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Chimie molculaire et supramolculaire des sucres

Serge David
Universit Paris-Sud, Orsay

Chimie molculaire et supramolculaire des sucres


Introduction chimique aux glycosciences

S A V O I R S

A C T U E L S

Interditions / CNRS ditions

Lillustration de la couverture est la formule dun acide sialosyl sialique, disaccharide atypique, prsent dans ltoile de mer Asterias rubens (daprs A. Bergwerff, S. Hulleman, J. Kamerling, J. Vliegenthart, L. Shaw, G. Reuter et R. Schauer, Polysialic Acid,from Microbes to Mun, ouvrage collectif publi sous la direction de J . Roth, U. Rutishauser et E A . Troy II, Birkhauser Verlag,Ble, 1993, page 201).

O 1995, Interditions, 7, rue de lEstrapade, 75005 Paris

et CNRS Editions, 20/22, rue Saint-Amand, 75015 Paris. Tous droits de traduction, dadaptation et de reproduction par tous procds rservs pour tous pays. Toute reproduction ou reprsentation intgrale ou partielle, par quelque procd que ce soit, des pages publies dans le prsent ouvrage, faite sans lautorisation de lditeur est illicite et constitue une contrefaon. Seules sont autorises, dune part, les reproductions strictement rserves lusage priv du copiste et non destines une utilisation collective, et dautre part, les courtes citations justifies par le caractre scientifique ou dinformation de luvre dans laquelle elles sont incorpores (art. L. 122-4, L. 122-5 et L. 335-2 du Code de la proprit intellectuelle). Des photocopies payantes peuvent tre ralises avec laccord de lditeur. Sadresser au : Centre franais dexploitation du droit de copie, 3, rue de Hautefeuille, 75006 Paris. Tl. (1) 43.26.95.35.

ISBN 2 7296 0528 2 ISBN 2 271 05254 8

Table des matires

Introduction 1 Configuration des monosaccharides 1.1 Le glucose 1.2 Autres configurations des sucres 1.3 Tautomrie 1.3.1 Gnralits 1.3.2 Chromatographie en phase vapeur 1.3.3 Chromatographie liquide sous haute pression (HPLC) 1.3.4 Dichrosme circulaire 1.3.5 Rsonance magntique nuclaire 1.3.6 Rsultats et discussion 1.4 Cintique de la mutarotation 1.5 Considrations gnrales sur ces mesures Rfrences 2 Conformation des monosaccharides et de leurs drivs 2.1 Symboles de conformation : pyranoses 2.2 Conformations ltat solide 2.3 Conformation en solution : rsonance magntique nuclaire du proton 2.4 Gnralits sur les facteurs de conformation des monosaccharides 2.5 Effet de coplanar& 2.6 Effet anomrique 2.6.1 Donnes exprimentales 2.6.2 Origine de leffet anornfique 2.7 Conformation des pentopyranoses 2.8 Conformation des hexopyranoses et de leurs drivs 2.9 Furanoses 2.10 Polyols non cycliques Rfrences

1 4 4 7 10 10 11 11 12 13 14 15 18 19

20
20 21 22 26 27 30 30 32 37 39 41 43 44

3 Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines


3.1 Dfinitions relatives aux glycosides (O-glycosides) 3.2 Synthse des alkyl glycosides par la mthode de Fischer 3.2.1 Aspect exprimental 3.2.2 Rle prparatif et limites dutilit

45
45 46 46 47

VI

Table des matires

3.3 Autres mthodes de prparation des glycosides 3.3.1 Activation du carbone anomrique 3.3.2 Aryl glycosides 3.4 Anhydropyranoses et anhydrofuranoses caractre actalique 3.5 Proprits chimiques des glycosides 3.5.1 Hydrolyse en milieu acide 3.5.2 Hydrolyse et transfert enzymatiques 3.5.3 Stabilit des glycosides dans les conditions neutres ou alcalines. Rle protecteur 3.6 Glycosylamines et nuclosides 3.6.1 Gnralits 3.6.2 Glycosylamine 3.6.3 Nuclosides Rfrences

49 49

50 51 54 54 58
61 62 62 63 66 69

4 Nomenclature
4.1 4.2 Introduction Nomenclature des aldoses 4.2.1 Noms courants des sucres et symboles de configuration 4.2.2 Sucres dsoxygns 4.2.3 Sucres substitus par NRR, F, C1, Br, I, N,, alkyl-S et phnyl-S 4.2.4 Drivs substitus sur loxygne 4.2.5 Formes acycliques 4.2.6 Formes cycliques 4.2.7 Alditols 4.2.8 Acides aldoniques 4.2.9 Acides uroniques 4.2.10 Actals cycliques 4.2.11 Actals et thioactals 4.2.12 Anhydrides intramolculaires 4.3 Ctoses 5.1 Drivs fonctionnels 5.1.1 Importance des ractions de protection 5.1.2 thers 5.1.3 Drivs silyls 5.1.4 Esters dacides organiques et carbonates 5.1.5 thrification et acylation slectives. Drivs organostanniques 5.1.6 Phosphates 5.1.7 Hydrognosulfates 5.2 Actals 5.3 Oxydations en carbonyle

71 71 71 71 73
74 74 75 75 76 77 77 77 78 78 79

5 Ractions des hydroxyles

80 80
80 80 82 82 83 85 86 86 89

Table des matires

VI1

5.3.1 Hydroxyles isols 5.3.2 Oxydation des diols en hydroxyctones 5.3.3 Utilit synthtique des sucres carbonyls 5.3.4 Oxydations catalytiques sur platine 5.4 Periodates alcalins et ttraactate de plomb 5.5 Dsoxygnation Rfrences

89 90 91 92 92 94 95

6 Ractions du carbonyle et de lhmiactal


6.1 Introduction 6.2 Oxydation par les halognes 6.3 Ractifs nuclophiles 6.3.1 Borohydrure de sodium 6.3.2 Thiols 6.3.3 Cyanures alcalins 6.3.4 Ractifs du type de Wittig et organomtalliques 6.4 Ractions impliquant la dprotonation en a du carbonyle. Les sucres c o m e aldols 6.5 Fonctionnalisation radicalaire au centre anornrique Rfrences

97 97 97 98 98 98 1O 0 101
103 106 107

7 Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis 7.1 Dplacement des hydroxyles alcooliques 7.2 poxides 7.3 Les ions acyloxoniums cycliques 7.4 Dplacements nuclophiles avec participation 7.5 Sucres non saturs 7.5.1 Glycals 7.5.2 Raction de Ferrier 7.6 Sucres ramifis 7.6.1 Gnralits 7.6.2 Famille > C (OH)-R 7.6.3 Famille > CH-R 7.6.4 Condensation aldolique Rfrences

108
108 112 114 117 117 117 119 120 120 121 122 125 125 127 127 127 129 132 133 133 135 140

8 Les sucres en synthse chirale


8.1 Induction asymtrique 8.1.1 Allylation et aldolisation nantioslective 8.1.2 Cycloaddition 8.1.3 Raction de Ugi 8.2 Les sucres comme prcurseurs de squences dans les synthses de produits naturels 8.2.1 Considrations gnrales 8.2.2 Synthse partir des sucres Rfrences

VI11

Table des matires

141 9 Les oligosaccharides : Configuration et analyse 141 9.1 Introduction, nomenclature 143 9.2 Effet exoanomrique 147 9.3 Dtermination des squences par les mthodes chimiques 147 9.3.1 Hydrolyse acide 147 9.3.2 Hydrolyse enzymatique 148 9.3.3 Analyse par mthylation 149 9.4 Dtermination des squences par les mthodes spectroscopiques 149 9.4.1 Spectromtrie de masse f.a.b 151 9.4.2 Technique dinjection dite << lectrovaporisation D 152 9.4.3 Rsonance magntique nuclaire du proton 9.5 Efficacit potentielle des oligosaccharides pour le stockage 156 et le transport de linformation 1.56 Rfrences 157 10 Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides 157 10.1 Ractions des oligosaccharides 159 10.2 Couplage osidique non enzymatique : principes gnraux 161 10.3 Pratique du couplage osidique 161 10.3.1 Ractions avec participation 162 10.3.2 Ractions SN2 163 10.3.3 Ractions faisant intervenir des intermdiaires cationiques 165 10.3.4 La cration de la liaison quatoriale-axiale-l,2 10.3.5 Glycosidation cis- 1,2 sans participation avec les sulfoxides 165 166 10.3.6 Effet de la configuration de laccepteur 169 10.3.7 Thiooligosaccharides 169 10.4 Mthodes enzymatiques 169 10.4.1 Raction de la galactosyltransfrase 173 10.4.2 Gnralisation 174 10.4.3 Glycosidases 176 10.5 Fluorohydrolyse 176 Rfrences 177 11 Associations avec anions, cations et molcules inorganiques 177 11.1 Association avec des cations mtalliques 177 11.1.1 Introduction 177 11.1.2 Structures ltat solide 179 11.1.3 Complexes en solution 182 11.2 Notions sur la structure de leau liquide 182 11.2.1 Introduction 182 11.2.2 Structure de leau 184 11.3 Cyclodextrines 187 11.4 Amylose 188 11.5 Complexes iods 11..5. 1 Introduction 188

Table des matires

IX 188 189 190 191 191

11.5.2 Complexes de la-cyclodextrine 11S.3 Le complexe (paranitrophnyl a-maltohexaoside),. Ba (1J2.27 H,O 11.5.4 Complexe iod de lamylose 11.6 Interaction des sucres avec leau liquide 11.6.1 Importance du problme

11.6.2 Le modle dhydratation strospcifique des hexopyranoses 191 193 11.6.3 Principe des mesures 197 Rfrences

12 Acides sialiques et oligosaccharides sialyls 12.1 tat naturel 12.2 Prparations des acides sialiques 12.3 Couplage chimique 12.4 Couplage enzymatique 12.5 acides polysialiques 12.5.1 Introduction 12.5.2 Acides polysialiques microbiens 12.5.3 La molcule dadhsion des cellules nerveuses, N-CAM Rfrences 13 Glycoconjugus 13.1 Glycolipides 13.1.1 Dfinitions, isolement 13.1.2 Glycolipides animaux 13.1.3 Gangliosides 13.1.4 Glycolipides vgtaux 13.2 Glycoprotines 13.2.1 Gnralits 13.2.2 Protines glycosides 13.2.3 Protines glycosaminides 13.2.4 Problmes conformationnels 13.3 Glycosaminoglycanes et protoglycanes 13.3.1 Donnes gnrales 13.3.2 Chanes priodiques ou quasipriodiques Rfrences 14 Structure de quelques complexes sucre-protine cristalliss 14.1 Gnralits. Le complexe ABP-L-arabinose 14.1.1 Protines et sucres 14.1.2 Le complexe protine ABP-L-arabinose 14.2 Complexe du maltose et de la protine de transport de la maltodextrine 14.2.1 Description de la protine complexante 14.2.2 Complexation des maltodextrines 14.2.3 Mode de complexation du maltose

198
198 20 1 203 205 209 209 209 210 212

213
213 213 214 214 215 216 216 216 218 220 222 222 223 224

225
225 225 226 228 228 229 230

Table des matires

14.3 Le complexe dune lectine et dun octasaccharide biantennaire Rfrences

232 235

15 Antignes et anticorps. Lectines 15.1 Avertissement 15.2 Antignes et anticorps 15.3 La raction immunochimique in vitro 15.3.1 Haptnes 15.3.2 Physicochimie de la raction immunochimique 15.4 Les lectines : dfinitions, extraction 15.4.1 Structure 15.4.2 Spcificit 15.4.3 Description abrge de quelques lectines 15.4.4 Proprits biologiques des lectines 15.4.5 Comparaison des anticorps anti-sucres et des lectines Rfrences 16 Les antignes de groupes sanguins : substances A, B, H et connexes 16.1 Les antignes A, B et H 16.I. 1 Gnralits. Polymorphisme 16.1.2 Types de jonction. Le systme Lewis 16.2 Le systme Ii et les effets de ramification 16.3 Synthse des dterminants oligosaccharidiques 16.3.1 Dterminants ABH 16.3.2 Dterminants Ii Rfrences 17 Ractions de reconnaissance doligosaccharides importantes dans le monde vivant 17.1 Introduction 17.2 Le signal de nodulation des rhizobia 17.3 Le pentasaccharide actif de lhparine 17.3.1 Isolement de lhparine 17.3.2 Biosynthse de lhparine 17.3.3 Dgradation de lhparine 17.3.4 Le pentasaccharide actif 17.4 Marqueurs tumoraux 17.4.1 Mthode de recherche 17.4.2 Antignes tumoraux 17.5 Antignes de diffrenciation 17.6 Les slectines 17.6.1 Raction inflammatoire et slectines 17.6.2 Slectines E 17.6.3 Slectine L 17.6.4 Synthse des ligands oligosaccharidiques des slectines Rfrences

236 236 236 239 240 24 1 245 246 248 249 25 1 25 1 252 253 253 253 254 257 258 258 260 263 264 264 264 265 265 266 267 268 27 1 27 1 272 273 27 5 275 276 27 8 278 279

Table des matires

XI

18 Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et lADN ? 18.1 Donnes du problme 18.2 Les synthses du pseudo-oligosaccharide de la calichamicine 18.2.1 Voie DCBAE 18.2.2 Voie EABCD 18.2.3 Mthodes alternatives 18.3 Reconnaissance du pseudo-ttrasaccharide par lADN 18.3.1 Rupture de un ou de deux brins 18.3.2 Efficacit compare 18.3.3 Spcificit du site dattaque 18.3.4 Conclusion Rfrences

280 280 283


283 287 288 290 290 290 290 29 1 29 1

Index

293

Introduction
A persoruie ,je rie .souhtrite nuturit ut7e chute ou uiie attetife fi)rc.ee LIU pont-levis de Knipplhro etc... cornirie N ces enrug&.s geri.s dufiiiire pieiris dune ir!ftiit cirrirreprises. cilors que r i o u s nutres, qunritl le poiit .ye live, trouiwis l i ioie horirie o c w s i o r i tie choir cluns tios prises. 1... I Certes il est dur tlhuhiter uti puys s c i i i s jartiuis de soleil sur 1 horimi, rnuis il nest guPre tlrlc> i i o r z plus tlhtrhiter LUI etirnit o le soleil vous tombe .si verticnleitierit sur le cr&e quil tie i i o i i s pirrtiet, tii N r i o s eiitoiirugc>s,de jeter quelque oinbre.

Sci-en Kierkegaard
Jourricil (E.xfrciit.s), 14 juillet I837 (traduit du danois par

Knud Fei-lov et Jean-Jacques Gatenu), Gallimard, I942

Le dcoupage des connaissances adopt dans cet ouvrage nest pas conforme 2 la tradition des livres de chimie organique. Manuels et traits dcrivent essentiellement les techniques contemporaines de construction de liaison covalente, avec quelques dveloppements sur les questions de conformation et, parfois, une brve allusion aux problmes du monde vivant. Certes la chimie organique synthtique des sucres a fait des progrs considrables au cours des dernires dcennies. La mise au point de nouvelles techniques et lintroduction de nouveaux concepts ont permis dtendre a cette famille la plupart des grandes ractions. Des efforts intenses ont permis damliorer notablement le pronostic de la raction de glycosidation, souvent inefficace avec la mthode ancienne. Aussi lauteur a-t-il consacr la moiti du prsent ouvrage 2 ces aspects synthtiques. Cependant, avec lvolution actuelle des ides sur la recherche, limiter un ouvrage sur les sucres la description des meilleures mthodes de construction de liaisons covalentes carbone-carbone et carbone-oxygne revient h laisser tomber ia moiti du sujet. I1 se trouve quun des axes privilgis de la chimie organique contemporaine est Itude dassociations entre molcules qui, tout en tant relativement stables, ne font pas intervenir de liaisons covalentes. Certaines de ces recherches se dveloppent de faon totalement autonome par rapport au monde vivant. Or on rencontre prcisment dans la chimie des oligosaccharides (voir le chapitre 9) un nombre important dassociations de ce type, essentiellement avec des rcepteurs macromolculaires prsents dans les cellules vivantes, mais aussi avec des difices minraux. Certes la complexit des rcepteurs organiques naturels rend lanalyse des modes de liaison ez conjecturale dans la majorit des cas, mais Iimportance des phnomnes du monde vivant qui en dpendent justifie aux yeux de

Introduction

lauteur dy consacrer la moiti de louvrage, ou presque. Faute de quoi, il aurait pass sous silence un domaine scientifique en expansion rapide. Enfin, de tout temps, les chimistes des sucres ont t trs proccups de chimie physique. Que lon songe la tentative de mise en ordre de pouvoirs rotatoires, avec les moyens de lpoque, que reprsentent les rgles de Hudson. Si elles sont presque oublies - nous nen dirons rien - lesprit demeure, et la plupart des chimistes des sucres, bien quessentiellement penchs sur des problmes de synthse, jugent ncessaire un examen attentif de la physicochimie de leurs molcules, avec des moyens modernes, ventuellement les calculs ab initio et MM.. . Le lecteur trouvera, ici et l, et plus particulirement aux chapitres 1, 2 et 9, une slection des rsultats modernes. Lauteur espre que le panorama gnral dessin dans son livre reflte fidlement lambiance des principaux laboratoires de chimie des sucres et latmosphre des congrs et colloques spcialiss dans ce domaine. Nous sommes en prsence dune science qui ne sest pas construite partir dun arsenal technique particulier, mais dune famille assez homogne. On a propos le terme de glycoscience. I1 sagit dune dmarche scientifique intressante en elle-mme, peut-tre un modle pour dautres sries, indpendamment de ses prolongements manifestement anthropocentristes. On pourra objecter lauteur quun trait multi-auteur rpondrait mieux son objectif. Or ce livre nest pas un trait, mais une tentative pour situer un ensemble de travaux dans une perspective exacte par des exemples caractristiques. Les rfrences ne constituent pas un palmars de dcouvertes, mais lindication dune documentation supplmentaire daccs commode, ou celle dexpriences valeur pdagogique. Nous ajouterons que la rdaction par un seul auteur permet un traitement homogne. Lossature de louvrage est la chimie organique, ce qui nous semble justifi puisque, tt ou tard, toutes ces interactions seront dcrites en termes molculaires. I1 peut y avoir des justifications plus pratiques : par exemple, selon une information gnrale 1, une socit amricaine de biotechnologie particulirement performante a d nanmoins se rapprocher dun grand groupe industriel en mesure de laider sur le plan de la chimie organique. Pour ce qui a trait la relation des sucres au monde vivant, nous avons mis laccent sur des molcules distribution trs large, souvent universelle, avec une attention particulire aux mcanismes gnraux. Cest la vision de la biochimie, qui nous a amen exclure des domaines chatoyants, comme celui des antibiotiques aminoglycosidiques. Mais nous navons pas dsir faire un manuel de biochimie des sucres et, par exemple, nous ne parlons pas de llaboration, si caractristique, de certaines units oligosaccharidiques des glycoconjugus I*]. Nous nous sommes intress avant tout aux problmes de lhomme et des animaux suprieurs. Cette restriction nous a amen h ne pas traiter, sauf exception, la structure si complexe et les problmes dune grande importance pratique des oligosaccharides microbiens. Les deux rfrences cites concernent deux articles parmi les Nous terplus rcents de deux coles europennes actives dans ce domaine minerons ces considrations gnrales par un avertissement pratique : les dessins sont le plus souvent schmatiques et ne doivent pas tre utiliss comme une sour13341.

Introduction

ce de donnes quantitatives. Pour celles-ci, le lecteur devra utiliser les nombreux tableaux de chiffres prsents dans louvrage. La biosynthse des protines suit le code gntique. Les analogues des protines dans le domaine des sucres sont les oligosaccharides. La jonction entre les units monosaccharidiques est catalyse par des enzymes, les glycosyltransfrases, videmment codes. Mais, contrairement ce qui se passe avec les acides amins, on na jusqu prsent aucune indication quil existe un code qui organise les squences des monosaccharides dans les oligosaccharides. Simplement (si lon peut dire !), les glycosyltransfrases doivent se manifester au bon moment et au bon endroit. Est-ce que cela entrane un certain flou dans la synthse? Lopinion diffuse a circul dans les cercles de spcialistes quun certain dsordre pourrait bien tre avantageux pour un organisme, en temprant lexcs de rigueur du code gntique. A notre connaissance, cette ide na pas encore t labore. I1 reste que nombre de ces enchanements ont une allure particulirement rbarbative, et que le lecteur venant du monde color de la chimie des substances naturelles aura limpression dentrer dans une contre aride et dsordonne, mais cest que le sens de ces structures ne se dvoile que lentement, et cela suffit les rendre passionnantes. Lauteur remercie le professeur Andr Lubineau pour sa collaboration la rdaction du paragraphe 17.6 consacr aux slectines et leurs ligands, et aux paragraphes 11.2 et 11.6 qui traitent de la relation intime, si vidente tout le monde, et pourtant encore mystrieuse, entre le sucre et leau. Laide de MIne Claudine Au&, directeur de recherche au CNRS, pour toutes les questions de chimie enzymatique prparative a t vivement apprcie. Dune faon gnrale, limmersion de lauteur au milieu dun groupe actif lui a grandement facilit la collecte et la vrification de linformation. Enfin lauteur remercie MmeTen Feizi, du Medical Research Council, Harrow (Angleterre), pour son aide la rdaction des paragraphes 17.4 17.6 et le docteur Seni-tiroh Hakomori pour son aide llaboration du chapitre 16.

RFRENCES
[ I 1 P. J.

Raugel, La Recherche, 262 (1994) 224-233. [2] V. N. Shibaev, Adv. Curbohydr: Chem. Biochem., 44 (1986) 277-339. [3] L. Kenne, B. Lindberg, M. Matibubur Rahman et M. Moyihuzzaman, Curbohydr: Res., 243 (1993) 131-138. [4] E I. Auzanneau, M. Mondange, D. Charon et L. Szabo, Curbohydr: Res., 228 (1992) 37-45.

CHAPITRE 1

Configuration des monosaccharides

1.1 LE GLUCOSE
Le glucose est extrmement soluble dans leau : on peut en dissoudre 0,5 kg dans 250 mL deau chaude. Laddition dacide actique cette solution entrane une prcipitation lente de cristaux. Cest une des varits tautomres, dsigne en nomenclature officielle par le nom << a-D-glucopyranose D dont la signification exacte apparatra dans la suite du chapitre. La configuration de ce solide est connue avec une grande prcision grce lassociation des mthodes de diffraction de rayons X et de neutrons, qui donnent les 23 longueurs de liaison, les 42 angles de valence et les 68 angles didres de la molcule solide[]. Dans la reprsentation schmatique 1.1 de cette configuration, les carbones 2 et 3 de la chane carbone sont supposs en avant de la molcule, les carbones 1 et 4 sont dans le plan du papier. Les autres carbones et loxygne cyclique sont en arrire. On reconnat un cycle oxane (ttrahydropyrane) sur lequel sont greffs trois fonctions alcool secondaire en orientation quatoriale, une chane latrale portant une fonction alcool primaire et enfin un hydroxyle hmiactalique port par le carbone 1. Cet hmiactal est intramolculaire, provenant de laddition de loxygne port par C(5) sur une fonction aldhyde. A partir dun chantillon quelconque de glucose, on peut prparer un isomre du compos 1.1 par le protocole suivant : recristallisation dans lacide actique, dissolution des cristaux dans leau glace (100 mL pour 100 g), filtration et addition dthanol (0,5 L) la solution filtre, ce qui amne une prcipitation rapide. Le solide obtenu a la configuration 1.2 ltat solideC2]. La seule diffrence avec la molcule 1.1 est dans lorientation de lhydroxyle hmiactalique. La molcule 1.2 est tout quatoriale. I1 y a donc une grande simplicit sous-jacente dans la configuration du D-glucose malgr son aspect rbarbatif pour le dbutant. Cette observation peut tre utile comme point de dpart pour la mmorisation des structures de sucres. On appelle la molcule 1.2 << PD-glucopyranose . Les isomres 1.1 et 1.2 sont en quilibre tautomrique en solution aqueuse, selon lquation (1.1).

(1.1)

a-D-glucopyranose >>

<<

P-D-glucopyranose >>

Le glucose

Ainsi le pouvoir rotatoire dune solution aqueuse de lisomre a-D, qui cor+ 112 immdiatement aprs la dissolution dcrot-il en quelques respond [a]iO heures jusqu la valeur 52,7. Rciproquement le pouvoir rotatoire de lisomre 0-D crot de 18,7,valeur la dissolution jusqu la mme valeur dquilibre. Une = 38/62. Le compos tout quatorial rgle de mlange permet de calculer [a]/[fl domine, mais nous verrons au paragraphe 2.6 quil faut sabstenir dy voir la confirmation des rgles de lanalyse de conformation classique. Ce sont ces expriences qui ont permis la premire observation de lquilibre tautomrique (1.1) qui, pour cette raison, a gard le nom de mutarotation. Le spectre de RMN du proton dans leau lourde volue de faon parallle. Le proton H-1 port par C( l), dblind par deux oxygnes gmins, donne un signal champs faible, spar du groupe des autres protons, facile reprer. Immdiatement aprs la dissolution, on observe sur le spectre de la-D-glucopyranose un doublet 3J4Hz, d un couplage quatorial-axial. Immdiatement aprs la dissolution, on observe sur le spectre du 0-D-glucopyranose dans les mmes conditions un doublet large 3J8Hz, d un couplage trans diaxial. On observe lquilibre la superposition de ces signaux (Fig. 1.1). En fait, cette solution aqueuse contient dautres tautomres, mais en concentration beaucoup trop faible pour se manifester en RMN de routine. Nous ngligerons provisoirement leur existence. I1 doit tre clair que les tautomres 1.1 et 1.2 sont deux tres chimiques distincts dont la diffrence ne se manifeste pas seulement dans les proprits physiques, mais aussi dans la ractivit chimique et

Anomre a
H(l).quatonal J 4HZ

Anomre p H ( l ) axial
J

8Hz

0,3? H
I
I

0,67 H
p.p.m.
I I I I I I
I

5,2

5,l

5,O

4,9

4,8

4,7

4,6

43

4,4

Figure 1.1 Signal RMN des protons anomriques H-1 des a- et fi-D-glucopyranoses.

Configuration des monosaccharides

WC -

YHO OH
C-H

HO-

1.1

1.2

1.3

HO-C-H
HO-

YHO
C-H

W-? i C
HO-C-H

YoOH
I

) I -

CHO F
1.4

W -OH

-OH

FF -OH
CH,OH
1.5 1.6

CH,OH

F F

F F CI\IHCOCH,
HO-C-H

Yo
I

CH,CONH-

C-H

YHO
I

F F C-NHCOCH,
HO-C-H HO-

HO-C-H

FF -OH FF -OH
!H20H

F F -OH
CH20FI
1.9

-H

1.7

1.8

enzymatique. Cependant on voit que le carbone C(1) se distingue des autres par sa configuration instable. Cest pourquoi on lui a donn le nom particulier de curhone unomrique. On a traditionnellement reprsent le glucose par le parent aldhydique 1.3, o il ny a plus que des configurations stables. Muis ce tuutomre n est prsent, en toute circonstunce, qu une concentration infime. Laldhyde 1.3 est dessin avec la convention de Fischer. Les hydroxyles situs au-dessous du plan moyen de loxane sont droite, lhydroxyle situ au-dessus est

Autres configurations de sucres

gauche. I1 y a une difficult de passage pour le carbone 5 li la chane latrale. Le lecteur devra se souvenir que, dans la convention Fischer, les valences verticales sloignent et les valences horizontales se rapprochent de lobservateur. I1 vrifiera alors que lon peut appliquer les atomes lourds du D-glycraldhyde 1.4 sur la portion correspondant aux carbones 4, 5 et 6 des oxanes 1.1 et 1.2.

1.2 AUTRES CONFIGURATIONS DE SUCRES


I1 y a quatre carbones asymtriques dans la configuration 1.3, il y a donc Z4 = 16 isomres, qui ont chacun leur nom. Le lecteur trouvera un tableau de ces sucres au chapitre 4, consacr la nomenclature. On retrouve la majorit de ces configurations sous forme drive dans les cellules vivantes. Pour nous en tenir aux constituants gnraux universellement rpandus, nous citerons le D-mannose 1.5, et le D-galactose 1.6, pimres respectivement en 2 et 4 du D-glucose. Nous rencontrerons aussi frquemment trois sucres o lhydroxyle en C-2 a t remplac par un groupement actamido, dsigns dans la pratique par les noms N-actylglucosamine 1.7, N-actylmannosamine 1.8, et N-actylgalactosamine 1.9. On observe aussi des molcules partiellement dsoxygnes, comme le fucose 1.10. Tous ces sucres fonction aldhyde latente ont reu le nom gnral daldoses. Mais le carbonyle latent peut aussi tre ctonique. On a alors les ctoses, tel le fructose 1.11. Tous les sucres comportant une chane de six carbones non ramifie ont reu le nom gnral dhexoses. 1 1existe aussi des sucres cinq carbones, les pentoses, dont deux reprsentants, le D-ribose 1.12, et le dsoxyribose (en nomenclature correcte, 2-doxy-D-rythro-pentose) 1.13, dpassent infiniment les autres en importance. Un sucre neuf carbones, lacide sialique 1.14, rassemble sur la mme chane un carboxyle, un carbonyle ctonique, cinq hydroxyles alcooliques et une fonction amide. On numrote les chanes de sucres dans le sens qui attribue le chiffre le plus bas au carbone du carbonyle. Toutes ces molcules font partie du groupe des monosacchu rides. A lexception du fucose, tous ces sucres prsentent sur le carbone pnultime la mme configuration que le carbone central du D-glycraldhyde. Ceci sex-

FHO HO-C-H
W COH

CH,OH
CO

CHO

HO-C-H *-OH
W -OH

eC -

OH

F F

W -OH

f k-OH
CH,OH
1.12

CH,OH
1.10
1.11

F F

Configuration des monosaccharides

CHO

WC-H
W-OH

YH CO
H-C-H
I

1.13

1.14

1.15

plique aisment, car les cellules vivantes les fabriquent tous partir du D-glycraldhyde, et le trajet biosynthtique ne comporte aucune tape une rupture entre le carbone central du D-glycraldhyde et ses quatre substituants. La figure 1.2 schmatise l'arbre gnalogique de ces monosaccharides. Le D-fructose rsulte de la condensation aldolique de la dihydroxyactone (partenaire nuclophile) sur le D-glycraldhyde. I1 conduit soit au D-glucose soit au D-mannose par des modifications sur C(1) et C(2). Le D-glucose est pimris sur C(4) pour donner le D-galactose. Le mme D-glucose perd C( 1) et subit quelques transformations sur C(2) et C(3) pour donner le D-ribose (il existe une autre voie biosynthtique, le

Acide sialique

N -Actylmannosamine

D-Glycraldhyde

D-Ribose

N -Actylglucosamine

D-Fructose

D-Glucose

N -Actylgalactosamine

D-Mannose

D-Galactose

Figure 1.2 Filiation des principaux sucres de la srie D.

Autres configurations de sucres

cycle pentose-heptose, plus complique, mais qui nimplique pas le carbone pnultime). Le dsoxyribose est fabriqu par dsoxygnation du D-ribose sur C(2). Lamination du D-fructose, suivie dactylation donne la N-actylglucosamine, pimrise en N-actylgalactosamine et N-actylmannosamine. La condensation aldolique de 1acide pyruvique sur la N-actylmannosamine donne lacide sialique. Seul parmi les sucres 1.5 1.14, le fucose prsente la configuration du L-glycraldhyde sur son carbone pnultime. Le prcurseur biologique est le D-mannose. I1 se forme un driv de structure 1.15 intermdiaire. Celui-ci subit des pimrisations en 3 et 5, conformes lintuition du chimiste organicien, puisque ces carbones sont contigus un carbonyle, et la rduction en alcool du carbonyle. I1 est peut-tre significatif quon observe aussi la configuration du L-glycraldhyde sur le carbone pnultime dautres sucres naturels dsoxygns en C(6). Pour viter toute erreur dinterprtation, on doit souligner que les substrats rels des enzymes dans ces voies biosynthtiques ne sont pas les sucres libres, mais des phosphates, ou des phosphates complexes. Toutefois, ceci ninfirme en rien nos dductions. Quittons la biochimie pour la gomtrie. On a pris lhabitude de classer le D-glucose et ses quinze isomres de configuration stable en deux groupes de huit : la srie D, o C(5) prsente la configuration du D-glycraldhyde et la srie L, o C(5) prsente la configuration du L-glycraldhyde. On fait prcder le nom des sucres de la srie D du prfixe D : D-glucose, D-mannose, etc. Les nantiomres de ces hexoses, qui appartiennent la srie L sont appels L-glucose, L-mannose, etc. Enfin, lorsque dans un texte, ou un nom de driv de sucre en nomenclature officielle (voir le chapitre 4) on veut dsigner la configuration, par opposition la molcule, on emploie les symboles en italiques D-manno, D-gluco, D-galacto, L-manno, etc. drivs des noms courants des sucres. Ces conventions stendent sans difficult aux pentoses. I1 y a huit pentoses, deux deux nantiomres, rpartis dans deux sries, D et L, selon que le carbone pnultime a la configuration du D-glycraldhyde ou la configuration oppose. La configuration du pentose D-ribose se dsigne par D-ribo. On remarquera que les mots << srie D >> et G srie L >> ne recouvrent pas la mme ralit biologique suivant quil sagit de sucres ou dacides amins. Les acides amins des protines, une vingtaine en tout, appartiennent exclusivement << la srie L des acides amins . Les squences des oligosaccharides, architectures parallles aux polypeptides dans les tissus (mais non directement codes), peuvent tre bties aussi bien de sucres D que de sucres L, quoique les premiers prdominent en gnral. On peut suggrer une explication : le carbone des acides amins dont la configuration dtermine la srie est directement li aux deux fonctions, amine et carboxyle, directement impliques dans la liaison peptidique. En revanche, le carbone pnultime des sucres, dont la configuration fixe la srie, est plutt passif dans la cration de la liaison entre monosaccharides, dite glycosidique.

10

Configuration des monosaccharides

1.3 TAUTOMRIE 1.3.1 Gnralits


Lexamen de la formule de laldhyde 1.3 laisse prvoir a priori lexistence de six tautomres. Nous avons dj rencontr les pyranoses 1.1 et 1.2, qui rsultent de lattaque par loxygne 0-5 de lune ou de lautre des faces de laldhyde prochiral 1.3. Mais nous navons pas de raison dexclure la possibilit dattaque par loxygne 0-4, avec formation de deux tautomres comportant un cycle cinq lments, 1.16 et 1.17. La stabilit dun cycle cinq lments nest pas trs diffrente de celle dun cycle six lments. A ce stade, nous allons terminer lexplication des termes introduits dogmatiquement au dbut du chapitre. Les sucres cycle oxane (ttrahydropyrane) sappellent des pyranoses, ceux cycle oxolane (ttrahydrofurane) sappellent des furanoses. Le symbole a est dfini par rfrence au carbone pnultime. Une explication simple de cette convention repose sur la considration de lhydrate du carbonyle, tel celui 1.18 correspondant au D-glucose. Sur le papier, on le transforme en furanose ou pyranose en remplaant lun des hydroxyles ports par C( 1) par loxygne dune fonction alcool porte par C(4) ou C(5). Si lhydroxyle qui reste est formellement cis par rapport loxygne du carbone pnultime, lanomre est dit a. On voit que 1.16 et 1.17 sont respectivement la- et le fi-D-furanose. Le cas des sucres plus de six carbones est trait au paragraphe 4.2.6. I1 y a aussi lieu denvisager la prsence de laldhyde libre dans le milieu et de son hydrate 1.18. car on sait que les hydrates des aldhydes a-hydroxyls sont relativement stables. En fait, tous ces tautomres existent dans les solutions aqueuses, mais le plus souvent, certains dentre eux sont prsents des concentrations trop faibles pour tre visibles sans techniques sophistiques. Par exemple, dans le cas du D-glucose, les tautomres autres que les a - et P-D-pyranoses ne sont prsents quen quantit insignifiante. Le problme de la composition tautomrique lquilibre des solutions de sucres, gnralement aqueuses, a suscit beaucoup dintrtL3].

H CH,OH CH,OH HO -CI


I

OH

WC-OH HO-C-H

OH

I OH
1.17

*&-OH

W -OH
kH.OH

1.16

1.18

Tautornrie

11

Contrairement la tradition, qui donne aux mesures physiques la prsance sur lisolement, nous allons traiter dabord des mthodes sparatives, parce quelles font appel des techniques trs fondamentales de la chimie des sucres. Reconnaissons cependant quelles ne sont pas les plus puissantes dans le prsent contexte. Bien sr, il ne faut pas que lisolement dun tautomre modifie apprciablement lquilibre. On utilisera donc des solvants o la mutarotation est lente, des ractions basse temprature et des ractions de drivation aussi rapides que possible.

1.3.2 Chromatographie en phase vapeur


Les sucres cristalliss sont extrmement stabiliss dans les phases solides et liquides par un rseau de liaisons hydrogne, puisque chaque hydroxyle peut tre ventuellement donneur ou accepteur. La destruction totale du rseau nest pas possible des tempratures infrieures celle o samorce la dcomposition de la molcule. Les sucres sont indistillables. La substitution de tous les hydrognes acides par le groupement Si(CH,), supprime toute possibilit de liaison hydrogne. Laccumulation de groupements mthyle la priphrie - quinze dans le cas du glucose - donne la molcule la forme approximative dune boule limite par 45 atomes dhydrogne neutres, de cohsion minimale. Bien que considrablement alourdie, la molcule devient volatile. Ainsi le driv de la-D-glucopyranose o tous les OH sont remplacs par OSi(CH,), bout 107-1 10C sous O, 1 mm de Hg. On peut alors sparer rapidement les drivs de sucres persilyls par chromatographie gazeuse. Dans un procd habituel de silylation, on dissout le sucre (10 mg) dans la pyridine (1 mL) et on ajoute de lhexamthyldisilazane, Me,SiNHSiMe3 (0,2 mL) et du chlorotrimthylsilane (O. 1 mL). Chaque hydroxyle est silyl selon lquation (1.2). La raction est normalement complte en S mn temprature ambiante (1.2) 3 ROH + ClSiMe,

+ Me,SiNHSiMe, + 3 ROSiMe, + NH,

C1

Pour suivre la mutarotation, le prlvement (5 pL) est rapidement dissous dans la N, N-dimthylformamide et la solution refroidie dans lazote liquide. On ajoute le mlange silylant, on laisse rchauffer et on injecte dans la colonne. Celle-ci, utilise 1S0-2OO0C, contient un remplissage dun liquide point dbullition lev, adsorb sur une phase solide pulvrulente. Avec cette mthode, on peut observer autant de pics sur le chromatogramme quil y a de tautomres en quantit apprciable en solution. I1 y a un problme didentification des pics, qui ncessite lisolement des fractions en quantit apprciable.

1.3.3 Chromatographie liquide sous haute pression (HPLC)


Lexamen chromatographique direct des sucres libres, ou presque libres, en solution aqueuse, est une technique dont lutilisation est en croissance rapide en chimie des 0ligosaccharides~~1. Ladsorbant est sous forme de particules mono-

12

Configurationdes monosaccharides

D-glucose

P-P

Figure 1.3 Sparation danomres par HPLC 4C, luant : eau-actonitrile (20:80 v/v). Ordonnes : absorption 280 nm. Pour les autres

fi

D-galactose

conditions, voir le texte. Adapt daprs S. Honda, S. Suzuki et K. Kakehi, J. ChrornatogE, 291 (1984) 317-325.

50

40

30

20

10

Minutes

disperses, dont la dimension varie de 3 15 p, dans des colonnes cylindriques analytiques de 10 15 cm. On utilise aussi des colonnes prparatives de dimensions 2,5 x 30 cm. Lcoulement nest possible que sous des pressions variant de une 300 atmosphres, et la dure de lopration est de lordre de lheure. On dose les sucres dans leffluant par mesure des variations de conductance, dindice de rfraction ou dabsorption ultra-violette. Ceci impose une extrme stabilit de toutes les conditions opratoires, si bien que la colonne est entoure dlments de rgulation particulirement dispendieux. Entre autres phases stationnaires adaptes ces sparations, on a dcrit lemploi de polystyrne-divinylbenzne sulfon en sphres de diamtre strictement contrl (6 p), qui remplissent une colonne de dimensions 6 x 150 mm. Cette rsine changeur de cations est employe sous la forme Ca++.Le dbit est 0,s mL/mn. Dans ces e~priences[~], les auteurs ont dos les sucres dans leffluant par conversion en un driv absorbant 280 nm, mais cela ne serait sans doute pas ncessaire avec un matriel plus moderne. La figure 1.3 donne les enregistrements obtenus avec le D-glucose, le D-galactose et le D - m a n n ~ s e [ ~ ] . Les furanoses a et fi squilibrent trop rapidement pour quon puisse les sparer 0-4C, mais on a pu raliser cette sparation entre -25 et -4S0, avec des solvants spciaux, sur le D-galactose et le fucose.

1.3.4 Dichrosme circulaire


On a fait appel aux mesures de dichrosme circulaire pour << voir )) les tautomres carbonyls, particulirement vanescents. Les composs carbonyls prsentent une absorption vers 280 nm due la transition nx* de la double liaison C = O. Le dpart de cette bande est visible sur les solutions aqueuses de sucres, mais en raison de sa faible intensit, elle est largement masque par un paulement dune bande beaucoup plus intense. Pour cette raison, on ne peut pas mesurer directement une extinction. Mais ce qui est caractristique, cest lexistence

Tautomrie

13

Sucre

I 03 A&

2 (nm)
285 287 285 292 289 273 274

Configuration
du carbone alpha

D-ribose D-galactose D-glucose D-mannose 5,6-di--mthylD-glucose (1.19) D-fructose 1-deoxy-D-fructose(1.20)

0,469 0,0222

- 0,170
-

+ 0,0535
-

R R R S R
S

9,57

+ 6,72

+ 138

Tableau 1.1 Dichrosme circulaire de sucres en solution aqueuse 20C. Daprs L.D. Hayward et P.J. Angyal, Carbohydl: Res., 53 (1977) 13-20 (publi avec laimable autorisation dElsevier Science).

dun dichrosme circulaire dans cette rgion, cest--dire dune diffrence dextinction eG- eP = A& entre les lumires polarises circulairement droite et gauche. Ceci vient de la prsence dun carbone asymtrique contigu au carbonyle. Nous donnons une slection de rsultats dans le tableau l . l Le tableau 1.1 montre dabord que de est positif quand la configuration du centre adjacent chiral est S, et ngatif quand cette configuration est R . Cest une rgle gnrale, vrifie sur 33 exemples. On remarquera ensuite la diffrence considrable dordre de grandeur entre les sucres aldhydiques non substitus et les sucres ctoniques, ce qui suggre que la concentration du tautomre carbonyl est beaucoup plus leve avec ces derniers. On observe aussi une valeur leve avec le 5,6-di-O-mthyl-D-glucose 1.19. Ce driv ne peut pas exister sous forme pyranose, il est essentiellement en solution sous la forme furanose, mais laugmentation trs considrable de de montre que la diffrence denthalpie libre entre aldhyde et furanose est plus faible quentre aldhyde et pyranose. Le dsoxy sucre 1.20 donne pour le moment le record absolu de ces mesures. Probablement, la stabilit naturelle plus grande de la fonction ctone est renforce par la suppression de leffet inducteur de la fonction alcool. On ne peut pas utiliser ces mesures pour doser exactement les tautomres carbonyles parce quon na pas accs la valeur de A& pour les composs purs. En prenant lunit comme valeur approximative plausible, on obtient par le calcul des concentrations du mme ordre que par les autres mthodes.

1.3.5 Rsonance magntique nuclaire


On peut tendre tous les aldoses ce que nous avons dit sur le glucose. Les signaux des protons H-1 des diffrents tautomres en solution dans loxyde de deutrium apparaissent, champs faibles, bien spars des autres. La technique de

14

Configuration des monosaccharides

Figure 1.4 Spectre de RMN de I3C du [ I - 3C]-D-glucosedans leau 37C. En abscisse : dplacements en ppm partir de Me,Si. En ordonne : intensits qualitatives. Attribution des signaux : 1. aldhyde ; 2. P-D-gluco-furanose ; 3. a-D-glucofuranose ; 4. P-D-glucopyranose ; 5. a-D-glucopyranose ; 6. gem-diol. Daprs S. R. Maple et A. Allerhand, J. Am. Chem. Soc., 109 (1987) 3168-3169 (publi avec laimable autorisation de I American Chemical Society).

RMN du proton, telle quelle est utilise en routine dans les laboratoires de synthse ne rvle que les signaux de la- et du D- pyranose dans les solutions de D-glucose et D-mannose, tandis que dans les solutions de D-galactose, deux autres pics, trs peu intenses, rvlent la prsence des deux furanoses. On peut voir le signal du carbonyle sur le spectre de RMN de I3C dune solution 4M de
Pour aller au-del on utilise la RMN de 13C avec les sucres marqus par un procd synthtique sur C( l), ce qui multiplie par 100 lintensit du signal. Avec des procds daccumulation particuliers, et prolongs, on peut voir les six tautomres du D-glucose 37C. (Fig. 1.4). La disproportion des concentrations ne permet pas de les reprsenter de faon quantitativement valable, et le lecteur devra se rapporter au tableau 1.2. Lutilisation de sucres marqus sur C( I ) prsente un autre avantage galement trs important : on peut observer les couplages avec C(1) des 13C prsents en faible abondance aux autres positions du sucre, ce qui dans le cas gnral nest visible que pour les couplages J . On a donc ici un outil pour faciliter linterprtation du s p e ~ t r e [ ~ Une * ~ I .simplification supplmentaire est ralise avec la technique INADEQUATE, qui nenregistre que les signaux dus aux carbones coupls C( 1). On peut adapter les paramtres de faon ne retenir que les signaux des carbones spars de C( I ) par soit une, soit deux, soit trois liaisons, etc. Cette technique efface les signaux des carbones non coupls C( I).

1.3.6 Rsultats et discussion


Le tableau 1.2 donne la composition tautomrique de pentoses et dhexoses en solution aqueuse ainsi que du 1-doxy-fructose, 1.20, et fructofuranose 1,6-

Cintique de la mutarotation

15

Sucre

t (OC)

Pyranose P
38,8 68,O 30

Furanose a fl 0,14 2,s 6,s 13 6,s 13

Ald-

hyde

Aldhydro1

D-Glucose D-Mannose D-Galactose D-Ribose


2-Doxy -D-rythro-pentose

27
21 31

60,9 32,O 64
58,5
35 65

0,15 0,0024* 0,0045

3,s
13,s 12

0,02
0,05

31
30

213 40
2,s

Fructose Fructofuranose1,6-diphosphate (1.21) 1-Doxy-fructose (1.20)

31
6
37

25
86 9

0,8 0,9 6**

75

Tableau 1.2 Composition tautomrique de sucres dans D,O. Daprs S.J. Angyal, Adv. Curbohydr: Chern. Biochem., 42 (1984) 15-68 ; 49 (1991) 19-35. (publi avec laimable

autorisation dAcademic Press). (* : 37C ; ** : tautomre ctonique.)

diphosphate, 1.21. On observera la prdominance des pyranoses. Les galactofuranoses 1.22 ont une stabilit relative plus grande que celle des glucofuranoses 1.23. Ceci est peut-tre d la disposition trans de lhydroxyle en C(3) et de la chane latrale dans les premiers. On observe aussi quil y a dix fois plus de P que dapyranose dans les solutions de fructose. Nous allons ici anticiper sur le chapitre 2 consacr aux problmes de conformation. On peut dessiner le P-D-fructopyranose sous une conformation 1.24 o lon ne retrouve quune interaction dfavorable, entre H-3 et OH-5. Lchange des substituants sur C(2) donne une conformation minemment dfavorable, qui bascule pour aboutir 1.25, le moindre mal, mais o subsistent encore de fortes interactions 1,3-diaxiales.

1.4 CINTIQUE DE LA MUTAROTATION


Dans le cas du D-glucose, il ny a pratiquement que des pyranoses en solution. On peut formuler leur interconversion comme une raction rversible du premier ordre (1.3), Ca et Cp tant les concentrations (activits) de chaque anomre. La vitesse de disparition est alors donne par la relation (1.4), qui sintgre de la faon habituelle. I1 est commode de convertir les variations de concentration en variations de pouvoir rotatoire une longueur donde dtermine, ce qui donne la relation (1 3,o ro et r _ reprsentent les rotations mesures pour t = O et t = m.

(1.3)

a-D-glucopyranose

-kl

D-D-glucopyranose

k2

16

Configuration des monosaccharides

FHO I+-C-OH
HOC-H

CH, CO HOC-H

H-

W -OCH,
CH20CH,
1.19

F F

I I -OH

F -OH

W -OH

fH20H
1.20 1.21

OH

&H,OH
1.22 1.23 1.24

PH
bH
1.25

OH

1.26
1.27

R=OH, R'=H R=H, R=OH

(1.5)

Cette relation est vrifie dans un grand nombre de cas@lLa vitesse est multiplie par un facteur voisin de 2,5 pour une lvation de temprature de 10C, ce qui correspond une nergie d'activation voisine de 17 kcal mol-'. Parfois, comme dans le cas du D-galactose, on observe un cart apprciable, et mme, avec le D-ribose, une variation qui n'est plus du tout monotone. Ces anomalies

Cintique de la mutarotation

17

sexpliquent aisment par la prsence de plus de deux tautomres en interconversion dans la solution. La mutarotation est catalyse par les acides et les bases, et la plus lente entre les pH 3,O et 7,O. On la reprsente par une fonction de [H+] et [OH-], du type A + B [H+]+ C [OH-], ce qui donne par exemple lquation (1.6) pour le glucose 20C. (1.6) k, + k2 = 0,0060 + 0,18 [H+] + 16,000 [OH-] Lobservation de la mutarotation ne permet de connatre que la somme k , + k,. Nimporte comment, k, et k2 sont des constantes composites. On a de trs fortes raisons de penser que lquilibre anomrique passe par lintermdiaire carbonyl (Fig. 1.5). Entre autres indications, loxygne port par le carbone anomrique ne schange pas avec leau pendant lopration.

Figure 1.5 Equilibre tautornrique en solution

Chacun des quilibres partiels de la figure 1.5, reprsent par une quation du type (1.7) fait intervenir deux constantes de vitesse lmentaires, k, et kf correspondant respectivement louverture et la fermeture du cycle. Leur rapport K = kf/ko est la constante dquilibre, mesurable sur les spectres de RMN si lon peut observer avec assez de prcision le signal du carbonyle. k, (1.7) tautomre cyclique tautomre carbonyl

kf On a pu mesurer k, et kf dans un certain nombre de cad6]. Lorsque les constantes de vitesse sont de lordre de 10-200 s-l, la mthode de mesure de llargissement des raies sur le spectre de RMN, selon Gutowsky et Holm, est applicable. Pour les valeurs plus faibles, de 0,05 10 s-l, on a fait appel une autre mthode, applicable aussi bien en RMN du proton quen RMN de I3C, le transfert de saturation entre deux sites. On irradie saturation la frquence du tautomre acyclique. Le bouclage de lhmiactal change son environnement, il devient le carbone hmiactalique, mais ne contribue pas lintensit du signal de ce carbone. Exprimentalement, on observe quen prolongeant lirradiation la frquence de rsonance du carbonyle, on provoque une baisse de lintensit de la rsonance hmiactalique. Celle-ci se stabilise un niveau final qui dpend de la relaxation au site hmiactalique et de la vitesse douverture du cycle. Une formule permet den extraire la vitesse douverture, et la mthode est utilisable dans

1s

Configuration des monosaccharides

la zone 0,05 - 10 s-. A titre dexemple, on a reproduit sur la figure 1.6 les variations avec le pH de k, pour les deux anomres 1.26 et 1.27 dun mtabolite trs important, le D-ribose 5-phosphate, obtenu avec la molcule marque D-[ 1-13C] ribose 5-phosphate. Le lecteur observera lordre de grandeur de k,. On peut dailleurs observer des valeurs beaucoup plus leves avec dautres sucres, mme pH 7,5. Quant la constante k,, elle est videmment beaucoup plus leve, puisque K est en gnral trs suprieur 1.

Figure 1.6 Variation en fonction du pH de la constante douverture des furanoses 1.26 (a)et 1.27 (p), en solution 0.3 M dans 2H,0 15 5 % 24C. Extrait de R. Barker et A. S. Serianni, Acc. Chern. Res., 19 (1986) 307-313 (publi avec laimable autorisation de ]American Chemical Society ; O 1986 American Chemical Society).

1.5 CONSIDRATIONSGNRALES SUR CES MESURES


Le lecteur peut tre tent de penser que les raffinements exprimentaux dcrits dans les paragraphes prcdents, qui utilisent des techniques difficiles, relvent de proccupations essentiellement acadmiques. En fait, dans le domaine de la chimie organique, nombre de ractions des sucres sexpliquent le plus facilement en admettant que le tautomre carbonyl est en quilibre rapide avec les cycles dominants. On observe des ractions typiques de carbonyle. De plus la mesure, mme approximative, de la concentration en aldhyde ou ctone, permet, par application de la relation de Gibbs, dapprcier lordre de grandeur de son excs denthalpie libre par rapport aux formes cycliques, soit environ 6 kcal mol- pour le glucose. Du point de vue de lconomie des cellules vivantes, la configuration anomrique des sucres libres nest probablement pas indiffrente, puisque la Nature a prvu une enzyme, la mutarotase (Aldose 1-pimrase), trs rpandue dans les tissus animaux et les bactries, qui catalyse la mutarotation. Lenzyme de Escherichia coli a un maximum dactivit au voisinage de la neutralit. Lnergie dactivation AG#= 11,9 kcal mol- est fortement abaisse, comme dhabitude, par rapport celle de la raction catalyse non enzymatiquement, voisine de 17 kcal mol-. Elle admet comme substrat le D-glucose, le D-galactose et le D-fucose, mais non le D-manno~e[~].

Rfrences

19

Le tableau 1.2 montre que la forme carbonyle, ici ctonique, est beaucoup plus importante avec le D-fructose et son diphosphate 1.21. Lun comme lautre, en forme acylique, prsentent une fonction mixte caractristique, la fonction carbonyle 0-hydroxyl (aldol ou ctol). Une des proprits de cette fonction est sa rupture, selon une raction rversible en prsence de catalyseurs purement chimiques. La raction du diphosphate 1.21 scrit selon lquation (1.8). Elle est catalyse par lenzyme aldolase, et cest une voie majeure de cration de liaisons carbone-carbone dans les cellules.

RFRENCES
[ 11 G. M. Brown et H. A. Levy, Acta Crysrullogr:,B35 (1979) 656-659. [2] S. S. C. Chu et G. A. Jeffrey, Acta Crysrullogr:, B24 (1968) 830-838. [3] S. J. Angyal, Adv. Curbohydr: Chern Biochern., 42 (1984) 15-68 ; 49 (1991) 19-35. [4] K. B. Hicks, Adv. Curbohydr: Chern. Biochem., 46 (1988) 17-72. [5] S. Honda, S. Suzuki et K. Kakehi, J. Chrornutogr, 291 (1984) 317-325. 161 R. Barker et A. S. Serianni, Acc. Chern. Res., 19 (1986) 307-313. [7] M. J. King-Morris et A. S. Serianni, J. Am. Chern. Soc., 109 (1987) 3501-3508. [8] H. S. Isbell et W. Pigman,Adv. Curbohydr. Chern., 23 (1968) 11-57 ; 24 (1969) 13-65. [9] E Hucho et K. Wallenfels, Eux J. Biochern., 23 (1971) 489-496.

CHAPITRE 2

Conformation des monosaccharides et de leurs drivs

2.1 SYMBOLES DE CONFORMATION : PYRANOSES


Les conformations remarquables du cycle oxane (ttrahydropyranne) des pyranoses sont les mmes que celles du cyclohexane. On numrote les carbones partir du carbone hmiactalique, dit anornrique. Cette convention nest pas conforme la rgle de numrotation des htrocycles, qui attribue le numro 1 lhtroatome (ici, loxygne). Reprsentons loxane avec les carbones 1, 3 et 5 dans un plan horizontal, les carbones 1 et 4 dans le plan du papier cens vertical, et loxygne cyclique en arrire du plan du papier. Lobservateur situ au-dessus du cycle voit les numros dfiler dans le sens des aiguilles dune montre. Dans un pyranose, tous les carbones, ou presque tous, sont substitus, mais pour la commodit de lexpos, il suffira dintroduire un substituant R un site arbitraire. Lquation (2.1) reprsente alors lextension la chimie des pyranoses de lquilibre classique de conformation du cyclohexane. Le symbole 4C1 de la conformation 2.1 indique que dans la reprsentation conventionnelle, les carbones 1 et 4 sont respectivement au-dessous et au-dessus du plan moyen de la molcule. Le symbole de la conformation 2.2 est alors lC4. De mme, lnantiomre 2.3 du pyranose 2.1 donne lieu un quilibre conformationnel (2.2),symtrique du prcdent, auquel correspondent, selon notre convention, les symboles IC4 et 4C1. On voit quon aboutit un rsultat choquant : la convention attribue le mme symbole 4C1aux conformations 2.1 et 2.4, ni superposables ni symtriques. Les symboles ;Cj nont un sens que si on connat la srie D ou L du pyranose, quil faut introduire pour lever lambigut. Si le sucre schmatique 2.1 appartient la srie D, les symboles corrects des conformations 2.1,2.2,2.3 et 2.4 sont alors respectivement D 4 C , , D-C4, L-C4 et L 4 C , . Remarquez que lnantiomre dune molcule en conformation D-4C1 est une molcule en conformation L-C4, alors que ces deux molcules se comportent identiquement dans tout environnement achiral. Les pyranoses contenant une double liaison cyclique ou un cycle oxirane fondu, qui sont dimportants intermdiaires de synthse, existent en conformation demi-chaise. On donnera leur description symbolique au moment de les traiter.

Conformations ltat solide

21

(2.1)

@
2 . 2 (IC4)

2 . 1 CC,)

2 . 3 (IC4)

2 . 4 (Cl)

Enfin, il existe des conformations intermdiaires entre chaise et conformation croise. On donnera leur description symbolique propos de lexemple le plus important, celui de lacide L- iduronique (voir le paragraphe 2.8).

2.2 CONFORMATIONS LTAT SOLIDE


Llucidation de la structure dun sucre cristallin donne videmment la fois sa configuration absolue et sa conformation. Les progrs techniques considrables raliss dans la construction des diffractomtres rendent la dtermination de structure par les rayons X de plus en plus rapide et de plus en plus facilement accessible au non-spcialiste. Plus rarement, on a associ au spectre de rayons X le spectre de diffraction de neutrons (spectres X, N) qui donnent les grandeurs gomtriques avec plus de prcision, permettent de localiser les hydrognes et, en principe, de connatre la rpartition de la densit lectronique dans les couches de valence. Les mthodes par diffraction sont les plus prcises des techniques actuelles : elles donnent les longueurs, les angles didres et les angles de valence. Toutefois, elles observent des molcules maintenues rigidement dans le rseau cristallin. On connat un grand nombre de structures de sucres ltat solide, qui sont dsormais recenses rgulirement dans la collection priodique Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. Le lecteur y trouvera un examen critique des rsultats du point de vue dun cristallographe[]. Toutefois, la prparation dun cristal adquat peut savrer une affaire plus difficile que la spectroscopie elle-mme. Bien sr, les sucres sont typiquement une famille << hautement cristalline . Mais, pour ses purifications, le chimiste contemporain compte plus sur les mthodes chromatographiques, plus systmatiques et plus puissantes, que sur la recherche alatoire du solvant idal de cristallisation. 11 y a aussi un problme plus fondamental. La conformation dans le cristal peut ntre pas la mme quen solution. Par exemple, considrons lquilibre conformationnel (2.3) dun driv fluor et actyl du b-D-xylopyranose :

22

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

Ce driv fluorure de 2,3,4-ttra--acetyl-~D-xylopyranosyle adopte la conformation ttraquatoriale 2.5 dans le cristal, mais en solution, il donne lieu un quilibre conformationnel o la conformation ttraaxiale 2.6 est trs fortement prdominante (80-90 %)c2]. La conformation ttraquatoriale 2.5 a donc un excs dnergie sur 2.6, que lon peut calculer, au moyen de la relation de Gibbs, comme au moins gal 0,8 kcal mol-. Ce lger excs est donc compens lors de llaboration du cristal, qui slectionne la conformation ttraquatoriale en solution et dplace lquilibre totalement vers la gauche. Peut-tre la plus grande planit de la conformation 2.5 favorise-t-elle un empilement compact. Ceci dit, lorsque la conformation en solution dune molcule apparat unique en solution, avec nos mthodes actuelles dobservation, dans la vaste majorit des cas, cest celle-ci que lon retrouve dans le cristal.

(2.3) F - cA Ac0 OAc


2.5

HF
Ac
2.6

Ac

2.3 CONFORMATION EN SOLUTION : RSONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE DU PROTON


On a dj mentionn au chapitre premier lutilisation de la rsonance magntique nuclaire ltude des quilibres anomriques, par analyse de la partie du spectre relative aux protons anomriques. En gnral, lanalyse du spectre 250 MHz dun monosaccharide ne prsente aucune difficult. Le couplage vicinal entre protons axiaux est de lordre de 8- I l Hz, le couplage entre protons gauches de lordre de 1-3 Hz. Le couplage quatorial-axial est plus lev que le couplage quatorial-quatorial, souvent nul. Lorsque la configuration dun driv pyranosique est connue, on peut en gnral trouver un couple de protons vicinaux trans. Si on peut mesurer leur couplage sur le spectre, la conformation est dtermine sans ambigut si ce couplage est proche dune des valeurs extrmes donnes cidessus. I1 est futile de calculer les angles didres avec une grande prcision par les relations de Karplus, et de tels renseignements ne sont pas ncessaires pour prdire des proprits de ractivit, par exemple. Quelques exemples montreront les particularits visibles sur des spectres de monosaccharides reproduits sur les figures 2.1, 2.2 et 2.3. Le mthyl 0-D-galactopyranoside 2.7 est reprsentatif du rsidu galactose intrieur des chanes de glycolipides. Le mthyl a-L-fucopyranoside 2.8, en conformation L- C4 est reprsentatif dune branche de lpitope(voir le chapitre 16) des antignes des groupes sanguins principaux. Lacide sialique 2.9 en conformation D-C, joue un rle

Conformation en solution : rsonance magntique nuclaire du proton

23

h
I
I I I

I I

I
I

I
I

I
I

I
I

I I

4,8

4,6

434

492

4,o

398

3,6

3,4

Figure 2.1 Spectre de RMN du proton 250 MHz du mthyl fi-D-galactopyranoside dans D,O.

OCH,

H
2.1

H
2.8

2.9

24

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

5:O

4 : 8

4 : 6

i,4

4:2

4:O ' 318 ' 3:6 ' 3:4 ' 3 : 2 ' 3:o ' 218 ' 2:6

'

2:4

'

2'2

'

210

'

118 ' 1)6 ' 1:4 ' 112

'

1:o

'

0:8

Figure 2.2 Spectre de RMN du proton 250 MHz du mthyl a-L-fucopyranoside dans D,O.

'

0 . 2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2
PPM

3.0

2.8

2.6

2,4

2.2

2.0

1.8

1.6

Figure 2.3 Spectre de RMN du proton 250 MHz de l'acide

N-actylneuraminique.

Conformation en solution : rsonance magntique nuclaire du proton

25

Protons H- 1 H-2 H-3ax H-3eq H-4 H-5 H-6 H-7 H-8 H-9 H-9 N-actyl O-mthyl

2.7 *

2.8 **

2.9 *

4,60
(1)

3,71 3,71

3,90
(1)

3.65

vers 3,75 (4,9) (7,4)*** 3,75 (-12) ***

335

3,38

Tableau 2.1 Donnes de RMN pour les sucres 2.7, 2.8, 2.9. Au-dessous de 6 (en p.p.m partir de Me$), on donne les couplage2J, J,, dans cet ordre, entre parenthses. (* Solvant D20, pic HOD 4,80 p.p.m ; ** solvant CD,OD, pic HOD 4,85 p.p.m ; *** valeurs calcules daprs D. Welti, J. Chern. Res. (M), (1977) 3566-3587.)

+,,

important dans les phnomnes de reconnaissance. Les valeurs numriques des dplacements chimiques et des couplages sont regroupes dans le tableau 2.1. Dans certains cas, on observe des valeurs intermdiaires des couplages, dorigines diverses : a) La conformation sloigne notablement dune chaise classique. Cest ce que lon observe sur le bis ctal2.10, << diactone-galactose D (1,2;3,4-di-O-isopropylidne-a-D-galactopyranose). On la dessin comme un compos alicyclique ordinaire pour ne pas prjuger de sa conformation.

26

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

2.10

Dans CDCl,, les couplages sont 5,O ; J2,, 2,4 ; J 3,4, 8,O et J4,5 1,4 Hz. Le lecteur pourra sassurer que ces couplages sont incompatibles avec une conformation D-4C,. On a propos une conformation intermdiaire entre croise et bateau[3].La fusion de deux cycles pentagonaux sur loxane est la cause de cette distorsion. Ceci est un cas extrme, on observe aussi des conformations chaises moins radicalement dformes. b) I1 y a un quilibre entre plusieurs conformations. Ce que lon mesure est alors une moyenne pondre. Ceci sera dvelopp longuement au paragraphe 2.6. Nous navons parl ici que de lapplication de la RMN aux monosaccharides ; le dveloppement de la chimie des oligosaccharides a d faire appel des techniques plus compliques, qui seront esquisses au chapitre 9.

2.4 GNRALITS SUR LES FACTEURS DE CONFORMATION DES MONOSACCHARIDES


Comme le montre lexemple 2.10 de la section prcdente, les contraintes mcaniques introduites par la fusion de loxane avec dautres cycles ont une influence prpondrante sur sa conformation. On traitera les cas analogues au fur et mesure de leur apparition dans la suite de louvrage. Dans le reste de ce chapitre, il ne sagira que de composs monocycliques. Dans lquilibre des deux conformations chaises dun cyclohexane substitu, lexcs denthalpie libre de la conformation la moins stable est calcul comme la diffrence entre deux sommes de termes, qui reprsentent respectivement les interactions diaxiales 1,3 et les interactions gauches 1,2 de chaque conformre. On admet donc une loi dadditivit des compressions striques. Ce traitement semi-quantitatif perd une partie de son sens avec les pyranoses. Tous les carbones sont fonctionnels, ce qui doit faciliter la propagation des interactions dun bout lautre de la molcule, et diminue la plausibilit de lapproche par addition de contributions indpendantes. De plus, avec les sucres non ramifis, essentielle-

Effet de coplanarit

27

ment ceux auxquels nous aurons affaire, les substituants sont le plus souvent des groupements hydroxyle, actoxy et benzoyloxy. Lencombrement de lhydroxyle varie suivant son degr de solvatation. Lacylation diminue son volume de faon imprvisible en dplaant de la densit lectronique vers le carbonyle. Enfin, presque chaque position a, dans une certaine mesure, un statut particulier. Les anomalies sont trs marques pour la position 1 de tous les pyranoses et pour la position 5 des hexopyranoses. On les discutera longuement dans les paragraphes 2.5 et 2.6. Restent les positions 2 , 3 , 4 . Dans le 4-actoxyoxane 2.11, le substituant axial subit la compression strique traditionnelle due aux deux liaisons C - H axiales en 2 et 6. Par contre, dans le 3-actoxyoxane 2.12 (et dans le 5-actoxy), le substituant est oppos un seul C - H axial, lautre position tant occupe par loxygne cyclique. Le compos 2.12 donne lieu un quilibre conformationnel o il y a presque la mme quantit des conformations 2.12 et 2.13. Lnergie conformationnelle est pratiquement nulle cette position.

A c OAc
2.11

H
2.12 2.13

En fait, la conformation des pyranoses est domine par deux effets qui nexistent pas dans le cyclohexane, et qui se manifestent aux positions 2 et 6 de loxane. Lun deux est particulier aux hexopyranoses et je propose de lappeler << effet de coplanarit >> pour ne pas impliquer de structure particulire restrictive dans le nom dun effet dj prsent dans le mthoxythane. Lautre effet, prsent dans tous les pyranoses, est leffet anomrique : le nom de cet effet, tir du vocabulaire des sucres parce que cest dans cette famille quon la reconnu la premire fois, en dissimule en fait le caractre trs gnral puisquil est dj prsent dans le mthyl chloromthyl-ther. Les consquences de ces effets peuvent tre modules par des interactions de type cyclohexane, mais pas au point de ncessiter plus quune discussion qualitative.

2.5 EFFET DE COPLANARIT I1 est bien connu que le butane a deux conformations prfrentielles, reprsentes selon une projection de Newman perpendiculaire la liaison 2-3 par 2.14 (anti) et 2.15 (gauche). La figure 2.4 I indique en b la variation dnergie de la molcule en fonction de langle didre M e c - CMe et, en a, la population des conformations corres-

28

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

y / :#\y/
Me
2.14

hH Aifie
Me
2.16
2.17

H
2.15

M Me
2.18 2.19

m
2.20

pondantes donne par des calculs ab initid4]. La figure 2.4 II indique les variations correspondantes pour le mtho~ythane[~, pour lequel, par analogie, on prvoit deux conformations privilgies, 2.16 et 2.17. Ce quil y a dimportant reconnatre dans les courbes de la figure 2.4, cest que lexcs dnergie de la forme gauche sur la forme anti, qui est de 0,70 kcal mol- dans le butane, slve 1,96 kcal mol- dans le mthoxythane. En consquence, la population de cette conformation est extrmement faible. On a ici lexemple le plus simple possible de la stabilisation considrable de la conformation anti due la prsence de loxy28

21 14

7
O

6
3
180

60

120

240

300 360
II

Figure 2.4 Donnes quantitatives thoriques sur lquilibre conformationnel du butane (I) et du mthoxythane (II). Abscisses : angles didres Mec-CMe ou Mec-OMe ; ordonnes : a) IO3 fractions molaires par degr dangle, b) kcal mol-. Daprs W. L. Jorgensen, R. C. Binning, Jr. et B. Bigot, J. Am. Chem. Soc., 103 (1981) 4393-4399 et W. L. Jorgensen et M. Ibrahim, J. Am. Chem. Soc., 103 (1981) 3976-3985 (publi avec laimable autorisa-

tion de 1AmericanChemical Society).

Effet de coplanarit

29

Substituant
2 - CH3 2 - CH20H

- A G /kcai moi-

2,86
2,89

3 - CH, 4 - CH3

1,43 I0,04 1,95 ? 0,05

Tableau 2.2 Energies libres conformationnelles doxanes substitus*. (* Dans lintervalle 163-183 K, dans des solvants chlors). Daprs E. L. Eliel, K. D. Hargrave, K. M. Pietrusiewicz et M. Manoharan, J. Am. Chem. Soc., 104 (1982) 3635-3643 (publi avec laimable autorisation de IAmerican Chemical Society).

gne. Le nom << effet de coplanarit >> donn ce phnomne rappelle Iexagration de la tendance de la liaison CMe rester dans le plan C-O-C. Passons maintenant au cas de loxane[6], qui donne trois types de drivs monomthyls, 2.18, 2.19 et 2.20. Pour un oxane monosubstitu, lexcs denthalpie libre de la conformation substituant axial sur la conformation substituant quatorial est, comme on le sait, par dfinition, lenthalpie libre conformationnelle (ELC) du substituant dans loxane, cette position. Ces valeurs, mesures ventuellement indirectement en utilisant des composs relais intermdiaires, sont consignes dans le tableau 2.2. Les conformations quatoriales correspondent aux conformations anti du butane et du mthoxythane et les conformations axiales (non reprsentes), aux conformations gauche. On observe que lenvironnement du driv 2.20 est le plus voisin de celui du cyclohexane et que 1ELC est du mme ordre. Par contre, la prsence de loxygne cyclique diminue notablement 1ELC du drive 2.19. Le point important est laugmentation notable de IELC d u compos 2.18, o le mthyle est proximit de loxygne cyclique, et possde sur un ct un environnement semblable celui du mthoxythane. Considrons lquilibre (2.4) du driv dimthyl 2.21.

Me
2.21a

Me
2.21b

Ce compos adopte presque exclusivement la conformation 2.21b. On trouve :

k = ~86,O [2.2 1 a]
correspondant - AG O = 1,62 kcal mol-. Si on admet que - AG O est la diffrence des nergies conformationnelles des mthyles en position 2 et 4, on trouve

[221b1-

30

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

pour IELG du mthyle en 2 1,62 + 1,43 = 3,05 kcal mol-. La valeur du tableau 2.2, rvise la baisse, rsulte dun calcul indirect, faisant intervenir des quilibres plus mesurables, car ici la valeur de k est trs grande, et la prcision sur la concentration de 2.21a sen ressent. On a calcul de mme IELG dune chane latrale CH,OH en 2, disposition habituelle chez les hexopyranoses. Leffet de coplanarit na pas soulev autant dexcitation chez les thoriciens que leffet anomrique et sa cause nest pas connue avec certitude. Lexplication la plus simple est que linteraction 1,3-diaxiale dun mthyle en 2 de loxane avec la liaison CH en 6 est augmente, parce que ces deux substituants sont plus rapprochs que sils taient spars par -CH,- au lieu de -O-. Le calcul pour l a -Dglucopyranose solide avec des liaisons carbone-oxygne de 1,439 et 1,427 , faisant entre elles un angle de 113,7, donne pour la distance C,-C, 2,400 A, alors que la valeur correspondante pour le cyclohexane est au moins gale 2,5 . I1 est connu que la compression strique crot rapidement avec le rapprochement.

2.6 EFFET ANOMRIQUE 2.6.1 Donnes exprimentales


Leffet anomrique se manifeste ltat pur sur une molcule trs simple, le mthyl chloromthyl ther, CH,0CH2C1. reprsente en projection le long de la liaison O-CH2C1 sur la formule 2.22. La conformation connue est celle de la molcule ltat gazeux, donc isole, dtermine par diffraction le~tronique[~1. Au lieu dadopter la position anti favorise dans le butane, la liaison carbone-chlore construit avec la liaison OMe un didre de 75. Elle est presque coplanaire laxe de lorbitale de la paire libre 2p de loxygne, lcart (15 en projection) tant probablement d une interaction non lie entre mthyle et hydrogne. La liaison carbone-chlore (1,s 13 A) est plus longue que dans les chloroalkanes, la liaison O-CH,Cl (1,368 ) est plus courte que dans les thers aliphatiques et que la liaison CH,-O (1,414 A). Enfin, on observe sur le mthyl chloromthyl ther ltat solide une frquence de rsonance quadripolaire de ,,Cl exceptionnellement basse (29,s 17 MHz) compare celle du 1-chloropropane (32,968 MHz), ce qui indique une augmentation de la population orbitale 3p dans la direction de la liaison ou, en termes moins prcis, une augmentation de lionicit du chlore. On retrouve le mme effet conformationnel dans les 2-halognooxanes (2.23, X = C1, Br, I). Ces composs nexistent que sous la conformation halogne axial 2.23a qui correspond la conformation gauche du mthyl chloromthyl ther, dont ils sont les analogues cycliques, compte tenu des contraintes exerces par le cycle, selon lquation (2.5). Nous avons t habitus jusqu prsent lide quun substituant volumineux impose un cycle six lments la conformation o il est quatorial. La tendance est donc oppose en a dun oxygne thr. On observe le phnomne avec les

Effet anornrique

31

2.22

x
2.23a 2.2313

drivs de sucres prsentant un halogne ou, ce qui est le cas gnral, un atome doxygne sur C(1). On essaye dvaluer leffet anomrique partir dun quilibre tel que (2.5) relatif, cette fois, un pyranose le plus gnral. Si A, est lnergie libre conformationnelle de X, on pose : Effet anomrique = AG, + A, Malheureusement, A, a la position 2 dun oxane nest pas mesurable pour un substituant effet anomrique, car on ne peut dissocier exprimentalement la rpulsion strique de leffet anomrique. On prend 1ELC dans le cyclohexane. Lexemple du mthyle, dpourvu deffet anomrique (voir le paragraphe 2.5) fait supposer que la rpulsion est plus grande cette position. On obtient des valeurs par dfaut. I1 y a dautres dfinitions, aucune nchappe la critique. Leffet anomrique des halognes est trop puissant pour quon puisse observer une autre conformation que 2.23a sur les 2-halognooxanes. Lestimation ne repose pas sur un quilibre conformationnel, mais sur une raction chimique quilibre (2.6) dinversion de configuration sur C( 1) des cis (2.24 c) et trans (2.24 t) 2-halo-4-mthyloxanes, catalyse par HCI[]. On observe toujours un mlange 97:3 o prdomine le driv trans, 2.24 t (X = Ci), chlore axial (-AG = 2,15 kcal mol-). Lexpression numrique de leffet anomrique sobtient en ajoutant IELC du chlore ( 0 3 kcal mol-), ce qui donne finalement 2,65 kcal mol- pour le liquide pur. De mme, on a estim la Quelques valeur de leffet anomrique partir dquilibres de glyco~idation[~].
O

2.24~

2.24t

32

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

Substituant Hydroxy Methoxy Acetoxy Fluor Chlore Brome Iode Nitro*

kcal mol -I
0,9 - 1,35 1,3 1,4
?

