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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA FACULTE DES SCIENCES

DE LA NATURE ET DE LA VIE ET DES SCIENCES DE LA TERRE ET DE LUNIVERS DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

Mmoire de Magister
En vue de lobtention du Diplme de Magister en Biologie Option : Microbiologie applique

THEME :

EFFET DES BACTERIOCINES (TYPE NISINE) PRODUITES PAR UNE SOUCHE LACTIQUE ISOLEE A PARTIR DU FROMAGE CAMELIN, SUR UNE SOUCHE PSYCHROTROPHE.

Prsent et soutenu publiquement par : M elle SOUID WAFA

Devant le jury: Prsident Encadreur Examinateur Examinateur Invite Mr ADAMOU A. Mme SIBOUKEUR O. Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Mr OULD EL HADJ M.D. Mme BOUDJENAH S. Maitre de confrences A Maitre de confrences A Maitre de confrences A Professeur Maitre -assistant A (U.K.M.O) (U.K.M.O) (U.K.M.O) (U.K.M.O) (U.K.M.O)

Anne universitaire : 2010 / 2011 Remerciements

Remerciements
Avant tout, je remercie Dieu le tout puissant, le Misricordieux, de mavoir donn le courage, la force, la sant et la persistance et de mavoir permis de finaliser se travail dans de meilleurs conditions. Je tiens remercier ma promotrice Mme SIBOUKEUR Oum-el-kheir, Matre de confrences A luniversit KASDI MERBAH dOuargla, pour lhonneur quelle ma fait en dirigeant ce travail, pour ses aides, ses conseils, tout au long de l laboration de ce modeste travail. Je remercie infiniment ma Co-promotrice, Mme BOUDJENAH Saliha, Matre-assistant A luniversit KASDI MERBAH dOuargla, pour avoir propos ce thme, pour ses aides, ses conseils et sa disponibilit. A Mr ADAMOU A ., Matre de confrences A luniversit KASDI MERBAH dOuargla, jadresse mes remerciements les plus sincres pour lhonneur quil me fait en acceptant de prsider ce jury. Je tiens remercier profondment Mme OULD EL HADJ-KHELIL Aminata, Responsable de la Post-Graduation, Option Microbiologie applique, Matre de confrences A luniversit KASDI MERBAH dOuargla, davoir accept dexaminer ce travail et pour son soutien morale inoubliable. Mes plus vifs remerciements sadressent Mr OULD EL HADJ Mohamed Didi, professeur luniversit KASDI MERBAH dOuargla, de lhonneur quil me fait en acceptant dexaminer ce mmoire. Au personnel des laboratoires pdagogiques, et du laboratoire de protection des cosystmes en zones arides et semi-arides pour leur aide et leurs conseils durant llaboration de lexprimentation de ce mmoire. J'adresse ma reconnaissance Mr BENSACI Messaoud Bachagha et Melle HASSAINE Amina pour leur soutien et leur infinie gentillesse. Enfin, je remercie, tous ceux qui de prs ou de loin, ont contribu la ralisation de ce travail.

Ddicaces

Je ddie ce mmoire :

Ma trs chre mre ; La mmoire de mon pre ; Mes frres et surs ; Toute ma famille ; Tous mes chers amis.

Sommaire

Pages Introduction............................... ..1 I. Synthse bibliographique... ...4 1.1. Prsentation du lait de chamelle ..4 1.1.1. Caractristiques physico-chimiques du lait camelin.4 1.1.2. Composition biochimique du lait de chamelle..5 1.1.3. Proprits antimicrobiennes du lait de chamelle..6 1.2. Conservation et transformation du lait de chamelle9 1.2.1. Mthodes de conservation de lait de chamelle ..9 1.2.1.1. Pasteurisation ..9 1.2.1.2. Strilisation... ..9 1.2.1.3. Thermisation..10 1.2.1.4. Rfrigration10 1.2.1.5. Action du froid sur le lait10 1.2.2. Flore psychrotrophe du lait12 1.2.2.1. Pseudomonas fluorescens..13 1.2.2.2. Impact des bactries psychrotrophes dans le lait... ..14 1.2.3. Aptitude du lait de chamelle la transformation en fromage18 1.2.4. Bactries lactiques et fabrication du fromage............................................................20 1.2.4.1. Lactococcus lactis.......20 1.2.4.2. Rle de Lactococcus lactis dans la fabrication du fromage.21 1.3. Bactriocines...........23 1.3.1. Bactriocines des bactries lactiques..24 1.3.1.1. Classification des bactriocines des bactries lactiques .24 1.3.1.2. Intrts des bactriocines. .....25 1.3.2. Production et conditionnement des bactriocines ...26 1.3.2.1. Production des bactriocines......26 1.3.2.2. Conditionnement des bactriocines. ...27 1.3.3. Mode dutilisation des bactriocines28 1.3.4 .La nisine... ....28 1.3.4.1. Structure et proprits physico-chimiques.28 1.3.4.2. Biosynthse de la nisine .30

1.3.4.3. Spectre dactivit...31 1.3.4.4. Mode daction31 1.3.4.5. Toxicit de la nisine...33 1.3.4.6. Rle de la nisine dans la conser vation des aliments.33 1.3.4.7. Mthodes de dtection et de quanti fication de la nisine34 II. Matriel et mthodes.. 36 2.1. Matriel....36 2.1.1. Echantillons de lait de chamelle...36 2.1.2. Appareillage.36 2.1.2.1. Appareils utiliss pour les analyses physico-chimiques....36 2.1.2.2. Appareils utiliss pour la prparation du fromage.36 2.1.2.3. Appareils utiliss pour les manipulations microbiologiques.36 2.1.3. Verrerie et petit matriel.37 2.1.4. Ractifs....37 2.1.5. Milieux de culture37 2.2. Mthodes.39 2.2.1. Analyses physico-chimiques.40 2.2.1.1. Mesure de l'acidit...40 2.2.1.2. Densit.40 2.2.2. Analyse microbiologiqu e du lait ..40 2.2.3. Isolement et identification De la souche productrice de nisine partir dun fromage frais camelin...41 2.2.3.1. Isolement41 2.2.3.1.1. Essai de fabrication de fro mage camelin frais41 2.2.3.1.2. Technique d'isolement de la souche productrice de nisine..41 2.2.3.2. Identification biochimique de la souche Lactococcus lactis ssp. lactis.43 2.2.4. Production de nisine partir de culture de Lc.lactis ssp. Lactis 46 2.2.5. Isolement et identification de lespce indicatrice....4 8 2.2.5.1. Isolement.48 2.2.5.2. Identificati on...48 2.2.6. Etude de l'activit inhibitrice de la nisine sur Pseudomonas fluorescens49 2.2.6.1. Prparation de linoculum...49 2.2.6.2. Mthode des puits50 2.2.6.3. Mthode des spots50

2.2.6.4. Mthode des disques imprgns..50 2.2.6.5. Mesure de lactivit antibactrienne en unit arbitraire (UA /ml). 51 III. Rsultats et discussion...52 3.1. Analyses physico-chimiques et microbiologiques..52 3.1.1. Analyses physico-chimiques.52 3.1.1.1. pH....52 3.1.1.2. Acidit.52 3.1.1.3. Densit....53 3.1.2. Qualit bactriologique de lait camelin....53 3.2. La fabrication du froma ge camelin.54 3.3. Identification de la souche productrice de nisine isole partir Du fromage camelin..55 3.4. Identification de la souche indicatrice isole partir du lait camelin Rfrigr.57 3.5. Production de la nisine et tude de lactivit antibactrienne de la nisine sur la souche Pseudomonas fluorescens...........61 Conclusion.66 Rfrences bibliographiques Annexes

Liste des abrviations

Ps. ssp. UHT ECD Lc. BL Sp. Nis . EDTA BN GNO SCN Zi

Pseudomonas Sous-espce Ultra Haute Temprature Extrait coagulant gastrique de dromadaires Lactococcus Bactries lactique espce nisine Ethylne Diamine Ttra Actique bouillon nutritif Glose nutritif ordinaire Surnageant de culture neutralise Zone dinhibition

Liste des figures

N 1 2 3 4 5 6 7

intitul Evolution de la flore bactrienne d'un lait rfrigr (D aprs AUCLAIR, 1979) Structure de quelques bactriocines des bactries lactiques (les lantibiotiques) Structure de la nisine A et de la nisine Z (Mc AULIFFE et al, 2001). Modle de formation dun pore transmembranaire par la nisine (SAHL et al, 1998). Procdure exprimentale Etapes de fabrication du fromage camelin frais Production de nisine partir dune culture de Lc.lactis ssp.lactis

page 13 27 30 33 40 43 48

Liste des photos

N 1 2 3 4 5 6 7 8 9

intitul Culture bactrienne sur milieu M17 Identification par la galerie biochimique API 20 E (Lc.) Culture bactrienne sur milieu GNO Identification par la galerie biochimique API 20 E ( Ps.) Culture bactrienne sur King A Culture bactrienne sur King B Activit antibactrienne du SCN vis--vis Ps. fluorescens par la mthode des spots Activit antibactrienne du SCN vis--vis Ps. fluorescens par la mthode des disques Activit antibactrienne du SCN vis--vis Ps. Fluorescens par la mthode des puits.

page 56 57 59 61 62 62 63 63 63

Liste des tableaux


N I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII intitul Composition biochimique globale (%) du lait de chamelle (daprs MIETTON et al. (1994) cit par BENGANA, 2001). Classification des microorganismes en fonction de leur temprature de dveloppement Caractristiques des principaux genres de Pseudomonas (selon GUIRAUD, 2003) Activits mtaboliques et dgradations dorigine microbienne dans les produits laitiers (CAROLE, 2002) Caractristiques des genres Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus (GUIRAUD, 2003) Classification des bactriocines des bactries lactiques (HENG et TAGG, 2006) Grille dapprciation de la qualit microbienne du lait (BERRENS et LUQUET, 1987). Analyses physico-chimiques du lait camelin Examens, microscopique et macroscopique, de la souche isole Identification de la souche isole par les tests biochimiques et physiologiques Examens prliminaires de la souche Identification de la souche indicatrice par les tests biochimiques et physiologiques Mesure du diamtre moyen des zones dinhibition (Zi) pour la technique des puits et des disques page 8 12 16 18 23 26 42 53 56 58 59 61 64

Rsum

La prsente tude a pour objectif de mettre en vidence leffet antagoniste dune souche lactique bactriocinogne dorigine cameline contre une souche psychrotrophe contaminante du lait. La souche lactique productrice de bactriocines (type nisi ne) est isole partir dun fromage camelin frais prpar au laboratoire avec un rendement non ngligeable, gale 35,5 %. La souche indicatrice est une souche psychrotrophe isole partir dun chantillon de lait de chamelle cru, stock 4C pendant plus de 3 jours. Ainsi, le surnageant neutralis dune culture de Lactococcus lactis ssp .lactis, sur milieu M17 (8000 g/ 20 min 4C) a t test contre la souche de Pseudomonas fluorescens selon les trois techniques de diffusion sur gel ; les spots, les puits et les disques. Le surnageant neutralis a montr une activit antibactrienne qui sest manifest par lapparition de zones dinhibition dont le diamtre diffre selon la nature du test utilis. Des diamtres variant entre 9 et 18 mm et entre 12 et 29 mm ont t enregistrs

respectivement avec les puits et les disques. La technique des spots a donn des rsultats moins concluants.

Mots cls : lait, chamelle, Pseudomonas fluorescens , Lactococcus lactis ssp .lactis, fromage, nisine.

ABSTRACT

This study aims to highlight in the antagonistic effect of a lactic strain bacteriocins producer against a psychrotrophic strain milk contaminant. The lactic strain producing bacteriocins (nisin type) was isolated from a fresh camel cheese, which was prepared on laboratory .his yield is not negligible, equal to 35, 5 %.The indicator strain is a psychrotrophic strain isolated from a raw camel milk sample ,stocked at 4C during more than 3 days. Thus, neutralized cell-free supernatant of Lactococcus lactis ssp .lactis growth in M17 medium (8000 g /20 min 4C) was tested against the strain Pseudomonas fluorescens using three techniques of gel diffusion method; the spots, the wells and disks technique. The neutralized cell-free supernatant pointed at antibacterial activity, which manifested by appearance of inhibition zones .the inhibition zones diameter differ according to the used test nature. Diameters varied between 9 and 18 mm and between 12 and 29 mm, registered respectively with wells technique and disks technique. The spots technique gave less conclusive results.

Key words: milk, camel, Pseudomonas fluorescens, Lactococcus lactis ssp .lactis, cheese, nisin.


. , . % 35,5 Pseudomonas fluorescens 4 3 . Lactococcus lactis ssp .lactis ) ,(8000 g/ 20 min 4C , M17 Pseudomonas fluorescens ) ( : , . , . 9 18 12 29 , .

: , ,Lactococcus lactis ssp .lactis ,Pseudomonas fluorescens , ,.

Introduction
Le lait est un fluide biologique complexe, scrt par les mammifres ( RASOLOFO, 2010 ). Il constitue un aliment important dans lalimentation quotidienne de lhomme vu sa composition quilibre en nutriments de base (protines, lipides et glucides), sa richesse en calcium et son apport non ngligeable en vitamines (A, B2, B5 et B12) et en divers sels minraux (OUALI, 2003). Le lait de chamelle, comme celui des autres mammifres, est un milieu de composition chimique et physique complexe permettant au chamelon de couvrir ses besoins nergtiques et nutritionnels pendant la premire tape de son existence (KAMOUN et RAMET, 1989). Il possde un certain nombre de particularits lies sa composition physico-chimique, biochimique et microbiologique. Parmi ces particularits, on signale sa teneur relativement leve en vitamine C et en niacine (vit. B3). Sa composition en lments minraux parat plus riche que celle du lait de vache surtout en Calcium et en Potassium ( SBOUI et al., 2009). Lactivit antimicrobienne du lait de chamelle est suprieure celle du lait de rfrence ( EL-AGAMY et al., 1992). Cette activit est due la prsence de teneurs assez importantes en facteurs antimicrobiens tels que la lactoferrine, le lysozyme, des immunoglobulines comparables celles de ltre humain Le lait camelin possde par ailleurs, certaines proprits thrapeutiques. Il renferme des teneurs assez intressantes en insuline ( AGRAWAL et al ., 2004). Il ne contient pas de -lactoglobuline, protine lactosrique reprsentant le principal allergne chez le nourrisson. Il est ainsi utilis contre la tuberculose, le diabte juvnile ( BEG et al ., 1985), la constipation, lasthme

(YAGIL, 1987) et peut tre consomm par les personnes immunodficients ( AGRAWAL et al., 2004). La transformation du lait camelin est rpute difficile, notamment la fabrication fromagre et beurrire. Des technologies modernes de transformation fromagre du lait de chamelle ont t testes dans diffrents pays (Mauritanie, Tunisie, Arabie Saoudite, Jordanie) (FAYE, 1997). Des mises au point de nouvelles techniques permettant de coaguler le lait de chamelle, offrira aux leveurs camelins une opportunit intressante de valoriser les excdents laitiers dhivernage sous forme de fromage (FAYE, 1998). Laptitude dun lait la transformation fromagre e st troitement lie la nature de ses constituants ( GOURSAUD, 1985). Linaptitude la coagulation, due essentiellement la composition particulire des micelles de casines et leur dimensions dont le diamtre moyen est environ le double (300 m) de celui du lait de vache (160 m), reprsente lune des contraintes rencontres lors de la transformation du lait camelin en fromage (FARAH et BACHMAN, 1987;

JARDALI, 1988; FARAH et RUEGG, 1989; JARDALI ET RAMET, 1991). De plus, compar au lait de la vache, le lait de chamelle est pauvre en casine, protine responsable de la consistance du coagulum. Son quilibre minral, particulier, amplifie son inaptitude la coagulation (KAMOUN, 1995). KAMOUN et RAMET (1989), ont montr la possibilit de transformer ce lait en fromage prsentant une conservabilit satisfaisante condition de tenir compte des particularits inhrentes sa composition physico- chimique. Plus rcemment, des travaux entrepris au niveau de luniversit de Ouargla, ont montr que la su bstitution des enzymes habituellement utilises en fromagerie (prsure commerciale), par des protases gastriques issues de caillettes de dromadaires adultes (gs de 8 9 ans) permet damliorer laptitude du lait camelin la coagulation ( SIBOUKEUR et al., 2005). Dautre part, lors de la rfrigration du lait, des germes psychrotrophes sont susceptibles de produire des enzymes lipolytiques et protolytiques, lorigine de mauvais gots dans les fromages (des gots amers, des flaveurs non dsires et atypiques ) (LE JAOUEN, 1993). Il sagit de micro-organismes prsents dans le lait cru, ayant une aptitude se dvelopper basse temprature (8-4C). Parmi cette flore, figure le genre Pseudomonas et plus particulirement l'espce Pseudomonas fluorescens qui synthtise des protases et des lipases exocellulaires

thermostables (LAW, 1979). Plusieurs auteurs ont rapport les impacts de ces enzymes dans le lait et les produits laitiers (FAIRBAIM et LAW, 1986 ; DEETH et al., 2002 ; NIELSEN, 2002 ). PAQUET et al. (1987) ont rapport que la production des protases est corrle avec la croissance de Pseudomonas fluorescens dans les laits entreposs 6 C pendant trois jours. La protolyse des casines augmente mesure que la concentration de Ps. fluorescens augmente dans le lait (RASOLOFO, 2010). La protolyse est parfois lorigine dun dfaut de saveur : lamertume. Ce dfaut rsulte de laccumulation de peptides de petite taille, ayant une hydrophobicit leve et dont la partie C terminale est constitue soit dun rsidu leucine, phnylalanine ou tyrosine (BROADBENT et al., 2002). Les lipases dorigines microbiennes p ermettent de transformer les triglycrides en glycrides partiels (mono et diglycrides) et en acides gras ( CHOISY et al.,1984). A des tempratures infrieures 10C, la flore lactique du lait ntant plus dominante, dautres micro-organismes considrs comme nuisibles en fromagerie tels que les psychrotrophes

deviennent dominants (LE JAOUEN, 1993). La flore lactique est un groupe htrogne de microorganismes produisant de lacide lactique comme produit principal du mtabolisme. Elle colonise de nombreux produits alimentaires comme le lait et ses produits (DORTU et THONART, 2008). Lintrt des bactries lactiques dans lindustrie agro -alimentaire rside principalement dans leur capacit transformer certains sucres en lactate et ainsi qu acidifier le milieu environnant. Il sagit dune caractristique utilise dans de nombreux procds de

transformation dont la fabrication fromagre ( RAYNAUD, 2006). Dautre part, les bactries lactiques produisent de nombreux mtabolites aux proprits antimicrobiennes tels que les acides organiques, le peroxyde dhydrogne, le dioxyde de carbone, la reutrine, le diactyl et les bactriocines. Ces dernires sont des peptides antimicrobiens inhibant la croissance de bactries daltration ou pathognes (DORTU et THONART, 2008). Les bactriocines reprsentent un intrt dans la conservation des denres alimentaires par leur capacit rguler la microflore existant dans les produits ferments et inhibent la croissance des germes pathognes (DORTU et THONART, 2009 ). En agro-alimentaire seule la nisine issue de Lactococcus lactis est autorise comme additif alimentaire (E 234) depuis 1969 (OMS). Selon la Generally Recognized As Safe (GRAS), la nisine possderai un large spectre d'activit antibactrienne, essentiellement dirig contre les bactries GRAM positives. En 1951, la nisine fut prconise par HIRSCH afin d'viter le gonflement de fromages pte presse cuite par Clostridium tyrobuturicum, elle fut galement utilise dans la conservation de fromages fondus (MCCLINTOCK, 1952), pour rduire ou mme supprimer l'emploi de conservateurs chimiques, comme les nitrites. La nisine est efficace contre les germes pathognes tels que Listeria

monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium tyrobuturicum (KALCHAYANAND et al., 2008). Les bactriocines peuvent tre appliques sous une forme purifie, semi-purifie ou sous la forme dun concentr obtenu aprs fermentation dun substrat alimentaire. Les bactries productrices peuvent galement tre appliques dans les produits alimentaires, la bactriocine sera alors produite in situ (DORTU et THONART, 2009 ). La prsente tude a pour objectif de mettre en vi dence leffet antagoniste dune souche lactique bactriocinogne contre une souche psychrotrophe contaminante du lait. Elle comporte 4 tapes essentielles: - Isolement et identification dune souche de Lactococcus lactis ssp. lactis partir dun fromage frais fabriqu partir de lait de chamelle : souche productrice de nisine. - Isolement et identification de lespce Pseudomonas fluorescens partir du lait de chamelle conserv 4C pendant 10 jours : bactrie cible de la nisine. - Culture de la souche lactique en vue de produire la nisine. - Etude de lactivit antibactrienne de la substance produite par Lactococcus lactis ssp. lactis contre la souche cible Ps. Fluorescens.

