mieloma mutante FUSO Cultivo de hibridomas em meio HAT

SELEO DOS HIBRIDOMAS

Sem produo de anticorpos desejados Cultivo dos hibridos para produo de anticorpo mococlonal

Com produo de anticorpos desejados

Anticorpo purificado

ANTICORPOS MONOCLONAIS HIBRIDOMA

OBTENO DO HIBRIDOMA

ANTICORPOS MONOCLONAIS - APLICAES

TERAPIA CONTRA CNCER

Bloqueio dos receptores de clulas cancerosas

Merci !

GLOSSRIO IMUNOLOGIA
Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)
Lise de clulas-alvo atravs da ao de anticorpos e neutrfilos, macrfagos ou clulas nulas. IgG.

Fagocitose o ato de comer realizado pelas clulas. O termo compreende vrios

processos, inclusive quimiotaxia, aderncia ingesto e digesto ede partculas.

Hapteno Molcula no protica que pode se ligar a stios especficos de Hemaglutinao Agregao de eritrcitos pr anticorpo ou vrus.

combinao de anticorpos mas no pode, pr si s, iniciar uma resposta imune.

Monocinas So produtos proticos de fagcitos mononucleares que influenciam

as atividades de outras populaes celulares.

Opsonina Substncia que se liga a partculas e facilita sua fagocitose. Pinocitose Literalmente o ato de beber realizado pelas clulas. Precipitao Agregamento de molculas de antgenos solveis pelos anticorpos
para produzir um precipitado visvel. Este contm tanto Ag como Ac.

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CINCIAS DA SADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM IMUNOLOGIA

P P G Im

PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

Cludia Valle Cabral Dias dos Santos
MESTRANDA

Laboratrio de Imunologia Molecular e Celular - LIMC Centro de Pesquisas Gonalo Moniz - CPqGM Fundao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ Salvador - BA

OBJETIVO GERAL
Produzir anticorpos monoclonais de antitcnicas amastigotas de Leishmania chagasi, visando o desenvolvimento futuro imunodiagnsticas que permitam a identificao de molculas de Leishmania especficas para o diagnstico da infeco no homem e no co.

OBJETIVOS ESPECFICOS
Testar diferentes protocolos de imunizao de camundongos com Leishmania chagasi ou seus antgenos, visando a obteno de melhor resposta humoral anti-amastigota

Produzir hibridomas utilizando esplencitos do animal que melhor respondeu s imunizaes

PROTOCOLO DE PURIFICAO DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

sacrifcio e coleta de bao

separao de clulas

lise de hemcias em NH4Cl a 0,85 %

hamster infectado

lavagem de amastigotas e armazenamento - 70oC

purificao de amastigotas em gradiente de Percoll

GRAU DE PURIFICAO DE AMASTIGOTAS

Imprint do bao Amastigotas aps gradiente de Percoll

O melhor rendimento foi de 3.4 x 10 9 parasitos por hamster

ESTRATGIA DE PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI - AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

ELISA para amastigotas promastigotas metacclicos vivos

fuso
seleo das clulas secretoras de anticorpos antiamastigotas clulas ps-fuso mieloma SP2/0
+

seleo do animal melhor respondedor

esplencitos

RESUMO DA PRODUO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI- AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

Nmero de poos Nmero de poos Nmeros de poos testados com crescimento positivos para L. chagasi utilizados de clulas em ELISA 1920 141 (7,3%) 05 (3,6% dos poos positivos)

CLONAGEM DE CLULAS HBRIDAS

Diluio limitante Distribuio em placas de 96 poos com cinco ou uma clula/poo

Seleo dos poos contendo apenas uma colnia

Expanso desses clones

CARACTERIZAO POR WESTERN BLOT DOS ANTGENOS DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

a b cd e f

g h i

a b c

d e

g h i

112KDa 84KDa 53KDa 35KDa 29KDa 21KDa

a. 4B6E11; b. 4B6F7; c. 5A9H8; d. 5A9H10; e. 5A9H11; f. 5A9H12; g. 9A7E12; h. salina; i. anticorpo monoclonal irrelevante. A- antgeno sob condies no desnaturantes; B- antgeno sob condies desnaturantes

CLASSES E SUBCLASSES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS E PESO MOLECULAR DAS PROTENAS DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

Clone

Peso molecular 60 kDa 35 e 68 kDa

Classe e subclasse de imunoglobulinas

9A7E12 4B6F7 5A9H8

 A inoculao de camundongos com promastigotas metacclicos vivos de Leishmania chagasi demonstrou ser de fcil execuo e eficiente na obteno de resposta imune humoral anti-amastigota de Leishmania chagasi. Um anticorpo monoclonal obtido pertencente subclasse de imunoglobulina IgG2a foi espcie e estgio especfico, reconhecendo dois antgenos de 35 e 68 kDa de protena nativa apenas das formas amastigotas de Leishmania chagasi. Outro anticorpo monoclonal da classe IgM reconheceu uma banda de 60 kDa de antgeno de amastigotas e promastigotas de quatro diferentes espcies do gnero Leishmania.

Merci !