2,7

32
3,l 3,4

Tableau 2.3 Evaluation numrique de leffet anomrique. (Daprs B. Aebischer, R. Hollenstein et A. Vasella, Helv. Chim. Acta, 66 (1983) 1748-1754.)

sont rassembls dans le tableau 2.3. Lordre donn par ces chiffres

a sans doute une vritable signification.


2.6.2 Origine de leffet anornrique
On observe sur les composs du chlore, du brome et de liode, une ou plusieurs raies dabsorption dans le domaine hertzien dont la frquence est caractristique de ltat de liaison de lhalogne. Cela vient du fait que les noyaux des atomes, 35Cl par exemple, possdent un moment quadripolaire qui peut exister sous plusieurs niveaux dnergie dans un gradient de champs lectrique. La relation de Townes et Dailey relie directement cette frquence de rsonance aux paramtres de description de la liaison par les orbitales molculaires, la population a de lorbitale p , de lhalogne implique dans la liaison carbone-halogne et la moyenne b des populations des orbitales p x et p , perpendiculaires, approxime ici par 2. Pour le noyau CI, cette relation scrit :

v/MHz=55 (2-a)
La frquence de rsonance est dautant plus basse que la population 3 p , dans la direction de la liaison est plus grande et sannule pour un compos ionique (a = 2). Dans un langage plus flou, plus la liaison est ionique, plus basse est la rsonance. On a interprt la rsonance exceptionnellement basse du mthyl chloromthyl ther comme une consquence de la dlocalisation de lorbitale 2p2 de la paire libre haute nergie de loxygne dans lorbitale antiliante O&, de la liaison carbone-chlore 12] (Fig. 2.5). Ceci implique un quasi-paralllisme entre les axes de ces deux orbitales. On observe un angle 19= 15, cos = 0,97. Dans la conformation anti, les deux orbitales seraient orthogonales et leur interaction nulle. Lintroduction dlectrons

Effet anomrique

33

Figure 2.5 Dlocalisation orbitalaire dans le mthyl chloromthyl ther.

fournis par loxygne dans cette orbitale augmente la population 3p, et abaisse donc la frquence de rsonance, mais comme il sagit dlectrons antiliants la liaison carbone-chlore est affaiblie et sallonge. Par contre, la liaison carbone-oxygne, laquelle participent deux orbitales p daxes parallles, prend un certain caractre TC, ce qui la raccourcit. Lhypothse de la dlocalisation explique de faon satisfaisante toutes les particularits du mthyl chloromthyl ther. Les tudes ultrieures sont plus directement lies aux sucres pyranosiques. On connat une famille importante de drivs, les halognures de pyranosyle, o les hydroxyles alcooliques sont acyls (gnralement actyls) et lhydroxyle hmiactalique remplac par du fluor, du chlore ou du brome, dont les formules 2.25 et 2.26 donnent les prototypes, en srie D-glucn. A partir de pentoses et dhexoses de configurations varies, on peut prparer deux collections de chlorures de pyranosyle, chlore axial ou quatorial, respectivement analogues de 2.25 et 2.26. Comme avec le 2-chlorooxane, lorientation axiale du chlore selon 2.25 correspond la conformation stable du mthyl chloromthyl ther. La comparaison des donnes gomtriques ltat solide, lorsquelles sont disponibles, montre que la liaison carbone-chlore axiale est invariablement plus longue que la liaison carbone-chlore quatoriale. Enfin la figure 2.6 montre que, du point de vue de la rsonance quadripolaire, ces composs se rpartissent en deux groupes.

& \A c

Ac0
CI
2.25

A c +

Ac0

CI

2.26

34

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

35

34

a-rhamno

-@-arabina

Figure 2.6 Frquence de rsonance quadripolaire de chlorures dhexopyranosyle

practyls, ayant les configurations indiques.

r-

a-manna

La frquence de rsonance du chlore axial est invariablement plus basse que celle du chlore q~atorial[~]. La figure 2.6 est aussi suggestive un autre point de vue : la dispersion des rsonances quatoriales, voisine de 0,5 Hz, est de lordre de grandeur de ce que les spcialistes appellent les << effets de cristal , dorigine intermolculaire. En premire analyse, on ne doit pas la considrer comme significative. Par contre, la plage de variation des rsonances axiales, 1,7 MHz, est trs suprieure aux effets de cristal. Cette dispersion traduit le fait, mentionn ci-dessus que leffet anomrique du chlore (comme dun autre substituant) dans un pyranose nest pas indpendant de la configuration du reste de la molcule. Ainsi la rsonance du chlorure axial D-manno est de beaucoup la plus basse et il est bien connu que leffet anomrique est renforc dans les drivs a-D-manno. La thorie explique aussi laugmentation de leffet dans le sens chlore, brome, iode ; lorbitale O* est de plus en plus diffuse et se prte un recouvrement de plus en plus efficace avec lorbitale 2p, de loxygne. Les polarisabilits atomiques des halognes sont : fluor, 0,557 ; chlore, 2,18 ; brome, 3,05 ; iode, 4,7. Leffet anomrique du fluor devrait tre le plus petit, en raison du caractre contract de ses

Effet anornrique

35

orbitales. I1 na pas t mesur mais il est incontestable. I1 impose 85 % de conformation ttraaxiale au driv 2.6 en solution. La comparaison des structures solides 2.5 et 2.27 est suggestive. La longueur de la liaison C-F axiale est 1,386 A, celle de la liaison C-F quatoriale, 1,367 A. Les longueurs des liaisons C( I)-O sont respectivement de 1,406 et 1,339 dans les drivs 2.5 et 2.27. Un calcul[14] conduit un effet anomrique de 1,85 kcal mol-, effectivement infrieur celui du chlore. Pour les sucres substitus par de loxygne sur C( l), la dlocalisation est plus difficile prouver, puisquon ne peut pas faire de spectre de rsonance quadripolaire. La polarisabilit atomique de loxygne, 0,802, le classe entre le fluor et le chlore, aussi semble-t-il peu probable que son effet anomrique relve dun mcanisme radicalement diffrent. Le dimthoxymthane, MeOCH20Me, a en phase gazeuse[151une conformation gauche 2.28 (projection le long de CH,-O) qui correspond celle des mthyl a-hexopyranosides, o le groupement mthoxy est axial. Toutefois, il faut remarquer que les deux oxygnes jouent le mme rle. La dlocalisation peut se produire dans les deux directions avec une gomtrie adquate. On y a vu lorigine de leffet exo-anomrique. Comme cet effet est principalement intressant en chimie des oligosaccharides, il sera trait au chapitre 9. F

OBz
2.21

%OMe

H
2.28

Notons seulement quil stabilise les anomres quatoriaux, donc diminue Ieffet anomrique des substituants oxygns. Cependant il y a dautres indications physiques de dlocalisation prfrentielle de loxygne cyclique vers loxygne entre exocyclique, fournies par la mesure de la constante de couplage direct JCH mesures le carbone anomre et lhydrogne. La comparaison des valeurs ]JCH, sur une vingtaine de couples danomres de configuration et de substitution varies, montre que lon observe pour chaque couple :

Jeq- J , ,

10 Hz

Or IJCH, mesur par spectroscopie de RMN de I3C, est reli au pourcentage de caractre s de la liaison, soit p, par la relation JCH = 500 p Donc le proton quatorial, prsent dans lanomre oxygne axial, a un caractre s plus lev que le proton axial, ce qui est conforme lide que la liaison C-O cyclique est plus voisine dune double liaison dans lanomre axial que dans lanomre quatorial (Fig. 2.5).

36

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

La dlocalisation de lorbitale 2p, de loxygne dans lantiliante axiale C-X est incontestable, mais ceci ne rsoud pas pour autant la question de la << cause D de leffet anomrique. Un des dogmes des thories lectroniques qualitatives a t que la dlocalisation est stabilisante, mais des contestations commencent se faire jour chez les thoriciens, mme concernant le traditionnel benzne. Une autre objection est que ces stabilisations se calculent partir de configurations non dlocalises qui sont des monstres conceptuels. Ltude thorique a t faite ici dans le cadre de la thorie des orbitales molculaires, pour 2.23a et 2.23b (X = Ci). Sur la figure 2.7, loxygne cyclique est lorigine des coordones, les orbitales p et sp2 des paires sont diriges respectivement suivant OZ et OY. Les liaisons C(5)-0-C( 1) sont dans le plan XOY, la liaison C - CI fait un angle de 30 avec OZ.

*_--

-Y

Figure 2.7 Orbitales molculaires du 2-chlorooxane impliques dans la thorie de leffet

anomrique.

CI

La stabilisation dune orbitale molculaire pleine dnergie E, par interaction avec une orbitale vide dnergie E , est donne par la formule classique :

A E = 2pcoc1 EO-EI

fi dpend des conditions gomtriques de linteraction et Co et C, sont les coefficients des orbitales atomiques au contact dans lexpression des orbitales molculaires en interaction. Cette expression na de sens que si on peut attribuer des nergies ces deux orbitales molculaires, donc sil sagit dorbitales canoniques. Lorsquon tudie la liste des orbitales molculaires des 2-chlorooxanes en conformation avec le chlore axial (Fig. 2.7) et avec le chlore quatorial, obtenues au niveau STO-3G, on observe videmment linteraction entre 2p, de loxygne et occisur le conformre axial, mais aussi dautres interactions qui, pour tre nettement plus faibles, ne sont pas ngligeables : 2p, / O&, dans le conformre quatorial, et les interactions entre la paire sp2 de loxygne (sur O,,) et les substituants quatoriaux dans les deux conformations. La figure 2.8 donne ces interactions pour le conformre chlore axial.

Conformation des pentopyranoses

37

AE*

Figure 2.8 Niveaux dnergie et interactions dans le 2-chlorooxane chlore axial.

Linteraction O&, l p , (O) domine parce que ce sont les deux orbitales les plus proches en nergie. Le calcul complet donne pour leffet anomrique du chlore :
AE=4h* i l & (AE*)3

h * tant calculable sur un modle. Cette formule, qui conduit un rsultat raisonnable, 3,3 kcal mol-, a aussi le mrite de souligner que leffet anomrique nest observable que parce quil y a une diffrence dnergie E entre les deux paires libres de loxygne.

2.7 CONFORMATION DES PENTOPYRANOSES


En raison de labsence de chane latrale en C(5), il y a frquemment mobilit conformationnelle. Le spectre de RMN du proton peut donner lillusion dun compos conformation homogne, alors quen fait, ce que lon observe est une moyenne temporelle, parce que linterconversion est rapide lchelle de temps de la RMN. Alternativement, le spectre du conformre minoritaire peut tre prsent, mais chapper la dtection. Ainsi la valeur intermdiaire du couplage JI,* (4,X Hz dans lactone deutre) du ttra-O-actyl-fi-D-ribopyranose suggre quil y a un quilibre entre les conformations 2.29 et 2.30, C, et ,C,. Au refroidissement, le signal examin sous 200 MHz slargit brusquement vers -60C, puis se rsout en deux signaux : un singulet troit champ plus faible, caractristique dun proton H-1 quatorial, et

38

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

PAC

2.29

2.30

un doublet large, champ plus fort, caractristique dun proton H-1 axial. A basse temprature, lquilibre correspond un excs (2:l) de la forme triaxiale. La mesure de la temprature de coalescence permet de calculer la constante de vitesse pour linversion : elle est voisine de 117 s-l 2 -6OC, et correspond une nergie dactivation A@ = 10,3 0,3 kcal mol- dans le sens 4C, -+ IC4. Pour la raction en sens inverse, les chiffres correspondant sont 57 s- et 10,6 f 0,3 kcal mol-, respectivement. Ces valeurs sont voisines de celles quon observe sur le cyclohexane ou loxane. 11 est remarquable que la substitution ne cause pas de gne linversion. Cette exprience permet de mesurer les valeurs << exactes >> des constantes de couplages J I , ?pour les deux conformations. Si, une autre temprature, les fractions molaires des conformres sont Ne et Na, une rgle de mlange donne :

Jobs

= Ne e

No a

La mesure de J permet de calculer k = Na / Ne et la diffrence denthalpie, AG O = -RTlnk. Ainsi on trouve qu temprature ambiante, il y a 55 % de conformre 2.29. Ce gel conformationnel est exceptionnel. Le seul autre exemple parmi les pentopyranoses ttraactyls est le driv O-D-lyxo. Le calcul des constantes dquilibre partir des spectres moyens ncessite certaines extrapolations. On nobserve pas deffet rgulier de la nature et de la polarit du solvant. On va maintenant examiner les diffrents types de drivs. Le cas le plus simple est celui des halognures per-acyls. La conformation est domine par leffet anomrique puissant dun halogne et on nobserve que des conformations halogne axial, sauf avec la configuration 0-D-xylo, qui donne lieu un quilibre (Equilibre (2.7) ; Tableau 2.4). Nanmoins, ce tableau montre que les conformations ttraaxiales sont toujours dominantes et parfois presque exclusives.

Conformation des hexopyranoses et de leurs drivs

39

R*

X*

k = 4C ,/IC

Ac
Bz

c1 c1
F F

0,26
0,19

Ac Bz Ac Bz

0,17 0,os
2,60 0,98

OAc
OBz

Tableau 2.4 Equilibre conformationnel des drivs PD-xylo dans CD,COCD,. (* Voir lquation (2.7)).

Si on remplace maintenant lhalogne anomrique par un actoxy, la position dquilibre est renverse, leffet anomrique faible ntant pas capable, la temprature ambiante, de compenser deux interactions diaxiales. Cependant, le driv per-O-benzoyl donne lieu un quilibre 1:l. On reconnat ici les limites de ces analyses qui ne prennent en compte que la partie oxane. Avec les substituants benzoate, << lessentiel D est sans doute ailleurs. Un autre aspect du problme est que les diffrences dnergie conformationnelles peuvent apparatre faibles par comparaison avec les forces dempilement dans les cristaux. Dans le cristal, le chorure p-D-qlo per-O-actyl adopte la conformation tout quatoriale. De mme le fluorure peractyl, 85 % ttraaxial en solution, cristallise sous la forme ttraquatoriale. Dans ces cas, o il y a un quilibre en solution, correspondant des diffrences denthalpie libre voisines de 0,8 kcal mol-, il nest pas surprenant que les forces dempilement - la tendance la structure compacte - puisse dominer. Plus tonnant est le cas du Iluorure per-O-benzoyl, qui cristallise sous la forme ttraaxiale. L, il semble probable que lempilement des noyaux phnyle soit un facteur essentiel. En rsum, ces drivs per-acyls conduisent des quilibres conformationnels, sauf dans des cas dont lissue est particulirement vidente (configuration aD-qlo, 4C,, 0-D-arabino, IC4). Restent les pentoses libres en solution aqueuse. Les interactions diaxiales sont plus leves quavec les actates et leffet anomrique plus faible. Sur les huit configurations des D-pentoses, quatre ( p -D-arabinose, a -D-lyxose, a -D-ribose et -D-ribose) donnent lieu un quilibre conformationnel.

2.8 CONFORMATION DES HEXOPYRANOSES ET DE LEURS DERIVES


La tendance de la chane latrale adopter la position quatoriale pse dun poids trs lourd[6] ; il nexiste quun seul cas dmontr o cette chane adopte la position axiale, cest celui du mthyl 2,4-bis(N-actyl-N-benzoylamino)-3-6-diO-benzoyl-2,4-didoxy-a -D-idopyranoside, compos exotique, avec deux sub-

40

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

stituants de volume norme. Nous avons soulign dans la section prcdente que les rgles applicables aux drivs simples des cycles six lments nont aucune raison dtre gnralisables ces cas extrmes. Dune faon plus gnrale, on peut prvoir quatre orientations autour de loxygne cyclique dun D-pyranose : I et III pour les drivs trans, II et IV pour les cis (Fig. 2.9). A lexception de lidose (et peut-tre de laltrose), tous les drivs trans, ici les a -D-hexopyranoses monocycliques et leurs drivs, existent sous la seule conformation observable D-4C,, qui correspond la conformation locale I, doublement stabilise par leffet anomrique et leffet de coplanarit.

II

III

IV

Figure 2.9 Orientations possibles des substituants autour de loxygne cyclique dun pyranose.

L a-D-idopyranose, 2.31, est le seul pyranose prsentant deux interactions 1,3-diaxiales en conformation D-,C,. Cest ici le moment dintroduire de nou2.32, velles conformations et leurs symboles. La conformation croise (skew, s), est dcrite en prenant comme plan de rfrence celui des quatre atomes coplanaires (non conscutifs). On complte le symbole en indiquant les numros des atomes situs au-dessus et au-dessous du plan de rfrence et, naturellement, le symbole de la srie, ce qui donne ici D-S,. La -D-idopyranose en conformation D-OS,, 2.33, ne prsente plus dinteractions diaxiales prohibitives, et satisfait nanmoins aux critres de stabilisation locale autour de loxygne cyclique, au moins partiellement. Le spectre de RMN du proton de la-D-idopyranose en solution aqueuse est celui dun mlange en quilibre des conformations 2.31 et 2.33. La configuration ido est prsente, de faon isole au milieu dautres rsidus monosaccharides dans les chanes polycondenses, dites << glycosaminoglycanes , de polysaccharides naturels : le dermatane sulfate, lhparane sulfate et lhparine. Le driv en question, qui appartient la srie L, est lacide 2-O-sulfoL-iduronique. On la reprsent en 2.34 (R = R = H) de faon non conformationnelle, avec la configuration a-L-idopyruno prsente dans ces polysaccharides. Le rsidu L-ido est isol dans la squence, au milieu des chanes attaches respectivement sur O( 1) et O(4) (paragraphe 17.3). I1 se trouve ltat de mlange des conformations L-C42.35 et L-2S, 2.36. La proportion de forme croise varie de 40 64 % selon les squences oligosaccharidiques attaches R et RLi71. Lancrage vigoureux de presque tous les hexopyranoses en conformation D-,C, (L-IC,) par effet de coplanarit entrane une certaine rigidit des chanes

Furanoses

41

6H
2.31
2.32

2.33

HO O

&
AR'
2.34

SO,H

OR'
2.35

bS0,H

6R'
2.36

oligosaccharidiques. I1 est possible que l'introduction de rsidus ido conformation flexible en certains sites cre la souplesse indispensable certaines fonctions. Dans 1' a-D-idopyranose peractyl, la compression strique des oxygnes axiaux est diminue par l'actylation, et l'effet anomrique est augment. Cet ester existe exclusivement en conformation D-4C, ttraaxiale 2.37[1].

2.37

2.9 FURANOSES
L'oxolane est aussi flexible que le cyclopentane, sur lequel on raisonnera d'abord. I1 est commode de mettre des noms sur certaines conformations, par exemple conformation croise (twist) 3T2 2.38, enveloppe 3E 2.39, croise 3T4 2.40, dont les symboles sont calqus sur ceux du cyclohexane (Equilibre (2.8)).

2.38 ('T2)

2.39 ( ' E )

2.40 (' T 4 )

42

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

Ce ne sont que des repres gomtriques. Les conformations 2.38, 2.39 et 2.40 sont trois tapes d'une dformation continue qui ne sont pas spares par des barrires apprciables. On peut construire une succession de conformations E et T alternes qui nous ramne de faon continue la case dpart. Par exemple, partant d'une enveloppe 3E, on passera par les enveloppes 5E, =E,4E, ' E pour revenir 3E : du point de vue de sa forme gomtrique, chaque enveloppe se dduit de la prcdente par rotation de 144", mais ce n'est pas la molcule qui tourne, seulement sa forme. On appelle ceci pseudo-rotation. Dans une conformation gele du cyclopentane, il y a 5 angles didres, O,,.. . O,, qui sont fixes (Fig. 2.10 a). Au cours de la pseudo-rotation, l'un d'eux, soit O,,, varie entre deux valeurs extrmes, (Po et - (Po, par exemple, en passant par les , (Po, O, - (Po, O, O,. D'o l'ide d'approximer cette fonction priodique valeurs , = 0, cos P. L'angle par une srie de Fourier rduite un seul terme, en crivant P varie de 360" lorsque la molcule subit le circuit complet de pseudo-rotation. (Notez qu'alors, une conformation particulire a fait deux fois le tour de la molcule, 2 x 360".) L'angle didre , a sa valeur maximum dans la conformation 3T2.On a alors 0, = O,, donc P = O". Pour les tapes suivantes 3E, 3T4 de la pseudo-rotation, on a P = 18" et 36". De mme l'itinraire =TI --+ =E + =T3correspond P = 144", 162", 180". Dans la conformation =T3, le didre est de sens oppos celui de la conformation 3T2,et l'on a O,, = 13, cos (180") = - . , I1 existe bien sur une valeur de P pour chacune des conformations repre, mais la nouveaut apporte par l'introduction du paramtre continu P est la possibilit de caractriser les conformations intermdiaires entre T et E , qui sont celles que l'on rencontre rellement. A partir de 0, et P on calcule les autres angles didres par la formule : ej=,cos(P+j6) j = O , l ... 4 6=144" On tend ces considrations aux furanoses en remplaant le sommet 5 par , 2 , ... 7 . , En dpit de la l'oxygne (Fig. 2.10 b). Les angles didres sont nots z flexibilit du systme furanosique, il y a une conformation (ou deux) plus basse nergie, dtermine par l'emplacement et l'orientation des substituants et, en phase solide, par les forces d'empilement dans le cristal. En gnral, elle ne concide pas avec une des conformations E ou T. Altona et Sundaralingam['sl propo-

74

73

O 70
S l

72
a

Figure 2.10 Convention de reprsentation des angles didres du cyclopentane ( a ) et de l'oxolane (b).

Polyols non cycliques

43

2.41 (,T2)

2.42 ('T,)

2.43

2.44

sent de la dcrire avec les paramtres O,, et P. Cette description s'est impose dans la littrature cristallographique''1. On expliquera cette notation sur un exemple tir de la chimie des nuclosidesnuclotides. C'est de trs loin la famille la plus importante de furanosides (voir le paragraphe 3.4). Les nuclosides sont des combinaisons glycosidiques d'une base htrocyclique et d'un rsidu p-D-ribofuranosyle ou 2-doxy-0 -D-qthro-pentofiiranosyle. L'exemple choisi est le nucloside artificiel 5-iodoridine. On observe deux conformations diffrentes de cette molcule dans le mme cristal, voisines respectivement de 3T22.41 et 2T32.42. L'angle didre maximum est entre 2' = O,, (Fig. 2.10) et, par suite, et 3'. Pour que P soit voisin de O, on choisira donc z2 , zo, z,, respectivement. La connaissance de deux pour O , . .. O,, les valeurs z3, z angles didres permet de calculer z , et P. L'angle P a le caractre d'une phase et , z , est une mesure de l'applatissement du cycle. La conformation 2.41, P = 9", est mi-chemin entre 3T2et 'E. On a , z = 36" et l'angle didre maximum 35" entre 2' et 3'. La conformation 2.42, P = 175", est assez voisine de 2T3.L'angle didre maximum est encore entre 2' et 3', - 41". Le fait qu'une mme molcule puisse se trouver sous deux conformations diffrentes dans le mme cristal est en soi rvlateur de leur faible diffrence d'nergie. C'est tout de mme inhabituel et les nuclosides-nuclotides se rpartissent galement entre 0 < P < 36" et 144 < P < 180" avec peu d'exceptions.

2.10 POLYOLS NON CYCLIQUES


Prenons comme exemple le galactitol l'tat solide, 2.43. La molcule a la forme d'un zigzag plan. C'est la disposition favorite en solution, sauf si elle conduit des interactions clipses 1,3 des hydroxyles. Dans ce dernier cas, la molcule se tord en forme de faucille. Cette conformation drive du zigzag plan par rotation de 120" autour d'une liaison C-C interne. On observe la conformation faucille sur le dithyl dithioactal du D-ribose peractyl 2.44.

44

Conformation de monosaccharides et de leurs drivs

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CHAPITRE 3

Alkyl et aryl glycosides Glycosylamines

3.1 DFINITIONS RELATIVES AUX GLYCOSIDES (O-GLYCOSIDES)


Les furanoses et les pyranoses sont des hmiactals. Les glycosides sont les actals correspondants. Ils drivent sur le papier des furanoses et des pyranoses par le remplacement de lhydrogne de lhydroxyle hemiactalique par un radical carbon. Ce sont donc des actals mixtes, internes et externes, o un des oxygnes actaliques provient de lune des fonctions alcool du sucre, et lautre dun compos hydroxyl extrieur R-OH. I1 sensuit qu chaque pentose ou hexose correspondent quatre types de glycosides. Par exemple, on voit ci-dessous les formules des quatre glycosides drivs du galactose par remplacement de lhydrogne hmiactalique par un mthyle, appels mthyl a-D-galactopyranoside 3.1, mthyl P-D-galactopyranoside 3.2, mthyl a-D-galactofuranoside 3.3, et mthyl P-D-galactofuranoside 3.4. La dfinition que nous avons donne inclut le cas o le driv hydroxyl R-OH correspondant au substituant R externe appartient la famille des sucres et, effec-

3.1

3.2

FOH
~H,OH
3.3

OH 1

3.4

46

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

tivement, la liaison correspondante se comporte exactement comme les autres du point de vue chimique ; dans tous les cas, cette liaison entre les deux groupes par une fonction actal sappelle liaison glycosidique. Dans la pratique, ces deux catgories de glycosides, suivant que R-OH est ou nest pas un sucre, jouent des rles trs diffrents qui justifient un traiterncnt spar. Les glycosides o R = mthyl, thyl, phnyl, benzyl, etc. sont trs importants comme intermdiaires synthtiques. Ce sont eux que lon dsigne en gnral sous le nom de glycosides et qui font lobjet du prsent chapitre. La partie << sucre >> sappelle unit glycosidique et le radical extrieur, aglycone. De lexamen des noms des drivs 3.1, 3.2, 3.3 et 3.4, le lecteur dduira les rgles de nomenclature. Le nom commence par le radical dsignant laglycone, suivi du nom qui indique la configuration de lunit glycosidique, o la terminaison << ose >> du sucre libre est remplace par << oside . Si R-OH est un sucre, on emploiera de prfrence le terme disaccharide. Dailleurs lassociation de beaucoup plus de deux molcules de sucres simples peut se poursuivre par le mme type de liaison. Ces associations dont certaines jouent un rle fondamental dans les phnomnes de reconnaissance cellulaire seront traites en dtail partir du chapitre 9.

3.2 SYNTHSEDES ALKYL GLYCOSIDES L41 PAR LA METHODE DE FISCHER[]12] 3.2.1 Aspect exprimental
En catalyse acide, on observe un quilibre entre un pentose ou un hexose et un alcool aliphatique OLI benzylique, dune part, et lactal mixte correspondant et leau, dautre part, conformment la figure 3.1. On sintresse dabord la synthse. La raction est dplace vers la droite par lutilisation dun gros excs dalcool ROH, gnralement employ comme solvant. Par exemple, en faisant bouillir reflux une solution de galactose dans le mthanol contenant 2 % de HC1, on obtient aprs 12 h un mlange en quilibre du sucre de dpart avec les galactosides 3.1, 3.2, 3.3 et 3.4. Cette raction de glycosidation est gnrale. Comme toujours, il ne se forme que des cycles cinq ou six lments et les seules fonctions alcool internes impliques sont celles portes par C-4 ou C-5. On lobserve donc avec les pentoses et les hexoses qui prsentent au moins une fonction alcool libre en you 6 du carbonyle (aldhydique ou ctonique).
CHOH-

CHOR+ROH

=:

-k H ~ o

Figure 3.1 Raction de glycosidation.

Cependant la composition du mlange en quilibre varie largement dun sucre un autre (Tableau 3.1). On dose les constituants par les mthodes que nous avons

Synthse des alkyl glycosides par la mthode de Fischer

47

Furanosides
T

Pyranosides

a
0,6 0,7 6 6 5 25

P
09 0

a
66

P
32,5 5,3 20 27 66 46

glucose* mannose galactose* fucose** ribose* fructose***

35C 35C 35C 65C 35C 28C

16 13 17 26

94 58 54 12 3

Tableau 3.1 Mthanolyse acide : composition a lquilibre du mlange de mthyl glycosides. (* Daprs R. J. Ferrier et P. M. Collins, Monosaccharide Chemistry, (chapitre 3) Penguin Books, Harmondsworth, 1972 ; ** daprs D. E Mowery, Curbokydr. Res., 43 (1975) 233-238 ; *** daprs G. S. Bethel1 et R. J. Ferrier, Curbokydr: Res., 31 (1973) 6980 ; publi avec les aimables autorisations de Penguin Books et de Elsevier Science.)

esquisses au chapitre 1 propos du dosage des anomres des sucres libres, cest-dire HPLC analytique ou chromatographie de vapeur aprs silylation. Ici les mesures sont beaucoup plus faciles, car, ds quils ne se trouvent plus dans un milieu relativement acide, les glycosides sont trs stables et il ny a pas de risque que la composition de lchantillon varie aprs le prlvement au cours du dosage. La composition de ces mlanges est videmment relie la diffrence des enthalpies libres de chaque constituant. On observe quelques comportement rguliers. Les pyranosides sont favoriss par rapport aux furanosides, presque absents dans le cas du glucose et du mannose. Dans le cas de pyranosides conformation stable, tels les gluco-, manno- et galactopyranosides, cest le driv mthoxyle axial qui prdomine, ce qui est une manifestation de leffet anomrique. Si, au lieu dexaminer la composition lquilibre, on suit le droulement temporel de la glycosidation on observe que les furanosides se forment au dpart, pour disparatre ensuite plus OLI moins compltement au profit des pyranosides.

3.2.2 Rle prparatif et limites dutilit


On procde toujours comme dans le cas du galactose dcrit ci-dessus, avec lalcool comme solvant. On peut commencer par essayer de chauffer quelques heures vers 80C en prsence dun acide minral, une molarit voisine de 0, 1 - 1 M. I1 faudra ensuite dterminer les meilleures conditions. Celles que nous venons de donner transformeraient quantitativement le dsoxyribose en acide lvulinique, CH,COCH,CH,COOH. Mais avec tous les sucres 2-doxy, la glycosidation est trs rapide dans des conditions beaucoup plus douces. Par exemple, la conversion du dsoxyribose en mthyl glycosides est complte en 20 mn 27C dans lacide chlorhydrique mthanolique 0,O15 M. Si le glycoside ne cristallise pas directement du milieu ractionnel, il faut liminer lacide minral catalyseur, et ceci peut poser problme, car en gnral les

48

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

glycosides sont trs solubles dans leau et il est impossible de les extraire avec des solvants organiques. Il est trs commode dutiliser comme catalyseur une rsine changeuse de cations sous forme hydrogne, que lon spare par filtration en fin dopration. Ainsi, pour prparer le mthyl a-D-glucopyranoside, on fait bouillir reflux une solution de 80 g de glucose anhydre dans 200 mL de mthanol pendant 24 h en prsence de 20 g de lchangeur de cations Dowex 50 (H). On filtre, concentre, ce qui amne une cristallisation spontane, et on recristallise dans le mthanol puis lthanol, ce qui donne 25 g (29 %) de mthyl a-D-glucopyranoside pur[5] A ce stade, il faut se pntrer de lide que dans ces synthses, qui nimpliquent quun petit nombre dtapes, au dpart de sucres banaux, la course aux rendements levs na plus grande signification. Ce qui compte, cest la simplicit doprations. En France, le kilogramme de glucose, au degr de puret ncessaire la recherche, vaut 53 F E La purification dun driv de ce kilogramme de glucose par chromatographie exigerait au minimum 20 kg de gel de silice (prix 3 560 FF) et 60 L de solvant (environ 600 FF). I1 est beaucoup plus conomique dutiliser une mthode qui ne ncessite que des cristallisations, quitte augmenter lchelle de travail si son rendement est faible. Cest en gnral le constituant majoritaire de la solution qui cristallise, cest--dire le pyranoside dont lalkoxyle anomrique est axial ; ce nest toutefois pas une rgle absolue. Donc, le plus souvent, la prparation du pyranoside alkoxyle anomrique quatorial par la mthode de Fischer implique une cristallisation fractionne assez pnible des eaux-mres et on fait plutt appel une autre mthode. Pour obtenir les furanosides, on peut essayer dinterrompre la glycosidation son dbut, au moment o leur concentration est maximum. Par exemple, en faisant bouillir reflux une solution de galactose dans le chlorure dhydrogne mthanolique 0,004 M pendant 6 h, on peut obtenir le mthyl P-D-galactofuranoside avec 53 % de rendementL6]. Dans cette prparation, on a ralenti ltablissement de lquilibre en utilisant une trs faible concentration de catalyseur. Mais ces conditions sont rarement aussi idales. Le remplacement du catalyseur acide protonique par du chlorure ferrique, acide de Lewis modr, donne exclusivement le mlange de furanosides. On peut ainsi obtenir le mlange de mthyl D-glucofuranosides (alp = 3/7) avec 75 % de rendement17].Une autre voie daccs un furanoside repose sur la complexation intermdiaire par les ions Ca++. Lensemble de ces complexations sera trait au chapitre 11. En faisant bouillir reflux une solution de mannose et de CaC12 dans le mthanol en prsence de chlorure dactyle comme source de protons pendant 2 h, on obtient 5 3 3 % de mthyl P-D-mannofuranoside, isolable avec 40 % de rendement[*]. Enfin, lapplication de la glycosidation selon Fischer un sucre dont la fonction alcool sur C-5 est bloque ne donne videmment que des furanosides. Ici apparaissent donc les limites dutilit de la mthode de Fischer : il faut que lalcool soit utilis en grand excs, de prfrence comme solvant, pour dplacer

Autres mthodes de prparation des glycosides

49

lquilibre dans le sens voulu. Les anomres alkoxyle anomrique quatorial sont difficilement isolables. I1 ny a pas de raction utilisable avec les phnols et les aryl glycosides ne sont pas accessibles.

3.3 AUTRES MTHODESDE PRPARATIONDES GLYCOSIDES

3.3.1 Activation du carbone anornrique


Dans la raction de Fischer, on imagine que le rle du catalyseur acide est de protoner lhydroxyle anomrique, le transformant ainsi en groupe partant (Fig. 3.2), ce qui facilitera la substitution nuclophile. Dans les mthodes que nous allons dcrire, il y a un groupe partant stable sur C-1, ce qui nempche pas lutilisation de ractifs dactivation supplmentaire, les << promoteurs >> introduits dans le milieu. Ces mthodes, plus longues mettre en uvre que la glycosidation selon Fischer et trs varies, servent essentiellement la synthse doligosaccharides : elles seront analyses en dtail au chapitre 10. Elles sont toutes utilisables la synthse des glycosides simples.

Figure 3.2 Intermdiaire proton dans la raction de glycosidation.

Ainsi dans le peractate du P-D-glucopyranose 3.5, le groupement actoxy anomrique a une labilit particulire. I1 est remplac par un mthoxy en prsen3.6L91. Ce ce de SnC14 pour donner le mthyl ttra-O-actyl-B-D-glucopyranoside type dactivation peut se rvler insuffisant. On a propos un promoteur plus efficace que SnCl,, mais beaucoup plus couteux, le tritluoromthanesulfonate de trimthylsilyle, CF3S03SiMe3. Aussi, pour une prparation grande chelle, prfre-t-on encore utiliser un bromure, aisment obtenu en traitant par HBr un peractate de P-D-glycopyranosyle tel que 3.5. On prpare ainsi le bromure de ttra-O-actyl-galactopyranoside 3.7, qui donne le mthyl P-D-galactoside peractyl 3.8 avec le mthanol en prsence dun mlange de HgO (1 eq.) et de Hg Br, (0,04 eq.). Le rendement global partir du galactose est de 24 %. On remarquera lorientation quatoriale du mthoxyle entrant dans les deux cas, indpendante de la configuration du produit de dpart. Nous verrons plus en dtail au chapitre 10 comment la participation du groupement actoxy en 2 impose la configuration trans- 1,2 du produit. Le rendement de la substitution proprement dite est en gnral excellent. En rsum, les alkyl glycosides avec une aglycone axiale sont aisment obtenus par la raction de Fischer, quils soient cis-1,2 ou truns-1,2. Les alkyl glyco-

50

Ac

*
Ac0 Ac0
3.5

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

* cA

OAc

Ac0 Ac0
3.6

OMe

Ac Ac0
3.7

Br

Ac0 AL0
3.8

OMe

sides trans- 1,2 diquatoriaux rsultent de ractions de participation. Restent les cis-1,2 avec une aglycone quatoriale comme le P-D-mannoside 3.9. On obtient 3.9 avec 30 % de rendement aprs isolement par addition simultane de sulfate de mthyle et dhydroxyde de sodium une solution aqueuse de mannose[].

3.9

3.3.2 Aryl glycosides


On ne peut pas les obtenir par la raction de glycosidation de Fischer. Peut-tre lhydroxyle alcoolique est-il insuffisamment nuclophile, par comparaison avec lhydroxyle alcoolique. Mais on peut les prparer assez facilement partir des actates en prsence de catalyseurs acides. La fusion dun mlange du peractate de la-D-glucopyranose 3.10 et de phnol donne 64 % de phnyl a-D-glucopyranoside ttraactyl 3.11 en prsence de chlorure de zinc et 85 % de lanomre P 3.12 en prsence dacide paratolunesulfonique[]. Le cours de la raction dpend donc fortement des conditions exprimentales. Chaque fois que lon obtient un alkyl ou aryl glycoside sous forme ttraactyle, il est facile, si cela savre ncessaire, de librer les fonctions alcool par mthanolyse alcaline, car la liaison actalique est trs stable dans les bases.

Anhydropyranoses et anhydrofuranoses a caractre actalique

51

Ac0
3.10

OAc
3.1 1

R
3. i 2

R=H, R=OPh R=OPh, R=H

3.4 ANHYDROPYRAN0,SES ET ANHYDROFURANOSES A CARACTERE ACETALIQUE


Le lecteur se sera peut-tre demand pourquoi, dans la raction de Fischer, il

ny a pas actalation par deux fonctions alcool de la molcule de sucre, conduisant un actal mixte compltement interne et bicyclique. En rgle gnrale, une raction intramolculaire est plus rapide que lanalogue intermolculaire ; ce type de compos est observ dans dautres familles que les sucres. La rponse pourrait tre quon prpare les alkyl glycosides en prsence dun gros excs dalcool. En fait, ces actals internes drivs de sucres sont une famille de composs bien connus et parfaitement stables en conditions non acides. On les nomme comme des drivs de pyranose ou furanose, par exemple un x, y-anhydro-P-D-pyranose est un P-D-pyranose avec un pont ther entre les carbones de rang x et y. Nous cest--dire lactal traiterons pour commencer des 1,6-anhydro-P-D-pyranoses, mixte interne entre la fonction aldhyde et lhydroxyle port par le carbone 6. Le squelette gnral de ces composs est 3.13. La conformation du cycle pyranose est la conformation D-C, inexistante avec les pyranoses libres. Elle prsente un effet anomrique favorable mais une disposition axiale de la chane latrale inacceptable dans le cas dun pyranose libre. I1 est difficile de prvoir sa contribution lnergie libre de la molcule, puisquil y a fermeture dun nouveau cycle. 1 1 est en tout cas certain quun substituant axial en C-3 introduit une forte compression strique. Le reprsentant le plus stable de la srie doit tre le triquatorial 3.14, drivant du D-idose 3.15. Nous avons mentionn au chapitre 2 linstabilit

HO-

C i ? H

FHO
I

H-C-OH

W -OH

CH,OH
3.13 3.14

3.15

52

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

conformationnelle de ce sucre. Par chauffage en solution aqueuse, en prsence dun acide dilu, il donne le 1,o-anhydride avec un rendement de 86 %. Cest donc, de loin, la configuration la plus stable en solution. Par contre, les trois sucres glucose, mannose et galactose ne donnent que des traces de 1,6-anhydride dans ces conditions. On prvoit en effet une puissante interaction 1,3-diaxiale entre CH, et lhydroxyle en 3 pour ces trois configurations, comme par exemple dans le 1,6-anhydro-D-glucose 3.16. A titre dexercice, le lecteur pourra interprter en termes danalyse conformationnelle les rendements de conversion en 1,6anhydrides des sucres suivants en solution acide 10O0C[1 : glucose (0,2 %) ; mannose (0,8 %) ; galactose (0,8 %) ; talose (2,8 %) ; allose (14 %) ; gulose (6.5 %) ; altrose (6.5 %) ; idose (86 %). I1 trouvera les configurations de ces hexoses au chapitre 4. Alors quen milieu acide, ces anhydrides sont en quilibre avec des quantits variables dhexoses correspondant, ils sont trs stables en milieu alcalin, comme tous les glycosides, et les actals dune faon gnrale. On peut prparer ceux qui sont instables en milieu acide par une raction trs originale et trs efficace, le chauffage 100 dun aryl P-D-glycopyranoside peractyl. Ainsi, le phnyl ttra-O-actyl-P-D-glucopyranoside 3.12 donne-t-il le 1,6-anhydro-D-glucose 3.16, facilement isolable avec un rendement de 80 % par peractylation et recristallisation du peractate hautement cristallin[*]. La raction fait apparemment car elle ne se produit pas si lhydroxyle intervenir un intermdiaire 1,2-anhydro, en 2 du glucoside est bloqu par mthylation et lanomre a 3.11 nest pas ractif. Lorsquun pyranose est transform en 1,6-anhydropyranose, les hydroxyles axiaux deviennent quatoriaux et vice versa. Cest sans doute la proprit la plus intressante du point de vue synthtique cause du changement de ractivit. Mais il y a des limites lutilit des 1,o-anhydro ; lespace endo entre loxolane et loxane est trs peu accessible et les nuclophiles sy introduisent difficilement, si bien quil peut tre difficile de substituer les hydroxyles activs par la raction SN2 impliquant lattaque endo. Pour finir, notons que lon sait galement prparer certains 1,4-anhydropyranoses. Les anhydrides 1,2 se comportent comme des oxiranes trs ractifs. Dailleurs on prpare 3.17 comme un oxirane, par attaque dun carbone chlor par un alcoolate vicinal, dans ce cas laction de lammoniac sur un driv du glucose chlor en 1 avec un hydroxyle libre en 2. On a prconis rcemment lpoxydation des
CH,OAc

OH
3.16

H
3.17

Anhydropyranoses et anhydrofuranoses caractre actalique

53

glycals tel 3.18 par le dimthyldio~irane[~I. Lorsque la protection R est le fait de

benzyles, ou de ter-butyldimthylsilyles, on observe lintroduction spcifique de loxygne en trans de loxygne en 3 (Equation (3.1) ; produits 3.18 et 3.19). Ces oxiranes sont ouverts froid, sans cutalyseur, par les alcools primaires (CH30H, PhCH,OH), avec inversion de configuration et donnent presque quantitativement les glycosides 1,2-trans, 3.20 (Equation (3.2)).Le compos 3.17 a permis la synthse du saccharose 3.21 par une raction superficiellement analogue, mais videmment plus complexe, puisquil y a rtention de configuration, quil faut oprer 100 h 100C, et que le rendement est faible114J.On connat dautres drivs de sucres qui se transforment en glycosides froid sans catalyseur. Les diazirines, 3.22 par exemple, peuvent donner des glycosides, mme avec des alcools secondaires (Equation (3.3)). Lintermdiaire est probablement le carbne 3.23[51.
CH,OR H,OR

3.18

3.19

CH,OR

CH,OR I

OH
3.20

OH
3.21

54

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

3.22

3.23

3.5 PROPRITS CHIMIQUES DES GLYCOSIDES


3.5.1 Hydrolyse en milieu acide[6],[I7],
[I8]

En prsence dun excs deau, la raction rversible de la figure 3.1 se droule videmment de droite gauche. Les glycosides en solution aqueuse sont dcomposs par les acides. Cette raction a suscit un intrt passionn. I1 y aurait Le mcanisme le plus gnralement dj eu << des milliers darticles B en 1979[16]. Lintermdiaire, proton rveradmis semble tre celui de J. T. Edward (1955)[19]. siblement sur loxygne exocyclique volue vers lion carbnium << cation glycosyle , ou subit une substitution bimolculaire par une molcule deau (Fig. 3.3). Avec une dure de vie dans leau de lordre de seconde, le cation glycosyle serait G la limite de lexistence relle >>L2OI. Lenvironnement serait ncessairement impliqu dans les ractions dun intermdiaire aussi instable.

lent

+ H,O
A

Produits

Figure 3.3 Mcanisme propos pour lhydrolyse des glycosides.

Dune faon plus gnrale, S tant le glycoside, on a le chemin ractionnel (3.4) ;

S + H (eau) (SH + ] produits La vitesse globale est proportionnelle [SH 1 puisque la concentration en eau est pratiquement constante. Comme S est une base trs faible, sa protonation est quilibre selon lgalit (3.5) et la vitesse de raction est alors donne par lexpression (3.6).
(3.4)
+

Proprits chimiques des glycosides

55

(3.5)

(3.6)

v = k [SH] = -[H+] [SI


K

En prsence dun excs de glycoside, la constante de vitesse pseudo-monomolculaire k est proportionnelle la concentration en ions hydronium (Equation (3.7)).

(3.7)

k = 1 [H]

En toute rigueur, il faudrait introduire lactivit des ions hydronium, car on opre parfois dans des solutions acides concentres (HCl2,5 M, H,SO, 2 M, etc.). On a aussi fait intervenir les fonctions dacidit dans les tudes mcanistiques, mais le fondement mme de la thorie des fonctions dacidit a donn lieu rcemment de vives critiques[21]. I1 suffira pour une discussion qualitative de confondre activit et concentration. I1 y a tellement de variations possibles dans les conditions de mesure, selon la nature et la concentration de lacide et selon la temprature, et lventail des valeurs de k est si tal, quil est difficile de prsenter les rsultats dune faon la fois uniforme et rigoureuse. Un auteur[*]a choisi de calculer la valeur k, de la constante de vitesse 100C, dans HCI normal partir de sa valeur k toc, dans lacide de concentration molaire c, par la relation (3.8) qui suppose connue lnergie dactivation E# (en cal mol-).

Lexpression (3.9) donne les dures de demi-raction en minutes, plus parlantes pour le chimiste de synthse. (3.9)
t
112

/m =---

O, 69
-1

klmn

On trouvera sur le tableau 3.2 des rsultats caractristiques pour quelques glucosides banals ainsi que pour les composs 3.24,3.25,3.26,3.27,3.28,3.29,3.30 et 3.31. Certaines extrapolations, loin des conditions relles de mesure sont sans doute irralistes, surtout pour les glycosides trs labiles. Nanmoins le tableau 3.2

56

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

Exemple
1

Glycoside

t 112mn

2 3
4

5
6 7 8 9
10 11

12
13 14

15

Mthyl a-D-glucopyranoside (3.24) Mthyl P-D-glucopyranoside Ethyl P-D-glucopyranoside Phnyl a-D-glucopyranoside Ethyl 0-D-glucofuranoside Mthyl a-D-galactopyranoside (3.1) Mthyl P-D-ribopyranoside (3.26) Mthyl 2-doxy-a-D-arabino-hexopyranoside (3.25) Mthyl 2-doxy-a, P-D-erythro-pentopyranoside (3.27)* Mthyl 6-doxy-a-L-galactopyranoside (3.28)** Mthyl 2-actamido-2-doxy-~-D-glucopyranoside (3.29) Mthyl 2-amino-2-doxy-P-D-gluco-pyranoside, chlorhydrate (3.30) ter-Butyl P-D-glucopyranoside Trithylmthyl P-D-glucopyranoside Mthyl a-D-fructopyranoside (3.31)

32
19

13
12

0,06 6 4

0,02 < 0,005


1 1O0

2800 0,075 0,003 0,003

Tableau 3.2 Comparaison des vitesses dhydrolyse de glycosides. (* Estimation ; ** mesure faite sur lnantiomre.)

3.26

3.27

OH

OH
3.28 3.29

H , O C H -

c 1 NH,
3.30

H + OH
3.31

CH,OH

OCH,

Proprits chimiques des glycosides

57

donne probablement une base de comparaison satisfaisante. Le lecteur qui voudrait exploiter numriquement les donnes publies est renvoy aux ouvrages cits. Les exemples 1 et 2 de ce tableau 3.2 montrent que lanomre mthyle quatorial est hydrolys environ deux fois plus vite que lanomre mthyle axial. Cest une proprit de la plupart des couples de glycosides. Notons cependant quavec ces glucopyranosides, lordre sinverse au-dessus de 132C. Le changement du mthyle en thyle na pas un effet considrable, mais la vitesse dhydrolyse des phnyl glycosides est nettement plus leve (exemples 1 et 4). La comparaison des exemples 3 et 5 montre lextrme labilit des furanosides. Lorsquil ny a pas dhydroxyle en position 2, lhydrolyse est galement considrablement acclre (comparez les exemples 1 et 8 dune part, 7 et 9 dautre part). Cest lextension la chimie des glycosides dune proprit bien connue des actals simples : lhydrolyse du dithyl actal CH,OH - CH (OEt), est 300 fois plus lente que celle de CH, - CH (OEt),. Leffet se manifeste aussi, mais trs attnu, lorsquil y a un hydroxyle manquant une position plus loigne de la fonction actal : comparer les exemples 6 et 10. Le compos 3.28 est un glycoside du fucose, qui est un sucre important dans des cellules vivantes ; il faut tenir compte de cette labilit particulire en chimie des oligosaccharides fucosyls. Les pyranosides fonction amide, comme 3.29 et son isomre D-gulucto, ont une importance considrable dans les cellules vivantes. Lors de lhydrolyse acide de la fonction actal de 3.29 80C dans HC1 N ( k = 7,25 min-), on observe lhydrolyse simultane de lamide ( k = 2,13 IOp3 min-), ce qui conduit, pour une fraction notable du produit de dpart, laccumulation du glycoside amin 3.30 proton dans le milieu. La charge positive sur lazote soppose la protonation de loxygne actalique, qui donne un dication, si bien que lhydrolyse de 3.30 est trs lente. Comparez ce sujet les exemples I , 11 et 12. Les oligosaccharides des parois cellulaires contiennent des units N-actylglucosamine ou N-actylgalactosamine rattaches la chane par des liaisons glycosidiques et la dtermination des conditions exactes de sparation de ces units par hydrolyse acide est particulirement importante. Enfin lexemple 15 montre la fragilit des ctosides. Parmi les sucres ctoniques naturels, il en est un qui nous intresse tout particulirement, cest lacide sialique, dont les glycosides sont hydrolyss dans des conditions trs modres : les glycosides de lacide sialique combinent les proprits des glycosides ctoniques et celles des sucres dsoxygns au voisinage immdiat de la fonction actal. Lacide sialique, sous forme sialoside, occupe une position priphrique dans les oligosaccharides des parois cellulaires, schmatise selon la structure 3.32. On le spare quantitativement par un chauffage dune heure dans HCl0,l M 80C. Parfois lacide sialique se prsente sous une forme actyle, telle que 3.33. Le problme analytique est alors dhydrolyser slectivement sans dsactyler, et on emploie HC1 0,01 M ou lacide formique, une heure 60C, mais lhydrolyse de la fonction glycosidique nest pas totale dans ces conditions[22].

58

Alkyl et aryl glycosides. Glycosyiamines

CH,OR

1
3.32
3.33

R'=H
R'=Ac

3.34

On notera, sur les exemples 13 et 14, l'norme labilit des glycosides d'alcools tertiaires. On pense que leur hydrolyse s'effectue par un mcanisme diffrent de celui de la figure 3.2, faisant intervenir, comme pour les halognures de ces alcools, un ion carbnium, tel Me3C+. Les tudes cintiques permettent de calculer les grandeurs d'activation, relies par la formule (3.10). (3.10) AG$ = & - TAS$ Pour 24 pyranosides, 60" C, on observe la relation numrique (3.11) ; d'autres valeurs publies sont du mme ordre. (3.11)

+ 4,l

2 AS$/ cal mol-' deg-' 2 23,O moyenne : 13,7

Sur un nombre restreint de furanosides, on a observ, au contraire, une valeur ngative[l71.


- 11,l IAS$ 2 - 8,3

On interprte ces chiffres comme l'indication d'un mcanisme d'hydrolyse diffrent[ 61.

3.5.2 Hydrolyse et transfert enzymatiques


Les enzymes glycoside-hydrolases, plus simplement << glycosidases , catalysent l'hydrolyse des liaisons glycosidiques dans des conditions voisines de la neutralit. On a donn dans le tableau 3.3 une liste de glycosidases commerciales, dont le prix est suffisamment modr pour qu'on puisse en envisager l'utilisation en chimie prparative. L'efficacit de cette catalyse est prodigieusement augmente par rapport celle de la catalyse acide. La comparaison directe avec les alkyl glycosides n'est pas possible, car il n'y a pas d'hydrolyse non enzymatique perceptible au voisinage de la neutralit, mais on peut mesurer une vitesse de raction au pH 5 avec le P-D-glucopyranoside du paranitrophnol 3.34. Dans l'eau 25" C, pH 5,0, la trs faible constante pseudo-monomolculaire est 52 x lo-'* s-l. En prsence de la P-D-glucosidase des amandes amres, dans les mmes conditions, on mesure une valeur de k gale 78 ss', soit environ lo'* fois plus leveI231.

Proprits chimiques des glycosides

59

Enzyme a-D-Glucosidase P-D-Glucosidase a-D-Galactosidase P-D-Galactosidase a-D-Mannosidase a-D-Fucosidase a-D-Neuraminidase (Sialidase)


N-acetyl-P-D-glucosaminidase

Source levure amandes grains de caf vert


Escherichia coli

fve Jack reins du buf


Arthrobacter ureofaciens, Clostridium Perfringens

P-D-Fructosidase (Invertase)

reins du buf levure

Tableau 3.3 Proprits de quelques glycoside - hydrolases commerciales.

On a aussi cherch comparer les vitesses dans les conditions o elles obissent toutes deux une loi du second ordre, par rapport la concentration en substrat et celle du catalyseur. On trouve alors que lenzyme est I O l 4 fois plus efficace que les ions hydronium. Un tel rapport de vitesse correspond une chute de lnergie dactivation voisine de 18 kcal mol-. On distingue les << exoglycosidases >> et les << endoglycosidases . Les premires hydrolysent des liaisons glycosidiques terminales dans les chanes oligosaccharidiques (voir le chapitre 9) et les secondes des liaisons internes. Dans le cadre de ce paragraphe, essentiellement consacr la chimie prparative, nous traiterons exclusivement des premires, qui sont trs nombreuses, car elles catalysent aussi lhydrolyse dalkyl et daryl glycosides. Chaque glycosidase est spcifique de la configuration du sucre qui intervient dans la liaison glycosidique par son oxygne anomrique. Elle est relativement indiffrente la nature du groupement organique li cet oxygne. Cette observation permet une classification en groupes : a-D-glucosidases qui hydrolysent tous les a-D-glucosides, P-D-galactosidases qui hydrolysent tous les 0-D-galactosides, etc., avec, au sein de chaque groupe, de petites variations de proprits suivant lorigine. Si maintenant on sattache la configuration, on voit quil y a quatre cas de figure a, b, c, d pour les pyranosides et deux cas de figure e,fpour les furanosides (Fig. 3.4). Lhmiactal au second membre est reprsent tel quil est immdiatement aprs sa sparation du site actif. Les hydrolyses procdent globalement avec rtention de configuration (a, b, e) ou inversion (c, d,A. On adopte donc des symboles de classification, qui sont, dans lordre a, b, c, d, e, 5 p (e-e), p (a-a), p (e-a), p (a-e), f (r), f (i). Toutes les glycosidases du tableau 3.3 fonctionnent avec rtention de configuration. En raison de la rapidit de la mutarotation, il est difficile davoir une certitude sur la configuration anomrique de lhmiactal au dpart de lenzyme. La rponse est donne par une autre raction des glycosidases rtention : elles catalysent

60

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

a
H
I

OR

+ H2

= + O H

RoH

b
OR I OH

OH

d
OR

e
H

qH +
RoH

f
+ O H OR H
I

RoH

Figure 3.4 Chemins possibles dhydrolyse enzymatique dun glycoside.

le transfert de glycosyl dune aglycone une autre, selon lquation (3.12) o GOR et G-OR sont deux glycosides du sucre G-OH.

(3.12)

G. OR + ROH

G. OR + R. OH

Lhydrolyse apparat alors comme le cas particulier du transfert sur leau, H-OH. I1 ny a alors plus dambigut sur la configuration anomrique du glycoside produit, incapable de mutarotation. On trouve que cest la mme que celle du glycoside de dpart. Cette conclusion simpose dailleurs en fonction de la rversibilit de la raction (3.12) par application du principe de microrversibilit. Si

Proprits chimiques des glycosides

61

la configuration anornrique ntait pas la mme dans les deux membres, lenzyme devrait pouvoir hydrolyser par le mme chemin les deux configurations opposes. La raction (3.12) suggre des applications synthtiques des glycosidases autres que lhydrolyse. Ainsi on observe la raction (3.13) en solution aqueuse en prsence dune a-D-galactosidase.

(3.13) + & HO H

OAr

+;oh hok
4

WH3

HO
OCH,

3.35

On fabrique ainsi trs rapidement un disaccharide 3.35 caractristique du groupe sanguin humain B. Le rendement est mdiocre, mais les autres mthodes purement chimiques connues impliquent de nombreuses tapes et ne sont finalement pas plus performantes. Dans les mthodes glycosidases, le rendement est faible, mais le cot des matires premires est ngligeable par rapport la valeur des oligosaccharides. Linconvnient nest pas l : il faut sparer les produits dun gros excs de substances trs voisines et trs polaires, problme qui na pas encore de solution conomique grande chelle. Le mcanisme de lhydrolyse enzymatique est encore sujet controverses[2] 1231. I1 y a accord sur un point : la rtention rsulte de deux inversions conscutives, lune lors de lattachement lenzyme, et lautre lors du transfert de glycosyl sur laccepteur.

3.5.3 Stabilit des glycosides dans les conditions neutres ou alcalines Rle protecteur
Les glycosides ne sont hydrolyss en milieu alcalin que dans des conditions extrmes, tout fait trangres la pratique synthtique courante. Pour toutes les ractions qui seffectuent en milieu neutre ou alcalin, les glycosides ont les proprits des polyols cycliques. Les sucres hmiactal ne supportent pas lalcalinit, en raison du caractre daldol du tautomre carbonyl. Pour effectuer des transformations au niveau des hydroxyles impliquant des conditions alcalines, on a avantage transformer dabord le sucre en glycoside. Par exemple, le fucose benzyl 3.37 est un intermdiaire obligatoire dans lactivation du fucose pour lintro-

62

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

I
B

OBn
3 . 2 8 R=H

OBn
3.37

3 . 3 6 R=CH,Ph(Bn)

duction de lunit a-fucopyranosyl dans les oligosaccharides. On le prpare en trois tapes : glycosidation du fucose en mthyl glycoside 3.28, benzylation des hydroxyles avec le chlorure de benzyle et lhydrure de sodium dans la N, N-dimthylformamide, ce qui donne 3.36 et finalement hydrolyse acide en 3.37. Le passage par le mthyl glycoside comme forme protge et le retour final Ihmiactal par hydrolyse acide ne sont possibles que si le produit final est stable dans les conditions dacidit ncessaires. Ainsi, sil y avait des substituants actyl au lieu de benzyl sur lintermdiaire 3.36, ils disparatraient partiellement au dbloquage. La plupart des sucres eux-mmes sont trs stables en milieu acide. Cependant, le fructose se transforme partiellement en acide lvulique CH,COCH,CH, COOH en milieu acide 100 C. Quant au dsoxyribose, il suffit de conditions acides trs modres pour quil se transforme quantitativement en acide lvulique. Le cas le plus frquent est celui o le dbloquage acide de la fonction protectrice risque dhydrolyser dautres liaisons glycosidiques, que lon dsire garder dans la molcule. Dans ce cas, on effectuera la protection en prparant un glycoside de lalcool benzylique, le groupement protecteur tant limin dans des conditions neutres par hydrognolyse sur palladium sur charbon (Fig. 3.5).

Figure 3.5 Hydrognolyse catalytique.

3.6 GLYCOSYLAMINES ET NUCLOSIDES 3.6.1 Gnralits


Nous traitons ici ces composs en raison de leur analogie de structure avec les glycosides oxygns mais leur rle est bien diffrent. Ce ne sont pas des intermdiaires souvent utiliss en synthse. On trouve dans cette famille des structures

Glycosylamines et nuclosides

63

naturelles universellement rpandues. Certaines transformations dcrites ci-dessous sont des modles valables de chemins biosynthtiques bien tablis.

3.6.2 Glyc~sylamine[~~]

Prparation
Le traitement des aldohexoses ou aldopentoses par lammoniac liquide ou en solution alcoolique remplace lhydroxyle anomrique par NH,, et donne un mlange anomrique de glycosylamines pyranosides. Le driv quatorial est prpondrant. On observe souvent sa cristallisation directe partir du milieu ractionnel. Ainsi le glucose donne-t-il la P-D-glucosylamine 3.38. Les amines primaires et secondaires aliphatiques conduisent aux glycosylamines substitues 3.39 et 3.40. Avec les arylamines moins nuclophiles, il peut tre ncessaire dutiliser un catalyseur acide modr comme un sel dammonium pour obtenir larylamine 3.41 en gnral bien cristallise. Les ctoses traits comme ci-dessus donnent les ctosylamines alkyles sur lazote, trs labiles en milieu acide. On voit que les fonctions carbonyles des sucres libres ne donnent pas de bases de Schiff. On ne peut les obtenir avec les sucres aldhydiques que si la formation de lhmiactal est rendue impossible par le blocage des fonctions alcool (on dit alors quon a affaire un sucre ald@h?d).

3 . 3 8 R=R=H 3 . 3 9 R=H, R = alkyl

3 . 4 0 R,R = alkyl

3.41

R=H, R = aryl

Comme dans les synthses de glycosides oxygns, il peut tre ncessaire de partir dun driv activ du sucre, par exemple lhalognose peractyl 3.7. On observe de la mme faon la formation du driv trans-1,2lorsquil y a un groupement participant sur la position 2 du sucre. Nous dtaillerons titre dexemple la prparation du compos 3.42 que lon trouve au point dancrage de la chane oligosaccharidique sur la chane polypeptidique dans les glycoprotines[2s][26] (voir le chapitre 13). Lazote de la fonction amide serait sans doute trop peu nuclophile pour quon puisse envisager une condensation directe sur le sucre libre. A partir de lhalognose peractyl 3.43 driv de la N-actylglucosamine, la substitution par iazoture de ttrabutylammonium donne Iazoture quatorial 3.44, rduit en amine 3.45 par hydrognation catalytique sur du platine. On condense lamine 3.45 avec le carboxyle libre de laspartate partiellement protg 3.46 au moyen de N, N-dicyclohexylcarbodiimide. La synthse se termine par hydrolyse alcaline des fonctions esters et la libration de la fonction a-amino de la partie aspartate par hydrognation catalytique.

64

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

NHrC-H

CH,OAc
BnOCONH-

C -H

A Ac0 c o = & R

Proprits des glycosylamines


I1 y a mutarotation en solution. La figure 3.6 donne un mcanisme possible. La protonation de loxygne cyclique est suivie de louverture du cycle, qui donne un intermdiaire o le carbone anomrique a perdu sa chiralit. Le mme interm-

hR,

Figure 3.6 Mcanisme propos pour lhydrolyse dune glycosylamine.

Glycosylamines et nuclosides

65

diaire peut voluer vers la formation du produit dhydrolyse, qui est trs rapide avec les glycosylamines, sauf aux pH extrmes suprieurs 9, ou infrieurs 1,5. En milieu trs acide, la protonation de lazote introduit une charge positive qui soppose celle de loxygne. Par exemple, la B-D-glucosylpipridine est stable 17 h O dans HCl 2N. La vitesse dhydrolyse est maximum au voisinage de pH 5. Les arylglycosylamines sont plus rsistantes. Les N-glycosylamines se rarrangent au chauffage en prsence de traces dacides en drivs arylamins de ctose. Par exemple la glucosylamine 3.41 donne le fructose amin 3.47. En fait, la raction se produit avec les glycosylamines les plus varies, drives damines aliphatiques, dacides amins, etc., avec quelques variations dans les procds. Elle est connue sous le nom de rarrangement d Amadori. La biosynthse de lindole dans les entrobactries fait intervenir un tel rarrangement, dont chaque tape est catalyse enzymatiquement. Un driv activ du phosphate du ribose 3.48 se condense lacide anthranilique 3.49, donnant une N-aryl ribosylamine 3.50. Le rarrangement de 3.50 conduit 3.51 qui a un carbonyle libre. Lattaque lectrophile sur le carbone ipso du carboxyle, suivie de dshydratations, donne le cycle indole li un triol phosphate, 3.52. Celui-ci se dtache ensuite par rupture rtroaldolique. Un autre rarrangement remarquable dans cette srie est le rarrangement de Heyns. Les ctosylamines se transforment en 2-amino-2-doxyaldoses dune manire strospcijique. Le fructose dans lammoniac alcoolique donne une fructosylamine 3.53 qui se transforme spontanment en 2-amino-2-doxy-D-glucose 3.55. On observe la mme raction spontane avec dautres fructosylamines substitues lazote, par exemple 3.54 donne 3.56. Parfois il faut une catalyse
NHAr

H
3.47

2 OH O

CH,OPO,H, y70H+a;

OH
3.49 3.50

J Q

C02H

OH
3.48

OH

66

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

CH,OPO,H,
3.51 3.52

CH,OH

H&O, O H o NHR

HO
3 . 5 3 R=H 3 . 5 4 R=CHMe, 3 . 5 5 R=H 3 . 5 6 R=CHMe,

acide. Cest au moyen de ce rearrangement que les cellules fabriquent le sucre fondamental dans leur conomie, partir du amin 2-amino-2-doxy-D-glucose, fructosyl-phosphate. Le donneur du groupement NH, est lacide amin glutamine. Nous avons dj signal cette biosynthse, qui explique lappartenance de la N-actyl-glucosamine la srie D des sucres, au chapitre 1, paragraphe 1.2.

3.6.3 Nuclosides[27]
Dans ces aminoglycosides, lazote fait partie dun htrocycle et le sucre est le D-ribose, ou son driv dsoxygn en 2, le G dsoxyribose , dont le nom correct tous les deux ltat de furanose. Les ribosides, est 2-dsoxy-D-rythro-pentose, lis par des fonctions phosphodiester entre les fonctions alcool 3 et 5 , forment lacide ribonuclique (ARN), et les dsoxyribosides forment de la mme faon lADN. Llucidation progressive du rle de ces deux molcules en gntique est sans doute la dcouverte la plus importante de la seconde moiti du xxe sicle, et lauteur pense quaucune personne cultive na le droit dignorer les formules 3.57,3.58, 3.59 et 3.60, dune part, et 3.61, 3.62, 3.63 et 3.64, dautre part, quelle que soit sa formation par ailleurs. La chimie de lADN et de 1ARN ne fait pas partie du cadre de cet ouvrage, seul laspect aminoglycoside sera trait. Donc la longueur de ce paragraphe est sans commune mesure avec limportance de ces molcules. On trouve en plus dans les acides nucliques, en particulier dans lacide ribonuclique de transfert (t-RNA), une cinquantaine de nuclosides modifis, en

Glycosylamines et nuclosides

67

OH
3.57 3.58

R
R=OH, R = H R=H, R=CH,

OH
3.59

R=OH 3 . 6 0 R=H

3 . 6 1 R=OH

3.63

R=OH

3 . 6 2 R=H

3.64

R=H

gnral assez voisins des types fondamentaux. Enfin, on trouve ltat naturel un trs grand nombre de nuclosides, comportant des bases htrocycliques varies, et des sucres varis, souvent dous de proprits thrapeutiques plus ou moins grandes. Comme les produits de cette dernire catgorie ne sont pas des constituants universels de la cellule vivante, ils sont galement en dehors du cadre de ce livre. Les nuclosides fondamentaux sont facilement prpars par hydrolyse chimique ou enzymatique, partir de sources abondantes comme 1ARN de la levure et lADN de la laitance de poisson et sont commercialement disponibles. Les synthses que nous allons donner ne se justifient donc que dans leur extension la prparation de nuclosides modifis, ou marqus isotopiquement. On obtient ladnosine par condensation du chlorure de ribofuranosyle activ 3.65 avec le driv chloromercuriel de la 6-benzamidopurine 3.66, suivie de dbenzoylation. (Raction (3.14)).

68

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

A
3.65

kgCl
3.66

CH20Bz

Ac SiMej \ /

(3.15)

$ > -O A c

I l
OAc

OBz

CAOSiMe3 a-.)
-OH

O H

3.67

On prpare souvent les nuclosides pyrimidiques par la mthode de Vorbriiggen[28].Le driv silyl de la base est condens avec le peractate du sucre froid en prsence de SnC1,. La raction (3.15) donne la prparation dune homocytidine 3.67 par cette mthode[29].Vorbrggen a introduit dautres catalyseurs plus rcemment. On remarquera que lon obtient uniquement, avec un Ceci est une consquence, une fois de excellent rendement, le driv P-truns-1,2. plus, de la prsence dun groupement participant en C(2). Aussi, lorsquon applique ces mthodes la prparation des dsoxyribonuclosides obtient-on en gnral un mlange de nuclosides a et p. Pour dautres composs, on a trouv avantageux de construire lhtrocycle sur lazote de la ribosylamine. Le traitement du ribose par lammoniac donne la ribopyranosylamine 3.68 qui subit une rgression de cycle lors de la ctalisation avec lactone ; on obtient 3.69. La condensation de 3.69 avec le driv 3.70 du cyanoactate de mthyle donne le P-ribosylimidazole 3.71. Dsactalation et dcar-

CH20H

* 2

w OH

O
3.68

x
3.69

Me

Me

Rfrences

69

C0,Me EtO-CH=N-CH C-N


3.70

OR
3.7 1 3.72

OR

R,R=CMe, R=R=H

R=CO,Me

boxylation de 3.71 conduisent au nucloside 3.72 dont le phosphate est le prkcurseur naturel des nuclosides drivs de ladnine[301et de la pyrimidine de la thia-

RFRENCES
R. J. Ferrier et P. M. Collins, Monosaccharide Chemistry, (chapitre 3) Penguin Books,

Harmondsworth, 1972.
W. G. Overend, Glycosides , dans The Carbohydrate, sous la direction de W. Pigman et D. Horton, (vol. iA, chapitre 9) Academic Press, New York, 2e d.,

1972. R. J. Ferrier,

<<

The Reaction and Synthesis of Monosaccharide Derivatives N dans

Carbohydrate Chemistry, sous la direction de J.F. Kennedy, (chapitre 11) Clarendon

Press, Oxford, 1988. J. W. Green, Adv. Carbohydr Chem., 21 (1966) 95-142. En ce qui concerne les mcanismes donns dans ces ouvrages [ 11, [2], [3] et [4], le lecteur se rappellera que, si les faits demeurent, leur interprtation volue vite. G. N. Bollenback, Methods Curbohydr: Chemistry II, 326-328. I. Augestad et E. Berner, Acta Chem. Scand., 8 (1954) 251-256. A. Lubineau et J. C. Fischer, Synthetic Communications, 1991 (21) 815-818. S. Angyal, M. E. Evans et R. J. Beveridge, Methods Carbohydr Chem., VI11 (1980) 233-235 S. Hannessian et J. Banoub, Methods Carbohydr: Chem., VI11 (1980) 243-245. H. S . Isbell et H. L. Frush, J. Res. Nat. Bur Stand., 24 (1940) 125-151. S. J. Angyal and K. Dawes, Aust. J . Chem., 21 (1968) 2747-2760. G. H. Coleman, Methods Carbohydr: Chem., II (1963) 397-399. R. H. Halcomb et S. J. Danishefsky, J. Am. Chem. Soc., 111 (1989) 6661-6666. R. U. Lemieux et G. J. Huber, J. Am. Chem. Soc., 78 (1956) 41 17-4119. K. Brimer et A. Vasella, Helv. Chim. Acta, 72 (1989) 1371-1382.

70

Alkyl et aryl glycosides. Glycosylamines

[16] A. E Bochkov et G. E. Zaikov, The Chemistry of the O-Glycosidic Bond, Pergamon Press, Oxford, 1979. [17] J. N. Bemiller, Adv. Carbohyds Chem., 22 (1967) 25-108. [ 181 J. Szejtli, Surehydro1.v.w glykosidischer Bindungen, Akadmiai Klad6, Budapest, 1976. [ 191 J. T. Edward, Chem. Ind. London (1955) 1102. [20] M. L. Sinnott, Chem. Rev., 90 (1990) 1171-1202. [21] C. D. Ritchie, Physical Organic Chemistry, Editions Marcel Dekker, New York, 1990. [22] R. Schauer, Adv. Carbohydl: Chem. Biochern., 40 (1982) 13i -234. [23] G. Legler, Adv. Curbohyds Chem. Biochein., 48 (1990) 319-384. [24] H. Paulsen et K.W. Pflugthaupt, The Carbohydrates, Chemistry and Biochemistry, sous la direction de W. Pigman et D. Horton (vol. 1B p. 881), Academic Press, New York, 2e d., 1980. [25] H. G. Garg et R.W. Jeanloz, Adv. Carbohyds Chem. Biochem., 43 (1985) 135-201. [26] C. Aug, C. Gautheron et H. Pora, Carbohydr: Res., 193 (1989) 288-293. [27] J. A. Secrist III, Curbohydrute Chemistry, sous la direction de J.F. Kennedy (chapitre 11) Clarendon Press, Oxford, 1988. [28] U. Niedballa et H. Vorbrggen, Ang. Chern. Int. Ed. Engl., 9 (1970) 40 1-462. [29] S. David et G. de Sennyey, Cnrbohydr: Res., 77 (1979) 79-97. [30] N. J. Cusack, B. J. Hildick, D. H. Robinson, P. W. Rugg et G. Shaw, J . Chem. Soc., Perkin I (1 973) 1720-1731. [31] B. Estramareix et S. David, Biochim. Biophys. Acta, 1035 (1990) 154-160.

CHAPITRE 4

Nomenclature

4.1 INTRODUCTION
Nous avons diffr jusquici lexpos de la nomenclature des sucres en raison de la scheresse du sujet. Nous esprons avoir suffisamment intress le lecteur dans les trois premiers chapitres pour quil se sente le courage daborder celui-ci. De cette nomenclature, nous ne donnerons que les rgles utiles dans cet ouvrage. Leur connaissance permet daborder la littrature originale et leur extrapolation des situations non envisages ici est possible avec un minimum de sens de la gnralisation. Ces rgles sont extrmement commodes. Les noms correspondants sont utiliss ( de minimes dtails prs) dans les tables par composs chimiques (Chemical Substances Index) de Chemical Abstracts. Ce sont galement les noms que lon doit employer dans les parties exprimentales des mmoires, en tte des paragraphes qui dcrivent des prparations.

