MANUAL DE LABORATORIO DE HEMATOLOGA

1. PREPARACIN DE ANTICOAGULANTES
Fundamento Debido a que en hematologa se requiere estudiar a la sangre con sus elementos formes, as como hacer recuentos en sus clulas y revisiones morfolgicas, es indispensable obtener la sangre con un anticoagulante que sea capaz no slo de mantener la sangre sin coagularse, sino que preserve, de la mejor manera posible, la morfologa celular. Para esto, existen diversos anticoagulantes que actan de diferentes modos: la heparina es un inactivador de la trombina y de la trombo-plastina; los citratos, oxalatos y EDTA remueven el calcio, ya sea precipitndola como sal (oxalatos) o fijndolo en forma no ionizada (citratos y EDTA). La desfibrinacin es un mtodo alterno para obtener sangre lquida mediante la remocin de la fibrina formada al coagularse la sangre. Sin embargo, de esta manera no se evita la coagulacin y, por lo tanto, la sangre pierde diversos factores de coagulacin, pudiendo sufrir alteraciones morfolgicas y volumtricas. Por ello, su uso se restringe a algunos estudios especiales. No debemos olvidar que una cantidad insuficiente de anticoagulante puede provocar una coagulacin parcial y que el exceso del mismo diluye la muestra, con los consecuentes errores de medicin. Por otro lado, el anticoagulante inadecuado puede ocasionar distorsin de las clulas. Por lo anterior, resulta obvia la importancia que tiene la eleccin y dosificacin correcta del anticoagulante. Cuando requerimos estudiar los factores de la coagulacin, es conveniente utilizar, adicionalmente, material siliconizado, con la finalidad de retrasar la activacin del factor XII y la adherencia de las plaquetas a las paredes del tubo Objetivos Al terminar la prctica, el alumno ser capaz de: 1. Preparar correctamente los principales anticoagulantes de importancia en hematologa. 2. Seleccionar el anticoagulante ms adecuado para cada determinacin. Equipo Balanza analtica Material a) Biolgico Ninguno b) De laboratorio Oxalato de amonio (reactivo nm. 1) Oxalato de potasio (reactivo nm. 2) Citrato disdico (reactivo nm. 3) Dextrosa (reactivo nm. 4) cido etilen diamino tetraactico (EDTA) (reactivo nm. 5) Heparina (reactivo nm. 6) Agua destilada Tubos de ensayo de 13 x 100 mm, con tapn Matraces aforados de 100 ml Tubos de centrfuga graduados de 5 mi Pipetas serolgicas de 5 ml Procedimiento Oxalatos Se utiliza la mezcla de oxalatos de amonio y potasio en proporcin de 3: 2, la que es conocida como mezcla de Wintrobe o de Heller y Paul. La sal de amonio tiende a aumentar el volumen eritrocitario en tanto que la de potasio lo disminuye. Con las proporciones mencionadas, se logra mantener el volumen sin alteraciones. Preparacin: Oxalato de amonio Oxalato de potasio Agua destilada ........

1.2 g 0.8 g 100.0 ml

En tubos con tapn, se coloca 0.1 ml de anticoagulante por cada mi de sangre que se vaya a depositar, es decir, que si necesitamos 5 ml de sangre, deberemos colocar 0.5 mi de la mezcla de oxalatos. Con la finalidad de evitar la dilucin, los tubos destapados se ponen en una incubadora hasta que se evapore el agua y quede nicamente el polvo seco. Ventajas 1. Bajo costo. 2. No modifica el volumen eritrocitario. 3. El plasma obtenido se puede utilizar para otros exmenes (como bioqumicos por ejemplo), exceptuando aquellos en los que el nitrgeno contenido en el oxalato de amonio pudiera ocasionar una interferencia, como en las determinaciones de urea. Desventajas 1. Puede producir hemolisis. 2. No pueden hacerse extendidos sanguneos despus de algunos minutos, ya que se producen alteraciones leucocitarias como: vacuolas en los neutrfilos, degeneracin nuclear en los leucocitos, fagocitosis de cristales de oxalato. Citratos a) Citrato de sodio Se utiliza el citrato disdico en solucin a 3.8 %, que es isotnica. Preparacin: Citrato disdico ................................................ 3.8 g Agua destilada .............................................. 100 ml En tubos, de preferencia graduados, se colocan 0.5 ml de la solucin de citrato de sodio, para aforar a 5 ml con la sangre. Su uso se ha restringido al estudio de la coagulacin. Ventajas 1. Es excelente para realizar pruebas de coagulacin. 2. Bajo costo. Desventajas 1. No es muy til para estudios morfolgicos pues altera la morfologa eritrocitaria y leucocitaria. 2. Debido a que ocasiona dilucin importante (1 a 10) no es til para realizar otras determinaciones cuantitativas. 3. ACD (cido ctrico-dextrosa) Tiene su principal aplicacin en bancos de sangre pues preserva la sangre hasta por tres semanas y se puede transfundir sin toxicidad. En el laboratorio de hematologa, se utiliza para preservar los antge-nos de los eritrocitos cuando se requieren estudiar.