Synthse bibliographique

I. Synthse bibliographique 1.1. Prsentation du lait de chamelle Le lait est le produit intgral de la traite totale et ininterrompue d'une femelle laitire bien portante, bien nourrie et non surmene. Il doit tre recueilli proprement et ne pas contenir de colostrum ( BOURGEOIS et LARPENT ,1996). Le lait camelin a un rle important pour la nutrition humaine dans les zones arides et semi-arides. Il renferme tous les nutriments essentiels quon trouve dans le lait bovin, en quantits quilibres ( EL-AGAMY, ABOU-SHLOUE et ABDEL-KADER , 1998; KARUE, 1998). 1.1.1. Caractristiques physico-chimiques du lait camelin Du point du vue physico- chimique, le lait est un produit trs complexe. Les principales proprits physico-chimiques qui intressent l'industrie laitire sont la densit, le point de conglation, l'acidit et le pH ( VIGNOLA et al, 2002). Le lait camelin, est gnralement blanc et opaque, avec un got agrable ( DILANYAN, 1959; KHERASKOV, 1953; YAGIL & ETZION, 1980 ). Ce lait a un got lgrement sucr, parfois piquant ou amer ou sal, selon la nature des plantes du dsert ingres par lanimal ( RAO, GUPTA et DASTUR, 1970 ; KHASKHELI et al, 2005). Le changement du got peut galement tre du la disponibilit de leau buvable (FARAH, 1996). Il peut se prsent sous forme crmeux quon il est lgrement agit ( SHALASH, 1979). La densit moyenne du lait camelin gale de 1.029 (FARAH, 1996), le rend moins visqueux que le lait bovin ( LALEYE, JOBE et WASESA, 2008). Selon SIBOUKEUR (2007 ), sa densit 15 C oscille entre 0,99 et 1,034, contre 1,028 1,035 pour le lait bovin. Sa viscosit moyenne est gale 2,2 centpoises. Le pH du lait camelin frais se situe entre 6 ,5 et 6,7 (KHASKHELI et al, 2005; MEHAIA, et al, 1979); un lgre abaissement du pH 6,4 ( ABU-TARABOUSH et al. 1998; YAGIL, SARAN, & ETZION, 1984 ) et 6,0 est aussi enregistr ( EL-HADI SULIEMAN et al, 2006). Le pH du lait camelin est similaire celui du lait de brebis (YAGIL et al, 1984), mais un peu acide par rapport celui du lait bovin, ce dernier se situe entre 6,6 et 6,8 (SAWAYA et al, 1984). Selon MOHAMED et al. (1995), WANGOH et al. (1998) et SMAIL (2002), le point de conglation du lait camelin se situe entre-0,543 et -0,565. Cette valeur est susceptible de variation selon la teneur en diffrentes composants du lait. Lacidit Dornic du lait dpend du nom bre de moles dacides prsents et est inversement proportionnelle son pH (MATHIEU ,1998). Les valeurs de lacidit titrable exprime en degr Dornic, du lait camelin varient dun auteur

Synthse bibliographique lautre. Elle est de lordre de 15,6D selon KAMOUN (1995) ; BADAOUI, (2000) et gale 160 ,91 selon GUERRADI (1998). 1.1.2. Composition biochimique du lait de chamelle La composition du lait camelin a t considre comme la moins stable compare celle des laits des autres espces, bovine en loccurrence. La variation de la composition du lait camelin peut tre attribue plusieurs facteurs, comme la localisation gographique, les conditions alimentaires, la race, le stade et le rang de lactation ( KHASKHELI et al, 2005). Le tableau cidessous (tableau I) illustre la composition biochimique globale du lait de chamelle selon diffrents auteurs en comparaison avec celle du lait bovin. Daprs le tableau, le lait de chamelle est presque similaire au lait bovin de par sa composition en eau, en lactose, en protines et en matire sche totale. Cependant, il est moins riche en matire grasse que le lait de vache. Ce rsultat est aussi signal par CHILLIARD en (1989) et FAYE en (1997). Les globules gras des lipides sont de trs petite taille, ce qui les rend trs digestes (CHILLIARD, 1989). Ils restent en suspension mme aprs 24h au repos, contrairement au lait de vache par exemple dans lequel ils constituent une couche grasse en surface au bout de quelques heures. Par ailleurs, la matire grasse du lait de chamelle est lie aux protines. Tout ceci explique la difficult baratter le lait de chamelle pour en extraire le beurre (FAYE, 1997). Les lipides du lait de dromadaire ne contiennent presque pas d'acides gras chane courte, contrairement ce qui est observ chez les ruminants (vache, chvre, brebis, antilope...). Il est par contre riche en acides gras insaturs (surtout linolique et palmitoleque) et en acides gras essentiels, ce qui permet de souligner encore son intrt nutritionnel pour le chamelon et le nomade ( CHILLIARD, 1989 ). Compar au lait de la vache, Le lait de chamelle est pauvre en casines, protines responsables de la consistance du lait coagul, et son quilibre minral particulier, amplifie son inaptitude la coagulation (KAMOUN, 1995). Les casines (CN) constituent la fraction protinique majeure du lait. Elle varie entre 52 et 87 % des protines totales du lait de chamelle (FARAG & KABARY, 1992; KHASKHELI et al, 2005; MEHAIA et al, 1995). Une particularit des casines camelines est quelles sont

distribues sous forme de micelles ayant un diamtre double de celui des micelles bovines (FARAH et BACHMAN ,1987 ; JARDALI ,1988. FARAH et RUEGG ,1989 ; JARDALI et RAMET, 1991).

Synthse bibliographique Les acides amins du lait camelin sont comparables celles du lait bovin. Cependant, la glycine et la cystine qui sont significativement, moins frquente dans la composition des casines camelines (FARAH & REGG, 1989 ). Les protines lactosriques camelines, solubles pH 4.3, se caractrisent par labsence de la lactoglobulines, comme dans le cas du le lait humain ( EL-AGAMY et al, 2009). Le srum du lait camelin contient aussi dautres composants importants tels que les immunoglobulines, le sr um albumine, la lactoferrine, la lactoproxydase, llactalbumine le composant 3 des protose peptones ( FARAH, 1993; KAPPELER, HEUBERGER, FARAH et PUHAN, 2004; MERIN et al, 2001). Une richesse exceptionnelle en vitamine C (au moins 3 fois plus que dans le lait de vache) et niacine (B3) caractrise ce lait. Il est galement riche en thiamine, riboflavine, acide pantothnique et vitamine B6. Il contient aussi un taux apprciable de vitamines B12 et A (SAWAYA et al, 1984 ; FAYE, 1997 ; MOHAMED, 1999 ; FARAH et al, 1992; STAHL et al, 2006 ; HADDADIN et al, 2008). Les principaux constituants minraux du lait camelin sont le calcium, le phosphore, le sodium, le potassium, le magnsium et le fer. Cependant en cas dintoxication, des lments traces tels que le plomb, le nickel ou le chrome peuvent tre retrouvs dans le lait ( FAYE, 1997). La composition en minraux du lait de chamelle est plus diversifie que celle de lait de vache. Si les taux en macro- lments (Na, K, Ca, Mg) sont pratique ment similaires dans les deux laits, cela nest pas le cas des oligo -lments o les teneurs en Fe, Cu, Mn, Pb et I, y sont particulirement leves dans le lait dorigine cameline ( SMAIL ,2002 ; MOUSSA ,2003). 1.1.3. Proprits antimicrobiennes du lait de chamelle Le lait de chamelle possderait un effet antimicrobien contre les bactries GRAM positive et GRAM ngative, parmi ces bactries on trouve Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus et Salmonella typhimurium (BENKERROUM, MEKKAOUI,

BENNANI, & KAMAL, 2004; EL- AGAMY et al, 1992). Cette activit est attribue la prsence dans le lait de chamelle de substances antimicrobiennes telles que le lysozyme, le peroxyde dhydrogne, la lactoferrine, la Lactoperoxydase et les immunoglobulines ( ELAGAMY et al, 1992). Lactivit antimicrobienne du lait de chamelle est en moyenne suprieure celle du lait de la vache (FAYE, 1997). La quantit de lysozyme, lactoferrine et

Synthse bibliographique

immunoglobulines dans ce lait est suprieure celle de lait bovin ( BENKERROUM, 2008; ELAGAMY, 2000; KAPPELER et al, 1999; KONUSPAYEVA et al, 2007). Le lysozyme ou muramidase, de masse molculaire estime en lectrophorse 14400 Da (EL-AGAMY et al, 1996), est thermostable, et hydrolyse les liaisons glycosidiques particulires de la paroi des bactries. Cette enzyme a un effet bactriolytique puissant ( ANONYME 1,1995). Tableau I : Composition biochimique globale (%) du lait de chamelle (daprs MIETTON et al. (1994) cit par BENGANA, 2001). Constituant Eau et Matire sche totale 11.72 11.90 13.4 8.75 12.20 Lactose Matire grasse 2.83 3.60 3.20 1.00 3.15 Protines

Espce

Rfrences bibliographiques YAGIL ETIZON ,1980

88.28

3.81 4.40 4.80 4.51 5.24

3.82 2.95 4.00 3.24 3.11

SAWAYA et al, 1984 88.10 ABDERAHIM, 1987 MEHAIA et al ,1988 FARAH et RUEGG, Chamelle 1989 ELAMIN WILCOX ,1992 ABU LEHIA ,1994 KAMOUN ,1994 87.85 88.22 et 88.33 87.40 91.25 87.80

10.95 12.15 11.87 12.85 10.68 12.5-13.0

4.16 4.95 4.78 4.17 4.44 4 .80-5.00

3.15 3.20 3 .66 4.43 2.84 3 .40-4.40

2.81 3.20 3.34 3.17 2.60 2.90- 3.50

WINGOH et al ,1994 87.15 MEHAIA et al, 1995 Vache MIETTON 1994 et 89.32

al, 87.00 87.50

La lactoferrine est une glycoprotine de masse molculaire gale environ 78000 Da. Elle peut fixer le fer, et joue un rle primordial dans labsorption intestinale du fer chez le nourrisson. Cette glycoprotine possde une activit bactriostatique, en captant le fer ncessaire au

dveloppement des microorganismes (MONARD et VERNERT, 1988 ; HURLEY et al. ,1993).

Synthse bibliographique La lactopoxydase de masse molculaire estime 78000 Da ( EL AGAMY et al, 1996) est une enzyme qui rsiste au suc gastrique et tolre des pH acides. Elle est relativement thermostable, entraine des lsions dans la membrane cytoplasmique des bactries, causant des fuites dion potassium, dacides amines et de polypeptides cellulaires, de plus les systm es de transport cellulaires sont inhibes, ainsi que la synthse des acides nucliques ou des protines ( HASLAY et LECLERC , 1993 ) . Cette enzyme joue un rle bactricide en catalysant loxydation par lH2O2, de lion SCN - provenant du catabolisme des a cides amins soufrs. Lion OSCN - produit semble inactiver certaines bactries sensibles ( RIBADEAU et DUMAS, 1991 ). Elle prsente une activit bactriostatique contre les bactries GRAM positif et bactricides contre les GRAM ngatif (EL AGAMY et al, 1992). Dautre part, les bactriocines, parmi lesquelles la nisine produite par les lactocoques, sont des protines doues dune activit bactricide importante. Elles ont un effet inhibiteur sur la majorit des germes pathognes GRAM positif (DE ROISSART et LUQUET, 1994). Dautre glycoprotines de poids molculaire lev, les immunoglobulines, prsentes dans les laits de toutes les espces et ayant pour la plupart une origine sanguine ( DEWIT, 1998), protgent le lait et le nourrisson contre les attaques microbiennes (LYDYARD et al. ,2002). Le peroxyde dhydrogne a un effet toxique sur les bactries pathognes. Il est prsent dans le lait camelin et a un effet toxique sur les bactries pathognes. Il est prsent dans le lait camelin une concentration de 10 m mole /l, il active le systme (Lactoperoxydase Thiocyanate Peroxyde dhydrogne ou systme LSP). Une autre protine doue dune activit antimicrobienne, le composant 3- des protose-

peptones (PP3). Ce composant prsente deux variants gntiques A et B qui ont respectivement 137 et 122 rsidus dacides amins et des PM estims respectivement 15 442 et 13 661 Da. Il se trouverait au niveau du lait camelin une teneur nettement plus leve que celle rencontre pour le PP3 bovin (KAPPELER et al, 1999). Le composant 3- des protose-peptones (PP3) a un effet inhibiteur et slectif contre les halophiles qui peut sexpliquer par le fait que ces bactries se dveloppent dans le milieu hypersal, le lait camelin de par sa composition et son got souvent sal semble prsenter un milieu favorable au dveloppement de ce groupe bactrien ( KOUNIBA, 2002). 1.2. Conservation et transformation du lait de chamelle 1.2.1. Mthodes de conservation de lait de chamelle Le lait est un bon milieu de croissance pour les microorganismes en raison de sa teneur en eau

Synthse bibliographique leve, de son pH proche de la neutralit et de sa composition quilibre en nutriments de base (RASOLOFO, 2010). Un des soucis constants de l'homme a t de tenter de diffrer dans le temps la consommation de ce lait en appliquant pour cela divers procds de conservation (RAMET, 1985). 1.2.1.1. Pasteurisation La pasteurisation est le traitement thermique qui prsente l avantage de dtruire la totalit des germes pathognes susceptibles de se trouver dans le lait et de rduire sa flore banale. Pour cela, des barmes appropris (temprature / temps de chauffage) ont t proposs : - Pasteurisation basse 63 C pendant 30 minutes ; - Pasteurisation haute (HTST) 72C pendant 20 secondes (LUQUET et BOURDIER, 1991 ). Si le procd de pasteurisation est correctement appliqu, le lait sera exempt de bactries psychrotrophes Gram ngatif et de bactries pathognes principalement observes dans le lait cru (RAY, 1996). Seules les bactries pathognes sont dtruites par la pasteurisation du lait, mais les toxines sont trs rsistantes aux traitements thermiques usuels. La pasteurisation ne permet donc pas dliminer le risque dintoxication. Les produits au lait cru et ceux pasteuriss restent sur un pied dgali t vis vis du danger li aux toxines staphylococciques ( LARPENT ,1996). Le traitement thermique le plus utilis dans le cas de lait de chamelle est la pasteurisation (CHAIBOU, 2005). 1.2.1.2. Strilisation La Strilisation (120 140 C pendant quelques secondes pour le lait et plus de 30 min pour les conserves) vise dtruire toutes les bactries et surtout les formes rsistantes (spores). Le produit est stable est conservable temprature ambiante ( SEBTI, 2000). Pour la strilisation commerciale du lait (UHT) o la temprature peut atteindre jusquau 150C, on vise la rduction des thermophiles dans le lait et mmes les formes sporules. Cependant, dans certains cas Le lait UHT, qui est un produit commercialement strile, peut contenir des spores viables de quelques bactries thermoduriques (RAY, 1996). 1.2.1.3. Thermisation La thermisation (traitement qui a lieu 64C pendant 15 20 secondes) est surtout utilise pour dtruire les bactries psychrotrophes, qui se dveloppent dans un lait ayant subi, soit une