4.2 NOMENCLATURE DES ALDOSES 4.2.1 Noms courants des sucres et symboles de configuration
Les noms fondamentaux des aldoses, avec une chane 3-10 carbones et audel, sont : triose, ttrose, pentose, hexose, heptose, octose, nonose, dcose, etc. On numrote la chane partir du carbone porteur de la fonction aldhyde, relle ou potentielle. A ces noms, il faut ajouter un symbole qui dcrit la configuration des hydroxyles. Ces symboles drivent des noms communs des sucres. Le tableau 4.1 donne la configuration et le nom commun des sucres de la srie droite, de C, C,. Les sucres sont dessins selon la projection de Fischer. Cest toujours ce mode de reprsentation quil faut revenir pour trouver le nom systmatique dun driv de sucre. Ce tableau doit tre complt par le tableau de la srie gauche, dont les 616ments sont deux deux symtriques de ceux du tableau 4.1. Les dfinitions des sries droite et gauche ont t donnes ds le chapitre 1. Rappelons que la srie droite est dfinie par lorientation droite de lhydroxyle alcoolique secondaire de rang le plus lev. On omet parfois le descripteur de srie pour glucose, galacto-

HOHO H -3 -OH OH3


xoyqi-a

HozH3
-44
I
OH3

H-3-H

OH3

I I

HO-3-

OH3

1 I

HO-34

aaoqiiJa-a

HO

-44

OH4

ZL

Nomenclature des aldoses

73

CHO -OH H-

CHO FC-OH

-OH

CH,OH
4.1

CH,OH
4.2 4.3

I
CHO OH OH OH OH CH,OH
4.4

CHO

D-glco

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dglycro
L-ribo

..........~~~~.........

CH,OH
4.5

daire. On dcrit ces configurations par une association de symboles. On part du centre chiral le plus prs de la fonction aldhyde, on regroupe les centres chiraux par groupes de 4, jusqu ce quil nen reste plus que 3, 2, ou 1, qui forment un dernier groupe du ct de lextrmit non rductrice. A chacun de ces groupes, on peut attribuer un symbole de configuration. Dans le nom systmatique, on les numre dans lordre partir de lextrmit non rductrice : D-glq.cro-D-gluco-heptose, 4.4., L-ribo-D-manno-nonose, 4.5.

4.2.2 Sucres dsoxygns


Le remplacement dun hydroxyle alcoolique par de lhydrogne sindique par le prfixe doxy-, prcd dun chiffre qui donne la position dsoxygne. Nous pouvons maintenant donner les noms systmatiques complets des trois sucres 4.1, 3-doxy-D-rythro-pentose 4.2 et 4.3, cest--dire : 2-doxy-D-rythro-pentose, et 4-doxy-D-rythro-pentose. Un souci prsent dans cette nomenclature est de ne pas introduire de terme qui suggre la prsence de plus de centres chiraux quil ny en a rellement. Ainsi le nom courant << dsoxyribose >> a une connotation

74

Nomenclature

H D - C-H

HO

w-M,

FHO

*C-OH

Yo

W C-

Yo

OH

WC-OH

FtC-N,

F E -OH
Ho-

F F-

CH,
4.6

4.7

4.8

4.9

incorrecte, parce que ce sucre na que deux carbones asymtriques alors que la racine << rib0 D suggre la prsence de la configuration du ribose, avec trois carbones asymtriques. En bref, ne pas introduire de centre chiral une extrmit du nom systmatique pour leffacer lautre extrmit. La dsoxygnation de la fonction alcool primaire ne supprime pas de centre chiral. Par exemple, la varit naturelle la plus abondante du fucose, le L-fucose, 4.6, a comme nom systmatique 6-doxy-L-galacto-hexose.

4.2.3 Sucres substitus par NRR, F, C1, Br, I, N,, alkyl-S et phnyl-S
On remplace dabord le groupement non oxygn par un hydroxyle, ce qui donne la configuration de base. Ainsi celle du driv amin 4.7 est celle du Dgalacto-hexose, 4.8. La filiation entre 4.8 et 4.7 sindique avec deux prfixes : lun deux est dsoxy-, introduit au paragraphe prcdent, et lautre prcise la nature du substituant. Les descripteurs les plus courants sont amino, actamido, fluoro, chloro, bromo, iodo, azido, alkylthio, phnylthio. Lemplacement est donn par un chiffre qui prcde chaque prfixe. Exemple pour 4.7 : 2-amino-2-doxy-Dgalacto-hexose. On admet les noms de galactosamine, glucosamine et mannosaD-gluco- et D-manno-hexoses. mine pour les 2-amino-2-doxy-D-galacto-, Le mme principe permet de dsigner 4.9 comme le 3-azido-3-doxy-D-allo4.11 comme le 5-doxy-Shexose, 4.10 comme le 4-doxy-4-iodo-D-talo-hexose, mthyithio-D-ribo-pentose. Les prfixes doivent se succder dans lordre alphabtique, avant les descripteurs de configuration.

4.2.4 Drivs substitus sur loxygne


On indique cette substitution par un 0 majuscule en italique, suivi dun tiret puis du nom du substituant, et prcd dun chiffre qui indique la position de loxygne substitu sur la chane. On ne rpte pas les substituants identiques. Exemples : 3-O-benzyl-D-galacto-hexose 4.12, 3-O-benzyl-6-O-mthyi-Dgalacto-hexose 4.13, 3,6-di-O-benzyl-D-galacto-hexose 4.14. Dans ces drivs directs dun sucre du tableau 4.1 (ou dun sucre symtrique), on simplifie les noms en 3-O-benzyl-D-galactose, 3,6-di-O-benzyl-D-galactose, etc.

Nomenclature des aldoses

75

HO-

Yo
C-H

CHO FC-OH
W -OH

WC -

Yo
C-H

OH

*C--OH

Yo

HO-C-H

RO-

EEC-OH H W -CH,

F -OH
CH,SCH,
4.10 4.11

F F

Ho-F-H F

&OH CH,OR' 4 . 1 2 R=Bn,R'=H 4.15 4 . 1 3 R=Bn, R'=CH, 4 . 1 4 R=R'=Bn

-OH

W -OH

La substitution sur le carbone s'indique de mme avec un C majuscule en italique. Exemple : 4-C-mthyl-D-gulo-hexose, 4.15.
4.2.5 Formes acycliques
En raison du caractre exceptionnel des formes acycliques, certains auteurs prfrent insister sur cette particularit. Le compos 4.16 s'appellera 2, 3,4, 5 , 6penta-O-actyl-aldhydo-D-gluco-hexose, plus brivement aldhydo-D-glucose pentaactate. On notera que le prfixe aldhydo n'ajoute rien au premier nom, mais qu'il est indispensable au second.

4.2.6 Formes cycliques


On indique la dimension du cycle en remplaant la terminaison << se >> du nom du sucre par e furanose >> pour un cycle 5 lments, << pyranose >> pour un cycle 6 lments et << septanose >> pour un cycle sept lments. Comme nous l'avons dj vu, l'hydroxyle hmiactalique s'appelle anomrique. L'anomre a est celui qui en projection Fischer se trouve du mme ct que l'oxygne li au carbone asymtrique dont la configuration dfinit la srie. Le symbole de configuration ano-

76

Nomenclature

E F -OH
W C-OH
HO-C-H

I----------

F --OH

I+

"-TH
CH,OH
4.19

F 7

mrique, a ou p, est plac avant le symbole de srie. Exemples : p-D-galactopy4.19. ranose, 4.17, a-D-glucopyranose, 4.18, L-glycro-B-D-gluco-heptopyranose, On forge le nom des glycosides (voir le chapitre 3) en remplaant la terminaison << se >> de la forme cyclique par << ide . Le nom du groupe qui substitue l'hydrogne hmiactalique est mis en avant, comme un mot spar. Exemple : mthyl a-D-gulofuranoside, 4.20. Le radical form par dtachement de l'hydroxyle anornrique est dsign en remplaant la lettre terminale e >> par << yle . Exemples : bromure, 4.21 ou phosDans le cas du phate dipotassique, 4.22 de ttra-O-actyl-a-D-glucopyranosyle. remplacement par un groupe amino, on ajoute la terminaison amine : 2-actamido-2-doxy-~-D-glucopyranosylamine, 4.23.

Ac0
p OH m H 3

AcNH X
4 . 2 1 R=Br 4 . 2 2 R=OPO,K, 4.23

CH,OH
4.20

4.2.7 Alditols
Ils drivent du nom du sucre parent par le remplacement de << ose >> par << itol . Le mme alditoi peut driver de plusieurs sucres parents. Ainsi le D-arabinitol 4.24, nomm comme un driv du D-arabinose, est aussi accessible par rduction du D-lyxose et pourrait tre appel D-lyxitol. Diverses rgles, que nous ne donnerons pas ici, permettent de slectionner un nom unique.

Nomenclature des aldoses

77

WC-OH H-C-H HOC-H

pCH3 E ke O A c AcOC-H

ACo-F-H
4.24 4.25

I I

CH,OAc
4.26

Ho-bvco
FH,OH N
HO-7-HI

&-

HO

OH

vL,/
OH
1

HO OH
4 . 2 9 R=H 4.30 RSH,

F-OH

4.27 4.28

4.2.8 Acides aldoniques


Ce sont les acides carboxyliques qui rsultent de loxydation de la fonction aldhyde. On les nomme en remplaant << ose D par (( onique . Les sels, esters, halognures, amides et nitriles sont dsigns suivant les rgles habituelles de la nomenclature organique. Exemples : D-gluconate de sodium, 4.25, ttra--actylL-arabinonate de mthyle, 4.26, D-glucono- 1,4-lactone, 4.27, D-glucononitrile,

4.28. 4.2.9 Acides uroniques


On appelle ainsi les acides monocarboxyliques rsultant de loxydation de la fonction alcool primaire des aldoses. On les dsigne en remplaant la terminaison << ose >> du nom courant ou systmatique par << uronique >> et la terminaison << oside D dun glycoside par << osiduronique . Exemples : acide a-D-galacturonique, 4.29, a-D-galactopyranuronate de mthyle, 4.30.

4.2.10 Actals cycliques


On les crit par extension des rgles applicables aux drivs dalcools, avec comme prfixe, des noms de radicaux divalents tels quil existent dans la nomen-

78

Nomenclature

FCHO-

OH

C-H

4.31

4.32

4.33 R=OCH, 4.34 R=SCH,

CH,OH CO

O
4.35 4.36

CH,OH
4.37

4.38

4.39

clature gnrale. Exemples : mthyl 4,6-O-benzylidne-a-D-glucopyranoside, 4.31, 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne-a-D-glucofuranoside, 4.32.

4.2.11 Actals et thioactals


On emploie les mots actal et thioactal la suite du nom du sucre gnrateur. Exemples : D-glucose dimthyl actal, 4.33, D-glucose dimthyl dithioactal,

4.34. 4.2.12 Anhydrides intramolculaires


On fait prcder le nom du sucre du prfixe N anhydro >> suivi dun tiret. Ce prfixe est prcd de deux chiffres qui indiquent le rang des carbones ponts. 4.35. Exemple : 1,6-anhydro-P-D-glucopyranose,

Ctoses

79

Les oxiranes drivs de sucres rentrent dans cette catgorie. Remarquez que 4.36, mthyl 2,3-anhydro-4,6-0-benzylidne-a-D-allopyranoside, est nomm comme un driv d o . Dans le D-allose de base, chacun des hydroxyles ports par les carbones 2 et 3 a la mme position que le pont oxygne de 4.36 par rapport au cycle pyranose.

4.3 CTOSES
On les classe comme 2-ctoses, 3-ctoses, etc., selon la position du carbonyle dans la chane. On peut supprimer 2 pour les 2-ctoses, varit naturelle commune. On remplace la terminaison << ose >> du nom de base par << ulose . Ainsi le fructose est un 2-hexulose, ou, plus simplement, un hexulose. Pour le nom complet, on le fait prcder du prfixe de configuration. Le nom systmatique du fructose 4.37 sera D-arabino-2-hexulose. Dans le cas des 2-ctoses, il ny a pas dambigut possible sur la configuration des pyranoses et furanoses. La nomenclature est calque sur celle des aldoses. Exemple : B-D-fructopyranose 4.38. Le mthyl glycoside 4.39 de lacide sialique se dnomme : acide mthyl 5-actamido-3,5-

didoxy-D-glycro-a-D-galacto-2-nonulopyranosidonique.

CHAPITRE 5

Ractions des hydroxyles

5.1 DRIVS FONCTIONNELS 5.1.1 Importance des ractions de protection


Dans la majorit des sucres, tous les carbones sont fonctionnels. Si lon veut faire ragir une fonction particulire avec les procds habituels de la chimie organique, il faut << protger B les autres fonctions. Ceci veut dire les transformer en drivs inertes dans les conditions de la raction envisage, mais nanmoins reconvertibles en fonction de dpart une tape ultrieure. Nous appellerons cette dernire phase << dprotection . I1 est souvent utile de protger les diverses fonctions dune mme molcule par des drivations de nature diffrente, de faon pouvoir effectuer des dprotections slectives. Nous avons dj rencontr la protection la plus universelle de lhydroxyle hmiactalique, qui est la glycosidation (voir le chapitre 3). I1 ny aura pas que des ractions de protection dans ce paragraphe. Certains drivs fonctionnels ont un rle analytique et les phosphates et sulfates sont des produits naturels universellement rpandus quil est utile de savoir prparer par synthse. On traitera les sulfonates au paragraphe 6.1, en introduction aux ractions dinversion de configuration.

5.1.2 thers
On les prpare communment par action des halognures et des sulfates sur les alcoolates. Ces conditions basiques dtruiraient les sucres libres, quil faut dabord transformer en glycosides. Les thers mthyliques ne servent que pour les applications analytiques et les dterminations de structure. On met ainsi profit leur grande stabilit. On trouvera leur prparation pour ces applications au paragraphe 9.4.3. Les thers benzyliques sont trs employs. Nous avons dj rencontr un exemple dutilisation au paragraphe 3.5.3, o est dcrite la synthse du mthyl tnO-benzyl-a-L-fucopyranoside, 3.36. On pratique le plus souvent la benzylation en milieu alcalin. On peut employer comme solvant loxolane, mais la raction est beaucoup plus rapide dans la N , N-dimthylformamide (DMF), qui par ailleurs est un meilleur solvant des sucres peu protgs. Comme base, on a utilis KOH, mais

Drivs fonctionnels

81

on prfre maintenant prformer lalcoolate avec NaH en trs lger excs. Le ractif alkylant est le bromure de benzyle. Les thers benzyliques sont stables dans les conditions acides modres et en milieu alcalin. Dune faon gnrale, les thers benzyliques sont coups par hydrognation catalytique suivant lquation (5.1).

(5.1)

R-O-CH,Ph

+ H,

PdIC

R-OH+ PhCH,

La dprotection a lieu par hydrognation catalytique en prsence de palladium sous une pression dhydrogne de quelques atmosphres. Ceci restitue les fonctions hydroxyles et le tolune est facilement sparable. Lhydrognolyse par transfert ne demande aucun quipement spcialis. On fait bouillir reflux une solution alcoolique du sucre protg en prsence de palladium sur charbon, avec, comme donneur dhydrogne, le cyclohexne ou le cyclohexadine qui saromatisent dans la raction. On prpare les thers paramthoxybenzyliques comme les thers benzyliques. Ils sont coups par oxydation par la 2,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone (DDQ) ou le nitrate crique ammoniacal, (NH&Ce (N02)6 (Raction (5.2)). Le moteur de la raction est loxydation de la position benzylique du groupement protecteur, grandement facilite par le mthoxy en pura.
O

OMe

OMe

Le chlorotriphnylmthane, Ph,CCl, ragit dans des conditions plus modres sur le sucre dissous dans la pyridine. A froid, si on ne prolonge pas induement la dure du traitement, seule la fonction alcool primaire est thrifie. Par exemple, on obtient lther 5.1 avec le mthyl a-D-glucopyranoside. Ces thers sont hydrolyss dans des conditions acides trs modres, par exemple dans lacide actique aqueux 80C. I1 y a un risque dhydrolyse, galement, lorsquon les chromatoCH,OCPh,

-*
OMe
5.1

82

Ractions des hydroxyles

graphie sur gel de silice ; enfin, ils sont coups par hydrognolyse dans les mmes conditions que les thers benzyliques. On prpare les thers allyliquesI1 comme les thers benzyliques, avec du bromure dallyle. La dprotection seffectue en deux temps : a) isomrisation en ther propnylique par chauffage en prsence dune base forte (Me,COK) ou dun catalyseur complexe de mtal de transition ; b) rupture par traitement de lther propnylique par un sel mercurique (Ractions (5.3)). On voit quon peut dprotger un hydroxyle transform en ther allylique sans toucher des protections benzyliques sur la mme molcule. Linverse nest pas vrai : en prsence de palladium, un ther allylique est partiellement hydrognolys, partiellement rduit en ther propylique, qui est un cul-de-sac synthtique.
U

(5.3)

R-O-CH,-CH=CH,-R-O-CH=CH-CH,

b -R.OH

On obtient les thers phnyliques en traitant les diols par le diactoxytriphnylbismuth dans le dichloromthane La raction (5.4) donne un exemple de cette transformation dont le mcanisme nest pas connu.

(5.4)

Bn

Ph,Bi(OAc), *

BnO p h

5.1.3 Drivs silyls

Les << thers P trimthylsilyls sont trop labiles pour assurer une protection des hydroxyles. On a dcrit leur synthse et leurs applications analytiques au chapitre 1. En synthse, on leur prfre les thers ter-butyldimthylsilyls, obtenus avec le ter-butylchlorodimthylsilane Me,CSiMe,Cl, par raction dans la pyridine en prsence dimidazole. Leur stabilit nest cependant pas parfaite. On gagne encore en stabilit en convertissant les alcools en drivs ter-butyldiphnylsilyls, Lthrification a lieu tempobtenus avec le ter-butylchlorodiphnylsilane[3]. rature modre dans la DMF, en prsence dimidazole. Cette dernire protection rsiste lhydrognolyse catalytique et aux conditions dhydrolyse des actals. Tous les thers silyls sont hydrolyss en prsence de fluorures. Ces sels ont des ractions lgrement alcalines, ce qui peut amener des migrations de groupement actyle.

5.1.4 Esters dacides organiques et carbonates


Sur les glycosides, on pratique actylation et benzoylation selon les techniques traditionnelles, avec les ractifs (CH,CO),O, CH,COCl, PhCOC1, et une base, pyridine ou trithylamine. Les nouveauts apparaissent dans lacylation des sucres libres. I1 se forme toujours essentiellement des peractates pyranosiques et on a trouv des conditions permettant dorienter vers la production de lun ou de

Drivs fonctionnels

83

lautre anomre. Ainsi, en prsence de ZnC12, ou dautres catalyseurs acides, dans des conditions anomrisantes, on obtient lanomre le plus stable, groupement acyl axial, tel le penta-O-actyl-a-D-glycopyranose. Ce nest malheureusement pas lanomre le plus intressant en synthse en raison de sa faible ractivit. On vite largement sa formation en oprant dans lanhydride actique loo, avec lactate de sodium comme base, conditions qui permettent de prparer lanomre quatorial 5.2. H,OAc -c A Ac0
OR

Ac0
5 . 2 R=Ac 5 . 3 R=H

NvN-Co-P
5.4

rn

On dprotge les glycosides actyls par mthanolyse alcaline, en les traitant froid par du mthanol qui contient environ 1 % de CH30Na. Les groupements actyle, transfrs sur le solvant, donnent lactate de mthyle volatil. On ne peut dsactyler loxygne anomrique de cette faon, car la fonction hmiactal produite serait rapidement dcompose dans le milieu alcalin. Les groupements actyle sont stables dans les conditions neutres ou acides modres, et ont effectivement t employs comme protections dans certaines synthses doligosaccharides. Cependant, la scurit nest pas totale, car, dans les produits partiellement actyls, il peut y avoir des migrations, probablement par des intermdiaires cycliques, selon le schma ractionnel (5.5).

(5.5)

COCH,

Pour la prparation des trichloractimidates, utiliss en couplage osidique (voir le paragraphe 10.3.2), il faut pouvoir dsactyler slectivement la position anomrique. On y arrive, partir de lanomre p, en le traitant par lactate dhydrazine14]. Ainsi on peut prparer 5.3 partir de 5.2 par cette mthode.

5.1.5 thrification et acylation slectives. Drivs organostanniques


Nous avons dj rencontr des drivations slectives, par exemple avec le chloqui thrifient slectiverotriphnylmthane et le ter-butylchlorodiphnylsilane, ment les fonctions alcool primaire. Le chlorure de pivalyle Me3CCOC1 manifeste aussi une prfrence pour cette position. On peut observer des ractions slectives avec le ractif benzoylant attnu N-benzoylimidazole 5.4. Lorsquil sagit de dis-

84

Ractions des hydroxyles

tinguer entre des positions secondaires, on peut avoir avantage passer par des intermdiaires qui se prsentent formellement comme des alcoolates du cation dibutyltain, Bu2,%++. Le ractif est loxyde polymre (Bu,SnO),, une poudre insoluble. Lorsquon chauffe un glycol en solution benznique bouillante avec cette poudre, en liminant leau avec un sparateur Dean-Stark, la poudre se dissout et il se forme un complexe pentacoordonn de ltain, gnralement dimre, 5.5 (n = 0,l) selon la raction (5.6). On peut transfrer le produit dans un solvant polaire, o il est alors monomre, avec coordination au solvant, 5.6. On voit sur cette structure plus simple que, mme si le glycol tait symtrique, les deux oxygnes se sont diffrencis dans le driv stannique, lun tant apical et lautre quatorial. Cest galement vrai dans chacun des monomres associs selon 5.5, mais il y a l une diffrenciation supplmentaire puisque lun des oxygnes est tricoordonn, donc sans pouvoir nu~lophile[~l. Le nom de << stannylne >> pour ces produits, gnralement utilis, y compris par lauteur, nest pas correct dans le cadre de la nomenclature organomtallique, o il dsigne un driv neutre R-Sn-R.

(CH,),

2 Bu,SnO

\ CH20H

+ & RO H HO
5 . 7 R=H 5.8

Solvant
5.6

R=OBn

On prpare de la mme faon les stannylnes de drivs de sucres o subsistent deux hydroxyles non protgs et convenablement situs. Les chlorures dacides ragissent en moins dune minute froid sur les stannylnes, en solution benznique ou dans la DMF, donnant le monoester dune faon strictement rgioslective. Les halognures de benzyle et d allyle conduisent aux thers correspondants chaud dans la DMF. L encore, la raction est rgioslective.

Drivs fonctionnels

85

On nobserve pas de raction entre les halognures de benzyle ou dallyle et les stannylnes, mme chaud dans le benzne, o ces drivs sont apparemment polymres. Cependant, on peut prparer ces thers avec de bons rendements dans le benzne au reflux en oprant en prsence de quantits catalytiques dhalogn u e s de ttralkylammonium ; et cest ainsi quon peut observer la plus stricte rgioslectivit dans les cas difficiles. Le benzyl B-D-galactopyranoside 5.7 transform en stannylne, puis trait par le bromure de benzyle en prsence de bromure de ttramthylammonium dans le benzne bouillant est benzyl exclusivement en 3, pour donner lther 5.8 avec 67 % de rendement. On notera la prfrence pour loxygne en 3 sur les trois autres, dont lun participe une fonction alcool primaire. On trouvera au paragraphe 10.1 un exemple de slectivit encore plus grande. Quelle peut tre lorigine de cette slectivit ? Sur le glycoside 5.7, il y a au moins trois couples dhydroxyles capables de former un stannylne. On peut supposer quils se forment tous les trois, mais sont en quilibre et que les enthalpies libres de tous les dimres, ou polymres suprieurs possibles, sont assez diffrentes pour quun seul subsiste pratiquement la fin. Ceci slectionne un couple dhydroxyles et diverses contraintes dues la nature de la molcule de sucre font que lun de ces deux hydroxyles prfre la position apicale.

5.1.6 Phosphates
Dans la majorit des cas, la conversion mtabolique dun sucre dans une cellule dbute par sa conversion en ester phosphorique. On a dabord labor des synthses de phosphates de sucres pour les avoir plus commodment disposition pour les recherches en biochimie. Plus rcemment, lintroduction des mthodes enzymatiques en chimie prparative a cr la demande pour des quantits importantes. Ce sont encore prcisment des mthodes enzymatiques qui permettent leur prparation une chelle trs leve. Ainsi le D-glucose 6-phosphate est obtenu par phosphorylation du glucose par un triphosphate, ladnosine triphosphate (ATP) que nous symboliserons de faon plus explicite par A-O-PO (OH)O-PO (OH)-O-PO,H,, qui transfre son phosphate terminal en prsence de lenzyme hexokinase. Lagent phosphorylant est transform en adnosine diphosphate ADP, ou A-O-PO(OH)-O-P0,H2 (Raction (5.7)). En raison du prix trs lev OH
(5.7)

+
OH

A-O-PO-O-PO-O-PO,H,

OH

CH,-OPO,H,
H - H

+
OH

A-O-PO-O-PO,H,

86

Ractions des hydroxyles

dATP, il faut coupler la raction (5.7) avec un systme de rgnration, le transfert de phosphate sur ADP partir du phosphate de lnol de lacide pyruvique (phosphate facilement accessible et peu couteux), catalys par lenzyme pyruvate kinase (Raction (5.8)). On mlange dans le mme rcipient glucose, phosphate de lnolpyruvate, hexokinase et pyruvate kinase et une quantit catalytique dATP (de lordre de 1 mole %) et le systme fabrique le D-glucose 6-phosphate jusqu puisement du phosphate dnol pyruvate. Les kinases sont facilement accessibles et, si elles sont immobilises sur un support insoluble (voir le paragraphe 10.4.1), elles sont rutilisables un certain nombre de fois. On fabrique aisment ainsi le glucose 6-phosphate lchelle de 250 gr6].

(5.8)

A-O-PO-O-PO,H,

OPO,H,

CH,=C-COOH OH OH

A-O-PO-O-PO-O-PO,H,

+ CH,COCOOH

La phosphorylation de lhydroxyle anornrique donne un phosphate de glycosyle. On prpare ces composs par des mthodes non enzymatiques. Un bref chauffage 50 du pentaactate p 5.2 avec H,PO, anhydre donne environ 50 % de phosphate de B-D-glycopyranosyle ttra-actyl, qui se transforme en anomre a par chauffage prolong. Ces phosphates de glycosyle sont plus labiles en milieu acide que les monoesters phosphoriques ordinaires. Dune faon gnrale les phosphates de sucres sont plus acides que lacide phosphorique.

5.1.7 Hydrognosulfates
Un certain nombre de phnomnes de reconnaissance font intervenir des sucres sulfats. On trouvera des exemples de synthse au chapitre 17. On prpare un hydrognosulfate par action du trioxyde de soufre sur lalcool dissous dans la DMF en prsence de trithylamine (Raction (5.9)).
(5.9) R - OH + SO,

+ R - O - S03H

5.2 ACTALSl7l
Les actals sont btis sur un couple doxygnes dhydroxyles. Dans lactalation dun sucre ou dun driv de sucre qui prsente plus de deux hydroxyles libres, plusieurs actals sont priori possibles. La plupart du temps, on utilise un catalyseur acide qui acclre ltablissement de lquilibre entre les actals possibles et on isole finalement le plus stable comme produit majoritaire. Les aldhydes forment de prfrence des 1,3-dioxanes. Le traitement du glucose par le benzaldhyde et le mthanol en prsence de chlorure de zinc donne

Actals

87

facilement le mthyl 4,6--benzylidne-a-D-glycopyranoside 5.9. Cependant, il ny a pas dobjection ce que les aldhydes bouclent un cycle 1,3-dioxolane sur deux hydroxyles cis vicinaux sil ny a pas dautre possibilit. Par contre les ctones ne forment les 1,3-dioxanes que dans des conditions exceptionnelles et gnralement bouclent un cycle 1,3-dioxolane sur des hydroxyles cis. Sil y a une possibilit tautomrique, le tautomre le plus favorable ce mode dactalation est slectionn. Le glucose donne avec lactone et le chlorure de zinc le bis actal furanosique 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne-a-Dglucofuranose, 5.10, et le galactose le bis actal pyranosique, 1,2 ; 3,4-di-O-isopropylidne-a-D-galactopyranose, 5.11. Mais le mthyl a-D-galactopyranoside, qui ne possde quune paire dhydroxyles vicinaux cis, donne le monoactal 5.12. Ces prfrences sobservent aussi dans lactalation du D-glucitol, reprsent selon le zig-zag plan, 5.13 : le benzaldhyde conduit au tri-actal 5.14 et lactone au tri-actal 5.15. Cependant des techniques particulires permettent de prpa-

5.9

5.10

CH3

Me

Me

%EA
OkO Me Me
5.11

Me

HO OMe
5.12

OH

OH

OH
5.13

OH

O ,

/O CHPh

5.14

88

Ractions des hydroxyles

5.15

5.16

rer les actals haute nergie, tel 5.16 obtenu partir du mthyl a-D-glucopyranoside par traitement par le dimthyl actal de la cyclohexanone en prsence d'acide paratolune-sulfonique dans la DMF. Les benzylidne-actals, trs fragiles en milieu acide, sont hydrolyss par l'acide actique aqueux, ou coups par hydrognolyse. On peut observer une slectivit dans l'hydrolyse des isopropylidne-actals. Sur le compos 5.10 seul le cycle en 5,6 est hydrolys par l'acide actique aqueux. L'hydrolyse de la fonction actal qui fait intervenir l'oxygne anomrique ncessite un chauffage de quelques heures dans l'acide minral 0,l M, conditions comparables celles de l'hydrolyse d'un glycoside. Les actals sont extrmement employs comme drivs protgs. Mais ce sont galement les produits de dpart de certaines ractions d'un grand intrt synthtique. Le traitement des actals benzylidne par la N-bromosuccinimide dans CC1, bouillant, en prsence de BaC03 les convertit en bromobenzoates[*]. La raction est particulirement intressante dans le cas des actals 4,6--benzylidne, car elle donne le bromure primaire exclusivement. Ainsi le mthyl 6-bromo6-doxy-a-D-galactopyranosideest obtenu avec 90 % de rendement (Raction (5.10)). Les conditions ractionnelles sont compatibles avec une grande varit de fonctions. Le mcanisme de la raction semble tre le remplacement de l'hydroPh
I

O \

P I

"0

C&Br

Oxydations en carbonyle

89

gne benzylique par du brome, suivi dune ionisation et de lattaque par le bromure du cation benzoxonium (Raction (5.11)). La raction (5.12) donne un exemple douverture avec rduction dun benzylidne. Le mlange dactal et de cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN) dans loxolane est acidifi avec HC1 dans lther jusqu cessation du dgagement gazeux. La raction est termine en 5 mn temprature ambiante avec un rendement de 87 % et parat gnrale[9].On linterprte comme la consquence de la protonation rgioslective de O(4) du sucre, suivie du dplacement de loxonium par un hydrure. Le traitement du dibenzylidne-mannoside 5.17 (Raction (5.13)) par le butyllithium donne un sucre carbonyl dsoxygn[lOl.On suppose que la base forte arrache le proton H(3), ce qui entrane llimination de O(2) vicinal, puis le dpart de PhCHO qui donne Inolate. B r-

n/7
CH2-O

CH2-O

\i+
OMe
Bn

CH-0

-CH-O

(5.12)

O BnO

OMe

BnO

5.17

5.3 OXYDATIONS EN CARBONYLE


5.3.1 Hydroxyles isols
Les mthodes les plus utilises sont la raction de Pfitzner et Moffat et ses variantes ultrieures[]. Loxydant est le dimthyIsulfoxyde (DMSO). Lintermdiaire accept en gnral la structure 5.18, qui conduit au compos 5.19 par une

90

Ractions des hydroxyles

5.18

5.19

raction dlimination (Raction (5.14)). Les variantes se distinguent par les ractifs employs pour prparer le driv sulfoxonium de lalcool 5.18. Pour Ioxydation de la fonction alcool primaire des sucres en aldhyde, on prconise le systme dicyclohexylcarbodiimide (C,H,, - N = C = N - C,H,,, 3 quivalents molaires), associe un acide modr, comme lacide dichloractique ( 0 3 quivalent). Ainsi on obtient laldhyde 5.20 (2 heures 30 froid, 80 % isol) partir du ribofuranoside. On peut activer simplement avec de lanhydride phosphorique pour loxydation des fonctions alcool secondaires en ctone, comme dans la prparation de 5.21, obtenu avec un rendement de 92 %I1*]. On a ainsi prpar la ctone 5.22 partir de lactal 5.10. On a aussi observ dexcellents rendements en prsence danhydride actique. On peut effectuer ces oxydations des chelles trs leves. La mthode de Swern (activation par le chlorure doxalyle) donne en gnral un rendement lev, mais ncessite un travail - 70C et semble peu adapte aux premires tapes dune synthse. On a galement appliqu aux sucres une autre mthode gnrale de prparation des ctones, loxydation des alcools secondaires par le ttroxyde de ruthnium, RuO,. On nutilise que des quantits catalytiques de ce compos trs coteux, qui est rgnr par un oxydant, par exemple KIO, en solution aqueuse, tamponn avec K,CO,, ou un hypochlorite alcalin.

5.3.2 Oxydation des diols en hydroxyctones


Le traitement des stannylnes (voir le paragraphe 5.15) dissous dans le benzne par une solution de brome dans le mme solvant, en prsence de tamis molculaire ou de la base Bu3SnOMe, donne froid, la vitesse dun titrage la ctone-aico~l[~]. La raction est presque uniformment strictement rgiospcifique, cest--dire quelle ne donne quune seule des deux hydroxy ctones possibles (Raction (5.15)). On retrouve lactivation slective par stannylation dj observe dans la benzylation, lallylation et Iacylation. On prpare ainsi 5.24 partir du glycol 5.23 avec 75 % de rendement. On a rcemment prconis le remplacement du brome par la N-bromosuccinimide sans autre addition[l41.
R-CH-O,

(5.15)
R-CH-O

()

SnBu2Br,

I
R-CHOH

Oxydations en carbonyle

91

P T * ;

O X M
5.20

TsO

e
5.21

OMe

BnO

5.22

5.23

H,OBn
HO O :

h BnO O B
5.24

5.3.3 Utilit synthtique des sucres carbonyls


La rduction par NaBH, ou LiAlH, donne le mlange dalcools pimres. Dans les cas les plus favorables, on peut sparer avec un rendement acceptable le composant configuration inverse par rapport au produit de dpart. Ainsi on prpar une oxydation du bis actal pare le 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne-a-D-allose 5.10 en ctone 5.22 suivie dune rduction par NaBH,. Celle-ci est strospcifique et donne la configuration a - D - d o , pimre en 3 de la configuration a-Dg l u m de dpart. Sauf cas exceptionnels, cette mthode dinversion de configuration a perdu de limportance au profit de la substitution SN2 des sulfonates depuis la dcouverte des solvants polaires aprotiques et des groupements partants exceptionnels. Naturellement, les hydrures marqus permettent dintroduire spcifiquement du deutrium ou du tritium sur le carbone hydroxyl. Ces drivs carbonyls de sucres sont facilement hydratables. Par incubation prolonge dans

92

Ractions des hydroxyles

[*O]- H,O, lquilibre hydratation-dshydratation peut introduire sur le carbonyle lisotope l 8 0 , quon retrouvera aprs rduction, dsormais stable, sur lhydroxyle alcoolique. Enfin, les voies majeures de prparation des sucres ramifis passent par les drivs carbonyls (voir le paragraphe 7.6).

5.3.4 Oxydations catalytiques sur platine


La raction est particulirement efficace et slective avec les glycopyranosides non protgs : la fonction alcool primaire est convertie en acide avec un bon rendement. On obtient donc des acides uroniques. Ainsi le driv 5.25 de la glucosamine est obtenu avec un rendement de 75 %. Pratiquement, on ajoute le sucre une suspension aqueuse de platine dAdams vigoureusement agite dans laquelle on fait barbotter de loxygne. I1 peut y avoir oxydation des hydroxyles secondaires avec une certaine slectivit lorsquil ny a pas dhydroxyle primaire.

5.4 PERIODATES ALCALINS ET TTRAACTATE DE PLOMB


On rappelle les ractions bien connues de ces deux oxydants sur les glycols vicinaux, (5.16) et (5.17). Ces deux ractifs sont complmentaires, le periodate est utilis en solution aqueuse et le ttraactate dans les solvants organiques. On admet que ces ractions passent par des intermdiaires cycliques, par exemple, pour IO:, 5.26, par addition des hydroxyles sur les liaisons IO, et 5.27 par dshydratation de 5.26, le premier octahdrique, le second en bipyramide trigonale. Nous ferons remarquer que vu la longueur de la liaison IO, langle 0-1-0 dans le cycle 5 lments une valeur trs petite voisine de 75 et que cela a sans doute une consquence sur la raction. Quoi quil en soit, la dshydratation en 5.27 semble fondamentale. Dans un milieu trs basique, 5.26 perd un proton, la dshydratation nest plus possible et la raction devient trs lente. De mme les complexes tridents comme 5.28, qui ne peuvent pas se dshydrater sont stables et Le lecteur reconnatra que 5.28 est un complexe du 1,2-Ovisibles en RMNLtS~. isopropylidne-a-D-glucofuranose, produit dhydrolyse partielle de 5.10. De fait, le priodate ne scinde pas les glycols vicinaux en disposition trans diaxiale rigide. Cependant signalons que lon peut observer avec le ttraactate des oxydations de glycols vicinaux incapables de participer un cycle 5 lments. R-CHOH (5.16) RI-CHOH

IO,

R-CHO

10,-

R-CHO

R-CHOH
(5.17)

R-CHO

Pb(OAc),

+
RI-CHO

Pb(OAc),

+ 2 AcOH

R-CHOH

Priodates alcalins et ttraactate de plomb

93

5.25

5.26

5.21

WC-OH
HO-C-H

Me
5.28 5.29

5.30

5.31

A ct des glycols, priodate et ttraactate effectuent la scission dautres composs polyoxygns vicinaux que lon rencontre en chimie des sucres - 2hydroxyaldhydes, dictones vicinales, acides a-ctoniques et a-hydroxyls - et aminoalcools. Sur le papier, la scission des a-hydroxyaldhydes par les periodates rpond au mcanisme gnral (5.17) en admettant que laldhyde est hydrat (R = OH), ce qui donne au second membre HO. CHO, cest--dire de lacide formique. Le lecteur vrifiera que, par ce mcanisme, le glucitol 5.29 consomme 5 molcules de priodate, fournit 2 molcules de formaldhyde, qui proviennent des carbones terminaux, et 4 molcules dacide formique venant des carbones centraux. La raction est stchiomtrique. Loxydation de la-D-glucopyranose commence par la rupture de la liaison C( I ) - C(2) et la formation du pentose formyl en 4, 5.30. Elle se poursuit et, si le formiate shydrolyse dans le milieu, la consommation est de 5 molcules de priodate et il se forme 5 molcules dacide formique et 1 molcule de formaldhyde, qui provient de C(6). Le mthyl a-Dglycopyranoside est scind entre C(2) et C(3), et C(3) et C(4), pour donner 1 molcule dacide formique et le << dialdhyde >> 5.31 (en fait hydrat et cyclis).

94

Ractions des hydroxyles

Les ractifs de scission de glycols ont jou un grand rle dans la construction de la chimie des carbohydrates. Nous ne citerons que des exemples dapplications rcentes. Le caractre stchiomtrique de ces ractions permet de les utiliser dans les dosages. La possibilit de sparer les carbones, par exemple C(6), le seul donnant CH,O partir du glucose, ou bien C(3), retrouv ltat dacide formique dans loxydation du mthyl a-D-glucopyranoside, etc., permet de localiser un carbone isotopique dans les tudes de mtabolisme intermdiaire. Lutilisation contemporaine la plus importante est dans les synthses par dgradation. On prpare commodment le D-rythrose partir du D-glucose par actalation avec lactaldhyde, catalyse par H,SO,, oxydation priodique et hydrolyse acide (Raction (5. IS)). Loxydation du << diactone mannitol , 5.32, par le ttraactate de plomb donne deux molcules disopropylidne-glycraldhyde, 5.33, matire premire importante en synthse chirale.

Me ,,Ko-F O-C-H HO-C-H


W -OH

CHO

*F-xMe
CH20 Me
5.32

-e Co H 2X 0 M Me e
5.33

5.5 DSOXYGNATION
Nous avons dj rencontr deux exemples de sucres dsoxygns universellement prsents dans les cellules, le dsoxyribose et le fucose. I1 y en a un grand nombre dautres, dans les produits bactriens en particulier, et souvent leur raret suggre de les prparer par synthse. Enfin les sucres abondants, qui sont trs utiles en synthse chirale, sont beaucoup trop fonctionnaliss pour tre utiliss tels quels. Les tosylates primaires sont rduits par LiAlH,. On prpare ainsi le diactal du D-fucose 5.35, nantiomre du L-fucose, par rduction du tosylate 5.34 du diactal du D-galactose 5.11. On peut aussi remplacer un hydroxyle alcoolique par un halogne (Ci, Br, I) nimporte quelle position dans un sucre protg.

Rfrences

95

Me Me
5.3 4 R=CH,OTs
5.35

5.36

R=CH3

Lhalognure est facilement rduit par voie radicalaire avec le tributylstannane, Bu,SnH (Raction (5.19)).

(5.19) R - C1+ Bu3Sn H + R - H + BU, SnCl On pourra sans doute remplacer dans cette raction le tributylstannane par lacide hypophosphoreux H,PO,, ou un sel de trithylammonium comme dans le cas de la raction de dsoxygnation dcrite la fin du prsent paragraphe. La mthode la plus directe pour dsoxygner un hydroxyle isol passe par la formation dun dithiocarbonate (Ractions (5.20)). NaH cs2 ICH, b R-O- b R-O-CS-S- b R-O-CS-SCH, (5.20) R-OH La rduction par le tributylstannane est une raction en chane, qui doit tre amorce par lazoisobutyronitrile. Le bilan global est donn par la raction (5.21). Le produit contenant ltain se dcompose rapidement et le rendement en produit rduit est excellent. (5.21) R-O-CS-SCH, + Bu,SnH + RH + (Bu,Sn-S-CO-S-CH,) Lemploi de Bu3SnH prsente quelques inconvnients : il est toxique et coteux ; il faut 291 g de ractif pour apporter 1 g dhydrogne et lexcs de ractif et les sous-produits de la raction sont difficiles liminer. On a propos rcemment comme donneur dhydrogne alternatif lacide hypophosphoreux H,PO, - ou ses sels de trithylammonium dans les cas o lacidit est viter - qui donnent des rsultats au moins aussi bons que les stannanes dans la raction radicalaire. On obtient ainsi le diactal du glucofuranose dsoxygn en 3 , 5.36 avec 91 % de rendement par rduction du mthyl dithiocarbonate du << diactone-glucose D 5.10[6].

RFRENCES
[ i l P. A. Manthorpe et R. Gigg, Methods Curbohydl: Ckem., 8 (1980) 305-311. [Z] S. David et A. Thieffry, J. Org. Chern., 48 (1983) 441-447.

96

Ractions des hydroxyles

[3] S. Hanessian et P. Lavalle, Can. J. Chem., 53 (1975) 2975-2977 ; 55 (1977) 562 565. [4] G. Excoffier, D. Gagnaire et J. P. Utille, Curbohydl: Res., 39 (1975) 368-373. [SI S. David et S. Hanessian, Tetrahedron, 41 (1985) 643-663. [6] A. Pollak, R. L. Baughn et G. M. Whitesides, J. Amer Chem. Soc., 99 (1977) 23662367. [7] J. Gelas, Adv. Curbohydl: Chem., 39 (1981) 71-150. [8] S. Hanessian, Curbohydl: Res., 2 (1966) 86-88. [9] P. J. Garegg, H. Hultberg et S. Wallin, Curbohydl: Res., 108 (1982) 97-101. [IO] A. Klemer et G. Rodemeyer, Chem. Bel:, 107 (1974) 2612-2614; D. Horton et W. Weckerl, Carbohydl: Res., 44 ( 1 975) 227-240. [ i l ] G. H. Jones et J. G. Moffatt, Methods Curbohydl: Chem., 6 (1972) 315-322. [I21 K. Onodera et N. Kashimura, Methods Curbohydl: Chem., 6 (1972) 331-336. [13] S. David et A. Thieffry, J. Chem. Soc. Perkin I, (1979) 1568-1573. [14] X. Kong et T. B. Grindley, J. Curbohydl: Chem., 12 (1993) 557-571. [ 151 A. S. Perlin et E. von Rudlof, Can. J. Chem., 43 (1965) 2071-2077. [16] D. H. R. Barton, D. O. Jang et J. Cs. Jaszberenyi, J. Org. Chem., 58 (1993) 68386842.

CHAPITRE 6

Ractions du carbonyle et de lhmiactal

6.1 INTRODUCTION
Lorsque la protection des hydroxyles empche la transformation du carbonyle en hmiactal par cyclisation, la ractivit dun sucre ne se distingue pas de celle dun aldhyde ou dune ctone ordinaire, lis des groupements trs lectrongatifs, avec ventuellement un oxygne thr en p. On observe donc la formation dhydrates stables dans leau et une p limination, si la strochimie le permet, en milieu alcalin. Quant au sucre habituel hmiactal, la rapidit de ltablissement de lquilibre tautomrique fait quil donne toutes les ractions des composs carbonyls. En fait, cest plutt linstabilit ventuelle dun ractif dans le solvant qui limite son application. Comme raction typique de lhmiactal, nous avons dj rencontr la glycosidation. Loxydation par les halognes, par laquelle nous allons commencer, en est un autre exemple.

6.2 OXYDATION PAR LES HALOGNES]


Les oxydants Cl,, Br2, I, semploient de manire diffrente. Si on traite un sucre en solution aqueuse non tamponne par le chlore ou le brome, loxydation amne lacidification du milieu par suite de la formation de HCl ou HBr. I1 semble que ceci ralentisse la raction et on a les meilleurs rendements, presque quantitatifs, en ajoutant un sel insoluble, comme BaC03, qui joue le rle de tampon. Dans loxydation par le brome, dans ce systme, le pH est voisin de 5,4. Cest la forme cyclique qui est oxyde. Le D-glucopyranose (a ou p) donne la D-glucono-15 lactone (Raction (6.1)). Industriellement, on pratique la raction dans une cellule dlectrolyse ; le brome est rgnr par oxydation anodique du bromure, dont on ajoute seulement une quantit catalytique. Lanomre p ragit beaucoup plus vite que Ianomre a. Loxydation est essentiellement due au brome molculaire. On admet quil y a formation dun hypobromite, qui subit ensuite une limination E, schmatise par la formule partielle 6.1. Loxydation par le brome est une voie prparative daccs aux acides gluconique, galactonique, etc.

(6.1)

4-

Br,

e \
CO i 2 HBr

98

Ractions du carbonyle et de Ihmiactal

Liode nest pas ractif en milieu acide. En milieu basique, il est converti en hypoiodite, un oxydant puissant, et oxyde quantitativement les aldoses en acides aldoniques, selon la raction (6.2) qui a aussi bien une valeur analytique que prparative.
(6.2)

RCHO

+ I, + 3 NaOH -+ RC0,Na + 2 Na1 + 2 H,O

6.3 RACTIFS NUCLOPHILES 6.3.1 Borohydrure de sodium


Ce ractif, stable dans leau dans des conditions trs lgrement alcalines est idal pour la rduction des sucres. La fonction aldhyde est rduite en alcool primaire et la fonction ctone en un mlange dalcools secondaires pimres. Le traitement le plus simple aprs rduction consiste liminer le sodium sur une colonne dchangeur de cations, puis lacide borique SOUS forme de borate de mthyle volatil par covaporation avec du mthanol. On rcupre lalditol par vaporation sec ou lyophilisation.

6.3.2 Thiold2]
Les dithioactals, obtenus par action des thiols sur les sucres, constituent la classe la plus nombreuse de drivs acycliques des sucres. On prpare le dithyl dithioactal 6.2 en traitant le glucose dissous dans HC1 I l M par lthanethiol EtSH, quatre heures O. On se dbarrasse de lexcs dacide avec BaC0, ou PbCO,, ou un changeur danions, et on obtient le produit par vaporation sec. La raction est trs gnrale. On utilise communment lthanethiol, le benzylthiol, lthanedithiol et le 1,3-propanedithiol. Le thiophnol ragit trs lentement. On lobserve avec tous les aldoses, selon le mcanisme probable, rversible, (6.3).

On voit qu la seconde tape, cest une deuxime molcule de thiol plutt quun hydroxyle du sucre qui dplace H20. Ceci doit tre mis en rapport avec la nuclophilie leve du soufre vis--vis du carbone. Les ctoses sont dcomposs dans ces conditions. Pour prparer les dithioactals du fructose, on passe par le peractate kto 6.3 qui est le produit normal de peractylation. Cependant le carbonyle de lacide sialique est transform en dithyl-dithioactal6.4 avec un excellent rendement temprature ordinaire. Le carboxyle a et la lactonisation dans le milieu aident sans doute la conversion. Le dithioactal du glucose et certains autres se dcomposent temprature ambiante dans le milieu de synthse, en donnant des alkyl l-thioglycopyrano-

Ractifs nuclophiles

99

H,OAc
CO

HO-C-H

Ac-C-H

W -0Ac

f W -0Ac
CH20Ac

H
6.1 6.2

6.3

Et

s,
C H , C O N H C-H HO-C-H

CH

/s

SR
6.4

6.5

6.6

sides. Cette classe de composs a pris une certaine importance dans la synthse doligosaccharides (Raction (10.4)). On les prpare plus commodment, sous forme peractyle, par exemple 6.5, en traitant le p peractate du pyranose par un thiol en prsence de BF,.Et,O. On peut effectuer sur les dithioactals toutes les transformations habituelles des hydroxyles des sucres, thrification, acylation, actalation. Par exemple, le propylne dithioactal du 2-dsoxyglucose D donne le bis actal isopropylidnique 6.6. Les rgles de prfrence pour les positions dactalation sapparentent celles des alditols. Les dithioactals acyls peuvent tre dsacyls par mthanolyse alcaline, ce qui indique quils supportent ce niveau de basicit. Cependant le butyllithium dtache le proton situ entre les deux soufres. Ceci cre une charge ngative sur C( 1) et, sil y a un oxygne thr en a, sur C(2), il y a tout de suite limination, pour former un groupement -CH = C(SPh),. Par contre, le carbanion sur C( 1) est stable dans les dithioactals de sucres 2-dsoxy et on peut le condenser avec des drivs iods. On a ainsi une mthode facile dintroduction de certaines chanes chirales, utilisable en synthse totale.

100

Ractions du carbonyle et de Ihmiactal

La dsulfuration au nickel de Raney remplace le groupement dithioactal par un mthyle. Cependant on prpare essentiellement les dithioactals comme intermdiaires dans la synthse de drivs acycliques. On peut en effet rgnrer le carbonyle dans des conditions qui respectent la plupart des fonctions usuelles. Bien que la rgnration avec liode soit quantitative et que le brome soit utilisable dune faon prparative, la faveur semble aller aux systmes base de sels mercuriques. Si les hydroxyles cyclisables sont bloqus, on prpare ainsi un driv acyclique de sucre. Par exemple la peractylation de 6.2 donne un pentaactate, transformable en pentaactate aldhydo 6.7 par HgC1, en excs dans lactone aqueuse. On prpare de mme le bis isopropylidne-actal aldhydo 6.8 partir du dithyl dithioactal du D-arabinose. La solvolyse dans le mthanol avec un mlange HgCl, - HgO conduit au dimthyl actal, par exemple 6.9, en srie D-galacto, dsactylable en 6.10 par Ba(OMe)2. /OM

FHO C - OAc
AC-

C-H

e *Ac e +Ac
CH,OAc
6.7

F F

eC-OR I RO-C-H I
RO-

To y
CH,-o
6.8

Me

F e F

-H

-OR

CH,OR

6 . 9 R=Ac
6 . 1 0 R=H

6.3.3 Cyanures alcalins


On prendra comme exemple la raction de KCN en solution aqueuse sur le D-arabinose. Laddition a lieu temprature ambiante et donne le mlange de nitriles a hydroxyls 6.11. Le chauffage en milieu alcalin hydrolyse ces nitriles en acides carboxyliques, obtenus ltat de sel. On rcupre le mlange dacides libres, gluconique 6.12 et mannonique 6.13, avec un changeur de cations, et on spare lpimre D-gluco 6.12 par cristallisation fractionne du D-gluconate de baryum. Lacide rgnr est lactonis par chauffage prolong 100 et la rduction de la lactone 6.14 par lamalgame de sodium donne le D-glucose. Cette suite de ractions, connue sous le nom de mthode de Fischer et Kiliani, est absolument gnrale. Cest une mthode dascension dans la srie des sucres du tableau 4.1 partir de glycraldhyde. On lutilise actuellement pour prparer des sucres suprieurs (heptoses partir dhexoses) ou des sucres rares. Ainsi la mme suite de ractions permet dobtenir le L-glucose et le L-mannose, deux rarets, partir dun sucre naturel trs abondant, le L-arabinose. Elle sert aussi prparer les

Ractifs nuclophiles

101

CN C E P OH HO-C-H &OH R HOCC-H R

W -OH

F F

CH,OH
6 . 1 2 R=H, R=OH 6 . 1 3 R=OH, R=H 6.14

6.11

sucres marqus spcifiquement avec un isotope du carbone, car les cyanures [ 14C]-KCN et [13C]-KCN sont des produits commerciaux. Dans une m~dification[~], on pratique laddition un pH contrl voisin de 7.5, que lon abaisse 4,2 en fin de raction. Les nitriles sont stables dans ces conditions. On les rduit en imines par hydrognation avec le catalyseur palladium sur sulfate de baryum. Ces imines sont hydrolyses rapidement en aldoses. Cest la (1). mthode prconise pour la prparation de sucres marqus sur C Nous dcrirons ici la synthse des sucres amins de Kuhn, bien quelle implique le passage par une glycosylamine (voir le paragraphe 3.6.1) parce quelle est conceptuellement analogue (Raction (6.4)). Laddition de HCN sur la N benzyl-glycosylamine 6.15 donne les nitriles pimres, 6.16 et 6.17. Chacun des deux donne par hydrognation catalytique sur palladium en prsence dacide chlorhydrique le sucre 2-amino-2-doxy de mme configuration (par exemple 6.18), le groupement benzyle tant simultanment limin ltat de tolune. La russite majeure de cette mthode est la synthse de la lactosamine dcrite au paragraphe 10.1. CN R \/

WC-OH

F
I

-RI

6.16

WC -

I WC-OH

NH,CI

+/ P
6.18

6.15

6 . 1 6 R=H, R=NHBn 6 . 1 7 R=NHBn. R=H

6.3.4 Ractifs du type de Wittig et organomtalliques


Comme nous lavons dit dans lintroduction, les ractions dun sucre bloqu dans sa forme tautomrique aldhydo ne diffrent pas essentiellement de celles dun aldhyde quelconque. Par exemple, on peut observer des additions dorganomagnsiens, dorganolithiens, etc. Ces ractions peuvent tre trs utiles, notamment en synthse totale chirale, mais cest, en principe, une chimie qui doit tre

102

Ractions du carbonyle et de Ihniiactal

familire au lecteur. Nous nenvisageons ici que les sucres totalement libres ou capables de tautomrie aldhyde-hmiactal. Dans certaines conditions, on peut utiliser avec ces substrats le triphnylmthylne phosphorane, CH, = PPh,, par exemple la mthylnation dcrite par la 0 -30 dans loxolane, avec raction (6.5) seffectue avec un rendement de 67 7 addition de un quivalent de NaH : le succs tient la stabilit en milieu alcalin de laldhyde, qui na pas doxygne en p, tandis que la dprotonation de lhydroxyle en a cre une charge ngative qui soppose une seconde dprotonation sur CHr4].

OH

I1 y a plus de ractions dcriteslj] avec les phosphoranes stabiliss comme Ph,P = CHC0,Et. Le ribofuranose 6.19 donne 54 % dthylnique cis, 6.20, accompagn de 36 % de lisomre trans. En prsence de NaOMe, la cyclisation de 6.20 par une raction de type Michael donne loxolane 6.21, pur trans- 1,2. En raison de lanalogie superficielle de composs comme 6.21 avec les glycosides, on leur a donn le nom de C-glycoside. Avec le mme phosphorane, le bis actal du mannofuranose 6.22 donne directement le C-mannofuranoside 6.23, trans 1,2. Celui-ci sisomrise en driv cis- 1,2, le plus stable, en prsence de NaOMe, le mcanisme probable tant la dprotonation en a de la fonction ester suivie de llimination de loxygne cyclique sous forme alcoolate.
H,OBn
/H
%?OH?>=?

C0,Me

y 2
H,OBn
6.21

H,-C0,Me

6.19

6.2

6.22

6.23

Ractions impliquant la dprotonationen a du carbonyle. Les sucres comme aldols

103

Les drivs organiques du magnsium et du lithium ne sont pas utilisables dans les solvants aqueux, et, en milieu anhydre, les substrats polyhydroxyls entranent le gaspillage du ractif. La dcouverte dune technique pour fabriquer et faire ragir les drivs allyliques de ltain dans leauL61 a permis deffectuer ces ractions organomtalliques en solution On a opr en solvant mixte alcool-eau, en prsence de 2 quivalents de poudre dtain et de bromure dallyle, dans un bac ultrasons. Le mannose, par exemple, donne avec un rendement de 90 % le mlange du carbinol 6.24 avec son pimre dans la proportion 6: 1. Lozonisation de la double liaison donne le sucre 2-dsoxy deux carbones de plus. On peut remplacer ltain par lindium.

HO-C-H

HO-

C-H

e -OH
i k -OH
!H,OH
6.24
6.25

OH

6.4 RACTIONS IMPLIQUANT LA DPROTONATION EN a DU CARBONYLE. LES SUCRES COMME ALDOLS


En milieu basique, on prvoit un quilibre entre le sucre et le carbanion produit par le dtachement du proton a.La premire consquence prvisible est lpimrisation partielle ce niveau. La raction peut avoir une valeur prparative si le sucre de dpart est abondant. Ainsi, on peut prparer la N-actylmannosamine 6.25 par pimrisation de la N-actylglucosamine (1.7) en solution aqueuse, au pH 11. Le rendement est 22 % aprs 3 jours temprature ambiante, mais le produit de dpart est trs accessible. Ces pimrisations sont gnrales, mais plus ou moins utiles en dehors de lexemple cit. Nous ferons ici une parenthse pour les mettre en regard de lpimrisation produite par lacide molybdique ( 90 en solution aqueuse, pH 4,5) qui nimplique pas de carbanion et qui est galement gnrale@].Glucose et mannose squilibrent et le rapport des concentrations (2,5: 1) est celui quon calcule partir de leur diffrence denthalpie libre. Cest typiquement une raction dune simplicit trompeuse, car il y a simultanment migration de carbone de la position 1 la position 2 (Raction (6.6))

(6.6)

[1 - 3C]-D-glucose

. - [2 - CI-D-mannose

On a ainsi une mthode trs lgante pour marquer C(2) dans un sucre, lintroduction de lisotope sur C( 1) tant facile avec les ractions du paragraphe 6.3.3.

104

Ractions du carbonyle et de I'hmiactal

On l'explique par la formation d'un complexe entre le dimolybdate Mo,O,- et le sucre, par exemple le D-glucose, sous forme uldhydo et une migration rversible de C(3) C( 1) au sein du complexe, suivant le schma trs simplifi 6.26.

CH,OH
6.26

6.27

Revenons maintenant aux proprits consquences de la dprotonation de C(2) des aldoses. L'anion peut ragir comme donneur sur un aldhyde pour donner un produit de condensation aldolique. Par exemple le << diactone-mannose >> donne le sucre ramifi 6.27. Ce qui restreint la gnralit de ces ractions, c'est qu'il y a le plus souvent un oxygne thr sur C(3) qui a tendance s'liminer s'il n'y a pas des contraintes striques particulires. C'est ce qui se passe, par exemple, lors du traitement alcalin de certaines glycoprotines (voir le paragraphe 13.2.2). Mais on peut vouloir au contraire favoriser l'limination, en introduisant un bon groupement partant sur 0 ( 3 ) , tel le groupement mthanesulfonyle. L'limination en solution aqueuse tide du 3-O-mthanesulfonyl-D-glucose par addition de potasse aqueuse se produit la vitesse d'un titrage acidimtrique, comme on l'observe en prsence de phtaline. En arrtant la coloration permanente, on obtient du 2-dsoxy-D-ribose, dont c'est la meilleure avec un rendement de 50 %, selon la raction (6.7). H-CO,H

HO

HO

Tous les aldoses communs possdent un hydroxyle alcoolique en p du carbonyle. Cette structure les apparente aux aldols qui se forment rversiblement partir des aldhydes en milieu alcalin. On pourrait s'attendre observer dans ces conditions la rupture rtro-aldolique entre C(2) et C(3), donnant une molcule d'aldhyde glycolique et une molcule d'aldose deux carbones de moins et, rciproquement, la condensation de ces deux fragments pour engendrer un aldose

Ractions impliquant la dprotonation en a du carbonyle. Les sucres comme aldols

105

suprieur. Sous leur forme non enzymatique, ces ractions sont inconnues ou de peu dimportance pratique et, dans les cellules vivantes, ces schmas du type C,, ou bien C , + C, L___ C, ne sont pas utiliss dans les C, + C, grandes voies mtaboliques. I1 existe cependant des enzymes aldolases, isoles de cellules vgtales ou microbiennes qui catalysent la rupture rtroaldolique dun phosphate du dsoxyribose en actaldhyde et phosphate de D-glycraldhyde. Leur rle est purement catabolique dans le monde vivant, car les cellules fabnquent la structure 2-doxy-D-ribo par dsoxygnation de la structure D-ribo. Elles pourraient tre utiles en chimie prparative car on peut dans une certaine mesure modifier donneur et accepteur[]. Mais dans les aldolases habituelles, le donneur est ctonique. CH,OPO,H, CO CH,OH
(6.8)

CH20P03H2
& L

+
CHO H-C-OH CH,OPO,H,

On a beaucoup tudi la fructose-1-6-diphosphate aldolase du muscle du lapin, que lon trouve dans le commerce. Celle des feuilles dpinard, videmment trs accessible, a t examine rcemment[]. Dans la raction fondamentale de la glycolyse ( 6 4 , le donneur est le phosphate de dihydroxyactone. I1 ne peut gure varier, mais il y a plus de souplesse du ct de laccepteur[l2l[ I 3 ] , et lon peut parfois sloigner largement de ia chimie des sucres. Dans tous les cas, le diol vicinal cr aux positions 3-4 (numrotation des uloses) a la configuration D-thro. Ainsi la condensation de laldhyde ctonique 6.28 donne un ctose 6.29 qui, aprs isolement, est dphosphat enzymatiquement en prsence de phosphatase acide. Lactalation en catalyse acide referme un systme de type anhydro sucre sur le carbonyle en 8, plus lectrophile. Le produit 6.30, obtenu[14]avec un rendement global de 48 %, est transform en une phromone, la (+)-em-Brvicomine par rduction du groupement COCH,OH en CH,CH,. On voit que, dans la plupart des synthses, la condensation enzymatique doit tre suivie de dphosphatation, ce qui nest pas un inconvnient trs grave. I1 y a des difficults plus srieuses : la prparation de grosses quantits de phosphate de dihydroxy-actone ne semble pas trs commode, en raison des grands volumes de solvants ncessaires ; le produit de laldolisation est un ctose, qui nest pas facilement isomrisable en aldhyde. Dautres aldolases fonctionnent avec lacide pyruvique comme donneur, par exemple la c< sialylaldolase , dont lutilisation synthtique est dcri-

106

Ractions du carbonyle et de Ihmiactal

6.29

/ CO-CH,OH
0 7
HO

CO,H OH

6.30

6.31

te au paragraphe 12.4, et la << KDO aldolase >> utilisable pour la synthse dun sucre du monde microbien et vgtal, le << KDO N 6.31.

6.5 FONCTIONNALISATION RADICALAIRE AU CENTRE ANOMERIQUE[]


Lirradiation de drivs pyranosiques produit un radical au centre anornerique. En prsence de brome, ou de N-bromo succinimide, le chlorure de b-D-glucopyranoside practyl donne le sucre dihalogn gmin 6.32, matire premire pour la synthse danalogues gmins sur C( 1). Le mannoside 6.33 subit une raction de type NORRISH II, qui donne loxolane 6.34. En prsence diode et de HgO, le glucoside de glycol, 6.35, donne le spiro orthoester, 6.36, sans doute par formation intermdiaire dun hypoiodite.

Br
6.32

Rfrences

107

Ac0 MeC
HO
6.33 6.34

Ac0
Ac0
$ - cA

R
O R'

6.35

6.36

RFRENCES
[ 11 J.

[2] [3] [4]


[SI

[6] 171

W. Green, Oxidatives Reactions and Degradations N dans The carbohydrates, Chemistry and Biochemistry, sous la direction de W. Pigman et D. Horton ; vol. IB, p. 1106-1119, 2e d. Academic Press, New York (1980). J. D. Wander et D. Horton, Adv. Carbohydr: Chem. Biochem., 32 (1976) 15- 123. A. S. Serianni, H. A. Munez et E. Barker, Cui-bohyclr:Res., 52 (1979) 71-78. K. C. Nicolaou, R. A. Daines, J. Uenishi, W. S. Li, D. P. Papahatjis et T.K. Chakraborty, J. Am. Chem. Soc., 1 I O (1988) 4672-4685. H. Ohrui, G. H. Jones, J. G. Moffatt, M. L. Maddox, A. T. Christenson et S. Byram, J. Am. Chem. Soc., 97 (1975) 4602-4613. C. J. Luche et J. C. Damiano, J. Am. Chem. Soc., 102 (1980) 7926-7927. E. Kim, D. M. Gordon, W. Schmid et G. M. Whitesides, J. Org. Chem., 58 (19971)
((

5500-5507.
[8] M. L. Hayes, N. J. Pennings, A. S . Serianni et R. Barker, J . Am. Chem. Soc., 104

(1982) 6764-6769. [9] E. Hardegger, M. Schellenbaum, R. Huwyler et A. Zst, Helv. Chim. Actu, 40 (1957) 18 15-1818. [IO] L. Chen, D. P. Dumas et C. H. Wong, J. Am. Chem. Soc., 114 (1992) 741-748. [ I 11 M. L. Valentin et J. Bolte, Tetrahedron Left. 34 (1993) 8103-8106. [I21 S. David, C. Aug et C. Gautheron, Adv. Curb. Chem. Biochem., 49 (1991) 189-194. [I31 M. D. Bednarski, E. S. Simon, M. Bischofberger, W. D. Fessner, M. J. Kim, W. Lees, T. Saito, H. Waldmann et G. Whitesides, J. Am. Chem. Soc., 1I 1 (1989) 627-635. [I41 M. Schultz, H. Waldmann, H. Kunz et W. Vogt, Liebigs Am. Chem., (1990) 10101024. [IS] G. Descotes, dans Carbohydrates, Synthetic Methods and Applications in Medicinal Chemistry, dit par H . Ogura et coll., VCH (1992) 89.

CHAPITRE 7

Changements de configuration Sucres non saturs et ramifis

7.1 DPLACEMENT DES HYDROXYLES ALCOOLIQUES


La mthode la plus frquente de dplacement dun hydroxyle alcoolique commence par sa conversion en sulfonate. Les sulfonates des hydroxyles cycliques des sucres sont trs peu ractifs vis--vis des nuclophiles externes. Cest sans doute une consquence de la fonctionnalisation leve de la molcule, qui conjugue empchement strique et effet inducteur dfavorable. La substitution, pratiquement impossible avec les anciennes techniques, nest devenue une opration courante qu la suite de deux innovations. La premire est lintroduction de solvants polaires aprotiques. Parmi ceux-ci, le solvant favori est la N, N-dimthylformamide, car cest le plus facile liminer en fin dopration, par exemple par extraction leau dune solution thre. Cependant, mme dans la DMF bouillante, certains tolunesulfonates et mthanesulfonates sont inertes. Aussi la seconde innovation a-t-elle t lintroduction de deux groupements partants dune efficacit suprieure, le trifluoromthanesulfonate (triflate) et limidazolylsulfonate (imidazylate). Lefficacit des triflates, CF,-SO,-OR, est sans doute lie la stabilit de lanion CF, Soi, elle-mme une consquence de lacidit leve de lacide CF,SO,H. On les prpare commodment par action sur lalcool de lanhydride (CF,SO,),O en prsence dune base, comme la pyridine, qui peut aussi jouer le rle de solvant. Les inconvnients lis lemploi des triflates sont le prix lev du ractif, leur instabilit vis--vis de lhumidit et leur incompatibilit avec le groupement actamido, sauf prcautions spciales[]. Le ractif pour la prparation des imidazylates est le sulfuryl-bis-imidazole 7.1, produit indfiniment stable, prpar par action du chlorure de sulfuryle sur limidazole. I1 ragit sur les alcoolates pour donner limidazylate 7.2. La raction (7.1) de substitution nuclophile121 donne comme sous-produits les produits de fragmentation, SO, et imidazolate. On peut expliquer lefficacit comme une consquence de cette fragmentation, qui rend irrversible la rupture de la liaison R-O conscutive une grande longation vibrationnelle dans le complexe activ SN2. Linconvnient des imidazylates est que leur prparation la plus commode passe par lalcoolate, donc implique des conditions basiques. Leurs avantages sont leur stabilit temprature ambiante - plusieurs jours dans leau - et le cot ngli-

Dplacement des hydroxyles alcooliques

109

7.1

7.2

CH20Bz OBz

All0

Me
OTf
7.3

Al10
7.4

OMe

geable du ractif. Ce sont donc les drivs les plus recommandables au dbut d'une squence synthtique. Suivant leur emplacement sur un sucre, les sulfonates ont des ractivits trs diffrentes. Ceci se manifeste, par exemple, dans le comportement des tosylates. Le tosylate de la fonction alcool primaire est substituable sans difficults, mme dans les solvants n'appartenant pas au groupe polaire-aprotique. La substitution en 3 ou 4 n'est possible qu'en solution dans la DMF. La substitution en 2 est rigoureusement impossible. En revanche, on l'observera souvent sans problme la position 2 partir d'un triflate ou d'un imidazylate. Ces diffrences de ractivit apparaissent clairement dans la raction de triple substitution du tris triflate P-D-galacto 7.3 par le benzoateF31. On prpare celui-ci quantitativement partir du triol en 5 heures O". Il ragit quantitativement avec le benzoate de ttrabutylammonium en solution tolunique temprature ambiante en 45 minutes pour donner le produit de substitution sur C(4) et C(6), D-gluco. Le chauffage, une heure loo", conduit ensuite au tribenzoate D-manno 7.4. Ces prdictions gnrales de ractivit doivent tre quelquefois rvises la baisse en raison de contraintes striques, mme sur une position primaire. Par exemple, le tosylate a-D-galacto 7.5 est extrmement peu ractif, sans doute cause de l'encombrement du groupement isopropylidne voisin. La comparaison des tosylates a - D - d o 7.6 et a-D-gluco 7.7 est significative. On substitue le tosylate 7.6 par NaN3 par un chauffage de 4 heures dans la DMF 140". Dans les mmes conditions, il faut 15 jours pour obtenir le produit de substitution du tosylate a-D-gluco 7.7, parce que I'azoture N j doit s'introduire en endo entre deux pentagones[4]. C'est dans ce contexte qu'une exprience[2]dmontre magistralement l'efficacit des nouveaux groupements partants : la substitution de l'imida-

110

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

Me

Me Me Me
7.5 7.6

Me

Me Me
7 . 7 R=Ts 7 . 8 R=Ims

-OR

OIms
Me
7.9 7.10

zylate a-D-glum 7.8 donne lazoture a - D - d o 7.9 avec 62 % de rendement en 5 heures dans le tolune 80. Comme nous lavons dit, la substitution sur C(3) du << diactone-glucose N est contrecarre parce que le nuclophile doit sapprocher dans le volume endo. On observe une opposition analogue lorsque le nuclophile doit sintroduire avec une orientation axiale gene par une interaction diaxiale-1,3 avec le reste de la molcule. Ainsi, lorsquon tente la substitution par le benzoate de limidazylate P-D-galacto 7.10, on observe lattaque intramolculaire par loxygne cyclique, avec formation du driv 7.11, 2,5-anhydro.

Dplacement des hydroxyles alcooliques

111

Les nuclophiles les plus couramment utiliss sont les sels des acides actiques et benzoques, qui conduisent aux actates et benzoates de sucres de configuration oppose, les halognures, les thiolates, qui permettent dintroduire un atome dhalogne ou un radical alkylthio, et enfin les nuclophiles azots, dont nous allons parler un peu plus longuement. Parmi ces derniers, on a utilis NH, et NH,-NH, et il peut y avoir des cas o leur emploi est prfrable, mais lanion azoture (N = h=N) -jouit prsentement dune grande faveur. Sa structure cylindrique lui donne un trs faible encombrement. De fait, son enthalpie libre conformationnelle (voir le paragraphe 2.5) est presque ngligeable. Enfin il nest que faiblement basique. Or le risque dlimination E, existe aussi avec les sucres, sil y a un proton antiparallle au sulfonate sur le carbone voisin. Lazoture organique est facilement transform en amine par rduction avec LiAlH,, ou un thiol, ou par hydrognation catalytique. Son introduction est incompatible avec une protection allyl ther. Les deux exemples suivants montrent lutilit des ractions de substitution pour prparer des sucres peu accessibles, mais importants dans le cadre de ce livre. La N-actylgalactosamine est trs coteuse alors que son pimre en 4, la N-actylglucosamine est disponible en grosses quantits. Pour faire un p-glycoside de la N-actylgalactosamine, on aura avantage prparer lanalogue D-gluco, par exemple 7.12, prpar pour la substitution des positions 4 et 6, qui conduit, aprs dprotection, au glycoside 7.13[sl. La N-actylmannosamine est galement un sucre trs coteux, dont la chimie a t peine explore. Pour prparer ses drivs, on a trouv utileF6]de passer par lazoture 7.15, lui-mme obtenu par substitution de limidazylate 7.14. On donnera au paragraphe 10.3.4 un exemple dapplication de ces mthodes la synthse des glycosides du type cis-1,2, quatorial-axial.

CH(0R)OBz
MAC
7.11 7.12

OBn NHAC
7.13

BnO

OBn R
07.16

7 . 1 4 R=O-Ims, R=H 7 . 1 5 R=H, R=N,

112

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

7.2 POXYDES[4]171
Pour quun cycle dpoxyde puisse se boucler, il faut quil y ait deux fonctions vicinales, sulfonate (ou halognure) et alcoolate en position antiparallle. Cette condition est peu contraignante en dehors des cycles et on btit facilement un poxyde sur les carbones C(5) - C(6) dun furanose. Dans un cycle 6 lments, elle implique une conformation trans diaxiale 7.16 des fonctions ragissantes. La fermeture de lpoxyde est alors extrmement rapide. La raction (7.2) donne un exemple qui peut paratre extrme, car on peut imaginer que lpoxyde obtenu est une molcule trs tendue en raison de ses trois cycles. De plus, cest une raction de substitution (interne) sur la position 2 peu ractive. Nanmoins, elle est complte en 10 mn temprature ambiante en prsence de NaOMe molaire. Cependant, on observe aussi la fermeture dpoxydes partir de substituants trans diquatoriaux dans des conditions modres, tout au plus un chauffage peu prolong 100C. On peut penser que le supplment lnergie dactivation est d la ncessit de passer par une conformation moins stable ou les fonctions ragissantes se rapprochent de la disposition 7.16. La raction (7.3) est une excellente voie daccs lpoxyde 7.17.