Preparacin: Citrato disdico (monocido) ........................ 2.0 g Dextrosa ............................................................ 3.0 g Agua destilada (libre de pirgenos) ............ 20 ml Se usa en proporcin de 4 ml de sangre por uno de anticoagulante. La sangre as obtenida se conserva en refrigeracin a 4o C. Ventajas 1. Conserva las clulas viables durante tres semanas. 2. No es txico, por lo que se puede transfundir. Desventajas 1. No es til para la mayora de los estudios hematolgicos cuantitativos porque ocasiona gran dilucin. EDTA El cido etilen diamino tetraactico se puede utilizar como sal disdica o tripotsica. Tiene una actividad anticoagulante muy intensa ya que impide que se ionice el calcio por quelacin del mismo; adems, conserva la morfologa celular durante muchas horas, por lo que es el anticoagulante de mayor uso en hematologa. La sal tripotsica es ms soluble, razn por la que se usa preferentemente. En los contadores automticos, que cuentan plaquetas, tambin funciona mejor ya que no deja pequeas partculas que puedan ser contadas como plaquetas. Preparacin:
EDTA (disdico

o triptasico) ......................... 2.0 g Agua destilada............................................. 100 ml Se disuelve el EDTA en el agua, de preferencia a 37 C, y posteriormente se filtra; se deposita en tubos a razn de 0.1 mi de anticoagulante para 5 ml de sangre. Se puede evaporar a sequedad con lo que se evita totalmente la dilucin de la muestra. Ventajas 1. Es muy barato. 2. Fcil de preparar. 3. Tiene gran poder anticoagulante por lo que se requieren bajas concentraciones. 4. Conserva excelentemente la morfologa celular, hasta 24 horas despus de obtenida la muestra. 5. Evita la aglutinacin plaquetaria. 6. Se considera el mejor anticoagulante para la hematologa habitual. Desventajas Ninguna

Heparina Es un anticoagulante natural de gran potencia; se considera el mejor para prevenir la hemolisis y las alteraciones morfolgicas. Sin embargo, su uso se ha limitado debido a que su costo es significativamente mayor que los anticoagulantes artificiales. La heparina se puede obtener en sales de sodio, calcio o amonio. Preparacin: Heparina ............................................ 1 000 Ul/ml Colocar en un tubo una gota de la solucin de heparina y evaporar a sequedad. Esta cantidad es suficiente para anticoagular 7 mi de sangre. Un mtodo alterno consiste en aspirar la heparina con la jeringa y regresarla nuevamente al recipiente; la cantidad que queda impregnada en las paredes de la aguja es suficiente para 10 mi de sangre. Ventajas 1. Tiene una gran actividad anticoagulante natural. 2. No ocasiona alteraciones morfolgicas. 3. El plasma obtenido puede ser utilizado para otras pruebas bioqumicas. 4. Es ideal para gasometras. Desventajas 1. Su costo es ms elevado que el de los dems anticoagulantes. Comentarios Es importante mencionar que, aun con el mejor anticoagulante, se pueden tener errores que ocasionen defectos analticos. Para minimizarlos, conviene tener en cuenta lo siguiente: 1. Al obtener una muestra de sangre, hay que depositarla de inmediato en el tubo con anticoagulante y mezclarla perfectamente por inversin del tubo o mediante un mezclador mecnico rotatorio, nunca por agitacin, que podra hemolizarla. 2. Los extendidos sanguneos debern realizarse lo ms pronto posible para evitar que la accin del anticoagulante provoque alteraciones morfolgicas. 3. Si en un lapso de 24 horas no se realizaran las determinaciones analticas, es conveniente refrigerar la muestra a 4-8 C. 4. Si se van a efectuar exmenes en plasma, es conveniente separarla por centrifugacin lo ms pronto posible. Actualmente, para la obtencin de muestras, se utiliza un sistema de tubos al vaco que ya tienen el anticoagulante y que se identifican por el color del tapn:

TAPON Lavanda Azul claro negro Amarillo claro Verde rojo

ANTICOAGULANTE EDTA Citrato de sodio oxalatos ACD heparina Sin anticoagulante