Synthse bibliographique rfrigration la ferme, soit un stockage rfrigr au niveau de la fromagerie. Ces bactries surtout les espces des genres : Pseudomonas, Achromobacter et Flavobacterium produisent des lipases et des protases exocellulaires rsistantes la pasteurisation (72-74C, 15-20 sec) et mme la strilisation UHT (132C, 1-2 sec) (LENOIR et al , 1983). La thermisation a aussi effet sur les bactries pathognes et les bactries msophiles, comme elle peut diminuer la charge globale en bactries (SEBTI, 2000). 1.2.1.4. Rfrigration La conservation basse temprature rduit la croissance et lactivit des bactries lorigine de la dgradation et prolonge la dure de conservation du lait. La conservation des tempratures en dessous du minimum de croissance entrane une prolongation continue de la phase de latence jusqu ce que la multiplication cesse et la croissance du microorganisme sarrte ( DOYLE et al, 1997). Dautre part, aux tempratures comprises entre 0 et 10C des changements mineurs dans les conditions physico-chimiques ont de grands effets sur la croissance bactrienne (KORKEALA et al, 1989). Toutefois la rfrigration ne tue pas ou nlimine pas une contamination microbienne. Elle permet de la croissance, le dveloppement aux seuls microorganismes psychrophiles capables de crotre sur le lait des tempratures en dessous de 7C ( ASHIE et al, 1996). La rfrigration du lait ds la ferme et son stockage pendant un temps plus ou moins long slectionne des bactries psychrotrophes qui peuvent devenir alors une flore dominante. Parmi ces bactries le genre Pseudomonas est le plus frquent (MIRANDA et GRIPON, 1986). 1.2.1.5. Action du froid sur le lait Le lait recueilli aprs la traite contient toujours des microorganismes dont le nombre et les espces auxquels ils appartiennent sont trs variables. La prsence invitable de ces germes est due des contaminations d'origine intra-mammaire et extra-mammaire qu'il est ncessaire de limiter le plus possible en raison du rle nfaste qu'elles peuvent avoir sur la conservation du lait et sur la qualit et le rendement des produits fabriqus. On connat depuis longtemps l'influence considrable de la temprature sur le dveloppement et l'activit des microorganismes et, en consquence, son action utile ou nuisible sur la conservation des aliments. En fonction des limites de temprature entre lesquelles prolifrent les microorganismes, on en distingue trois groupes (Tableau II) :

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Synthse bibliographique
Tableau II : Classification des microorganismes en fonction de leur temprature de dveloppement Temprature de dveloppement en C Microorganismes Minimum Psychrophiles Msophiles Thermophiles -5 + 10 + 40 Optimum + 5 + 10 + 30 + 40 + 50 + 60 Maximum + 20 + 45 + 75

Le maintien du lait au froid a essentiellement pour but d'arrter le dveloppement des microorganismes. Il constitue un traitement de stabilisation. Il ne peut ni amliorer la qualit initiale du lait ni entraner la mort des bactries. Dans les limites courantes de temprature auxquelles, en pratique, le lait peut tre soumis (entre 40C et 3C), on observe que la prolifration microbienne diminue avec l'abaissement de la temprature, ainsi que le montre la figure 01. 1.2.2. Flore psychrotrophe du lait Les psychrotrophes sont les micro-organismes qui conservent une activit notable des tempratures infrieures ou gales + 7C ( ROZIER ,1995 ; CATTEAU ,1999). Daprs cette dfinition, les bactries psychrophiles appartiennent aussi au groupe des psychrotrophes, mais en pratique les principales bactries psychrotrophes dintrt alimentaire sont msophiles.

Figure 1: Evolution de la flore bactrienne d'un lait rfrigr (Daprs AUCLAIR, 1979).

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Synthse bibliographique Il faut noter que le monde des micro-organismes psychrotrophes ne se limite pas aux seules bactries, on rencontre aussi un nombre trs important despce de micromyctes, agents de laltration au froid, des denres alimentaires. Les bactries psychrotrophes du lait cru sont essentiellement des bactries GRAM ngatif, se multipliant une temprature infrieure 7C et dont le genre le plus reprsentatif est Pseudomonas (LAW, 1979). Les bactries psychrotrophes dtectes dans le lait peuvent tre des bactries GRAM ngatif ou GRAM positif. Les bactries GRAM ngatif sont les principaux psychrotrophes dans le lait cru. Les Pseudomonas y reprsentent 51% des bactries psychrotrophes ( REINHEIMER et al, 1990). Les autres bactries GRAM ngatif rencontres dans le lait appartiennent aux genres, Aeromonas, Alcaligenes, Chromobacterium et Flavobacterium (MIKOLAJCIK, 1979 ). Ces bactries sont responsables de la production de protases et de lipases entranant la dtrioration du lait (COUSIN, 1982). Les bactries psychrotrophes Gram positif sont galement prsentes dans le lait, mais en plus faible nombre. Ces bactries selles appartiennent aux genres Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Sarcina, Staphylococcus et Streptococcus. Les genres GRAM positif dominants dans le lait sont : Arthrobacter et Bacillus. Certaines bactries GRAM positif tels que les genres Bacillus et Clostridium, peuvent produire des spores ( GRIFFITHS ET PHILLIPS, 1990 ). La contamination du lait par les bactries psychrotrophes est essentiellement un problme d'hygine. Ces germes sont largement dissmins dans la nature. Ce sont les htes habituels du sol, des plantes, des eaux et du fumier. Les eaux d'alimentation des fermes sont souvent trs contamines. Ils peuvent aussi tre vhiculs par un air charg de poussire de fourrage ou autres aliments. Leur prsence dans le lait cru est due des pollutions dont l'importance dpend des conditions de propret de la traite et du matriel de collecte, de transfert et de conservation du lait, de la qualit des eaux de nettoyage et de rinage, et du mode d'alimentation de btail ( VERON, 1987). Les bactries psychrotrophes possdent une relative capacit de rsistance au stress froid, mettant en jeu des mcanismes dont les principaux sont la synthse denzymes adaptes fonctionner basse temprature, ladaptation par la composition des memb ranes riches en acides gras insaturs et la synthse de protines de choc thermique ( DRUESNE ,1996 ; GOUNOT ,1991 ).

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Synthse bibliographique A l'exception de quelques espces thermorsistantes, les psychrotrophes sont dtruits par la pasteurisation 74C pendant 15 secondes, voire par une thermisation 65C pendant 20 secondes. Mais certaines produisent des enzymes qui rsistent des traitements thermiques levs de lordre de 90 100C pendant plusieurs minutes. 1.2.2.1. Pseudomonas fluorescens Dans la filire laitire, les Pseudomonas producteurs de pigments vert fluorescent abusivement regroupes sous lappellation Pseudomonas fluorescens , sont considrs comme un problme majeur. Leur caractre psychrotrophe associ la disparition de la flore comptitrice est trs probablement responsable de leur mergence durant la conservation du lait basse temprature (PITON et RECHARD ,1986). Le genre Pseudomonas regroupe plus de 140 espces qui prsentent les caractres communes suivantes : ce sont des bacilles de taille de 0.5- 1.0 1.5-5.0 m qui sont, la plupart du temps mobiles grce un ou plusieurs flagelles polaires. Ils ragissent ngativement la coloration de GRAM et peuvent accumuler des rserves de poly- hydroxybutyrate. Arobies, elles possdent un mtabolisme oxydatif et utilise alors loxygne comme accepteur final des lectrons. Cependant, quelques espces sont capables de se multiplier en anarobiose en prsence de nitrate (chimio-organotrophes). La plupart sont incapables de se multiplier en milieu acide (pH < 4 .5). Enfin, ils peuvent tre oxydase (+) ou moins, mais sont toujours catalase (+).La fluorescence de lespce Pseudomonas fluorescens est due la production d'un pigment appel fluorescine (pyoverdine) de couleur jaune vert. Sa temprature de croissance optimale se situe entre 25 et 30 C. Sa croissance 42 C est ngative : ce point est important pour la diffrencier de Pseudomonas aeroginosa (LERICHE et al, 1999). Les principaux caractres physiologiques et biochimiques de lidentification des Pseudomonas sont indiqus sur le tableau III ( GUIRAUD, 2003). 1.2.2 .2. Impact des bactries psychrotrophes dans le lait La plupart des bactries psychrotrophes ne causent pas de problmes dans le lait car elles sont limines par la pasteurisation. Cependant, les enzymes des psychrotrophes (protases et lipases) sont thermorsistantes et ne sont pas dnatures par la pasteurisation. Plusieurs auteurs ont rapport les impacts des enzymes des psychrotrophes dans le lait et les produits laitiers (FAIRBAIM et LAW, 1986 ; DEETH et al, 2002 ; NIELSEN, 2002). Les Protases des

bactries psychrotrophes sont des enzymes exocellulaires et thermorsistantes, capables de

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Synthse bibliographique dgrader les constituants du lait et d'occasionner des dfauts en cours de stockage (MIRANDA et GRIPON, 1986). La synthse de protases exocellulaires par les bactries psychrotrophes

s'effectue pendant la phase exponentielle de la courbe de croissance (ADAMS et al, 1975) et le maximum de production a lieu en fin de phase exponentielle et au dbut de la phase stationnaire (ROWE et GILMOUR, 1982 ). La plupart des protases de bactries psychrotrophes rsistent aux tempratures leves et ne sont que partiellement dtruites par diffrents traitements de strilisation UHT (120 150 C, 5 20 secondes) ( ADAMS et al, 1975 ; ALICHANIDIS et ANDREWS, 1977 ; TE WHAITI et FRYER, 1978 ; DRIESSEN, 1983 ). De nombreux travaux ont tabli une relation entre la prsence de protases thermostables de bactries psychrotrophes et l'altration de la dure de vie du lait UHT. Celle-ci se manifeste par l'apparition de gots amers (BENGTSOON et al, 1973 ; RICHARDSON et NEWSTEAD, 1979 ; Mc KELLAR et al, 1984) et de phnomnes de glification ( ADAMS et al, 1976 ; BENGTSOON et al, 1973 ; LAW et al, 1977 ; SNOEREN et al, 1979).Les protases des bactries psychrotrophes interviennent galement en fromagerie o elles sont l'origine de pertes d'azote dans le lactosrum et de diminution du rendement fromager. Il a t montr que les protases des bactries psychrotrophes peuvent provoquer une protolyse incontrle des constituants du lait. Au cours de leur activit, elles dgradent les protines du lait pH optimum situe entre 6,5 et 8,0

(MAYERHOFER et al, 1973 ; ADAMS et al, 1975 ; ALICHANIDIS et ANDREWS, 1977), ce phnomne produit la libration de sous produits trs varis, dont les peptides longues chaines ou courtes chaines et des acides amins libres. Elles ont une action comparable celle de la prsure. Elles attaquent prfrentiellement la kappa- casine, puis la casine et enfin la s1casine. Les protines non dnatures du lactosrum sont insensibles laction de ces enzymes (DE BEUCLAR et al ,1977). Les principaux microorganismes psychrotrophes protolytiques associs aux produits laitiers (VIGNOLA ,2002) sont les suivants: -Pseudomonas sp. -Bacillus sp. -Clostridium sp. -Flavobacterium sp.

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Synthse bibliographique
Tableau III : Caractristiques de principales espces de Pseudomonas selon GUIRAUD (2003)

P.aerginosa

P.cepacia

P.chlororaphis

P .fluorescens

P.mallei

P.pseudomallei

P.putida

P .solanaceareaum

P.syringae

Groupe Gnomique Oxydase Nitrate Rductase Glatinase

II

II

II

II

Lcithinase

+ + +

v
V + + + + + V V + -

Mannitol Pigments Fluorescents ADH PHB (Accumulati on) Culture 4C Culture 41C + + +

+ + +

V : variable

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Synthse bibliographique -Alcaligenes sp. -Levures et moisissures. Certains microorganismes, grce leurs lipases peuvent dcomposer la matire grasse et les acides gras libres du lait, entrainant lapparition des odeurs rances dans les produits laitiers. Les principaux microorganismes psychrotrophes lipolytiques (VIGNOLA, 2002) sont les suivants: -Pseudomonas sp. -Bacillus sp. - Clostridium sp. -Levures et Moisissures. Le tableau IV rcapitule les activits mtaboliques et les dgradations dorigine microbie nne dans les produits laitiers. 1.2.3. Aptitude du lait de chamelle la transformation en fromage Le fromage, selon la norme Codex, est le produit affin ou non affin, de consistance molle ou semi dure, dure ou extra dure qui peut tre enrob et dans lequel le rapport protines de lactosrum/ casines ne dpasse pas celui du lait ( VIGNOLA et al, 2002 Le fromage est un mode de conservation des deux principaux constituants insolubles du lait ,la casines et la matire grasse, et d'une partie plus ou moins importante de sels minraux et des lments solubles ( DE ROISSART ,1986). Pour la fabrication du fromage trois tapes essentielles sont ncessaires : la coagulation de la casine qui conduit, partir du lait, la formation d'un caill ( sous leffet dune acidification par la fermentation lactique et /ou par laddition dun agent coagulant enzymatique qui est la prsure) ; l'gouttage , qui sert sparer une partie plus ou moins importante de srum pour obtenir une caillebotte ; l'affinage de cette caillebotte, qui dveloppe des saveurs et des textures originales, sous linfluence des systmes enzymatiques prsents lorigine dans le lait (enzymes endognes ) ou des agents coagulants et des flores microbiennes dintrt . Ce sont les diffrentes techniques associes chacune de ces trois tapes qui dterminent les diffrences entre les fromages (VIGNOLA et al, 2002). Dans les traditions pastorales, le lait camelin est principalement rserv l'alimentation du jeune dromadaire et celle de lhomme. Ce lait, est le plus souvent bu

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Synthse bibliographique immdiatement aprs la traite. Il peut tre galement consomm sous forme de laits ferments obtenus par acidification lactique naturelle pendant quelques heures dans des rcipients en peau ou en terre cuite (RAMET, 1987; RAMET, 1989 ; YAGIL, 1982). Tableau IV : Activits mtaboliques et dgradations dorigine microbienne da ns les produits laitiers (VIGNOLA, 2002) Action microbienne Protolyse (protases) Protines - acides amins ou drivs, composs peptides longs (amertume) soufrs, composs -bactries sporules (thermophiles msophiles) -Bacillus -Clostridium protines peptides courts -amertume, got de -Pseudomonas fruits, de vanille ou -Flavobacterium de malt dans le lait. -Alcaligenes -Levures -amertume, flaveurs moisissures inhabituelles et perte Acides amins Lipolyse (lipase) Lipides -Rancidit produits laitiers. Lipides Glycrol +acides gras -odeurs butyriques libres des -bactries sporules (thermophiles msophiles) -Bacillus -Clostridium -Pseudomonas -Levures moisissures et ou e rendement dans les fromages et ou Composantes Raction Produits rpercussion de Microorganisme responsables

ammoniacaux, polypeptides.

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Synthse bibliographique

Le lait camelin a constitu depuis des temps trs lointains un produit nourricier de la population nomade qui le consomme ltat frais ou ferment (RAMET ,1994 ; KIHAL ,1999). La transformation du lait de dromadaire en produits drivs de type fromage est rpute trs difficile, voire impossible. II n'existe pas de tradition fromagre exploitant le lait de dromadaire, situation tout fait surprenante et exceptionnelle au regard de la plupart des systmes pastoraux qui ont trs souvent dvelopp un ou plusieurs types de fromages originaux. Ce constat peut tre expliqu par certains interdits culturels et locaux qui limitent la consommation du lait camelin la forme boisson et en excluent toute possibilit de ngoce. II est probable galement que le caractre trs altrable de la plupart des fromages en climat chaud, n'a pas favoris la cration de courants d'changes entre des populations par ailleurs isoles et souvent enclaves, comme cela existe pour d'autres produits moins prissables (DICKSON, 1951; GAST et al, 1969; YAGIL, 1982; WILSON, 1984). Outre les causes culturelles prcites, il apparat galement que, du point de vue technologique, le lait de dromadaire est plus difficile transformer que le lait des autres espces animales domestiques. L'tude bibliographique indique que seuls quelques rares fromages sont fabriqus en Ahaggar et dans la pninsule du Sina, par sparation des protines de lait pralablement insolubilises par acidification ( GAST et al, 1969 ; YAGIL, 1982 ). Le fromage ainsi obtenu se prsente sous forme d'une pte humide prsentant les caractristiques des fromages frais. Il s'agit d'un produit altrable en raison dune forte teneur en eau . Il doit tre consomm rapidement. Toutefois, par salage et schage naturel au vent et au soleil, il est possible de prolonger considrablement la conservation du produit et de la porter plusieurs mois. La transformation de lait de chamelle en fromage prsente des difficults ayant pour origine une teneur rduite en casine Kappa et une aptitude trs limite l'acidification et la coagulation enzymatique (RAMET, 2003). Ces fromages frais, ventuellement schs, ne correspondent pas la dfinition vraie du fromage qui fait intervenir, ds le dbut de la fabrication lors de la coagulation, une action plus ou moins importante d'une enzyme coagulante conjointement l'acidification par voie fermentaire (RAMET, 1985). De plus, une caractristique originale des casines camelines est qu'elles se trouvent sous forme de micelles de grande taille dont le diamtre moyen est environ le double (300 m) de celui du lait de vache (160 m) ( FARAH et BACHMAN, 1987; JARDALI, 1988; FARAH ET RUEGG, 1989; JARDALI et RAMET, 1991).

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Synthse bibliographique Parmi les diffrentes mthodes de corrections proposes, le mlange de lait casineux provenant dautres espces (ovins, bovins) permet de renforcer laptitude fromagre. Lexprimentation confirme, en particulier, lintrt dutiliser le lait de brebis en quantits

limites (10 30 pour cent du mlange) pour amliorer considrablement les modalits de la coagulation et de lgouttage, ainsi que les rendements fromagers ( RAMET, 2003). Dautres travaux raliss en Egypte ( EL-ABASSY, 1987; EL-BATAWY et al, 1987) ont montr que la pepsine provenant de l'estomac de dromadaire adulte pouvait tre utilise pour produire une prparation coagulante dans des conditions acceptables d'activit et de stabilit. Plus rcemment, des tudes ont t ralises au niveau des laboratoires de l'universit KASDI MERBAH Ouargla dans le but damliorer la coagulabilit du lait camelin (SIBOUKEUR et al., 2005 ; MAHBOUB et al., 2010). Les rsultats obtenus ont t trs satisfaisants. Le fromage fabriqu a prsent une bonne consistance et une qualit

organoleptique satisfaisante (BOUDJENAH-HAROUN et al., accept sous presse).