(7.2)

A
(7.3)

OTs

OH

p + )

i ?
O

OMe

7.17

On peut remplacer lhydroxyle alcoolique vicinal par toute fonction transformable en alcoolate dans les conditions trs basiques de la synthse, par exemple actate. Plus surprenante est la prparation, videmment trs commode, partir des ditosylates trans (Ractions (7.4)). Cette raction se produit 0C et, cependant, elle implique une rupture htrolytique entre oxygne et soufre quil nest pas du tout commode de raliser par voie intermolculaire. Nous observons que cest le tosylate sur C(3) qui est dplac, ce qui conduit un poxyde a-D-allo 7.18. On retrouve encore ici linertie de la position 2 vis--vis de la substitution.

Epoxydes

113

(7.4)

TsO
OMe

O
7.18

7.19

La fermeture de loxirane entrane la coplanarit de quatre atomes du cycle pyranose, et une conformation demi-chaise 7.19 (les sommets de lhexagone sont oxygne ou carbone). Ces poxydes de sucres manifestent la mme grande ractivit que les autres, en particulier vis--vis des nuclophiles. On sait que louverture des poxydes cyclohexaniques est << trans-diaxiale , selon la rgle de Frst-Plattner. Cette rgle a t tablie avec des strodes rigides. Si les sommets 3, 4, 5 , 6 de lhexagone de la stucture 7.19 sont maintenus de faon presque rigide, il ny a quune conformation chaise possible par ouverture de loxirane et la dfinition des positions axiales dans le produit final ne soulve aucune ambigut. Dans le cas o on arrive une chaise mobile, on peut objecter la rgle que la conformation de cette chaise et, partant, la dfinition des positions axiales, ne sont pas indpendantes des nouveaux substituants du cycle. Dans le cas des pyranoses, disons que louverture se fait de faon donner le produit diaxial dans la chaise btie sur les atomes 3, 4, 5, 6 supposs maintenus presque rigidement. Si cette conformation est instable, la molcule prend la conformation chaise alternative et les deux substituants introduits se retrouvent en position trans-diquatoriale. On connat des exemples de cette situation, mais, bien souvent les substituants se retrouvent finalement en position trans diaxiale. Un grand nombre de nuclophiles ouvrent les poxydes de sucres, si bien que ces drivs ont une grande utilit synthtique. On a dcrit des ractions avec les nuclophiles oxygns hydroxyle, alcoolate, benzoate, phosphate, eau en milieu acide, les nuclophiles soufrs thiolate, thiobenzoate et thiocyanate, et les nuclophiles azots ammoniac, amines et azoture en prsence de chlorure dammonium. On a ainsi les ouvertures diaxiales typiques de la raction (7.5) partir de lpoxyde a-D-manno (X = OH, OCH,, NH,, N,, SCH,, SCN) et de la raction (7.6) partir de lpoxyde a-D-allo (X = OH, OCH,, NH,). Laluminohydrure de lithium se comporte comme le nuclophile H- (X = H) dans les deux ractions prcdentes, ce qui permet une bonne prparation des sucres dsoxygns, par exemple

114

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

(7.7). Les nuclophiles carbons ouvrent les poxydes bis secondaires en donnant des sucres ramifis ; ils seront traits au paragraphe 7.6.3. Naturellement, si la structure sy prte, les poxydes peuvent aussi souvrir par voie intramolculaire. Louverture par un alcoolate vicinal trans. saccompagne alors du bouclage dun autre cycle. Avec un alcoolate vicinal, ceci conduit une migration dpoxyde, plus ou moins rversible, telle lisomrisation (7.8), observe en milieu basique.

OMe

OH

OMe

LiAIH, Q O M e OMe CH,OH


I

7.3 LES IONS ACYLOXONIUMS CYCLIQUES[81


I1 y a plusieurs manires de prparer les ions acyloxoniums cycliques. Nous ne traiterons que de laction du pentachlorure dantimoine sur les diactates vicinaux et les actates chlors ou broms sur le carbone vicinal, car cest la technique qui a permis les ractions les plus intressantes en chimie de sucres (Ractions (7.9)). Le cation acyloxonium est ambident : la raction dite cintique a lieu sur le site le plus charg, par exemple H,O et OH- donnent lorthoester instable 7.20 qui souvre en hydroxy ester cis 7.21 ; la raction dite thermodynamique, avec actate

Les ions acyloxoniums cycliques

115

en milieu acide, chlorure et bromure conduit la formation du produit trans 7.22 (X = AcO, C1, Br).

(7.9)

i FCH2 \ TCH2 +
SbC1,
O

\+/

0 SbCi,X-

\ //O
C

CH,

V H
OH
O

OCOCH,

5=
7.22

OCOCH,

CH, OH
7.20 7.21

Le tripivalate de glycrol, 7.23 (Raction (7. lo)), peut ragir par cyclisation avec la participation de l'un ou l'autre des groupements pivaloyl terminaux, en donnant deux acyloxoniums identiques 7.24 et 7.25. Ces deux cations sont en quilibre, par suite de l'attaque trans du carbonyle ester sur le cycle acyloxonium. Cinterconversion est assez lente la temprature ambiante. On observe deux signaux de mthyle en RMN du proton, celui des mthyles du groupement pivalate, Me3CCOO-, et celui des mthyles du groupement pivaloyloxonium, dcal vers les champs faibles par la proximit d'une charge positive. La vitesse d'interconversion augmente rapidement avec la temprature et on observe la coalescence 87C. On peut calculer partir de ces observations une enthalpie libre d'activation AG; = 18,55 & 0,06 kcal mol cette temprature, en solution dans le ni tromthane.

R
7.23 7.24

R
7.25

116

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

O x N H

COCH,
7 . 2 6 R=OAc 7 . 2 7 R=Cl 7.28

On ne peut observer une raction propre avec les pyranoses que si lon sarrange pour orienter la premire cationisation sur c(1). Avec le glucose, le pentaa7.27 ont la ctate b, 7.26 et le chlorure de ttra-0-actyl-P-D-glucopyranosyle disposition favorable lattaque par le carbonyle de lactate en C(2). Le chlorure a,anomre de 7.27 ragit aussi en raison de la facilit avec laquelle il sionise en ion oxocarbnium. Lun quelconque de ces trois prcurseurs, en solution dans le dichloromthane trait 20C donne un mlange en quilibre de cations actoxonium drivs des quatre configurations, D-gluco, D-manno, D-altro et D-ido (7.11). On dtermine la composition du mlange par hydrolyse. On a alors le mode cis de dcomposition, qui donne un mlange de sucres partiellement actyls. On peractyle le mlange et on dtermine sa composition par chromatographie de vapeur. A temprature ordinaire, lquilibre entre les cations actoxonium drivs des quatre configurations correspond aux proportions suivantes : Dg l u m : 54 % ; D-rnanno 13 % ; D-altro 6-9 % ; D-ido 21 %. Mais comme lhexachloroantimonate du driv D-ido est trs peu soluble dans le dichloromthane, il se spare par cristallisation, ce qui dplace lquilibre, si bien quon peut lisoler avec 73 % de rendement. On a ainsi un accs trs facile cette configuration rare.

Sucres non saturs

117

7.4 DPLACEMENTS NUCLOPHILES AVEC PARTICIPATION


Les ions acyloxonium du paragraphe 7.3 sont stabiliss par un anion lourd. On admet aussi la formation dacyloxonium, cette fois comme intermdiaires ractionnels non isols, dans la solvolyse de certains tosylates. Dans la raction (7.12) avec lactate de sodium, lintroduction de lactate en 6 et la migration du benzoate en 5 tmoignent du passage par un intermdiaire benzoxonium. De mme, la solvolyse des sulfonates prsentant un groupement actamido trans vicinal passe par un cation oxazolinium 7.28, analogue dun acyloxonium.
CH,- O,+

(7.12)

NaOAc

k>
H,OAc

Me Me Me Louverture dite << cis >> du ct de loxygne donne le mme rsultat que la substitution SN2 du sulfonate. Mais on observe une substitution dans des conditions o une raction SN2 sans participation serait inapprciable. Ainsi la raction (7.13) donne 66 % de rendement en 40 heures au reflux du mthylcellosolve (124), ce qui est tout de mme un traitement relativement nergique, mais nimplique pas de solvants polaires aprotique~[~]. A partir de lanomre p du mme substrat dans la DMF, le nucloside PhCH,SK donne un mlange de benzyl thiothers avec rtention et inversion de configuration (correspondant respectivement aux ouvertures << trans >> et << cis >> du cation oxazolidinium) et doxazolidine, produit de dprotonation de ce cation.

7.5 SUCRES NON SATURS 7.5.1 Glycals


On obtient le prototype 7.29 par rduction par le zinc et lacide actique du broOn peut imaginer que le dpart de mure de ttra-O-actyl-P-D-glucopyranosyle.

118

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

bromure laisse un cation oxocarbnium, rduit au stade anion par le zinc, et que la raction se termine par limination C( 1) - C(2) dactate. Du triactate 7.29, on passe au glycal libre 7.30 par mthanolyse alcaline. Cette voie daccs est gnrale et peut servir aussi, par exemple, la prparation de lisomre D-galactal. Les glycals, facilement accessibles et capables de ractions varies, ont un grand potentiel synthtique[lO]. Les glycals sont des thers dnols et donnent lieu des additions lectrophiles. Avec un ractif dissymtrique, la partie lectrophile sadditionne sur C(2), de faon faire apparatre un ion oxocarbnium relativement stable en C( 1). Ainsi leau, les alcools et les acides carboxyliques, en catalyse acide, donnent respectivement le sucre 2-dsoxy (7.31, Z = OH), le glycoside 2-dsoxy (7.31, Z = OR) et lester (7.31, Z = OCOR). Les conditions, qui catalysent aussi lanomrisation, conduisent lanomre le plus stable. Les acides HC1 et HBr donnent les chlorures et bromures de 2-doxyglycosyle (7.31, Z = C1, Br). Chlore et brome donnent chacun les deux drivs halogns possibles, par exemple, partir du tri-0actyl-D-glucal, a-D-gluco (7.32, 60 %) et a-D-manno (7.33, 30 %). L encore, ltape initiale, due la molcule de brome ou au cation Br+ lectrophiles engendre un cation oxocarbnium centr sur C( l), qui, en prsence de sels dargent, capte une molcule dun solvant alcoolique, pour donner un a-glycoside, 2bromo-2-dsoxy, par exemple 7.34. En revanche, le couplage des bromures 7.32 ou 7.33 en prsence de carbonate dargent donne le glycoside p de la faon attendue. On limine facilement lhalogne dans tous ces composs par voie radicalaire et on arrive ainsi aux sucres 2-dsoxy. La mthoxymercuration de 7.29 ou 7.30 avec lactate mercurique dans le mthanol fabrique une liaison carbone-mercure. Le triactylglucal7.29 donne, aprs remplacement de lactate ionique par du chlore, le glycoside p 7.35, mlang son isomre a-D-manno (les deux produits sont trans- 1,2). Le D-glucal libre donne le mthyl 2-actoxymercuri-2-doxy-aD-mannopyranoside avec un rendement lev. La rduction au borohydrure remplace le mercure par de lhydrogne. Enfin les peracides, qui se comportent en premire approximation comme des sources de cations OH+, reconstituent des pyranoses partir des glycals. Ce peut-tre un procd commode pour inverser la configuration en C(2) dun sucre. Ainsi, du galactose on passe au D-galactal7.36, puis, par traitement avec de lacide perbenzoque en solution aqueuse, un mlange de galactose et de talose[]. Ce sucre rare 7.37 est facilement sparable du galactose par cristallisation. Rappelons que linversion directe sur C(2) est impossible dans la srie du galactose. Pour terminer, rappelons la synthse des anhydrides de Brig1 par poxydation des glycals avec le dimthyldioxirane expose au paragraphe 3.4. On traitera dun autre type daddition, lazidonitration, au paragraphe 10.3.3 Les composs hydroxyls -eau, alcools, phnols - ne sadditionnent pas sur la double liaison des glycals et de leurs esters en labsence de catalyseurs acides. En revanche, une temprature relativement leve, ils produisent un dplacement de la fonction actate en 3 des triactylglycals, avec migration de la double

Sucres non saturs

119

H
7 . 2 9 R=Ac 7 . 3 0 R=H 7.31

R I Br 7 . 3 2 R=Br, R'=H 7 . 3 3 R=H, R'=Br CH,OH

-A c

Me
7.34 7.35 7.36

7.37

7.38

7.39

liaison la position 2-3 selon 7.38. Ainsi le mthanol conduit au mthyl4,6.di-O-

actyl-2,3-didoxy-a-D-rythro-hex-2-enopyranoside.
7.5.2 Raction de Ferrier
Nous avons rencontr ci-dessus des pyranoses avec une double liaison en C( 1)
- C(2) ou C(2) - C(3). On connat des exemples de sucres avec des doubles liai-

sons sur toutes les autres positions. Nous nous bornerons dcrire une raction importante des pyranoses non saturs en 5-6. On les prpare par limination partir des pyranoses 6-doxy-6-iodo. Un article de 1988[12] propose un traitement de 4 heures 80" dans la DMF en prsence d'une base non nuclophile, le DBU 7.39, mais d'autres ractifs ont pu tre utiliss antrieurement. En quelques heures de reflux dans l'actone aqueuse en prsence de chlorure mercurique, le ttrabenzoate 7.40 donne la cyclohexanone substitue 7.41[131.Le produit de dpart 7.40 est, comme le glucal, un ther vinylique. En oprant dans des conditions trs modres, on a pu mettre en vidence l'intermdiaire ouvert 7.42, qui se cyclise ensuite comme un aldhyde &ctonique['4]. On a pu galement raliser la conver-

120

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

H,HgCl

HO

BzO OBz
7.40 7.41

OBz
7.42

7.45

7.46

sion en cyclohexanone en remplaant HgC1, par une quantit catalytique (relativement leve, 10-20 mol %) dactate ou de chlorure de palladium[*].

7.6 SUCRES RAMIFIS 7.6.1 Gnralits


Deux sucres ramifis, lapiose 7.43 et lhamamlose 7.44, sont trs rpandus dans le monde vgtal. On en a isol au moins une quarantaine dautres comme constituants de molcules antibiotiques, ce qui a stimul un effort synthtique important. La matrise des conditions de ramification semble indispensable si lon veut utiliser les sucres comme matire premire chirale. I1 est commode de classer les sucres ramifis en deux groupes. Dans le groupe le plus abondant, car cest le plus facile prparer, il y a un htrolment, le plus souvent loxygne dun

Sucres ramifis

121

hydroxyle, au pied de la ramification, selon lenchanement %(OH) - R. Dans lautre groupe, il y a de lhydrogne, selon lenchanement >CH - R[l5].

7.6.2 Famille >C(OH) - R


Les organomtalliques sadditionnent de la faon habituelle sur les carbonyles des cycles furanose ou pyranose. Pour viter le gaspillage de ractif, ou des prcipitations indsirables en cours de raction, il est souhaitable dutiliser des protections ther ou actal. La raction est souvent strospcifique. Le diactal 7.45 donne avec CH3MgBr ou CH,Li uniquement le produit a-D-allo 7.46 de lattaque exo. Les ractions (7.14) illustrent quelques tapes de la synthse de lhamamlose qui comporte laddition exo sur la ctone approprie du dithiane lithi (78 %). La libration de la fonction aldhyde par loxyde mercurique et le trifluorure de bore (75 %) est suivie dune rduction par laluminohydrure de lithium (70 %). On observe des additions analogues avec dautres nuclophiles carbons, comme le cyanure, lanion driv du nitromthane, etc.

Une autre procd de ramification utilise la raction de Wittig. La condensation du sucre carbonyl avec le mthylnetriphnylphosphoranedonne les sucres double liaison exocyclique, comme le furanose 7.47. La conversion en diol vicinal 7.48 par OsO,, suivie de la tosylation slective de la fonction alcool primaire et de la rduction du sulfonate 7.49 par LiAlH, donne le produit final 7.50. Cest un chemin contourn, mais qui aboutit lisomre endo. Lpoxydation de la double liaison exocyclique par les peracides donne le << spiropoxyde , qui peut

7.47

7 . 4 8 R=OH, R=Bz 7 . 4 9 R=OTs, R=Bz 7 . 5 0 R=H. R=H

122

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

tre hydrolys en glycol, ou rduit son extrmit primaire (Ractions (7.15)). On obtient galement un spiropoxyde directement partir du sucre carbonyl en le traitant par le dimthylsulfoxonium mthylure CH, = S(0)Me2. On a donc un vaste choix de voies daccs cette premire famille, ce qui laisse esprer que lune ou lautre conduira lisomre dsir.

(7.15)

-O

CH20H

7.6.3 Famille >CH-R


La synthse de ces produits prend de plus en plus dimportance, avec lemploi croissant de squences de sucres en synthse totale. I1 est rare que les squences prparer ne soient pas ramifies. Une premire solution consiste hydrogner . 5 1 catalytiquement les doubles liaisons exocycliques. Ainsi, la ctone 7 (R = Me,CPh,Si) aisment accessible partir de 2-dsoxyglucose, condense avec le phosphonate (MeO),P(O)CH,CO,Me (Raction de Wittig-Homer) donne le produit double liaison exocyclique 7.52, qui est ensuite hydrogn sur palladium sur charbon. On obtient le sucre ramifi 7.53 avec au moins 95 % de rendeH

OBz
7.51

OBz
7.52

CONe

cH2w
CH-OR OBz
I

OMe

7.53

Sucres ramifis

123

ment. La strospcificit vient des contraintes imposes par la structure polyfonctionnelle du pyranose et le volume du groupement R. Le produit 7.53 est un intermdiaire dans la synthse du thromboxane B2[16]. Une autre voie dapproche est la dsoxygnation de lhydroxyle tertiaire au pied de la ramification. Parfois la configuration facilite une orientation slective de la dshydratation endocyclique, donnant une double liaison rductible par la suite (7.16). On a aussi dcrit la dsoxygnation radicalaire dun benzoate vicinal dun carbonyle au moyen du tributylstannane (7.17). Dans ce cas, il y a inversion de configuration mais cest peut-tre un exemple isol. Le rsultat est sans doute li la configuration du radical intermdiaire port par le carbone li au benzoate. En tout cas, cest une rduction radicalaire atypique. Dautres ractions introduisent directement la ramification >CH-R, par exemple louverture des oxiranes par les nuclophiles carbons. Le cuprate Me2CuLi donne avec loxirane 7.18 le produit douverture diaxale 7.54. On observe des ractions analogues avec les dialkylmagnsium (la prsence dun anion halognure doit parfois tre vite), le cyanure Et,AlCN et le malonate dthyle sod.

H3

OH
7.54

OMe

Nous navons rencontr jusqu prsent que des ractions ioniques dans la prparation des deux types de sucres ramifis. On peut aussi introduire une ramifica-

124

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

Br

1.55

1.56

tion du type >CH-R par voie radicalaire. Par exemple, on traite le driv 2-bromo2-dsoxy 7.55 par I'allyltriphnyl-stannane CH, = CH - CH, - SnPh3 dans le benzne 80" et on entretient la raction radicalaire en chane par addition lente (7 heures) d'azoisobutyronitrile, un amorceur classique de ractions en chane. On obtient ainsi le sucre ramifi 7.56, mlang 10 % de son pimre en 2, mais isolable par cristallisation avec 39 % de rendement[I7].Le mcanisme de la raction en chane est donn sur la figure 7.1, ou le sucre brom 7.55 est reprsent par RBr. L'amorceur le transforme en radical R', qui s'additionne sur l'allylstannane. Le nouveau radical se fragmente en donnant le sucre ramifi R - CH, - CH = CH, et le radical Ph3Sn', qui dtache Br de RBr, et la raction se poursuit[lsI. On a effectu des ramifications par cette mthode d'autres positions que C(2) et avec d'autres accepteurs, comme l'acrylate de mthyle. Enfin, on a prpar des sucres ramifis par une raction sigmatropique, le rarrangement de Claisen. Le chauffage 180" de l'ther vinylique 7.57 donne le dihydropyrane 7.58. La ramification est du mme ct du cycle que la fonction ther vinylique du produit de dpart et le rarrangement est strictement strospcifique. Ce type de raction est utile en synthse chirale, car le << sucre >> final est dsoxygn sur trois positions, cependant la prsence d'une double liaison

Figure 7.1 Mcanisme de la substitution radicalaire du ttra-O-actyl-2-bromo-2-doxy-PD-glucopyranose.

Rfrences

125

H,OH

7.57

7.58

CH,OH
7.59 7.60

dans 7.58 laisse entrevoir des possibilits dintroduction dhydroxyles, cis ou trans sur les carbones C(3) et C(4).

7.6.4 Condensation aldolique


Cest encore une raction ionique, mais elle mrite une place a part. Elle peut conduire des sucres des deux familles. La condensation dun aldhyde en a dun carbonyle libre, dans des conditions alcalines modres, semble toujours possible. Cette raction trs simple peut tre trs efficace. Ainsi le diactal 7.59, prpar quantitativement en traitant le mannose par lactone en milieu acide, est en quilibre avec le tautomre carbonyl. La condensation avec le formaldhyde, utilis en solution aqueuse, en prsence de carbonate de potassium, donne le sucre hydroxymthyl 7.60 avec 86 % de

RFRENCES
A. Lubineau et H. Bienaym, Curbohydl: Res., 212 (1991) 267-271. S. Hanessian et J. M. Vatle, Tetrahedron Lett., 22 (1981) 3579-3582. J. Alais et S. David, Curbohydr: Res., 201 (1990) 69-77. N. Baggett, << The Synthesis of Monosaccharides n dans Carbohydrate Chemistry, (sous la direction de J. E Kennedy, chapitre lo), Oxford University Press, Oxford, 1988. P. H. Gross, E du Bois et R. W. Jeanloz, Curbohydl: Res., 4 (1967) 244-248. C. Aug, S. David, C. Gautheron, A. Malleron et B. Cavay, New J. Chem., 12 (1988) I 3 3-744.

126

Changements de configuration. Sucres non saturs et ramifis

[7] [SI [9] [lo] [il] [12] [13] [I41 [15] [16] [17] [is] [19]

N. R. Williams, Adv. Carbokydr: Ckem. Biockem., 25 (1970) 109-179. H. Paulsen, Adv. Carbokydr: Chem. Biockem., 26 (1971) 127-195. R.W. Jeanloz, J. Am. Ckem. Soc., 79 (1957) 2591-2. R. J. Ferrier, << Unsaturated Sugars >> dans The carbohydrates, Chemistry and Biochemistry, (sous la direction de W. Pigman et D. Horton), volume lB, p. 844, Academic Press, New York, 2e d., 1980. R. S. Tipson et H. S. Isbell, Methods Carb. Chem., I(1961) 157-8. S. Adams, Tetrahedron Lett., 29 (1988) 6589-6592. R. Blattner, R. J. Ferrier et P. Prasit, J. Chem. Soc., Chem. Commum., (1980) 944. R. Blattner, R. J. Ferrier et S. R. Haines, J. Chem. Soc., Perkin Trans. Z, (1985) 24132416. J. Yoshimura, Adv. Carbokydl: Chem. Biockem., 42 (1984) 69-134. S. Hanessian et P. Lavalle, Can. J. Chem., 59 (1981) 870-877. H. G. Korth, R. Sustmann, B. Giese, B. Rckert et K. S. Groninger, Chem. Ber:, 123 (1990) 1891-1898. B. Giese, Radicals in Organic Synthesis : Formation of Carbon-Carbon Bonds Pergamon Press, Oxford, New York, 1986. P. T. Ho, Can. J. Chem., 57 (1979) 381-383.

CHAPITRE 8

Les sucres en synthse chirale

8.1 INDUCTION ASYMTRIQUE[~~ 8.1.1 Allylation et aldolisation nantioslective


Les expriences que nous allons dcrire mettent en jeu des ractifs chiraux construits partir dun titanocneL2]L31 L41 c51. Le produit de dpart est le trichlorure de cylopentadinyltitane, C,H,TiCl,, que lon prpare partir du dichlorure (C,H,),TiCl, par chauffage avec TiC1,. Ce trichlorure se combine deux molcules de 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne-~~-D-glucofuranose (diactone-glucose) en prsence de trithylamine et donne le bis titanate 8.1. Celui-ci est un compos cristallis ; on a donc pu dterminer sa structure ltat solide. I1 a la forme dun tabouret de piano trois pieds, dont le cyclopentadinyl serait le sige. Les deux ligands ont des orientations compltement diffrentes par rapport au cycle cyclopentadinyle. De ce fait, ils mnagent une cavit chirale autour de latome de titane. Ltude de 8.1 en solution par RMN nindique ni inversion du centre mtallique, ni change rapide de ligands. Ceci suggre que la conformation en solution est voisine de la conformation dans le cristal. Le traitement de ce complexe par le chlorure dallylmagnsium donne lorganomtallique allyllitane 8.2. I1 semble que la cavit chirale du prcurseur 8.1 soit encore prsente dans 8.2. On a prpar deux autres drivs partir du monochlorure 8.1 : lnolate au titane 8.3, en lui opposant le lithien LiCH,COOCMe3 driv de lactate de butyle tertiaire, et

Ci
8.1

8.2

128

Les sucres en synthse chirale

/Ti\

8.3

8.4

8.5

lnolate au titane 8.4, en lui opposant le lithien du glycinate dthyle protg sur la fonction amine 8.5. Lallyltitane 8.2 donne avec les aldhydes Ialcool homoallylique (Raction (8.1)). A -76, laddition a lieu prfrentiellement sur la face re du carbonyle. La raction a t conduite avec seize aldhydes aliphatiques et aromatiques. La moyenne des excs nantiomriques mesurs sur les produits daddition est de 90,5 %. Lnolate au titane 8.3 donne avec les aldhydes un produit de condensation aldolique, un ester hydroxyl en p (Raction (8.2)). Lexcs nantiomrique moyen, mesur partir de treize exemples, est de 94 %. Finalement lnolate du glycinate dthyle protg 8.4 donne comme produit de condensation avec les aldhydes des acides amins hydroxyls en p 8.6 (Raction (8.3)). Cette raction conduit des produits D-thru avec deux centres de chiralit. Les excs diastroisomriques et nantiomriques moyens sont de 97 % et 96 %. Comme lallylation, ces additions dnolates (8.2) et (8.3) ont lieu prfrentiellement sur la face re des aldhydes. I1 est raisonnable dattribuer ces slectivits nantiomriques la coordination de laldhyde dans la cavit chirale du complexe.

(8.1)

8.2

+
+

R-CHO

OH R

+ A / \ \
OH

....

(8.2)

8.3

R-CHO

C0,Me + RA/

....

OH
CO,Et R
NHR
8.6

(8.3)

8.4

R-CHO

....

Induction asymtrique

129

Dans toutes ces expriences, on rcupre comme sous-produit un polymre du cyclopentadinyltitane [(C, Hs) Ti(OH)O], qui peut tre reconverti en trichlorure et recycl. Lautre sous-produit est le diactone-glucose, galement rcuprable, mais en gnral de valeur ngligeable par rapport au reste.

8.1.2 Cycloaddition

2,3-dihydro-6H-pyraned61
La cycloaddition du glyoxylate de butyle, HCO-CO,C,H,, sur des thers dinyliques donne des 2,3-dihydro-6H-pyranes, substitus en 6 par un groupement alcoxy et en 2 par une fonction ester, que lon peut considrer comme des analogues trs rduits de pyranose[6]. On peut prparer des thers dinyliques de sucres. La plus simple de ces prparations consiste en laddition de loxygne de lhydroxyle dun sucre partiellement protg, tel 8.7, sur une des triples liaisons du butadiyne vendu sous une forme stabilise, Me2C(OH) - C = C - C C C(OH)Me2. Cette addition donne lther 8.8 (mlange cis-trans), ensuite semihydrogn en 8.9 (mlange cis-trans). Les deux constituants de ce mlange sont sparables. La cycloaddition du glyoxylate de butyle cre deux nouveaux centres de chiralit, et, compte tenu de la chiralit du sucre, quatre dihydropyranes diastroisomres. I1 est commode de les dsigner avec les conventions de la nomenclature des sucres, par a-D, 0-D, a-L, B-L. Les proportions dans le mlange de dihydropyranes 8.11 obtenus dans la cycloaddition sur lther dinylique trans

Bn
3n
8.7

8.8 8.9

R=H R= CHICH-CGCH R= CH=C-CH=CH,

8.10

0,Bu

CO,Bu

OR*

a -D

P-D

CI-L

P-L

8.11

130

Les sucres en synthse chirale

Me M%o] O

bR
OX0

Me Me
8.12 8.13

8.10 sont a-D (44 %), p-D (4 %), a-L (O %) et p-L (52 %). Ces proportions correspondent 56 % daddition endo. Plus intressant est le degr lev de slectivit faciale, la proportion daddition sur la face si de lther dinylique, qui correspond la s o m e ( a - D )+ @-L), atteignant 96 %. I1 y a donc un degr lev de protection de la face re contre lapproche du dinophile par la molcule de glucose perbenzyl. Les configurations a - D et p-L seraient identiques si on avait utilis un dinophile appropri. Effectivement, la cycloaddition du msoxalate dthyle CO(CO,Et), sur le dine cis 8.12 prpar partir du diactone-glucose donne, avec un rendement global de 85 % un mlange qui contient 92 % dadduit S, 8.13. Les dihydropyranes 8.11 et 8.13 et de nombreux analogues sont transformables en sucres pyranosiques authentiques par des fonctionnalisations convenable^^^] L8]. Ces premires cycloadditions ntaient compltes quaprs 72 heures 60C. Lorsque les partenaires sont plus ractifs et quon peut catalyser la cycloaddition avec des acides de Lewis, on peut oprer -78C. Dans ces conditions, on observe ventuellement une induction asymtrique leve : la raction (8.4) du cyclopentadine sur un acrylate driv du 5--trimthylsilyl-a-D-xylofuranose, conduite -78C dans le dichloromthane en prsence de TiCl, donne exclusivement ladduit endo ( l R , 2R). On explique ceci par la formation dun complexe intermdiaire qui contient la fois le dinophile et lacide de Lewis attachs au sucre inducteur chiral[9].

Induction asymtrique

131

3,6-Dihydr0-2H-1,2-oxazines[~~~
La cycloaddition [4 +2] de dines sur les drivs nitross chlors en a ouvre non substitues l'azote. On a un accs facile aux 3,6 dihydro-2-H-1,2-oxazines dvelopp cette raction partir de composs nitross chlors nantiomriquement purs drivs de sucres. La prparation de l'un deux est schmatise selon (8.5). L'oxime du << diactone-mannose B 8.14 est en quilibre tautomrique avec I'hydroxylamine cyclique. L'oxydation de cette hydroxylamine par le periodate de sodium 80" dans des conditions lgrement basiques (actate de sodium) donne l'hydroximinolactone 8.15. On peut considrer 8.15 comme l'oxime d'un carbonyle d'ester. Le driv nitros chlor 8.16, de couleur bleue, est finalement obtenu par chloration de 8.15 avec l'hypochlorite de butyle tertiaire. Le driv chlor nitros 8.16 est la fois plus stable et beaucoup plus ractif que ses analogues aliphatiques simples. Avec les dines les plus ractifs, comme le 1,3-cyclohexadine, la raction est termine en moins de 15 mn -70". Avec le 2,4-hexadine truns, truns, la raction dure moins de 4 heures -20". On reconnat la fin la disparition de la couleur bleue de 8.16. Le produit primaire de la cycloaddition du cyclohexadine subit une quaternisation interne, donnant un produit qui est coup par HC1 (Raction (8.6)) Dans cette exprience, qui conduit 8.17, comme avec les autres dines symtriques, la dihydrooxazine est obtenue avec un excs nantiomrique au moins gal 96 %. Me Me O-CH,

l o

> (

Me

8.14

8.15

8.16

132

Les sucres en synthse chirale

a
8.18

8.19

Dans le furanose 8.16 ltat solide, le chlore adopte une orientation pseudoaxiale et lazote une orientation pseudo-quatoriale. Lorientation de la liaison N-O est prcise par la reprsentation de Newman le long de la liaison C(1)-N, 8.18. Un modle compact indique quune face de N = O est trs encombre. I1 est probable quil y a la mme conformation en solution et que cest ceci qui impose lapproche endo schmatise en 8.19, o le cyclohexadine cherche viter le support sucre du driv nitros chlor.

8.1.3 Raction de Ugi


La raction de Ugi est la synthse de lamide dun acide a-amin par action sur un aldhyde dune amine et dun isonitrile, en prsence de chlorure de zinc et dacide formique. On a propos comme partenaire amin chiral une P-D-galactosylamine, dont les fonctions alcool sont protges par estrification en pivalate (Raction (8.7))[]. On conduit la raction dans loxolane entre -75C et -25C. Le mlange diastromnque obtenu correspond un rapport D/L voisin de 95 5 .

H,
OPiv

R-CHO, Me,C-NC HCO,H,ZnCl,


OPiv

Les sucres comme prcurseurs de squences dans les synthses de produits naturels

133

On obtient lisomre D pur par une recristallisation dans lheptane. On sait que la liaison entre sucre et azote est facile couper dans les glycosylamines (voir le paragraphe 3.6.2).

8.2 LES SUCRES COMME PRCURSEURS DE SQUENCES DANS LES SYNTHESES DE PRODUITS NATURELS

8.2.1 Considrations gnrales


On peut faire la synthse d u n e substance naturelle partir de prcurseurs racmiques en utilisant des ractions stroslectives ou strospcifiques. Le produit final est un racmique et il faut achever la synthse par un ddoublement optique. Cette voie dapproche semble passe de mode, au moins dans les laboratoires acadmiques. Une deuxime mthode repose sur la synthse asymtrique. Les produits de dpart sont racmiques, mais lemploi de ractifs et de catalyseurs incorporant des structures chirales permet dorienter une ou plusieurs tapes privilgies la route synthtique dans une voie chirale. Nous avons vu des exemples de tels ractifs au paragraphe 8.1 ci-dessus. La philosophie synthtique que nous allons dvelopper mantenant repose sur lemploi de matires premires chirales, gnralement abondantes. Elle repose sur un corps de principes dont lutilisation est facilite par des programmes informatiques particuliers, groups ri31 [141. Le mot sous le nom de << mthode du chiron D (the chimn approach)[121 chiron a t forg partir de << synthon chiral . On sait quen synthse totale, le mot synthon dsigne une petite molcule btie sur mesure pour sencastrer exactement sa place dans une synthse totale multitape. Le dcoupage en synthons de la cible (sur le papier !) est pratiqu aux sites o on peut esprer coudre les morceaux dans lavance synthtique. Ce sont en gnral les types de fonction prsents dans la cible (et lexprience passe du chimiste) qui orientent le dcoupage. Dans la << mthode chiron , le principe directeur est la conservation de la strochimie, on tche de dcouper la cible synthtique avec une pertubation minimale des centres strogniques. Naturellement, une deuxime condition intervient : les chirons coudre ensemble doivent tre des produits naturels abondants ou facilement accessibles partir de produits naturels abondants. Dans une certaine mesure, cest cette facilit daccs qui dicte la stratgie. Le coup dil du chimiste expriment nest pas toujours suffisant pour reconnatre les prcurseurs appropris sur la molcule cible. Un programme informatique se propose daider la reconnaissance de rapports cryptiques[I21[I3] [I4. Dabord, la molcule est prsente sous des aspects inhabituels, retourne, renverse, etc. Dune famille de composs lautre, les chimistes, suivis en cela par la presse spcialise, adoptent des convention picturales diffrentes. Cette diversit de reprsentation ralentit le transfert mental entre les configurations de membres de familles chimiques diffrentes. Le programme permet de passer automatiquement dune reprsentation conventionnelle une autre. Ceci est illustr sur la figure 8.1. La donne fournie

134

Les sucres en synthse chirale

lordinateur est la structure dun compos naturel forte activit, le FK506, dessine dune certaine faon, qui est la plus habituelle dans les priodiques, en haut gauche. A partir de ce dessin, le programme donne la configuration absolue, R ou S,autour de chaque carbone. I1 sectionne le grand cycle et aligne la chane sur un axe vertical, ce qui permet de passer la reprsentation suivant la convention de Fischer (en haut droite), familire aux spcialistes des sucres, ou la reprsentation en zig-zag (en bas). La reprsentation Fischer est particulirement com-

Me

/O Me

Me
12

XC

ox

OH

OX

Figure 8.1 Attribution des symboles R, S et dessin de deux projections du compos FK SO6 par le programme Chiron. Daprs S. Hanessian, J. Franco et B. Larouche, Pure Appl. Chem., 62 (1990) 1887-1910, S. Hanessian, Ibid., 65 (1993) 1189-1204 et S. Hanessian, Total Synthesis of Natural Product : The Chiron Approach, Pergamon Press, 1983 (publi avec les aimables autorisations de lInternational Union of Pure and Applied Chemistry).

Les sucres comme prcurseurs de squences dans les synthses de produits naturels

135

mode pour tablir une corrlation avec les sucres. Le programme va plus loin et suggre des voies synthtiques au dpart de << chirons D accessibles. Parfois la correspondance entre Chiron et squence de la cible nest pas du tout vidente. Ainsi les sucres ont des fonctions alcool en trop et il faut les dsoxygner. Plus subtilement, il peut tre profitable de conserver une fonction non prsente dans la cible jusqu une tape tardive de la synthse, parce quelle favorise la strospcificit des ractions. Depuis 1975, le rapport annuel de la Socit Chimique dAngleterre, Carbohydrate Chemistry, comporte un chapitre intitul Synthesis [ partir de sucres] of Enantiomerically Pure Non-Carbohydrate Compounds.

8.2.2 Synthse partir de sucres

(+)-Mroquinne[lSI
Cette pipridine 8.20 a une relation vidente avec la quinine 8.21, dont elle est un prcurseur synthtique. Le prcurseur est le compos 8.22, peractate dun 2-hydroxyglucal. On a entour le dessin 8.22 des indications sur les modifications ncessaires pour arriver au (+)-mroquinne. Le ttraactate 8.22 est trs facilement accessible, car cest le produit dlimination du bromure de ttra--actyla-D-glucopyranosyle 8.23 par la base non nuclophile, 1,5-diazabicyclo [5.4.0]

H
8.20
actate

8.21

Ac0
dsoxy

couper

NHX
8.22 8.23 8.24

136

Les sucres en synthse chirale

undc-5-ne (DBU ; 8.24). I1 se comporte strictement comme le glycal en prsence dun alcool et dthrate de trifluorure de bore : le rarrangement donne le glycoside non satur 8.25, qui est comme 8.22, un actate dnol. Lhydrolyse alcaline libre lnolate dont le tautomre ctonique subit aisment une limination dactate sur les positions 3-4. En ractylant, on obtient 8.26. A ce stade, le lecteur remarquera que 8.26 ne contient aucun des deux centres strogniques de la cible. I1 ny a plus que deux carbones asymtriques et, comme on va le voir, tous les deux destins disparatre dans la synthse. Mais cest grce leur prsence ce stade que les deux centres chiraux dfinitifs vont stablir. Laddition de Michal du vinylcuprate modifi, (CH, = CH) CuCN (MgBr)*, donne un nolate sur lequel on fait instantanment ragir le bromoactate de mthyle. Ceci donne presque exclusivement lisomre trans 8.27, isomris en cis 8.28 par la trithylamine. La suite des oprations comporte la dsoxygnation en C(2), 8.29, lhydrolyse des protections, 8.30 et le clivage du diol 5,6 par le periodate. La condensation du dialdhyde 8.31 avec la benzylamine, suivie de rduction par le cyanoborohydrure au pH 4.3 donne la pipridine 8.32.

8.25

8.26

CO,Me

Me,C O
8.27 8.28

K n/\/OR RO 1

CHO

CHO

\ /

Bn
8 . 2 9 R= CMe,, R= Ac 8 . 3 0 R=R= H 8.31 8.32

Les sucres comme prcurseurs de squences dans les synthses de produits naturels

137

(-) Ajmalicine (8.33) et (+)-IPpiajmalicine (8.34)[161

Ces deux alcalodes indoliques ont des proprits pharmacologiques importantes. Le point de dpart est lintermdiaire 8.29 dj employ la synthse du (+)-mroquinne. On hydrolyse la fonction actate par mthanolyse alcaline, ce qui donne lalcool primaire 8.35. Nous revenons ici passagrement au mode de reprsentation traditionnel des pyranoses pour mettre en vidence lorientation axiale du groupement vinyle. On dsoxygne le carbone 6 en remplaant dabord lhydroxyle par du chlore, au moyen du systme PPh,-CCl,, et on rduit ensuite le chlorure par voie radicalaire avec le tributylstannane. Ltape suivante est lozonisation du groupement vinyle en aldhyde 8.36, axial. Trait par la base 8.24, le substituant -CHO adopte la position stable quatoriale 8.37. Le couplage avec la tryptamine 8.38 en prsence de rducteur (NaBH4) donne 8.39 o lon reconnat les cycles ABDE des deux alcalodes cibles. Dans cette raction, la base de Schiff entre lamine et laldhyde est rduite en amine secondaire ; cette dernire est cyclise en amide cyclique par la fonction ester. Sans donner plus de dtails, notons que ce carbonyle amidique est en bonne place pour permettre une cyclisation sur le carbone a de lazote indolique, fermant ainsi le cycle C. Lintroduction du substituant COzMe sur le cycle E ncessite la conversion du glycoside en lactone 8.40, que lon peut dprotoner en a avec la base Et,NLi. La

&/O 0,Me
8 . 3 3 R= H, R= Me 8 . 3 4 R= Me, R= H

eo
H
CH,OH
OCMe,
8.35

Me

OCMe,
8.36

CO,Me
8.37

OCMe,

138

Les sucres en synthse chirale

8.38

8.39

IrV'.
OCMe, C02Me
8.42

O
8.40

C0,Me

O
8.41

Me
, CH,
,,'

T, , '

R;1"
,"

CH,

\
CO

,CH2

\
CO
OH

, '

CO
OH OH

OH

OH
8.43

OH
8.44

condensation de l'anion avec CNC02Me donne 8.41, qui est rduit en 8.42 par l'hydrure de diisobutylaluminium. L'orientation du mthyle de 8.42 correspond celle de l'alcalode epi. Pour la (-)-ajmalicine, il faut pimriser au niveau de C(5) du sucre, une tape convenable. La mthode repose sur l'ouverture de la lactone, qui libre la fonction alcool sur C(5). Celle-ci est alors inverse.

Substances naturelles d'origine polypropionique


Sur la molcule d'un certain nombre de substances naturelles, souvent antibiotiques, on observe des squences constitues par une chane carbone linaire sur laquelle alternent les ramifications mthyle et hydroxyle comme sur le fragment

Les sucres comme prcurseurs de squences dans les synthses de produits naturels

139

8.43. La plupart drivent sans doute de la condensation de formes biologiquement actives de lacide propionique selon 8.44. On rencontre aussi les squences dsoxygnes. Pour construire ces squences partir denchanement de sucres, un des problmes est lintroduction strospcifique de ramifications mthyle. Un Chiron possible est la D-ribonolactone 8.45. La protection slective de la fonction alcool primaire et la drivation du systme diol avec le thiocarbonyl bis imidazole 8.46 donnent le thionocarbonate 8.47. Le traitement de 8.47 au nickel de Raney produit une limination et conduit la lactone non sature 8.48. Laddition de Michal du ractif volumineux (MeS)3CLi a lieu en trans de C(5). On oxyde directement lnolate avec un peroxyde du molybdne et, l encore, un facteur dencombrement introduit lhydroxyle strospcifiquement en trans, donnant en une seule opration 8.49. Le substituant soufr est rduit en mthyle par le nickel de Raney. On a ainsi introduit spcifiquement la ramification carbone. De l on passe 8.50 par des transformations classiques. Nous avons port la numrotation de la ribonolactone pour permettre au lecteur de suivre les avatars du sucre. On

OH

OH
8.46

8.45

CH,OSiPh,CMe,

yo?. . Do
CH,OSiPh,CMe, CH,OSiPh,CMe,

cs
8.47

8.48

8.49

I/>O
Me-OxMe -0 Me
8.52
5

i.Ph

O Me
8.51

8.50

140

Les sucres en synthse chirale

Me
I

Me
5

OH

, .-.

FoxMe O Me
8.53

- \ yM

Me
8.54

ouvre lpoxyde avec lorganolithien bifonctionnel LiCH (SPh) C0,Li. Ceci introduit une fonction acide carboxylique, qui est lactonise sur la fonction alcool secondaire provenant de louverture de lpoxyde. On obtient la lactone 8.51. La fonction phnylthio est en place pour permettre lintroduction de la double liaison par limination de sulfoxyde. Le produit, 8.52, est un analogue de 8.48, sauf que la chane latrale a lorientation oppose. Aussi, cest toujours en trans de cette chane latrale qua lieu laddition de Michal. Le mthyllithiurn donne le produit ramifi 8.53. Comme prcdemment, on peut oxyder in situ. Aprs ouverture rductrice du cycle lactonique par LiAlH,, on arrive 8.54, prcurseur dune squence de lion~mycine[~].

RFRENCES
H. Kunz et K. Rck, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 32 (1993) 336-358. M. Riediker et R. O. Duthaler, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 28 (1989) 494-495. R.O. Duthaler, P. Herold, W. Lottenbach, K. Oertle et M. Riediker, Ibid., 495-497. G. Bold, R. O. Duthaler et M. Riediler, Ibid., 497-498. M. Riediker, A. Hafner, U. Piantini, G. Rihs et A. Togni, Ibid, 499-500. A. Zamojski, A. Banaszek et C . Grynkiewicz, Adv. Carbohydr: Chem. Biochem., 40 (1982) 1-112. S. David, A. Lubineau et A. Thiffry, Tetrahedron, 34 (1978) 299-304. S. David, J. Eustache et A. Lubineau, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I , (1979) 17951798. H. Kunz, B. Mller et D. Schanzenbach,Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 26 (1987) 267269. H. Felber, G. Kresze, R. Prewo et A. Vasella, Helv. Chim. Acta, 69 ( 1 986) 1137-1146. H. Kunz et W. Pfrengle, Tetrahedron, 44 (1988) 5487-5494. S. Hanessian, J. Franco et B. Larouche, Pure Appl. Chem., 62 (1990) 1887-1910. S. Hanessian, Ibid., 65 (1 993) 1189- 1204. S. Hanessian, Total Synthesis of Natural Products :The Chiron Approach, Pergamon Press, 1983. S. Hanessian, A. M. Faucher et S. Lger, Tetrahedron, 46 (1990) 231-243. S. Hanessian et A. M. Faucher, J. Org. Chem., 56 (1991) 2947-2949. S. Hanessian et P. J. Murray, Tetrahedron, 43 (1987) 5055-5072.

CHAPITRE 9

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

9.1 INTRODUCTION, NOMENCLATURE


Les molcules rencontres jusquici drivaient en gnral dun seul sucre simple, pentose, hexose, etc. Nous les avons appeles sucres, ce qui est correct, mais il va falloir dsormais les diffrencier dautres sucres, btis partir de deux, trois, quatre ... ou un trs grand nombre de sucres simples. Cest le moment dintroduire les termes, la signification vidente, de monosaccharide, di-, tri-, ttrasaccharide,. .. polysaccharide. Les units monosaccharidiques sont relies par des ponts oxygne, qui se prsentent comme le rsultat de la substitution de lhydroxyle hmiactalique de lune delles par loxygne dun hydroxyle li 2i lautre. Si ce dernier est galement hmiactalique, ces deux fonctions se bloquent rciproquement, il ny a plus daldhyde potentiel. La disparition du pouvoir rducteur tait dj facile reconnatre avec les moyens de lancienne chimie ; elle a servi trs tt de base la classification. Comme disaccharide non rducteur, nous avons dj rencontr le sucre ordinaire 3.21. Les trhaloses sont les trois disaccharides non rducteurs btis uniquement partir dunits D-glucopyranosyle, donc avec les configurations anomriques fixes a, a ; a, p et b, p. Le plus commun est lisomre a, a, 9.1, substance de rserve chez les invertbrs et les vgtaux infrieurs. Dans lautre type de liaison, loxygne du pont provient dun hydroxyle alcoolique. On la rencontre dans une multitude de produits naturels. Elle permet la formation denchanements de petite ou grande dimension, que le chimiste polymriste appellerait des oligomres et polymres de polycondensation. I1 reste toujours un bout de ces chanes une fonction aldhyde potentielle, do le nom dextrmit rductrice quon lui donne par abus de langage, mme si elle ne lest pas du tout, parce quelle est engage dans une liaison glycoside avec une molcule nappartenant pas la famille des sucres. Les trs longues chanes sont priodiques. Pour lamylose, 11.14, et la cellulose, 9.2, la priode est dune unit monosaccharidique D-glucopyranosyle, lie en 1 et 4. Les configurations anomriques sont toutes a pour lamylose et toutes p pour la cellulose. Mais on rencontre aussi des portions de chanes priodiques, plus ou moins longues, o lunit rptitrice est un disaccharide, comme dans ccrtains glycolipides ou lhparine

142

Les oligosaccharides :Configuration et analyse

HO

OH o

HO ~

4 OH

~ Hio~ & HO

n OH

OH
9.1

9.2

et les polysaccharides apparents, ou mme un tri-, un ttrasaccharide comme dans les antignes bactriens. Depuis une vingtaine dannes, on a t amen attacher une importance particulire une classe de molcules intermdiaires appeles de faon imprcise les oligosaccharides : ce nom recouvre tous les degrs de condensation, depuis deux jusqu un maximum mal dfini, une vingtaine peut-tre dunits mono-saccharidiques. Ce classement nest pas dict par la chimie, mais par lactivit frquemment observe de certains reprsentants dans les phnomnes de reconnaissance. I1 ny a aucune rgularit vidente dans ces difices, auxquels la suite de cet ouvrage sera dsormais presque uniquement consacre. Dans la nomenclature prconise, un oligosaccharide est un compos dont lhydrolyse complte donne un nombre restreint de monosaccharides. Un disaccharide non rducteur est dcrit comme un glycosylglycoside. Exemples : Sucre ; ordinaire ou saccharose, 3.21 : p-D-Fructofuranosyl-a-D-glucopyranoside Ttrahalose a, a, 9.1 : a-D-Glucopyranosyl-a-D-glucopyranoside. Un disaccharide rducteur est dcrit comme un glycosylglycose, lunit non rductrice considre comme un substituant de lautre : N-Actyllactosamine (voir la formule 9.9, R = H, R = OH, n = 1) : 2-Actamido-2-doxy-4-O-~-Dgalactopyranosyl-glucose. On dessine en gnral les chanes non ramifies de lextrmit non rductrice, gauche, lextrmit rductrice, droite. Une nomenclature, plus parlante que la prcdente, crit les units monosaccharidiques dans le mme sens, la liaison glycosidique tant dcrite par le symbole (n + m), avec n = 1 ou 2. La N-actyllactosamine scrit alors : O-P-D-Galactopyranosyl-( 1 + 4)-2-actamido-2doxy-D-glucose. Le ttrasaccharide glycoside tudi au paragraphe 11S.3 scrit : 4-nitrophnyl 1+4)-O-a-D-glucopyraO-a-D-glucopyranosyl-( 1+4)-O-a-D-glucopyranosyl-( nosyl-( 1+4)-a-D-glucopyranoside. On note les ramifications dunits monosaccharidiques sur la chane principale par un systme de crochets. Ces deux nomenclatures sont les seules qui permettent dindiquer avec clart la position des substituants sur les monosaccharides constitutifs et ce sont celles quon rencontre dans les articles de chimie synthtique en particulier. Elles sont

Effet exoanomrique

143

Biochimie

Nomenclature prcise

a (P)-D-Glc p
a @)-D-GaI p

a (P)-L-Fuc p a @)-D-CICNAC~ a (p)-D-GalNAcp a (p)-D-Neu 5Acp


Tableau 9.1 Traduction en nomenclature prcise des noms de rsidus monosaccharidiques

employs en biochimie.

encombrantes et on peut simplifier pour les oligosaccharide libres. Chaque monosaccharide est reprsent par un symbole : glucose : Glc ; galactose : Gal ; mannose : Man ; fucose : Fuc ; N-actyl-glucosamine : GlcNAc ; N-actyl galactosamine : GalNAc ; acide sialique (le plus commun) : NeuAc. La dimension du cycle est prcise par ladjonction de p ouf. La N-actyllactosamine et le ttrasaccharide libre scrivent alors : P-D-Galp-( 1+4)-D-GlcNAc et a-D-Glcp-( 1+4)-a-D-Glcp (1-+ 4)-a-D-Glcp(1+4)-D-Gl~ Parmi les biochimistes, ceux qui rencontrent dans leurs tudes un nombre limit de sucres, tous sous la forme pyranosique, emploient dans leurs articles une nomenclature encore plus simple. Ils suppriment D, L, p e t f e t rejettent le descripteur danomrie aprs le symbole du sucre, ce qui donne, pour la N-actyllactosamine : Gal

P (1+4)-GlcNAc

Si devant une formule de ce style, le lecteur ressent un besoin de prcision, il pourra se reporter au tableau 9.1 pour la traduire en nomenclature sans ambigut.

9.2 EFFET EXOANOMRIQUE


Les oligosaccharides sont btis partir de rsidus monosaccharidiques relis par des ponts oxygne. Est-ce que cette articulation est bloque ou semi-bloque; y a-t-il libre rotation autour des deux liaisons simples carbone-oxygne ? A vrai dire, ce problme se pose dj avec les glucosides simples (voir le chapitre 3), mais nous lexaminerons ici parce que cest dans le cadre de la chimie des oligosaccharides quil a soulev le plus dintrt. On comprendra quil est trs important de savoir si ces molcules forment un ensemble souple ou semi-rigide pour comprendre le mcanisme de la reconnaissance cellulaire. Dans le cas gnral, la conformation autour dune liaison simple est gauche (ou synclinale, sc) ou antipriplanaire (up).Dans la rgion anomrique on prend cumme rfrence la liaison

144

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

9
H OR
9.3a

9.3e

C(1) - O(5) et les conformations sont prcises par la connaissance des angles didres O = O(1) - C(1) - O(5) - C(5) et <p = R - 0 ( 1 ) - C(1) - 0(5), avec les conventions de notation des cristallographes. Dans le pyranoside en conformation idale, l'anomre quatorial, 9.3e correspondant O = 180" (up) et l'anomre axial, 9.3a O = + 60" (+ sc). On voit sur la figure 9.1 les trois conformations de chaque anomre considrer a priori[ll. Anomre quatorial

Anornre axial

e
@

+ 60" (+SC)
+ 60" (+SC)

+ 60" (+SC)
-

60'

(-SC)

Figure 9.1 Conformations considrer pour deux glycosides anomriques.

Effet exoanomrique

145

H
Figure 9.2 Les atomes C et H dont on mesure le couplage vicinal, droite, projection de Newman suivant C( 1) - O( 1).

3 .

1
9100

IL00

2:oo

Figure 9.3 Dpendance du couplage 3J,,

de langle didre @ dfini sur la figure 9.2 (publi avec laimable autorisation dElsevier Science).

On mesure videmment sans difficult 8 et <p par les rayons X sur les chantillons cristalliss, mais cest exceptionnel den obtenir avec les oligosaccharides. Nimporte comment, cela ne donne pas de certitude sur la conformation en solution, cest--dire dans les conditions o ils manifestent rellement leur activit. Les mesures en solution utilisent la RMN de 13C,qui permet de dterminer le couplage 3J entre le proton anomrique et latome de carbone de jonction de la molcule glycoside (Fig. 9.2). On a tabli exprimentalement la relation entre 3JCHet <D partir de drivs de sucres prsums trs rigides, tel que 9.4. I1 est alors vraisemblable que les angles didres considrs sont peu modifis par le passage en solution. Les mesures sont bien reprsentes par la formule (9.l), qui donne graphiquement une courbe du type Lemieux-Karplus[2](Fig. 9.3) :

JcH/Hz = 5,7 cos2@ - 0,6 COS @ + 0.5 (9.1) On peut aussi valuer la proximit de ces atomes carbone et hydrogne par mesure du temps de relaxation spin-rseau de ce proton[3]. On trouve que les glycosides axiaux existent uniformment sous la conformation (+ sc, + s~).Par exemple dans le trhalose, a, 9.1, les quatre angles didres

146

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

OAc
9.4

anomriques correspondent + sc et le disaccharide possde un axe C,, aussi bien en solution qu ltat solide. Par contre, les glycosides quatoriaux connus se rpartissent en deux groupes, lun majoritaire up, -sc (trois contre un) et lautre minoritaire, up, up. On peut se demander si ces prfrences conformationnelles sont dues autre chose que des interactions non lies. Les conformations interdites up, sc et + sc, -sc amnent la molcule substituante sur O( 1) dans une position dtroite proximit avec les surfaces infrieure ou suprieure du pyranose. La prfrence pour up, -sc et + sc, +sc tiendrait simplement au fait que loxygne cyclique est moins encombrant que le carbone ttrahdrique C(2). Lorsquon prend, sur un trs grand nombre dexemples, la moyenne des valeurs de cp - qui sont dailleurs fort disperses - on observe les conformations donnes la figure 9.4. Ceci peut traduire une tendance de lorbitale 2 p de loxygne saligner sur la liaison C( 1) - O(5)de faon interagir avec lantiliante correspondante. Mais plus simplement, on peut juger que le groupe R se rapproche naturellement de lhydrogne, le groupe de loin le moins volumineux. Comme dhabitude, on peut reprocher aux mesures de RMN de ne traduire quune moyenne entre plusieurs conformations. Ce qui compte videmment, cest dvaluer les barrires. I1 y a eu beaucoup de calculs sur des modles simples. Peut-tre la leon en tirer est-elle quon ne peut pas considrer quangles et longueurs de liaison varient indpendamment les uns des autres, donc chaque modle doit tre optimis.

Z,

Anomre quatorial

( p = -79,4

Anomre axial @ = 84,5

Figure 9.4 Moyenne des conformations exoanomriques observes.

Dtermination des squences par les mthodes chimiques

147

9.3 DTERMINATION DES SQUENCES PAR LES METHODES CHIMIQUES 9.3.1 Hydrolyse acide
La premire question concerne la nature et les proportions relatives des monosaccharides constitutifs. On y arrive en principe par hydrolyse acide14] mais, dans la pratique, il faut lappliquer avec discernement car il y a un certain nombre de cas despce importants. On emploie les acides chlorhydrique, sulfurique et trifluoractique, dont les solutions N ont respectivement les pH 0,l - 0,3 - 0,7. Lorsque lhydrolyse libre des monosaccharides fragiles en milieu acide, il y a un quilibre dlicat maintenir entre les risques dhydrolyse incomplte et de destruction partielle du produit dhydrolyse. Les sucres fragiles sont les pentoses, les dsoxysucres, les acides uroniques et aldoniques. Lorsque lacide sialique est maintenu 30 mn 90 dans HCl0,Ol M, il y a 20 % de dcomposition. Avec les polysaccharides neutres, on peut limiter la dcomposition moins de 9 %. Les groupements actyls des actamides sont hydrolyss et on obtient les amino sucres protons, qui sont relativement stables. Chydrolyse par lacide chlorhydrique mthanolique, qui conduit aux mthyl glycosides serait moins destructrice, mais, dans le pire des cas, un monosaccharide peut se retrouver dans le << mthanolysat >> sous quatre formes chimiques diffrentes, les quatre mthyl glycosides. Lactolyse, cest--dire la dgradation par un mlange danhydride actique et dacide sulfurique transforme la cellulose en octoactate du disaccharide P-D-Glcp-( 1+4)-Glc, mais cest une raction prparative plutt quune mthode danalyse. Lactolyse est parfois prconise comme tape additionnelle dans les oprations analytiques.

9.3.2 Hydrolyse enzymatique


Nous avons dj parl, au paragraphe 3.5.2 des enzymes glycosidases. Les exoglycosidases dtachent un lment monosaccharidique situ une extrmit non

rductrice (il y en a souvent plusieurs car les chanes sont ramifies). Elles sont nommes en fonction de lunit quelles dtachent, neuraminidase (dun autre nom de lacide sialique, acide N-actylneuraminique), fucosidase, galactosidase, mannosidases et aminohexosidases, et sont normalement spcifiques pour les configurations a ou p. En principe, elles permettent donc une dgradation rsidu par rsidu partir de lextrmit non rductrice et peuvent tre employes en conjonction avec les mthodes par mthylation dcrites ci-dessous. Nous navons pas dcrit au chapitre 3 les endoglycosidases. Elles catalysent lhydrolyse dune liaison glycosidique au milieu dune chane et sont spcifiques de la configuration des deux sucres quelles ~parent~]. La endo-2-actamido-2doxy-fi-D-glucosidase coupe en son milieu la squence dite << chitobiose >> )-P-D-GlcNAcp-( 1+4)-P-D-GlcNAcp-( prsente lextrmit rductrice de certaines glycoprotines. Un autre enzyme, une endo-P-D-galactosidase coupe spcifiquement la liaison entre galactose et N-actylglucosamine dans la squence fort commune -+3)-P-D-Galp-( 1-+4)-P-D-Glc NAc p (I+.

148

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

9.3.3 Analyse par mthylation


Lide est dthrifier tous les hydroxyles libres. Comme les fonctions thers rsistent aux conditions de lhydrolyse acide, on ne retrouve dans les morceaux, comme fonction hydroxyle libre, que celles qui taient primitivement engages dans la liaison glycosidique et celle de lextrmit rductrice de loligosaccharide. Sur un exemple simple, le lactose 9.5, permthyl en 9.6, on voit que Ihydrolyse acide de 9.6 donnera un galactose ttramthyl 9.7 et un glucose trimthyl 9.8, ce qui fixe lagencement des deux rsidus dans le disaccharide. Cette ide banale se heurte quelques difficults dans la mise en uvre : il faut un solvant proprits contradictoires, puisque le systme est trs hydrophile au dpart et trs hydrophobe larrive. Dans un oligosaccharide assez important, il faut crer une grande quantit de fonctions alcoolate charge ngative et proches les unes des autres. Le solvant actuellement prfr est le dimthylsulfoxyde, CH,SOCH,, et, comme base, on utilise lanion correspondant, obtenu en ajoutant au dimthylsulfoxyde de lhydrure de sodium ou du ter-butylate de potassium. Pour pouvoir tablir un diagnostic sr, il est essentiel que la conversion des hydroxyles en alcoolates soit complte. On vrifie quon a bien un excs de CH,SOCH, en utilisant la couleur rouge que donne cet anion avec le triphnylmthane. Cette mthode mthyle aussi les azotes amidiques des hexosamines Nactyles. Les mthodes que nous avons esquisses dans ces trois derniers paragraphes donnent finalement un mlange de monosaccharides ou de drivs de monosaccharides analyser. On pratique cette analyse par les mthodes chromatographiques dcrites aux chapitre 1 et 3, avec ventuellement une transformation approprie pour rendre les molcules volatiles. Le couplage chromatographie de vapeur-spectromtrie de masse est particulirement utile. On a miniaturis les oprations chimiques pour pouvoir traiter de trs petites quantits dchantillon.
R

RO

hoCH,OR
RO

RO
9.5

OR

R=H

9 . 6 R=Me

M e & o H
Me

*
Me0
9.7

Me0
9.8

OH

Dtermination des squences par les mthodes spectroscopiques

149

Ceci tait ncessaire, car on a rarement les oligosaccharides vraiment importants en quantit notable. Ils proviennent souvent de sources humaines. Les mthodes spectroscopiques, que nous abordons maintenant, permettent de reculer un peu plus loin les limites dinvestigation.

9.4 DTERMINATION DES SQUENCES PAR LES MTHODES SPECTROSCOPIQUES

9.4.1 Spectromtrie de masse f.a.b


Dans cette spectroscopie[6], dont le nom est labrg de <(fastatom bombardment , un jet datomes ou dions acclrs est projet sur une cible constitue par une solution de lchantillon dans un liquide visqueux. En frappant la surface de la cible, les atomes transmettent leur nergie cintique aux molcules de lchantillon. Beaucoup sont projetes hors de la cible dans le vide de la source dions et ionises en proportion notable. De cette faon, les ions en phase gazeuse sont produits sans volatilisation pralable de lchantillon. TI se forme des ions positifs [M + HI+, [M + cation] et ngatifs [M - HI-, surtout, et aussi, [M + anion]-, selon la nature de lchantillon et de la matrice visqueuse. On emploie de prfrence le glycrol avec les molcules polaires, tels que les oligosaccharides et les glycopeptides natifs, mais pour les composs hydrophobes comme les glycosphingolipides, qui ont tendance sagglomrer dans les solvants polaires, on prfre le 1-thioglycrol CH,SH - CHOH - CH,OH. I1 est utile dacidifier le mlange avec des traces dHCI dilu. Laddition dactate de sodium entrane la formation dions [M + Na]+. Laddition de thiocyanate dammonium certains oligosaccharides permthyls entrane la formation dions [M + NHJ et [M + SCNI-. Seules les molcules prsentes la surface de la matrice sont ionises par le jet atomique et il faut viter la prsence dimpurets plus tensio-actives qui les en chasseraient. On observe des pics intenses dions pseudo-monomolculaires et des pics de fragments. On emploie les sucres non drivs pour dterminer M, mais il est souvent utile de prparer dabord un driv par permthylation (voir le paragraphe 9.3.3) ou peractylation (traitement par un mlange dacide actique et danhydride trifluoractique, 2 :1, v/v, 9 mn temprature ambiante). Les quantits dchantillon ncessaires linvestigation sont 1-9 pg de sucre libre, ou O, 1-5pg de driv. Trois types de sucre donnent des pics au-dessus de M 4000 : les polysaccharides permthyls, les glycosphingolipides permthyls et les formes naturelles acyles des polysaccharides mycobactriens. Nous donnerons deux modes de clivage, dsigns comme dans la rfrenceL6] (Fig. 9.5). Dans le mode A, le principal, la charge est retenue sur le fragment du ct de lextrmit non rductrice. Dans le mode B, la charge est retenue du ct de lextrmit rductrice. Avec les oligosaccharides drivs, MNPQR, o M est le rsidu monosaccharidique du ct non rducteur, on observe principalement la voie A selon lquation (9.2).

150

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

Figure 9.5 Deux modes de clivage des chanes doiigosaccharides en spectroscopie f.a.b.

MNPQR

M+, MN+, MNP+, MNPQ+, ..

1
NP+

1
NPQ+

Les flches verticales aboutissent des fragments dus deux ruptures. La masse des fragments renseigne sur leur composition, car laddition la structure fondamentale mthyle Hex-HexNAc de rsidus fucose, N-actylneuraminique ou N-glycollylneuraminique mthyls se traduit par des incrments de masse caractristiques diffrents. On ne distingue pas les isomres et on donne une composition en hexoses, pentoses, dsoxyhexoses, hexosamine, etc. Le clivage a lieu de faon dominante et, parfois mme exclusive, sur les gros oligosaccharides permthyls, chaque rsidu hexosamine, selon lquation (9.3). (9.3) MN - HexNAc - QR + MN - HexNAc]+ La spectroscopie f.a.b. nest pas restreinte aux glycolipides (voir le paragraphe 13.1) mais leur est trs bien adapte. On a observ avec un glycosphingolipide naturel 25 rsidus mono-saccharidiques permthyls un signal [M + Na]+ 6184. La figure 9.6 donne les fragmentations principales dun ganglioside permthyl isol de granuI~cytes[~]. En plus des fragmentations du type dj dcrit, on observera le clivage, qui est de rgle, entre loligosaccharide et la chane lipidique cramide. Lion [M + H]+ perd le groupe acyle en donnant un ion de masse caractristique du type de ganglioside - dans le cas de la figure 9.6, [M + H]+ - 238. Hex HexNAc
R R

Hex HexNAc Hex HexNAc


9.10

HO

n
9.9

Dtermination des squences par les mthodes spectroscopiques

151

[M+H]

+= 2241

O=C-(CH2),&H3

Figure 9.6 Reprsentation schmatique de la fragmentation dun ganglioside permthyl de granulocytes. Extrait de M. N. Fukuda, A. Dell, J. E. Oates, P. Wu, J. C. Klock et M. Fukuda; J. B i d Chern., 260 (1985) 967-982 (publi avec laimable autorisation dAcademic Press).

La tendance au clivage au niveau des rsidus HexNAc est particulirement intressante dans lexamen des glycolipides. I1 y a dans ces composs une chane principale forme de rsidus P-D-Gal-( 1 + 4)-P-D-GlcNAc, correspondant au disacharide N-actyllactosamine. Ces rsidus disaccharidiques sont relis par des liaisons (1+ 3) de faon schmatise en 9.9. Lhexasaccharide (n = 3), qui est non ramifi, donne des fragments 3,2 et 1 units HexHexNAc. En revanche, lhexasaccharide ramifi 9.10 permthyl ne donne pas de fragment ttrasaccharidique (il faut se rappeler que la charge reste du ct non rducteur). La spectroscopie f.a.b. ne permet en gnral pas de dterminer la position des liaisons. Cependant on peut parfois reconnatre la prsence dun fucose en 3 du rsidu P-D-GlcNAc. Lorsque lion de rupture principale a une masse infrieure 900, on peut observer une fragmentation ultrieure, selon lquation (9.4). Si OH(3) ntait pas substitu dans loligosaccharide, la perte de masse correspondrait CH,OH, 32. Sil y avait un fucose, la perte de masse serait 206.

(9.4)

RO

ORNMeAc

RO
_____

NMeAc

9.4.2 Technique dinjection dite << lectrovaporisationD


Certains modles rcents de spectromtres de masse permettent demployer une technique dinjection considrablement plus simple. Une solution de lchantillon est injecte directement dans lappareil au moyen dune seringue. On observe des pics molculaires parfaitement dtachs. Nous donnerons ici lexemple du spectre du pentasaccharide sulfat, sel de sodium, 9.11. Nous aurons loccasion de

152

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

OH NHCWH, HO OH

I CH,OH
9.11

revenir au chapitre 17 sur ce compos synthtiqueL8I, qui est le meilleur ligand connu ce jour de la lectine E-slectine humaine. On observe avec la technique dlectrovaporisation des pics 932,2 (M - Na+), 978,3 (M + Na+) et 500,7 (M + 2 Na+).

9.4.3 Rsonance magntique nuclaire du proton


Le chimiste qui dsire connatre la structure dun oligosaccharide naturel conjugu doit en gnral travailler sur un mlange despces trs voisines. I1 y a en effet le problme de lhtrognit naturelle de ces structures, mme sur un support protique homogne, et de lhtrognit artificielle provoque par les ractifs de clivage - car il nest pas concevable dtudier le glycoconjugu dans son ensemble. I1 est donc ncessaire de procder dabord un fractionnement, particulirement difficile entre structures trs voisines. Lanalyse du spectre de RMN du proton, telle quelle sera dcrite dans ce paragraphe[9], donne une indication sur lhomognit de lchantillon, puisquun mlange donne une superposition des signaux, dont on peut connatre lappartenance par la considration des intensits. En raison de la grande complexit du problme de structure, il est ncessaire de connatre les valeurs de 6 avec trois dcimales. Ceci impose un champ magntique trs lev Uusqu 14 Tesla) pour une frquence de travail de 500 ou 600 MHz. Le traitement informatique des donnes permet daugmenter la rsolution et de descendre jusqu des concentrations O,05 mM de lchantillon. Mme cette frquence les signaux des protons squelettaux non anomriques des divers sucres se superposent en une large bande non rsolue entre 3,4 et 4,0 p.p.m. Lanalyse repose sur un groupe de signaux, les indicateurs, situs en dehors de cette rgion. Ils correspondent aux protons numrs ci-dessous. a) Les protons anomriques On rappelle que leur couplage 3J est significatif (voir le chapitre 2). Si H-2 est axial (Gal, GlcNAc, Fuc), on observe 3J 2-4 Hz et 7-9 Hz pour les apyranoses et P-pyranoses respectivement. Si H-2 est quatorial (Man), la diffrence est plus faible, 3J 1,6 et 0,s Hz pour les anomres a et P respectivement. Cependant cest la valeur de F qui est la plus intressante.

Dtermination des squences par les mthodes spectroscopiques

153

b) Les protons H-2 et H-3 du mannose c) Les protons H-3 des acides sialiques d) Le proton H-5 et le mthyle du fucose e) Les protons H-3 et H-4 du galactose f) Le mthyle des groupements N-actyle des sucres amins et de lacide sialique Dans les cas les plus favorables, la valeur de 6 dpend du type de rsidu, de sa configuration anomrique, du site de glycosidation, de la squence des sucres composants et de la position du rsidu dans la squence. On a rcemment[l0I ajout cette liste les protons NH des groupements -NHCOCH,. Naturellement, ils ne sont pas visibles dans le solvant D,O ni dans leau ordinaire aux pH > 7. On les observe facilement dans H,O, 27C, pH 5,2. Lorsquun signal NH a t identifi, on peut reprer les signaux de certains protons voisins du mme rsidu monosaccharidique par effet Overhauser : le mthyle de CH,CONH et le proton anomrique sur un rsidu 2-actamido-2-doxy pyranose, les protons H-3 sur un sialoside. Pour utiliser ces donnes spectroscopiques, on se sert dun certain nombre de rgles empiriques, tablies sur des oligosaccharides simples de structure parfaitement bien connue par ailleurs. Ainsi la glycosidation dun rsidu dans un oligosaccharide entrane de petits dplacements des signaux indicateurs de ce rsidu, parfois galement perceptibles dans les rsidus voisins, de lordre de 0,02 - 0,25 p.p.m. Lemploi de ces rgles des dterminations de structures inconnues suppose quil y a additivit et quil ny a pas de changement important de conformation, qui perturberait fortement le diamagntisme local. Elles sont donc les plus sres dans les sries formes de blocs analogues. Pour que le lecteur puisse apprcier ceci, nous allons donner un extrait dune analyse de ce type des chanes oligosaccharides de la thyro-globuline Cest la glycoprotine la plus importante de la glande thyrode. La chane glucidique, lie lacide aspartique, est spare par hydrolyse catalyse par lenzyme peptide-N4 - (N-acetyl-0glucosaminyl) asparagine amidase F, dorigine bactrienne (Flavobacterium meningosepticum), et le mlange doligosaccharides est fractionn sur colonne. Parmi les produits isols, nous retiendrons la collection schmatise sur la figure 9.7. Le terme le plus simple est le nonasaccharide 9.12, o manquent les rsidus encadrs et le sulfate. On repre les signaux indicateurs de ce nonasaccharide, et lon observe que le signal de H(2) du rsidu Man-4est noy dans la masse. I1 y a aussi dans la collection un dcasaccharide avec un rsidu GlcNAc supplmentaire. Dans ce compos, le signal de H-2 de Man-4sort de la masse et apparat 6 4,109, ce qui indique que le nouveau rsidu GlcNAc est en 2 du mannose Man4. Les signaux indicateurs confirment sa position terminale, celle du cadre 5. Laddition du rsidu D-Gal donne un undcasaccharide. On en connaissait dj un proche analogue[9].La position de ce rsidu est confirme comme celle du cadre 6par un dplacement de +28 mpm du signal de H-1 de GlcNAc - 5. Le terme suivant de la collection est un dodcasaccharide. I1 contient en plus un rsidu Gal,

154

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

Fuca (1-6)

2 3 Manp (1-4)-GlcNAcB (1-4)-GlcNAc 1

NeuSAca (2-6)-Galp (1-4)-GlcNAcB (1-2)-Mana(l-3) t

Figure 9.7 Reprsentation schmatique des oligosaccharides obtenus partir de la thyroglobuline du porc. La partie sans units encadres correspond 9.12. Les autres oligosaccharides spars sont 9.12 + S , 9.12 + 5 et 6, 9.12 + 5 + 6 + 7, et le dodcasaccharide sulfat 9.13 (9.12 + 5+ 6 + 7 + 8).

dont lanomrie a est prouve par le signal de son proton anomre et la position, celle du cadre 7, par leffet de sa prsence sur le signal dc H-4 de Gal-6, qui sori de la masse pour apparatre 6 = 4,185 ppm. Nous avons donn les signaux caractristiques de 9.13 dans le tableau 9.2, pour permettre au lecteur dapprcier

Protons
H- 1

Units l a 1P 2 (a)
2

Protons H-2 H-3a H-3e H-4 H-5


Me

Units 4
Neu SAC

(0)

H-2

3 4 4 5 5 6 6 a-Gal Fuc (a) Fuc <Pl 3 4

5,180 4,692 4,664 4,669 4,772 5,135 4,929 4,605 4,583 4,445 4,544 5,146 4,890 4,897 4,257 4,195

NAc

Neu SAC 6 Fuc (aj Fuc (P) Fuc (a) FUC (P) 1 2 5
5 Neu SAC

4,111 1,722 2,666 4,185


4,098

4,134 1,209 1,220 2,038 2,097 2,069 2,048 2,029

Tableau 9.2 Signaux indicateurs du dodcasaccharide 9.13.