1.2.4. Bactries lactiques et fabrication du fromage Les bactries lactiques sont des cellules procaryotes, htrotrophes et chimio-organotrophes qui partagent les caractristiques communes suivantes ( DELLAGLIO et al, 1994). Elles sont GRAM +, gnralement immobiles et asporules, micro-arophiles. Du point de vue enzymatique, elles ne possdent ni catalase (certaines souches ont une pseudo-catalase), ni nitrate rductase, ni cytochrome oxydase. Elles ne liqufient pas la glatine, ne produisent pas d'indole, ni d'hydrogne sulfureux. Quelques espces hydrolysent faiblement la casine. En outre, elles ont des exigences nutritionnelles complexes envers les acides amins, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles. II est possible de les classer suivant la nature des produits obtenus partir des glucides : en bactries homolactiques strictes produisant uniquement de l'acide lactique et en bactries htrolactiques facultatives produisant un mlange d'acides, lactique et actique. Les bactries htrolactiques strictes produisent de l'thanol ou du CO 2, en plus des acides lactique et actique. Certaines souches ou certaines espces peuvent galement produire des acides, formique et succinique. Les bactries lactiques appartiennent aux douze genres suivants : Streptococcus, Vagococcus, Enterococcus, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenoccus,

Leuconostoc, Lactobacillus, Carnobacterium, Atopobium, Lactococcus et Bifidobacterium.

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Synthse bibliographique 1.2.4.1. Lactococcus lactis Les bactries appartenant au genre Lactococcus se prsentent sous forme de coques

rassembles en chaines de longueur variable. Elles appartiennent au groupe N de la classification de Lancefield. Elles sont faiblement a-hmolytiques et non -hmolytiques (DELLAGLIO et al, 1994). Les lactocoques ont une temprature de croissance minimale infrieure 10C, et une temprature de croissance optimale de 30C. Ces bactries sont thermosensibles, et ne peuvent pas crotre en prsence de 6.5% de Na Cl, ou lorsque le pH est suprieur 9,6. Elles ont un

mtabolisme homofermentaire et produisent exclusivement de l'acide lactique L (+) ( TEUBER et al, 1992 ; DELLAGLIO et al, 1994). Le genre Lactococcus comporte plusieurs espces et sous espces. Pour la fabrication fromagre (cheddar, fromage frais ...) ou la fermentation de la crme, les trois espces suivantes sont utilises : Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp .lactis biovar diacetylactis (TEUBER et al, 1992). Ces sous-espces et biovariants se

diffrencient selon certains caractres biochimiques, telle la production de diactyle partir du citrate, la dsamination de l'arginine, la capacit croitre en prsence de 4.5% de sel, pH 9,2 et 40 C. Le tableau VI indique les principaux caractres didentification des lactocoques (GUIRAUD, 2003). Les deux sous espces de Lc. lactis : Lc.lactis ssp. lactis et Lc. lactis ssp. cremoris se distinguent essentiellement par leur capacit acidifiante et leur sensibilit la temprature. La sous- espce Lc. lactis ssp. cremoris est incapable de pousser au- dessus de 37C. Le biovar Lc. lactis ssp .lactis var diacetylactis, utilise le citrate, produit du diactyle, de lactoi ne et du CO2 (CHAMBA ,2000). Habitat

Les bactries du genre Lactococcus sont les bactries lactiques les plus importantes d'un point de vue commercial. Les habitats les plus importants des lactoccoques demeurent le lait, les laits ferments ainsi que les fromages o ils constituent la flore dominante. Cependant, on peut galement les isoler des plantes ( SANDINE et al ,1972) ainsi que de la peau de certains animaux, et il semble que la contamination qui a lieu au cours de la traite ait pour origine principale le fourrage (RAUNAUD ,2006).

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Synthse bibliographique

1.2.4.2. Rle de Lactococcus lactis dans la fabrication du fromage Lactococcus lactis est la seule espce de lactocoques utilise industriellement en fromagerie (HOLLER et STEELE , 1995). Le groupe des levains msophiles, auquel les lactocoques appartiennent, est le premier avoir fait lobjet de slection et de production pour lindustrie laitire. Les souches sont slectionnes pour leur aptitude acidifier le lait, travers leur mtabolisme homofermentaire, et produire des armes. Les lactocoques sont utiliss dans la majorit des technologies fromagres o ils peuvent constituer le seul ensemencement en bactries lactiques (CHAMBA ,2000). La fabrication dun fromage rsulte dun ensemble de phnomnes physico-chimiques et biochimiques de transformation du lait par une flore microbienne et/ou par laction de prsure. Les levains lactiques sont capables de fermenter les sucres en lactate entranant la coagulation du lait, mais galement de produire de nombreux autres composs comme des polysaccharides, des armes ou encore des agents antibactriens (bactriocines). Ainsi, les fonctions technologiques r sultant de laction de ces micro -organismes touchent aussi bien la texture que les aspects organoleptiques, nutritionnels et sanitaires du produit fini, ainsi que sa conservation (RAYNAUD ,2006). 1.3. Bactriocines Les bactriocines sont dfinies comme des molcules scrtes par les bactries, de nature protique ou peptidiques et doues d'une activit antagoniste vis--vis des souches phylogntiquement proches des souches productrices. Leur synthse par voie ribosomique, les diffrencie des antibiotiques de nature peptidique provenant de l'assemblage enzymatique d'acides amins libres (CENATIEMPO et al, 1996). Deux grands groupes de bactriocines peuvent tre distingus avec, d'une part, les bactriocines produites par des bactries GRAM ngatif, principalement reprsentes par les colicines et les microcines, et d'autre part, celles produites par les bactries GRAM positif, et notamment les bactriocines de bactries lactiques (MORISSET ,2003). La dcouverte des bactriocines remonte 1925 quand GRATIA appela "colicines" des substances antibactriennes scrtes par E. coli active contre E. coli V. Des substances semblables scrtes par des bactries GRAM positif ont t dcouvertes. Elles ont t appeles bactriocines . II a t rapport pour la premire fois par ROGERS en 1928, qu'une substance antimicrobienne produite par Lactococcus lactis ssp. lactis avait une activit inhibitrice sur Lactobacillus delbruckii ssp. bulgaricus.

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Synthse bibliographique La nature protique de cette substance a t identifie par HIRCH en 1951 qui l'appela nisine. "n" dsigne les streptocoques de groupe N selon la classification de Lancefield (1993). "is" est l'abrviation de Inhibitory Substances et "ine" dsigne une bactriocine ( DE VUYST et VANDAMME ,1994) cit par (DAOUDI , 2000). La production d'une bactriocine peut tre considre comme une faon d'liminer des bactries envahissantes qui font comptition la bactrie productrice pour les nutriments. Le spectre d'activit d'une bactriocine se dfinit comme tant la diversit des bactries sensibles l'action bactricide ou bactriostatique du peptide. On a d'abord attribu aux bactriocines un spectre d'activit limit aux bactries taxinomiquement proches de la bactrie productrice. Certaines bactriocines possdent un large spectre d'activit qui inclut des bactries loignes au point de vue phylogntique ( LACHANCE, 2000). Des critres ont t tablis pour dfinir les bactriocines :

Ce sont des protines Elles ont une activit bactricide et pas seulement bactriostatique ; Elles ont des sites de liaisons spcifiques dans la membrane des bactries cibles ; leur synthse est associe la synthse d'une protine d'immunit qui vite de provoquer la mort de la cellule excrtrice ;

elles ont un spectre d'activit troit (TROUPEL, 2007).

1.3.1. Bactriocines des bactries lactiques Depuis des temps immmoriaux les bactries lactiques (BL) ont t utiliss comme ferments dans les aliments en vue de leur conservation. Vu les rglementations imposes aujourd'hui concernant l'utilisation de certaines substances chimiques non dsirables dans les aliments, il y a eu un intrt de plus en plus lev vers l'utilisation des produits naturels comme industriels. II a t montr que les BL ont 1a capacit de produire des acides organiques, tel l'acide lactique, de tolrer les milieux faibles pH ( TRAMER, 1961), de produire du peroxyde d'hydrogne (WHEARER et al, 1952) ainsi que des substances antibactriennes appeles bactriocines (KLAENHAMMER, 1988). La production de bactriocines a t mise en vidence chez tous les genres de bactries lactiques. Cependant les caractristiques chimiques, biochimiques et gntiques de la plupart de ces substances ne sont pas encore bien lucide ( DE VUYST et VANDAMME, 1991). 1.3.1.1. Classification des bactriocines des bactries lactiques La premire classification fut labore par KLAENHAMMER en 1988. Elle sparait les bactriocines des bactries lactiques en deux groupes, selon l'tendue de leur spectre d'inhibition. Cette classification fut ractualise en 1993, suite au dveloppement des mthodes biochimiques

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Synthse bibliographique
Tableau V : Caractristiques des genres Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus (GUIRAUD, 2003)

Enterococcus

Lactococcus L. lactis subsp cremoris L. lactis subsp lactis L .diacetylactis

Streptococcus S.thermophilu s + + V V . AC + . V V . + 23

S. agalactiae

S. dysgalactiae

Groupe gnomique Hmolyse Croissance 10C Croissance 45C Croissance pH 9,6 Croissance 6 ,5 % Na Cl Croissance sur milieu bili Rsistance 30 min 63C Rsistance loptochine

D V + + + + V .

D + + + + + + . + + + + +

D + + + + + + . + + + -

N + + V . + + . .

N + V . V . V .

N + + V . + + . V .

B V V V + + . + .

D V V + + + . V AC + + V . V . . + +

C + + . . . + + . . . + .

+ V V V V . V . . . + + . . . -_ V

A + . + . . A + + . . . V V

Croissance sur lait au V bleu de Sherham Hydrolyse de lArginine Rsistance au tellurite Hydrolyse de lhippurate Rduction du TTC Lait tournesol Lactose Maltose Mannitol Melibiose Actoine (VP) Citrate CO2 sur citrate -glucoronidase Glatinase + V ARC + + V V -

ARC ARC ARC ARC ARC . + + + V + V + + + V V . + + + + + + + + + V + . V . . + -

Hydrolyse de lamidon -

Esculine + + + V V V + V : variable, (.) : non dtermin, ARC : Acidification Rduction Coagulation

S . pyogenes

E. faecium

E .faecalis

E.durans

S. boris

S.mitis

Synthse bibliographique et gntiques, se basant alors sur la structure et le mode d'action des bactriocines (HENG et TAGG, 2006) (Tableau VI). Les bactriocines des BL peuvent tre subdivises en trois classes selon leur structure primaire, leur poids molculaire et leur stabilit la chaleur ( DE VUYST et VANDAMME, 1994) cit par DAOUDI (2000) : Les Lantibiotiques : ce sont de petites molcules (entre 19 et 37 acides amines) stables la chaleur. Dans cette classe on retrouve la nisine, la lacticine 481, la lactocine S et la carnocine U 149 (fig.1). Les non-lantibiotiques de faible poids molculaire : ce sont des bactriocines de poids molculaire infrieur 15000 et stables la chaleur (entre 30 min. 100C et 15 min. 121C), Cette classe regroupe la diplococcine, la lactococcine A, la lactocine 27, la lactacine B et F, la sakacine A, la pdiocine PA -1, la leucocine A-UAL 187 et enfin les carnobactriocines. Les non-lantibiotiques de haut poids molculaire : ce sont des bactriocines de poids molculaire suprieur 15 000 et sensibles la chaleur (inactives entre 10 15 min. 60100C). On y retrouve l'helvticine J, l'acidophilucine A, la lacticine A et B et la casicine 80. Tableau VI : Classification des bactriocines des bactries lactiques (HENG et TAGG, 2006)
Classes Sous-classes Contiennent des lanthionines et des -mthyl- lanthionines Ia : molcules linaires Classe I- Lantibiotiques Ib : bactriocines globulaires Ic : bactriocines composes de plusieurs peptides

IIa : bactriocines apparentes la pdiocine IIb : peptides de type divers Classe II- Peptides non modifis Ilc : bactriocines composes de plusieurs peptides

Illa : bactriocines bactriolytiques Illb : peptides non lytiques Classe III- Protines de poids molculaire lev

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Synthse bibliographique 1.3.1.2. Intrts des bactriocines Dans leur grande majorit, les bactriocines peptidiques de bactries lactiques sont thermorsistantes (120C pendant 10 minutes), stables dans des zones de pH de 3 8 et sensibles laction denzymes protolytiques (prsentes dans le tractus inte stinal). De plus, contrairement certains autres peptides antimicrobiens dinvertbrs et vertbrs, elles ne montrent pas dactivit hmolytique vis vis des cellules eucaryotes ( NES et HOLO, 2000). Parmi les applications relles ou envisages pour les bactriocines de bactries lactiques, on peut citer lutilisation de ferments producteurs de bactriocines dans lindustrie laitire (cependant peu de ferments de ce type sont utiliss) ( CLEVELAND et al, 2001). La fixation des bactriocines sur des polymres pour lemballage daliments pourrait aussi tre un mode de conservation des aliments (SEBTI et al, 2002). Diffrentes bactriocines trouvent des applications dans les domaines, mdicaux et vtrinaires. Par exemple, la nisine a fait lobjet dun brevet (BLACKBURN et PROJAN, 1994 ) quant son utilisation dans la prvention et le traitement dulcre caus par Helicobacter pylori .Elle est, de plus, connue pour tre un agent thrapeutique potentiel des mastites bovines, et est dj utilise comme agent prophylactique. Diffrentes tudes ont t ralises sur lutilisation de la nisine en solution buccale. Elle a dmontr une action prventive contre la plaque dentaire et les inflammations gingivales chez le chien (HOWELL et al, 1993 ).

Figure 2 : Structure de quelques bactriocines des bactries lactiques (les lantibiotiques).

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1.3.2. Production et conditionnement des bactriocines 1.3.2.1. Production des bactriocines Les bactriocines sont gnralement produites la fin de la phase exponentielle et au dbut de la phase stationnaire de croissance. Elles peuvent ensuite tre dgrades par les protases produites par la bactrie lactique productrice (SAVIJOKI et al, 2006) ou tre adsorbes sa surface ce qui mne la baisse de la concentration de bactriocines dans la culture. Les facteurs influenant la production de bactriocines sont principalement la souche productrice, la temprature, le pH, la composition du milieu et la technologie de fermentation employe (DORTU et THONART, 2008). La composition du milieu, tout particulirement les sources et concentrations de carbone et azote, affectent fortement la production de bactriocines. Les bactries lactiques productrices requirent de nombreux nutriments pour leur croissance et des milieux riches, contenant de lextrait de viande, de levure et des hydrolysats de protines, sont ncessaires. Il a dj t mon tr que laugmentation des concentrations en extrait de levure, extrait de viande ou peptone peut permettre une augmentation de la production de bactriocines ( AASEN et al, 2000 ; NEL et al, 2001 ; MATARAGAS et al, 2004 ; TODOROV et al, 2004 ; VERLUYTEN et al, 2004). Dautre part, quelques tudes ont montr que la source de carbone utilise et sa concentration est un facteur important dans loptimisation de la production de bactriocines (LEAL-SANCHEZ et al, 2002 ; LEROY et al, 2006 ; CHEN et al, 2007 ; ANASTASIADOU et al, 2008). Lajout de ces nutriments lors dune culture Fed -batch permet souvent daugmenter la production comparativement une culture en batch ( CALLEWAERT et al, 2000 ; GUERRA et al, 2005 ; Lv. et al, 2005). Lutilisation de la technique des cellules immobilises peut permettre daugmenter la dure et la stabilit de la production de bactriocines. Les cellules peuvent tre immobilises dans des biofilms ou des billes dalginates de calcium. Cette technique a dj t utilise avec succs pour la lacticine 3147 et la nisine (SCANNELL et al, 2000 ; PONGTHARANGKUL et al, 2006). 1.3.2.2. Conditionnement des bactriocines Il est trs difficile de conditionner les bactriocines sous une forme purifie. Leur purification est une procdure longue et coteuse qui ncessite la mise en uvre de nombreuses techniques savoir une prcipitation des protines au sulfate dammonium, diffrentes combinaisons de chromatographies sur colonne telles que des changes dions ou des interactions hydrophobes et

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Synthse bibliographique une tape finale de chromatographie liquide haute performance en phase inverse. Ces traitements ne sont pas applicables lchelle industrielle. La stratgie souvent mise en uvre consiste ds lors de ladsorption de la bactriocine sur la cellule productrice, en une centrifugation ou une ultrafiltration de la culture et une dsorption de la bactriocine par abaissement du pH 2 et augmentation de la concentration en chlorure de sodium. Les bactriocines semi-purifies peuvent alors tre conditionnes sous forme sche par atomisation ou lyophilisation par exemple (PARENTE et al, 1999). La nisine, la seule bactriocine lgalement approuve comme additif alimentaire, est commercialise sous une forme semi-purifie (DORTU, 2008). 1.3.3. Mode dutilisation des bactriocines Les bactriocines peuvent tre utilises dans les aliments selon trois procds : - inoculation de la souche productrice de bactriocine dans le produit : si la bactrie lactique est naturellement prsente dans le produit alors dans ce cas elle se dveloppe normalement et produit la substance inhibitrice au cours de sa phase exponentielle de croissance. Si au contraire, il faut implanter la souche productrice, le succs de lopration dpend de la capacit de la souche se dvelopper et produire la bactriocine dans un environnement nouveau. Les conditions de culture (temprature, pH, aw, exigences nutritionnelles dans laliment) peuvent ne pas convenir au dveloppement du microorganisme souhait ; - utilisation dune prparation semi-purifie de bactriocine : le plus souvent, il sagit du milieu de culture ferment dbarrass des cellules bactriennes ; - utilisation de la bactriocine pure : dans ce cas, la bactriocine nest pas accompagne de substances nuisibles au procd de fabrication ou lobtention du produit souhait (METIVIER ,1997) 1.3.4 .La nisine La nisine est un agent antimicrobien produit par quelques souches de Lc. lactis sp. Elle appartient au groupe des bactriocines dfinies par TAGG et al, (1976) comme des composs protiques ayant une activit inhibitrice contre des souches phylogntiquement proches de la souche productrice. De nombreuses bactriocines rpondent cette dfinition mais certaines dentre elles prsentent un spectre dactivit plus large, stendant des souches plus loignes (KLAENHAMMER, 1993). La nisine fut dcouverte en 1928 par ROGERS lorsquil saperut quun mtabolite produit par Streptococcus lactis (Lc. lactis dans la nouvelle nomenclature) possdait une activit inhibitrice contre dautres bactries lactiques.