Dtermination des squences par les mthodes spectroscopiques

155

GlcNAcP (1-6) Gal P (1 -4)-Glc P OMe GlcNAcP (113)


9.14

Gal P ( 1-4)GlcNAcP (1-6)

Gal (1 -4)-Glc P OMe GlcNAcP (1 -3)


C

J B
t

9.15

concrtement les rsultats de ce genre de travail. On trouve aussi dans le mlange une collection doligosaccharides sulfats. La sulfation dplace vers les champs faibles les protons gmins. Ici, ce sont les signaux de H-6 et H-6 de GlcNAc-5 qui sortent de la masse (6 = 4,306 et 4,44O), ce qui indique la position du cadre 8 pour le groupement sulfate. Dans certains cas on a pu mesurer 6 pour tous les protons dun oligosaccharide. Ainsi on a pu montrer que la galactosylation enzymatique (voir le paragraphe 10.4.1) du ttrasaccharide 9.14 procde slectivement sur la branche lie en 6 du rsidu GlcNAc, car cest seulement le signal de H-1 de ce rsidu qui est perturb (+23 mp.p.m.). Par RMN deux dimensions, il a t possible de donner les signaux de tous les protons du pentasaccharide 9.15 ainsi obtenu aprs peractylation (Tableau 9.3) *I.

Proton H- 1 H-2 H-3


H-4 H-5

H-6 H-6 H-N

4,40 4,87 5,11 3,78 3,60 4,17 4,48

4,35
5,05 3,80

5,41 3,81
334

3,80

4,96 3,39 5,43 5,O8 3,67 4,14 435 5,62

4,67 3,7 1 $32 3,15 3,67 4,14 4,37 6,42

4,s I 5,14
5,Ol

5,32
3,89

4,05 4,90

Tableau 9.3 Valeurs de 6 en p.p.m. pour les signaux des protons des units A, B, C, E, F du produit de peractylation du pentasaccharide 9.15.

156

Les oligosaccharides : Configuration et analyse

9.5 EFFICACIT POTENTIELLE DES OLIGOSACCHARIDES POUR LE STOCKAGE ET LE TRANSPORT DE LINFORMATION


Deux dsoxyribonuclotides, disons dA et dC, ne peuvent donner que deux combinaisons distinctes, dAdC et dCdA. Cest la mme mme chose avec deux amino-acides, il y a deux dipeptides possibles, par exemple CysAl et AlCys. Dans les deux cas, deux molcules identiques ne peuvent donner quun seul produit de condensation. En revanche, le lecteur vrifiera que lassociation de deux molcules de glucose peut donner 11 disaccharides distincts si on se restreint aux tautomres pyranose. Le nombre saccrot dans des proportions fantastiques, si lon considre les oligosaccharides drivs de monosaccharides diffrents. Quatre nuclotides diffrents ne peuvent donner que 24 ttranuclotides distincts, alors que 4 monosaccharides diffrents peuvent donner 35 560 ttrasaccharides dist i n c t ~ [ ~La . nature dispose dun alphabet o 4 lettres permettent dcrire 35 560 mots diffrents ! Dans la mesure o ces molcules peuvent tre reconnues par des protines spcialises, on voit quun trs petit nombre dlments de base peut suffire pour stocker et transmettre les informations les plus varies, sous la forme la plus compacte qui soit concevable dans les cellules vivantes. Ceci sera longuement dvelopp dans la suite de cet ouvrage.

RFRENCES
[I] I. TvarovSka et T. Bleha, Adv. in Curbohydr: Chem. Biochem., 47 (1989) 45-123. [2] I. TvarovSka, M. Hricovini et E. Petrakovh, Curbohydl: Res., 189 (1989) 359-362. [3] P. Dais et A. S. Perlin, Adv. in Curbohydr: Chem. Biochem., 45 (1987) 125-168. [4] C. J. Biermann, Adv. in Curbohydr: Chem. Biochem., 46 (1988) 25 1-271 . [5] H. Rauvala, J. Finne, T. Krusius, J. Karkkainen et J. Jarnefelt, Adv. Curbohydr: Chem. Biochem., 37 (1980) 389-416. [6] A. Dell, Adv. Curbohydr: Chem. Biochem., 45 (1987) 19-72. [7] M. N. Fukuda, A. Dell, J. E. Oates, P. Wu, J.C. Klock et M. Fukuda, J. B i d . Chem., 260 (1985) 967-982. [8] A. Lubineau, J. Le Gallic et R. Lemoine, paratre. [9] J. E G. Vliegenthart, L. Dorland et H. van Albeek, Adv. Curbohydr: Chem. Biochern., 41 (1983) 209-374. [lo] K. Hard, B. A. Spronk, C. H. Hooke, J. P. Kamerling et J. E G. Vliegenthart, FE.B.S., 287 (1991) 98-112. [ i l ] P. de Waard, A. Koorevaar, J. P. Karmerling et J. E G. Vliegenthart, J. Bid. Chern., 266 (1991) 4237-4243. [12] C. Aug, C. Mathieu et C. Mrienne, Curbohydr. Res., 151 (1980) 147-156. [ 131 N. Sharon et H. Lis, Scientific American, (1993) 74-81.

CHAPITRE 10

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

10.1 RACTIONS DES OLIGOSACCHARIDES


Dans un oligosaccharide rducteur, il y a deux fonctions hydroxyles diffrentes, alcool et hmiactal. Les fonctions alcools se rpartissent en deux catgories, primaires et secondaires, moyennement bien diffrencie. I1 y a des diffrences plus subtiles entre les fonctions alcool secondaire, selon quelles sont axiales ou quatoriales, associes en diol vicinal, etc. I1 ny a rien de fondamentalement nouveau par rapport aux monosaccharides et la chimie connue des oligosaccharides repose sur des ractions slectives correspondantes. Comme exemple, on peut donner la prparation dun disaccharide trs important, la N-actyllactosamine, 10.1 partir du lactose, produit de faible valeur. Coxime de la fonction aldhyde potentielle, soit R - CHOH - CH = N - OH, est actyle et dshydrate simultanment en nitrile peractyl R - CHOAc - CN. La mthanolyse alcaline dsactyle et provoque llimination de HCN, donnant R - CHO, le disaccharide O-B-D-galactopyranosyl - (1 +3) - D-arabinose. Celui-ci est commodment isol sous la forme drive N-benzyl glycosylamine 10.2. Laddition de HCN donne le nitrile 10.3, qui est converti en N-actyllactosamine par hydrognation catalytique sur palladium et N-actylation par lanhydride actique dans le mthanol[]. Une adaptation plus rcentel2I vite lemploi de HCN, en procdant par addition progressive dacide actique du cyanure dissous dans le milieu ractionnel. On recueille par filtration le nitrile 10.3, obtenu cristallin par chance, ce qui ouvre la voie la fabrication grande chelle. On peut oxyder slectivement la fonction aldhyde du lactose en carboxyle, ce qui donne lacide lactobionique. On peut aussi la rduire en alcool. Nous verrons plus loin quon est amen utiliser des conditions alcalines pour dtacher certains

10.1

158

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

10.2

10.3

RO
10.4

HO
10.5 1O . 6 10.7 10.8

R=R=H R, R=CMe, R, R= SnBuz R= Allyl, R = H

oligosaccharides de leur support protique. Ces conditions dgradent loligosaccharide, particulirement sil y a une substitution en 3, car il se produit llimination bien connue des P-alkoxyaldhydes sur la fraction de tautomre carbonyl prsente, schmatise par la formule 10.4. La technique consiste alors pratiquer le clivage avec un mlange dhydroxyde et de borohydrure de sodium. Lhmiactal est rduit en alcool ; il ny a plus dlimination. On protge les alcools primaires avec les ractifs traditionnels : triphnylchloromthane, chlorure de ter-butyldimthylsilyle, chlorure de pivaloyle. Un systme cis-diol, axial-quatorial est bloqu, slectivement sil est unique, par actalation avec lactone. On bloque ainsi slectivement les hydroxyles en 3 et 4 de lunit galactose du mthyl lactoside 10.5 en prparant le driv isopropylidne 10.6. On notera ce propos une raction o chaque unit de lactose se comporte comme si elle tait isole : le traitement du glucose par lactone et le 2,2-dimthoxypropane, en catalyse acide, donne, entre autres, 10.9[31. Dans les mmes conditions, le

Couplage osidique non enzymatique : principes gnraux

159

10.9

10.10

lactose donne le produit 10.10 o 6 hydroxyles sur 8 sont bloqus[41. Avec (Bu2SnO),, le lactoside 10.5 donne un stannylne, vraisemblablement 10.7, dont le traitement par le bromure dallyle conduit lther monoallylique 10.8. Cest le seul produit de substitution isol, avec un rendement de 70 %, alors quil ny avait pas moins de sept hydroxyles libres dans le lactoside de dpartI5]. Les groupements diols vicinaux des oligosaccharides sont coups par le periodate, ce qui permet de dtruire slectivement les units monosaccharidiques qui en possdent. On note ensuite leur disparition de lhydrolysat total. On verra ci-dessous (voir le paragraphe 10.3.4) lutilisation de linversion de configuration sur C(2) dune unit monosaccharidique pour accder la configuration B-D-manno. Une des transformations les plus importantes des oligosaccharides est lactivation de lextrmit rductrice pour raliser des synthses convergentes doligosaccharides suprieurs, dont nous donnerons aussi des exemples dans les paragraphes suivants. Comme nous lavons dit, ces ractions sont des extensions prvisibles des ractions des monosaccharides. I1 pourrait y avoir un domaine spcifique de la chimie des oligosaccharides : comment la ractivit de chaque hydroxyle est-elle modifie par le reste dun enchanement complexe, par sa configuration et sa conformation ? Y a-t-il des fonctions qui ont perdu toute ractivit ou bien, au contraire, des sites prfrentiels inattendus, comme les sites actifs des protines. Ce domaine na pas t explor avec les oligosaccharides vraiment compliqus

10.2 COUPLAGE OSIDIQUE NON ENZYMATIQUE : PRINCIPES GENERAUX


Le couplage osidique est lopration fondamentale dans la synthse des oligosaccharides. I1 sagit de btir un pont oxygne avec le carbone hmiactalique dun sucre et la fonction alcool dun autre sucrer6]c71 [*I. Considrant la trs grande stabilit de la liaison C - O dans les alcools, compare la labilit de la liaison C - O dans un hmiactal, dans limmense majorit des cas, la raction est globalement une substitution nuclophile de loxygne alcoolique sur le carbone hmiactalique.

160

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

Lhydroxyle ntant.pas un bon groupement partant, il faut le remplacer par dautres groupements pour activer le partenaire lectrophile. I1 faut aussi protger les fonctions alcools pour viter que dans les conditions d u couplage, les molcules ne ragissent les unes sur les autres en donnant des produits de polycondensation. Ces molcules protges actives que nous appellerons << ractifs glycosylants D ne sont pas capables de ragir directement sur les hydroxyles alcooliques, il faut ajouter dans le milieu des acides de Lewis, ou des sels ayant un caractre dacides de Lewis plus ou moins marqu, en proportions variables selon les techniques, depuis catalytique jusqu fort excs molaire. Ce sont les << promoteurs . Dans ces conditions, on peut prvoir que le ractif glycosylant existera sous six formes chimiques distinctes, 10.11 10.16. Dailleurs, mme si on introduit au dpart un ractif homogne 10.11 ou 10.12, il se formera souvent le mlange anomrique dans le milieu ractionnel. Lindividu chimique 10.13 est une paire ionique provenant de lionisation partielle de lanomre a. La formation de cette paire ionique est facilite par la coordination de X- un acide prsent dans le milieu. En prsence de promoteurs de type salin, lanion du sel peut ventuellement remplacer, dans cette paire ionique, le groupement partant X- du ractif glycosylant de dpart. La paire ionique 11.13 peut sanomriser en 10.14. Lindividu chimique 10.15 est lion oxocarbnium libre. La formation dun ion carbnium sur C( I ) est favorise par la participation de loxygne cyclique. Cependant, sil y a un groupement participant acyloxy sur C(2), lintermdiaire a la structure 10.16. Les deux problmes de la glycosidation, qui dailleurs ne sont pas compltement indpendants, cest que le rendement du couplage soit acceptable et que ce couplage donne la liaison glycosidique avec lanomrie dsire. I1 faut demble mettre part les ractions avec participation, qui passent par lintermdiaire 10.16. Elles sont souvent rapides et donnent exclusivement lanomre 1,2-trans, comme il est prvisible, avec un excellent rendement. Lorsquil ny a pas participation, on peut sattendre ce que chacun des intermdiaires 10.11 10.14 ragis-

F&
10.11

10.12

10.13

m y . - yRO
RO

0 1

1 5 0

R
10.14 10.15

/c

10.16

Pratique du couplage osidique

161

sent par le mcanisme SN2 avec inversion de configuration. On aura donc la liaison quatoriale avec 10.11 et 10.13, la liaison axiale avec les deux autres. Malheureusement ces intermdiaires sont en gnral tous prsents simultanment, quel que soit le ractif glycosylant ajout au dpart. On attend peu de slectivit dune raction de lion oxocarbnium 10.15. Donc le partenaire nuclophile dans le milieu a le choix entre un certain nombre de trajets ractionnels dont les nergies dactivation peuvent ntre pas tellement diffrentes. Aussi comprendra-t-on que le couplage osidique, malgr les progrs considrables de la dernire dcennie reste une opration dont lissue ne peut tre prdite avec une certitude totale.

10.3 PRATIQUE DU COUPLAGE OSIDIQUE 10.3.1 Ractions avec participation


Ce sont les moins incertaines. Elles conduisent selon la raction (10.1) Ianomre trans 1,2. Les configurations gluco et galacto donnent les glycosides diquatoriaux -1,2 et la configuration manno donne les glycosides di-axiaux- 1,2. Les plus simples des ractifs glycosylants sont les anomres quatoriaux des peractates de pyranoses tel le driv P-D-gluco 10.17. Celui-ci, en prsence de trifluoromthanesulfonate (triflate) de trimthylsilyle, CF,SO,SiMe, comme promoteur, conduit aux P-D-glucopyranosides. Lintrt de la raction est limit par la ncessit de prparer cet anomre instable et le prix lev du promoteur. Le traitement des pyranoses peractyls par HCI ou HBr donne Ianomre stable, avec lhalogne axial, de lhalognose, 10.18 ou 10.19. Le << promoteur universel >> pour les couplages de ces halognoses semble tre le triflate dargentL9]. Son domaine defficacit est trs tendu et parfois le couplage est termin en quelques minutes, mme -70C. On opre dans le dichloromthane, avec la ttramthylu-

~~a~
Ac0 C A Ac0
10.17

Ac0 X
10.18 10.19 X = B r

x=c1

162

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

10 . 2 1 R=

H, R= OAC

1 0 . 2 2 R= OAc, R = H 10.20 10.23 R= C1, R = H

re comme accepteur de protons. Pour prparer de grosses quantits au dbut dune squence ractionnelle, on utilise aussi les promoteurs classiques (HgBr, ou HgC1, dans les mlanges tolune-actonitrile ou nitromthane) ou le triflate stanneux dans le dichloromthane[l0I. Pour faire les glycosides des sucres amins, la prfrence va au chlorure driv de la phtalimido-glucosamine 10.20. Cet anomre p est beaucoup plus ractif par traitement que lanomre a en glycosidation et on lobtient commodment~ll] du mlange dactates anomres (analogues phtalimido de 10.21 et 10.22) par le dichloromthyl mthyl ther en prsence dthrate de BF,. Le chlorure 10.20 sutilise avec le triflate dargent comme promoteur ou, dans les cas o il est moins indispensable davoir le rendement maximum, avec les sels de mercure. On hydrolyse le groupement phtalimido avec de lhydrazine et on actyle lamine libre pour obtenir la vritable structure naturelle. I1 est parfois possible dviter ces tapes supplmentaires en partant directement dun driv actif de lamine naturelle qui est, comme on sait, N-actyle. Le p-actate 10.21, driv de la N-actylglycosamine, donne un bon rendement en prsence de chlorure ferrique[I21. Le chlorure 10.23, daccs plus facile, est utilisable en prsence de triflate stanneux[l31.La raction est particulirement efficace avec les alcools primaires, par exemple pour prparer la squence p-D-GlcNAcp-( 1+ 6)-D-Gal, frquente dans les oligosaccharides naturels.

10.3.2 Ractions SN2


En prsence de sels dargent, les halognures de glycosyles attaquent les amides sur loxygne pour donner les imidates tels que 10.24. Les imidates sans groupements participants ragissent sur les alcools avec inversion de configuraLes trichl~ractimidates[~] sont faciletion, conduisant aux composs cis-1 ment accessibles par addition des alcools sur le trichloractonitrile, selon lquation (10.2) en prsence de bases fortes. Avec les pyranoses hmiactal limidate quatorial se forme le premier, sous contrle cintique, et sanomrise ensuite en imidate axial. Les deux types dimidates ragissent en prsence de trifluorure de

Pratique du couplage osidique

163

bore avec les alcools, par exemple selon lquation (10.3). I1 y a inversion de configuration avec ou sans participation.

10.24

(10.2)

CC1,-CN

R-OH

+
G?OH

y c 1 3 R-O-C=NH

-G
BF,.Et,O
-t

CCl,CONH,

hm

10.3.3 Ractions faisant intervenir des intermdiaires cationiques


La raction << assiste par un halognure >> sapplique un halognure sans groupement participant en 2. Lintermdiaire 10.16 est donc exclu. On travaille dans un solvant non polaire pour minimiser lapparition de lintermdiaire ionique 10.15. Restent les formes chimiques 10.11 10.14, qui sont en quilibre, et on acclre ltablissement de cet quilibre par addition dun sel minral qui fournit un ion commun X-. Lintermdiaire le plus ractif en glycosidation est la paire ionique quatoriale 10.14 qui conduit dans le cas de figure au glycoside cis-1,2, anomre axial. Si la vitesse dapparition de 10.14 est nettement suprieure sa vitesse de couplage, toute la glycosidation sera dvie par ce canal, quel que soit lanomre ajout au dpart. Parfois, le partenaire hydroxyl est trop peu ractif pour que la condensation procde de faon acceptable (il ny a pas de promoteur dans le milieu !). Dans ces cas-l, cest le triflate dargent qui est le promoteur le plus efficace, la slectivit tant dautant plus grande que lhydroxyle est moins ractif. On a essentiellement dvelopp ces mthodes pour introduire un rsidu a-Dgalactopyranosyle, ce qui correspond une glycosidation cis-l,2. Pour raliser cet objectif, on a publi rcemment une mthode particulirement brillante, mais nous la classerons part (voir le paragraphe 10.3.5) pour ne pas prjuger de son mcanisme.

164

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

A ct des chlorures et bromures de pyranosyle, lusage des fluorures tend se rpandre pour les glycosidations sans participation. Le substituant en 2 est protg par un benzyle. Le fluorure cis 1,2, axial-quatorial, donne le glycoside cis 1,2, axial, quatorial, en solution dans lther en prsence de perchlorate dargent et de triflate stanneux. Les fluorures, comme dailleurs les bromures, peuvent tre prpars partir des thioglycosides. Le passage par le thioglycoside est un moyen de protger temporairement la fonction hmiactalique, car la liaison C( I)-S peut persister intacte travers un certain nombre de transformations du reste de la molcule. Ceci est galement vrai des mthyl glycosides, seulement les thioglycosides sont transforms en ractifs glycosylants dune faon bien plus commode que les mthyl glycosides, avec moins de risques pour le reste de la molcule. Lquation (10.4) montre comment on peut convertir un mme phnyl thioglycoside en partenaire glycosylant ou glycosylable, en le traitant soit par Et,N-SF,, soit par Bu4NF.
s (10.4) A n F

H20SiCMe,Ph2

CH OH

SPh

A c &

B n

SPh

Dans les ractifs glycosylants non anims, la protection non participante de O(2) est assure par un benzyle. Dans les ractifs glycosylants amins, le groupement actamido est remplac par un groupement azido, qui est rduit en amine et N-actyl aprs la glycosidation. La prparation habituelle des azides en 2 part des glycals. Par exemple, la raction (10.5) donne la prparation dun halognose 10.27 utilisable pour introduire une unit 2-actamido-2-doxy-a-D-galactopyranosyl. Le galactal 10.25 est trait par un mlange de nitrate de crium et dammonium (NH& Ce (NO3& et dazoture de sodium. I1 y a addition sur la double liaison donnant 10.26 et le nitrate intermdiaire est trait successivement par Iiodure de lithium et le chlorure damm0nium[~1.

(10.5)

10.25

10.26

10.27

Pratique du couplage osidique

165

10.3.4 La cration de la liaison quatoriale-axiale-1,2


C'est la configuration des P-mannosides. On pourrait imaginer les obtenir par une substitution SN2 des halognures a-manno, axiaux et facilement accessibles avec une protection non participante sur O(2). Mais ces drivs sont peu ractifs, peut-tre cause de la rpulsion strique du groupement axial en 2. On a pu cependant les prparer directement[161avec un promoteur insoluble, le driv argent de l'changeur de cations naturel zolite, par exemple, selon l'quation (10.6). Une autre te~hniquer'~], qui offre un degr lev de scurit, consiste prparer le glycoside P-D-glum gnralement accessible en rendement lev par un couplage avec participation et inverser la configuration en C(2). Dans cette mthode, aprs la raction de glycosidation, avec le p-actate 10.28 en prsence de triflate de trimthylsilyle, gnralement ralise avec un rendement lev, le di (tri) saccharide 10.29 est soumis une mthanolyse alcaline, suivie de benzylidnation. On obtient ainsi successivement 10.30 et 10.31. I1 faut un groupement partant particulirement efficace pour arriver substituer en C(2). La conversion de 10.31 en imidazolyl sulfonate[l8] dplace par un benzoate donne 10.32 avec un rendement trs lev.

CH,OR'

O R o f R v BnO
10.28 10.29 10.30 10.31

OR'

BnO

R= R'= R"= AC R = G R = R"= AC R = G R'=R"= H R= G R'= H R", R"= PhCH

10.32

10.3.5 Glycosidation cis-1,2 sans participation avec les sulfoxydes


Cette mthode rcente, d'abord dcrite par a t exprimente par Matta[20]. Par exemple, on peut utiliser comme ractif glycosylant le sulfoxyde 10.33, aisment obtenu par oxydation du phnylthio galactoside perbenzyl au moyen d'un peracide. Le couplage a lieu -76C dans le dichloromthane, en prsence d'anhydride trifluoromthanesulfonique et d'une base encombre. I1 ne se

166

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

BnO CH,OBn

BnO

W
10.33

Y SO-Ph

BnO CH,OBn B n O ~ o ~ Bn o M e

10.34

forme que le glycoside a, en rendement pratiquement quantitatif. Ainsi le couplage sur le mthyl p-D-galactopyranoside protg par benzylation, sauf en 3, donne-t-il le disaccharide 10.34 caractristique du groupe sanguin B (voir le chapitre 16), isol avec 90 % du rendement. I1 ny a encore que peu dexemples de cette mthode, qui pourrait se substituer la mthode lion commun du paragraphe 10.3.3.
10.3.6 Effet de la configuration de laccepteur

Laccepteur est confront un mlange dentits potentiellement glycosylantes en quilibre, six - de 10.11 10.16 - dans le pire des cas. Le choix de lune delle, qui conditionne le chemin ractionnel ultrieur et lissue finale dpend de deux facteurs : sa vitesse de disparition par le couplage et sa vitesse de << reformation >> par le jeu de lquilibre. La ractivit de lhydroxyle vis--vis de lune des entits glycosylantes dpend de sa position dans la molcule daccepteur et deffets striques et lectroniques des groupements protecteurs. Leffet strique (expliqu par la rpulsion des orbitales pleines dans la thorie des orbitales molculaires) semble parfois vident : la condensation du bromure per-actyl 10.35 avec la N-actylglucosamine protge 10.36 donne le disaccharide p (trans- 1,2) avec plus de 78 % de rendement[21].Cette raction, effectue en prsence de Hg (CN),[*lI est un exemple typique de glycosylation avec participation. Le mme donneur, avec la phtalimidoglucosamine 10.37 donne un mlange a, p avec un faible rendement, ce que lon pourrait interprter comme leffet de lencombrement du groupe phtalimido. Cependant, la raction, en principe SN2, avec le trichloractimidate donne 70 % de disaccharide p pur. I1 est ncessaire dinvoquer des facteurs lectroniques (modifications de la forme et du niveau dnergie de la HOMO de la paire libre de loxygne) pour expliquer leffet parfois considrable de modifications loignes du site de cou-

Pratique du couplage osidique

167

Ac0 Br
10.35

HO

OBn

1 0 . 3 6 R= H, R = AC 1 0 . 3 7 R,R= Phtalyl

BnO
Brio Br

Me
10.38 1 0 . 3 9 R=Bn 1 0 . 4 0 R= CH,CCl,

plage, aussi bien dans le donneur que dans laccepteur. Par exemple[6],le couplage du bromure 10.38 avec le benzyl rhamnoside 10.39 donne un mlange a, p, dans le rapport d p = 19/8 1, typique dune raction sans participation modrment slective. Mais le rapport est invers (81: 19) avec le trichlorthyl rhamnoside 10.40. I1 est clair que lorbitale HOMO du rhamnoside 10.40, essentiellement la paire libre 2p de 0(4), a subit une modification dnergie et peut-tre mme une certaine dlocalisation. Plus gnralement, les protections actates sont plus dsactivantes que les protections ther benzylique, au point de rendre parfois le couplage impossible. Une tentative pour sparer les effets lectroniques et striques repose sur la notion de strodifSrenciation[221. Pour en simplifier lexpos, nous parlerons de leffet strique comme dune interaction entre solides. Supposons que deux entits chirales RXYZ et RXYZ se rapprochent pour crer un tat de transition, comme sur la figure 10.1, nous imaginons un cas idal ou ladaptation (la recon-

Figure 10.1 Interaction strique de deux solides chiraux.

168

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

naissance) mutuelle est parfaite : chaque bosse de RXYZ correspond un creux de RXYZ et vice versa, si bien que les deux entits peuvent sapprocher suffisamment pour que la liaison stablisse. Permutons )< et Y : ces branches sont diffrentes, ladaptation ne peut plus tre aussi bonne. Cette permutation donne lnantiomre ; elle ne change pas lnergie de lorbitale frontire. La baisse de ractivit est dorigine strique. Une observation de ce genre permet de sparer les contributions striques et lectroniques dans la ractivit. Ce raisonnement nest pas strictement rigoureux. I1 nest valable que si lorbitale frontire nest pas chirale. Quoi quil en soit, les rsultats pratiques sont suggestifs. La raction du bromure de D-fucopyranosyle perbenzoyl avec laccepteur 10.42 (Fig. 10.2) en prsence de triflate dargent et de 2,6-di-tert-butylpyridine donne un mlange de disaccharides (87 %). On attendrait une raction avec participation, donnant p pur ; en fait, on a alp = 2 : I . La figure 10.2 montre que ltat de transition avec

Figure 10.2 Schma illustrant lorigine de la diastroslectivit dans un couplage.

10.43

Mthodes enzymatiques

169

lintermdiaire de participation 10.41 est trs dfavoris. Mais le bromure nantiomre de L-fucopyranosyle donne un intermdiaire 10.43 o lapproche P est moins dfavorise, on observe un rendement de 78 % et un rapport a/p renvers, gal 1/8,4.

10.3.7 Thiooligosaccharides
Ce sont les analogues des oligosaccharides o loxygne interglycosidique est remplac par du soufre. Lintert sest port sur ces produits artificiels en raison de leur comportement particulier en chimie enzymatique : rsistance lhydrolyse enzymatique, inhibition ou induction de glycosidases. On les prpare par substitution nuclophile dun ester activ (triflate) de laccepteur par le soufre dun << thioglycose >> activ. La russite est due au caractre nuclophile lev du soufre (la synthse des vritables oligosaccharides de faon analogue a t envisageI7l mais ne sest pas encore gnralise). Naturellement, il y a inversion de configuration sur laccepteur, quil faut choisir en consquence. Ainsi, le sel de sodium du 2,3,4-tri--actyl-l -thio-P-D-xylopyranose 10.44 conduit au << 4-thioxylobiose D 10.45. Cette raction (10.7) est complte en quelques heures temprature ordinaire en prsence dun agent de complexation du sodium, avec 92 % de rendement aprs isolement~23~. On passe au thiodisaccharide libre par mthanolyse alcaline.
QTf

10.44

AQ c0

B
Ac0

m
10.45

OBz OBz

10.4 MTHODES

lZ5l

10.4.1 Raction de la galactosyltransfrase


Le chimiste organicien non prvenu risque dimaginer les enzymes comme des produits dont lisolement demande un immense entranement, trs fragiles ltat pur et trs coteuses sur les catalogues et servant dailleurs essentiellement dmontrer des voies mtaboliques, lchelle de la micro-, ou de la nanomole.

170

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

Les perspectives sont dsormais diffrentes. Les techniques dimmobilisation permettent de les utiliser plusieurs fois - et dans les meilleures conditions - et le clonage ouvre le chemin de la production massive. Le chimiste organicien qui ne suit pas attentivement le dveloppement de cette nouvelle classe de ractifs risque de voir le rsultat de ses efforts rduit zro par de brillants raccourcis synthtiques. Enfin, il est trs important de noter que, contrairement ce que lon pourrait imaginer, lorsque les ractions enzymatiques sont utilisables, elles permettent de prparer les oligosaccharides une chelle considrablement plus leve que les mthodes de couplage purement chimiques. Nous tudierons dabord un exemple particulier, la synthse de la N-actyllactosamine par couplage du galactose sur la N-actylglucosamine. La forme active du galactose est un << nuclotide-sucre , un pyrophosphate duridine et de galactose, UDPGal (10.46). Le couplage (10.8) est catalys par lenzyme galactosyl transfrase, prsente dans le colostrum de vache. (10.8) UDPGal

+ GlcNAc + Gal-P-( 1-4)-GlcNAc + UDP

Sous cette forme, cette raction na pas de valeur prparative, car elle consomme un quivalent de UDPGal, un produit trs coteux. I1 faut donc lassocier la rgnration de UDPGal, qui se fait en trois tapes. OPO,H,

CO,H -+ UTP + CH, COCOOH (10.IO) UTP + a-D-glucopyranosyl phosphate UDPGlc + HZPO, - O - PO,H, (IO. I l ) UDPGlc -+ UDPGal H,O,P - O - PO,H, + H, O -+ 2 PO,H, (10.12) La raction (10.9) est une phosphorylation de phosphate, catalyse par lenzyme pyruvate kinase (PK). La raction (IO. 10) est la synthse du << nuclotide-glucose >> UDPGlc, uridine diphosphate glucose (10.47) partir du triphosphate, catalyse par lenzyme UDP-pyrophosphorylase (UP). La raction (IO. I l ) est lpimrisation du nuclotide-glucose en nuclotide-galactose. On remarquera
(10.9) UDP
I

+ CH, =C

CH,OH
* R
~

0-

II

P-

1 0 . 4 6 R= H, R= OH 1 0 . 4 7 R= OH, R= H

Mthodes enzymatiques

171

que la nature prfre fabriquer UDP Glc et lpimriser plutt que fabriquer directement UDP Gal. Lenzyme est une pimrase (E). Comme la raction (10.10) est rversible, on dplace lquilibre vers la droite avec une cinquime enzyme, la pyrophosphatase inorganique, qui limine le pyrophosphate du milieu en catalysant son hydrolyse en phosphate. La somme des ractions (10.8) (10.12) donne le bilan de lopration (10.13). a-D-glucopyranosyl phosphate + N-actylglucosamine + (10.13) phosphate dnolpyruvate -+ N-actyllactosamine + pyruvate + 2 PO,H, On voit que la source dnergie primordiale est le phosphate dnol pyruvate, compos facilement accessible en grande quantit par synthse chimique. De mme, lorigine du rsidu galactopyranosyle, qui est la-D-glucopyranosyl phosphate, 10.48, est galement accessible sans problmes. On voit aussi que les divers nuclotides ne jouent quun rle catalytique. Or toutes les enzymes concernes sont actives au pH8 ; on peut donc mlanger substrat et enzymes dans le mme rcipient et raliser un cycle o le seul nuclotide ajout est UDP Glc en quantit catalytique (2 %, mol/mol). Ce cycle fabriquera de la N-actyllactosamine selon lquation (10.13) jusqu puisement des substrats (Fig. 10.3)[26]. Aucune des enzymes de ce systme nest trs difficile obtenir. Cependant il est avantageux de les immobiliser sur un support insoluble. Comme support, lagarose, polysaccharide naturel, base de D-galactose et de 3,6-anhydro-Lgalactose, est particulirement bien adapt au travail lchelle du laboratoire. Le

2Pi

UDP-Glucose

UDP-Galactosc

NHAC

Glucosea 1 -phosphate

NHAc

H O CH,OH

Phosphoenolpyruvate
Figure 10.3 Cycle de galactosylation enzymatique.

172

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

Spharose

I+

+
E-NH2

E-NH,

Figure 10.4 Mcanisme propos pour limmobilisation dune enzyme E-NH, sur agarose avec laide du bromure de cyanogne.

support est dabord activ avec du bromure de cyanogne. La figure 10.4 donne le mcanisme de lactivation dun systme cis-diol et de son couplage sur lenzyme symbolise par E-NH, par lintermdiaire de ses fonctions amines. Les couplages impliquent probablement la formation disores ou dimidocarbonates. Lactivit enzymatique est ds lors solidaire dun gel insoluble. On mlange dans le racteur les cinq gels, quil faut maintenir en suspension par agitation, et, une fois la raction termine, on rcupre par filtration le mlange de gels enzymatiques, utilisable une nouvelle galactosylation. On prparera finalement 10 g de disaccharide et lextension 100 g ou plus poserait peu de problmes. Ce systme a permis la galactosylation dun grand nombre de drivs de la N-actylglucosamine. Quand le substrat est le ttrasaccharide ramifi 10.49 qui comporte deux rsidus N-actylglycosaminyl galactosylables, le couplage a lieu exclusivement sur lune des branches, pour donner 10.50. GlcNAcQ -( 1-6) Gal-p -( 1-4)-Glc

1 t

10.48

10.49

Gal$ -( 1-4)-GlcNAcQ -( 1-6)


Gal-p -( 1-4)-Glc

GlcNAcp -( 1-3)
10.50

1 t

Mthodes enzymatiques

173

10.4.2 Gnralisation
Le paragraphe prcdent nous a permis de voir les donnes essentielles des couplages avec les transfrases. a) Lactivation de la position anomrique du monosaccharide rsulte de son estrification par un groupement phosphate dun nuclotide. Sept nuclotides sucres sont frquents chez les mammifres : UDP Glc, UDP Gal, UDP GlcNAc, UDP GlcUA (uridine - diphosphate - acide glucuronique), GDPMan (guanosinediphosphate-mannose), GDPFuc (guanosine-diphosphate-fucose), CMP NeuAc (cytidine monophosphate acide N-actylneuraminique). Les nuclotides-sucres sont trs coteux et il faut tcher de mettre au point un cycle de rgnration. b) La raction est catalyse par une glycosyl transfrase. Celle-ci a une double spcificit : elle fonctionne avec un nuclotide sucre particulier et elle le transfre sur une position dtermine dun sucre particulier. c) Pour cette raison, le couplage enzymatique est un couplage sans protections. La simplicit des oprations permet de travailler une chelle beaucoup plus leve que dans les mthodes sans enzymes. d) Dans le cas o le couplage est essay sur lunit terminale non rductrice dune chane doligosaccharide, la nature de cette chane, mme distance, peut modifier lefficacit de lenzyme. Nous avons vu que la vitesse de glycosidation est nulle sur une des branches du tetrasaccharide 10.49. Inversement, elle est 5 fois plus grande sur le chitobiose, GlcNAc -p- (I-4)-GlcNAc que sur GlcNAc. En plus de la galactosyl transfrase du colostrum, sept autres transfrases ont t clones et peuvent donc tre obtenues partir de cellules en culture. Le cot de ces enzymes restera sans doute pour un certain temps assez lev, refltant la longueur de la mise au point du clonage. En fait, on peut raliser des synthses efficaces avec des prparations enzymatiques partiellement purifies extraites dorganes de mammifre (foie, rein, cerveau) achets dans une boucherie.

Fucosyl transfrases
Elles utilisent GDPFuc, 10.51, qui a la rputation de ntre pas trs commodune fucosylation avec rgment accessible par aucune mthode. On a nration calque sur une des voies de biosynthse du fucose, selon la suite de ractions (10.14), dont lanalogie avec la suite de ractions (10.8) (10.11)

OH
10.51

OH

174

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

nchappera pas au lecteur. La-D-mannopyranosyl phosphate est rapidement prparable par voie non enzymatique. (10.14) GDP Fuc + R - OH -+ fucoside + GDP GDP + phosphate denolpyruvate -+ GTP + pyruvate GDP Man + P,O,H, Mannosyl phosphate + GTP GDP Man + NADPH -+ GDP Fuc + NADP

Comme dans la galactosylation, il faut prvoir lhydrolyse du pyrophosphate. Une nouveaut, cest que la conversion mannose -+ fucose implique une rduction, qui a lieu avec le rducteur cellulaire universel, NADPH, nicotinamide adnine diphosphate sous forme rduite. I1 faut donc prvoir un cycle adventice pour sa regnration, ce qui amne six le nombre total denzymes mlanges. I1 existe deux fucosyl transfrases impliques dans la biosynthse des substances de groupes sanguins (voir le chapitre 16). Une a-1,2-fucosyltransfrase introduit une unit a-L-fucopyranosyl en position 2 dune unit 0-D-galactopyraa t clonosy1 terminale non rductrice. Une autre, la a - 1,3/4-fucosyltransfrase ne. Elle introduit une unit a-L-fucopyranosyl soit en 4, soit en 3 du galactose, respectivement, dans les units terminales non rductrices Gal-B- (1-3)-GlcNAc et Gal-P- (1-4)-GlcNAc

Glucuronyl transfrase
Les B-D-glycosides de lacide glucuronique 10.52, sont fabriqus par les organismes suprieurs au cours du processus dit << dtoxification , pour faciliter llimination dune aglycone trangre. Le nuclotide-sucre est alors UDP GlcUA. La glycosylation enzymatique libre UDP comme sous produit. Celui-ci est transform en UDPGlc comme dans le cycle de galactosylation, mais ce stade, au lieu de lpimrisation en UDPGal, on produit une oxydation enzymatique de la fonction alcool primaire en carboxyle avec NADP comme oxydant. Celui-ci est rduit et doit tre rgnr.

H& O

10.52

On a utilis aussi en synthse une glucosyl transfrase et des N-actylglucosaminyl transfrases. On traitera des sialyltransfrases dans le chapitre 12 consacr aux acides sialiques.

10.4.3 Glycosidases
Nous avons dcrit au paragraphe 3.5.2 lemploi des glycosidases la prparation des alkyl glycosides. Lenzyme capable dhydrolyser un glycoside peut aussi

Mthodes enzymatiques

175

Figure 10.5 Racteur membrane. a. entre, b. chambre de raction, c. membrane semipermable, d. sortie, e. agitateur.

transfrer lunit glycosyle sur un hydroxyle dun autre sucre, donnant un disaccharide avec la mme anomrie. Cette certitude est dj un avantage considrable, tant donn le prix gnralement peu lev des glycosidases et labsence de protection. Ainsi, en prsence da-galactosidase, on a la raction (10.15).

(10.15)

Paranitrophnyl a-D-galactopyranoside + mthyl a-D-galactopyranoside -+ G a l a - ( 1-3)-Gal-a-OMe + NO, C, H, OH

Le rendement est de 28 % par rapport au glycoside donneur, ce qui est remarquable, car ce disaccharide important est difficilement accessible par dautres voies[24]. Toutefois, il faut utiliser un gros excs daccepteur et la sparation du produit est extrmement laborieuse. Les rendements sont en gnral plus faibles dans les autres conversions de ce type. Une P-galactosidase de Bacillus circulans peut transfrer un rsidu P-D-galactopyranosyle du lactose sur la N-actylglucosamine, selon (10.16) : (10.16) Gal-P-( 1-4)-Glc + GlcNAc

+ Gal-P-( 1-4)-GlcNAc + Glc

On a utilis rcemment cette enzyme trs stable et trs peu couteuse une synthse en continu de la N-actyllactosamine dans un << racteur membranaire . Dans ces racteurs, une des parois de la chambre de raction est semi-permable et retient lenzyme, en laissant passer les produits (Fig. 10.5).Le mlange de ractifs en solution aqueuse arrive par a, reste un temps T au contact de lenzyme, puis est chass vers lextrieur en d par larrive dune nouvelle charge. Un problme important de cette technologie est la dtermination de la valeur optimum de T dans le cas prsent pour limiter les hydrolyses parasites. Dans lexprience dcrite, une chambre de 10 mL, contenant 30 mg denzyme est traverse en 100 h par 2,6 L dune solution de lactose (120 mM) et de N-actylglucosamine (300 mM), On avec T gal 0,25 h ou 0,5 h. On obtient 11,3 g de N-actylla~tosamine[~~1. peut augmenter lchelle sans diminuer le rendement.

116

Transformations chimiques et synthse des oligosaccharides

10.5 FLUOROHYDROLYSE~~~]

Le traitement de la chitine 10.53, [O-D-GlcNAcp-( 1-4)-1, P-D-GlcAc, ( n trs grand) de la carapace des crustacs par le fluorure dhydrogne liquide pur 0C donne quantitativement une collection doligomres 10.54, [P-D-GlcNAcp-( 14)],-a-D-GlcNAcp-( 1-F), ( n = 1-11). La raction est prparative. Ces oligomres jouent un rle dans les interactions de reconnaissance entre les plantes suprieures et leurs htes, symbiotiques ou parasitiques.

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395. R. U. Lemieux et R. M. Ratcliffe, Can. J. Chem., 57 (1 979) 1244-1251 . 1161 P. J. Garegg, C. Henrichson, T. Norberg et P. Ossovski, Curbohydr: Res., 119 (1983) 95-100. [I71 S . David, A. Malleron et C. Dini, Carbohydr: Res., 188 (1989) 193-200. [18] S. Hanessian et J. M. Vatle, Tetrahedron Lett., (1981) 3579-3582. [19] D. Kahne, S. Walker, Y. Cheng et D. V. Engen, J. Am. Chem. Soc., 111 (1989) 68816882. [20] A. K. Sarkar et K. L. Matta, Curbohydl: Res., 233 (1992) 245-250. [21] C. Aug et A. Veyrires, Curbolzydr: Res., 46 (1976) 293-298. [22] N. M. Spijker et C. A. A. Bockel, Angew. Chem. Znt., Ed. Engl. 30 (1991) 180-182. [23] J. Defaye, J. M. Guillot, P. Biely et M. Vrhnka, Curbohydr: Res, 228 (1992) 47-64. [24] S. David, C. Aug et C. Gautheron, Adv. Curbohydr: Chem. Biochem., 49 (1991) 176237. [25] Y. Ichikawa, G. C. Look et C. H. Wong, Anal. Bioch., 202 (1992) 215-238. 1261 C. H. Wong, S. L. Haynie et G. M. Whitesides, J. Org. Chem., 47 (1982) 5416-5418. 1271 C. E Herrmann, U. Kragl et C. Wandrey, Angew. Chem. Znt. Ed. Engl. 32 (1993) 1342-1343. (281 J. Defaye, A. Cadelle et C. Petersen, Curbohydr: Res. 261 (1994) 267-277.

CHAPITRE 11

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

11.1 ASSOCIATION AVEC DES CATIONS MTALLIQUES 11.l.1 Introduction


I1 est bien vident que dans un mlange de sucres et de sels en solution, il y aura toujours au moins une association lche entre les hydroxyles et les cations mtalliques. De mme, lorsquon cristallise un sucre partir dune solution concentre en sels, lexamen aux rayons X rvle des associations entre le sucre, les cations et des molcules deau. Ceci nest pas rellement significatif de notre point de vue. Par exemple il existe un compos daddition cristallis rpondant la formule saccharose NaBr.2H20, alors quil nexiste pas dassociation visible en solution entre le saccharose et les ions sodium. Nous ne prendrons ici en considration que les associations qui impliquent au moins trois hydroxyles de la mme molcule de sucre[l. Nous ne traiterons pas des associations en milieu alcalin qui sont en fait des alcoolates. Lexamen des structures solides (en nombre limit) donne une base de discussion. Des techniques simples, comme llectrophorse sur papier ou la chromatographie sur couche mince dchangeur cationique ainsi que la spectroscopie RMN, donnent des renseignements sur la complexation en solution.

11.1.2 Structures ltat solide


Malheureusement les complexes dont on a pu dterminer la structure solide ne drivent pas en gnral des molcules de sucres banales dont la complexation est vidente en solution. Le complexe calcique du mthyl D-glycro-a-D-gulo-heptopyranoside, C8H,,0,.Ca2+.C1~.H,0, 11.1, nous indique la disposition caractristique dun complexe trident sur un cycle pyranosique. Le cation est coordin aux oxygnes 0(1), O(2) et O(3) dune molcule et 0(4),O(6) et O(7) dune autre molcule. I1 y a en plus une molcule deau et un chlorure, ce qui amne la coordinence du calcium 8. On remarquera sur la structure 11.1 la disposition axiale-quatoriale-axiale, m a , des ligands 0(1), O(2) et O(3).Cest la plus favorable la complexation sur un cycle pyranosique. La chane latrale adopte une conformation qui permet aux hydroxyles 0(4), O(6) et O(7)davoir la mme rela-

178

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

tion gomtrique mutuelle que O( 1), O(2) et O(3). Tous les hydroxyles du sucre sont engags dans la complexation. Le complexe P-D-mannofuranose. Ca++.(C1-),.4 H,O (11.2) cristallise partir dune solution aqueuse trs concentre de mannose en prsence dun excs de CaCl,. I1 est remarquable que la proportion de B-D-mannofuranose dans leau

HO-

OH I
\
I

, ,h ,

PH.

Ca++
11.1 11.2

H O

\ \

,,, , ,, ,, , , , , , ,, ,,
I

\ I

Ca+-+

.__ -. -_ - - -.

11.3

11.4

Association avec des cations mtalliques

179

pure nest que 0,3 %. La complexation dplace donc notablement lquilibre tautomrique en solution aqueuse. Le cation est coordinn O( I), O(2) et O(3) dune molcule et O(5)et O(6)dune autre molcule. Trois molcules deau amnent 8 la coordinence de Ca++. I1 est impossible de dcrire la coordination en fonction dun polydre classique. Ce type de complexation (triol vicinal, cis-cis) est caractristique des complexes des furanoses. Un monosaccharide ne peut pas fournir plus de trois oxygnes pour se coordonner un cation, mais avec un disaccharide, on peut observer la coordination avec 4 ou 5 sites. Ainsi le disaccharide non rducteur a-D-allopyranosy1-a-Dallopyranoside prsente-t-il la disposition aea sur chacune de ses units monosaccharidiques. Dans le complexe 11.3 avec CaCI, et 5 H20, Ca++est coordonn O(l), 0(2), 0(3), O(2) et O(3). Quatre molcules deau amnent la coordinence 9, chiffre assez rare. Le P-D-fructopyranose 1,2 ; 1,2-dianhydride 11.4 se complexe trs facilement avec CaCl,, SrC12, BaCI, et LaC13. Les hydroxyles engags sont O( l), 0(3), O( 1)et O(3).

11.1.3 Complexes en solution


Dans llectrophorse s u r papier, en prsence dun lectrolyte support, tous les sucres migrent vers la cathode, ce qui indique quune fraction au moins des molcules est complexe aux cations. Ce sont les cations Ca2+, Sr2+et Ba2+qui assurent la plus grande mobilit. La vitesse de migration est une mesure du taux de complexation. La molcule la plus rapide est le cis-inositol 11.5. La coordination fait intervenir les trois hydroxyles axiaux. Cest la disposition qui entrane la meilleure complexation possible, mais cette molcule nappartient pas la famille des sucres et, bien sr, il nexiste pas de drivs pyranosiques avec trois hydroxyles axiaux cis. Le glucose ne migre presque pas. On sait prparer des plaques pour couches minces base dchangeur de cations. I1 est facile de les faire passer sous la forme mtallique dsire (Cu2+, Ca2+, La3+, etc.) en les immergeant dans la solution saline correspondante. Avec leau comme irrigant, la migration des sucres sur ces plaques est plus ou moins retarde suivant leur degr de complexation. La rsonance magntique nuclaire donne des renseignements prcis sur la complexation en solution. Ltablissement de lquilibre est rapide lchelle de temps de la RMN, on nobserve donc quun spectre moyen et il est malais de dterminer le spectre du complexe pur. Lors de la complexation dun sucre ou dun polyol avec un ion diamagntique, tous les signaux migrent vers les champs faibles. La formule (11.1) permet de calculer la variation do de la constante dcran du proton lorsque la liaison est soumise un champ lectrique E (exprim en u.e.s.), dont la projection sur la liaison C-H est E,, (11.1)

AG= -2 x 10

-* E,

10-*E

En se reportant un complexe du type aea, par exemple 11.1, on remarquera que la projection E, a sa valeur maximale le long de la liaison C-H axiale centra-

180

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

,
\ \

, ,, ,
\ .
I ,

Ca++

11.5

11.6

OH
11.7 11.8

le et une valeur plus faible sur les C-H quatoriaux. Ceci permet didentifier le site de complexation. Par exemple, laddition dions calcium modifie le spectre du mthyl a-D-allopyranoside en solution aqueuse et on observe que cest le signal de H(2) qui est le plus dplac, suivi par ceux de H( 1) et H(3). On en dduit que le complexe a la structure 11.6. Dans ces expriences, les dplacements des signaux de protons sur les spectres sont de lordre de 0,2 p.p.m. I1 y a possibilit de piges dans ces dductions. La complexation peut entraner une inversion de conformation du cycle et celle-ci amne une variation de position des signaux beaucoup plus importante que la complexation. Ainsi, par suite L , 11.8, un polyol cyclohexanique de lquilibre conformationnel 11.7 peut prsenter deux sites de complexation efficaces, un site aea et unsite triaxial, qui nexistent pas dans sa configuration la plus stable. Les dplacements de signaux en prsence de cations paramagntiques sont observs avec les sucres comme avec presque toutes les familles organiques. Ils sont beaucoup plus importants et leur interprtation est beaucoup plus complique. Nous considrons que ces phnomnes sont en dehors du cadre de ce chapitre. Avant mme toute dtermination de structure solide, lexamen de la mobilit en lectrophorse avait dj montr que les sucres qui peuvent prsenter la squence aea dans lune de leurs conformations se complexent bien. Cest la disposition la plus favorable ; la disposition triaxiale 1, 3, 5 sur un cyclohexane est encore meilleure mais nest pas ralisable sur un pyranose. A cette disposition aea correspond pour un furanose, la disposition cis de trois hydroxyles comme dans le pD-mannofuranose discut ci-dessus. Le furanose flexible peut alors prendre une

Association avec des cations mtalliques

181

conformation qui place les hydroxyles dans une situation relative trs voisine de la disposition aea. Dune faon gnrale, la stabilit des complexes augmente suivant la valence des cations, dans lordre monovalent < divalent < trivalent, mais il y a un autre facteur, le rayon ionique du cation, dont la valeur optimale se situe entre 100 et 110 pm, comme dans le cas de Na +, Ca2 et La3 +.Les complexes de Li dont le rayon est 68 pm sont trs peu stables. On prdit que Cu2+,de rayon 72 pm, doit tre un complexant mdiocre et cest en gnral vrifi. Cependant il y a de fortes indications quil existe une complexation nergique dans les solutions dactate cuivrique. Le complexant rel serait alors [Cu, (0H),l2 +. A lquilibre de complexation (11.2) correspond une constante dquilibre K, donne par lexpression (11.3) ; cest une mesure de la force de complexation, quon appelle constante de stabilit.
+ +

(11.2)
(11.3)

Sucre + X+

(Sucre. X+)

K=

[(sucre .

x+)]

[sucre ] [x+]

Avec les sucres, la mesure est imprcise : K est relativement peu leve. Comme il sagit de solutions parfois trs concentres, il faudrait introduire les activits qui, pour ces cations complexes, ne sont pas aisment accessibles. I1 peut y avoir plusieurs ractions de complexation avec des stchiomtries diffrentes. On nglige ces sources derreur. La mthode de calcul de K la plus directe repose sur un dosage potentiomtrique du cation non complex en solution, en prsence de quantits variables de sucre. Lorsque la complexation implique ncessairement un changement de conformation du sucre, qui modifie profondment son spectre de RMN, on peut dduire la fraction de sucre complexe des dkplacements de signaux observs sur ce spectre. Avec Ca++, on mesure pour les << bons complexants D des constantes de stabilit voisines de 5 M- (a-D-allopyranose, 5,l - 6,5 ; a-D-ribopyranose, 4,6 - 5 3 , qui descendent jusqu 0,l pour les << mauvais D complexants comme le mthyl a-D-xylofuranoside. Les constantes de stabilit sont beaucoup plus leves dans le mthanol ou lthanol. Ceci explique le pouvoir dissolvant lev des solutions alcooliques de certains sels vis-vis des sucres, par exemple des solutions alcooliques concentres de chlorure de calcium. Parmi les applications, nous avons mentionn la sparation des sucres sur colonne dchangeur de cations sous forme calcium au chapitre 1, propos de la HPLC analytique. Signalons quon peut sparer le glucose du fructose lchelle du kilogramme par cette mthode. Sous sa forme prparative, lemploi de ces colonnes est trs recommandable : elles ont une grande capacit ; elles sont rgnrables et lluant est leau. I1 existe aussi des applications en synthse. Laddition de CaCl, une solution aqueuse de sucre augmente la proportion de tautomres pyranoses prsentant une disposition aea dans une de leurs conformation et de tautomres furanoses prsentant une disposition triol contigu cis, cis. On

182

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

peut ainsi changer radicalement le cours de la glycosidation de Fischer (voir le paragraphe 3.3) et lorienter vers la production majoritaire de furanosides, en gnral mal accessibles par dautres mthodes. Ainsi le rendement en mthyl a-D-ribofuranoside passe-t-il de 4 69 %.

11.2 NOTIONS SUR LA STRUCTURE DE LEAU LIQUIDE 11.2.1 Introduction


La connaissance de la structure de leau est surtout importante pour comprendre son interaction avec les sucres dont ltude est reporte en fin de chapitre, pour des raisons qui seront exposes en leur temps. Cependant, comme le concept dinteraction hydrophobe apparat plusieurs fois dans les paragraphes 1 1.3 et 1 1.4, il vaut mieux que le lecteur soit demble familier avec lui.

11.2.2 Structure de Ieau12]


Dans la glace, chaque molcule deau est laccepteur de deux liaisons hydrognes assures par les protons de deux molcules deau voisines. La configuration autour de chaque atome doxygne est celle dun ttrahdre rgulier, 11.9. Ces ttrahdres sont assembls pour donner un cristal de type tridymite. Celui-ci contient des cavits notables en raison de la longueur des liaisons oxygne-oxygne par lhydrogne, qui constituent larte des polydres. Dans leau liquide, en raison de lagitation molculaire, on ne peut plus assigner une position fixe aux atomes, ni la dterminer avec prcision par diffraction de rayons X ou de neutrons. Mais lorsquon emploie ces mmes mthodes avec de minces lames de liquide, on peut calculer partir des images de diffraction une fonction de distribution radiale g(r) qui est une mesure de la probabilit de trouver un atome doxygne j la distance r dun atome doxygne i. Cette fonction, reprsente la figure 1, montre quil y a une forte probabilit de trouver dans

O
11.9 11.10

Notions sur la structure de leau liquide

183

4
3

Figure 11.1 Fonction de distribution radiale dans leau liquide. Ordonnes : g ( R ) ; abscisses : distances un oxygne particulier, comptes en diamtre de Van der Waals de la molcule deau.

leau liquide un deuxime atome doxygne la distance R voisine du diamtre de Van der Waals de la molcule deau, 282 pm, et une probabilit plus faible den trouver un troisime la distance I,6 R. Puis la fonction samortit rapidement, ce qui indique que latome doxygne i considr ne conditionne plus lordre grande distance. Les deux pics observs tmoigneraient de la persistance dans leau liquide dassociations selon le modle 11.10 avec la configuration ttrahdrale. En intgrant la fonction de distribution de O r, on calcule le nombre n(r) de voisins immdiats, selon la relation (11.4), o p dsigne la densit. On trouve quun atome doxygne est entour par 4,4 atomes doxygne voisins immdiats. I1 y a donc un certain degr dorganisation.

(11.4)
I1 y a certainement les modes dassociation les plus varis dans leau liquide, mais on pense quil y a, en particulier, des cavits plus grandes que dans la glace. Lorsque lon refroidit les solutions aqueuses de gaz inertes ou dhydrocarbures (videmment trs dilues !), il se dpose ce que lon appelle un clathrate : dans cet difice, le solut, si ses dimensions le permettent, est emprisonn dans un dodcahkdre rgulier constitu par des molcules deau. On pense que ce type de cage et dautres plus grandes prexistent dans leau pure. Naturellement, elles se disloquent et se reforment constamment, puisque la dure de vie dune liaison hydrogne dans leau est de lordre de seconde. Le volume total, eau plus futur solut, diminue lors de la dissolution, ce quon interprte en supposant que le solut occupe simplement des volumes primitivement vides. Les grandeurs thermodynamiques associes au transfert dune molcule de mthane, par exemple, dun solvant organique leau saccordent avec cette interprtation.

184

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

Lenthalpie libre est positive (leau est un trs mauvais solvant pour le mthane !), mais en fait lenthalpie lie est ngative (raction exothermique) et cest une forte diminution dentropie qui renverse la tendance. Ceci rvle une augmentation de lordre dans le systme. On se reprsente le solut, quand il est loin de la saturation, comme entour par une sphre de molcules deau, qui dirigent leurs liaisons O-H tangentiellement dans la mesure du possible, de faon sloigner de la molcule de solut, 11.11. On a formul lopinion que ceci impliquait une certaine rigidification de la structure de leau. Si lon augmente la concentration, deux molcules A et B se rapprochent et finissent par se runir dans une mme cavit de plus grande dimension, 11.12. Ceci est un processus favorable car linterface eau-hydrocarbure sen trouve diminu. Ces phnomnes caractrisent lhydrutution hydrophobe.

11.3 CYCLODEXTRINES[3]
Nous commenons maintenant ltude dune famille de molcules complexantes qui sont sur le papier des produits de polycondensation de la-D-glycopyranose, rpondant la formule gnrale 11.13. On y trouve des polysaccharides linaires (R = H, R = OH) mais nous commencerons par des oligosaccharides cycliques, les cyclodextrines. En effet, leurs proprits sont souvent connues avec prcision et elles peuvent servir de modle pour comprendre le comportement de lamylose (voir le paragraphe 11.4) en dpit dune indiscutable diffrence de forme. Ce sont des oligomres cycliques btis partir dunits a-D-glucopyranosyl relies en 1 + 4. Les trois plus importantes, les a, p et y-cyclodextrines sont constitues partir de 6, 7 et 8 units a-D-glucopyranosyl en conformation habituelle D-4C,. Les anneaux ont la forme dun tronc de cne, avec les fonctions alcool primaire sur la petite base et les fonctions alcool secondaire sur la grande base. La structure 11.14 est celle de la P-cyclodextrine, prsentement la plus utilise. La cavit intrieure est tapisse par les hydrognes lis aux carbones 3 et 5 et les oxygnes glycosidiques. Elle apparat essentiellement hydrophobe. La conformation est stabilise par des liaisons hydrogne entre deux hydroxyles voisins de deux units a-D-glucopyranose adjacentes. Les dimensions de la cavit sont de lordre de 470-520 pm pour la-cyclodextrine, 600-640 pm pour la P-cyclodextrine et 750-830 pm pour la y-cyclodextrine. I1 est remarquable que la (3-cyclodextrine soit relativement peu soluble dans leau ( 1 8 3 g/L), tandis que la- et la y-cyclodextrine sont respectivement huit et douze fois plus solubles. Les cyclodextrines sont les produits de la dgradation de lamidon par la bactrie Bacillus rnacerans. On les spare ltat de complexes prcipitants avec certains solvants et on les purifie par recristallisation. I1 serait probablement possible den fabriquer industriellement un fort tonnage. La formation des cyclodextrines est interprte comme un trans glycosidation sous contrle enzymatique de lamylose. Celle-ci, en solution aqueuse, adopte au moins partiellement la forme

Cyclodextrines

185

11.11

11.12

11.13

OH

$1

*O'

OH O
11.14

d'une hlice, avec une priode de six units glucopyranose. L'enzyme bactrienne catalyse la jonction de deux rsidus glucopyranose, spars par quatre, cinq ou six rsidus sur la chane, mais en proximit spatiale cause de la structure en hlice 11.15. La proprit la plus caractristique des cyclodextrines est leur aptitude former des complexes d'inclusion en solution aqueuse avec des molcules de dimension infrieure celle de leur cavit. Ceci est visible, entre autres, dans les expriences de RMN. Ainsi l'addition de l'a-cyclodextrine l'anion paranitrophnate en solution aqueuse (pD = 11) dplace de 14-35 Hz les signaux de protons aromatiques examins 100 MHz. L'tude du dplacement en fonction de la concentration permet de calculer une constante de dissociation du complexe, K, = 3,7 x 10" M. On trouve des valeurs du mme ordre en analysant l'volution d'autres proprits physiques14].On peut dterminer le site de complexation sur la cyclodextrine en utilisant l'effet Overhauser nuclaire du proton[']. Rappelons que la

186

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

11.15

11.16

relaxation mutuelle de deux protons dpend de leur distance r selon une loi en y - , . La proximit spatiale de deux protons se traduit donc par une augmentation de lintensit du signal. Lexprience dcrite repose sur ce principe, mais fait appel une technique plus sophistique de RMN deux dimensions. La solution examine est 40 mM en a-cyclodextrine et 80 mM en paranitrophnate, dans D,O (pD IO), et au moins 95 % de la cyclodextrine est complexe. On montre quil y et mta (m)du a proximit des H(3) de la cyclodextrine avec les protons ortho (0) paranitrophnate et des H(5) avec les protons mta seulement. Ceci indique que le phnate est lintrieur de la cavit, avec la disposition schmatise par la formule 11.16. I1 y a de nombreuses autres mthodes pour mettre en vidence la complexation. Par exemple, il est bien connu que les protons situs au voisinage de laxe C, dun noyau aromatique donnent des signaux en RMN dplacs vers les champs forts, parfois jusqu des valeurs ngatives de 6. Linclusion dune molcule aromatique dans une cyclodextrine produit cet effet sur les signaux de H(3) et H(5). Mais il est relativement faible (-0,2 p.p.m.)[6]. Plusieurs autres mthodes dinvestigations sont possibles : les modifications du spectre lectronique, laugmentation de la fluorescence de lhte, qui dans la cavit est protg contre le choc des molcules extrieures, les changements dans le dichrosme circulaire. On observe aussi une augmentation de la solubilit des substances peu solubles dans leau. Dans la liste des molcules complexes on trouve des alcools et des acides carboxyliques aliphatiques bas poids molculaire, les acides cyclohexane- et adamantane-carboxyliques, des benznes substitus par des groupements fonctionnels varis, des htrocycles (pyridines, pyrimidines, indoles) et enfin des sels inorganiques. I1 ne semble pas quon soit encore arriv une explication dfinitive du mcanisme dinclusion. Dans lexpression de lenthalpie libre de la complexation, le terme denthalpie lie est ngatif, assez variable, de lordre de 20 kJ mol-, mais sa contribution est diminue par un terme entropique presque toujours positif. Ce comportement uniforme de molcules htes de structures extrmement varies par ailleurs suggre un mcanisme commun de complexation. On a vu ci-dessus que deux molcules de solut hydrophobe, A et B, 11.11 et 11.12, ont tendance se

Amylose

187

rejoindre en chassant les molcules deau qui les sparent. Ici lintrieur hydrophobe de la cavit de la cyclodextrine joue le rle de la molcule A et lhte B vient son contact en chassant tout ou partie des molcules deau qui occupent normalement cette cavit. I1 semble probable que la complexation est aussi due la participation de forces de Van der Waals, en proportion variable suivant la configuration de lhte. Actuellement on poursuit activement lexploration des proprits des cyclodextrines. En raison de leur absence de toxicit et de leur aptitude complexer leurs htes dans leau, on peut imaginer des applications dans lindustrie pharmaceutique pour ladministration de mdicaments insolubles. Elles peuvent jouer un rle catalytique. Ainsi la B-cyclodextrine acclre-t-elle la cycloaddition du cylopentadine avec lacrylonitrile par inclusion simultane des deux molcules. On cherche modifier les proprits complexantes en utilisant les hydroxyles pour accrocher des groupes supplmentaires. En introduisant un groupement fonctionnel basique faible prs de la cavit rceptrice, on a bti une enzyme hydrolase artificielle. Enfin, les cyclodextrines tant des molcules chirales, on sattend observer une rsolution plus ou moins efficace des htes racmiques. Cest ce quon a observ parfois et on a mme bti des colonnes chirales base de cyclodextrine immobilise. I1 ne semble cependant pas que les cyclodextrines se soient imposes comme ractifs de ddoublement.

11.4 AMYLOSE
Lamidon, substance de rserve des graines de vgtaux est un mlange de deux polysaccharides, lamylose et lamyl~pectine[~]. Lamylose est linaire, avec comme motif priodique la-D-glucopyranose, li comme sur la formule 11.13 (R = H, R = OH), II tant frquemment de lordre de 6 000. En revanche, Iamylopectine est un polysaccharide ramifi, o des chanes analogues, mais beaucoup plus courtes - de 17 26 units - sont relies entre elles par des liaisons 1-6. On spare ces deux constituants par traitement dune dispersion aqueuse damidon (lempois) par des composs organiques hydroxyls comme le thymol et le butanol primaire qui forment des complexes insolubles avec lamylose. Camylopectine reste en solution et nous nen parlerons plus. En ce qui concerne lamylose, on peut prparer plusieurs varits cristallises, selon les conditions du dpt partir dune solution aqueuse. La structure de base des amyloses A et B est une double hlice*], constitue par lenroulement lune avec lautre de deux chanes parallles, chacune ayant la forme dune hlice droite 11.17. Un tour complet correspond six units glucopyranosiques pour chaque brin. Les amyloses A et B diffrent par lorganisation dans la maille cristalline. Le pas de lhlice dans lamylose B est 2 080 pm. Les amyloses V qui prcipitent en prsence de complexant comme le dimthylsulfoxyde ou le butanol primaire sont des hlices simples, galement avec une rptition de six units a-D-glucopyranosyl, En solupeut-tre un peu moins rgulire. La varit V, est une hlice

188

Associations avec anions., cations et molcules inorganiques

1 -

11.17

11.18

11.19

11.20

tion, lamylose aurait la conformation dune hlice, simple ou double, probablement assez relche, ou de pelotes dsordonnes. La conformation hlicodale reproduit dans une certaine mesure le vis--vis des surfaces hydrophobes caractristique des cyclodextrines. On peut imaginer quelle vite ou restreint la formation de la couche aqueuse hydrophobe qui entoure normalement dans leau les molcules non polaires. On pourrait hasarder lexpression << autocomplexation . En revanche, lhlice prsente des groupements polaires vers la masse du solvant.

11.5 COMPLEXES IODS

11.5.1 Introduction
La coloration bleue de lamidon avec liode, bien connue des lycens, a t observe pour la premire fois il y a bientt 200 ans. Cest la fraction amylose qui est responsable. On observe la complexation avec les homologues infrieurs et, comme il est plus facile darriver des certitudes avec ces petites molcules, nous allons les traiter en priorit.

11.5.2 Complexes de la-cyclodextrine


En mettant au contact une solution aqueuse da-cyclodextrine et une solution thre diode, des cristaux brun rougetre se dveloppent linterface. Ils rpondent la composition (C,H,,0,),.12.4H20. Lanalyse par diffraction de rayons X indique que la molcule diode est colinaire laxe C, de la cyclodextrine. Les plus proches contacts dans la direction perpendiculaire cet axe ont lieu entre lun

Complexes iods

189

des atomes diode et les carbones C(5) et C(6), et lautre atome diode et loxygne O(4). Lenvironnement est donc hydrophobe pour le premier, hydrophile pour le second. Lempilement des molcules dans le cristal est tel que les deux orifices de la cavit de chaque molcule de cyclodextrine sont bouchs par les molcules voisines. On a affaire ici un complexe du type cage[0]. Lorsquon prpare les complexes en prsence diodure, on peut obtenir, suivant les conditions quatre types de complexes diffrents. On ne parlera ici que du comSur laxe C , de la molcule, plexe brun-noir, (a-~yclodextrine)~.Cd~,~.I,.27H,O. on trouve quatre des cinq atomes diode de Ii, le cinquime, central, tant dsordonn. Les deux molcules da-cyclodextrine se font face par leurs grandes bases, entre lesquelles se trouve latome diode dsordonn, 11.18. Les difices 11.18 sont empils les uns sur les autres de faon crer un canal continu rempli datomes diode. On a ici un complexe de type canal[].On observe soit lun soit lautre des deux types de structure cristalline rencontres ici, cage ou canal, avec des molcules htes autres que liode.

11.5.3 Le complexe (paranitrophnyl a-maltohexaoside)2 Ba (13)2.27 H,O


Le prfixe multo sert dsigner plus prcisment une famille doligosaccharide linaires de formule gnrale 11.13 (R = H, R = OH), avec n pair. Pour cette raison, on peut les voir comme des drivs de Ianomre a du maltose, 11.13 (R = H, R = OH, n = 2). On peut considrer le maltohexaose (n = 6) comme un petit fragment damylose. Dans cette tude,], on a utilis la-glycoside du paranitrophnol, que nous dsignerons par M, pour viter les complications dune possible mutarotation. Lvaporation de solutions aqueuses dcimolaires en M et triiodure de baryum amne la cristallisation daiguilles bruntres M,.Ba(13),.27 H,O. Ce complexe nest donc pas bleu intense, il a la couleur de liode en solution aqueuse. Nous simplifierons lextrme la description de cette molcule, assez complique dans les dtails, pour concentrer lattention sur les points qui nous semblent les plus intressants. La maille lmentaire contient quatre anions I; qui forment une ligne brise allonge 11.19. Les distances entres les triiodures sont un peu infrieures aux distances de Van der Waals. Chaque groupe de deux triiodures conscutifs est en contact avec deux hydroxyles du sucre et deux molcules deau. Lenvironnement nest donc pas hydrophobe essentiellement et cest peut-tre la raison pour laquelle la couleur du complexe se rapproche de celle de liode dans leau ou lalcool, plutt que du bleu du complexe iode-amidon. Autour de chaque triiodure senroulent deux molcules M, chacune en hlice gauche, mais en disposition relative antiparallle. Elles sont reprsentes sur la formule 11.20 par une ligne en V termine par un hexagone qui matrialise laglycone, tandis que la colonne diode est dessine rectiligne. On observe une interaction dempilement entre les noyaux aromatiques des aglycones de deux molcules M antiparallles, qui renforce peut-tre la cohsion du systme. Les deux chanes solidaires dun anion

190

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

11.21

H
11.22

triiodure sont dessines dplies en 11.21. Les traits pointills reprsentent les liaisons hydrognes directes entre ces chanes. La cohsion du systme est largement assure par le cation Ba++,qui prsente la coordinence 10. I1 est li quatre rsidus a-D-glucopyranosyl, de quatre chanes M diyrentes, deux fois sur les oxygnes 4 et 6 et deux fois sur les oxygnes 2 et 3, et deux molcules deau. La double hlice antiparallle est trs hydrate. Tous les groupes donneurs ou accepteurs de liaison hydrogne sont impliqus, y compris la plupart des oxygnes cycliques. On observe la prdominance remarquable de chelations impliquant O(5) et 0(6), ainsi que O(2) et 0 ( 3 ) ,conduisant des cycles 5 lments, 11.22. La superposition des mailles lmentaires schmatises selon 11.20 donne dans le cristal une cavit cylindrique infinie, dlimite par les hlices M et remplie danions triiodure en zigzag.

11.5.4 Complexe iod de lamylose


La complexation en solution de liode par lamylose se poursuit jusqu ce que le polysaccharide ait squestr environ 20 % de son poids diode. Le taux exact, ainsi que la longueur donde au maximum dabsorption du colorant bleu, variant de 606 642 nm, dpendent des conditions exprimentales et de lorigine de lamylose. On peut aussi obtenir le colorant en traitant lamylose V par la vapeur diode. I1 est gnralement admis que liode sinstalle au centre de lhlice[13]. Cela pourrait expliquer labsence de raction des amyloses A et B, en double hlice compacte, sans place suffisante disponible sur leur axe. On a fait une structure ltat solide du complexe iod de lamylose V,41. Le complexe avec le dim-

Interaction des sucres avec leau liquide

191

thylsulfoxyde est dcompos par le mthanol bouillant, puis expos la vapeur diode en atmosphre sature dhumidit. II prend ce moment-l la coloration bleu intense caractristique. On peut dcrire la structure ainsi : une droite ou une ligne presque rectiligne sur laquelle salignent des atomes diode, spars par 295 f 4 pm, pratiquement quidistants. Tout autour senroule lamylose en une hlice gauche dont chaque tour correspond six units a-D-glucopyranose. I1 y a trois atomes diode par tour dhlice. Les atomes diode sont aligns ; il ny a pas de contact avec des atomes doxygne et la couleur est bleue, tandis que dans le complexe du paranitrophnyl a-D-maltohexaoside avec I;, la chane diode est zigzagante, il y a des contacts avec les atomes doxygne et la couleur est brune. Selon un article rcent, la complexation de lamylose rigoureusement anhydre (ce qui vite la formation danion iodure) donnerait un complexe de liode molculaire 1 ~ 1 .

11.6 INTERACTION DES SUCRES AVEC LEAU LIQUIDE 11.6.1 Importance du problme
La place de cette question dans le chapitre ne doit pas faire juger quelle est secondaire. On la reporte la fin cause de lincertitude qui plane sur les interprtations. Nous exposerons essentiellement des hypothses et des tentatives de rponse exprimentale. Rappelons une banalit : le glucose et la majorit des sucres libres sont trs solubles dans leau. I1 reste une part de vrit dans le vieux nom dhydrate de carbone, car cest la famille organique la plus voisine de leau. Aussi, les molcules de sucres, attaches la priphrie des cellules vivant en milieu aqueux assurent-elles une espce de continuit entre une membrane hydrophobe dans ses parties profondes et le milieu aqueux extrieur. Luniversalit du glucose dans le monde vivant suggre une origine trs ancienne. Doit-il son mergence une adaptation particulire leau de << locan primordial >> ? Ceci est pure spculation, mais il y a aussi des problmes de notre monde contemporain. Bon nombre dinteractions entre une cellule et son milieu reposent sur lattachement dun oligosaccharide membranaire qui baigne dans un milieu aqueux un rcepteur lipidique ou protique. On peut en gnral mesurer les paramtres thermodynamiques de cette raction mais leur interprtation concrte exige que lon connaisse bien le type de liaison impliqu dans ltat initial. En forant un peu les mots, on pourrait dire que leau liquide est le rcepteur primordial et universel de tous les sucres et voir les interactions sucre-rcepteur protiques en milieu aqueux comme le passage dun rcepteur 2 un autre.