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Synthse bibliographique La nisine appartient la classe I des bactriocines ( KLAENHAMMER, 1993). Cette classe regroupe les composs protiques dune taille infrieure 5 k Da et contenant les acides amins modifis thiother lanthionine et mthyl-lanthionine et des acides amins dshydrats tels que le didshydrobutyrine (Dhb) et didshydroalanine (Dha). Le terme lantibiotique (par contraction des mots lanthionine et antibiotique) leur est gnralement rserv ( SAHL et al, 1998). 1.3.4.1. Structure et proprits physico-chimiques La nisine est un peptide de 3488 Da constitu de 34 acides amins dont la structure est reprsente dans la figure 3. Les molcules de nisine peuvent sassembler en dimres ou en oligomres de 7000 14000 Da ( KLAENHAMMER, 1993) via des ractions intermolculaires entre les rsidus Dha et Dhb. La conformation en anneaux des lanthionines assurerait la rigidit du peptide, diminuerait sa sensibilit la protolyse et augmenterait sa rsistance la chaleur ( Mc AULIFFE et al, 2001). MULDERS et al, (1991) ont isol un variant naturel de la nisine A, la nisine Z, qui diffre par un acide amin en position 27. La spcificit de lactivit antimicrobienne des deux variants est identique. Cependant, des tests dactivit mens par la technique de diff usion en glose et des concentrations en bactriocines suprieures 0.1 g/ml ont montr que la nisine A donnait des zones dinhibition dun diamtre infrieur celles de la nisine Z concentrations identiques (DE VOS et al, 1993). Cette diffrence sexplique par une meilleure diffusion de la nisine Z dans lagar (DE VOS et al, 1993). La solubilit de la nisine est fonction du pH et de la force ionique de la solution (ROLLEMA et al, 1995). Au dessous de pH 5, la nisine A prsente une solubilit suprieure celle de la nisine Z. Dans des conditions de pH neutre ou basique, la solubilit des deux variants est comparable (ROLLEMA et al, 1995). Le pH influence de faon importante la stabilit de la nisine la temprature (HURST, 1981 ; ROLLEMA et al, 1995). La nisine dans une solution pH 5.0 et 6.8 perd respectivement 40 et plus de 90 % de son activit aprs un autoclavage 115.6C, alors qu pH 2 aucune diminution de lactivit nest observe (HURST, 1998). 1.3.4.2. Biosynthse de la nisine Les bactriocines sont directement produites par la voie ribosomique, sous la forme de polypeptide ou de prpeptide, contrairement aux antibiotiques ou aux toxines qui sont plutt synthtiss par des cascades enzymatiques (JACK et al, 1995).Trois classes de transposons dune

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Asparagine au lieu de lhistidine pour la nisine Z

Figure 3 : Structure de la nisine A et de la nisine Z (Mc AULIFFE et al, 2001).

taille de 70 kb contenant les gnes responsables de la synthse de nisine ont t identifis chez Lc. lactis sp. (RAUCH et al, 1994). Les classes I et II regroupent les transposons conjugatifs portant respectivement les gnes nisA et nisZ codant pour le prpeptide de la nisine A et Z. Les membres de la classe III contiennent le gne nisZ et sont non conjugatifs. Les transposons portent galement les gnes des protines impliques dans les modifications post-traductionnelles du prpeptide (nisB, nisC et nisP), la scrtion du peptide mature (nisT), de limmunit de la souche productrice la bactriocine (nisI , nisF, nisE et nisG) et des facteurs de rgulation de la transcription ( nisK et nisR) (KLEEREBEZEM et al, 2001). Les bactries productrices possdent un gne qui leur confre une immunit contre l'action de leur propre bactriocine (DRIDER et al, 2006 ; RECHARD et SAHL 2002; NES et al, 1996). La biosynthse des bactriocines est grandement influence par diffrents facteurs tels que le milieu de culture, la temprature et le pH ( AUDISIO et al. 2001 ; TODOROV et DICK 2006). De plus, KLEEREBEZEM (2004) a suggr que la biosynthse de la nisine chez certaines bactries pouvait tre auto-rgule par un phnomne de dtection du quorum (en anglais, Quorum Sensing ), c'est--dire que la transcription des gnes de biosynthse serait dpendante du niveau de la densit cellulaire bactrienne dans le milieu. D'autres auteurs ont rcemment publi des rsultats dmontrant aussi l'importance du Quorum Sensing lors de la biosynthse des bactriocines (PETERSEN et al, 2006; PLOEG, 2005).

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Synthse bibliographique 1.3.4.3. Spectre dactivit La nisine possde une action inhibitrice sur les bactries GRAM positif. Parmi toutes les bactriocines, la nisine possde un spectre dactivit trs large incluant des souches de Lactococcus, Lactobacillus, Listeria, Enterococcus, Micrococcus, Pediococcus et Staphylococcus ainsi que des cellules vgtatives et des spores de Clostridium et Bacillus (MEGHROUS et al, 1999). Dans des conditions normales, les bactriocines produites par des bactries GRAM positif nont pas deffet bactricide sur des espces GRAM ngatif. Cependant, la nisine prsente une activit inhibitrice contre des souches d Helicobacter pylori et de Neisseria (MOTA-MEIRA et al, 2000) et de Salmonella en prsence dEDTA (STEVENS et al, 1991). Il est connu depuis longtemps que les bactries GRAM ngatif ne sont pas affectes par la nisine. STEVENS et al. (1991) ont confirm les rsultats obtenus par BLACKBURN et al. (1989) sur l'inhibition des espces de Salmonella et d'autres bactries GRAM ngatif. L'effet bactricide d'une combinaison de nisine (0.1 300 UI/ m) avec un agent chlateur comme lEDTA (0.1 20 mM) sur les bactries GRAM ngatif incluant les espces de Salmonella, E. coli et Pseudomonas, a t dmontr. Cette combinaison fragilise et dsorganise la membrane externe de ces bactries et permet la nisine d'tre en contact avec leur membrane cytoplasmique pour la dstabiliser (STEVENS et al, 1992). 1.3.4.4. Mode daction La premire cible de la nisine se situe au niveau de la membrane cytoplasmique des souches sensibles ( SAHL et al, 1998). Des deux modles proposs dans la littrature pour expliquer la formation des pores transmembranaires par la nisine, celui de DRIESSEN et al. (1995) et VAN DEN HOOVEN et al. (1996) est gnralement retenu ( SAHL et al, 1998).modle est reprsent par la figure 4. Les forces dattraction lectrostatiques entre les charges ngatives des ttes phospholipidiques de la membrane et les charges positives des rsidus de lysine de lextrmit C terminale de la nisine seraient lorigine des interactions entre les molcules de nisine et la membrane ( BREUKINK et al, 1998). Le caractre amphiphile de la nisine lui permettrait ensuite de sinsrer dans le feuillet externe de la bicouche lipidique ( VAN DEN HOOVEN et al, 1996). Laccumulation de plusieurs molcules de nisine au mme point conduirait la formation dun pore. Tout en restant attaches la surface, les molcules de nisine se dplaceraient travers la membrane, en rponse au potentiel lectrique, entranant avec elles les lipides de la couche

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Synthse bibliographique externe du ct cytoplasmique (MOLL et al, 1996). La formation transitoire de ces pores saccompagne dune rupture de la force proton - motrice par dissipation du potentiel lectrique transmembranaire ( et du gradient de pH conduisant larrt de toutes biosynthses (MONTVILLE et al, 1994). Les pores entranent galement le passage dans le milieu extracellulaire dATP, dacides amins, de potassium et de phosphate inorganique (RUHR et al, 1985 ; ABEE et al, 1994). Le deuxime mode daction de la nisine est linhibition de la biosynthse de la paroi cellulaire (REISINGER et al, 1980). Cette inhibition rsulterait de la formation dun complexe entre le prcurseur lipidique membranaire du peptidoglycane, le lipide II, et les molcules de nisine. Le lipide II est galement la seule cible spcifique de la nisine pour la formation de pores ( Mc AULIFFE et al, 2001). Cette association engendre des pores stables et uniformes composs de 8 molcules de nisine et 4 de lipides II selon un nouveau modle propos par HASPER et al. (2004). 1.3.4.5. Toxicit de la nisine Les bactriocines sont dgrades par certains enzymes protolytiques. La non-toxicit de la nisine, la seule bactriocine autorise comme additif alimentaire, a t dmontre ( TURTELL et DELVES-BROUGHTON, 1998). De plus, un facteur important considrer est que la nisine prsente dans les aliments, est facilement dgrade par les enzymes digestifs sans toutefois gnrer des produits toxiques (HURST, 1981). Ainsi, lorganisation de lagriculture et de lalimentation (FAO) et l'organisation mondiale de la sant (OMS) ont recommand une prise moyenne journalire (Average Daily Intake: ADI) de 0 33 mg de nisine par kg de poids corporel. La nisine a t approuve pour des utilisations spcifiques dans diffrents produits alimentaires dans 50 pays dont les Etats-Unis (TURTELL et DELVES-BROUGHTON, 1998 ; DELVES-BROUGHTON, 1997). Toutefois son usage alimentaire reste restreint certains aliments ( BOUKSAIM , 1999).

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enisiN

Milieu extracellulaire

Milieu intracellulaire

Figure 4 : Modle de formation dun pore transmembranaire par la nisine (SAHL et al, 1998). 1.3.4.6. Rle de la nisine dans la conservation des aliments Les spectres d'action antimicrobienne de la nisine et de la pdiocine sont larges. Elles agissent de trs faibles concentrations sur des bactries pathognes ou d'altration alimentaire (De VUYST et VANDAMME, 1994). Cependant, la nisine est la plus connue et la seule bactriocine des BL accepte comme bio-ingrdient dans les aliments par FDA (1988). La nisine est surtout rpute pour son efficacit contre les spores de Clostridium et de Bacillus, frquemment responsables de la dtrioration des conserves alimentaires ( DELVES-BROUGHTON, 1990). L'efficacit de la nisine est dpendante de la qualit des aliments et est meilleure dans le cas o la charge des contaminants n'est pas leve (DAOUDI, 2000). La conservation du lait par la nisine a t rapporte par WAJID et KALN (1976) qui ont montr que des chantillons du lait striliss et traits avec la nisine ont pu tre conservs six mois 37C et trois semaines 55C. La nisine a t efficace contre les cellules vgtatives ou les spores des bactries contaminants sans qu'un traitement de rfrigration ne soit appliqu. La nisine a t utilise pour la premire fois dans un fromage de type Emmental pour empcher le gonflement par Clostridium butyricum (HIRSCH et al, 1951) et contre la contamination par C. botulinum des fromages pasteuriss pte fondue (DELVES-BROUGHTON, 1990).

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Synthse bibliographique La nisine connat une large application comme additif alimentaire dans les conserves de vgtaux, soupes ou poudings base de crales ( ECKNER, 1992). Il ressort que la nisine peut remplacer partiellement les nitrites reconnus pour tre cancrignes dans la conservation des aliments (RAYMAN et a1, 1981). L'ajout de bactriocines dans les aliments permettrait non seulement de commercialiser des produits plus sains et plus scuritaires mais aussi de diminuer l'emploi de conservateurs chimiques (HARLANDER, 1993). Dans la viande l'utilisation de la nisine est limit en raison de la quantit importante de nisine requise pour avoir un effet notable sur la dure de vie du produit ( TAYLOR et SOMERS 1985). La faible solubilit, la distribution non homogne et le manque de stabilit des bactriocines la surface des viandes ainsi que l'action des protases des ferments utiliss ou de la viande peuvent affecter l'efficacit des bactriocines. La Nisaplin, une prparation contenant 2.5% de nisine A pure, est utilise 10 6 UI/g dans les industries alimentaires pour la conservation (DELVES-BROUGHTON, 1990). Les inconvnients lis l'emploi des bactriocines tiennent leur spectre d'action rduit aux bactries GRAM positif et leur dpendance du pH, de la temprature, de la composition et la structure de l'aliment. De plus, vue la nature protique de la nisine, son activit peut tre rduite aussi par des enzymes protolytiques, par oxydation, lors d'interaction avec des mtaux lourds, lors d'agitation excessive ou aprs dconglation (DAESCHEL et al, 1991). Une perspective efficace contre la contamination des aliments serait l'utilisation combine de la nisine et les traitements de conservation conventionnels (Pasteurisation. atmosphre modifie ...) en vue d'aboutir des produits stables et scuritaires pour le consommateur. TAYLOR et al. (1990) ont rapport qu'un emballage sous atmosphre modifie (CO 2) ou sous vide combin l'utilisation de la nisine pourrait allonger significativement la dure de vie de certains poissons.

1.3.4.7. Mthodes de dtection et de quantification de la nisine Depuis les 50 dernires annes, le dosage de la nisine a t effectu par les mthodes microbiologiques utilisant des techniques de dilution ( HIRSCH, 1950), de turbidimtrie (BEMDGE et BARRETT , 1952) et de diffusion sur glose (TRAMER et FOWLER , 1964 ; DABA et al, 1994 ; DAOUDI, 2000). Il existe plusieurs variantes de la mthode de diffusion dans l'agar, mais pour la plupart d'entre elles, l'observation d'une zone de lyse claire autour d'un puits ou d'une goutte indique la prsence possible de l'activit d'une bactriocine. Des tmoins ngatifs sont ncessaires pour liminer toute possibilit d'inhibition due des acides organiques, des

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Synthse bibliographique bactriophages, du peroxyde d'hydrogne ou tout autre compos inhibiteur. Selon quelques auteurs, les mthodes turbidimtriques semblent plus sensibles que les mthodes de diffusion dans l'agar pour dtecter l'activit bactriocinogne d'une bactrie ( PAPAGIANNI et al, 2006; PARENTE et al, 1995 ; TURCOTTE et al, 2004). Des approches immunologiques (BOUKSAIM et al, 1998; BOUKSAIM et al, 1999; KEREN et al, 2004), des essais fonds sur l'induction de gnes de bioluminescence ( HARKONOVIRTA et al, 2006 ; REUNANEN et SARIS, 2003) et la quantification du potassium largu hors de la cellule cible lors de la formation des pores (MUGOCHI et al, 2001) sont aussi d'autres possibilits pour vrifier l'activit

bactriocinogne d'une bactrie. Par ailleurs, la quantification du potassium largu permet d'obtenir quelques informations sur le mode d'action des bactriocines ( MANTOVANI et RUSSELL, 2003) cits par CHAMPAGNE (2007).

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Matriel mthodes Synthseet bibliographique II. Matriel et mthodes 2 .1.Matriel 2.1.1. Echantillons de lait de chamelle Le lait de chamelle utilis dans la prsente tude est un lait de mlange. Il est collect le 26 fvrier 2011, partir dun levage implant dans la rgion de Ghardaa et conduit en semi -extensif (Pturage du Mzab). Il est transport dans des flacons striles, dans une glacire, au laboratoire de luniversit pour y subir des analyses, physico -chimiques et microbiologiques. Lchantillon de lait collect est divis en deux parties, aprs avoir subit quelques analyses prliminaires : - la premire partie est immdiatement utilise pour la prparation dun fromage frais en vue de lisolement de la souche lactique productrice de nisine ; - la deuxime partie subit une conservation 7C pendant 10 jours, en vue de lisolement de la souche psychrotrophe. 2.1.2. Appareillage 2.1.2.1. Appareils utiliss pour les analyses physico-chimiques - pH-Mtre (METROHOM 620) ; - Densimtre (G-widder). 2.1.2.2. Appareils utiliss pour la prparation du fromage - Bain marie (MEMMERT) ; - Four Pasteur (HEARAEAUS) ; -Rfrigrateur (Binder).
2.1.2.3. Appareils utiliss pour les manipulations microbiologiques

-Microscope optique (Laboscope 200); -Autoclave (Systec 5075 MLV); -Incubateur (HERAEAUS); -Incubateur agitateur (Heidolph Inkubator 1000) ;

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Matriel et mthodes Synthse bibliographique

-Centrifugeuse max .10000 tours /min. (Universal 16 R). 2.1.3. Verrerie et petit matriel Pipettes Pasteur, flacons en verre (de 250 ml), tubes essais en verre, pipettes gradues (1ml, 5ml, 10ml ), boites de ptri en plastique, bchers de 500 et 1000 ml, des Erlen Myers, tubes hmolyse en plastique (5ml), micropipette (50 l), burette, anse de platine, fil droit, mortier, cloches de Durham ... 2.1.4. Ractifs -Eau physiologique, - Phnolphtaline, - Solution de Soude (1N), - Bleu de Mthylne, - Rouge de Mthyle, - Tampon citrate (2%), - Tampon tryptone-sel (TS), - Ractifs pour coloration du GRAM, - L'eau oxygne, - Disques doxydase. 2.1.5. Milieux De Culture (annexe 1). -Milieu M 17(bouillon et glos) -Milieu Glose Nutritive Ordinaire (GNO) -Milieu King A -Milieu King B

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse

-Milieu Muller Hilton -Galerie API 20 E (Biomrieux) -Milieu T.S.I -Milieu K .I.A -Milieu Mannitol de Mobilit - Bouillon Nutritif (BN) -Bouillon de Clark et Lubs 2.2. Mthodes Les diffrentes tapes de la mthodologie suivie dans cette tude sont schmatises sur la figure 5 :

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse

Collecte du lait de chamelle

Etude prliminaire

Analyse Physico-chimique

Analyse microbiologique (test de rductase)

Isolement et identification des souches bactriennes, production de la nisine

Rfrigration du lait camelin cru pour quelques jours

Fabrication du fromage frais partir du lait camelin frais

Isolement et identification de la souche Pseudomonas fluorescens


Pseudomonas fluorescens

Isolement et identification de la souche Lactococcus lactis ssp. lactis

Mise en culture de la souche identifie et rcupration du surnageant

Essai de lactivit inhibitrice de la nisine contre Pseudomonas fluorescens Figure 05: Procdure exprimentale

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Matriel et mthodes Synthse bibliographique 2.2.1. Analyses physico-chimiques 2.2.1.1. Mesure de l'acidit Le pH est mesur 20C laide dun pH -mtre de type (METROHOM 620). Le principe repose sur la mesure directe du pH l'aide d'une lectrode plonge dans un bcher contenant 100 ml du lait. La valeur de pH est lue directement sur l'appareil (SBOUI et al., 2009). Lacidit est dose par titration avec une solution de NaOH (N/9) et exprime en Dornic (SBOUI et al., 2009). Un chantillon prcis de 10 ml de lait est plac dans un bcher de 100 ml en prsence de 0,1 ml de phnolphtaline, la soude est ajoute la burette jusqu'au virage au rose de l'chantillon le degr Dornic correspondant au nombre de 1/10 de ml de soude Dornic N/9 ncessaire pour assurer le virage de la phnolphtaline (GUIRAUD, 2003). 2.2.1.2. Densit La densit est dtermine laide dun densimtre de type (Gwinder) sur un lait maintenu au repos. Elle consiste plonger l'appareil dans une prouvette de 250 ml remplie de lait, lorsqu'il se stabilise, la lecture de la valeur de la densit se fait directement sur l'appareil (SBOUI et al., 2009). 2.2.2. Analyse microbiologique du lait Test de rductase La population bactrienne du lait peut tre indirectement dtermine en ajoutant l'chantillon examiner , une quantit connue de bleu de mthylne et en observant le temps requis pour sa dcoloration ( GUIRAUD , 2003). La dure de la dcoloration nous permet de quantifier approximativement la population microbienne du lait et par consquent destimer sa qualit microbiologique ( BERRENS et LUQUET, 1987). (Tableau VII). Il sagit de mettre dans des tubes essai striles lchantillon du lait de chamelle (lait cru) , ajouter de bleu de mthylne (1%), mlanger, et incuber 37 C .