11.6.2 Le modle dhydradation strospcifique des hexopyranoses


Elucider les dtails de linteraction entre le sucre et leau revient sparer le comportement dune mince pellicule au contact du solut de celui de la masse des

192

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

molcules deau qui lentourent. On observe les variations avec la concentration de certaines proprits du solvant, concernant ses atomes doxygne, dhydrogne, ou la molcule entire, et on les interprte comme un effet des perturbations qui affectent la fraction deau lie sur la moyenne gnrale. On observe des diffrences entre les divers hexoses, ce qui oblige demble carter lide que chaque hydroxyle peut tre la fois donneur et accepteur de faon indiffrencie. En comparant leffet sur leau dune collection de sucres, on essaye de construire un modle dhydratation spcijique, cest--dire dnoncer les rgles qui dfinissent la constitution des hydrates en fonction de la configuration et la conformation du sucre dissous. On voit tout de suite que lexploitation des expriences sera difficile, puisque chaque sucre en solution aqueuse est un mlange, dans le pire des cas, des deux pyranoses et des deux furanoses. Une autre source de difficults, apparemment nglige par les auteurs, est linstabilit conformationnelle, qui entrane un mlange de formes, mme pour un tautomre dtermin (voir le chapitre 2). Bien sr, les hexopyranoses sont rigides, lexception de lidose, mais avec les pentopyranoses, il y a lieu dexaminer sil ny a pas de changement de conformation dans les conditions de lexprience. Enfin, il y a le problme de la flexibilit des furanoses. Autre source de difficult, les coles de pense concernes par ces problmes semblent avoir une conception diffrente de 1 adaptation . Selon lune de ces coles, une perturbation leve des proprits de leau de la solution par rapport celles de leau pure rvle quil y a un grand nombre de molcules deau associes au sucre, donc que cette couche dhydratation est relativement stable. Les auteurs considrent alors que cest une indication de sa bonne intgration au rseau de leau. Ainsi, on calcule que P-D-glucopyranose entranerait avec lui quatre molcules deau, formant un difice dont la dure de vie, de lordre de la ps, serait mille fois plus grande que celle des liaisons hydrogne dans le solvant. Cette hydratation optimale serait une consquence de la configuration favorable de ses hydroxyles. La distance entre les couples quatoriaux O(1) - O(3) et O(2) - O(4) est trs proche de la distance entre un atome doxygne et son second voisin dans leau pure. Ceci permettrait la formation de 11.23 qui se raccorde bien au rseau de leau. Quand on sloigne de cette configuration optimale, lhydratation diminue. La-D-glucopyranose nentranerait plus que trois molcules deau. La prpondrance en solution aqueuse de lanomre P du D-glucopyranose, contraire leffet anomrique, est interprte comme une consquence de sa meilleure stabilisation par le rseau de leau[l6I. Comme lhydroxyle primaire est aussi impliqu dans le rseau de liaisons hydrogne, certains auteurs ont formul lnonc paradoxal : tous les groupements polaires du P-D-glucose participent des liaisons hydrogne ; en consquence il se comporte comme un solut hydrophobe, en ce sens quune molcule trangre qui lapproche ne voit que des liaisons C-H. Pour conclure, on voit que selon ces principes, lhydratation calcule tant fonction croissante de la perturbation, la meilleure adaptation au rseau de leau correspond la perturbation maximale des proprits de leau pure.

Interaction des sucres avec leau liquide

193

,HO

= O \
5.. .O/H

O
I

H
11.23

CH,OH OH
HO

OH
11.24

OH
11.25

Une autre cole dfend le point de vue oppos[171. Si un sucre sadaptait parfaitement au rseau de leau, les molcules deau son contact ne se distingueraient en rien des autres : la perturbation des proprits physiques de leau pure serait nulle. Dans la pratique, le sucre le mieux adapt est celui qui perturbe le moins ; cest la-D-talose, 11.24, et le plus mal adapt, celui qui perturbe le plus, est la-D-galactose 11.25. Sur le sucre 11.24, les oxygnes 0(2), O(4) et 0(6) forment un triangle presque quilatral, dont le ct est approximativement gal la distance entre un oxygne et son premier voisin dans le rseau de leau. I1 y aurait trois distances adaptables au rseau de leau, contre une seule pour la-D-galactopyranose.

11.6.3 Principe des mesures

Relaxation
On prendra lexemple de la relaxation observe en RMN[18]. Sous leffet de lagitation molculaire, une magntisation samortit suivant une loi (suppose)

194

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

exponentielle M = Mo (1 - e; T,, temps de relaxation longitudinale, est une mesure de mobilit. Dans la molcule deau pure, TI mesur avec lisotope 1 7 0 prsent en abondance naturelle est de 7,3 ms 25C. I1 est multipli par environ 1,6 dans les solutions dhexoses de molalit 2,O. On explique ceci en considrant que leau lie au moins temporairement au sucre comme couche de solvatation est moins mobile que celle de la masse du solvant. La perturbation crot dans le sens mannose, galactose, glucose.

Mesure de compressibilit
Un procd acoustique permet de mesurer les compressibilits isentropiques molaires partielles. Selon les auteurs, si un solut sadapte exactement leau, on doit observer la mme valeur que dans leau pure, 8,17 x lo4 mL mol- bar-. Dans ce cas idal, les molcules deau au contact sont indiscernables. Sil y a mauvaise adaptation, il y a une couche intermdiaire suppose moins compressible que leau pure. On trouve effectivement des compressibilits molaires partielles ngatives : talose -11,9 ; mannose -16,O ; glucose -17,6 ; galactose -20,s x lo4 mL mol- bar- 25C.

Effet cintique du milieu


I1 sagit de linfluence dun solut tranger sur la vitesse dune raction en solution. La raction (11.5) tudie ici est la partie indpendante du pH de lhydrolyse dune benzamide dans leau. Elle procde par un tat de transition polaire qui contient deux molcules deau. La raction est retarde par tous les hexoses. On interprte en supposant quil y a des molcules deau communes dans les couches dhydratation de la benzamide, de ltat de transition et du sucre, ce qui a pour effet de modifier dune faon non parallle les enthalpies libres du produit de dpart et de ltat de transition. Si le sucre se comporte rellement de manire hydrophobe, on peut imaginer quil aura une interaction stabilisante avec la benzamide peu polaire. Le ralentissement augmente dans le sens galactose, glucose, mannose et talose. Les auteurs considrent que cela traduit une augmentation de caractre hydrophobe et confirme les rsultats de la mesure de compressibilit. Nous devons cependant souligner ici que le talose est le seul hexose de la srie tudie qui contienne 3 1 % de furanose en solution aqueuse.

PhCO - N
~

\HN

(11.5) PhCO-N
\ + N

H-O

H\ O H

PhCOOH

HN
\I,N

Interaction des sucres avec leau liquide

195

Cycloaddition en phase aqueuse


La cycloaddition dun dine sur un dinophile a la rputation dtre peu sensible la polarit du solvant. Cependant, elle est considrablement acclre dans I e a ~ [ ~Ainsi l. la raction (11.6) est 1000 fois plus rapide dans leau que dans lisooctane. On a suggr que ceci tait une consquence de leffet hydrophobe. Lacclration est encore plus grande dans les solutions de LiC1, sel qui diminue la solubilit des molcules lipophiles dans leau par augmentation de leffet hydrophobe. On a dj signal au paragraphe I l .3 un effet analogue de la fi-cyclodextrine. Dine et dinophile peuvent tre complexs simultanment dans la cavit hydrophobe de taille adquate. La-cyclodextrine, plus petite, ne peut complexer que lun des ractifs et ralentit la raction. Quand la vitesse dune raction dpend ce point de la nature du solvant, il est tentant de lutiliser comme outil chimique dtude de ce solvant : ses paramtres dactivation doivent tre priori trs sensibles laddition de composs qui en modifient la structure. On les a compars dans le mthanol et Le tableau 11.1 (lignes 1 et 2) montre que lacclration, lorsque lon passe de la solution mthanolique la solution aqueuse, vient dune augmentation de lentropie dactivation. Ceci pourrait tre la consquence dune diminution dentropie au transfert du mthanol leau plus importante pour ltat initial que pour ltat final.

Raction
(11.6)
(1 1.6)

Solvant eau mthanol eau mthanol-eau (1:1,vol/vol)

lo4 k,
(M-I
sI)

AS$ A(AHt)* AH$ (kJ mol-) (J mol-I T I )(kJ mol-I)

TA(AS)* (kJ mol-)

543 1O,4
2,85

(11.7) (1 1.7)

0,85

38,O ? 1,7 38,O _+ 1,0 40,0 f 0,6 33,6 f O X ,

14O,9 ? 5,0 173,9 f 3,4 178,X ? 2,l 1,l f 2,6

9,83

6,4

9,63

- 21

Tableau 11.1 Grandeurs thermodynamiques dactivation dans la cycloaddition 25C (* : Augmentation du solvant mthanolique leau). Daprs A. Lubineau, H. Bienaym, Y. Queneau et M. C. Scherrmann, New . I Clzen., . 18 (1994) 279-285 (publi avec laimable autorisation de Gauthier-Villars ; O 1994 Gauthier-Villars).

196

Associations avec anions, cations et molcules inorganiques

La sonde chimique idale de la structure du solvant devrait mettre en jeu des ractifs moins volatils et plus solubles dans leau, ce qui est apparemment incompatible avec un caractre lipophile. On sen rapproche avec un dine li un sucre libre, selon la raction (11.7). La comparaison des lignes 3 et 4 du tableau 11.1 montre que cette raction est galement acclre dans leau pure et que cest I aussi une consquence de laugmentation de lentropie dactivation. Donc, leffet hydrophobe peut sexercer entre dine et dinophile proximit de la partie sucre. (11.7)

La raction (1 1.7) est trs sensible laddition de sucres au milieu ractionnel. Le tableau 11.2 donne des prcisions numriques. Ces sucres, sans action faible concentration, acclrent la raction dune faon linaire partir de 0,2 M. A la concentration 2M, le glucose acclre plus la raction quune solution sature de B-cyclodextrine. Les additions de glucose, mannose, galactose, sorbitol, ribose.. . ont des effets acclrateurs comparables, mais ceci occulte peut-tre des mcanismes bien diffrents. Ainsi titre dexemples, si le glucose et le ribose la mme molalit (2,6 M) acclrent tous deux la raction, le ribose acclre la raction grce une baisse de lenthalpie dactivation alors que le glucose se comporte comme le chlorure de lithium et acclre la raction en agissant favorablement la fois sur les termes entropique et enthalpique contrairement la rgle habituelle de compensation. I1 a naturellement t montr que cette acclration nest pas une consquence de laugmentation de viscosit du milieu, qui se rvle au contraire tre un facteur dfavorable. Cette tude montre donc le caractre structurant du glucose (il augmente leffet hydrophobe) par rapport au ribose et apporte un support nouveau au modle dhydratation spcifique des sucres. Se liant de manire privilgie au rseau ttracoordonn de leau liquide, le glucose maintient cette structure par liaison

Additif Molarit
lo5 k, (M-I s-I)

Aucun
-

Mthanol
(SO %)
1M

Glucose 2M 3M

Saccharose P-Cyclodextrine
~~

1M

2M

(sature) 4O,2

28,5

8,s

34,0 45,O 61,3

44,9 74,9

Tableau 11.2 Influence dadditifs sur la constante de vitesse du second ordre de la raction (11.7) 25C dans leau. Daprs A. Lubineau, H. Bienaym, Y. Queneau et M.C. Scherrmann, New J. Chern., 18 (1994) (publi avec laimable autorisation de Gauthier-Villars ; O 1994 Gauthier-Villars).

Rfrences

197

hydrogne cooprative et favorise les interactions entre les molcules lipophiles limitant ainsi les contacts dfavorables avec leau structure. Cela pourrait expliquer le comportement favorable du glucose (par rapport au ribose) dans la stabilisation de protines comme lovalbumine contre la dnaturation thermique.

RFRENCES
S. J. Angyal, Adv. Curbohydr: Chem. Biochem., 47 (1989) 1-43. E Francks, Water, The Royal Society of Chemistry, Londres, 1984. R. J. Clarke, J. H. Coates et S. F. Lincoln, Adv. Curbohydr: Chem. Biochem., 46

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CHAPITRE 12

Acides sialiques et oligosaccharides sialyls

12.1 TAT NATUREL


Les acides sialiques naturelsrl sont des drivs de lacide 5-amino-3,5didoxy-D-glycru-D-galactu-nonulosonique 12.1. On remplace ce nom encombrant par << acide neuraminique . Le plus commun est lacide N-actylneuraminique 12.2, dont la configuration est facile mmoriser, car, en reprsentation Fischer, 12.3, il se prsente comme un produit de condensation aldolique de la et de lacide pyruN-actylmannosamine (2-actamido-2-doxy-D-mannose) vique. Cest du driv 12.2 quil sagit lorsquon emploie les mots << acide sialique >> sans autre prcision. I1 existe ltat libre ou glycosid dans la conformation L - 2C,, qui permet une disposition quatoriale de la chane latrale trois carbones. Le dessin 12.2 est celui de lanomre stable p du sucre libre, qui associe un hydroxyle anomrique axial des substituants non anomriques tous quatoriaux. Le spectre de rayons X de cet anomre p cristallis confirme cette conformation et nous apprend en plus que la chane latCrale a la conformation zigzag plan, avec les deux hydroxyles en 7 et 8 en disposition trans. Cette conformation L - 2C, est galement indique en solution aqueuse par le spectre de RMN du proton, qui dpend un peu du pH puisquil y a une fonction dissociable. En solution aqueuse, au pH 7.0, les signaux de certains protons des anomres a et p sont bien spars (Tableau 12.1) et le rapport des concentrations p : a est de 93 :7. Les glycosides naturels de lacide sialique ont tous la configuration anomrique a, tandis que la forme dactivation naturelle (voir le paragraphe 12.4) a la configuration p. Anomre H - 3ax 1,827 1,621 H-3eq 2,208 2,730 NAc 2,050 2,030

Tableau 12.1 Signaux RMN de certains protons de Neu5Ac en solution aqueuse (pH 7,O). Daprs J. Haverkamp, H. Van Halbeek, L. Dorland, J.F.G. Vliegenthart, R. Pfeil et R. Schauer, EUKJ. Biochern., 122 (1982) 305-31 1.

Etat naturel

199

Neu 5 Ac (12.2) Neu 4,5 Ac2 Neu 5,8 AC, Neu 5,9 Ac, Neu 4, 5 , 9 AC, Neu 5 , 7, 9 Ac, Neu 5 , 8, 9 Ac, Neu 5 , 7 , 8, 9 Ac, Neu 5 Ac 9 Lac Neu 4, 5 Ac, 9 Lac Neu 5 Ac 8 Me Neu 5,9 Ac, 8 Me Neu 5 Ac 9 P

Neu 5 Gc Neu 4 Ac 5 Gc Neu 7 Ac 5 Gc Neu 9 Ac 5 Gc Neu 7,9 Ac, 5 Gc Neu 8,9 Ac2 5 Gc Neu 7 , 8 , 9 Ac, 5 Gc Neu 5 Gc 8 Me Neu 9 Ac 5 Gc 8 Me Neu 5 Gc 8s Neu 5 (COCH,OAc) Neu 2 en 5 Ac (12.4)

Tableau 12.2 Drivs naturels de lacide neuraminique.

On rencontre deux types de drivs sialiques dans le monde vivant : des rsidus a-sialopyranosides, situs dans limmense majorit des cas en position terminale non rductrice de chanes oligosaccharidiques, et des produits polycondenss G polysialosides . On traitera ceux-ci plus spcialement en fin de chapitre. Dans les oligosaccharides sialyls solidaires des surfaces cellulaires, la position priphrique de lacide sialique entrane sa participation de nombreux phnomnes de reconnaissance : attachement denzymes, hormones, toxines, lectines, bactries et virus, participation au dveloppement du systme nerveux. Cest le principal responsable de la charge ngative des cellules. Une particularit de la configuration neuraminique, cest quon en a rencontr ce jour au moins vingt-cinq drivs de substitution diffrents dans les glycoconjugus (Tableau 12.2). Sur la structure de base, on trouve les substituants actyl (Ac), glycollyl (Gc), lactyl (Lac), actoxyactyl, mthyl (Me), sulfate (S) et phosphate (P). Leur symbole abrg utilise les trois lettres Neu, qui reprsentent lacide neuraminique, 12.1, suivie, dun chiffre qui indique la place du substituant, sur loxygne ou lazote, et du symbole du substituant. Par exemple, laciscrit Neu9AcSGc. Le dernier acide en de 9-O-actyl-N-glycollylneuraminique bas gauche du tableau 12.2, Neu2enSAc, est un produit dlimination de lhydroxyle anomrique, 12.4. On en rencontre des traces dans les fluides humains, et, sous forme drive, cest un sous-produit non dsir dans certaines ractions chimiques. Cette diversit dexpression est particulire la configuration neuraminique : les autres configurations reconnues dans les glycoconjugus se manifestant dune faon uniforme. Les acides sialiques se distinguent galement des autres monosaccharides des glycoconjugus par leur absence totale du rgne vgtai. Ce sont des productions typiques du rgne animal, quoiquon en trouve dans quelques bactries dailleurs pathognes pour lhomme et un protozoaire. Ils apparaissent 2 partir des chinodermes, toiles de mer et oursins, o lon trouve les thers mthyliques

200

Acides siaiiques et oligosaccharides siaiyls

CH,OH W

OH c

NH2

O OH

12.1

12.2

CO

H -

C-H

I+

CH,CON-C-H

-OH

cw-&
OH OHdCH3
12.4

OOH

HO-C-H

It -OH

12.3

CH,OH W

12.5

NeuSAc8Me et le sulfate NeuSGcSS de la fonction alcool en C(8). Parmi les vertbrs, cest chez les mammifres que lon observe la plus grande varit et il y a des diffrences nettes entre les drivs que lon trouve chez lhomme et, par exemple, le btail. La concentration dans la salive humaine normale est 25 pM. On a dcrit le cas dun enfant retard mentalement qui en scrtait 10 g par jour dans lurine, soit 1O4 fois la normale. Les glycoprotines des scrtions normales sont souvent riches en acide sialiques : la mucine des glandes sous-maxillaires, les nids dhirondelles de lExtrme-Orient en contiennent 9 - 36 %, la gele qui enveloppe les oursins jusqu 70 %. Lacide sialique est instable en milieu acide (voir le paragraphe l0.4.1), donc le protocole de sparation par hydrolyse acide doit tre un compromis entre une sparation insuffisante et une dgradation excessive. Nous avons dj donn, au paragraphe 3.5.1, les conditions dhydrolyse pour NeuAc et les conditions, encore plus modres, qui permettent de sparer sans dsactylation totale ses esters actiques. I1 existe une grande varit denzymes, les neuraminidases, qui hydrolysent la liaison glycosidique des sialosides. On trouve sur les catalogues des prparations dorigine bactrienne, quil est commode dutiliser aprs immobilisation sur agarose. Leur action ncessite un milieu lgrement acide, ventuellement des ions minraux (par exemple Ca++, 4 mM) et la vitesse dhy-

Prparations des acides sialiques

201

drolyse dpend des substituants sur lacide neuraminique et de la position de la liaison sur le rsidu pnultime. A la limite, lactivit peut tre pratiquement nulle. Le produit primaire de laction de la neuraminidase de Clostridium perfringens sur un a-sialoside est lanomre a , qui sisomrise ensuite lentement en p. Pour terminer, il faut mentionner un sucre troitement li lacide sialique, dans sa structure et sa filiation biologique, lacide 3-dsoxy-D-glycero-D-gulucto-nonulosonique 12.5, ou KDN. Cet acide a t isol lchelle du pg dune polysialoglycoprotine des ufs de la truite arc-en-ciel. I1 est localis exclusivement lextrmit non rductrice des chanes polysialiques et jouerait un rle dans lactivation des ufs des salmonids en les protgeant contre la sialidase. I1 se prsente comme un acide sialique hydrolytiquement dsamin.

12.2 PRPARATIONS DES ACIDES SIALIQUES


On trouve en France dans les piceries chinoises des prparations conditionnes pour la confection des potages de nids dhirondelle. Elles contiennent 10 % de leur poids dacide sialique combin, que lon peut rcuprer par hydrolyse avec de lacide sulfurique dilu et chaud, suivie dune sparation sur une colonne dchangeur danions. Le procd est simple, niais la matire premire est relativement coteuse. Comme il y a en ce moment dans le monde une forte demande en acides sialiques pour les recherches en biologie humaine, on a propos des procds de caractre enzymatique qui ne reposent plus sur un approvisionnement Les mammifres fabriquent leur acide sialique par condensation aldolique du phospho-enolpyruvate et du phosphate en 6 de la IV-actylmannosamine (Raction ( 12.1)). Une enzyme kinase catalyse la phosphorylation de la N-actylmannosamine et une phosphatase catalyse la dphosphatation de lacide sialique. Ces tapes de phosphorylation et dphosphorylation sont irrversibles, si bien que la synthse peut tre totale mme avec de faibles concentrations de substrat. Une variante de la raction (1 2. l), observe chez la bactrie Neisseria meningitidis utilise la N-actylmannosamine non phosphate. Cependant ce ne sont pas ces enzymes que lon a utilises en synthse prparative, mais une aldolase microbienne qui catalyse lquilibre (12.2). Cette enzyme a probablement un rle cata-

202

Acides sialiques et oligosaccharides sialyls

bolique dans ces organismes, mais elle fonctionne dans le sens synthtique en prsence dun excs de pyruvate. Elle est commercialement accessible un prix acceptable et son clonage a t brevet. Lenzyme immobilise sur agarose conserve encore 80 % de son activit aprs quatre utilisations conscutives et permet la synthse de lacide N-actylneuraminique lchelle de la vingtaine de grammes. En raison du prix lev de la N-actylmannosamine pure, on utilise comme produit de dpart le mlange de N-actylmannosamine et N-actylglucosamine obtenu par pimrisation alcaline de ce dernier sucre (dont le prix est ngligeable). Lpimre D-glum ntant rigoureusement pas substrat, lenzyme nutilise que la N-actylmannosamine131. Laldolase immoblise a galement permis de prparer en quantit apprciable un certain nombre des acides sialiques du qui tableau 12.2. Le produit de dpart est un driv 2-azido-2-doxy-P-D-munno permet, en jouant sur les groupements protecteurs dobtenir des mannosamines diversement substitues en 2, 4 et 6. Ainsi ont t prpars les acides N-actyls NeuS,9Ac2 et NeuSAc9Lac, les acides N-glycollyls Neu5Gc et Neu9Ac5Gc et un actate de NeuSGc, N~u~(COCH,OAC)[~]. Ces acides sont trs rpandus chez les animaux, mais non sparables partir des sources naturelles en quantit suffisante pour une tude complte. Laldolase accepte donc dautres substrats que Man Ac, un point sur lequel nous reviendrons ci-dessous. Une autre adaptation de la synthse enzymatique de lacide sialique utilise la N-actylglucosamine comme substrat et un systme de deux enzymes, qui associe la sialyl aldolase une pimruse. Celle-ci met en quilibre la N-actylglucosamine et son pimre manno dans le racteur, un pH (7,O - 8,O) compatible avec le fonctionnement de laldolase. Ces deux enzymes ne sont pas immobilises, mais en solution aqueuse et sont retenues dans le racteur par une membrane semi-permable, qui laisse passer substrats et Une installation de ce type a permis la prparation de 3 3 kg dacide sialique. Nous allons maintenant revoir le problme de la spcificit de lenzyme. I1 est instructif de revenir sur le KDN, 12.5. La sialyl aldolase le met en quilibre avec ses deux produits de rupture aldolique, le D-mannose et le pyruvate. La conversion peut tre oriente dans le sens synthtique et on peut prparer trs efficacement le KDN avec cette enzyme, partir de ces deux produits trs communs, nimporte quelle chelle161. En fait le D-mannose est au moins aussi bon substrat que ManAc. Ceci suggre que la nature du substituant en 2 est peu importante, pourvu quil soit axial[7]*I. Effectivement, ce principe a permis de prparer des acides nonulosonique avec des substituants varis en 5 , tels les acides 5-doxy, 12.6, 5-azido, 12.7, et 5-phnyl, 12.8. Les << mannoses dsoxygns >> en 2, 4, 5 ou 6 donnent avec un bon rendement les acides nonulosoniques 5-, 7-, 8-, ou 9doxy. Le sucre obtenu en supprimant la chane latrale du D-mannopyranose, cest--dire le D-lyxopyranose, donne lacide octulosonique 12.11. Son produit de dsoxygnation sur C(2), le 2-doxy-D-rhro-pentose est le substrat le plus simple connu ce jour : il donne lacide 12.12 dune faon prparative. Parmi les non-substrats nous avons not GlcNAc, mais, fait remarquable, Iacide sialique des toiles de mer NeuSGcSMe, 12.9, rsiste laldolase. Le produit

CH,OH

)-*
Couplage chimique

203

R'

OOH

OH

1 2 . 6 R= H, R = OH 1 2 . 7 R= N,, R'= OH 1 2 . 8 R= Ph, R'= OH 12.9 R= NHCOCH,OH, R'= OMe 1 2 . 1 0 R= NHAc, R'= H

1 2 . 1 1 R=OH 1 2 . 1 2 R=H

HO

& &
COOH CH,OAc AcNH
OH

CH,OH

COOMe OAc

OAc

12.13

12.14

de rupture serait un furanose et, d'ailleurs, le furanose 2-actamido-2-doxy-5-0mthyl-D-mannose n'est pas substrat. Cependant ni la prsence d'un hydroxyle libre en 8 dans l'acide sialique, ni une configuration pyranose de l'hexose de rupture ne sont ncessaires, car l'acide 8-doxy 12.10 est Par contre, on observe des ractions univoques et 2 bon rendement avec des sucres de la srie L, comme le L-mannose, qui donne l'acide nonulosonique 12.13['"1et le L-gulose["l. L'acide 12.13 est nantiomre du KDN. Cette multiplicit d'observations montre qu'il est prmatur de dfinir la spcificit de l'enzyme, mais que d'ores et dj, elle apparat comme un remarquable outil de synthse organique.

12.3 COUPLAGE CHIMIQUE


Le couplage chimique de l'acide sialique, la << sialylation N d'un sucre prsente des difficults particulires[121. Comme c'est un ctose, le couplage est la construction d'un carbone quaternaire. I1 n'y a pas de substituant sur C(3), donc pas de participation attendre de ce ct-l. Enfin les conditions des ractions de couplage favorisent la dshydratation qui donne une version protge de l'acide 12.4, particulirement lorsque l'hydroxyle coupler est peu nuclophile. Pour cette raison, les halognoses peractyls de style classique 12.14 (X = F, C1, Br) donnent des rsultats rarement satisfaisants avec les sucres protgs et, le plus

204

Acides sialiques et oligosaccharides sialgls

OAc
12.15

SPh OAc

CH,OAc

2
.
OAc

\,OR
+OR
OAc
UK

A C I Y H ?

12.16 R= SPh, R = COCMe,, R= CH,CH,SiMe, 12.17 R= H, R = COCMe,, R = CH,CH,SiMe, 12.18 R= H, R= Bz, R= CH,CH,Br

Me

III
I

N +

12.19

souvent, des mlanges anomriques, en rendement global moins que moyen. On a propos comme solution lintroduction dun substituant quatorial temporaire sur C(3). I1 peut fonctionner soit par participation, soit par blocage strique de la face p. Cest dans cet esprit quon a prpar dabord comme ractif sialylant un bromure analogue 12.15, mais avec protection des fonctions alcool par des benzyles. Ce ractif a permis[I2]la sialylation dalcools secondaires avec de bons rendements. La voie daccs la plus simple un ractif de ce genre semble tre Iaddition du chlorure de phnylsulfnyle, PhSC1, sur le peractate de lester mthylique de lacide olfinique 12.4, qui donne le ractif 12.15. Celui-ci se condense sur la position 3dun lactoside partiellement protg pour donner 12.16 avec 70 % de rendement. On obtient 12.17 par dsulfuration avec le tributylstannanel31 1141 1151. En fait, on a montr rcemment que lactivation directe de thioglycosides de lacide sialique donnait des rendements satisfaisants avec les hydroxyles secondaires. Ainsi le mlange anomrique des mthyl thioglycosides protgs de laci-

Couplage enzymatique

205

de sialique, en prsence du promoteur N-iodosuccinimide - CF,SO,H se condense sur O(3) du galactose (a : 59 % ; : 10 %)[I6]. On a enfin propos le mthyl xanthate[I7], prpar suivant la raction ( 12.3). Ce ractif sialylant est activ par additions successives de triflate dargent et de MeSBr, prcurseurs du promoteur CF,SO, - SMe. Avec 2 quivalents de xanthate et un lactoside libre sur les posiDans ces tions 2, 3 et 4,on obtient 12.18 avec un rendement lev (p : 1 %)Lis]. couplages[161,L i le solvant contient toujours une proportion leve dactonitrile (pur si possible) et on pense que la formation intermdiaire dun nitrilium axial 12.19 favorise lintroduction a de loxygne.

(12.3)

KSCSOEt

12.4 COUPLAGE ENZYMATIQUE


La forme active naturelle de lacide sialique est le cc nuclotide-sucre D CMPNeuSAc 12.20 que les cellules fabriquent partir de cytidine-triphosphate CTP en prsence dune synthtase (cytidine 5-monophosphosialic acid synthtase) selon la raction (12.4). Parmi les ractions dactivation de sucres, celle-ci est remarquable plusieurs points de vue : lenzyme a comme substrat le sucre non phos-

12.20

206

Acides sialiques et oligosaccharides sialyls

phoryl ; le nuclotide sucre est un phosphodiester au lieu dun pyrophosphate (voir le paragraphe 10.4), la raction est irrversible et la liaison est P. Lenzyme synthtase est isolable partir de cervelle de veau achete dans une boucherie[*l Lenzyme de E. coli a t clone et surexprime dans une souche de E. coli, dont elle reprsente 10 % des protines solubles[19][20]. Elle admet comme substrat les acides neuraminiques modifis, Neu5Gc et Neu5,9Ac2 et, avec une efficacit moindre, KDN. La raction (12.4) consomme une quantit stoechiomtrique de CTP, produit rare et couteux. On part donc du nuclotide phosphate commun cytidine monophosphate, qui est phosphoryl deux fois, selon les ractions (12.5) et (1 2.6). La premire phosphorylation, avec ATP, est catalyse par lenzyme nucloside monosphosphate kinase. En raison du prix de ATP, il faut la coupler avec une raction de rgnration de ATP qui est la raction traditionnelle de la biochimie, (1 2.7), catalyse par lenzyme pyruvate kinase. La phosphorylation de CDP en CTP est possible directement par le phosphoenolpyruvate et la pyruvate kinase. En plus des deux kinases et de la synthtase, on utilise une pyrophosphatase inorganique pour hydrolyser le pyrophosphate form dans la raction (12.4) et la rendre irrversible. On immobilise sparment les quatre enzymes sur agarose et on mlange les gels, en suspension dans une solution aqueuse au pH 7,5 dans le racteur. Ce systme, aliment en cytidine monophosphate, acide sialique et phosphoenolpyruvate et en prsence de quantits catalytiques d ATP, fabrique le nuclotide sucre que lon peut extraire du milieu, aprs sparation des gels par filtration. La figure 12.1 schmatise les ractions enzymatiques couples dans le racteur. On observe les rendements suivants12] : CMP-Neu5Ac : 60 % ; CMPNeu5Gc : 80 % ; CMP - Neu5,9Ac2 : 52 % : CMP-KDN : 26 %.
(12.5)
(12.6)
(12.7)

CMP

CDP ADP

+ + +

ATP

phosphonolpyruvate phosphonolpyruvate

ADP

CDP CTP ATP

+ pyruvate

pyruvate

Ltape suivante est le couplage sur le sucre accepteur, qui a lieu avec libration de CMP, catalyse par une siczlyltransfevase, prsente selon le mode de la biochimie sur la figure 12.2. Les sialyltransfrases introduisent une unit sialyl sous la forme a-D-pyranosyl sur un sucre en situation terminale non rductrice dans un oligosaccharide. Les exemples que nous donnerons ci-dessous mettront en vidence la nature de leur spcificit. La plus commune introduit le rsidu a-D-sialopyranosyl sur la position primaire du galactose dans le mthyl P-D-galactopyranoside, le mthyl P-lactoside et la N-actyl-lactosamine libre ou en position terminale non rductrice dans un oligosaccharide. Elle est abondante dans le foie de porc, disponible en boucherie. Sous forme immobilise, elle a permis de prparer le ttrasaccharide glycoside 12.21a, dont lenchanement est frquent dans les glycoprotines[211.Les trois couplages osidiques de 12.21a ont t raliss de trois faons diffrentes, le pre-

Couplage enzymatique

207

Neu5Ac

PP7"4

Pyruvate

%
CDP

CMPNeuSAc

Phosphoenolpyruvate

CMP

Phosphoenolpyruvate

Pyruvate

A=-;.

Figure 12.1 Synthse enzymatique de CMPNeuSAc avec rgnration des cofacteurs : NK : nuclotide monophosphate kinase ; PK : pyruvate kinase ; S : synthtase.

CMP Neu5Ac

CMP

NeuSAc-a -(2-x)-G

Figure 12.2 Sialylation enzymatique avec la sialyltransfrase ST.

mier, sur le mannose, par un procd de chimie organique (avec AgCF,SO,), le second avec la galactosyltransfrase, le troisime avec la sialyltransfrase (46 76). Cette enzyme admet galement comme substrat le nuclotide CMP-Neu5,9Ac7. Le transfert sur la lactosamine donne le trisaccharide 12.21b ( I 15 mg ; 57 %), q i i I1 aurait fait partie du rcepteur du virus de la grippe B sur les globules t trs compliqu de prparer par les voies chimiques traditionnelles un trisaccharide actyl spcifiquement sur un seul de ses onze hydroxyles.

208

Acides sialiques et oligosaccharides sialyls

COOH

AcHN

HO

HO

HO OH HO

12.21a
COOH

OMe

A C O *

AcHN

HO

HO h

&

O
OH

H
NHAC

12.21b

COOH
OH
AcHN OH
NHAC

HO

12.22

Toutefois, il semble que la majorit des oligosaccharides sialyls impliqus dans les phnomnes de reconnaissance prsentent la liaison glycosidique Neu5Ac-a- (2-3)-Gal. On peut isoler du foie de porc sans difficults excessives une transfrase utilisable pour ce couplage, dont le substrat naturel est Ienchanement p-D-Gal-( 1 43)-D-GalNXc. Cctte transfrase catalyse aussi le couplage sur le motif P-D-Gal-(l + 3)-D-GlcNAc et a permis de prparer 140 mg du trisaccharide 12.22, lpitope << CA 50 >> dun antigne exprim abondamment en association avec certaines On observera que lassociation des schmas ractionnels des figures 12.1 et 12.2 forme un cycle de sialylation complet, qui en principe doit fonctionner avec seulement des quantits catalytiques de CMP. Toutefois une activit enzymatique parasite de la synthtase isole de la cervelle de veau, impossible liminer conomiquement, empche le fonctionnement de ce cycle, qui a t ralis avec la synthtase obtenue par clonage. Les deux transfrases, a - (2 + 6) et a - (2 + 3) ont galement t obtenues par clonage[23][241.

Acides polysialiques

209

12.5 ACIDES POLYSIALIQUES[251 12.5.1 Introduction


Ce paragraphe suppose connues quelques notions sur les glycoprotines et limmunochimie qui ne seront dveloppes que dans la suite de louvrage, aux chapitres 13 et 15. Le lecteur pourra sy reporter. Nous prfrons cette prsentation un ordre plus logique et condenser en un seul chapitre le plus grand nombre de manifestations de la personnalit remarquable des acides sialiques. Les configurations de la liaison glycosidique dans les polymres polycondenss naturels de lacide sialique sont a - (2 + S), a - (2 + 9). Exceptionnellement, dans lacide polysialique dune toile de mer, la liaison interglycosidique fait intervenir la fonction alcool primaire du rsidu glycollyl dans N e ~ 5 G c S M e ~ ~ ~ l . Des oligomres 12.23 (n = 2,. ..5) ont t isols et caractriss partir dun ganglioside prsent dans une toile de mer.

12.5.2 Acides polysialiques microbiens


Les mningocoques, Neisseria meningitidis, se rpartissent en dix srogroupes distincts. Les groupes B et C sont responsables de SO % des mningites observes, qui sont une cause majeure de mortalit chez les enfants et chez les adultes. Les capsules de ces bactries contiennent des acides polysialiques linaires. Dans le groupe C, la liaison entre les rsidus sialiques qui peuvent tre actyls partiellement ou non actyls est a - (2 + 9). Cette structure 12.24 est un immunogne puissant ; le polysaccharide du groupe C est un vaccin autoris. Cependant, il ny a pas de rponse chez les enfants de moins de deux ans, peut tre parce qu cet ge, ils expriment une structure polysialique analogue dans leurs tissus.

O-CH,-CO
12.23

L
12.24

Jn

210

Acides sialiques et oligosaccharides sialyls

L
12.25

Jn

Les bactries du groupe B prsentent sur leur surface lacide polysialique a (2 + 8) 12.25. I1 est trs peu immunogne et il ny a pas de vaccin connu contre cette forme de la maladie. On attribue ceci la prsence dun acide polysialique trs voisin dans le cerveau humain, si bien que cette structure nest pas reconnue comme trangre par le systme immunitaire (voir le paragraphe 12.5.3). De fait on connat un anticorps monoclonal commun ces deux acides polysialiques (raction croise). La bactrie Escherichia coli KI, galement cause de mningite, produit aussi un acide polysialique a - (2 -+ 8), ventuellement actyl. Enfin, on observe ce mme polymre la surface de certaines cellules tumorales. On a examin de prs lacide polysialique a - (2 + 8) avec lespoir dobtenir un bon immunogne par modification. I1 se combine un anticorps du srum de cheval, et, de la manire traditionnelle, on a cherch reconnatre lpitope en essayant dinhiber la combinaison par des oligosaccharides. Normalement un pitope oligosaccharidique correspond au plus 5-6 rsidus monosaccharidiques, or loligomre 12.25 (n = 5 ) nest pas actif, il faut au tnoins n = 10 pour observer une inhibition. On pense tre en presence dun pitope conformationnel, cest--dire que ce nest pas seulement la squence oligosaccharidique qui compte, mais la forme gnrale. Celle de Ipitope de lacide polysialique a - (2 -+ 8) serait une hlice trs allonge, avec 8- 12 rsidus par tour. On trouve, dans un bactriophage, une enzyme endosialidase a - (2 -+8), qui hydrolyse avec un degr de spcificit lev les liaisons internes de cet acide polysialique. Le site de clivage doit tre flanqu par au moins cinq rsidus sialosides du ct terminal non rducteur et trois de lautre. On retrouve le site de reconnaissance exceptionnellement tendu dj observ dans la raction immunochimique.

12.5.3 La molcule dadhsion des cellules nerveuses, N - CAM


Ladhsion entre cellules joue un rle majeur dans le dveloppement embryonnaire du systme nerveux. Plutt que dimpliquer un grand nombre de molcules dadhsion, on pense plutt maintenant quil y en a seulement un petit groupe de spcificits diffrentes et que la varit de phnomnes observs repose sur une coordination de leur expression avec des vnements cytoplasmiques. Les molcules N - CAM sont les mieux connues[.

Acides polysialiques

211

Figure 12.3 Reprsentation schmatique de la molcule N-CAM,8,. Les points noirs correspondent des sites de glycosidation. Extrait de C. M. Regan, Znt. J. Bioch., 23 (1991) 5 13-523 (publie avec laimable autorisation dElsevier Science Ltd, Kidlington, UK).

La figure 12.3 donne une reprsentation schmatique[27] de lune dentre elles, N - CAM,,,, lindice 180 rappelant la masse molculaire, voisine de 180 000, de la charpente polypeptidique. Cest une protine transmembrannaire compose dune seule chane polypeptidique de 1072 acides amins. Partant de lextrmit NH,, qui baigne dans le milieu extrieur, il y a dabord une rgion denviron 400 rsidus acides amins. I1 y a dans cette rgion une chane latrale oligosaccharidique, probablement lie lasparagine 203, qui porte Ipitope ttrasaccharidique sulfat dit L2/HNK -1, 12.26, qui nest pas sialyl. Cest dans cette rgion aussi que se trouvent les domaines impliqus dans ladhsion entre cellules, selon un mcanisme dit <<homophile . Ceci signifie quune molcule N - CAM sur une cellule sattache une molcule N - CAM sur une autre cellule. Cette adhsion ne fait donc pas intervenir dacide sialique. Poursuivant la chane vers lextrmit carboxylique, on rencontre de nouvelles chanes glycosyles au niveau des asparagines 404, 430 et 459. Celles-ci se terminent par des chanes polysialiques, avec la liaison a - (2 4 8). A peu prs au rsidu 692, la charpente polypeptidique aborde la traverse de la membranne cellulaire, dont elle sort vers le rsidu 710, et prolonge une longue racine de 300 rsidus environ dans le cytoplasme. HS03-3-GlcUAQ -(1-3)-Gal-P -( 1 -4)-GlcNAc-P -( 1-3)-Gal
12.26

La quantit totale dacide sialique varie au cours du dveloppement embryonnaire, entre les limites < 10 % et 30 %. Des observations ont montr que ces chanes dacide polysialique sopposent ladhsion. Donc leur biosynthse apparat comme un mcanisme de rgulation des proprits adhsives de la rgion du polypeptide termine par NH,. II est concevable, en termes trs gnraux, quun dveloppement correct du systme nerveux implique parfois adhsion, parfois rpulsion. Le mcanisme exact nest pas connu avec certitude. I1 peut y avoir un simple effet mcanique. La croissance de la chane polysialique augmente beaucoup le volume de la molcule N-CAM et ceci pourrait maintenir la surface dune cellule voisine trop loin pour quil y ait interaction. Ce volume est en partie la consquence dune forte hydratation. I1 pourrait y avoir rpulsion par les charges ngatives des carboxylates ou encapsulation des sites dadhsion par des chanes polysialiques, ou modifications corifor~iiationnelles.

212

Acides sialiques et oligosaccharides sialyls

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CHAPITRE 13

Glycoconjugus

13.1 GLYCOLIPIDES 13.1.1 Dfinitions, isolement


Cest lassociation dun oligosaccharide et dune molcule lipidique] [*I. On se bornera deux familles dont la dfinition ne pose aucun problme. Dans le fype sphingosine, Ioligosaccharide est li de faon glycosidique la fonction alcool primaire dun aminoalcool longue chane. Le plus communment observ est la sphingosine 13.1. Dans les glycolipides, la fonction amine est engage dans une liaison amide avec un rsidu acyle driv dun acide gras longue chane. I1 y a une grande varit de drivs de ce type, auxquels on donne le nom collectif de cramide (Cer).Lautre famille importante de glycolipides appartient au type glycrol. Loligosaccharide est li par liaison glycosidique la fonction alcool primaire dune molcule de glycrol estrifie par deux molcules dacides gras,

13.2. Suivant les poids respectifs de la partie lipophile et de la partie hydrophile dans le glycolipide, le protocole dextraction sera variable. On procde gnralement une premire extraction des tissus avec un mlange chloroforme-mthanol ( 2 :1) et on extrait nouveau le rsidu en introduisant de leau (5 %) dans le mlange de solvants. Le relargage avec du chlorure de sodium spare une phase chloroformique qui contient les glycolipides neutres, dune phase aqueuse-mthanolique qui contient les glycolipides acides ou trs hydrophiles. On poursuit avec les techniques habituelles de sparation, chromatographie sur gel, dialyse, chromatographie sur colonne de dithylaminothylcellulose, c.c.m. Une mthanolyse acide spare la sphingosine et les acides gras de loligosaccharide. La caractrisation de loligosaccharide utilise les principes gnraux dcrits au chapitre 9. Le lecteur se rappellera quon a avantage analyser directement le glycolipide par f.a.b.
CH,OH CHOCOR OH
13.1

CH,OCOR
13.2

214

Glycoconjugus

globo

isoglobo lacto nolucto ganglio muco gala

GalNAc-P-( 1+3)-Gal-a-( 1-+4)-Gal-P-( 1+4)-Glc-P-( 1-Cer) GalNAc-P-( l-+3)-Gal-a-( 1+3)-Gal-P-( 1+4)-Glc-P-( 1-Cer) Gal-P-( 1+3)-GlcNAc-P-( I -+3)-Gal-P-( 1 +4)-Glc-P-( 1-Cer) Gal-P-( 1+4)-GlcNAc-P-( 1-+3)-Gal-P-( 1+4)-Glc-P-( 1+Cer) Ga@-( 1-+3)-GalNAc-P-( 1+4)-Gal-P-( 1+4)-Glc-B-( 1+Cer) Gal-P-( 1+3)-Gal-P-( 1+4)-Gal-P-( 1+4)-Glc-f-( 1 +Cer) Gal-a-( 1+4)-Gal-a-( 1-+4)-Gal-P-( 1+4)-Gal-B-( 1+Cer)

Tableau 13.1 Familles de glycosphingolipides neutres*. (* Tous les rsidus sont des pyranoses de la srie D.)

13.1.2 Glycolipides animaux


Les glycolipides neutres des tissus animaux (sans acide sialique) sont presque exclusivement des glycosphingolipides. Le classement en familles repose sur lenchanement des rsidus monosaccharidiques attachs la cramide. Lunit directement lie la cramide est dans la grande majorit des cas P-D-Glcp et exceptionnellement P-D-Galp. Le rsidu suivant est toujours P-D-Galp si bien que les familles les plus nombreuses de glycosphingolipides commencent par une unit P-lactosyl. Le tableau 13.1 nest gure mmorisable, mais il peut donner au lecteur une ide de la varit des structures que lon rencontre. On rencontre ces glycolipides ttrasaccharidiques, tels quels, ou avec des chanes de sucres raccourcies ou prolonges dans divers tissus de lhomme et des animaux suprieurs : le trihexoside globo 13.3 est le glycolipide le plus important des globules rouges humains ; le ttrahexoside lacto se prolonge en support des pitopes des substances de groupes sanguins, ABH, Lewis, Ii et Pi ; la famille muco porte les pitopes des groupes A et H. I1 est remarquable dobserver des glycolipides dont la charpente peut compter jusqu 20 units rptitives de N-actyllactosamine lies lune lautre par une liaison p ( I + 3), selon la formule schmatise 13.4.

13.1.3 Gangliosides
Cest le nom donn aux glycolipides sialyls. Le support de lacide sialique est gnralement un glycosphingolipide de la famille ganglio. La sparation de ces glycolipides et leur fractionnement en drivs mono-, di-, trisialiques, etc., repose sur leur caractre acide et utilise des colonnes dchangeurs danions (DEAEcellulose). Les acides sialiques prsents sont NeuSAc, Neu5Gc et leurs actates. Lhmatoside 13.5 est prsent dans le cerveau et les rythrocytes du chien. On le rencontre aussi sur les rythrocytes du cheval et du buf, o NeuSAc est remplac respectivement par NeuSGc et Neu4AcSGc. Le ganglioside le plus important du cerveau, appel GM1, est un produit de sialylation 13.6 du glycolipide ganglio du tableau 13.1 avec une liaison glycosidique a-(2+3).On observe aussi des

Glycolipides

215

Gala-( 1-4)-Gal-P -( 1-4)-Glcf -( 1-Cer)


13.3

-( 1 -4)-GlcNAc-P( 1

3)-Gai$ -( 1-4)-Glc-P -(1-Cer)

13.4

NeuSAca-(2-3)-Gal$ -( 1-4)-Glc-P-(1-Cer)
13.5

Gal$-( 1-3)-GalNAc-p-(1-4)-Gal$ -( 1-4)-Glc-P-(1-Cer)

t
Neu5Aca-(2-3)
13.6

NeuSAc-a-(2-8)-NeuSAca-(2-3)13.7

Neu5Ac-a-(2-8)-NeuSAc-a-(2-8)-NeuSAc-a-(2-3)13.8

squences polysialyles avec liaison inter-sialosidique a-(2+8) 13.7 et 13.8, accroches en 3 du mme galactose non terminal du glycolipide ganglio, et des prolongements sialiques et disialiques analogues partir de la position 3 du galactose terminal non rducteur. Pour conclure, aussi bien dans la famille des glycosphingolipides que dans celles des gangliosides, il y a une trs grande varit de structures des oligosaccharides construit sur les chanes de base. Signalons la prsence de L-fucose sur certains et desters sulfuriques. Dans la synthse des gangliosides, le couplage de lunit rductrice est pratiqu sur un prcurseur azido de la cramide, par la mthode au trichloractimidate (voir le paragraphe 10.3.2).

13.1.4 Glycolipides vgtaux


Nous nous bornerons mentionner les galactosylglycrols 13.9 et 13.10.

216

Glycoconjugus

Gal-$-( 1 -O-CH,
CHOCOR

Gala-( 1 -6)-Gal-p-( 1-0- H,

CH,OCOR
13.9

CH,OCOR
13.10

(TOC0

13.2 GLYCOPROTINES[3] 13.2.1 Gnralits


On appelle glycoprotines des protines lies de faon convalente des oligosaccharides. I1 y a un grand nombre de preuves que ces branchements oligosaccharidiques sont lorigine de proprits biologiques importantes ; le lecteur en trouvera de nombreux exemples dans les chapitres suivants. Les glycoprotines sont omniprsentes dans le monde vivant, soit comme composs solubles, soit lies aux parois cellulaires, soit intrieures aux cellules, soit dans les fluides extracellulaires. Pour leur extraction et leur purification, on utilise les mthodes de la chimie des protines, mais la prsence des sucres permet dutiliser un outil supplmentaire dune grande puissance, la chromatographie daffinit sur une lectine immobilise. Les lectines (voir le chapitre 15) sont des protines, animales ou vgtales, mais facilement accessibles lorsquelles viennent du rgne vgtal, qui se combinent rversiblement des monosaccharides ou des squences doligosaccharides. A chacune correspond un ligand sucre spcifique. Une colonne de lectine immobilise retient spcifiquement la glycoprotine laquelle est attach ce ligand. Clution a lieu avec une solution du ligand spcifique (une petite molcule) qui dplace la glycoprotine des sites de reconnaissance de la lectine. Six sucres participent larchitecture des oligosaccharides des protines animales totalement labores : galactose, mannose, N-actylglucosamine N-actylgalactosamine et acide sialique, de la srie D, et fucose, de la srie L, tous sous forme pyranosique. I1 y a deux types principaux de jonction au polypeptide, qui peuvent dailleurs parfois coexister dans la mme glycoprotine. Dans tous les cas, on cherche sparer loligosaccharide aussi peu dgrad que possible et on analyse sa squence par les mthodes exposes au chapitre 9. La squence contigu la jonction sappelle le << cur B de loligosaccharide. Le concept de cur13] trouve sa justification dans lobservation quil ny a quun trs petit nombre de curs. Chacun se prsente comme un << invariant >> au sein dune grande multiplicit de formes.

13.2.2 Protines glycosides


Loligosaccharide est engag son extrmit << rductrice >> dans une liaison glycosidique avec un des rsidus chane latrale hydroxyle du polypeptide. Ce

Glycoprotines

217

+ +
CH,OH
CH3
13.11 13.12 13.13

.CO,

13.14

13.15

sont ceux qui drivent de la L-srine, 13.11, de la L-thronine, 13.12, de la L-hydroxylysine, 13.13, et de la L-hydroxyproline, 3.14. La formule 13.15 reprsente un type de jonction extraordinairement rpandu, sur la L-srine (R = H) ou la L-thronine (R = CH,). Dans certaines glycoprotines, lunit P-D-Gal est remplace par P-D-GalNAc. A partir de ce disaccharide, des prolongements et des ramifications conduisent une trs grande varit de structures. Pour les dterminer, il faut dtacher loligosaccharide du polypeptide. Lhydrolyse catalyse par une enzyme protolytique large spcificit, la pronase, peut ventuellement librer un glycopeptide, cest--dire loligosaccharide encore li lacide amin de jonction, mais parfois loligosaccharide exerce une fonction de protection contre la protolyse enzymatique. Le mode de clivage le plus caractristique des glycosides des rsidus L-srine et L-thronine est llimination p en milieu alcalin. Cest une consquence attendue de la labilit du proton a du carbonyle amidique, qui est dcroch par la base B (Fig. 13.1.a). Malheureusement, on ne sarrte pas l. Le sucre dont la fonction rductrice a t libre est en quilibre avec le tautomre aldhydique, qui prsente lui aussi un proton a acide, et il se produit une nouvelle limination p (Fig. 13.1.b), et ainsi de suite. Cest le (( pelage , que lon tche dviter en oprant en prsence de NaBH,, avec lespoir que la rduction du carbonyle aldhydique sera plus rapide que llimination P. La synthse du disaccharide peptide correspondant 13.15 pose le problme de la glycosidation cis 1,2. On utilise le disaccharide activ groupement azido non participant 13.16, qui est condens sur une srine ou une thronine protge sur lazote et le carboxyle, avec le mlange promoteur AgC10,/Ag,C03. Pour rdui-

218

Glycoconjugus

CHO

CHO

C-OH

+
(CHOH),

Il

H
Figure 13.1 Elimination thronine.

( a ) et << pelage D ( b ) des glycosides de la srine et de la

13.16

Arg-Ser-Ala-Gly-Ala-GIy GalNAccl13.17

re le groupement azido en amino avant la N-actylation, on utilise H,S. On peut aussi prolonger du cot du polypeptide avec les mthodes habituelles de la synthse peptidiq~e'~] et obtenir, par exemple, 13.17.

13.2.3 Protines glycosaminides


Le sucre la jonction est la N-actylglucosamine et la structure partielle est 13.18, le sucre tant substitu comme on le verra un peu plus loin. On peut dcrire 13.18 soit comme une amide de glycosylamine drive de l'acide aspartique

Glycoprotines

219

CH,OCOCF, - H AcNH
13.18 13.19

NH-CO

NHCOCF, NHCOCF,

Man-p-( 1-4)-GlcNAc$ -( 1-4)-GlcNAc-p-(1-Asn)

I
Mana-( 1-3)
13.20

soit, de faon prfre, comme un produit de glycosylation de lasparagine. Une mthode pour dtacher loligosaccharide pas trop dgrad est la trifluoractolyqui consiste maintenir 2 j 100 dans un mlange danhydride et dacide trifluoractique, 50: 1. Coligosaccharide est perfiuoractyl et leffet inducteur des radicaux fluoractyles stabilise les liaisons interglycosidiques en dstabilisant lintermdiaire proton de lhydrolyse, formule partielle 13.19. Cependant, on coupe ainsi la liaison avec lasparagine. Un traitement rectificatif ultrieur du produit de coupure est ncessaire pour hydrolyser les groupements esters et amides de lacide trifluoractique et r-actyler lazote. Le cur des branchements sur lasparagine est un pentasaccharide 13.20. On trouve du ct rducteur deux rsidus N-actylglucosamine enchans comme dans le chitobiose, puis un rsidu p-mannose. Sur ce p-mannose sont attachs en 3 et 6 deux rsidus a-mannose. Selon la structure des prolongations et branchements sur ce cur 13.20, on distingue deux sous-familles principales. Dans la premire, on ne rencontre que des rsidus a-mannose. Dans la seconde, le pentasaccharide est substitu par un nombre variable de rsidus de N-actyllactosamine, Gal-O-( I -+4)-GlcNAc, avec en plus, des rsidus fucose, acide sialique, etc. Nous avons dj abord les problmes synthtiques relatifs ces oligosaccharides. Nous avons donn, propos des glycosylamines, la prparation des glucosides de lasparagine au paragraphe 3.6.2 et, comme exemple de synthse, par les mthodes enzymatiques, la synthse dune squence priphrique, 12.20.

220

Glycoconjugus

13.2.4 Problmes conformationnels


Dans les protines glycosaminides, loligosaccharide sattache une asparagine solidaire dun rsidu tripeptidique particulier, Asn-X-Ser (Thr). Mais tous les enchanements de ce type ne sont pas ncessairement glycosids. I1 y a dautres conditions apparemment lies la structure secondaire de la chane polypeptidique. En gnral, dans les protines, celle-ci adopte une conformation prfre o apparaissent des formes gomtriques varies : hlices, plis, tournants, pingles cheveux et boucles. Les squences de rsidus damino-acides au voisinage des sites glycosyls sont le plus souvent celles que lon observe dans certains tournants des chanes de protine (Fig. 13.2) et les autres sont au voisinage des boucles. Ce sont, en fait, des rgions plus accessibles du polypeptide, ce qui pourait expliquer la fois la glycosylation prfrentielle et le rle important de loligosaccharide, trs expos, en diverses circonstances. Ce que nous venons de dire sapplique aussi aux protines glycosides. En ce qui concerne la conformation de loligo~accharide[~], qui a certainement une importance capitale dans les problmes de reconnaissance, un certain nombre de phnomnes significatifs se manifestent. Les rsultats proviennent de mesures de RMN avec des techniques modernes perfectionnes, en particulier par la mesure de leffet Overhauser, de calculs de modlisation et de la comparaison avec la structure ltat solide du trisaccharide 13.21. Les valeurs des angles didres <p et y, qui caractrisent la liaison interglycosidique (voir le paragraphe 9.2) sont conformes aux prdictions de la thorie de leffet exoanomrique. La glycosida-

O Y21

0-0-0-0-0

f
Jfo~:-o-o-o
145
0-0-0-0-0-0-0

do--

.sr
\

P
Figure 13.2 Reprsentation partielle de la sous-unit 0 de ihormonocorticogonadotropine, glycoside aux rsidus acides amins 121, 127, 132 et 138. Daprs J. Montreuil, Adv. Curbohydr Chem. Biochem., 37 (1980) 157-223 (publi avec laimable autorisation de Academic Press).

Glycoprotines

221

Mancl-( 1-3)-Man-P-( 1-4)-GlcNAc


13.21

13.22

13.23

Figure 13.3 Conformations au point de ramification du cur des glycosaminides des protines A : GlcNAc ;B : Ma@( 1 4); C : Manx-( 1 -6) ;D : Mana-( 1 -3) ; E : GlcNAcP-(1 4).

Gal$ -( 1-4)-GlcNAc-p-(1 -2)-Mana-(1-6) Min@-(1 -4)-GlcNAc$ -( 1-4)-GlcNAc Gal-P-( 1-4)-GlcNAcQ -( 1-2)-Mana-(1-3)


13.24

tion sur les fonctions alcool primaire introduit de la flexibilit, cause des possibilits de rotation autour de la liaison C(5)-C(6). Ainsi le ttrasaccharide 13.22 (Fig. 13.3) qui reprsente le point de branchement du cur des oligosaccharides lis lasparagine, adopte-t-il la conformation esquisse, o lon voit lunit Mana-(1-6) (C) se replier sur GlcNAc. Dans certains oligosaccharides, dits << bissects , il y a une substitution supplmentaire sur O(4) du mannose central. Dans le modle 13.23, on observe que le rsidu C se retourne alors vers le nouveau substituant GlcNAc (E). On a pu prciser aux rayons X la structure solide complte dune immunoglobuline IgG, (voir le paragraphe 15.2) cristallise. Nous nous bornerons esquisser la topologie de lensemble constitu par les deux chanes lourdes et les deux molcules de dcasaccharide 13.24 lies un rsidu asparagine que porte chacune delles. La figure 13.4 montre que les dcasaccharides se trouvent sur la face interne du croissant form par les deux chanes lourdes et se font vis--vis, mais sans contact. Le disque B reprsente le point de branchement, Man-0-

222

Glycoconjugus

Figure 13.4 Disposition du dcasaccharide 13.24 lintrieur des deux chanes F, de Iimmunoglobuline IgG,. A* : chitobiose de jonction ; B, C, D identiques la figure 13.3 : Man-B-(1-4) ; Man-a-(I-6) ; Man-a-( 1-3).

(1+4). Le disque A* correspond au chitobiose accroch lasparagine. Lintrt considrable de la conformation vient du rle dissymtrique jou par les deux trisaccharides identiques lis en 3 et 6 du mannose. La chane flexible lie en 6 par lintermdiaire du mannose C repose sur une partie hydrophobe du polypeptide (riche en rsidus phnylalanine, valine, tyrosine). Lautre trisaccharide li par lintermdiaire du mannose D, au contraire, baigne dans leau de la cavit centrale et, apparemment, se comporte comme hydrophile. Le lecteur a dj vu au chapitre 11 les ambiguits des notions hydrophile-hydrophobe lorsquil sagit dun sucre.

13.3 GLYCOSAMINOGLYCANES ET PROTOGLYCANES 13.3.1 Donnes gnrales


Les macromolcules traites dans ce paragraphe sont essentiellement extracelMaires. En association avec les fibres de collagne (une glycoprotine), elles contribuent la nature, la structure et la rigidit des tissus. Ce sont des associations sucres-protine comme les glycoprotines, mais elles sen distinguent de faon assez caractristique pour quon les range dans une classe particulire. La proportion de protine est gnralement faible et peut descendre jusqu 2 %, alors quil y a 50-95 % de sucre. Cependant, ce point de vue l, les limites entre les deux catgories de glycoconjugus sont floues. Ce qui est plus caractristique, ce sont les longues chanes linaires des protoglycanes, construites par la rptition dun motif disaccharidique priodique. Parfois des altrations en apparence alatoires restreignent la priodicit au sens strict, mais elle reste clairement discernable sous les modification^[^]. On appelle << glycosaminoglycane )) le polysaccharide et << protoglycane )) le conjugu entier. Comme les glycoprotines, les protoglycanes comportent soit des liaisons glycosaminides impliquant la L-aparagine, soit des liaisons glycosides sur loxygne alcoolique de la L-srine ou de la L-thronine. La chane priodique, ou pseudopriodique, ne saccroche pas directement sur la protine, mais il y a un oligosaccharide de cur, comme dans les glycoprotines.

Glycosaminoglycanes et protoglycanes

223

La liaison sur la L-asparagine a lieu par l'intermdiaire d'un oligosaccharide riche en mannose, qui est probablement le mme, 13.20, que dans les glycoprotines. Par contre, la structure de cur la plus frquente sur L-srine et L-thronine est tout fait diffrente, 13.25. Le lecteur remarquera les units P-D-xylopyranosyle et P-D-glucuronopyranosyle.La longue chane est lie l'oxygne O(4) de l'unit P-D-glucuronopyranosyle. On reviendra sur ces structures au chapitre 17, propos de l'hparine, qui appartient cette famille.

13.3.2 Chanes priodiques ou quasipriodiques


L'acide hyaluronique a la structure fondamentale 13.26. I1 peut y avoir plusieurs milliers d'units disaccharidiques. Dans la chondrotine 13.27, la N-actylglucosamine est remplace par la N-actylgalactosamine. I1 y a deux drivs naturels sulfats de la chondrotine. Dans l'un, l'unit disaccharidique est sulfate sur O(4) et, dans l'autre, sur O(6) du rsidu N-actylgalactosamine, 13.28 et 13.29. Les chanes sont considrablement plus courtes que dans l'acide hyaluronique (10-60 priodes). Dans le dermatane-sulfate, on retrouve le motif de base 13.28

OH n
13.26

13.27

R=R'=H 1 3 . 2 8 R= SO,H, R = H 1 3 . 2 9 R= H, R'= SO,H

224

lK# b
Glycoconjugus

OS0,H

CH,OH

NHA(

OH
13.30

$ H m ; o H q

OH
13.31

NHAc
n

mais un certain nombre de molcules de rsidus D-glucuroniques ont subi une inversion de configuration sur C(5), ce qui donne un rsidu L-iduronique et un motif de base 13.30. La fraction transforme varie de quelques units 100 %. La structure de glycosaminoglucane de l'hparine est expose au chapitre 17. Le kratane-sulfate est exceptionnel. Le motif 13.31 ne comporte pas de fonction acide carboxylique, la liaison interne est p( 1-4) et la liaison avec le reste de la chane p( 1+3). La condensation est faible (10 ou bien 30-50 motifs). Ce polysaccharide est structuralement une chane poly-(N-actyllactosamine) comme nous en avons dj rencontres aux paragraphes 13.1 et 13.2, sulfate sur O(6) de GlcNAc.

'

RFRENCES
[ 11 I. M. Morisson, c< The Glycolipids and Gangliosides D dans Carbohydrate Chemistry,

sous la direction de J. E Kennedy, Clarendon Press, Oxford, 1988, chapitre 5. [2] Y.T. Li et S. C. Li, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 40 (1982) 235-244. [3] J. Montreuil, Adit Carbohydr. Chem. Biochem ; , 37 (1980) 157-223. [4] H. Paulsen,Angew. Chem. Znt. Ed. Eng., 29 (1990) 823-839. [SI A. M. Jansson, M. Meldal et K. Bock, Tetrahedron Lett., 48 (1 990) 6987-6990. [6] B. Nilsson et S. Svensson, Carbohydr: Res., 72 (1979) 183-190. [7] J.F. Kennedy et C.A. White, << The Glycosaminoglycans and Proteoglycans >> dans Carbohydrate Chemistry, sous la direction de J. E Kennedy, Clarendon Press, Oxford, 1988, chapitre 8.

CHAPITRE 14

Structure de quelques complexes sucre-protine cristalliss

14.1 GNRALITS. LE COMPLEXE ABP-L-ARABINOSE 14.1.1 Protines et sucres


Nous rencontrons dans ce livre quatre types de protines qui sassocient aux sucres : les enzymes de mtabolisme des sucres, les lectines, les anticorps spcifiques et les protines de transport. On a pu cristalliser un nombre important de ces protines et les examiner aux rayons X pour dterminer leur structure tertiaire. Compte tenu de leur masse molculaire leve, lanalyse des spectres de diffraction est un travail difficile. Cependant, on est guid par la connaissance de la structure primaire, cest--dire lenchanement peptidique, obtenue par les procds chimiques. Le pouvoir de rsolution des mthodes est en moyenne de 2,5 A. I1 est meilleur dans les exemples que nous donnerons. La connaissance de la structure de la protine ne donne que des prsomptions sur celle du complexe, dautant plus quil peut y avoir des modifications de conformation la complexation. On a pu obtenir ltat cristallis certains complexes protine-sucre et dcrire leur structure avec des degrs de rsolution comparables. En gnral le site rcepteur sur la protine est une cavit allonge, plus ou moins profonde, mais le reste de la protine semble minemment variable suivant sa fonction biologique[]. On connat et on a tudi des combinaisons cristallines appartenant aux quatre types de protines mentionns ci-dessus. Dans le domaine des enzymes, mentionnons le complexe entre le poly-N-actylchitobiose et le lysozyme, enzyme capable dhydrolyser les parois bactriennes, qui a six sites rcepteurs, et entre une maltodextrine et la takaamylase, enzyme qui hydrolyse lamylose et peut sassocier une unit hexasaccharidique. Ces tudes ont une importance capitale pour llucidation du mcanisme de lhydrolyse enzymatique. Cependant, comme il sagit darticles dj anciens que le lecteur non cristallographe aura quelques difficults jauger, nous prfrons renvoyer aux commentaires qui en ont t faits]. Cesprit de ce chapitre est de dcrire avec prcision lenvironnement immdiat du sucre et cest en fonction de ceci que nous avons choisi les exemples. Nous recommandons au lecteur dexaminer les vues stroscopiques et en couleur des mmoires originaux.

226

Structure de quelques complexes sucre-protine cristalliss

14.1.2 Le complexe protine ABP-L-arabinose

Un groupe amricain[l] r2] a considr avec normment dattention un complexe du L-arabinose avec une protine dite ABP (arabinose-binding protein), qui a pu tre dcrit avec une rsolution de 1,7 A. Les auteurs pensent que les modes de liaison quils ont observs ont une valeur gnrale. Cest pourquoi nous commenceront ce chapitre par un expos simplifi de leurs conclusions, bien que le Larabinose ne participe pas des phnomnes de reconnaissance chez les animaux suprieurs. Une famille assez tendue de protines, localises dans lespace priplasmique des bactries gram-ngatives, complexent certaines petites molcules et permettent leurs transport actif travers la paroi cellulaire ou le dclenchement de mouvements chimio-tactiques. Chacune de ces fonctions implique une interaction ultrieure avec des protines membranaires spcifiques. Les molcules transportes sont des acides amins, le sulfate, des mono- et oligosaccharides. Ainsi la protine ABP (arabinose-binding-protein) complexe le L-arabinose M), la protine MBP complexe le maltose (Kd 35 x et les (Kd 0,98 x maltodextrines. Cest dans cette srie quon trouve les liaisons les plus fortes observables entre sucre et protine. La vitesse de dissociation (k.i 1,5s-) indique la limite suprieure de la vitesse du transport ionique.

Les liaisons hydrogne


Elles jouent un rle trs important dans le complexe ABP-L-arabinose : tous les groupements polaires sont utiliss. Dune faon gnrale, les hydroxyles sont les groupements fonctionnels caractristiques des sucres, ils ont des orientations fixes, sont bien exposs et peuvent collaborer chacun 3 liaisons hydrogne, une comme donneur, deux comme accepteur. Les variations de langle didre H-C-O-H permettent ltablissement de la structure la plus favorable. La participation la complexation des liaisons hydrogne fortement directives expliquent la spcificit de linteraction. On rencontre trois types de systme de liaison hydrogne. Dans les liaisons hydrogne coopratives, lhydroxyle du sucre est simultanment donneur et accepteur selon le schma :

NH

+ OH -+

Les atomes NH et O font partie du site de complexation. Dans les liaisons bidentes, deux hydroxyles contigus, en disposition quatoriale-quatoriale ou axiale-quatoriale, ferment un cycle sur deux atomes dun groupement polaire plan, selon la disposition 14.1. La formation des liaisons coopratives et bidentes cre un rseau dense de liaisons hydrogne entre le sucre et les rcepteurs essentiels. Ces liaisons sont fortes. La distance moyenne entre les atomes lourds, donneur-accepteur, est 2,82 (0,15) A, et langle moyen 164 (9). Les rsidus groupes plans polaires, Asn, Asp, Glu, Gln, Arg et His sont particulirement reprsents dans les sites rcepteurs (la lysine nest utilise quune fois). Ces groupes sont lis rigidement

Gnralits. Le complexe ABP-L-arabinose

227

H , N .

/ - -

NH

Glu 14

Figure 14.1 Schma du rseau de liaisons hydrogne dans le complexe L-arabinose ABP. Daprs F. A. Quiocho, Pure Appl. Chem., 61 (1985) 1293-1306 (publi avec laimable autorisation de International Union of Pure and Applied Chemistry).

et leur adaptation finale au sucre ne peut tre ralise que par un changement conformationnel de la protine. Une proprit commune de toutes ces protines priplasmiques est leur capacit complexer les anomres a et p sans diffrence visible. Ceci sexplique facilement par le schma des liaisons hydrogne. Lalignement trs prcis de lun des oxygnes de laspartate lui permet daccepter une liaison hydrogne aussi bien de lanomre a que de lanomre p, sans aucune perturbation du reste du rseau, 14.2. La figure 14.1 donne un schma topologique du rseau de liaisons hydrogne. La conformation du sucre est reste normale, 4C,, dans le complexe.

Forces de Van der Waals

Tous les atomes lourds du L-arabinose sont en contact de Van der Waals (d < 4 A) avec ceux de la protine-hte. I1 y a peu prs 54 contacts en tout, nombre inhabituellement lev, d au rseau dense de liaisons hydrognes. Celuici entrane une grande compacit. La face << hydrophobe >> a du pyranose, o dominent les liaisons C-H, repose en partie sur le noyau indolique du tryptopha-

228

Structure de quelques complexes sucre-protine cristalliss

Asn 232

\p/

H\

O
I

N H ,
'

O H -\ '

/O H
14.1

HO

O
H

Asp 90

O
14.2

O
Il

Try 16
14.3

H
14.4

'

Il

ne 16. Sur la formule 14.3, cet indole est reprsent par la trace de son plan de symtrie horizontal.

14.2 COMPLEXE DU MALTOSE ET DE LA PROTINE DE TRANSPORT DE LA MALTODEXTRINE 14.2.1 Description de la protine complexante
Elle comporte un enchanement de 370 acides amins, correspondant une masse molculaire de 40 622. Sa forme est celle d'un ellipsode, de dimensions 65 x 40 x 30 A, et elle est compose de deux domaines globulaires spars par un sillon profond. La figure 14.2 donne un mode de reprsentation de cette protine.

Complexe du maltose et de la protine de transport de la maltodextrine

229

Figure 14.2 Reprsentation conventionnelle de la protine de transport des maltodextrines. On reprsente les plis p par des flches. Lordre de succession des plis p dans la chane polypeptidique est donne par des lettres et celui des hlices par des chiffres romains. On a indiqu le site du maltose, au centre, par -. Extrait de J. C. Spurlino, G. Y. Lu et F. A. Quiocho, J. B i d . Chem., 266 (1991) 5202-5219 (publi avec les aimables autorisations de 1American Society for Biochemistry and Molecular Biology et des auteurs).

On la dcrit comme << une protine a l p >> o 40 % des acides amins sont engags dans des hlices a, 20 % dans des plis p et le reste forme des boucles ou des pelotes. On remarquera sur la figure 14.2 les deux domaines ingaux, appels N ( gauche) et C ( droite), selon quils contiennent lextrmit amine ou lextrmit carboxylique de la chane peptidique, spars par le sillon, ici peu prs vertical. La chane, partir de lextrmit amine, serpente dabord dans le domaine N, puis traverse le sillon pour sengager dans le domaine C au niveau des rsidus 110-113, retraverse le sillon en sens inverse au niveau des rsidus 268-271 et, aprs stre dveloppe dans le domaine N, retourne dfinitivement au niveau des rsidus 3 11-315 dans le domaine C o elle se termine. I1 y a donc trois tripeptides qui assurent la connexion entre les domaines et constituent en mme temps le fond de la crevasse. Ils apparaissent sur la figure 14.2 comme trois brins peu prs horizontaux au centre. Ces peptides de jonction sont aussi la charnire qui permet aux deux domaines de se rabattre lun sur lautre comme les coquilles dune hutre. En effet, alors que le systme CO-NH est rigide, il y a des possibilits de rotation autour du carbone situ entre NH et CO, 14.4.

14.2.2 Complexation des maltodextrines


La protine de transport que nous venons de dcrire complexe toute une famille de maltodextrines. Les paramtres thermodynamiques et cintiques sont ras-

230

Stnicture de quelques complexes sucre-protine cristalliss

sembls dans le tableau 14.1. I1 est remarquable qu'il y ait si peu de variations du maltose aux cyclodextrines. Les trois premiers complexes du tableau ont t obtenus l'tat cristallis.

Maltose Maltotriose Maltottraose Maltopentaose Maltohexaose Maltoheptaose a-Cyclodextrine* P-Cyclodextrine

35 16 23
50

90 8,4

34 16 40 18

110 46

Tableau 14.1 Complexes des maltodextrines avec la protine de transport du maltose. D'aprs E A. Quiocho, Pure Appl. Chern., 61 (1989) 1293-1306 (publi avec l'aimable autorisation de l'International Union of Pure and Applied Chemistry).Kd constante de dissociation, k , et k.+ vitesses de complexation et dcomplexation. (* : voir le paragraphe 11.3.)

14.2.3 Mode de complexation du maltose


Au niveau actuel d'laboration, la conformation du maltose complex parat trs voisine de celle du maltose libre solide (Fig. 14.3)L3]. La conformation de chaque cycle est D-4C,. Les angles didres sont O(5') - C(1') - O(1') - C(4) = +116" et C(1') - O(1') - C(4) - C(3) = +122". L'angle glycosidique C(1') - O(1') - C(4') vaut 120". I1 y a une liaison hydrogne intermolculaire O(3) - H - O(2'). Le rcepteur des maltodextrines ressemble une crevasse dont les parois (hauteur 18 A) sont les domaines N et C et dont le fond (surface 9 x 18 A2) est constitu par les trois segments peptidiques de jonction et l'hlice XIII. Les dimensions de cette cavit sont suffisantes pour lui permettre d'hberger des cyclodextrines (voir le paragraphe 11.3), comme la P-cyclodextrine (diamtre 15,4 A, hauteur 7,9 Lors de la complexation du maltose au fond de la crevasse, les deux parois se rapprochent l'une de l'autre en pivotant autour de la charnire constitue par les peptides de jonction L51. Ce mouvement correspond une rotation de 35". Le maltose est enseveli, au point que, de sa surface (545,5 A2), il n'y a plus que 3,6 % qui reste accessible au solvant. La complexation utilise des rsidus de chacune des parois et du fond de la crevasse.