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Matriel et mthodes Synthse bibliographique Tableau VII : Grille dapprciation de la qualit microbienne du lait (BERRENS et LUQUET, 1987). Dure de dcoloration (heures) Suprieure heures De 2 4 heures Infrieure 2 heures Nombre de germes (germe/ml) 5 100000 200000 200000 2 millions 2 10 millions Qualit microbienne du lait Bonne Bonne passable insuffisante

2.2.3. Isolement et identification De la souche productrice de nisine partir dun fromage frais camelin 2.2.3.1. Isolement 2.2.3.1.1. Essai de fabrication de fromage camelin frais Un fromage frais est tout d'abord un fromage que l'on doit consommer assez rapidement aprs sa fabrication. Il est obtenu par simple coagulation du lait que l'on dclenche par emprsurage et/ou acidification ou par acidification et chauffage. Il est peu goutt et non affin. Il peut tre sal ou sucr (RAMET, 1993). La mthode de fabrication utilise dans le prsent travail consiste utiliser des enzymes gastriques de dromadaire (ECD) comme seul agent de coagulation. Ces enzymes sont extraites partir de lestomac dun dromadaire g de 14 mois (BOUDJENAH-HAROUN et al., 2011) et conserves dans un flacon en prsence de thymol comme conservateur. La fabrication dure une journe et elle comprend sept tapes dcrites dans la figure 6 et sur lannexe 02.

2.2.3.1.2. Technique d'isolement de la souche productrice de nisine Lisolement de cette souche dintrt partir du fromage fabriqu au laboratoire avec les ECD, se fait comme suit : un chantillon de fromage de (10 gr) est mlang avec 90 ml de tampon citrate 2 %, dans un mortier. Aprs trituration pendant 3 min. la temprature ambiante, la suspension mre obtenue est utilise pour raliser des dilutions dcimales successives dans le mme tampon jusqu' une dilution 10 -8, dilution ncessaire pour lisolement bactrien ( EDIMA ,2007).

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse

1. Prparation du lait de chamelle

Rpartir 2 litres de lait de chamelle frais dans des bchers (500 ml /bcher) ; pasteurisation du lait pendant 15 secondes 72C dans un bain marie ; Laisser les bchers temprature ambiante pour quelques minutes.

2. Emprsurage du lait
Remettre les bchers contenant le lait au bain marie 30C ; Ajouter chaque bcher 10ml des ECD

3. Synrse (formation du caill)


Laisser les bchers au bain marie 42C pendant une heure au moins

4 .Exsudation (gouttage)
Verser les bchers doucement dans un dispositif facilitant lgouttage (des bchers recouvert par des compresses striles) ; Laisser le caill goutter pendant une nuit.

5. Moulage et dcoupage du coagulum : fromage


Rpartir le coagulum dans des boites de ptri striles : le fromage obtenu est dcoup

6. Conservation du fromage 4C Figure 6 : Fabrication du fromage camelin frais

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Matriel et mthodes Synthse bibliographique Le milieu glucos tamponn ou le bouillon M17 convient gnralement bien pour la culture en milieu liquide des lactocoques. Quelques gouttes de la dilution 10-8 sont prleves l'aide de l'anse de platine et sont ensemences en stries d'puisement, la surface d'une boite de ptri contenant de la glose M17; l'incubation se fait temprature de 30 C pendant 24 heures (GUIRAUD, 2003). 2.2.3.2. Identification biochimique de la souche Lactococcus lactis ssp. lactis A partir dune culture sur M 17 glos (incube 24 h / 30C) on ralise des repiquages successifs de la souche identifier sur le mme milieu glos pour assurer sa purification. Lidentification biochimique de la souche se fait selon GUIRAUD (2003) et JOFFIN et LEYRAL (2006) par : lexamen macroscopique (aspect des colonies sur glose M17) ; lexamen microscopique (aprs coloration de GRAM) ; le test de la catalase ; le test de loxydase ; lidentification classique de la souche selon quelques tests biochimiques (la galerie de Sherman) (selon JOFFIN et LEYRAL, 2006) ; ltude de type du mtabolisme et lassimilation d e quelques sucres (tests T.S.I, K.I.A et mannitol de mobilit) ; lutilisation de quelques tests de la galerie API 20 E.

Examen macroscopique Il sagit de dcrire laspect des colonies savoir leur forme, leur couleur et leur texture. Examen microscopique Cet examen est effectu avec lobjectif 100 immersion, aprs la coloration double de GRAM .Il sert classer la souche (GRAM + ou -) et dterminer la forme unitaire des cellules ainsi que leur mode denchainement (GUIRAUD, 2003) (annexe 3). Test de la catalase La catalase est une enzyme produite en abondance par les bactries ayant un mtabolisme

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse respiratoire qui dtruit le peroxyde dhydrogne et libre de loxygne ( VZINA et LACROIX, 2000). La mise en vidence d'une catalase se fait par contact de la culture microbienne avec une solution fraiche d'eau oxygne (GUIRAUD, 2003). Test de loxydase Le test de loxydase est bas sur la production bactrienne dune enzyme oxydase intracellulaire (cytochrome C oxydase) en prsence doxygne atmosphrique et de cytochrome C. Sur un papier filtre strile, dposer un disque doxydase imprgn de dimthyle -para-phnylne diamine, humidifier le disque avec quelques gouttes deau distille strile, laide dune pipette pasteur, on prend une partie de la culture de la bactrie identifier (culture de 18 24h) et on la dpose sur le disque. La lecture se fait aprs 30 secondes, la raction est considre comme positive si on remarque la prsence dune coloration rose ple violet. Labsence de coloration signifie une raction ngative ( VZINA et LACROIX, 2000 ). Identification par la galerie de Sherman Culture 45C Ce test est ralis on ensemenant un tube essai contenant le bouillon M17 partir dune culture sur glose M17, lincubation dure 24 48 h. La prsence des troubles dans le tube indique la prsence de culture (on compare avec un tube tmoin non ensemenc). Culture en bouillon hypersal

Dans un tube essai contenant le bouillon M17 on ajoute du Na Cl 6 ,5 %, la culture se fait par quelques gouttes de suspension bactrienne dense, lincubation est de 24 h 37C. Culture pH 9,6 (base)

La mme technique que celle du test prcdent en remplaant le chlorure de sodium par du NaOH (1N), la solution de soude ajoute est pralablement prpare et strilise par autoclavage (120C / 15 min).

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse Etude du type du mtabolisme et de lassimilation de quelques sucres Etude de type de mtabolisme

Pour ltude de mtabolisme on verse le milieu M17 liquide sur des tubes essai contenant des cloches de Durham et on autoclave les tubes pour 15 minutes 120C. Lensemencement est suivi dune incubation 24 h 30 C. Le mtabolisme oxydatif se tradu it par labsence de gaz et les cloches restent au fond des tubes. Le flottement des cloches signifie la prsence des gaz et un mtabolisme fermentaire ( GUIRAUD, 2003). Test de (Mannitol mobilit) Le Test de (Mannitol mobilit) est ralis sur un milieu Mannitol de mobilit, un milieu glos semi solide qui permet d'tudier la mobilit dune souche bactrienne et de tester sa capacit ou non de dgrader le mannitol. L'ensemencement pa rtir dune culture sur milieu glos, se fait par piqre centrale du tube laide dun fil droit, suivie par une incubation pendant 24 h 30C. La transformation du milieu en jaune signifie : Mannitol + ; Les bactries trs mobiles peuvent se dplacer dans la glose molle et aller dgrader le mannitol tout le long du tube ( GUIRAUD, 2003). Test de T.S.I (Tri-Sugar-Iron) Ce test est ralis sur un milieu glos inclin T.S.I qui permet lutilisation du lactose, du saccharose, la fermentatio n du glucose et la production dH 2 S. Lensemencement des tubes est ralis sur la pente et par piqure en culot partir dune culture sur milieu glos. Lincubation se fait 30C pendant 24h (JOFFIN et LEYRAL , 2006). Test de Hajna-Kligler (K.I.A) Le test de Hajna-Kligler se fait sur milieu glos inclin qui permet lutilisation du lactose, fermentation de glucose et la production dH 2 S. Lensemencement est sur la pente et par piqure en culot partir dune culture sur milieu glos, lincubation se fait 30C pendant 24h (JOFFIN et LEYRAL, 2006). Identification par la galerie API 20 E Le principe consiste identifier les microorganismes par leur capacit fermenter des sucres, critre de diffrenciation des espces. Cette micro galerie est utilise pour lidentification des entrobactries, on lutilise dans cette tude pour quelques tests comme :

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse ADH (arginine dshydrolase)

Le test arginine dshydrolase sert dterminer si la bactrie transforme larginine par larginine dshydrolase, la ralisation de test se fait comme de la manire suivante : A laide dune pipette de Pasteur, on inocule la cupule de lAPI 20 E contenant larginine dshydrate avec linoculum de la bactrie identifier (prpar partir dune culture de 18 24 h avec de leau physiologique), on ajoute quelques gouttes dhuile minrale strile, on incube 30C pendant 24 48 h. A la suite de l incubation, on lit la raction obtenue : -raction positive : si le milieu demeure rose -raction ngative : si le milieu devient jaune orang (JOFFIN et LEYRAL, 2006). CIT (recherche de la citratase) Cest un examen qui affirme lutilisation de ci trate par les bactries comme seule source de carbone et dnergie, ce milieu est identique celui de citrate de Simmons (milieu glos), lensemencement se fait en remplissant la cupule linoculum de lincubation de la galerie se fait 30C/24- 48 h pour la lecture de test : - Raction positive : couleur bleu ou vert bleu - Raction ngative : couleur jaune (JOFFIN et LEYRAL, 2006). GEL (hydrolyse de la glatine) Ce test permet de mettre en vidence la prsence dune pro tase hydrolysant la glatine de lAPI 20 E (glatine agglomre avec du carbone). Lhydrolyse de la glatine peut tre tudie sur milieu glatin en culot, milieu de Kohn ou sur la cupule GEL de la galerie API 20 E (GUIRAUD , 2003). Lensemencement se fait en remplissant la cupule linoculum de la bactrie identifier. Linoculum est prpar partir une partie de la culture de la souche tudier avec 10ml deau physiologique, lincubation de la galerie se fait 30C/24 - 48 h, Pour la lecture : Raction positive : une suspension noire dans la cupule ; Raction ngative : les particules de glatine restent agglomres au fond de la cupule la bactrie identifier,

(JOFFIN et LEYRAL, 2006). 2.2.4. Production de nisine partir de culture de Lc.lactis ssp. Lactis Le protocole de production utilis sinspire de ceux raliss par plusieurs auteurs

(BAREFOOT et al, 1983 ; LACHANCE, 2000 ; SEBTI ,2002 ; XIA LIU et al, 2003 ; DOUMANDJI et al, 2010). La production de nisine commence par une pr-culture de la souche Lc.lactis ssp. lactis, souche prcdemment isole. Tout dabord, la pr-culture est obtenue en

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse ensemenant des tubes essai striles contenant 9 ml de bouillon M17 ave 1ml dune culture de plus de 24h de la souche Lc.lactis ssp. Lactis isole partir du fromage au lait camelin fabriqu au laboratoire, dans le mme bouillon. Les tubes sont incubs 30 C avec agitation 140 rpm pendant 18 h dans un incubateur agitateur. Pour faciliter la diffusion de la bactriocine de la souche Lactococcus lactis on utilise le milieu M17. 100 ml de ce milieu sont rparti en deux Erlen meyers (de 100 ml), enrichis en glucose 1% et striliss pendant 20min 120C. Ensuite, le milieu M17 est ensemenc 10 % par de la pr-culture de Lc.lactis ssp. lactis, cette culture est incube pendant 18 24 h 30C avec agitation 140 rpm. Pour la rcupration du surnageant, la culture bactrienne est rparti dans des tubes hmolyse (de 5 ml) et centrifug 8000 g pendant 20 min laide dune centrifugeuse rfrigre (UNVERSAL R16), le surnageant est rcupr soigneusement avec limination des cellules bactriennes rassembles en fond des tubes. Pour lim iner leffet des acides organiques, le pH de le surnageant obtenu est ajust 6 avec une solution de NaOH (1N). La figure 7 reprsente les principales tapes de production de la nisine partir d'une culture de Lc.lactis ssp lactis :
Culture de Lc. lactis ssp lactis en bouillon M17 et incubation 24H /30C 24h/30C

Prparation de pr-culture, incubation 30 C pendant 18 h.

Ensemencement de 100 ml du bouillon M 17 par 10 % de la prculture, incubation 30C /18 24 h

Centrifugation de la culture (8000 g / 20 min / 4C)

Rcupration du surnageant et ajustement de pH 6 avec Na OH (1N)

Figure 7 : Production de nisine partir de culture de Lc.lactis ssp.lactis.

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Matriel et mthodes Synthse bibliographique

2.2.5. Isolement et identification de lespce indicatrice 2.2.5.1. Isolement Lisolement de Pseudomonas fluorescens partir du lait camelin rfrigr se fait sur glose nutritive aprs incubation 7C pendant 10 jours ( MILLIERE et VEILLET-PNCET, 1979). Le milieu glos est rpartit en boites de ptri et ensemenc en surface par quelques gouttes du la dilution 10-3 du lait. Le diluant utilis est un tampon tryptone sel (TS) (GUIRAUD ,2003). 2.2.5.2. Identification Les colonies apparues sur GNO sont examines macroscopiquement. Lexamen ltat frais (examen de mobilit) et aprs coloration de GRAM doit tre observ sous microscope optique (100) (GUIRAUD, 2003). Culture sur King A et King B Les milieux de King (milieu King A et milieu King B permettent de diffrencier entre elles les diffrentes espces du genre Pseudomonas, par la mise en vidence de la production de pigments spcifiques, pyocyanine sur King A et pyoverdine sur King B ( GUILLAUME ,2004). Lensemencement des milieux King A et King B gloss couls en boites de Ptri et en tubes inclins se fait partir dune culture de la souche identifier sur GNO (aprs quelques r epiquages successifs) par des stries en surface des milieux. Lincubation se fait au moins pour 24h 30C et en arobiose. Mtabolisme des glucides (tests K.I.A et T.S.I) Lincubation de ces milieux se fait en arobios e (la technique densemencement est dj mentionne). Test de rouge de mthyle (RM) Le test au rouge de mthyle prsente un intrt dans lidentification bactrien ; il permet de prciser lvolution du pH en milieu glucos, ce test est raliser en utilisant le milieu Clark et Lubs (bouillon rpartit dans des tubes standards), lensemencement se fait partir dune culture sur GNO, lincubation 30C /24 h est suivie par lajout dune deux gouttes de RM avec lecture immdiat du test : raction positive : la coloration rouge montre un milieu relativement acide, la bactrie est dite RM+.

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Matrielbibliographique et mthodes Synthse

Raction ngative : la coloration jaune montre un milieu lgrement acide ou alcalin, la bactrie est dite RM- (JOFFIN ET LEYRAL, 2006).

Test de la catalase (GUIRAUD ,2003). Test de loxydase ( VZINA et LACROIX, 2000). Croissance 4C et 43C Des tubes essai striles contenant le bouillon nutritif (BN) sont ensemencs partir dune culture de la souche identifier sur GNO, lincubation se fait en arobiose pendant 24 h. La prsence des troubles dans les tubes indique la croissance bactrienne ( GUIRAUD ,2003). API 20 E On utilise la galerie API 20 E pour raliser les deux tests: GEL (Glatinase) ADH (arginine dshydrolase)

Le test arginine dshydrolase est ralis sur milieu semi-liquide dARGININE ou sur la cupule ADH de la galerie API 20E ( VZINA et LACROIX, 1998). 2.2.6. Etude de l'activit inhibitrice de la nisine sur Pseudomonas fluorescens Lactivit antimicrobienne du surnageant rcupr partir de culture de la souche Lactococcus lactis subsp. lactis est teste selon plusieurs mthodes de diffusion sur gel prconise par TAG et al. (1976). Elle est fonde sur l'apparition d'une zone d'inhibition, provoque par les surnageants de cultures, contenant les bactriocines, dposs dans des puits, des spots ou mme imbibs sur des disques. Les bactries indicatrices sont pralablement ensemences, en tapis, en Milieu glos appropri. 2.2.6.1. Prparation de linoculum Linoculum de la souche test ( Pseudomonas fluorescens) est prpar dans des tubes essai striles on inoculant 5 ml deau physiologique strile avec une colonie de la souche test prise de GNO . 2.2.6.2. Mthode des puits Trois boites de ptri contenant le milieu Mueller-Hilton (MHA) sont inocules par la germe cible ( Pseudomonas fluorescens). Sur chaque boite on creuse des puits en utilisant

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Matriel bibliographique et mthodes Synthse lextrmit dune pipette de Pasteur strile (diamtre de 4,5 mm). Les puits sont remplis par la suite, par 50 l de surnageant bactriocinique. Les boites de ptri ainsi prpares sont pr -incubes pendant 2 4 heures + 4 C, afin de permettre la diffu sion radiale de lagent inhibiteur. Une incubation seffectue alors 30 C pendant 18 24 heures, en arobiose. L'effet antibactrien de la nisine est mis en vidence par l'apparition d'une zone d'inhibition (zone claire) autour du puits. La lecture de lactivit bactriocinognique se fait par la mesure du diamtre dinhibition autour du puits (Zi), exprime en mm ( ALLOUACHE et al, 2010). Une inhibition est considre positive si le diamtre est suprieur 2 mm THOMPSON et al, (1996) cit par DOUMANDJI et al (2010). La mesure du diamtre dinhibition (Zi) est effectue selon la formule suivante:

Zi en (mm) = diamtre de la zone dinhibition obtenue (mm) diamtre de puits (4,5 mm)

2.2.6.3. Mthode des spots Trois boites de ptri contenant le milieu Mueller-Hilton sont inocules par les germes cibles et laisses scher sous flux dair pendant 15 min. Des gouttes de 10 l de la surnageant tester sont dposs la surface de la glose laide dune micro pipette. Les boites sont tuves pendant 18 24 h 30C. Le rsultat recherch se manifeste par la prsence de zones dinhibition claires dans une nappe trouble forme par la croissance de la souche cible (IZQUIERDO, 2009). 2.2.6.4. Mthode des disques imprgns Elle consiste selon TADESSE et al, (2004) : - Inonder en surface les boites de Ptri contenant le milieu Mueller-Hilton par linoculum de la souche cible, - Laisser scher les boites pendant 30 min 30C, aprs schage, dposer la surface de la glose des disques en papier buvard strile pralablement imprgns par le surnageant bactriocinique, ensuite scher encore une fois les boites pendant 30 min, - Mettre les boites 4C pendant 4h pour assur la diffusion de la bactriocine, enfin incuber les boites 30C pendant 24h.

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Matriel et mthodes Synthse bibliographique Linhibition de la souche indicatrice se traduit par la formation de zones claires autour des disques dont le diamtre est mesur en mm. 2.2.6.5. Mesure de lactivit antibactrienne en unit arbitraire (UA /ml) Il sagit dun titrage ralis selon le test de la dilution critique : une srie de dilution en cascade au de la surnageant tester est effectuer en eau distille strilise. Une goutte de 10l de chaque dilution est dpose sur un endroit prcis dans la boite de Ptri (4 spots pour chaque boite) contenant linoculum de la souche cible prpare comme indique prcdemment. Les boites sont incubes pour 18 24 h 30C. Lact ivit antibactrieMatrielunit arbitraire par ml (UA / ml) est dtermine selon CHAMPAGNE (2007) par le nombre d'units arbitraires dans la prparation initiale est calcul partir de la plus grande dilution (D) o il y a encore la prsence d'une zone d'inhibition de plus de 2 mm, selon l'quation suivante:

A (UA / ml) = (1000 / 10 l) x (l/D)

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique III. Rsultats et discussion 3.1. Analyses physico-chimiques et microbiologiques 3.1.1. Analyses physico-chimiques Le tableau VIII regroupe les rsultats relatifs aux caractristiques physico-chimiques du lait de chamelle analys. Le rsultat reprsente la moyenne de trois rptitions. Tableau VIII : Analyses physico-chimiques de lchantillon de lait camelin Paramtres pH (T =18 ,2C) Acidit (D) Densit valeur moyenne 6 ,546 17,5 1 ,025 Ecart type
0.002 0.500 0.001

3.1.1.1. pH Le pH de lchantillon de lait camelin ayant fait lobjet de la prsente tude est gal 6 ,546 . Le lait de chamelle ltat frais est plus acide et moins dense que les laits, bovin et humain dont les valeurs du pH sont respectivement gales 6,6 et 7,01 (SBOUI et al., 2009). Plusieurs auteurs ont rvls des valeurs de pH de lait de chamelle diffrentes de notre rsultat. Parmi ces auteurs, on peut citer, MAHBOUB et al. (2010) Ouargla et KIHAL et al. (1999) BECHAR, qui ont enregistrs des valeurs de pH suprieures soient 6,65 0,132 et 6,570,32, respectivement. En revanche, SBOUI et al. (2009) en Tunisie, SIBOUKEUR (2005) Ouargla et SAWAYA et al. (1984) en Arabie Saoudite ont trouvs des valeurs de pH infrieures, soient 6, 41 , 6,31 0,15 et 6,490,024, respectivement. Le pH ainsi que le got du lait de chamelle peuvent dpendre de la nature des fourrages et de la disponibilit de leau (GORBAN et IZZELDIN ,1997). De plus, La teneur relativement leve en vitamine C du lait de dromadaire, est lorigine du pH bas compar au lait bovin ( SALEY, 1993). Il a t montr que le pH bas du lait camelin est dpendant de la teneur en citrates, phosphates et casines, ainsi, que de ltat sanitaire de la mamelle (MATHIEU, 1998). 3.1.1.2. Acidit Le lait frachement trait est lgrement acide. Cette acidit provient essentiellement, des protines, des phosphates et du CO2 dissous. Il acquiert ensuite une acidit, dite acidit dveloppe

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique car elle est provoqu par lacide lactique et autres acides issus de la dgradation par des micro organismes (BADAOUI, 2000). Lacidit mesure au cours de cette tude est gale 17,5 D, elle est comparable celle obtenue par SBOUI et al. (2009) en Tunisie qui est gale 17,2D et par MAHBOUB et al. (2010) Ouargla qui est de lordre de 21,3 1,44 D. Les variations dans la valeur lacidit sont gnralement dues la variation de lalimentation des animaux, aux conditions environnementales ainsi qu la priode de lactation ( ABUTARBOUSH, 1996). De plus, le lait de chamelle possde un effet tampon plus lev par rapport au lait bovin ( ABUTARBOUSH, 1996). En effet, lacidit titrable de ce lait varie relativement peu par rapport llvation du pH. 3.1.1.3. Densit Le taux de matires sches du lait camelin est plus faible que celui du lait bovin (KAMOUN, 1989). Ce qui explique la faible densit enregistre dans la prsente tude et qui est de lordre de 1,025. Similaire celle obtenue par SBOUI et al. (2009), elle est infrieure celles rapportes pour le lait de vache (de 1,028 1,035) ( VIGNOLA et al., 2002). 3.1.2. Qualit bactriologique de lait camelin Lpreuve de la rductase nest pas un moyen dapprciation du nombre des bactries mais une preuve destine estimer le degr de la contamination du lait (PETRANSEXIENE , 1981). La dcoloration du bleu de mthylne par le lait de chamelle analys a eu lieu aprs une dure suprieure 4 heures. Ce lait est par consquent de bonne qualit bactriologique. Il renferme moins de 2 .106 germes /ml (LARPENT, 1970 ; GUIRAUD ,1998). La dcoloration du bleu de mthylne est due au mtabolisme bactrien et sa rapidit est directement proportionnelle au nombre de germes. En effet le lait cru contient peu de microorganismes lorsquil est prlev dans de bonnes conditions partir dun animal sain (moins de 50 000 germe /ml et moins de 1 coliforme / ml). Il sagit essentiellement de germes saprophytes du pis et des canaux

galactophores, comme les microcoques, les streptocoques lactiques, les lactobacilles et peu de germes contaminants. Dautres germes peuvent tre prsents dans le lait notamment lorsquil est issu dun animal malade (agents de mammite, etc.). Le lait peut galement tre contamin au cours

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique de la traite et des diverses manipulations, par une multitude de micro-organismes. Ainsi la nature de la flore microbienne du lait cru est la fois complexe et variable (LARPENT, 1997). Le lait de chamelle caractris par sa richesse en lysozyme et en vitamine C, est naturellement protg contre les attaques extrieures. En plus, le milieu naturel du dromadaire, caractris par de fortes insolations, des tempratures leves et de faibles humidits relatives, limite le dveloppement des microorganismes (SAIDI et al., 1999). 3.2. La fabrication du fromage camelin A partir de 2 litres de lait de chamelle cru, nous avons produit 710 grammes de fromage frais avec un rendement de 35 ,5%. Ce fromage dont laspect gnral est proche de celui du fromage au lait de vache, possde les caractristiques organoleptiques suivantes : il est de couleur jaune paill ; il est mou ; il prsente une lgre amertume.

Ces rsultats montrent que le fromage fabriqu au laboratoire, diffre de celui dcrit par RAMET (1989). Lauteur a caractris le coagulum comme tant friable et les rendements rapports sont de lordre de 8 10 % p our les fromages frais (RAMET, 1989). La friabilit augmente normment les pertes en matire sche dans le lactosrum ce qui diminue les rendements fromagers. Lauteur c onclut aprs de nombreux essais de fabrication que l'aptitude fromagre du lait de chamelle est satisfaisante sous rserve de modifier certains paramtres technologiques destins en particulier renforcer la fermet des gels. Dans le mme contexte, des exprimentations conduites en Arabie Saoudite ( RAMET, 1985) et en Tunisie (RAMET, 1987; KAMOUN et RAMET , 1988) montrent que les difficults rencontrs lors de la fabrication du fromage au lait de chamelle peuvent tre contournes en partie par des adaptations technologiques adquates. Au cours de ce travail, la substitution de la prsure habituellement utilise en fromagerie par des enzymes coagulantes extraites partir des caillettes de dromadaires (ECD), au niveau des laboratoires de luniversit KASDI MERBAH Ouargla, a permis une nette amlioration de la texture et du rendement fromager de ce produit driv. En effet, les travaux raliss en Egypte par EL-ABASSY (1987) et EL-BATAWY et al. (1987) avaient prconis lutilisation de la pepsine de dromadaire pour produire une prparation coagulante dans des conditions acceptables d'activit

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique et de stabilit. Plus rcemment, lefficacit des protases gastriques issues de caillettes de dromadaires adultes donc dominance pepsine a t prouve par SIBOUKEUR et al. (2005), et par BOUDJENAH et al. (2011). 3.3. Identification de la souche productrice de nisine isole partir du fromage camelin Les souches isoles produisent sur milieu M17, des colonies de forme irrgulire, de couleur blanche crme, avec une surface lisse et muqueuse et un pourtour irrgulier (photo 1). L'examen microscopique rvle que les souches testes sont GRAM positif, de forme coccoide, rparties en paires ou en chanettes. Les rsultats des examens microscopiques et macroscopiques de la souche isole sont illustrs sur le tableau (IX) : Tableau IX : Examens microscopique et macroscopique de la souche isole forme des colonies Examen macroscopique couleur des colonies aspect des colonies dtermination du GRAM forme unitaire Examen microscopique Mode de rassemblement ronde et irrgulire blanchtre jauntre (beige) Muqueux GRAM + coques de petite taille en paires ou en chainettes

SOUID 2011 Photo 1 : Culture bactrienne sur milieu M17 Lidentification de la souche isole est ralise par des tests biochimiques et physiologiques classiques (tableau X) et laide de quelques tests de la galerie API 20 E (photo 2).

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique

La souche isole est dnue de catalase et doxydase. Elle est immobile. Elle fermente le glucose en donnant seulement de lacide lactique (homofermentaire). Elle nhydrolyse ni larginine ni le citrate. Elle crot pH 9 ,6 et rsiste 45 C (tableau X). Les rsultats des tests physiologiques et biochimiques ont permis didentifier la souche isole comme tant une souche appartenant lespce Lactococcus lactis ssp. lactis (GUIRAUD , 2003). La mme souche a t identifie par SADI (1998) et KACEM (2003) partir de laits crus de vaches produites dans la rgion de lOuest Algrien et par ZADI- KARAM (1998) dans le lait de chamelle. Une souche de Lactococcus lactis ssp. lactis productrice de nisine a t galement isole partir dun fromage base de lait bovin (MEGHROUS, 1998 ). Cependant, cette souche capable de crotre pH de 9 ,6 est diffrente de celle isole par MUNDT (1986), SCHLEIFER (1987) et HASSANE et al. (2007), qui na pas montr cette capacit. Cela peut sans doute sexpliquer par une slection due lenvironnement naturel de la bactrie, cest --dire le lait de chamelle. En effet, le rgime alimentaire influe sur la composition chimique et microbiologique du lait camelin ( MOSLAH, 2002). Lespce Lactococcus lactis joue un rle important dans la conservation de nombreux aliments et dans la fabrication des fromages et des produits ferments. En effet, les lactocoques sont gnralement associs une forte capacit dacidification du lait. Elles prsentent au ssi des proprits inhibitrices envers la flore daltration et envers la flore pathogne du fromage, grce la production de mtabolites tels que les acides organiques, le proxyde dhydrogne et les bactriocines ou sa comptition cologique vis--vis des nutriments (OSULLIVAN et al., 2002 ; DORTU et al., 2009).

SOUID 2011

Photo 2: Identification de la souche isole par la galerie biochimique API 20 E.

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique

Tableau X : Identification par les tests biochimiques et physiologiques Test catalase oxydase croissance 45C croissance 6 ,5 % de Na Cl croissance pH 9 ,6 type de mtabolisme mannitol de mobilit T.S.I K.I.A ONPG ADH LDC ODC CIT H2S Ure TDA IND VP GEL GLU MAN IND SOR RHA SAC MEL AMY ARA Rsultats + + fermentaire (homofermentaire) mannitol (+), mobilit (-) lactose (+), glucose (+), aro-anarobie, saccharose (+/-) fermentation de glucose (+), lactose (+) + NR NR NR + + + + + +

API 20 E (aprs 48 h dincubation)

NR : test non ralis 3.4. Identification de la souche indicatrice isole partir du lait camelin rfrigr Les colonies apparues sur GNO aprs 48 heures dincubation prsentent une coloration blanche et un aspect muqueux. Leur diamtre se situe entre 1 et 2 mm (photo 3). Les rsultats relatifs lexamen microscopique ltat frais (mobilit) et aprs coloration de GRAM sont indiqus dans le tableau XI.

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique

Tableau XI : Examens prliminaires de la souche indicatrice isole forme des colonies couleur des colonies aspect des colonies dtermination du GRAM forme unitaire Examen microscopique disposition des bactries Examen ltat frais (100) Ronde, rgulire Blanche Muqueux GRAM Btonnet long Isoles Bactries trs mobiles

Examen macroscopique

SOUID 2011 Photo 3: Culture bactrienne sur milieu GNO Les rsultats des tests biochimiques et physiologiques de lidentification sont reports dans le tableau XII. La souche isole partir du lchantillon du lait rfrigr pousse bien sur glose nutritive ordinaire (annexe 1). Ce milieu non slectif permet la culture des bactries peu exigeantes (GUILLAUME, 2004 ; GUIRAUD, 2003). La culture apparait sous forme de colonies rondes de petite taille, de couleur blanche et dun aspect muqueux. Les bactries sont GRAM (-). Elles sont trs nombreuses et doues dune mobilit flagellaire visible sous microscope optique grossissement (100). La souche isole est catalase positive, oxydase positive, ne ragit pas avec le rouge de mthyle (raction RM ngatif). Elle dgrade le glucose, lamygdaloside, larabinose et le mlibiose, en arobiose sur la galerie biochimique API 20 E (photo 4). Elle hydrolyse galement

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique

larginine et la glatine sur la mme galerie. La croissance sur bouillon nutritif

(BN) est

enregistre temprature de 4C et pas 41C. La production de pyoverdine (pigment) est visualise sur milieu King B (couleur verte fluorescente) (photo 6). Les caractres morphologiques et les diffrents tests biochimiques et physiologiques permettent didentifier la souche isole comme tant une souche appartenant lespce

Pseudomonas fluorescens (GUIRAUD, 2003 ). Ce rsultat est confirm par la production de la pyoverdine sur milieu King B (KING et al. ,1954) (photo 6). La production de pyoverdine, est favorise par une teneur leve en phosphate de milieu King B ( GUILLAUME, 2004). Parmi les bactries GRAM ngatives qui constituent la flore psychrotrophe dominante du lait cru rfrigr, le genre Pseudomonas occupe la premire place (LECLERC, 1961 ; BUSSE, 1965 ; BOCKELMAN, 1969 ). Dans ce genre, le groupe des fluorescents prdomine. Lespce Ps. fluorescens est la principale espce psychrotrophe casolytique du lait cru et 95 % des souches de cette espce, tudies par SAMAGH et CUNNINGHAM (1972) liqufient la glatine et produisent une protolyse sur le lait crm, aux basses tempratures. Les espces appartenant au genre Pseudomonas sont dotes dune grande activit mtabolique (Protolyse, lipolyse et la dgradation des substances carbones) ( THIERRY, 1997). THOMAS et THOMAS, en 1973, montraient que 51 97 % des souches psychrotrophes isoles de laits crus sont fortement protolytiques et SCHULTZE et OLSEN(1970) rapportent que 90 % des cultures de bactries psychrotrophes isoles de laits ou de produits laitiers sont soit protolytiques, soit lipolytiques et que 66 % possdent ces deux activits. En plus des diffrentes sources de contamination, telles que le sol, .l'eau et la nourriture, la prdominance de genre Pseudomonas dans le lait est lie l'tat sanitaire de lanimal et de l'quipement laitier (MILLIERE et VEILLET -PONCET, 1972).

Photo 4 : Identification de la souche indicatrice par la galerie biochimique API 20 E.