Liaisons hydrogne
Comme avec le L-arabinose, 1' attachement est essentiellement d des liaisons hydrogne. Celles-ci sont presque exclusivement accroches aux groupes polaires

Complexe du maltose et de la protine de transport de la maltodextrine

231

Figure 14.3 Structure du maltose ltat solide. Daprs G. A. Jeffrey et M. Sundaralingam, Adv. Curbohydr: Chem. Biochem., 38 (1981) 417-529 (publi avec laimable autorisation de 1Academic Press). Dans le texte, les numros 3 et 4 correspondent au rsidu rducteur et les numros 1 et 5 au rsidu non rducteur.

de chanes latrales. On observe ici une diffrence avec le mode de complexation du sulfate, ltat anionique, qui lui sassocie essentiellement aux NH des liaisons peptidiques. Lassociation du maltose a lieu au moyen de 16 liaisons hydrogne, 11 correspondant une liaison directe avec les rsidus acides-amins et 5 probablement par lintermdiaire de molcules deau (Fig. 14.4). Les seuls oxygnes non lis sont les oxygnes cycliques et interglycosidiques. Neuf des liaisons hydrogne directes stablissent entre lhydroxyle neutre du sucre et des rsidus chargs : carboxylate, ammonium, guanidinium. On retrouve enfin la disposition prcise dun rsidu aspartate, qui permet la complexation aussi bien du maltose a que du maltose p avec une gale efficacit.

Contacts Van der Waals


I1 y a environ 65 contacts de Van der Waals (< 4A). La plupart doivent tre considrs comme des consquences indirectes des liaisons hydrogne, qui tendent crer ldifice le plus compact possible. Presque toute la face a de lunit

232

Structure de quelques complexes sucre-protine cristalliss

Figure 14.4 Rseau de liaisons hydrogne du maltose complex. On na pas reprsent les liaisons par lintermdiaire dune molcule deau. Daprs J. C. Spuriino, G. Y. Lu et F. A. Quiocho, J. Biol. Chem., 266 (1991) 5002-5219 (publi avec les aimables autorisations de 1American Society for Biochemistry and Molecular Biology et des auteurs).

terminale non rductrice repose sur le noyau indole du tryptophane 340. La liaison glycosidique et une partie de la face a de lunit rductrice reposent sur le noyau phnyle de la tyrosine 155. Ces faces a des glucopyranoses constituant le maltose appeles parfois << faces hydrophobes >> prsentent une srie de liaison C-H sur leur surface.

14.3 LE COMPLEXE DUNE LECTINE ET DUN OCTASACCHARIDE BIANTENNAIREr6]


Cette lectine est 1 Isolectine I , isole des graines de Lathyrus Ochrus. Elle prsente deux sous-units identiques, composes chacune dune chane lgre de 52 acides amins et dune chane lourde de 181 acides amins. Chaque sous-unit contient un ion Ca++ et un ion Mn++, ncessaires lactivit. Les ligands examins sont des fragments du dodcasaccharide-asparagine 14.5 prsent dans la lactotransfrine humaine : le mannose, le trisaccharide 234 et loctasaccharide 23456456.On a pu obtenir les complexes ltat cristallis. On soccupera ici du complexe avec loctasaccharide, dont on a pu prparer un cristal de 0,3 m m et donner la structure avec une rsolution de 2,3 A. Nous nous bornerons des reprsentations schmatiques, topologiquement correctes de la molcule, laccent portant ici essentiellement sur la nature des liaisons. Le lecteur qui dsire plus de prcision est invit examiner les vues stroscopiques colores des articles
I71.

Le complexe dune lectine et dun octasaccharide biantennaire

233

NeuSAc-a-(2-6)-Gal-P-( 1-4)- GlcNAc-B-( 1-2)- Man-a-( 1-3)


I 1

3 Man-P-( I -4)-GlcNAc-[3-( 1 -4)-GlcNAc-P-( 1-Am)

t
NeuSAc-a-(2-6)-Gal-P-( 1-4)- GlcNAc-P-(l-2)- M a n a - ( 1-6)
6

Fucc-(l-h)
1

14.5

(4

(b)

Figure 14.5 Disposition (a) des molcules doctasacchariclc CI CIL\cations Ca++Mn++ sur la lectine de Lathyrus Ochru., et dtail (b) montrant les units libres et complexes (Adapt de Y. Bourne, P. Roug et C. Cambillau, J. B i d . Chem., 1992, 267, p. 197).

La figure 14.5.a donne la disposition relative de chaque sous-unit de la lectine, des deux molcules doctasaccharide et des deux paires Ca++, Mn++. Les sucres sont voisins des extrmits du grand axe de ldifice. En 14.5.b, on a reprsent plus en dtail la disposition du sucre au voisinage de la lectine. La complexation change peu la configuration de celle-ci, sauf quune boucle peptidique, 208-21 1 se rapproche de 0,s A de Man-4. Ce mannose occupe une poche localise prs de Ca++,dite << le site de liaison du monosaccharide . Loctosaccharide complex la forme dun S tir (Fig. 14.6). Cinq des angles didres 0 et cp (voir le paragraphe 10.2) correspondent des minimum dnergie selon les ides reues sur leffet exoanomrique. La liaison a (1-3) entre Man-3 Dans le complexe du fragment plus et Man-4 correspond un simple 234, la conformation est trs diffrente, ce qui montre quun petit fragment nest pas ncessairement un bon modle[*]. La complexation est assure par une multiplicit de liaisons polaires (< 3 A). I1 y a 14 liaisons hydrogne directes entre les oxygnes ou azotes du sucre et les groupements polaires des rsidus acides amins et 7 ralises par lintermdiaire dune molcule deau. De plus, 14 molcules deau sont impliques dans des

234

Structure de quelques complexes sucre-protine cristalliss

Figure 14.6 Reprsentation schmatique de loctosaccharide complex. Adapt de A. Imberty, M. M. Delage, Y. Bourne, C. Cambillau et S. Perez, Glycoconj. J., 8 (1991) 456-483. La flche indique lemplacement du phnyle enserr comme par une pince par entre Man-4 et GlcNAc-5.

contacts indirects, entre le sucre et la lectine, ou entre les units conscutives du sucre (Tableau 14.2). Dans ce dernier cas le rsultat est une stabilisation de la conformation. A ceci contribuent en plus 18 liaisons hydrogne, dont une directe et 17 indirectes. En raison de la spcificit leve des lectines, on doit sattendre ce que la complexation fasse intervenir les liaisons hydrogne, qui ont un carac-

Liaisons directes

Liaisons directes

Man 4

o(3)

O(4) O(4)
O(5)

O(6) O(6) O(6)

Gly-99 ASP-81 Gly-99 Asn- 125 Asp-8 1 Gly-208 Ala-209


Glu-2 1O

GlcNAc 5 GlcNAc 5 Gal-6

0(5) 0(5)

O(6)
0(3)

N(2)
0(2)

Asn-39 Ala-209 Tyr- 124 Tyr-77 Glu-210 Tyr 77

Liaisons par lintermdiaire dune molcule deau

GlcNAc 5 Glc NAc 5

N(2)
O(4)

Gal-6

O(5)

Asn 39 Gly-98 Tyr-77 Val-79 Thre-122 Arg- 135 Tyr-124

Tableau 14.2 Description sommaire des liaisons hydrogne entre loctasaccharide et la lectine de Luthyrus Ochrus.

Rfrences

235

tre directif. La nouveaut importante dans cette dtermination de structure est lobservation de la participation massive de molcules deau la complexation. Le complexe est galement stabilis par 68 contacts de Van der Waals (< 4 A), dont 27 avec des rsidus aromatiques. On observe principalement ces contacts entre les cycles aromatiques et les atomes C(5) - C(6) des sucres. Les units Man-4 et GlcNAc-5 interagissent de part et dautre des deux faces du cycle phnyle de Phe-123, quelles enserrent comme une pince (Fig. 14.6). Les deux units qui les sparent, Man-3 et Man-4, sont exposes au solvant. De mme, GlcNAc-2 et Gal-6 sont compltement exposs au solvant. Ceci apparat plus clairement la figure 14.5.b.

RFRENCES
[il E A. Quiocho, Annu. Rev. Biochem., 55 (1985) 287-315. [2] E A. Quiocho, PureAppZ. Chem., 61 (1989) 1293-1306. [3] G. A. Jeffrey et M. Sundaralingam, Adv. Curbohydl: Chem. Biochem., 38 (1981) 417529. [4] J. C. Spurlino, G. Y. Lu et E A. Quiocho, J. B i d . Chem., 266 (1991) 5202-5219. [5] A. J. Sharff, L. R. Rodseth, J. C. Spurlino et E A. Quiocho, Biochemistry, 31 (1992) 10657-10663. [6] Y. Bourne, P. Roug et C. Cambillau, J. Biol. Chem., 267 (1992) 197-203. [7] Y. Bourne, P. Roug et C. Cambillau, J. Biol. Chem., 265 (1990) 18161-18165. [8] A. Imberty, M. M. Delage, Y. Bourne, C. Cambillau et S. Perez, GZycoconj. J., 8 (1991) 456-483.

CHAPITRE 15

Antignes et anticorps. Lectines

15.1 AVERTISSEMENT
Les lecteurs qui ont reu une formation biochimique ou mdicale reconnatront de suite que les paragraphes 15.2 et 15.3 ne se situent pas au mme niveau que les autres exposs de ce livre. Cet expos sommaire de limmunochimie est destin avant tout aux lecteurs qui ont suivi le cursus traditionnel en chimie organique. Actuellement une forte proportion des chimistes travaillant sur les sucres ont des relations plus ou moins troites avec des groupes dimmunologistes. Dans cet ouvrage mme, des termes tels que antigne, anticorps, anticorps monoclonal, dterminant, pitope, etc., se rencontrent en diffrents paragraphes ; il est fait galement rfrence certaines mthodes analytiques de limmunologie quantitative. La lecture des paragraphes 15.2 et 15.3 doit donner au chimiste organicien une vision plus concrte de ces notions et de ces expriences. On espre ainsi faciliter le dialogue avec les immunologistes.

15.2 ANTIGNES ET ANTICORPS


Lintroduction dune macromolcule trangre dans la circulation sanguine dun vertbr suprieur (souris, lapin, cobaye, mouton, chvre.. .) peut ventuellement susciter lapparition dans le srum dune collection de protines particulires. Cest le plus souvent un mlange htrogne de molcules doues dune proprit commune : elles se combinent de faon non covalente la macromolcule qui a entran leur apparition. On dit alors que cette macromolcule sest comporte comme un antigne dans les circonstances exactes de lexprience et les protines ractives apparues dans le srum sappellent anticorps. I1 faut prciser le protocole de linjection - molcule homogne, ou lie un support macromolculaire, ou solidaire dune paroi cellulaire - et lanimal inject - lapin, souris, etc. - car une mme molcule peut tre antignique ou non suivant les conditions de son administration. Ltude de la structure des anticorps a t possible grce une technique, dcrite plus loin dans ce chapitre, qui a permis dobtenir des protines homognes. Ces protines appartiennent la famille gnrale des globulines, les immunoglobulines I,. Elles se rpartissent en classe et sous-classes sur lesquelles nous reviendrons.

Antignes et anticorps

237

446

YOOH

COOH

Figure 15.1 Reprsentation schmatique dune immunoglobuline.

Elles sont toutes bties selon le mme plan gnral, donn la figure 15.1 dans le cas particulier dune << ig A . I1 y a deux sous-units identiques relies par des ponts disulfure. Chaque sous-unit comprend deux chanes polypeptidiques relies par un pont disulfure, une chane dite lourde H (M = 50 000) et une chane dite lgre L (M = 23 000). I1 y a deux domaines dans la chane lgre. Un domaine variable VL, dont la squence varie en fonction de la spcificit antignique de limmunoglobuline, stend sur environ la moiti de la chane, du ct N amino . Lautre domaine, du ct e carboxylique >> CL, est constant. Au sein du domaine variable VL, on rencontre des rgions c hypervariables D reprsentes par des traits noirs. Ces rgions hypervariables sont dans les boucles qui relient les plis p. La conformation particulire du polypeptide dans le domaine variable a pour effet de ramener ces rgions hypervariables au voisinage les unes des autres et une extrmit de ldifice. De mme, la chane lourde comporte un domaine variable VH avec des rgions hypervariables rejetes vers lextrmit, qui stend sur le quart de sa longueur, puis un premier domaine constant CH1 jusqu une rgion charnire qui contient deux ponts disulfure qui la relient lautre chane lourde. I1 y a ensuite deux autres domaines constants CH2 et CH3. A ce niveau se trouve un oligosaccharide. Une protolyse limite au voisinage de la charnire spare deux fragments identiques appels Fab, composs chacun dune chane L et des domaines VH et CH1 de la chane H. Ce fragment Fab

238

Antignes et anticorps. Lectines

conserve les proprits dassociation avec les antignes. Lautre moiti de la chane H, appele Fc, est la partie responsable de certaines proprits immunologiques de limmunoglobuline, autres que la combinaison directe avec lantigne. Ce sont les rgions hypervariables des chanes L et H, voisines les unes des autres dans les immunoglobulines qui constituent le site dinteraction - le site de reconnaissance - de lantigne par lanticorps. On voit quil y a deux sites de reconnaissance dans limmunoglobuline de la figure 15.1. I1 y a cinq classes de chanes H, p, 6, y, E et a, auxquelles correspondent cinq classes dimmunoglobulines, IgM, IgD, IgG, IgE et IgA. I1 y a deux types de chanes lgres, K et h. Certaines immunoglobulines sont circulantes ; certaines jouent le rle de rcepteur la surface de certaines cellules sanguines ; ou prsentent ces deux comportements. Ladaptation de lanticorps lantigne est parfois dune trs grande finesse, ce qui peut laisser perplexe, car lanimal immunis sest trouv confront des molcules qui lui taient totalement trangres et, mme parfois, des substances organiques sans aucun rapport avec le monde vivant. Tout se passe comme sil stait agi pour lui dun costume coup par un excellent tailleur mais ce nest quune illusion, car le costume est un costume de confection, achet dans un magasin o il y a en stock lo8 patrons diffrents et o il est procd ultrieurement des retouches. Nous allons dcrire sommairement le mcanisme. Les cellules responsables de la fabrication des anticorps anti-sucres, auxquels nous nous intressons principalement sont les lymphocytes B. I1 y a au moins IOs clones de lymphocytes B, cest--dire de populations, chacune trs restreinte, issues dune seule cellule mre. Les cellules dun clone dtermin, qui sont toutes identiques, fabriquent et expriment leur surface une immunoglobuline caractristique. Les cellules dun autre clone fabriquent une immunoglobuline diffrente. I1 y a donc autant dimmunoglobulines que de clones distincts, soit environ 1Os. Lantigne se fixe sur les sites rcepteurs des Ig pour lesquels il a la plus grande affinit. Cette fixation dclenche la prolifration des lymphocytes porteurs de ces immunoglobulines reconnues, et lexpansion du clone bien au-del de ses dimensions primitives. Les lymphocytes B ainsi activs se diffrencient en plasmocytes, qui scrtent dans le srum limmunoglobuline complmentaire de lantigne, et en cellules mmoire. Enfin, un taux de mutation lev de ces cellules a pour consquence une amlioration constante de la finesse de ladaptation antigne-anticorps. Ce sont les << retouches D dont nous laisserons de ct le mcanisme. Dans ces conditions, on comprendra aisment lhtrognit des anticorps. Sur les IO8 molcules dimmunoglobulines entre lesquelles lantigne doit faire un choix, il y en aura en gnral plus dune dont la complmentarit lantigne sera suffisante pour dclencher la prolifration du lymphocyte porteur. Aussi le srum de lanimal immunis contient-il un mlange danticorps issus de clones diffrents, que lon appelle un anticorps polyclonal. Ses proprits varient avec le temps et le calendrier des injections. I1 peut y avoir encore une autre source dhtrognit, cest la prsence de plusieurs sites antigniques chimiquement diff-

La raction immunochimique in vitro

239

rents sur la molcule dantigne. Plusieurs techniques trs fines dmontrent lhtrognit de lanticorps polyclonal, mais la sparation des constituants monoclonaux en quantit suffisante pour tudier leurs proprits nest pas praticable. La prparation des anticorps monoclonaux repose sur un autre principe. Le lecteur reconnatra au passage que, comme dans toutes les autres branches, plus traditionnelles, de la chimie, lobtention de composs purs est source de progrs considrables. Nous avons vu que limmunisation avec un antigne Ag amne la prolifration de clones de lymphocytes B, chacun spcialis dans la production de lun des anticorps anti-Ag, soient X, X, X, etc. Si lon pouvait cultiver ces cellules in vitro, des mthodes prouves permettraient de sparer ces clones. Malheureusement il nest pas possible de cultiver les lymphocytes B in vitro. On a tourn la difficult en utilisant les proprits dune ligne de cellules mylomateuses. Le mylome multiple est une maladie qui rsulte de la transformation maligne dun clone unique de plasmocytes, dont la prolifration seffectue essentiellement dans la moelle osseuse. Ces cellules synthtisent et excrtent une immunoglobuline monoclonale. On peut les propager indfiniment par culture. En les fusionnant avec les cellules de la population de lymphocytes activs par lantigne, on obtient les hybridomes, des cellules hybrides, cultivables in vitro, et exprimant lune des immunoglobulines X, X , X,.. . Les tapes successives de la prparation de lanticorps monoclonal X ltat pur sont les suivantes. On immunise des souris avec lantigne. On recueille les lymphocytes B en prlevant la rate de lanimal et on les mlange avec les cellules mylomateuses dans une solution aqueuse 50 % de polythylneglycol, pH 8,O. Aprs quelques heures, on a un mlange dhybridomes avec les deux types de cellules dorigine. Les cellules de la rate non hybrides meurent en un ou deux jours. Quant aux cellules mylomateuses, elles ont t gntiquement programmes pour quon puisse les tuer slectivement. Ne restent que les hybridomes exprimant les immunoglobulines X, X, X,... I1 faut vrifier cette tape que ces cellules sont effectivement productrices danticorps. La dernire tape est le clonage, technique qui permet de prparer des cultures homognes, issues chacune dune seule cellule et exprimant chacune un anticorps monoclonal dtermin.

15.3 LA RACTION IMMUNOCHIMIQUE IN VITRO


Le lecteur aura compris en lisant le paragraphe prcdent que limmunisation dun animal pour obtenir un anticorps polyclonal et la sparation de ses constituants en units monoclonales homognes font appel des techniques apparentes la biologie. En revanche, ltude de lassociation entre antigne et anticorps chimiquement dfinis in vitro est typiquement une branche de la chimie, science dont le domaine doit recouvrir toute espce de combinaisons, mme si elles nimpliquent pas de liaisons covalentes. Sauf indication contraire, il ne sera plus question dans la suite que danticorps monoclonaux.

240

Antignes et anticorps. Lectines

15.3.1 Haptnes
Nous avons dcrit en termes gnraux, au paragraphe 15.1, le site rcepteur des immunoglobulines, constitu par le rapprochement des boucles hypervariables lextrmit des chanes L et H. Nous allons maintenant nous proccuper du site complmentaire sur les antignes. I1 peut y avoir plusieurs sites antigniques chimiquement diffrents (ou de conformations stables diffrentes) sur une mme molcule dantigne et on retrouvera alors les anticorps correspondants mlangs dans Iantisrum. On arrive ventuellement reconnatre la nature chimique des sites dans certains cas. Cette squence particulire de lantigne sappelle un dterminant antignique, nom quelques fois remplac dans les textes modernes par pitope. I1 peut arriver que cet pitope soit un rsidu oligosaccharidique et que loligosaccharide libre correspondant soit disponible par ailleurs, partir dune source naturelle ou par synthse. Cette petite molcule, ajoute une solution de lanticorps monoclonal suscit contre la grosse molcule de lantigne, se combine rversiblement cet anticorps. I1 y a plusieurs dmonstrations de cette association, dont lune repose sur les expriences dinhibition dcrites plus loin. Cependant elle nest pas antignique et ne suscite pas la formation dun anticorps quand elle est introduite dans la circulation sanguine. Pour tre antignique, une molcule doit avoir une masse molculaire dau moins 3000 D et de prfrence suprieure 10 000 D. I1 arrive quon puisse tourner la difficult en attachant loligosaccharide de faon covalente une macromolcule transporteuse, le plus souvent une protine, par exemple la srumalbumine bovine. Lattachement a lieu en utilisant les fonctions des chanes latrales des rsidus acides amins de la chane peptidique, presque toujours les fonctions amines. I1 est vident que le problme a un grand nombre de solutions. Cune dentre elles consiste prparer un glycoside 15.1 de lester mthylique de lacide 9-hydroxynonanoque qui est transform en azoture dacyle 15.2 par des traitements successifs classiques par lhydrazine et lacide nitreux. Ces drivs ragissent sur les amines primaires pour donner une amide et, de cette faon Ioligosaccharide est fix selon le schma par-

15.1 R=OMe 1 5 . 2 R=N,

15.3

La raction immunochimique in vitro

241

tiel 15.3. Naturellement, il y a beaucoup de chanes latrales amines dans la srumalbumine bovine, donc beaucoup de molcules doligosaccharide fix. I1 y aura ainsi plusieurs pitopes dun mme anticorps. Lantigne est dit multivalent. Cette petite molcule couple un support macromolculaire pour susciter la formation dun anticorps sappelle un haptne. La technique de fixation du haptne sur un transporteur macromolculaire a permis la prparation danticorps dirigs contre un grand nombre de structures chimiques, certaines totalement trangres lconomie du monde vivant. Un inconvnient de cette technique, cest quelle suscite galement la formation danticorps dirigs contre la molcule transporteuse et parfois lancre daccrochage.

15.3.2 Physicochimie de la raction immunochimique


Les forces de la liaison impliques sont des attractions lectrostatiques entre sites chargs, comme un site -NHi port par la lysine et un carboxylate, des forces de Van der Waals et des liaisons hydrogne. On prvoit que les deux premiers types de force, qui augmentent rapidement quand la distance diminue, seront dautant plus efficaces que meilleure sera la complmentarit. On parle aussi dinteractions hydrophobes, du fait quune exacte complmentarit chasse les molcules deau entre les sites correspondants. Ces interactions pourraient se manifester entre les rsidus << hydrophobes , valine, leucine, phnylalanine, etc. Cette notion, dveloppe au chapitre 11, sous-entend que la diminution de laire de contact de ces rsidus avec leau est en elle-mme un facteur favorable. Toutes ces interactions sont rversibles : si on introduit un complexe haptne-anticorps en solution dans un sac dialyse, le haptne peut seul diffuser travers la paroi et son limination de la solution intrieure au sac entrane la dissociation complte par dplacement de lquilibre. La raction dun site de lanticorps Ab avec une molcule de haptne H (ou de lantigne monovalent de mme spcificit) est quilibre, avec une constante k fonction de la temprature (15.1) et il lui correspond une variation denthalpie libre donne par (1 5.2)

(15.1)

Ab+H

k12
k12

Ab-H

[Ab - H] [Ab] [HI =

( 1 5.2)

AG = - RT log k

La vitesse de lassociation est toujours trs grande, k , , = lo6 - 108 mol- s-. Comme il y un large ventail de constantes dquilibre k , gales k,,lk,,, il y a un talement comparable des valeurs de k,,. En fait la situation est loin dtre aussi simple : il y a deux sites de combinaison lantigne sur les immunoglobulines IgG, IgD et IgE, mais pour les deux autres, il peut y avoir association de plusieurs units fondamentales Ig analogues celle qui est esquisse la figure 15.1, si bien quil y a dix sites de combinaison

242

Antignes et anticorps. Lectines

lantigne sur les IgM et deux ou quatre sur les IgA. On dit que ces anticorps sont dca-, di- ou ttravalents. Les antignes et les conjugus haptniques peuvent aussi tre multivalents. Par exemple, sur un antigne artificiel prpar par couplage dun haptne avec une protine, il peut y avoir un site de combinaison li chaque rsidu lysine de la molcule porteuse. Les polysaccharides bactriens, dont ltude est une branche importante de limmunochimie, sont constitus dunits oligosaccharidiques rptitives. I1 peut y avoir jusqu 40 sites de combinaison. La raction entre antigne et anticorps multivalents est donc trs complique et donne des produits de composition continment variable en fonction des proportions de ractif. Elle est non stchiomtrique. Les formules (15.3) et (15.4) nont pas un sens physicochimique rigoureux, mais dcrivent approximativement une moyenne de sous-ractions.

(15.3)
AG = - RT log k (15.4) On peut toujours calculer un chiffre k, partir des concentrations mesurables [Ag-Ab] de lantigne libre et combin. Ces valeurs de k , comprises entre IO3 et 10 mol-, sont une mesure pratique de laffinit de lanticorps pour lantigne. Dans ces situations de liaisons multiples on emploie la place daffinit le mot << avidit , pour mieux souligner le caractre empirique des mesures. La multivalence de lanticorps et de lantigne entrane une augmentation notable de k. On peut le comprendre qualitativement : la rupture dune liaison sur un seul site ne rompt pas lassociation, puisquil y a encore des liaisons en dautres sites daccrochage. On calcule que AG varie de -6 -11 kcal mol- et AH, de -4 - 13 kcal mol-. Lentropie dassociation est presque toujours positive. Mme un pitope parfaitement dfini sur une molcule dantigne entrane la formation de plusieurs anticorps monoclonaux, qui diffrent les uns des autres par la structure du site de combinaison et laffinit. Cest trs comprhensible daprs le mcanisme de multiplication expos au paragraphe 15.2. Ce quil faut noter maintenant, cest que la spcificit de chacun de ces anticorps monoclonaux nest pas rigoureuse. Elle est souvent leve, mais on peut observer aussi lassociation avec des molcules voisines. Dans ce cas-l, la constante dassociation est plus faible. Par exemple, un pitope oligosaccharidique peut correspondre un enchanement de six rsidus monosaccharidiques (hexasaccharide). Avec lantigne monoclonal spcifique de cet enchanement, on observera encore des associations, avec constantes daffinits rapidement dcroissantes, des pentasaccharides, ttrasaccharides, etc. obtenus en laguant un, deux rsidus monosaccharidiques, etc. partir dune extrmit de lhexasaccharide. Par ailleurs, si la suppression, par exemple, dun hydroxyle, en un point dtermin dun oligosaccharide par une mthode chimique, change peu - ou ne change pas du tout - lassociation avec lanticorps correspondant, on en conclut quil ne participe pas la liaison. Comme lanticorps ne << voit D que le nuage lectronique frontire du haptne. on peut imaginer des rpartitions datomes et donc une molcule radicalement diffrents

La raction immunochimique in vitro

243

auxquels cet anticorps sassociera tout aussi bien quavec le haptne, parce quils offrent une frontire approximativement identique la combinaison. I1 y a des exemples, mais cet aspect na pas t tudi systmatiquement. On a mis profit lexistence de ces ractions croises dans la technique des anticorps catalytiques. Lide fondamentale est de stabiliser ltat de transition dune raction, donc dabaisser son nergie dactivation, en lassociant un anticorps spcifique. Naturellement il est impossible de manipuler comme un haptne un difice hautement instable comme un tat de transition. On le remplace donc par une molcule stable, dont lextrieur est aussi voisin que possible de la priphrie (suppose !) de ltat de transition. Les anticorps ainsi prpars acclrent les ractions et fonctionnent comme des enzymes. On a forg pour ces immunoglobulines le nom dabzyme. On en a prpar une cinquantaine ce jour.

La raction de prcipitation
Les chimistes organiciens connaissent bien les ractions de polycondensation entre molcules bifonctionnelles et molcules au moins trifonctionnelles, par exemple entre lanhydride phtalique et la glycrine. I1 se forme alors un rseau tridimensionnel. Cest la mme situation lorsquon oppose un antigne multivalent une immunoglobuline, il se produit un enchevtrement de macromolcules qui devient rapidement insoluble dans leau. Cependant, il y a une diffrence notable avec la polycondensation industrielle, cest que lassociation est rversible dans les conditions de la raction. Supposons quon ajoute progressivement lantigne lanticorps en solution aqueuse. Au dbut, il y a un excs danticorps et les associations peuvent tre symbolises par Ab-Ag, AbAg,, puis laddition du ractif polyfonctionnel Ag entrane une rticulation et il se produit un prcipit. Celui-ci augmente graduellement, tout en changeant de composition, sil est en quilibre avec la solution, jusqu la composition stchiomtrique n o tous les sites de combinaison de lantigne et de lanticorps sont utiliss. Si lon poursuit laddition dantigne au-del de ce stade, on observe la dissolution progressive du prcipit. Cest une consquence de la rversibilit de lassociation : la raction (15.5) indique comment un excs dantigne produit la rupture de lassociation de deux molcules danticorps lies par lintermdiaire dune molcule dantigne au moins divalent.

(15.5) R - Ab - A g - A b - R + Ag R - Ab - Ag + Ag - Ab - R On progresse jusqu la dpolymrisation complte et la redissolution. En accord avec ce mcanisme, on nobserve pas de prcipitation avec les antignes monovalents, ni avec certaines immunoglobulines, qui sont devenues monovalentes la suite du blocage interne de lun des deux sites actifs par une squence oligosaccharidique attache de faon covalente leur chane polypeptidique.

La raction dagglutination
Nous nous retrouvons ici la limite de la biologie, mais cette raction doit tre cite cause de son extrme sensibilit. Les molcules antigniques peuvent par-

244

Antignes et anticorps. Lectines

fois sexprimer naturellement, avec une densit particulirement leve sur les rythrocytes. Ainsi il y a lo6 dterminants A de groupe sanguin sur la surface des hmaties A,. Ces cellules donnent des suspensions modrment stables, et ne se sdimentent que lentement. En prsence danticorps anti-A, il y a rticulation en de nombreux points entre des molcules dantigne solidaires de cellules diffrentes, ce qui provoque la formation dagglomrats qui sdimentent rapidement. Les IgM dcavalentes sont particulirement efficaces.

Dosages danticorps et dantignes Nous ne donnerons ici que les principes et le lecteur trouvera des exemples dapplication dans les chapitres 16 et 17. La pese directe du prcipit centrifug ou lestimation de son poids par dosage de sa teneur en azote ne semblent pas adaptes au recherches modernes, qui ncessitent de doser des pg dantigne et danticorps. Cependant on a pu laborer une mesure fonde sur la prcipitation. Le dosage dun anticorps en milieu liquide utilise lantigne spcifique marqu par un traceur, maintenant gnralement 251,Ag*, ajout en excs. La combinaison Ag*Ab, soluble dans ces conditions, est spare par prcipitation, par le sulfate dammonium 50 % ou par un anticorps anti-lg gnral. On mesure la radioactivit du prcipit. Pour doser lantigne, on commence de la mme faon par faire la combinaison Ag*Ab en solution avec un excs dAg*. On ajoute la solution de Ag doser, do lquilibre (15.6).
(15.6) Ag*Ab+Ag AgAb+Ag*

On mesure le rapport de la radioactivit lie la radioactivit libre et on fait une courbe dtalonnage pour une srie de concentrations de lantigne Ag. Cette technique se prte aussi la comparaison de laffinit dune srie de petites molcules H pour le rcepteur antignique sur lanticorps. Celles-ci dplacent partiellement lantigne de la combinaison (15.7). (15.7) Ag*Ab + H
__T

Ag* + HAb

Laffinit de H pour le site de combinaison de lantigne sur lanticorps Ab sera caractrise, par exemple, par la molarit ncessaire pour observer SO % dinhibition de la combinaison e authentique >> AgAb. On peut aussi prsenter le rsultat plus compltement comme la courbe donnant le % dinhibition en fonction de la molarit de H. I1 faut souligner que, pour ces essais, le chimiste doit donner limmunochimiste des chantillons ayant le maximum de puret possible, car laffinit peut varier de un mille dans une srie, cest--dire que un millime dun analogue trs actif dans un compos moins actif fausse compltement les conclusions. On fait maintenant beaucoup danalyses en phase solide. Par exemple, lantigne est adsorb la surface de cupules de plastique et, aprs laddition de la solution danticorps, un lavage spare lanticorps li de lanticorps libre.

Les lectines : dfinitions, extraction

245

15.4 LES LECTINES : DFINITIONS, EXTRACTION


Initialement, on a donn le nom de lectines[lL2] des protines, ou glycoprotines, presque exclusivement extraites des graines vgtales pouvant sassocier rversiblement des molcules de sucre. On a aussi ds le dbut class avec les lectines certaines prparations faites partir de fluides animaux, provenant par exemple de languille, de lescargot comestible ou de la limace. Puis le terme sest tendu toute une srie de protines ayant de laffinit pour les sucres, ayant les origines les plus diverses. Par exemple, il y a dans le srum de lapin une glycoprotine, la cruloplasmine, dont les chanes oligosaccharidiques se terminent par un rsidu sialique, en position terminale non rductrice, port par un rsidu galactose pnultime. La dsialylation de cette glycoprotine entrane sa rapide absorption par les cellules hpatiques. Ceci est d la prsence dans ces cellules dune lectine qui retient les molcules possdant un rsidu galactose en position terminale non rductrice. Ces << lectines >> animales sont assez nombreuses et ont probablement des fonctions biologiques importantes. On trouve aussi des protines capables de lier rversiblement les sucres chez les bactries et les moisissures. Donc, le terme de lectine recouvre une catgorie plus tendue quau dbut, cependant on exclue de cette catgorie les enzymes de mtabolisme des sucres, les anticorps anti-sucres et les protines de transport des sucres. Nous ne dcrirons dans ce chapitre que les lectines traditionnelles. On trouvera des exemples de lectines animales, les slectines, au paragraphe 17.6. Presque toutes les mthodes actuelles disolement et de purification des lectines reposent sur la chromatographie daffinit. Bien sr, il faut dterminer lavance le ligand caractristique. On peut utiliser la proprit des lectines de prcipiter certaines macromolcules et dagglutiner certains types de cellules, animales ou vgtales. Le moteur de la raction est lassociation avec certains rsidus, gnralement monosaccharidiques, solidaires de la macromolcule ou de la priphrie cellulaire. Lorsquune activit de ce type a t reconnue, on recherche quel est le sucre qui peut linhiber la concentration molaire la plus basse possible. Comme dans le cas des prcipitation5 immunochimiques, cette inhibition est due loccupation du site de reconnaissance par la petite molcule soluble. Une fois le ligand le plus efficace dcouvert, on lattache par une liaison covalente stable une macromolcule insoluble et inerte et on monte une colonne chromatographique avec ce matriau. Dans certains cas, on peut remplir directement les colonnes avec des absorbants commerciaux qui contiennent la structure du ligand. Le << Sephadex , base de dextrane, polysaccharide rsidus a-glucopyranosyle retient les lectines spcifiques de cette configuration. On peut aussi employer directement la chitine, polysaccharide insoluble rsidus B-N-actylglucosamine, ou Iagarose. Parmi les supports utiliss pour fabriquer des conjugus, notons lagarose (spharose), la polyacrylamide (BioGel P) et lamidon. Pour isoler une lectine vgtale, on moud les graines en farine trs fine, que lon traite dabord par des solvants organiques (mthanol, ther) pour enlever les matires grasses. On extrait ensuite les protines par des solutions salines ou des

246

Antignes et anticorps. Lectines

tampons et on concentre la lectine par les oprations habituelles de prcipitation au sulfate dammonium, redissolution, etc. Pour la purification finale, on fait percoler la solution de lectine travers la colonne daffinit. La lectine est retenue sur le remplissage par son association avec le ligand combin solidaire de ce remplissage. Aprs lavage de la colonne, on dcroche la lectine par lution avec une solution du mme ligand soluble, qui dplace lquilibre dassociation. Un certain nombre de lectines, extraites de graines peu coteuses par des oprations simples, sont dun accs trs facile. Par exemple, on a pu isoler 3 g de la lectine << Concanavaline A >> partir de 100 g de farine de fve Jack. Cette facilit daccs aux lectines, jointe la multiplicit de leurs proprits a eu comme consquence une norme littrature. I1 ne semble pas possible de fonder une nomenclature des lectines sur la structure. La nomenclature propose par Goldstein[] associe lorigine botanique aux configurations reconnues classes par affinits dcroissantes. Par exemple : Lectine de Canavalia ensiformis (a-D-Manp > a-D-Glcp > a-D-GlcNAcp), Lectine de Triticum vulgaris (P-D-GlcNAcp-( 1+4)-P-D-GlcNAcp - (1 +4)D-GlcNAc > B-D-GlcNAcp-( 1-4)-D-GlcNAc >> P-D-GlcNAcp). I1 sagit respectivement de la lectine de la fve Jack et de celle du germe de bl. Malheureusement cette nomenclature dpend du raffinement exprimental. Comparez le nom de la lectine de la fve Jack donn ici (1978) et celui du paragraphe 15.5.3 (1986). 15.4.1 Structure On prendra comme exemple la Concanavaline A, abondante dans la farine de la fve Jack. La purification finale utilise labsorption sur une colonne de Sephadex, dont la lectine est dsorbe par une solution de glucose. La Concanavaline A est forme de quatre sous-units, M 26 500 daltons, associes en dimres au-dessous du pH 5.6 et en ttramres au-dessus. Chaque sous-unit contient un ion Mn2 +,un ion Ca2 et un site de liaison au sucre. La figure 15.2 indique leur mode dassociation, avec lemplacement des ions et du site de combinaison. Une partie trs importante des chanes polypeptidiques existe sous la forme de plis P. Cest par ces rgions que seffectue lassociation entre monomres. On peut enlever les ions minraux par traitement avec HC1 O. 1 N, suivi de dialyse contre de leau distille. Cette limination abolit lactivit. On a identifi le site de combinaison par examen aux rayons X du complexe cristallis avec le mthyle a-D-mannopyranoside. I1 se situe 7 A et 11 A, respectivement, des ions Ca2+ et Mn2+. Les rsidus dacides amins les plus voisins semblent tre deux tyrosines, deux acides aspartiques, une asparagine, une leucine, une srine et une arginine. Cette numration semble indiquer une cavit nettement hydrophile. En fait, on observe que la fixation du ligand dissimule deux carboxyles par sous-unit vis--vis dun certain nombre de ractifs, par exemple dans le titrage acidim+

Les lectines : dfinitions, extraction

247

Figure 15.2 Reprsentation schmatique du ttramre de la Concanavaline A. Les sites des par Mn, ions Mn++et Ca++et le site dassociation du sucre sont dsigns Ca et S. Extrait de J. W. Becler, G. N. Reeke Jr., B. A. Cunningham et G. M. Edelman, Nature, 259 (1976) 406-409 (publi avec les aimables autorisations de Nature et des auteurs ; O 1976 Macmillan Magazines Limited ; nous remercions le Dr Edelman pour sa coopration).

trique. Les carboxyles en question pourraient tre ceux des rsidus aspartiques voisins du site de combinaison. Examinons maintenant les autres lectines. On observe frquemment la prsence disolectines. Ce sont des molcules lgrement diffrentes, mais avec les mmes proprits dassociation, que lon isole simultanment partir dune source naturelle dtermine. Ainsi la sparation chromatographique des protines activit agglutinante du germe de bl (250-500 mgkg) montre que cette activit est rpartie sur quatre fractions dont les compositions en acides amins sont presque identiques. Par ailleurs, ni les lectines du germe de bl ni la Concanavaline A ne sont lies de faon covalente des sucres, alors que beaucoup dautres lectines sont des glycoprotines. I1 leur arrive de prsenter une proportion trs leve de sucres. Par exemple, on extrait de la pomme de terre (Solanum ruberosum) une lectine (38 mg pour 4,5 kg de tubercules) qui est spcifique des oligosaccharides lis la chitine : P-D-GlcNAcp-( 1 +4)-[P-D-GlcNAcp-( 144)], - P-D-GlcNAc (n = 1 ou 2) Cette lectine est une glycoprotine, qui contient environ 50 % de son poids de sucre.

248

Antignes et anticorps. Lectines

Comme la Concanavaline A, la grande majorit des lectines sont des associations de sous-units. Elles sont parfois identiques, parfois diffrentes, souvent au nombre de quatre, mais parfois plus ou moins (deux). Ainsi chacune des deux isolectines de la lentille (Lens culinaris syn. esculentu) est dcompose en quatre sous-units en milieu acide ou dans lure 8M. 1 1 y a des chanes << lourdes >> H (M 17570D) et << lgres >> (M 57 10 D). Chacune des deux isolectines se prsente comme une association par liaison non covalente de deux chanes H et deux chanes L, conduisant une masse molaire voisine de 46 O00 D. Les lectines du germe de bl sont des dimres dunits (M 21 600) dissociables par les dnaturants ou en conditions de pH extrmes. Par contre, les sous-units de la lectine des graines de ricin (Ricinus communis) sont associes de faon covalente par des ponts disulfure et on doit utiliser un rducteur, comme le mercaptothanol, pour les sparer. Enfin la prsence dions Mn2+ et Ca2+,indispensables lactivit de la concavaline A, a t reconnue dans un certain nombre dautres lectines.

15.4.2 Spcificit
La spcificit des lectines sexprime par des associations solubles avec des petites molcules de sucres, ou des oligosaccharides, par des ractions de prcipitation avec des oligosaccharides et enfin par des ractions dagglutination de cellules vgtales ou animales. Les divers niveaux de spcificit sont apparents, par exemple avec les cellules sanguines. Certaines lectines les agglutinent toutes ; dautres lectines sont spcifiques de lespce de lanimal et dautres encore spcifiques de son groupe sanguin. On peut analyser de faon quantitative les associations qui ne conduisent pas une prcipitation avec les sucres simples et leurs drivs, et les oligosaccharides, par la mthode de dialyse lquilibre. La solution de ligand est verse dans les deux compartiments spars par la membrane et la lectine est ajoute dun ct seulement. A lquilibre, la concentration en ligand libre est la mme dans les deux compartiments et on la mesure commodment dans celui o il ny a pas la lectine. Les constantes dassociation varient de lo2 lo5 M-l. I1 est intressant de comparer la constante dassociation dun ligand monosaccharidique, ou de son alkyl glycoside avec lanomrie convenable, avec celle dun oligosaccharide o ce ligand occupe une position terminale non rductrice. La comparaison semble indiquer que le site de reconnaissance de la plupart des lectines correspond un seul rsidu glycosyl. Toutefois, avec plusieurs lectines, di- et tri-saccharides sont de meilleurs ligands que les monosaccharides, ce qui indique une interaction qui stend au-del dun seul rsidu. Ainsi la Concanavaline A reconnat essentiellement la-D-mannose, cependant les associations sont respectivement 4 et 20 fois plus fortes avec les di- et tri-saccharides a - D - M a y - ( 1-+2)-D-Man et a-D-Manp-( 1+2)-a-D-Manp-( 1+2)-D-Man quavec le mthyle a-D-manno-pyranoside. Ce type denchanement se rencontre dans les glycoprotines. Dans presque tous les cas, dans les associations entre lectine et oligosaccharide ou glycoprotine, lassociation la plus importante du point

Les lectines : dfinitions, extraction

249

de vue de lnergie de liaison a lieu avec le sucre terminal non rducteur. Plus rarement, elle a lieu avec rsidus monosaccharides en ramification sur une chane principale. Par exemple, la Concanavaline A reconnat les units a-D-mannopyranosyl et a-D-glucopyranosyl terminales dans une chane oligosaccharidique, mais galement les ramifications a-D-mannopyranosyl branches en position 2 dun sucre de la chane principale. Certaines lectines ne sassocient efficacement qu un anomre donn ; dautres sont plus ou moins indiffrentes la configuration anomrique du rsidu reconnu. La lectine de soja (Glycine max) reconnat aussi bien les configurations a et p de la forme pyranosique de la N-actylgalactosamine. Sa dfinition par ses ligands scrit : a-D-GalNAcp 2 P-D-GalNAcp B a-D-Galp. I1 y a cependant une lgre prfrence pour lanomre a. De mme, un certain nombre de lectines tolrent des variations en position 2. On a remarqu cidessus que la Concanavaline A sassocie la fois au D-mannose et au D-glucose. Un certain nombre de lectines reconnaissent la fois le D-galactose et la N-actylgalactosamine, quoiquavec une prfrence marque pour lun ou lautre de ces deux sucres. On laura remarqu, ci-dessus, propos de la lectine du soja. En revanche, les lectines tolrent trs peu de variations sur les positions 3 et 4. I1 ny a pas de << ractions croises D entre les configurations D-gluco et D-gulucto, par exemple. Le mlange en solution aqueuse dune lectine avec un polysaccharide comportant des rsidus reconnus par cette lectine entrane en gnral une prcipitation, tout comme le mlange dune immunoglobuline avec lantigne correspondant. La Concanavaline A prcipite le dextrane, polysaccharide bti partir dunits a D-glucopyranose. I1 est possible doprer quantitativement ; on ajoute des quantits croissantes de polysaccharide des portions aliquotes de lectine, on centrifuge, on lave le prcipit et on procde au dosage dazote. On observe une courbe de prcipitation tout fait semblable celle que lon observerait dans une raction antigne-anticorps (voir le paragraphe 15.3) : il y a trois zones : au dpart, il y a excs de lectine et tout le dextrane est prcipit. A lquivalence, tout le dextrane et toute la lectine ont prcipit. Cest ce stade que lon observe le maximum de prcipitation. Un excs de dextrane solubilise le prcipit qui disparat.

15.4.3 Description abrge de quelques lectines[3]


Pour chaque lectine, on donne dabord sa description selon la nomenclature prconise. A la ligne suivante, on trouvera sa masse molaire et celle des sousunits ( a , p.. .) ainsi que le mode dassociation des sous-units, le nombre n de sites actifs et les mtaux ventuellement prsents. On termine par la constante dassociation avec un bon substrat.

Lectine de la f i v e Jack (Canavalia ensiformis)


a-D-Manp-( 1+2)-a-D-Manp-( 1+2)-D-Man > a-D-Manp (1 +2)-D-Man > a-D-Man > a-D-Glc > a-D-Glc NAc

250

Antignes et anticorps. Lectines

M 106000 ; a :26500 ; pH7 : a, ; pH5 : a2; n =4 ; Ca2+,Mn2+; ka 2,06 x lo4 M-' (2C) (mthyl a-D-mannopyranoside ; 3,6-di--a-Dmannosyl-D-mannose).

Lectines de Griffonia simplicifolia


Isolectine B, : a-D-Gal
>>

a-GalNAc ; lsolectine A, : a-D-GalNAc >> a-D-Gal

M 114000 ; a :32000, p :33000 ; cinq isolectines, A, (a,), A,B (a, p), A, B, (a, P Z > > AB, (a B3) et B, (P4) ; = 4 ; Ca++; Isolectine B, : Ka 2,06 x IO4 M-' (mthyle a-D-galactopyranoside) ; Isolectine A, : ka 1,87 x lo5 M-' (rsidu a-D-GalNAc en position terminale non rductrice ; ragit strictement avec les rythrocytes du groupe sanguin A).

Lectines du germe de bl (Triticum vulgare)


fi-D-GlcNAcp - (1 -+4)-p-D-GlcNAcp-( 1+4)-D-GlcNAc > fi-D-GlcNAcp (1-4) -D-GlcNAc >> D-GlcNAc M 43200 ; a : 21600 ; au moins trois isolectines ; pH > 4 : a2; solution acide : a;n=2 Ca++ ; K, 5,3 x lo4 M-' (20C) {(H+4)-[B-D-GlcNAcp -(1+4)l4 - (l+OH)) ; K , 1,3 x IO3 (4C) (D-GlcNAc).

Lectines du soja (Glycine max)


a-D-GalNAcp = 0-D-GalNAcp > a-D-Galp M 122000; a 30000 ; a,; n = 4 ; Ca++,Mn++ ; K , 3,0 x 104 M-1 ( 4 ~ ) .

Lectine de l'escargot (Helix pomatia)


a-D-GalNAc - (1+3)-D-GalNAc > a-D-GlcNAc p
>>

a-D-Gal

M 79000 ; a 13000 ; au moins douze isolectines ; a6; n = 6 ; ka 5 x lo3 M-'


(pentasaccharide du groupe sanguin A : a-D-GalNAcp - (1+3)-[a-LFucp (I+ 2)]-P-D-Galp-( 1+4)-fi-D-GlcNAcp -( 1+6)-R).

Lectines Z du gent (Ulex europaeus)


WL-FUC

Les lectines : dfinitions, extraction

251

M 60000 - 68000 ; a 29000, p 3 1O00 ; Ca++,Mn++,Zn++ ; Ka 3,l x lop3 M- (L-fucose).

Lectines de la limace (Limax flavu~)[~I


NeuSAc

M 44000 ( 2 x 22000) ; II =2 ; ka 3,8 x lo4 M- (Neu5Ac).

15.4.4 Proprits biologiques des lectines151


Nous ne reviendrons pas ici sur les proprits dagglutination de cellules dont nous avons dj parl au paragraphe 15.4.2. Une de leurs caractristiques les plus impressionnantes est leur pouvoir mitogne, cest--dire quelles dclenchent dans une colonie de lymphocytes, en tat de repos et de non division, un tat de croissance et de prolifration. Cet effet mitogne est presque toujours inhib par des sucres simples, de faon rversible, par exemple dans le cas de la concanavaline A. Signalons au passage quun certain nombre dagents autres que les lectines, mais galement capables de ragir sur les sucres priphriques des lymphocytes sont galement mitognes. Les lectines les plus utilises comme mitognes sont la Concanavaline A et la lectine de Phaseolus vulgaris. Contrairement aux antignes qui activent des clones spcifiques, les lectines agissent de faon indiscrimine sur une population approprie et la proportion de cellules stimules peut atteindre 80 %. On observe simultanment une stimulation gnrale de toutes les activits mtaboliques, mais aussi la scrtion dune famille de polypeptides actifs 1 est probable que la phase initiale de la stibiologiquement, les lymphokines. 1 mulation est lassociation de la lectine aux sucres de la surface cellulaire, mais lassociation napparat pas suffisante dans tous les cas. Il y a un certain nombre dautres proprits trs caractristiques, mais leur expos suppose des connaissances en hmatologie qui dpassent le cadre de cet ouvrage.

15.4.5 Comparaison des anticorps anti-sucres et des lectines


videmment cette comparaison simpose. La similitude tient en peu de mots : lectines et anticorps sont des protines (ou glycoprotines) possdant plusieurs sites dassociation rversible sur leur molcule, qui en font des ractifs de rticulation rversible. Donc avec les deux familles de molcule, on observe lassociation avec des mono- et oligosaccharides, la prcipitation des macromolcules polysaccharidiques et glycoprotines avec dissolution des prcipits en prsence dun excs de polysaccharides, et enfin lagglutination de cellules. Prcipitation et agglutination sont une consquence de la mutivalence des deux ractifs oppo-

252

Antignes et anticorps. Lectines

ss et sont inhibes en prsence du ligand mono- ou oligosaccharidique spcifique. Une autre consquence de la multivalence, observe avec lectines et anticorps, est laugmentation de laffinit apparente lorsque le substrat permet la rticulation. Ceci dit, les immunoglobulines sont construites sur un modle uniforme ou par association de molcules bties selon ce mme modle, tandis quil semble quil y ait une grande varit de structure dans les lectines. Dans le modle de base des immunoglobulines, les deux sites de reconnaissance sont solidaires de deux demi-molcules identiques lies entre elles par des ponts disulfure. En revanche, la lectine est une association de sous-units qui peuvent comporter ou ne pas comporter de site de reconnaissance et sont lies de faon non covalente, probablement grce des contacts entre des surfaces tendues de plis p.

RFRENCES
[il I. G. Goldstein et C.E. Hayes, Adv. Carbohydr: Chern. Biochern, 35 (1978) 127-340. [2] The Lectins, Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine, ouvrage collectif publi sous la direction de I. E. Liener, N. Sharon et I. J. Goldstein, Academic Press, New York 1986. [3] I. J. Goldstein, The Lectins, Properties, Functions and Applications in Biology und Medicine, op. cit., page 35. [4] R. N. Knibbs, S. E. Osborne, G. D. Glick et I. J. Goldstein, J. Biol. Ckern., 268 (1993) 18524-18531. [5] H. Lis et N. Sharon, The Lectins, Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine, op. cit., page 266.

CHAPITRE 16

Les antignes de groupes sanguins : substances A, B, H et connexes

16.1 LES ANTIGNES A , B ET HLi][2][3] 16.1.1 Gnralits. Polymorphisme


Les dterminants antigniques sont le trisaccharide A, 16.1, le trisaccharide B, 16.2, et le disaccharide H, 16.3. Le lecteur reconnatra que les trisaccharides A et B sont les produits de la glycosidation du disaccharide H sur la position 3 du galactose, par, respectivement, une unit N-actylgalactosamine et une unit galactose et dans les deux cas avec lanomrie a. Donc les dterminants A et B ne different que par leur substitution en 2 sur leur unit terminale non rductrice D-galacto, N-actyle dans la substance A, hydroxyle dans la substance B. On notera aussi la participation du sucre dsoxygn fucose et enfin les liaisons a cis1,2, moins frquentes que les liaisons p trans-1,2 dans les glycoconjugus. Ces diet trisaccharides sont situs aux extrmits terminales non rductrices des chanes oligosaccharidiques des glycoprotines et des glycolipides et, ventuellement, de leurs ramifications. Les individus du groupe A prsentent le dterminant A et une certaine quantit de H, mais non B, tandis que ceux du groupe B prsentent B et H mais non A, de faon symtrique. Les individus du groupe O ne prsentent que le dterminant H. Ceci suggre tout de suite une biosynthse incomplte, due labsence ou la non-expression des gnes qui codent les glycosyltransfrases A ou B. Les molcules porteuses se trouvent sur la paroi des rythrocytes et les dterminants sont exposs vers lextrieur. Chez les individus du groupe A, la molcule B est reconnue comme trangre et suscite lapparition dun anticorps anti-B. Pour la mme raison, dans le sang B, on trouve lanticorps anti A et dans le sang O les anticorps anti-A et anti-B. Les accidents observs lintroduction de la pratique des transfusions sanguines taient dus la prsence de ces anticorps. Ainsi le sang dun donneur du groupe A qui contient lanticorps anti-B produit lagglutination des rythrocytes dun receveur du groupe B, etc. Mais les antignes ABH sont galement prsents la surface des cellules de la majorit des organes et dans les scrtions. Ils sont une cause majeure de rejets de greffon donneur et receveur appartenant des groupes diffrents. Pour cette raison, on juge quon devrait galement leur donner le nom dantignes tissulaires.

254

Les antignes de groupes sanguins : substances A, B, H et connexes

Y
c H HP
16.1

HO

HO

16.2

16.3

Les antignes ABH prsentent un degr lev le phnomne de polymorphisme. Ceci signifie que les dterminants ABH peuvent tre ports par une multiplicit de molcules chimiques diffrentes. Les diffrences de structure lointaines nont pas de consquences sur la raction immunochimique A-anti-A, par exemple, mais les diffrences trs proches peuvent se manifester avec les techniques fines des anticorps monoclonaux. Les causes de polymorphisme sont : a) la nature de lantigne complet, glycolipide, ou glycoprotine glycoside, ou glycoprotine glycosaminide ; b) la squence de sucres sur la chane qui joint le cur du glycoconjugu aux dterminants antigniques et, tout particulirement, la prsence ou non de ramifications ; c) la nature de la jonction du dterminant Ioligosaccharide. Le lecteur qui prouverait ici et ci-dessous un sentiment de confusion devant ces formules peut se reporter au rsum pictural donn par la figure 16.6 en fin de chapitre.

16.1.2 Types de jonction. Le systme Lewis


On observe quatre modes de jonction du galactose G des formules 16.1 16.3 la chane porteuse du glycoconjugu, les << types H 1 4, rassembls dans le

Les antignes A, B et H

255

tableau 16.1. Nous soulignons que le galactose de gauche dans les formules du tableau 16.1 est le galactose G des antignes ABH. La rpartition de ces types de jonction disaccharidique est diffrente suivant la famille du glyconjugu porteur. Type 1 : Gal-P-(1-3)-GlcNAc-P-( 1 -R) Type 2 : Gal-P-(1-4)-GlcNAc-P-( I-R) Type 3 : Gal-P-(1-3)-GalNAc-a-(1-R) Type 4 : Gal-P-(1-3)-GalNAc-P-( 1-R)
Tableau 16.1 Les quatre types de jonction des dterminants ABH.

On rencontre les chanes de type 1 et 2 la fois sur les glycoprotines, glycosides ou glycosaminides et les glycolipides, la chane de type 3 surtout sur les protines glycosides et la chane de type 4 seuleiiicnt sur les glycolipides. La fucosylation enzymatique de la chane de type 1 donne les antignes du groupe Lewis. Par exemple, dans lantigne Lewis Lea, il y a un rsidu fucosyle sur la position 4 de GlcNAc, 16.4. Une seconde fucosylation donne lantigne Leb, qui est donc un produit difucosyl, 16.5. Les antignes du type 1 sont les principaux porteurs des dterminants ABH dans les fluides corporels et les scrtions. Ils ne sont pas synthtiss par les rythrocytes et les lymphocytes, qui nanmoins les absorbent partir du plasma et, de ce fait, les expriment. On observe les antignes du type 2 sur la peau et les rythrocytes. La fucosylation transforme le disaccharide du type 2 en dterminant H, mais on observe aussi dautres produits de fucosylation, 16.6 et 16.7, qui sont respectivement isomres des antignes Lea et Leb et ont reu le nom dantignes LeXet Ley. Le lecteur aura reconnu la N-actyllactosamine dans la chane de type 2. On observe la chane de type 3 comme disaccharide de cur des glycoprotines glycosides, 16.8. Le disaccharide-srine (thronine) est lantigne T et son prcurseur monosaccharidique lantigne T,,. Les dterminants ABH sont construits directement sur le cur disaccharidique. On a observ leur prsence sur la muqueuse gastrique et dans la glycoprotine des kystes de lovaire. Cest dans cette catgorie quil faut ranger lantigne << A priodique >> correspondant la squence 16.9. On voit que le dterminant A est construit sur un Gal$-( 1-3)-GlcNAc-P-( 1-R) Fuca-( 1-4)
16.4

Fuca-( 1-2)-Gal-P-(1-3)-GlcNAc-P-( 1-R) F u c a - ( 1-4)


16.5

Gal$-( 1-4)-GlcNAc-P-( 1-R) F u c a - ( 1-3)


16.6

Fuc-a-( 1-2)-Gal-P-(l-4)-GlcNAc-fi-( 1-R) Fuca-( 1-3)


16.7

256

Les antignes de groupes sanguins :substances A, B, H et connexes

Gal$ -( 1-3)-GalNAca-(1-O)-Ser/Thr
16.8

GalNAc-a-( 1-3)-Gal-B-(l-3)-GalNAcax-( 1-3)-G 1-p -( 1-4)-GlcNAc-p-(1-R) Fuca-( 1-2)

Fuc-cc-(~-~)
16.9

disaccharide de type 3. En fait, ce disaccharide est le produit de la galactosylation de lunit GalNAc a dun premier dterminant A. On a isol un certain nombre dantignes glycolipidiques A-priodiques et il est possible quils constituent plus de la moiti des substances dactivit A des rythrocytes. Naturellement, on ne trouve cet antigne que chez les individus A. En ce qui concerne la chane de type 4, elle apparat par galactosylation lextrmit terminale non rductrice de certains glycolipides, comme le globoside 16.10, ce qui donne le prcurseur 16.11. Les structures sous les accolades dans la formule 16.10, P, pk et p sont trois des quatre dterminants antigniques du systme de groupe sanguin P. Les dterminants ABH peuvent se construire sur le galactose terminal non rducteur du globoside prolong 16.11. La majorit des antignes ABH des reins appartiennent cette famille. Daprs ce qui prcde, le lecteur pourrait imaginer que les dterminants antigniques ABH se rduisent des di- et trisaccharides. Ceci serait possible, mais on a des raisons de penser que les dterminants antigniques, en gnral, peuvent stendre sur des squences plus tendues. On devrait alors distinguer les variantes dues au polymorphisme du systme. Ceci a t possible par immunisation avec des antignes soigneusement purifies, en prparant ensuite les anticorps monoclonaux. Par exemple, parmi les anticorps anti-A monoclonaux, lun reconP

P
,
>

GalNAc-p-(1-3)-Gaicl-(l-4>-Gal$ -(1-4)-Glc$ -(l-Cer)


16.10

Gal$ -(1-3)GalNAc-p-(l-3)-Gal-a-(l-4)-Gal$ -(1-4)-Glc$ -(I-Cer)


16.11

Le systme Ii et les effets de ramification

257

GalNAc-a-( 1-3)-Gal-p-( 1-3)-GlcNAc-P-( 1-3)-Gal Fuca-( 1-2)


16.12

GalNAc-a-( 1-3)-Gal-B-(1-4)-GlcNAcQ -( 1-3)-Gal Fuca-( 1-2)


16.13

GalNAc-a-( 1-3)-Gal$-( 1-4)-GlcNAc-P -(I -3)-Gal Fuca-( 1-2) F u c - ~ -1-3) (


16.14

nat spcifiquement 16.12 (chane de type l), un autre reconnat 16.13 (chane de type 2), mais donne une raction croise avec 16.14 (type 2, difucosyl, appel AneY) Les tudes srologiques et gntiques ont montr que le groupe A se subdivisait en deux sous-groupes principaux, A, et A,. I1 ny a pas encore dexplication dfinitive en terme de structure, mais de fortes indications concernant le sousgroupe A,. Nous avons signal ci-dessus la dcouverte dun antigne A priodique, apparent au type 3, exprim seulement sur des glycolipides - sur le globoside pour le type 4. Or on ne les trouve que sur les rythrocytes A , .

16.2 LE SYSTME Ii ET LES EFFETS DE RAMIFICATION


Le dterminant de lantigne i est lhexasaccharide linaire 16.15, trimre dicondens de la N-actyllact~samine~~]. Le dterminant I, 16.16, est une unit Gal$-( 1-4)-GlcNAc-P-(1-3)Gal-p-( 1-4)-GlcNAcQ -( 1-3)-Gal-P-(1-4)-GlcNAc-P-(1-R)
16.15

CH,OH CH,OH

HO

b o H - o 16.16

1
AcNH CH*-

258

Les antignes de groupes sanguins : substances A, B, H et connexes

N-actyllactosamine branche sur la position alcool primaire dun hexopyranose[4].I1 recouvre donc un site de ramification. Le dterminant i se prsente comme un fragment des longues chanes de poly-N-actyllactosamine polycondenses lies aux mannoses du cur des glycoprotines glycosaminides et aux units GalNAc (ou Gal) du cur des glycoprotines glycosides. De trs longues chanes de ce type, jusqu 40 monosaccharides, seraient prsentes dans les glycolipides des rythrocytes de lapin, avec sept ramifications. On a isol un glycolipide 20 units et trois ramifications du placenta humain. Ce sont, dune manire gnrale, ces ramifications qui seraient le site de combinaison du dterminant I. Ces antignes, prsents dans tous les individus humains, ne devraient pas tre reconnus comme non-soi et susciter la synthse danticorps. Cependant, il existe certaines conditions pathologiques, appeles maladies auto-immunes, o antigne et anticorps coexistent chez le mme individu. Les anticorps dont nous allons parler ont reu le nom dagglutinines froides. Lagglutination des rythrocytes se manifeste par un trouble lorsquon refroidit le sang 4C, qui disparat au retour 37C. Les srums de ces malades sont une source danticorps anti-i et anti-I. Ces anticorps sont naturellement monoclonaux et servent de ractifs pour tudier la distribution des antignes i et I dans les sujets normaux. Ainsi le sang du fetus humain exprime lantigne i, observable sur les rythrocytes du cordon ombilical. Au cours des dix-huit premiers mois dexistence du nourrisson, lantigne i disparat au profit de lantigne I. En termes de structure, ceci sinterprte simplement par la ramification de la chane linaire i, par couplage avec Ianomrie p du disaccharide N-actyllactosamine sur les fonctions alcool primaire des rsidus galactose. Nous reviendrons au chapitre 17 sur le rle probable des antignes i et I dans lembryognse des mammifres. Ces questions de ramification seront loccasion dun bref retour sur les anticorps ABH. Les anticorps anti-sucres ont en gnral une affinit faible ou modre. Celle-ci est trs augmente sil y a plusieurs dterminants sur une seule molcule porteuse, ce qui est rendu possible si elle est ramifie. La combinaison avec un anticorps deux sites rcepteur multiplie laffinit par un facteur de lordre de lo3 - io4.

16.3 SYNTHSE DES DTERMINANTS OLIGOSACCHARIDIQUES 16.3.1 Dterminants ABH


Ces synthses posent le problme difficile de la glycosidation 1,2-cis conduisant des a-glycosides. Cest spcifiquement pour prparer certains de ces oligosaccharides que la mthode lion commun a t labore (voir le paragraphe 10.3.3). La figure 16.1 donne la prparation du trisaccharide Lea par fucosylation dun driv protg de la N-actylla~tosamine[~]. La figure 16.2 illustre lutilisation de la mme mthode pour prparer un a-D-galactopyranoside, en Ioccurrence le trisaccharide BC6].

Ac

&
Ac0

Synthse des dterminants oligosaccharidiques


C H 3 W I i n

Ac0

259
Et,NBr-MeCHNEt

Ac0

NHAc

OCH,CCI,

OBn OBn

CH,CI,-Me,NCOH

Ac0 NHAc
80%

OCH,CCI,

Figure 16.1 Synthse du trisaccharide Lea.

HO

OCH2CC1,

+
Bn O Br OBn

Et,NBr CH,Cl,-Me,NCOH

Bn O
O

OCH,CCI,

OBn

Figure 16.2 Synthse du trisaccharide B.


Pour introduire une unit N-actylgaiactosamine a, 1,2-cis,il faut partir dun ractif sans groupement participant. On emploie les halognures de 2-azido-2doxy-a-D-galactopyranosyle16.17 et 16.18 dont la prparation la plus habituel-

260

Les antignes de groupes sanguins :substances A, B, H et connexes

le utilise 1 azidonitration >> du galactal peractyl 16.19 (Fig. 16.3) (voir le paragraphe 10.3.3). La condensation du bromure 16.18 avec le trisaccharide 16.20 est ltape cl dans la synthse du dterminant A port par une chane de type 2. On termine en dbloquant, en rduisant Iazide et en N-actylant[] (Fig. 16.4). CH,OAc

Ac0

-16.19

AcO

16.17 X = C1 1 6 . 1 8 X = Br

Figure 16.3 Raction dazidonitration.


Ph

CalNAc-a-( I-?)-Gal-P-( 1-4)-GlcNAc


+ d

Fuca-( 1-2)
Figure 16.4 Synthse dun ttrasaccharide A.

16.3.2 Dterminants Ii
On a dabord effectu la synthse du dterminant I et des composs apparents en couplant loxazoline 16.21 drive de la lactosamine peractyle avec un galactose ayant la fonction alcool primaire libre (Fig. 16.5). Depuis les oxazolines ont t largement remplaces par les phtalimidochlorures pour le couplage p-1,2 trans des sucres amins. Sur la figure 16.5, on voit que la fonction alcool en 3 du galactose accepteur est bloqu temporairement par allylation. Le dblocage slec-

Synthse des dterminants oligosaccharidiques

261

CH,OAc Ac O
Ac

+
Ac
All0

Brio

OBn

16.21

Me

CH,OAc

Ac 0

-cz

\B O n o CH,

All0
Figure 16.5 Synthse du trisaccharide I.

Bn0

tif de cette position libre un hydroxyle qui peut servir lextension de la chane dans une autre direction[*]. La synthse des oligosaccharides de la famille du dterminant i illustre une stratgie particulire de doublement19]. On part de la phtalimidolactosamine convenablement drive, 16.22. Sur une portion, on hydrognolyse le benzyle anornrique et on convertit I hydroxyle anomrique en trichloractimidate. On a
O

OBn NPht
16.22

NPht

16.23

262

Les antignes de groupes sanguins : substances A, B, H et connexes

Gal

0
K I u

GalNAc

GlcNAc

Fuc

O
Types de jonction

o=u

a(1-2)

Hn
a(l-2)

a(l-2)

1 2

3
4

Lea

Figure 16.6 Rsum pictural de certaines squences considres au chapitre 16.

ainsi fabriqu le donneur glycosylant. Sur une autre portion de 16.22, on pratique une hydrolyse acide modre qui expose les hydroxyles en 3 et 4 de l'unit galactose. Mais seul l'hydroxyle en 3 est ractif au couplage dans ces conditions. Le

Rfrences

263

16.24

couplage donne le ttrasaccharide 16.23. Une portion de 16.23 est active sur le carbone de l'unit rductrice exactement comme ci-dessus et, dans une autre, on expose par hydrolyse acide la fonction alcool en 3 du galactose terminal non rducteur. Le couplage donne l'octosaccharide protg 16.24. Les essais immunochimiques faits avec cette collection de produits aprs dprotection semblent indiquer que le dterminant i est une chane hexasaccharidique. La figure 16.6 donne une reprsentation picturale des principaux dterminants antigniques mentionns dans ce chapitre.

RFRENCES
[ I ] H. Clausen et Sen-itiroh Hakomori, Vox Sanguinis, 56 (1989) 1-20. [2] Sen-itiroh Hakomori, Baillre's Clinical Haematology, 4 (1991) 957-914. [3] Sen-itiroh Hakomoni, La Recherche (1993) 548-554. [4] H.C. Gooi, A. Veyrires, J. Alais, P. Scudder, E. E Hounsell et T. Feizi, Molecular Immunology, 21 (1984) 548.554, 1099-1104. [SI R. U. Lemieux et H. Driguez, J. Am. Chem. Soc., 97 (1975) 4063-4069. [6] R. U. Lemieux et H. Driguez, J. Am. Chem. Soc., 97 (1975) 4069-4075. [7] H. Paulsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21 (1982) 155-224. [8] C. Aug, S. David et A. Veyrires, Nouv. J. Chim., 1979 (3) 491-497. [9] J. Alais et A. Veyrires, Curbohyd~Res., 207 (1990) 11-31.

CHAPITRE 17

Ractions de reconnaissance doligosaccharides importantes dans le monde vivant

17.1 INTRODUCTION
Nous avons choisi ces exemples non seulement en raison de leur importance, mais aussi avec lespoir de rendre concrte aux yeux des chimistes organiciens la mthodologie applique. Un volume rcent de symposium rend compte dun certain nombre dobservations analogues dans les domaines les plus varis]. Le lecteur intress pourra sy documenter sur des questions que nous naborderons pas, comme lintervention des oligosaccharides dans la fertilisation des mammifres et le dveloppement embryonnaire du systme nerveux. Dans le cadre plus limit de ce chapitre, tous les exemples, sauf le premier, viennent du monde animal. La matire de ce chapitre paratra peut-tre disparate au lecteur, mais prcisment, lauteur cherche le convaincre du caractre gnral et de la varit des associations supramolculaires protine-sucre dans le monde vivant.

17.2 LE SIGNAL DE NODULATION DES RHIZOBIA


Les ttrasaccharides 17.1 et 17.2 jouent un rle fondamental dans la symbiose entre les Rhizobia et les lgumineuses. Ils induisent la formation des nodosits des racines qui permettent la fixation de lazote et la dformation des radicelles sur la luzerne[*]. Ils sont inactifs sur la vesce, qui, par contre, rpond des analogues non sulfats. On reconnat l un fragment ttrasaccharidique du polymre chitine, 17.3, produit de soutien de la carapace des crustacs. Lactolyse de la chitine (Ac,O - H,SO,) la dcompose en N-actylglucosamine et oligosaccharides ( n = 2, 3 , 4.. .), peractyls. Les composs 17.1 et 17.2 se distinguent du << chitottraose D 17.3 ( n = 4) par les substitutions suivantes : sulfation de la fonction alcool primaire de lunit rductrice et, dans lunit terminale non rductrice, remplacement de lactyle par un groupement driv dun acide gras non satur et actylation ventuelle de lhydroxyle primaire. On a fait la synthsec31 des ttrasaccharides 17.1 et 17.2 par addition successive dunits glucosamine convena-

Le pentasaccharide actif de lhparine

265

o
NH
I

&

CH,OH

o
NHAc

o
NHAc

~
NHAc

<
OH

17.1 R = H 17.2 R = A c

PMBO NPht
17.3 17.4

OMP

MP 4mthoxyphnyl PMB 4-mthoxybenzyl TBDPS tert-BuPh,Si Pht phtalimido blement protges. Le prcurseur 17.4 de lunit rductrice contient quatre types de groupements protecteurs (voir le paragraphe 5.1.1). Un cinquime type, terBuMe2Si, protge la fonction alcool primaire du prcurseur de lunit terminale non rductrice. Le couplage utilise lactivation par transformation en fluorures. On arrive finalement un ttrasaccharide glycoside, o toutes les fonctions alcool sont protges par des groupements MP ou PMB, sauf deux, protgs par silylation. On hydrolyse slectivement lther ter-butyldimthylsilyle sur la fonction alcool primaire de lunit terminale non rductrice en milieu acide modr (tosylate de pyridinium) et on actyle. On hydrolyse lther ter-butyldiphnylsilyle avec le fluorure de ttrabutylammonium et on convertit lalcool en sulfate acide avec le complexe SO, - Me3N dans la pyridine. Finalement, on obtient 17.2 en liminant les thers restants par oxydation par le nitrate de crium et dammonium.

17.3 LE PENTASACCHARIDE ACTIF DE CHPARINE 17.3.1 Isolement de lhpariner41c51


La source commerciale la plus habituelle est la muqueuse intestinale du porc, dont on peut retirer plus de 100 mgkg. Cest un polyacide quon extrait des tissus autolyss par une solution alcaline. On coagule les protines au chauffage. Le

266

Ractions de reconnaissance doligosaccharides importantes dans le monde vivant

refroidissement prcipite une association hparine-protine, quon dbarrasse de lipides contaminants par extraction lalcool ou lactone. Aprs redissolution, on limine les protines par digestion trypsique. On spare des contaminants de la mme famille par lintermdiaire dun sel de baryum cristallis ou de sels dammoniums quaternaires insolubles. On peut purifier lhparine sur des colonnes dchangeurs danions. Cest la molcule la plus charge de la srie et celle qui ncessite les concentrations en sels les plus leves (2M) pour son lution.

17.3.2 Biosynthse de lhparine


Elle est particulirement intressante, car elle montre bien comment sintroduit lhtrognit dans cette molcule primitivement rgulire. Au dpart se forme une colonne vertbrale polypeptidique, comportant une quinzaine de rsidus glycine et L-srine alternants, dont le dessin 17.5 reprsente un lment possible. A la plupart des rsidus srine, des transfrases appropries ajoutent successivement des units P-D-xylopyranosyl, 0-D-galactopyranosyl deux fois et P-D-glucurono-

I
CH,OH -NH-CH-CO-NH-CH,-COGlcUA-P-( 1 -3)-Gal-P-(1 -3)-Gal-P-( 1-4)-Xyl- p(1 -CH,-CH CO
17.5

17.6

OH
i

17.7

CH,OSO,H

OSO,H
17.8

1.

Le pentasaccharide actif de lhparine

267

syl, ce qui donne le glycopeptide 17.6. Cest sur lunit 0-D-GlcUA que va maintenant se construire la chane du glycosaminoglycane par addition alterne dunits a-D-GlcNAc et P-D-GlcUA. Le motif priodique est alors 17.7. Cette chane rgulire subit dans lordre, les modifications qui suivent : a) d N-actylation et sulfation de lazote, qui remplacent -NHAc par NHS0,H ; b) pimrisation en C(5) qui transforme le rsidu D-glucuronique en L-iduronique ; c) sulfation de loxygne O(2) du rsidu iduronique ; d) sulfation de la fonction alcool primaire. La nouvelle chane est principalement constitue dlments disaccharidiques 17.8, mais il y a parfois des arrts en cours de route, si bien que les chanes deviennent htrognes. Le poids molculaire est 60 O00 - 100 000, mais il y a ensuite une hydrolyse de certaines liaisons peptidiques et glycosidiques qui donnent finalement un mlange de poids molculaire 5 000-25 000.

17.3.3 Dgradation de lhparine


Le motif 17.8 reste dominant. La liaison sulfamique est hydrolyse en milieu acide et lhydrolyse acide donne le chlorhydrate de la glucosamine comme unique sucre amin. Le traitement par lacide nitreux en milieu acide donne principalement le disaccharide 17.9. La rupture de la liaison glycosidique et la rgression de cycle sobservent dj sur le mthyl a-D-glucosaminide, dont le rarrangement est reprsent schmatiquement la figure 17.1. En raison de linstabilit dun ion carbnium sur C(2), le dpart dazote est probablement concert avec lattaque par la liaison C( 1)-O@). La rgression de cycle donne alors un ion oxocarbnium, qui donne avec leau un hmi-actal instable dans ces conditions. Celui-ci est vite hydrolys en aldhyde et mthanol. On sait induire des enzymes capables de dgrader lhparine, lhparinase et lhparanase, chez la bactrie Flavobacterium heparinum, en cultivant cet organisme sur des polysaccharides de la mme famille. Le produit de clivage est alors

6HOMe

O M e
Figure 17.1 Rarrangement dun glycoside damino-sucrepar dsamination nitreuse.

268

Ractions de reconnaissance doligosaccharides importantes dans le monde vivant

OH

OSO,H
17.9

17.10

17.11

le disaccharide 17.10, qui, dans les cas les plus favorables, est obtenu avec un rendement de 80 %. Le lecteur reconnatra une p-limination, premire vue trs comprhensible, dun oxygne en p dun carboxyle. Elle devrait tre encore plus facilite par la disposition trans diaxiale des deux substituants qui sliminent, 17.11. Cependant, en lisant les protocoles dextractions, on doit conclure que lhparine est stable dans les solutions alcalines concentres chaudes. I1 est possible que la surabondance de changes ngatives au voisinage de H(5) dans ces conditions empche lapproche dune base et la dprotonation.

17.3.4 Le pentasaccharide actif


Lhparine empche la coagulation du sang en sassociant une protine du plasma, lantithrombine III (AT III). Ceci entrane linactivation dun certain nombre denzymes impliques dans le processus de coagulation. On dmontre cette raction in vitro par chromatographie daffinit : on attache de faon cova-

Le pentasaccharide actif de lhparine

269

SO,H HS0,-OCH,
OH O HS03NH

OH

OH

17.12

lente la protine AT III de lagarose activ au bromure de cyanogne (voir le paragraphe 10.4)[6]. On pratique ce couplage en prsence dun excs dhparine pour protger les sites de AT III impliqus dans la reconnaissance de lhparine. Si on fait passer au travers dune colonne de cet absorbant agarose-AT III une solution dhparine dans NaCl 0,2 M, au pH 7.5 (donc sous forme sel de sodium), on constate que lhparine est retenue. On peut dissocier cette combinaison en forant la concentration saline de lluant (0,2 M -+ 3 M). Des expriences similaires avec des fragments dhparine produits par dsamination ou limination enzymatique ont montr que le site de reconnaissance sur lhparine se rduit une squence de 5 rsidus monosaccharidiques, disposs comme dans le pentasaccharide (synthtique) 17.12. La squence de 17.12 se distingue de la squence prvalente par un rsidu glucuronique, sans doute tmoin dune biosynthse incomplte, et dune glucosamine trisulfate. Ce troisime sulfate est indispensable pour lactivit biologique. On peut mettre en vidence la combinaison pentasaccharide 17.12-AT III par chromatographie sur une colonne de S p h a d e ~ [ ~ Ce ] . type dabsorbant prsente des cavits de dimension normalise et retient dautant plus une molcule quelle est plus petite et peut y rentrer. Les protines sont exclues et suivent pratiquement le front de la solution. La figure 17.2 donne les profils dlution, avec NaCl O, 15 M (pH 7 5 ) comme luant. La protine AT III est rapidement lue, en A. Le pentasaccharide 17.12, seul, est retard, et sort de la colonne en B. En chromatographiant un mlange quimolculaire de AT III et 17.12, on nobserve quun pic dlution, en A, qui est celui de lassociation 17.12-AT III, qui est exclue comme AT III.

Figure 17.2 Profils dlution sur Sphadex G-60, de lantithrombine III etlou de son ligand 17.12, avec NaCl 0,15 M comme luant (pH 7,5).

25

50

mL

270

Ractions de reconnaissance doligosaccharides importantes dans le monde vivant

Nous allons esquisser les grandes lignes de la synthse de 17.12. La configuration L-id0 est ralise par inversion de la configuration de C(5) sur le furanose 17.13. La dsactalation en milieu acide de 17.14 donne le pyranose qui, en un certain nombre dtapes, est activ par conversion en orthoester 17.15. On obtient un prcurseur du fragment AB de 17.12 par condensation de cet orthoester avec la glucosamine protge 17.16. On obtient un prcurseur du fragment CD en condensant le bromure 17.17 sur lanhydro 17.18. La condensation des deux disaccharides protgs AB et CD donne le ttrasaccharide prcurseur du fragment ABCD, auquel lunit monosaccharidique E est ajoute en fin de synthse. La sufation a lieu en deux temps : la synthse a conduit un pentasaccharide o tous les hydroxyles sulfater sont actyls, tandis que les prcurseurs des fonctions amines, azide (introduite avec 17.18) et benzyloxycarbonyle (introduite avec 17.16) sont encore intacts. Aprs dsactylation, on sulfate les cinq hydroxyles

17.13

17.14

OBn M e O C w J OcMe,
17.16

Me BnO

OCOCH,CI
17.15

CH2C1C00 BnO

= R0
C0,Me

BnO Br

HO

N3

17.17

17.18

Marqueurs tumoraux

271

librs par le systme SO, - Me,N dans la dimthylformamide. On introduit ensuite les fonctions amines par hydrognation catalytique, et on procde la N-sulfation dans leau (pH 9 3 , avec le mme complexe SO, - Me,NL8] L91.

17.4 MARQUEURS TUMORAUX 17.4.1 Mthode de recherche


Les recherches dcrites dans ce paragraphe et le sont, en fin de compte, des analyses de la composition des surfaces cellulaires en molcules diverses. Si elles apparaissent comme la frontire de la chimie organique, cest parce que la complexit du problme et les difficults exprimentales imposent le recours aux mthodes trs fines de limmunochimie. Cest aussi parce que les objectifs sont la rsolution de problmes biologiques ou mdicaux. La voie dapproche la plus employe est de susciter chez un animal la formation danticorps par immunisation avec des cellules entires ou leur membrane. On obtient avec une cellule dtermine un mlange danticorps, qui sont spars et reproduits plus grande chelle par la technique des hybridomes (voir le paragraphe 15.2). Un grand nombre de ces anticorps monoclonaux ont t prpars de cette faon. I1 faut alors dterminer leur spcificit, ce qui nest pas un problme simple. I1 faut disposer dune collection dantignes dont la structure est connue et les essayer tour tour pour trouver ceux qui se combinent un anticorps monoclonal donn. Des considrations danalogie chimique ou une intuition biologique ou mdicale peuvent guider la recherche. Lorsquon a trouv quune molcule est antignique, il faut reconnatre sa partie active dans la combinaison immunochimique, le dterminant. En effet, sur la surface des cellules, ce dterminant pourra sexprimer sur des molcules diffrentes de celles de lantigne qui a servi caractriser lanticorps. Finalement, dans lhypothse optimiste, limmunochimiste a sa disposition une batterie danticorps monoclonaux, chacun dou dune spcificit particulire, qui permet de prouver lexistence de certains lments de structure sur la surface dune cellule. Toutes les spcificits dcouvertes de cette faon correspondent des antignes oligosaccharidiques, voisins des antignes des groupes sanguins ABH. Les dterminants sont ports soit par des glycolipides, soit par des protines. Le lecteur pourra mettre en doute la rigueur de cette mthode : on ne pourrait pas dcouvrir un dterminant radicalement nouveau en testant des anticorps monoclonaux avec des antignes dj parfaitement connus. On peut, en tout cas, aprs avoir dcouvert une squence active, la modifier chimiquement ou enzymatiquement de faon crer une structure originale. Si cette modification augmente la ractivit immunitaire, on se rapproche de la spcificit authentique de lanticorps monoclonal sous tude. On peut ainsi dcouvrir un dterminant encore inconnu. Quoi quil en soit les anticorps monoclonaux ont servi mettre en vidence des diffrences entre cellules embryonnaires et adultes, entre cellules nor-

272

Ractions de reconnaissance doligosaccharidesimportantes dans le monde vivant

males et cancreuses. Nous donnerons dans ce chapitre quelques exemples caractristiques et un aperu de certaines techniques exprimentales.

17.4.2 Antignes tumoraux1


Si lon trouve une diffrence de composition caractristique entre la surface dune cellule tumorale et celle dune cellule normale du mme organe, on peut esprer fonder sur cette diffrence une raction de diagnostic, ventuellement un procd dlimination. En utilisant des immunisations avec des types divers de cellules de tumeurs, on a prpar un trs grand nombre danticorps monoclonaux dirigs contre leurs molcules de surface. Les dterminants dcouverts jusqu prsent sont tous des oligosaccharides apparentes aux substances de groupes sanguins et drivent soit de la charpente soit de la priphrie de ces substances. Ainsi on observe sur les mtastases des tumeurs du clon (mais non sur les tumeurs primaires) une accumulation des antignes I et i, 17.19 et 17.20. Ils sont lis des glycoprotines de type mucine, extraites des tissus correspondants. Galp (1+4) GlcNAc (145) Gal ...
17.19

H - [-3) Galp (1-+ 4) GlcNAcB (1 -I3 - OH


17.20

On a reconnu lantigne 19.9 grce un anticorps monoclonal obtenu aprs immunisation de souris avec des cellules dadnocarcinone du clon humain. Lattachement de cet anticorps ces cellules est inhib par un traitement pralable avec la neuraminidase, ce qui indique la prsence dun rsidu sialoside terminal dans le dterminant antignique et suggre de rechercher lantigne parmi les gangliosides. On extrait les glycolipides des cellules et on les spare par chromatographie sur couche mince. Le rvlateur est lanticorps monoclonal, qui nest retenu que sur la tache de lantigne. On reconnat lemplacement de cet anticorps par Lantigne prsent combinaison spcifique avec une molcule marque par 1251. sur la cellule tumorale qui a servi limmunisation est un ganglioside 17.21 o lon reconnat le dterminant antignique des groupes sanguins Lewisa, sialyl lextrmit non rductrice. Toutefois, dans le srum des malades, le dterminant antignique est li une glycoprotine. Lantigne 19.9 est absent du clon normal et utilis en diagnostic. NeuAc

a (2-3)Galp (1-3)GlcNAcP( 1-3)GalP( 1 4 ) G l c Cer


4 II Fuc a
17.21

Antignes de diffrenciation

273

Par immunisation avec une ligne de cellules du rat, on a obtenu un anticorps qui ragit spcifiquement sur le cerveau embryonnaire du rat. Lantigne correspondant appartient donc au groupe des antignes de diffrenciation traits au paragraphe 17.5. En raison de labondance des structures polysialyles dans ces tissus, il nest pas tonnant que le dterminant antignique soit un oligosaccharide sialyl. Cet antigne est galement prsent dans les gangliosides des cellules de mlanomes, o il est trs abondant - ou trs expos. I1 est remarquable par la prsence dune unit terminale non rductrice qui drive de lactate en 9 de lacide sialique 17.22.

17.22

On a dcrit un grand nombre dautres antignes de cellules tumorales. Le lecteur pourra se reporter aux tableaux donns dans les rfrences[10] Toutefois, les anticorps correspondants ne doivent tre utiliss en diagnostic quavec discernement. Comme le montre trs bien le dernier exemple, la prsence dun antigne dtermin peut tre caractristique de la prsence dune tumeur dans un type dorgane et normale dans un autre. La mise au point dun protocole de diagnostic doit liminer cette cause derreurs.

17.5 ANTIGNES DE DIFFRENCIATION[~~~ 1131 141


Cest le nom donn aux antignes dont lexpression sur la surface des cellules varie aux cours des tapes successives du dveloppement embryonnaire. Limmunisation dun animal contre des cellules embryonnaires entires a permis dobtenir finalement un grand nombre danticorps monoclonaux dirigs contre les antignes de surface. Ainsi, on a mis en vidence lantigne de Forssman dans lembryon de la souris ses tout premiers stades. Cet antigne correspond la squence oligosaccharidique du glycolipide 17.23, mais la structure support pourrait tre aussi bien une glycoprotine. Cet antigne nest plus exprim que par quelques types de cellules chez la souris adulte. GalNAc a (I

-+ 3) GalNAc p (1 -+

3) Gal a (1 -+ 4) Gal
17.23

p ( I + 4) Glc Cer

Dautres tapes ont t prcises avec laide des anticorps monoclonaux naturels anti-I et anti-i. Le caractre dantignes de diffrenciation des antignes Ii est

274

Ractions de reconnaissance doligosaccharides importantes dans le monde vivant

fortement suggr par leur ordre dapparition chez lhomme. Lantigne i, dont lpitope est 17.20, est exprim sur les rythrocytes du nouveau-n, par exemple dans le sang du cordon ombilical. I1 disparat au cours de la premire anne de lexistence au profit de lantigne I, pitope 17.19. Ces structures sont sans doute portes la fois par des glycolipides et des glycoprotines. Lordre dapparition parat rationnel, si on suppose que la ramification rsulte de laction de transfrases. Cependant, cest lordre inverse que lon observe au cours du dveloppement embryonnaire de la souris, comme nous allons le dtailler ci-dessous. On met en vidence lexpression des antignes de diffrenciation au site mme o ils se manifestent sur lembryon par observation microscopique des coupes. Celles-ci sont traites par lanticorps qui se fixe aux sites o se trouve lantigne. On limine lexcs danticorps par lavage et on visualise sa prsence aux sites o il a t retenu par combinaison spcifique avec une molcule fluorescente. Cest lantigne I qui apparat aux stades prcoces, ds le zygote, et lantigne i napparat quaprs cinq jours, au dbut de la diffrentiation visible des cellules[ls~. Evidemment, lapparition prcoce de loligosaccharide ramifi est surprenante et, parmi les explications possibles, on a suggr la persistance dans lovocyte dune glycosyl transfrase maternelle. Un nouvel antigne, SSEA- 1 (Stage Spcijk Embryonic Antigen), dont lpitope est 17.24, sexprime au stade huit cellules[161.Son expression est transitoire, car il nest plus exprim quen un nombre restreint de sites chez la souris adulte. Sa structure 17.24 suggre que son expression est le rsultat de la fucosylation dune unit terminale non rductrice N-actyllactosamine des antignes i ou I. Une seconde fucosylation, donnant 17.25, abolit la ractivit vis--vis de lanticorps anti SSEA-I. Ces observations suggrent un mcanisme pour expliquer lapparition et la disparition des antignes durant les diverses phases de lembryognse : laddition (par des transfrases) ou llimination (par des hydrolases) dunits monosaccharidiques. De mme, chez lhomme, les antignes de groupes sanguins, ABH apparaissent sur des organes varis diverses tapes du dveloppement et, parfois, ne sont plus finalement dcelables. Gal

p (1+4)

GlcNAc

Gal

p (1 -4)

Fuc a
17.24

1:

GlcNAc 3 Il F u c a Fuc a

1:

17.25

On a exprim lopinion que ces antignes de diffrenciation jouent le rle dun code postal. Ces molcules, par un systme dadhsions, commanderaient la route que doivent suivre les cellules dun embryon pour arriver leur place et, notamment, se rassembler dans les gros organes. Mais ce trafic doit tre organis par des e facteurs >> ou des << agents de la circulation . I1 faut donc dautres molcules pour reconnatre ces antignes, rle que pourraient tenir des lectines proximit.

Les slectines

275

17.6 LES SLECTINES 17.6.1 Raction inflammatoire et slectines I1 se produit dans les tissus endommags une mobilisation des leucocytes. Les leucocytes du flux sanguin sont ralentis, puis arrts le long de la paroi intrieure (endothliale) des veinules, puis la traversent en sinsrant entre les cellules au voisinage de la lsion : cest la raction inflammatoire. Cette mobilisation fait intervenir une multiplicit de molcules dadhsion, rparties en trois groupes, les intgrines, les superimmunoglobulines et les slectines[l71.Nous nous attacherons plus particulirement ce dernier groupe. II y a trois slectines E, P et L. La slectine E apparat sur les cellules endothliales ; la slectine P apparat sur la majorit des classes de leucocytes. Les slectines sont des protines dont la structure primaire a t lucide par clonage. Elles sont bties de faon analogue (Fig. 17.3). Ce sont des protines transmembrannaires, dont lextrmit acide baigne dans le cytoplasme tandis que lextrmit amine est dirige vers lextrieur. Partant de celle-ci, on rencontre dabord une chane denviron 120 rsidus, le << domaine lectine , qui se rapproche des lectines animales (dont leffet dpend de Ca++). Ceci a fait demble souponner lexistence de ligands oligosaccharidiques. Ensuite vient une squence de 30 rsidus aminoacides, dite EGF, puis une structure priodique constitue par un alignement de squences de 62 rsidus (6 pour E, 9 pour P, 2 pour L). Tout ceci constitue la portion des slectines extrieure la cellule. La squence suivante correspond la traverse de la membrane et la partie cytoplasmique est beaucoup plus courte. Le nom de slectine rappelle lanalogie de ces protines avec les lectines animales. Nous choisirons dans limportante documentation sur les slectines ce qui est relatif la mise en vidence du ligand oligosaccharidique des slectines E et L.

Figure 17.3 Architecture des slectines E, P et L. Publi daprs J.M. Harlan et D.Y. Liu, Adhesion, Its Role in Inflummatory Diseuse, copyright O 1977 by W.H. Freeman and Company (reproduit avec laimable autorisation de lditeur).

276

Ractions de reconnaissance doligosaccharides importantes dans le monde vivant

17.6.2 Slectines E
La slectine E nest pas exprime sur les cellules vasculaires endothliales c au repos . Elle apparat de faon transitoire lorsque lagression des tissus en leur voisinage entrane la scrtion dune cytokine, polypeptide actif, qui stimule sa biosynthse. Les endotoxines bactriennes produisent le mme effet. Par contre, la slectine E serait exprime de faon permanente dans larthrite rhumastismale. La cellule active accroche (ou freine) un leucocyte par association de ses molcules de slectine E avec un oligosaccharide complmentaire prsent la surface du leucocyte. On peut aussi activer les cellules endothliales en culture avec la cytokine. Ceci a permi le clonage de la slectine E et, finalement, son expression de faon stable dans un autre type de cellules en culture, les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary). Cette ligne, CHO-E sera loutil de recherche pour dcouvrir le ligand oligosaccharidique complmentaire. La mthode logique consisterait sparer et isoler tous les oligosaccharides de la paroi leucocytaire et les tester sparment. Cest rigoureusement impratiquable. I1 sagira donc de deviner intelligemment les meilleurs candidats parmi les sources naturelles accessibles. Une mthode consiste faire adsorber une quantit connue du produit tester par les parois dune cuvette en plastique, recouvrir avec une suspension de cellules CHO-E, ventuellement marques au tritium, et doser la radioactivit persistante aprs lavage. Cette mthode se prte des dterminations semi-quantitatives. Quoi quil en soit, il faut multiplier les essais, donc les tests doivent tre faciles et rapides. La mthode des << noglycolipides N se prte bien cette exploration. Cette mthode part de lobservation des proprits analytiques remarquables des glycolipides : ils se sparent trs bien les uns des autres par chromatographie sur couche mince de gel de silice. 1 se prtent bien lanalyse de structure par spectromtrie de masse (voir le paragraphe 10.5.1). Cest pourquoi, si les ligands tester ne sont pas dj des glycolipides, mais des oligosaccharides obtenus par synthse ou par dgradation de glycoprotines, on les convertit dabord en analogues de glycolipides, les noglycolipides. Pour cela on les combine au dipalmitoyle de phosphatidylthanolamine 17.26 par amination rductrice. CH,OCOC ,5H31

I
CHOCOC15H3 CH,OPO (OH) CH,CH,NH,
17.26

Ceci suppose que Ioligosaccharide a sa fonction aldhhyde potentielle intacte lextrmit terminale rductrice. Si ce nest pas le cas, lorsque loligosaccharide a t obtenu par p-limination alcaline rductrice, il faut faire apparatre une fonction aldhyde par oxydation priodique (au dtriment de lintgrit de loli-

Les slectines

217

gosaccharide). Ces noglycolipides se sparent par une technique familire aux chimistes organiciens, la chromatographie sur couche mince de gel de silice, avec un irrigant assez polaire, CHCI, - MeOH - H,O, 60:35 :8, v/v/v. Aprs la migration, on << rvle >> la plaque en la recouvrant avec une suspension de cellules CHO-E qui expriment la slectine E. Sil y a dans le mlange un oligosaccharide ligand de la slectine E, les cellules viennent adhrer la tache correspondante. On limine lexcs de cellule par lavage et on repre le site dadhsion en mettant en vidence les cellules fixes. Diverses mthodes de visualisation sont possibles. Lune dentre elles utilise des cellules marques au dpart par du tritium et repre donc finalement la position du ligand par autoradiographie. On peut analyser directement les taches par spectromtrie de masse. On voit lconomie de temps ralis avec cette mthode, puisquon nanalyse que les structures dj repres comme actives. Lobservation de dpart est que les cellules CHO-E sont fortement retenues sur une glycoprotine riche en carbohydrates dorigine ovarienne. I1 y a donc sur cette glycoprotine des squences oligosaccharidiques qui se combinent la slectine E. On isole les oligosaccharides par hydrolyse acide et on les convertit en ngolycolipides. La technique de recouvrement dcrite ci-dessus permet alors de mettre en vidence une fraction particulirement active dans le mlange. Lanalyse par spectromtrie de masse et methylation indique quil sagit dun mlange quimolculaire des noglycolipides prsentant les ttrasaccharides sulfats 17.27 et 17.28 lextrmit terminale non rductrice. Une tude antrieure avait montr que les squences des oligosaccharides sialyls 17.29 << 3-sialylD taient galement reconnues par la slectine E, Lea B et 17.30 << 3-sialyl-LeX mais laffinit de 17.27 et de 17.28 est suprieure. En tout cas, cela souligne limportance de lanion dans cette reconnaissance particulire, car le dtachement du rsidu sialique dans 17.29 et dans 17.30 par lenzyme neuraminidase abolit la raction. La modlisation de la structure des ttrasaccharides 17.27 et 17.29 indique que leurs groupements anioniques (-SO;

HSO,

3 Gal (1 - 3) GlcNAc 1 - 3 Gal

Fuc
17.27

I:

HSO, - 3 Gal ( I

4) GlcNAc 1 - 3 Gal

FUC
17.28

I:

278

Ractions de reconnaissance doligosaccharidesimportantes dans le monde vivant

NeuAc ( 2 - 3) Gai (1 - 3) GlcNAc (1 - 3) Gal

Fuc
17.29

I I

NeuAc ( 2 - 3) Gal (1 - 4) GlcNAc (1 - 3) Gal

Fuc
17.30

II

et CO,) se trouvent sensiblement au mme endroit de la molcule[18].Enfin, des modifications du rsidu sialique qui laissent intact le carboxyle, comme le remplacement du groupement actylamido par un groupement glycollylamido ou la destruction de la chane latrale par oxydation priodique, laissent intacte la ractivit.

17.6.3 Slectine L
Cette molcule dadhsion est implique dans la migration des lymphocytes dans les ganglions lymphatiques priphriques. Par des mthodes analogues celles du paragraphe prcdent, on observe les plus grandes affinits avec un mlange dont les composants prsentent les structures de sulfates 17.27 et 17.28. I1 y a cependant des diffrences avec la slectine Eli9].

17.6.4 Synthse des ligands oligosaccharidiques des slectines


La synthse dune collection doligosaccharides sulfats ou sialyls a confirm que les sulfates taient les meilleurs inhibiteurs. Le plus actif est le pentasaccharide sulfat 17.31, qui est jusqu prsent le meilleur ligand connu de la slectine M[*O]. E, donnant 50 % dinhibition la concentration trs basse 5.

17.31

Rfrences

279

RFRENCES
[I] Carbohydrate recognition in cellular function, Ciba Foundation Symposium 145, Wiley and Sons, New York, 1989. [2] P. Roche, F. Debelle, E Maillet, P. Lerouge, C. Faucher, G. Truchet, J. Demarie et J. C. Prom, Cell., 67 (1991) 1131 (et les autres publications du mme groupe en 1990-1991). [3] K. C. Nicolaou, N. J. Bocovitch, D. R. Carcanague, C. W. Hummel et L. F. Even, J. Am. Chem. Soc., I14 ( 1 992) 8701-8702. [4] B. Casu, Adv. Carbohydr: Chem. Biochem., 43 (1985) 5 1-1 34. [5] B. Casu, Ann. N.Y Acad. Sci., 556 (1989) 1-17. [6] M. Hook, I. Bjork, J. Hopwood et Ulf Lindahl, FEES Letters, 66 (1976) 90-93. [7] J. Choay, M. Petitou, J.-C. Lormeau, P. Sinay, B. Casu et G. Gatti, Biochem. Biophys. Res. Comm., 116 (1983) 492-499. [8] J.-C. Jacquinet, M. Petitou, P. Duchaussoy, I. Lederman, J. Choay, G. Torri et P. Sinay, Carbohyd. Res., 130 (1984) 221-241. [9] M. Petitou, P. Deuchaussoy, I. Lederman, J. Choay, P. Sinay, J.-C. Jacquinet et G. Torri, Carbohydr: Res., 147 (1986) 221-236. [lo] T. Feizi, Nature, 314 (1985) 53-57. [I I] T. Feizi, Cancer Surveys, 4 (1985) 245-269. [12] T. Feizi et R. A. Childs, Trends in Biochemical Sciences, 10 (1985) 24-29. [I31 T. Feizi et R. A. Childs, Biochem. J., 245 (1987) 1-11. [14] T. Feizi, T I.B.S., 16 (1991) 84-86. [I51 A. Kapadia, T. Feizi et M. J. Evans, J. Exptl. Cell. Res., 131 (1981) 185.195. [I61 H. C. Gooi, T. Feizi, A. Kapadia, B. B. Knowles, D. Solter et M. J. Evans, Nature, 292 (1981) 156-158. [I71 Adhesion, its role in influrnmatory disease, sous la direction de J. M. Harlan et D.Y. Lice, Freeman, New York 1992, chapitres 2 et 3. [18] C. T. Yuen, A. M. Lawson, W. Chai, M. Larkin, M. S. Stoll, A. C. Stuart, F. W X. Sullivan, T.J. Ahern et T. Feizi, Biochemistry, 31 (1992) 9126-9131. [19] P. J. Green, T. Tamatani, T. Watanabe, M. Miyasaka, A. Hasegawa, M Kiso, C. T. Yuen, M. S. Stoll et T. Feizi, Biochem. Biophys. Res. Comrn., 188 (1992) 244251.

[20] A. Lubineau, J. Le Gallic et R. Lemoine, Bioorg. Med. Chem. paratre.

CHAPITRE 18

Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et lADN ?

18.1 DONNESDU PROBLME


A la forme interrogative de ce titre, le lecteur aura compris quil sagit dacquis rcents, dont linterprtation dfinitive nest peut-tre pas assure. Le problme a t pos par les proprits dune famille dantibiotiques, les calichamicines[] et espramicines[2], qui ont une cytotoxicit puissante et sont antitumorales. Nous consacrerons essentiellement ce chapitre la calichamicine y:, la plus tudie, que nous dsignerons simplement par le mot calichamicine. Sur la structure 18.1 de ce compos, le lecteur reconnatra plusieurs lments exceptionnels. Cest avant tout un glycoside, dont laglycone bicyclique, la calichamicinone, contient un systme ne-diyne dans un cycle 10 carbones. On notera aussi le rare enchanement trisulfure. La partie oligosaccharidique est galement trs particulire. Le rsidu B est glycosid par une hydroxylamine, si bien que la liaison entre A et B est un pont -NH-O. Les rsidus B et D sont lis par lintermdiaire dun benzne compltement substitu, C. La cytotoxicit de la calichamicine et de ses congnres est due une rupture, apparemment irrparable, de la double hlice de lADN, consquence dune transformation remarquable de laglycone. On peut lobserver en labsence dADN. Le traitement de la calichamicine en solution dans CD,C12 par la triphnylphosphine donne le produit 18.2 (o R reprsente le rsidu oligosacchari-

18.1

Donnes du problme

dique), avec un atome de deutrium chacune des positions x et y . Linterprtation est la suivante : le ractif coupe le trisulfure, en sparant latome de soufre du ct de laglycone, qui se trouve alors sous la forme thiolate. Laddition de Michael du thiolate sur la cyclohexnone engendre le dihydrothiophne, 18.3. Dans cet intermdiaire, le systme ne-diyne est dstabilis et il se cyclise en biradical benznique, 18.2, o x et y reprsentent, cette fois, des lectrons clibataires, principalement localiss en ces deux sites. Ce biradical arrache deux atomes de deutrium au solvant. Avant dexaminer laction sur lADN, nous rappellerons quelques conventions dcriture dans ce domaine. Les majuscules A, G, C et T reprsentent respectivement les monosphosphates de la 2-dsoxyadnosine, la 2-dsoxyguanosine, la 2-dsoxycytidine et la thymidine (voir le paragraphe 3.6.3). Le symbole TCCT reprsente un fragment dADN de quatre nuclotides, o chaque nucloside est reli son voisin par un pont phosphodiester entre la fonction alcool en 5 de lun des sucres et en 3 de lautre. Les primes sont rserves aux numros des carbones du dsoxyribose. La notation STCCT signifie que le pont phosphodiester relie la fonction alcool en 3 dun nucloside la fonction alcool en 5 du suivant, dans lordre de la lecture. Cette convention sapplique bien sr nimporte quelle longueur ou composition du polynuclotide. Dans la double hlice de lADN, deux chanes de polynuclotides sont associes, avec la correspondance bien connue des bases en vis--vis : adnine-thymine, guanine-cytosine. Au ttranuclotide TCCT correspond AGGA. Les deux chanes sont disposes en sens inverse, si bien que, sur cette dernire squence, lue dans cet ordre, le pont phosphodiester relie la fonction alcool en 5 dun nucloside la fonction alcool en 3 de celui qui suit. En consquence, le symbole complet est 3AGGA. La figure 18.1 reprsente un fragment dADN en double hlice, o lon a reprsent plus prcisment les ttranuclotides complmentaires, STCCT et 3AGGA, qui jouent un rle dans les phnomnes dcrits ci-dessous. Lidentit des autres nuclotides, N, na provisoirement pas besoin dtre prcise. Laglycone de la calichamicine se loge dans le petit sillon entre les deux chanes polynuclotidiques, de la faon indique par le

282

Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et lADN ?

Figure 18.1 Localisation de la calichamicine dans le petit sillon de la double hlice. Extrait de M. D. Lee, G.A. Ellestad et D.B. Borders,Acc. Chem. Res., 24 (1991) 235243 (publi avec laimable autorisation de Accounrs of chemical Researtch ; O 1991 American Chemical Society).

SGGGTCCTAAATT3 3CCCAGGATTTAAS
18.4

O-PO(0H)-O18.5

trait ondul. Laddition dun thiol rducteur amne alors la rupture des deux chanes polynuclotides, sur lune au niveau de la cytidine marque par une flche, et sur lautre, au niveau dun nucloside non spcifi, situ deux units nuclotides au-del de ladnosine, vers le ct 3. Ces ruptures sont amorces par larrachement dun atome dhydrogne du dsoxyribose par le biradical 18.2 (x et y , lectrons clibataires). On a pu le montrer directement avec un systme plus simple pour la rupture au niveau de la cytidine. On a prpar par synthse le << duplex >> de dodcanuclotides 18.4. Lunit cytidylique C est marque en 5 sur le dsoxyribose par du deutrium de la faon reprsente par la formule partielle 18.5. Aprs avoir fait ragir la calichamicine sur le fragment dADN 18.4, on recueille le produit de transformation 18.2 marqu par du deutrium sur la position x (x = D, y = H). Le carbone correspondant x sur le systme ne-diyne est donc celui qui se trouvait proximit de la cytidine dans lassociation de la double hlice avec la calichamicine. Dautres expriences confirment que des protons non changeables de lADN sont bien la source des hydrognes introduits en x et y , mais elles ne permettent pas de dfinir leur emplacement sur les polynuclotides. Dans un tampon deutr, la transformation de la calichamycine, amorce par le thiol deutr DSCH,COOCH, donne le compos 18.2 (20 %), avec plus de 98 % dincorporation de deutrium aux positions x et y . La mme exprience, en

Les synthses du pseudo-oligosaccharide de la calichamicine

283

prsence dADN, donne 18.2 (65 %), avec uniquement de lhydrogne ces mmes positions. Donc ces atomes dhydrogne proviennent de sites non changeables de lADN. La rupture aprs enlvement dun atome dhydrogne en 5 conduit probablement laldhyde 18.6, car le fragment restant perd un driv de la cytosine en milieu basique, sans doute par p-limination. Ce mcanisme gnral de la rupture ne fait pas intervenir explicitement le pseudo-oligosaccharide et ]aglycone seule devrait avoir les mmes proprits. On ne peut pas sparer celle-ci, la calichamicinone 18.7, de Ioligosaccharide sans la dgrader, mais on la obtenue sous forme racmique par une synthse totale assez laborieu~e[~]. Cette synthse est en dehors du cadre de notre livre. La calichamicinone est effectivement capable de couper lADN en double hlice, mais de faon anarchique. Dautres diffrences de comportement entre le produit naturel et Iaglycone montrent que la partie pseudo-oligosaccharide a une grande importance. Nous les examinerons plus en dtail au paragraphe 18.3, tandis que le paragraphe 18.2 commentera la synthse du pseudo-oligosaccharide exceptionnel.

O-PO(0H)-O18.6 18.7

18.2 LES SYNTHSES DU PSEUDO-OLIGOSACCHARIDE DE LA CALICHEAMICINE


18.2.1 Voie DCBAEL4]
Lordre dassemblage est le suivant :

D+C+DC DC + B -+ DC B A+E+AE Les prcurseurs des units monosaccharidiques ABDE sont des drivs de glycals, mais chacun est utilis dune faon diffrente. Lhydroxylamine substitue entre les rsidus A et B est protge sous forme de driv urthane pour empcher un rarrangement du rsidu A que nous dtaillerons plus loin. Le prcurseur de

284

Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et lADN ?

lunit D est le di-O-actyl-L-rhamnal 18.8, qui donne le benryl glycoside 18.9 en prsence dalcool benzylique et de BF, - Et,O par rarrangement de Ferrier (voir le paragraphe 7.5.1). La fonctionnalisation dfinitive de 18.9, pour donner 18.10, demande quatre tapes, parmi lesquelles il y a une bis hydroxylation de la double Aprs actylaliaison avec le ractif OsO, - N-mthylmorpholine-N-oxyde-eau. tion et dbenzylation catalytique on active le sucre par conversion en trichloroactimidate 18.11. Le prcurseur du cycle C est le diiodophnol 18.12, selon un schma ractionnel suggr auparavant[5]c6]. Le couplage avec le trichloroactimidate 18.11 donne la-L-phnyl glycoside 18.13, en raison de la participation de la fonction actate en 2. On remplace celle-ci par un groupement ter-butyldimthylsilyle, puis on introduit le groupement mthoxycarbonyle en traitant le diiodophnol par un mlange de mthanol et de monoxyde de carbone, dans une raction catalyse par lactate palladeux, en prsence de la diphosphine Ph,P (CH,),PPh, et de trithylamine. Le driv mthoxycarbonyle 18.14 est ensuite transform en chlorure dacide, 18.15. On a ainsi le fragment CD sous une forme prte au couplage ultrieur. Le prcurseur du rsidu B est le glycal 18.16. Celui-ci possde une fonction thiol protge par un groupement dinitrophnyl (DNP) et un hydroxyle protg par un groupement ter-butyldimthylsilyl. Laddition de lhydroxylamine substitue Me,SiCH,CH,OCONHOH sur la double liaison, en prsence de quantits catalytiques de Ph,P. HBr donne lurthane 18.17. On libre alors la fonction thiol, ce qui donne 18.18, qui se condense sans difficult sur le chlorure dacide 18.15. On arrive ainsi une version protge du fragment DCB, jusque et y compris latome dazote, 18.19.

18.8

18.9

18.10

FH3
WH,
18.11

18.12

Les synthses du pseudo-oligosaccharidede la calichamicine

OTBS

OR
R = AC, R = I 18.14 R = TBS, R = CO,Me 18.15 R = TBS, R = COCl
18.13 18.16

RS -ONHCOOCH2CH2SiA4e3 OTBS
18.17 18.18

R=DNP R=H

Le prcurseur de lunit A est le glycal 18.20, prpar partir du D-fucose, dont un hydroxyle est protg par le groupement paramthoxybenzyle (PMB). Le traitement par le 2,2-dimthyldioxirane donne Ioxirane 18.21 (un anhydride de Brigl), qui est trs facilement converti en glycoside trans, 18.22, par simple mlange avec lalcool paramthoxybenzylique la temprature ambiante. Des deux hydroxyles libres de ce glycoside, seul lquatorial est ractif dans le couplage conscutif.

286

Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et l'ADN ?

H3

HgJ
O
18.21

18.20

HO

PMBO
OH

OPMB

18.22

18.23

R'O

PMBO

omm

PhtN

e
1 8 . 2 4 R = I, R' = H 18.25 R = R ' = H 1 8 . 2 6 R = H. R = Tf

Les synthses du pseudo-oligosaccharide de la calichamicine

287

Le glycal 18.23 est le prcurseur du rsidu E. I1 possde une fonction amine protge par transformation en driv phtalimido (abrg en Pht). I1 se condense avec le glycoside 18.22 en prsence du complexe I T 1 0 4 (syrn-collidine)2 pour donner le disaccharide 18.24. Liode est remplac par de lhydrogne par rduction avec le triphnylstannane. Sur ce compos, 18.25, lhydroxyle libre est activ par conversion en trifluoromthanesulfonate 18.26. On a ainsi prpar le fragment AE. Le pont exceptionnel -N-O- entre les fragments AE et DCB est construit par raction de ce trifluoromthanesulfonate 18.26 sur le sel de sodium de lurthane 18.19, en solution dans la N, N-dimthylformamide. I1 termine lassemblage du pseudo-ttrasaccharide. Lenlvement des groupements paramthoxybenzyle par oxydation donne un produit encore partiellement protg, 18.27 avec la fonction hmi-actal libre pour le couplage ventuel laglycone. La protection de lazote par drivation en urthane appelle quelques commentaires. Lunit A nest stable que glycosyle. Si lhydroxyle anomrique est libr, cette unit se transforme en pyrrolidinose, selon la raction (1 8.1). La drivation en urthane, inspire dun travail antrieur[7], a une double utilit : la proximit du carbonyle facilite la dprotonation de lazote et le 4-amino-4-doxyhexose rsultant de la libration de la fonction hmi-actal est protg sur lazote, ce qui vite sa transformation en pyrrolidinose. Aprs engagement de lhmiactal en liaison glycosidique, on effectue la dprotection de lazote de lhydroxylamine de faon pratiquement quantitative avec le fluorure de ttrabutylammonium.

(18.1) , , * -O- .

OR

18.2.2 Voie EABCD[51.L6]


On prpare le prcurseur 18.28 du rsidu E partir de la L-srine. La fonction amine secondaire est protge par drivation en 9-fluornylmthylcarbamate (R = C,,H,CH,OCO), que lon peut liminer dans des conditions alcalines modres. Le couplage du fluorure de pyranosyle 18.28 avec 18.29 utilise AgC10, (2 quivalents) et SnC1, ( 2 quivalents) comme promoteurs ( a l p = 4,5 :l). On obtient ainsi le fragment AE. On libre le systme cis-diol, qui est oxyd slectivement en hydroxy-ctone 18.30. La liaison BA est alors ralise par loximation de cette ctone par une glycopyranosylhydroxylamine,ce qui donne 18.31. En raison de linstabilit du rsidu A non glycosid dj mentionne, il faut conserver

288

Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et lADN ?

OMe
18.28 18.29

OH

18.30

18.31

R = Aroyl P N

18.32 R = C S - N

18.33

18.34

la fonction oxime jusquaprs le couplage. Elle est alors rduite par le cyanoborohydrure au pH 3. Pour en revenir 18.31, le produit a t prpar pour lintroduction du soufre en position 4 du trisaccharide EAB. On remplace le groupement aroyl par un thiocarbonylimidazole et le thionocarbonate 18.32 est isomrise par thermolyse en thioester en 4 (98 %), par rarrangement sigmatropique 3,3. Lassemblage final a lieu comme dans la synthse prcdente, par couplage dun chlorure dacide li au fragment CD au thiol libre li EAB.

18.2.3 Mthodes alternatives[8]

[O]

La glycosidation de loxime 18.33 par un phnyl pyranosyl sulfoxyde G-SOPh, en prsence de triflate de trimthylsilyle a lieu sur O(2) avec isomrisation du ctal, donnant 18.34. La rduction de 18.34 par le cyanoborohydrure donne uni-

Les synthses du pseudo-oligosaccharide de la calichamicine

289

quement la configuration a-D-gluco, 18.35, hydrolysable en hydroxylamine libre. La nitrone 18.36 obtenue en traitant cette hydroxylamine par le para-anisaldhyde est glycoside par un halognure de pyranosyle exclusivement sur loxygne (80 %O). Une voie daccs simple lunit B part du glycal du D-fucose, qui donne le glycoside 18.37 par traitement au mthanol en prsence dacide. Celui-ci est silyl slectivement en 3 par lintermdiaire du stannylne, donnant 18.38, puis converti en trifluoromthanesulfonate, 18.39. On introduit le soufre en 4 avec inversion de configuration par substitution nuclophile avec PhCOSK, dans la N-N-dimthylformamide 0C (80 %), 18.40. Aprs hydrolyse de lther silylique, on convertit 18.40 en trifluoromthanesulfonate 18.41. La solvolyse par leau a lieu avec participation du groupement benzoyl, ce qui entrane une inversion de configuration et une migration de benzoyl, pour donner la configuration souhaite, 18.42. Ces mthodes alternatives ont permis de prparer lanalogue du trisaccharide ABE prsent dans Iespramycine

18.35

18.36

RO

B s z
OMe
18.37 R = R = H 1 8 . 3 8 R = ter-BuSiMe2,R = H 1 8 . 3 9 R = ter-BuSiMe2,R = Tf

OMe
18.40 R = H 18.41 R = T f

OBz
18.42

OMe

290

Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et lADN ?

18.3 RECONNAISSANCE DU PSEUDO-TTRASACCHARIDE PAR LADN


La raction de la calichamicine avec la double hlice de lADN se distingue de faon significative de celle de son aglycone isole[].

18.3.1 Rupture de un ou deux brins


Le substrat est un ADN circulaire << super-enroul , << forme I , o la double hlice est referme sur elle-mme par liaisons covalentes. Lun des ADN grand cycle utilis tait long de 9 O00 nuclotides. La rupture dun seul brin produit la << forme II , ou entaille, et la rupture sur chaque brin, en des sites proches, la << forme III , linaire (Fig. 18.2). On sait sparer et doser ces trois formes par lectrophorse sur gel. Avec la calichamicine, en dbut de raction, le rapport rupture de deux brins sur rupture dun seul brin est 1:2. Avec la calichamicinone, ce rapport tombe 1:30 ; la rupture dun seul brin prdomine.

III

II

Figure 18.2 Reprsentation schmatique des formes I, II et III de lADN.

18.3.2 Efficacit compare


Le mme substrat et la mme technique permettent de comparer lefficacit de la calichamicine et de son aglycone spare. En prsence dun thiol rducteur, la calichamicine produit dj une dgradation importante la concentration 0,7 nM. A la concentration 1,5 pM, il ne subsiste plus que des petits nuclotides. La calichamicinone produit une rupture observable la concentration 13 pM.

18.3.3 Spcificit du site dattaque


On a reconnu demble que la rupture de chane par la calichamicine avait lieu au niveau de certains enchanements de ttranuclotides comme TCCG, TCCT, GCCT. Pour tudier ceci on a prpar par synthse le polynuclotide 18.43, 53 paires de bases, dont on na reprsent que lun des brins. Ce polynuclotide

S-TTTAACCGATCAGAATTCCGGTGCATGCATGCTCCTAAGTGTACGCCTAAGCTTCTT
18.43

Rfrences

291

incorpore les sites prsums dattaque, souligns par des caractres gras. I1 a t marqu radioactivement sur les deux brins de son extrmit 3,par un procd que nous ne dtaillerons pas ici. Aprs la rupture, les morceaux sont spars par lectrophorse sur gel et reprs par radioautographie. On observe effectivement les morceaux correspondant la rupture au niveau TCCT, mais les autres points de fragmentation ne sinterprtent pas aussi facilement. Dans dautres expriences[*], avec un autre type denchanement polynuclotidique, on a observ des fragmentations prfrentielles dautres niveaux, ainsi aux squences STTCA ; STTTT ; STTGT. Dans les deux cas, les coupures prfrentielles limitent le nombre de polynuclotides de rupture et llectrophorse sur gel ne rvle quun petit nombre de composs. Par contre, la rupture est anarchique avec laglycone et ceci se traduit par la prsence dun grand nombre de taches dintensit uniforme.

18.3.4 Conclusion
Ces rsultats suggrent une relation de reconnaissance entre certains enchanements nuclotidiques de la double hlice et le pseudo-oligosaccharide. Celui-ci interviendrait pour acheminer laglycone ractive vers un site particulier et, peuttre aussi, en ce site, lui donner lorientation prcise la plus favorable la rupture double brin. Une estimation grossire suggre que laffinit de la calichamicine pour la double hlice est de lordre de trois ordres de grandeur plus leve que celle de la calichamicinone. Le mthyl glycoside du pseudo-oligosaccharide, en occupant un site particulier sur la double hlice, le protge contre des agressions extrieures, par exemple la coupure par la calichami~inone[~I et la dsoxyribonuclase, enzyme de dgradation hydrolytique gnrale de On peut se demander quels sont les lments fondamentaux dans la structure du pseudo-oligosaccharide. I1 y a quelques rsultats suggestifs : la spcificit de la coupure reste inchange si on supprime les rsidus D ou E. Par contre, la calichamicine T, produit artificiel o ne restent plus que les sucres A et E, nagit qu une concentration beaucoup plus leve que le produit naturel, et de faon non slective. Un problme en suspens est celui de la capacit de reconnaissance du noyau aromatique. I1 est maintenant certain que latome diode joue un grand rle dans linter-

RFRENCES
[l] [2] [3] [4]
M. D. Lee et collaborateurs, J. Am. Chem. Soc., 114 (1992) 985-997. J. Golik et collaborateurs, J. Am. Ckem. Soc. 109 (1987) 3461-3464. M. D. Lee, G.A. Ellestad et D.B. Borders, Acc. Chem. Res., 24 (1991) 235-243. R. L. Halcomb, S. H. Boyer et S. J. Danishefsky, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 31

(1992) 338-342. [5] K. C. Nicolaou et collaborateurs, J. Am. Ckem. Soc., 112 (1990) 8193-8195 [6] K. C. Nicolaou et collaborateurs, Angew. Ckem. Int. Ed. Engl., 31 (1992) 340-342.

292

Y a-t-il une interaction de reconnaissance entre les oligosaccharides et lADN ?

[7] D. Yang, S. H. Kim et D. Kahne, J. Am. Chem. Soc., 113 (1991) 4715 -4716. [SI T. Bamhaoud, J.-M. Lancelin et J.-M. Beau, J. Chem. Soc., Chem. Commun., (1992) 1494-1496. [9] EY. Dupradeau, S. Allaire, J. Prandi et J.-M. Beau, Tetrahedron Lett., 34 (1993) 4513-4516. [IO] E. Da Silva, J. Prandi et J.-M. Beau, J. Chem Soc., Chem. Comm., (1994) 2127-2128. [ i l ] J. Drak, N. Iwasawa, S. Danishefsky et D. M. Grothers, Proc. Nutl. Acad. Sci. USA, 88 (1991) 7464-7468. [12] D. Kahne et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4608-4612. [I31 J. Aiyar, S.J. Danishefsky et D.M. Grothers, J. Am. Chem. Soc., 114 (1992) 75527554. [14] K.C. Nicolaou et coll., J. Am. Chem. Soc., 114 (1992) 7555-7557. [15] Tianhu Li et coll., J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) 3709-3715.

Index
Cet index ne fait pas double emploi avec la table des matires et nous conseillons de consulter celle-ci en priorit. La majorit des composs cits dans le livre ont t indexs. Nous avons utilis le nom dusage courant au laboratoire, par exemple, N-actylglucosamine, chaque fois que possible. Les autres produits sont classs par configuration. Les noms donns sont ceux de la nomenclature officielle, ce dtail prs que le descripteur de configuration devrait suivre et non prcder les termes de substitution.

Actimidates, 162-163 Actoxyoxanes, nergies libres conformationnelles, 27 N-Actylgalactosamine, 6 N-Actylglucosamine, 6 N-Actyllactosamine synthse chimique, 157 synthse enzymatiques, 171, 175 N-Actylmannosamine, 6 Acide N-actylneuraminique (voir aussi chapitre 12), RMN du proton, 24, 25, 198 9-O-actyl dans les oligosaccharides des mlanomes et du cerveau embryonnaire du rat, 273 synthse enzymatique, 202 Acides amins de la jonction sucre-protine, 217 Adnosine, 67 diphosphate, 85-86 triphosphate, 85-86 Adhsion (molcules d), 275 Agarose, 171 Agglutinines froides, 258 a - D - Aiiofuranose 3-azido- 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne, 110 1,2 ; 5,6-di-O-cyclohexylidne-3-Cmthyl, 120 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne-3-O-tosyl,
110

mthyl 2,3-anhydro-4,6-0-benzylidne, 113 a-D-Allopyranosyl-a-D-allopyranoside, complexe calcique, 179 Altona-Sundaralingam (convention), 42 a-D-Altropyranoside, mthyl 3,4-anhydro, isomrisation, 114 Amylopectine, 187 Anticorps catalytiques, 243 monoclonaux, 239 polyclonaux, 238 Antignes 19.9, et diagnostic du cancer, 272 A priodique, 255-256 dans le dveloppement embryonnaire, 273-274 Forssman, 273
P, 256

SSEA-1,274 sur les cellules cancreuses, 272 T, 255-256 Antithrombine III, association au site actif de lhparine, 268 Apiose, 120 P-D-Arabinopyranosyle, chlorure, tri-Oactyl, RQN de 35Cl,34 Autoimmunes (maladies), 258 Azidonitration. 164 B Benzoquinone, 2,3-dichloro-5,6-dicyano, 81 Bismuth, diactyltriphnyl, 82 Butane, conformation, 28

a+- Allopyranoside mthyl, complexation de Ca++, 180 mthyl 2-actamido-4,6-0-benzylidne-2-doxy, 117

294

Index

C Calichamycine y;, 280 Calichamycinone, 280 Cramide, 2 13 Chiron (mthode), 133 Chitine, 264-265 Chondrotine, 223 Chromatographie daffinit dhparine et de son site actif, 269 des lectines, 245-246 dexclusion, sur gel, pour Iantithrombine III, 269 sur couche mince pour les noglycolipides, 276 sur changeur danions, pour isoler lhparine, 266 sur changeur de cations en plaques, 179 sur colonne prparative, forme Ca++, 12, 181 Claisen, rarrangement, 124-125 Couplage I3C - H, et effet anomrique, 35 Cycloaddition, paramtres thermodynamiques en phase aqueuse, 195 Cyclohexanone, 2,3,4-tribenzoyloxy-5hydroxy, 120 Cyclopentadinyltitane, trichlorure, 127 Cytidine, 67 diphosphate, 206-207 5-monophosphate, 206-207 5-monophosphosialic acid, 205-206 5-monophosphosialic acid synthtase, 205-206 triphosphate, 206-207 D Dermatane sulfate, 223 Dsoxyadnosine, 67, 28 1 Dsoxycytidine, 67, 281 Dsoxyguanosine, 67, 281 Dsoxyribose, 8 composition tautornrique dans leau, 15 Dterminant antignique (voir aussi pitope), 240 Dimthoxymthane, conformation, 35 Dimthyldioxirane, dans lpoxydation des glucals, 53 Dimthylsulfoxonium mthylure, 122 Dithiane, 121

E Electrophorse mobilit des cations complexs, 180 sur papier, 179 Endoglycosidases, 147-148 Epimrase, 170-171 Epitope, 240 D-Erythrose, 94 F Fischer, convention, 6-8 FK 506, diverses reprsentations, 134 Fonction de distribution radiale de leau. 182 a-D-Fructofuranose 1 ,o.diphosphate biosynthse, 19 composition tautornrique dans leau.
15

P-D-Fructopyranose 1,2 : 1,2-dianhydride, complexes mtalliques, 179 P-D-Fructopyranoside, mthyl, vitesse dhydrolyse 100C, 56 P-D-Fructopyranosylarnine, N-aryl, 65 D-Fructose, 7 composition du mlange de mthanolyse acide, 47 composition tautornrique dans leau,
15

dichrosme circulaire, 13 D-Fructose, 1-doxy composition tautornrique dans leau, 15 dichrosme circulaire, 13 a-~-Fucp- ( 1 -2)-P-~-Gaip -( 1-4)-a-DGlcNAc-( 1-OBn), driv partiellement protg, 260 a-L-Fucopyranose, tri-O-benzyl, 62 a-L-Fucopyranoside, mthyl, RMN du proton, 24, 25 tri-O-benzyl, 62 vitesse dhydrolyse 100C, 56 a-L-Fucopyranosyle bromure, tri-O-benzyl, dans la synthse des trisaccharides Lea et B, 259 chlorure, tri-O-actyl, RQN de 35Cl,34 L-Fucose, 7 composition du mlange de mthanolyse acide, 47 Fucosyltransfrase, 173 0.-1,2, 174 a-1, 314, 174 Frst-Plattner, rgle, 1 13

Index

295

D-Galactal conversion en talose, 1 18-119 tri-O-actyl, azidonitration, 164 a-D-Galactofuranoside, mthyl, 45 P-D-Galactofuranoside, mthyl, prparation, 48 a-D-Galactopyranose, I ,2 : 3,4-di--isopropylidne o-doxy, 95 prparation, 87 RMN et conformation, 26 6-O-tosy1, 95, I10 a-D-Galactopyranoside aryl, comme galactosylant enzymatique, 61 comme accepteur enzymatique, 61 mthyl, 45 mthyl 4-O-benzoyl-6-bromo-6-doxy,
88 mthyl4,6-O-benzylidne, 88

chlorure, 3,4,6-tri--actyl-2-azido-2doxy, 164 phnylsulfoxyde, ttra-O-benzyl, couplage, 166 D-Galactose, 6 adaptation l'eau, 193 composition du mlange obtenu par mthanolyse acide, 47 composition tautomrique dans l'eau,
15

dichrosme circulaire, 13 2,3,4,6-ttra-O-mthyl, 148 a-Galactosidase, en couplage osidique.


175

mthyl 3,4-O-isopropylidne, 87 paranitrophnyl, comme galactosylant enzymatique, 175 vitesse d'hydrolyse acide 100"C, 56 P-D-Galactopyranoside benzyl, 84 benzyl, 2-actamido-2-doxy, prparation, 11 1 benzyl, 3-O-allyl-2,4-di-O-benzyl, 26 I benzyl, 3-O-benzy1, 84 benzyl, 2,6-di-O-benzyl, 91 mthyl, 45 RMN du proton, 23, 25 mthyl 3-0-allyl-2,4,6-tri-O-triflyl, substitution, I09 paramthoxybenzyl, 6-doxy-3-O-paramthoxybenzyl, 286 a-D-Galactopyranosyle bromure, 6-O-actyl-2,3-4-tri--benzyl, couplage, 167 bromure, ttra-O-actyl, prparation et couplage, 49-50, 167 bromure, 3,4,6-tri-O-actyl-2-azido-2doxy, couplage, 260 chlorure, ttra-O-actyl, RQN de % 2 c 1 , 34 nitrate, 3,4,6-tri-O-actyl-2-azido-2doxy, 164 P-D-Gaiactopyranosyle chlorure, ttra-O-acetyl, RQN de "Cl, 34

P-Galactosidase, de B.circuZuns, en couplage osidique, 175 Galactosyltransfrase, 169-171 a-D-Galp-( i -3)-a-D-Gaip-( i -OMe), synthses enzymatiques, 61, 175 hepta-O-benzyl ther, synthse, 166 P-D-Gaip-(i -4)-P-~-GlcNAcp-( 1 -~)-[P-DGICNACp-( I -3)]-P-~-Gaip-( I -4)-P-DGlc-( 1 -0Me) prparation, 172 RMN du proton, 155 Gangliosides, des granulocytes, spectromtrie f.a.b., 151 Globoside, 256 D-Glucal, 119 2-actoxy-3,4,6-tri-O-actyl, 135 tri-O-actyl, 1 19 tri-O-benzyl, poxydation, 53
D-Glucitoi

1,3 ; 2,4 ; 5,6-tri-O-benzylidne, 87 1,2 ; 3,4 ; 5,6-tri-O-isopropylidne, 88 a-D-Glucofuranose, 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne, 87 alcoolate avec le chlorocyclopentadinyltitane, 127 3-azido-3-doxy, 109 3-O-(truns-butadinyl), cycloaddition, 130 3-O-imidazyl, substitution, I I0 3-O-tosyl, inertie, 1 1 0 a-o-Glucofuranose, 1;2-O isopropylidne, complexe avec le periodate, 92-93 P-D-Glucofuranoside, thyl, hydrolyse, 56 a-D-Glucopyranose 2-actamido- I ,3,4,6-ttra--acty1-2doxy, 162 1,2-anhydro, prparation, conversion en glycoside, 53

296

Index ter- butyl, vitesse d'hydrolyse I O O T ,

56 thyl, vitesse d'hydrolyse 100C, 56 mthyl, vitesse d'hydrolyse lOO"C, 56 mthyl 2-actamido-2-doxy, vitesse d'hydrolyse 100C, 56 mthyl 3,4,6-tri-O-actyl-2-chloromercuri-2-doxy, 119 mthyl 2-amino-2-doxy, vitesse d'hydrolyse 100C, 56 mthyl 2,3-di-O-benzyI-4,6-O-benzylidne, 89 mthyl 2,3,6-tri-O-benzyl, 89 paranitrophnyl, hydrolyse chimique et enzymatique, 58 1,3,4,6-ttra-O-actyl-2-bromo-2doxy, substitution radicalaire, 124 phnyl ttra-O-actyl, prparation, 5 1 D-GlUcOpyranOSe, 2,3,4,6-ttra-O-actyl, conversion en l,o-anhydro, 52 83 phnyl ttra-O-benzyl, 89 a-D-Glucopyranoside trimthylmthyl, vitesse d'hydrolyse benzyl 6-O-actyl-3-O-benzyl-2-benzyIOO'C, 56 loxycarbonylamido-2-doxy, dans la P-D-Glycopyranosylamine et drivs Nsynthse du site actif de l'hparine, substitus, 63 270 2-actamido-tri-O-actyl-2-doxy, benzyl 2,3,6-tri-O-benzyl, trans butaamide avec l'acide aspartique, 64 dienyl ether, cycloaddition, 129 a-D-Ghcopyranosyle mthyl, 48 bromure, ttra-O-actyl, conversion en cintique de l'hydrolyse 100C, 56 actoxyglycal, 135 rnthyl 2-actarnido-4,6-O-benzyliden glycosylation, 161 ne-2-doxy-3-O-msy1, conversion bromure, 3,4,6-tri-O-acty1-2-bromo-2en driv d o , 1 17 doxy, 119 mthyl 4,6-O-benzylidne, 87 chlorure, 2-actamido-3,4,6-tri-O-acmthyl 4,6-0-benzylidne-2-O-tosyl, tyl-2-doxy, 64, 162 conversion en oxirane, 112 chlorure, ttra-O-actyl, 116 mthyl 2,3 ; 4,6-di-O-cyclohexylidne, en glycosylation, 161 88 RQN de 35Clet conformation, 33-34 mthyl ttra-O-actyl, 5 1 fluorure, 4-O-actyl-2,3-di-O-benzyl-6mthyl 3,4,6-tri-O-actyl-2-bromo-2O-(ter butyldiphnylsilyl), en glycodoxy, 119 sidation, 164 mthyl 6-O-trityl, 81 phosphate, 170 phnyl, cintique de l'hydrolyse phosphate, ttra-O-actyl, 86 100C, 56 P-D-GhCOpyranOSyk phnyl ttra-O-actyl, 5 1 azoture, 2-actamido-3,4,6-tri-O-actylfi-D-Ghcopyranoside 2-doxy, 64 benzyl 2-actamido-3-O-actyl-2-doxychlorure, ttra-O-actyl, isomrisation 4,6-di-O-msyl, inversion de configuen driv ido, 116 ration, 111 chlorure, tri-O-actyl-2-doxy-2-phtalibenzyl 2-actamido-4,6-0-benzylidnemido, 162 2-doxy, glycosidation, 167 phosphate, ttra-O-actyl, 86 benzyl 3-0-benzyl-4,6-0-benzylidneRQN de 35Cl,33-34 2-O-imidazyl, raction SN2, 1Il D-Glucose, 6 benzyl 4,6-0-benzylidne-2-doxy-2adaptation l'eau, 192-193 phtalimido, glycosidation, 167 aldhydo, hydrat, 10

B-D-Glucopyranose 2-actamido- 1,3,4,6-ttra-O-actyI-2doxy, 162 3-O-actyl- 1,6-anhydro-2-azido-2doxy, dans la synthse du site actif de l'hparino, 270 I,o-anhydro, 52 1,6-anhydro-2-O-tosyl, conversion en poxyde, 112 penta-O-actyl, 116 conversion en bromure, 49 en glycosidation, 49, 161 hydrolyse slective, 83 isomrisation avec SbCI,, 116

Index

297

composition du mlange de glycosidation, 47 composition tautomrique dans l'eau,


15

dichrosme circulaire, 13 2,3 ; 5,6-di-O-isopropylidne, dimthyl actal, 158-159 5,6-di-O-mthyl, dichrosme circulaire,
13

a-D-ribo-Hexofuranose, 3-doxy- 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne, 95 Hexokinase, 86 P-D-gluco-Hexopyranose, 1,3,4,6-ttra-O-actyI-2-C-allyl, synthse radicalaire, 124
1,3,4,6-ttra-O-acty1-2-bromo-2-

doxy, substitution radicalaire, 124


a-D-ultro-Hexopyranoside, mthyl 4,6-O-

mutarotation, 4 2,3,6-tri-O-mthyl, 148 6-phosphate, 85-86 RMN du proton, 5 [ I - 13C]-~-Giucose, RMN de I3C des tautomres, 14 D-Glucuronique (acide) benzyl P-D-pyranoside, 2-benzyloxycarbonylamido-2-doxy, 93 a-D-fUranOSe, mthyl ester, 3-O-benzyl1,2-O-isopropylidne, 270 Glucuronosides, synthse enzymatique, 174 D-Glycraldhyde, 6 2,3-O-isopropylidne, 94 Glycerol, tripivalate et pivaloyloxonium, 115 Glycosidases, 59 Glyoxylique (acide), ester butylique, cycloaddition, 129-130 GMI, 214,215 Groupes sanguins A, pitope trisaccharidique, 254 A,, A,, sous-groupes, 257 B, pitope trisaccharidique, 254 O, et dterminant H, 253,254 Guanosine, 67 diphosphate, 174 diphosphate-fucose, 173 triphosphate, 174
H Hamamlose, 120, 121 Hmatoside, 2 14, 2 15
a-D-glycro-a-D-gulo-Heptopyranoside,

benzylidne-2-doxy-2-C-mthyl, 123
a-D-rythro-Hexopyranoside, mthyl3-0-

benzoyl-6-U-ter-butyIdiphnylsilyl-4C-mthoxycarbonylmthylne-2,4didoxy, 122 a-D-urubino-Hexopyranoside, mthyl 2doxy, vitesse d'hydrolyse I00"C, 56 a-o-riho-Hexopyranoside mthyl 2-C-actyl-2-O-benzoyl-4,6-Ubenzylidne-3-doxy, 123 mthyl-2-C-actyl-4,6--benzylidne2,3-didoxy, 123 a-D-lyxo-Hexopyranoside, mthyl 3,6didoxy, 114 a-D-r~ho-Hexos-3-ulofuranose,1,2 ; 5,6di-O-cyclohexylidne, 120 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne, 91 a-D- ryth ro - Hex0 s - 3-ul O py ranosi de, mthyl4.6-0-benzylidne-2-doxy, 89 a-D-ryt h ro -He xo s -4-ul opy ran0 s i de, mthyl 3-O-benzyoyl-6-O-ter-butyldiphnylsilyl-2-doxy, 122 ~-~-rythro-Hexos-2-ulopyranoside, 3,4O-isoproppylidne, conversion en hamamlose, 121 a-~-ribo-Hexos-3-ulopyranoside, mthyl 4,6-0-benzylidne-2-O-tosyl, 91 ~-~-nylo-Hexos-4-ulopyranoside, benzyl 2,6-di-O-benzyl, 91 Hyaluronique (acide), 223 Hybridomes, 239, 271 Hydradation hydrophobe, 184 Hypophosphoreux (acide), 95
I a-L-Idofuranuronate, mthyl, 3-O-benzyl1,2-O-isopropylidne, 270 a-L-Idopyranose, conformation, 40 pentaactate, conformation, 41 P-D-idopyranose, 1,6-anhydro, prparation et configuration, 5 1-52

mthyl, complexe calcique, 177-178 a-~-rythro-Hex-2-nopyranoside, terbutyl 2,4,6-tri-O-acty1-3-doxy, 136 ~-rythro-Hex-2-nopyranoside, 4,6-di-0actyl-2,3-didoxy, 119 P-D-xylo-Hex-5-nopyranose, 1,2,3,4ttra-U-benzoyl-6-doxy, 120

298

Index

a-L-Idopyranosiduronique (acide), confor-

mation des rsidus dans les glycosaminoglycanes, 40 a-D-Idopyranosyie, chlorure ttra-O-actyl, RQN de "CI, 34 D-Idose, ttraactate, synthse, 116 Imidazole N-benzoyl, 83 thiocarbonyl (bis), dans la prparation des thionocarbonates, 139 Imidazolylsufonates, 108 Immunoglobulines, 236-238 Immunoglobulines IgG,, dcasaccharide et conformation, 221-222 Indole-glycrol, 3'-phosphate, 66 Inositol (ci$),lectrophorse, 179
K KDN, 200-201 Kratane sulfate, 224
L

Lactobionique (acide), 157 Lactosaminide, 2,2,2-trichlorthyl, driv partiellement protg dans la synthse du trisaccharide Lea, 259 Lactose allylation rgioslective, 158-159 dgradation, 157 oxydation, 157 tri-O-isopropylidne, dimthyl actal,
159

Lactotransfrine humaine, dodcaaccharide-asparagine, 232-233 Luthyrus Ochrus, lectine, structure aux rayons X, 232 Lemieux-Karplus (courbe de), relative au couplage 3J,- H' 145 Lvulinique (acide), par traitement acide du dsoxyribose, 47 L2/HNK-1, 2 11 Longueurs de liaisons dans le glucose, 30 en relation avec l'effet anomrique, 30 D-Lyxal, 6-doxy-3-O-mthoxybenzyl, 286
M

b-D-Mannofuranose, complexe calcique, 178 2,3 ; 5,6-di-O-isopropylidne, ramification, 125 oxime, 131 2-C-hydroxymthyl-2,3 ; 5-6-di-O-isopropylidne, 125 P-D-Mannofuranoside, mthyl, 48 a-D-Mannopyranose, 2,3-anhydro-4,6-0benzylidne, 112 0-D-Mannopyranose, 1,6 ; 2,3-bis-anhydro, 112 a-o-Mannopyranoside mthyl 2,3-anhydro, isomrisation, 114 mthyl, 2,3-anhydro-4,6-0-benzylidne, 112 mthyl, 2,3 ; 4,6-di-O-benzylidne, 89 a-L-Mannopyranoside aryl, 285 benzyl, 284 4-O-ter-butyldimthyIsilyl-6-doxy-3O-mthyl, 284 6-doxy-2,3-0-isopropylidne, glycosylation, 167 P-D-Mannopyranoside, prparation, 50 benzyl, 2-azido-3-0-benzyl-4,6-O-benzylidne-2-doxy, dans la prparation des drivs de la N-actylmannosamine, 111 2-O-benzoyl-3-O-benzyl-4,6-O-benzylidne, par inversion sur C(2), 165 mthyl, 3-0-allyl-2,4,6-tri-O-benzoyl, 109 a-D-Mannopyranosyie bromure, 6-0-actyl-2,3,4-tri-O-benzyl,
16.5

Maltose, structure l'tat solide, 23 1 Mannitol, 1,2 ; 5,6-di-O-isopropylidne, 94

bromure, 3,4,6-tri-O-acty1-2-bromo-2doxy, 119 chlorure, ttra-O-actyl, RQN de 35CI, 34 phosphate, 174 a-L-Mannopyranos y le trichloractimidate, 4-O-ter- butyldimthylsilyl-6-doxy-3-O-mthyl, 284 P-D-Mannopyranosyie chlorure, tetraactyl, RQN de 35Cl, 34 Mannosamine, N-actyl, reprsentation Fischer, 6 D-Mannose, 6 composition du mlange obtenu par mthanolyse acide, 47

Index

299

composition tautomrique dans l'eau, 15 dichrosme circulaire, 13 Msoxalate d'thyle, cycloaddition, 130 Mthoxythane, conformation, 28 Mthoxymercuration (des glycals), 118 Mthyl chloromthyl ther conformation l'tat gazeux, 30 constantes physiques, 30 orbitales molculaires, 32 Mutarotase, 19
N Noglycolipides, prparation par chromatographie, 276 a-D-NeuSAcp-(2-3)-P-~-Galp-( 1-3)-Glc NAc, synthse enzymatique, 208 a-~-NeuSAcp--(2-6)-P-~-Galp-( 1-~)-P-DGlcNAcp-( 1-2)-a-~-Manp-( 1 -OMe), synthse enzymatique, 208 a-D-Neu SAcp-(2-3)-P-~-Galp ( 1 -4)-Glc, synthse d'un driv protg par couplage, 204-205 a-D-Neu 5,9 Ac, p -( l-o)-P-~-Galp(l-4)GlcNAc, synthse enzymatique, 208 Neuraminidases, 200 Nicotinamide adnine diphosphate, 174 Nitrate crique ammoniacal, 8 1 Nuclotides-sucres, gnralits, 1 73
O

a-D-qthro-Pentopyranoside, mthyl 2doxy, vitesse d'hydrolyse 100"C, 56

Peptide-N4-(N-actyl-P-glucosaminyl) asparagine amidase F, dans l'tude de la thyroglobuline porcine, 153 Pfitzner et Moffat (raction d'oxydation), 89 Phosphnolpyruvique (acide), 86, 170 Polymorphisme (des antignes de groupe sanguin) 254 Polysialiques (acides) dans Escherichia Coli KI, 210 dans les toiles de mer, 209 dans Neisseria meningitidis, 209 immunochimie, 209-210 Promoteurs de glycosidation, 160, 161, 162 Pseudorotation, 42 Pyruvate kinase, 86, 170
R Racteur membrannaire, 175 Ractions croises, 243 L-Rhamnal, di-O-actyl, 284 a-L-Rhamnopyranosyl, chlorure, tri-Oactyl, RQN de %, 34 D-Ribofuranosyle, chlorure, tri-O-actyl,
68

Overhauser (effet), 185 Oxane 2-chlor0, conformation, effet anomrique, 31 orbitales molculaires, 36 2-chloro-4-mthy1, quilibre cis-trans,
31

cis-2,5-dimthyl, conformation, 29 2-hydroxymthyl, nergie libre conforinationnelle, 29 mthyl, nergies libres conformationnelles, 29 Oxyde de dibutyltain, 84
P a-D-ribo-Pentodialdo- 1,4-furanoside, mthyl 2,3-O-isopropylidne, 91 a-D-erythro-Pentofuranose, 5-O-benzoyl3-doxy- 1,2-O-isopropylidne-3-Cmthylne, 121

D-Ribonic (acide), 1 -4-lactone, 139 P-D-Ribopyranose, ttra-O-actyl, RMN du proton et conformation, 37 0-o-Ribopyranoside, mthyl, vitesse d'hydrolyse 100"C, 56 P-D-Ribopyranosylamine, prparation, 68 2,3-O-isopropylidne, 68 P-D-Ribopyranosyle, chlorure, tri-O-actyl, RQN de "Cl, 34 D-Ribose, 6 composition du mlange obtenu par mthanolyse acide, 47 composition tautomrique en solution aqueuse, 15 dichrosme circulaire, 13 5-phosphate, 65 Ribosylimidazole, 69
S Saccharose, 53 Slectines (ligands des) sialyl, 3'-sialyl-Lewisa, 278 sialyl, 3'-sialyl-LewisX,278

300

Index

sulfat, pentasaccharide, 152, 278 sulfat, ttrasaccharide, 277 Srie D, dfinition, 7 nomenclature, 9 origine naturelle, 8 Sialosides, hydrolyse acide, 57 Sialylaldolase prparation de NeuSAc et analogues, 202 spcificit, 202-203 Sialyltransfrases, 206, 207 Silane ter-butylchlorodimthyl, 82 ter-butylchlorodiphnyl, 82 Sphingosine, 213 Stabilit (constantes de) complexes de la cyclodextrine, 185 complexes des sucres, 181 Strodiffrenciation. 167-169
T a-D-Talopyranoside, mthyl 2,3-anhydro6-doxy, rduction, 114 D-Taiose, adaptation l'eau, 193 prparation, 118 Thymidine, 67, 281 Thyroglobuline porcine, tude par RMN, 153-I55 Trhalose, 141 Trichloroactimidates, 162-163 Trifluoractolyse, 2 19
Trifluoromthanesulfonates, 108 Triphnylchloromthane, 8 i

Uridine diphosphate, 170 Uridine-diphosphate-galactose, 170 Uridine-diphosphate-glucose, 170 Uridine triphosphate, 170
V Vorbrggen (mthode), synthse des nuclosides pyrimidiques, 68 W Wittig (raction), 121 Wittig-Horner (raction), 122
X Xylobiose, 4-thio, 169 a-D-Xylofuranose, 3-O-acryloyl- 1,2-O- isopropylidne-5O-trimthylsilyl, cycloaddition, 130 5-O-benzoyl-3-C- hydroxymthyl- 1,2O-isopropylidne, 121 5-O-benzoyl-1,2-O-isopropylidne-3C-tosyloxymthyl, 121 1,2-O-isopropylidne-3-C-mthyl, 121 P-D-Xylopyranose ttra-O-actyl, conformation, 39 ttra-O-benzoyl, conformation, 39 2,3,4-tri-O-actyl-l-thio, 169 a-D-Xylopyranosyle, chlorure, tri-O-actyl, RQN de 35Cl,34 p-D-Xylopyranosyle, chlorure, tri-O-actyl, RQN de "CI, 34 chlorure, tri-O-benzoyl, conformation, 39 conformation, 39 fluorure, tri-O-actyl, conformation, 22, 39 fluorure, tri-O-benzoyl, conformation, 35,39

Triphnylstannane, 124
U

Ugi (raction), 132 Uridine, 67

Imprimerie Louis-Jean - Gap Dpt lgal, no 987, janvier 1995