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique Tableau XII : Identification de la souche indicatrice par les tests biochimiques et physiologiques Test Rsultats catalase + oxydase + RM Croissance 4C + Croissance 41C Production de pigmentation sur King A Production de pigmentation sur King B + (pyoverdine) ONPG ADH + LDC ODC CIT + H 2S API 20 E (aprs 24 h Ure dincubation) TDA NR IND NR VP NR GEL + GLU + MAN IND SOR RHA SAC MEL + AMY + ARA +

SOUID 2011 Photo 5 : culture bactrienne sur King A

SOUID 2011 Photo 6: culture bactrienne sur King B

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique

3.5. Production de la nisine et tude de lactivit antibactrienne de la nisine sur la souche Pseudomonas fluorescens La souche purifie Lactococcus lactis ssp.lactis partir du fromage frais de lait camelin est teste pour la production dune substance antibactrienne autre que les acides organiques : la nisine. Le surnageant de la culture bactrienne productrice de nisine est utilis afin dtudier son effet antagoniste vis--vis de la souche de Pseudomonas fluorescens, isole partir de lait camelin rfrigr. Cette technique est prconise par TAGG et MCGIVEN (1971). Dans le but de tester in vitro, leffet inhibiteur du surnageant de culture de la souch e nisinogne Lactococcus lactis ssp.lactis vis--vis la souche Pseudomonas fluorescens isoles respectivement, partir du fromage camelin et du lait camelin rfrigr, trois mthodes de diffusion sur gel sont utilises. Aprs avoir limin linfluence de lacide lactique par neutralisation du surnageant, lactivit antimicrobienne due laction de la nisine a rvl une action inhibitrice vis --vis du germe cible: Pseudomonas fluorescens. Ce rsultat est mis en vidence par les trois techniques de diffusion sur gel en boites de ptri : la technique des spots, la technique des disques imprgns de surnageant et la technique des puits. Les rsultats obtenus sont illustrs par les photos 7, 8 et 9. Leffet antimicrobien du surnageant de cu lture neutralis (SCN), bactricide issu de Lactococcus lactis a t dmontr par plusieurs auteurs. Dans le mme contexte, DIOP et al. (2009) ont montr un effet positif dun SCN, issu dune souche de Lactococcus lactis ssp .lactis pour la conservation des poissons au Sngal. La souche cible Pseudomonas fluorescens, produit un tapis bactrien de couleur vert fluorescent du la production de pyoverdine sur milieu

Mueller-Hinton (MHA), La glose Mueller-Hinton est un milieu destin la ralisation dantibiogrammes par diffusion. Sa composition permet la croissance des bactries non exigeantes (GUILLAUME, 2004). Ainsi, lactivit antibactrienne du SCN de la souche Lactococcus lactis ssp.lactis vis--vis Ps. fluorescens a t mise en vidence par les trois mthodes utilises. Linhibition se traduit par la formation de zones claires (Zi) de diamtres diffrents selon la technique utilise. La mesure de diamtres moyens des zones dinhibition (Zi) est prse nte sur le tableau XIII pour les deux techniques (techniques des disques et des puits) :

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique

SOUID 2011 Photo 7 : Activit antibactrienne du SCN vis--vis Ps. fluorescens par la mthode des spots.

SOUID 2011 Photo 8: Activit antibactrienne du SCN vis--vis Ps. fluorescens par la mthode des disques.

SOUID 2011 Photo 9 : Activit antibactrienne du SCN vis--vis Ps. Fluorescens par la mthode des puits. Tableau XIII : Mesure de diamtres moyens des zones dinhibition (Zi) pour la technique des puits et des disques Technique Mthode puits (*) Mthode disques Diamtres moyens des zones dinhibition (Zi) en (mm) des 8,75 (pour 4 puits positifs) des 20,05 (pour 10 puits positifs) Ecart-type 0,030 0,022

(*) : Diamtre des puits est gale 6 mm.

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique Les 3 mthodes donnent des rsultats positifs avec apparition des zones dinhibition bien distinctes (halos clairs) autour, des spots, des puits et des disques. Les (Zi) ont des diamtres variables. Ces derniers se situent entre 9 et 18 mm avec une moyenne de 8,75 mm (> 2 mm), obtenue par la technique des puits partir de 4 puits considrs comme positifs. Ce rsultat est considr comme positif selon THOMPSON et al. (1996). Par la mthode des disques imprgns de SCN, les diamtres des (Zi) varient de 12 29 mm avec un diamtre moyen gal 20,05 mm (au niveau de 10 disques). La prsente tude a montr que la mthode des spots tait moins adapte. Nous pensons quune mauvaise rpartition du SCN ou une diffusion de bactriocine insuffisante en sont responsables. La mthode de la dilution critique du SCN a permis de calculer lactivit antibactrienne en unit arbitraire (UA) selon lquation de CHAMPAGNE (2007) : A (UA / ml) = (1000 / 10 l) x (l/D). Sachant que la dilution maximale permettant de donner encore une zone dinhibition dun diamtre suprieur 2 mm par la mthode des spots, est la dilution 1/32 : A (UA/ml) = 1000/10 x 1/ 1/32
A= 3200 UA / ml

Lactivit antibactrienne estime par

la mthode de la dilution critique

de MAYR -

HARTING et al. (1972), est donc gale 3200 UA/ml. Mais cette mesure peut tre plus ou moins accepte. MEGHROUS et al. (1999) ont publi que lestimation de l'activit d'une bactriocine par la mthode de diffusion dans l'agar est une mesure relative, car la sensibilit de la bactrie cible, le milieu de croissance utilis, la concentration d'agar du milieu test, ainsi que la concentration en bactriocine sont tous des facteurs pouvant affecter les rsultats. Lantagonisme de la souche Lactococcus lactis ssp.lactis contre des souches pathognes GRAM ngatif a t dcrites dans la littrature ( CHOI et al., 2000 ; TOPISIROVIC et al., 2006 ; KUMARI et GARG, 2007 ; EL -SHAFIE et al., 2008). Les souches indicatrices tudies par ces auteurs examines appartiennent aux deux espces : Escherichia coli et Salmonella sp. En rgle gnrale, les bactriocines des bactries lactiques ne sont pas actives contre les bactries GRAM ngatif. Ceci est du la diffrence dans la composition de l'enveloppe

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique cellulaire des bactries GRAM positives et GRAM ngatives. Toutefois, certaines tudes ont suggr qu'un changement des proprits de permabilit de la membrane externe suite certains traitements utiliss en combinaison avec des bactriocines ou encore des conditions de stress rendraient les bactries GRAM ngatives sensibles aux bactriocines ( ABEE et al., 1995; CINTAS et al., 2001; DEEGAN et al., 2006). SEBTI et al. (2002) et CARNEIRO et al. (1998) ont montr que pour amliorer lactivit antibactrienne contre les bactries GRAM - insensibles aux bactriocines de bactries lactiques, les bactriocines ont t associes dautres composs pour amliorer les dures de conservation des aliments. Par exemple, leffet, dans un premier temps du lysozyme, suivi de laction de la nisine, montre que les bactries GRAM - sont lyses par la nisine. En effet, le nombre de Campylobacter jejuni , Pseudomonas fluorescens ou encore Salmonella enterica est diminu de lordre de 6 log sous laction de la nisine ds que le lysozyme une concentration de 10 g.ml -1 est utilise. Ces donnes bibliographiques sont importantes, si lon prend en considration lune des principales caractristiques du lait camelin qui est sa richesse en lysozyme par rapport au lait de rfrence (trois fois plus). Ceci pourrait expliquer limportante activit antibactrienne de la souche Lactococcus lactis ssp.lactis vis--vis Ps. Fluorescens, mise en vidence lors de la prsente tude. Par ailleurs, la nisine et lacide lactique agissent synergiquement sur Ps . fluorescens et Staph. Hominis isoles partir des poissons (NYKANEN et al., 1998 ; STEVENS et al., 1991). Ces auteurs rapportent que la nisine inhibe la croissance des bactries GRAM quand elles sont traites simultanment avec lagent chlateur EDTA. A notre connaissance, aucune tude sur leffet de la nisine utilise seule sur les Pseudomonas na t signale dans la littrature. Cependant, le spectre d'a ctivit des quelques bactriocines (comme la nisine) selon KLAENHAMMER en 1993, peut ne pas tre restreint aux espces proches taxonomiquement ou mme occupant la mme niche cologique que la bactrie productrice. D'un point de vue pratique, le champ d'activit d'une bactriocine peut tre plus ou moins large suivant les conditions du milieu et la concentration en substance active. Les rsultats de cette tude sont encourageants dans la mesure o ils rvlent la possibilit dutiliser les ferments lactiques dorigine cameline, producteurs de nisine pour la prservation du lait camelin rfrigr contre les bactries psychrotrophes, responsables de dfauts fromagers. En effet, la nisine est un mtabolite primaire et sa biosynthse est fonction de la croissance bactrienne ( PIARD et DESMAZEAUD, 1992 ; RAY, 1992).

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique Dans la pratique les applications de la nisine en industrie agroalimentaire sont limites. En France, titre dexemple, la nisine nest autorise que dans le cas des fromages fondus (CORRIEU et al., 2008). La NisaplineTM est le seul exemple d'ingrdient concentr non purifi qui est actuellement utilis en tant qu'additif alimentaire. La Nisapline TM provient de la

fermentation du lait crm avec la souche productrice de nisine, Lactococcus lactis et elle est utilise de manire efficace dans plusieurs applications alimentaires. Cependant, elle apparat inefficace dans certaines applications ( BENECH et al., 2002). Lutilisation des ferments producteurs de nisine a galement t tudie par TOPISIROVIC et al. (2006) et MORISSET et al. (2005) dans le domaine des produits carns. Leur utilisation dans les produits laitiers se limite la fromagerie. La proprit de produire la nisine a dabord t envisage pour linhibition de Clostridium botulinum et Clostridium tyrobuturicum dans les fromages ( LIPINSKA, 1957 ; TAYLORS, 1977). Plusieurs raisons peuvent permettre lutilisation de la nisine comme additif alimentaire selon CORRIEU et al. (2008). Tout dabord, cette bactriocine est produite par un organisme

normalement utilis dans les fermentations alimentaires. Elle ne prsente pas de toxicit. De plus, la nisine rsiduelle dans les aliments est digre, elle est en effet sensible l -chymotrypsine. Dautre part, les tudes restent rares sur les possibilits dacquisition de la rsistance la nisine par certains microorganismes, selon CARLSON et BAUER (1957), aucune acquisition de rsistance la nisine na peut tre mise en videnc e chez les microorganismes dans les aliments contenant un fort taux de nisine. La rsistance la nisine a t mise en vidence chez certaines types de bactries telles que Streptococcus thermophilus et Staphylococcus aureus et Bacillus spp. Cette rsistance est lie la production d'une enzyme, la nisinase qui est une didhydroalanine rductase et qui dsactive la nisine et la subtiline ( HARRIS et al., 1991). La rsistance la nisine a t aussi lie la rigidit des membranes bactriennes et leur faible taux de lipides chargs ngativement (CRANDELL et MONTVILLE , 1998). Les inconvnients lis l'emploi des bactriocines tient leur spectre d'action rduit aux bactries Gram positif et en particulier la flore lactique. Ce spectre dpend du pH, de la temprature, de la composition et la structure de l'aliment. De plus, vue la nature protique de la nisine, son activit peut tre galement rduite par des enzymes protolytiques ou par oxydation, lors dinteraction avec des mtaux lourds, lors dagitation excessive et aprs une dconglation (DAESCHEL et al., 1991).

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Rsultats et discussion Synthse bibliographique La connaissance de l'organisation gntique, de la rgulation et des relations structure-fonction des bactriocines pourra permettre de pallier ces problmes par la mise en place de procds antibactriens plus efficaces. Finalement, la connaissance du mode d'action des bactriocines est essentielle afin d'optimiser l'effet antagoniste de ces dernires et de limiter l'apparition de souches rsistantes (RICHARD , 1996).

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CONCLUSION

Le lait de chamelle constitue la principale source alimentaire

pour les leveurs de

dromadaires au Sahara. Il ne semble pas diffrent de celui des autres animaux domestiques et constitue un trs bon apport en nutriments de base (protines, lipides, glucides et vitamines), et en minraux pour le chamelon et le consommateur . Le lait de chamelle a plusieurs vertus thrapeutiques. Il est gnralement consomm ltat cru, ferment, pasteuris ou strilis. Il peut tre aussi transform en fromage malgr des difficults inhrentes sa coagulation. La pratique courante de stocker le lait basse temprature est l'origine du dveloppement des germes psychrotrophes. Germes dous des activits protolytiques et lipolytiques responsables par la suite de lamertume des produits laitiers et plus particulirement du fromage. Dautre part, la production de substances antibactriennes telles que les bactriocines par les bactries lactiques du lait reprsente une voie intressante pour la lutte contre les micro organismes pathognes et/ou indsirables. Nous avons tent travers cette tude de contribuer dune part amliorer la conservabilit du lait de chamelle gnralement consomm ltat frais et dautre part maitriser la technique de sa transformation en un fromage, conforme aux exigences du consommateur, par la diminution de sa flore psychrotrophe, responsable des dfauts damertume et de mauvais gots. Cette flore est essentiellement reprsente par lespce Pseudomonas fluorescens. Linhibition de croissance de Pseudomonas fluorescens, isole partir dun lait de chamelle entrepos 4C durant plus de 3 jours, est mise en vidence in vitro par leffet dune bactriocine (nisine) issue dune culture de la souche lactique productrice Lactococcus lactis ssp.lactis. Dans le prsent travail, la souche nisinogne est isole partir du fromage frais base de lait chamelle prpar au niveau du laboratoire. Malgr les difficults de coagulation du lait de chamelle, voques par de nombreux auteurs, le fromage que nous avons obtenu se caractrise par un rendement non ngligeable (35 ,5%) et par des caractristiques organoleptiques et rhologiques acceptables. Nous avons utiliss la place de la prsure commerciale, des extraits coagulants gastriques de dromadaires gs (ECD), conformment des travaux entrepris luniversit de Ouargla, raison de 10 ml / 500 ml de lait. Lidentification, des souches isoles, a t ralise sur la base de caractrisations morphologiques et de tests biochimiques et physiologiques. Ltude de leffet antagoniste de

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surnageant de la culture de Lactococcus lactis ssp.lactis vis--vis de Pseudomonas fluorescens a montr une inhibition de la croissance de la souche cible par leffet bactricide de la nisine. Pour la recherche de linhibition bactrienne, nous avons a dopt la technique de TAG et al. (1971). Trois mthodes de diffusion sur gel sont utilises et les rsultats obtenus sont trs probants. La mesure de diamtres des zones dinhibition sur la culture de la souche cible a rvle une variation des rsultats pour chaque mthode. Les diamtres des zones dinhibition varient de 9 18 mm pour la technique des puits et de 12 29 mm pour la mthode des disques. La technique des spots a donn des zones dinhibition peu apparentes. On peut constater alors que la nettet des zones dinhibition dpend de la mthode utilise. La mthode intressante. Enfin, l'isolement des bactries lactiques particulirement partir du fromage ou du lait de chamelle et la mise en vidence de leur pouvoir antagoniste par la production des bactriocines, contre la flore GRAM ngatif, constitue un sujet intressant approfondir dans la mesure o peu dinformations sont disponibles dans la littrature sur ces microorganismes. des disques semble la plus

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Annexe 01
Composition des milieux des cultures et des diffrents bouillons utiliss :

milieux de culture

Composition (g/l) Peptone de soja Peptone de viande Peptone de casine Extrait de viande Extrait de levure Lactose Acide ascorbique Glycrophosphate de sodium Sulfate de magnsium
pH =7,1

aspect de milieux avant lensemencement 5 2,5 2,5 5 2,5 5 0,5 19 0,25

aspect de milieux aprs lensemencement

bouillon M 17

(milieu Ml7 glose: il s'agit du milieu prcdant +


15 g/l dagar.)

GNO (glose nutritive ordinaire)

Peptone Extrait De Viande Chlorure De Sodium Agar


pH = 7,2

10 4 5 13

Extrait de viande Hydrolysat acide de casine Amidon Glose MuellerHinton pH = 7,4

2 17,5 1,5 10

King A Peptone Glycrol Sulfate de potassium Chlorure de magnsium Glose King B Protose-peptone Glycrol Phosphate di potassique Sulfate de magnsium Glose pH = 7,2 Peptone Extrait de viande Extrait de levure Chlorure de sodium Glucose Lactose Saccharose Citrate de fer Hyposulfite de sodium Rouge de phnol Glose pH = 7,4 Peptone Extrait de viande Extrait de levure Lactose Glucose Sulfate ferreux Chlorure de sodium Hyposulfite de sodium Rouge de phnol Glose pH = 7,4 20 3 3 10 1 0,3 5 0,3 25mg 15 20 3 3 5 1 10 10 0,5 0,5 25 mg 12 20 10 ml 10 1,4 15

milieu King A + milieu King B

20 10 ml 1,5 1,5 15

King A

King B

milieu T.S.I

milieu K.I.A

bouillon de Clark et Lubs

Peptone Phosphate Dipotassique Glucose

10 2 5

pH = 7

Peptone Extrait de viande Chlorure de sodium Bouillon Nutritif (BN) pH = 7,2 Peptone Nitrate de Potassium Mannitol Rouge de Phnol Glose pH = 8,1

10 5 5

milieu Mannitol de mobilit

20 1 2 40 mg 4

galerie API 20 E

Galerie constitue de 20 microtubes contenant milieux et substrats sous forme dshydrate permettant de raliser 23 tests biochimiques

Annexe 02
Etapes de fabrication du fromage camelin frais au laboratoire (1) (2) (3)

(6)

(5)

(4)

(1) Echantillons du lait, (2) Dispositif dexsudation, (3) (4) Egouttage du caill, (5) Caill goutt (aprs 24 heures dgouttage) , (6) Fromage moul.

Annexe 03

Coloration de Gram : Dposer une goutte deau physiologique strile sur une lame bien propre ; Prlever un chantillon de colonie et mlanger avec la goutte d eau, strier et scher par passage rapide sur la flamme dun bec benzne ; Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes ; Laver l excs du colorant avec de l eau distille ; Couvrir de lugol pendant 30 secondes ; Laver l eau distille pendant 5 secondes ; Rincer immdiatement le frottis avec le mlange alcool - actone en inclinant la lame et par goutte goutte jusqu disparition complte de la coloration violette; Laver leau distille pendant 5 secondes ; Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes Laver leau distille pendant 10 secondes Dposer une goutte d huile immersion sur le frottis et observer au microscope un fort grossissement. Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement rostres.