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Validacin y comparacin de modelos de crecimiento microbiano

Cayr, Mara E.1 - Vignolo, Graciela2 - Garro, Oscar A.1 1.Facultad de Agroindustrias - UNNE. Cdte. Fernndez 755 - (H3700LGO) Pcia. R. Senz Pea - Chaco - Argentina. Telfono/Fax: +54 (3732) 420137 E-mail: ecayre@fai.unne.edu.ar 2.CERELA - CONICET.

ANTECEDENTES

La elaboracin y conservacin de los alimentos con adecuada calidad es un requerimiento imprescindible para satisfacer las demandas de los consumidores. Una de las principales causas de disminucin de la calidad y seguridad biolgica de los alimentos es el desarrollo de microorganismos alteradores y causante de enfermedades. El modelado matemtico es una herramienta de gran utilidad en tecnologa de alimentos, ya que permite analizar en forma cuantitativa el comportamiento microbiano en un determinado ambiente o sistema particular, es decir, permite realizar estimaciones cuantitativas, considerando la accin simultnea de diversos factores limitantes extrnsecos e intrnsecos; lo cual implica una gran ventaja, en tiempo y costo, comparado a los mtodos utilizados tradicionalmente en microbiologa de alimentos. El modelado matemtico es realizado, generalmente, asumiendo condiciones constantes para determinar los valores de los parmetros cinticos de crecimiento. Sin embargo, condiciones tales como temperatura, pH o composicin de la atmsfera gaseosa no se mantienen constantes durante el almacenamiento refrigerado de los alimentos (Labuza and Taoukis, 1992). Debido a este hecho, en la actualidad el modelado matemtico est orientado a la obtencin de modelos dinmicos, es decir, modelos que permitan predecir la seguridad o vida til de los alimentos bajo condiciones fluctuantes. Uno de los factores que ms flucta es la temperatura de almacenamiento y es el ms investigado ( Roos and McMeekin, 1994). Una de las tcnicas utilizadas para la obtencin de modelos dinmicos es la combinacin de modelos primarios, tales como el Logstico y la ecuacin de Gompertz, con modelos secundarios. As, Blankenship et al. (1988) desarrollaron un modelo para predecir el crecimiento de Clostridium perfringens a partir de esporas durante el proceso de enfriamiento despus de la coccin de un alimento. Ellos combinaron una funcin logstica para el tiempo de latencia con una funcin exponencial para el crecimiento. Los valores de velocidad de crecimiento fueron puestos en funcin de la temperatura mediante el modelo de raz cuadrada. El nmero de esporas germinadas y el crecimiento fueron calculados cada hora usando las respectivas temperaturas de enfriamiento. Dickson et al., 1992, estimaron el crecimiento de Salmonella durante el congelamiento de tejidos vacunos por interpolacin del tiempo de latencia y el tiempo de generacin que fueron calculados a partir de determinaciones isotrmicas de los parmetros de la ecuacin de Gompertz y una funcin exponencial para la temperatura. El xito de esta tcnica depende, en parte, de la correcta eleccin de los modelos involucrados. En este trabajo se compararon y validaron modelos primarios de crecimiento microbiano con el objeto de seleccionar el ms adecuado para la construccin de un modelo dinmico que permita predecir la vida til de emulsiones crnicas cocidas almacenadas bajo condiciones fluctuantes de temperatura.

MATERIALES Y METODOS

Preparacin de las muestras y almacenamiento Se utilizaron muestras de emulsiones crnicas cocidas (salchichas) suministradas por una industria local. Las mismas se retiraron de la industria inmediatamente despus de su preparacin y se transportaron hasta el laboratorio en refrigeracin donde fueron envasadas al vaco en pelcula plstica con permeabilidad al oxgeno de 70 cm3/m2/24h/1atm usando envasadora RAPI-VAC S-750. Las muestras envasadas se almacenaron bajo condiciones estticas 8 C durante 50 das.

Anlisis microbiolgico de las muestras A cada tiempo de muestreo se tomaron muestras a partir de las cuales se determin el nmero de Unidades Formadoras de Colonias por gramo (UFC / g) de bacterias lcticas por siembra sobre agar MRS (Man et al., 1960) luego de 72 horas de incubacin a 30C. El experimento se realiz por duplicado. Modelos Primarios de Crecimiento Se utilizaron los siguientes modelos: Ecuacin modificada de Gompertz (Zweitering et al., 1990) cuya expresin es:

log N = A + C * e ( e

( B *( t M ))

(1)

Donde: log N es logaritmo decimal del nmero de microorganismos al tiempo t, A es el valor asinttico cuando el tiempo decrece indefinidamente (aproximadamente equivalente al logaritmo decimal del nmero inicial de microorganismos), C representa el incremento en el logaritmo del nmero de microorganismos cuando el tiempo se incrementa indefinidamente (nmero de ciclos de crecimiento), B es la velocidad de crecimiento mxima relativa al tiempo M y M es el tiempo requerido para alcanzar la mxima velocidad de crecimiento. Modelo Logstico (Ricker, 1979) cuya expresin matemtica es:

log N = A +

C 1 + e ( D F *t )

(2)

Donde: log N, A y C son similares a los definidos en la ecuacin anterior, D es un parmetro adimensional y F es la velocidad de crecimiento relativa al tiempo medio de la fase exponencial. Anlisis estadstico Los datos experimentales se ajustaron a los modelos utilizando el algoritmo Marquardt (regresin no lineal) usando STATGRAPHICS Plus version 4.0. Para determinar si se cumplen las hiptesis estadsticas que permiten el uso correcto de modelos, los valores residuales se estudiaron aplicando el test de Kolmogorov Smirnov, Cotchran y Durvin Watson. Los modelos fueron validados estadsticamente mediante el test de lack-of-fit. Para ello la suma de cuadrados debida al lack-of-fit fue comparada con la suma de cuadrados correspondiente al error puro y dicha comparacin fue cuantificada estadsticamente mediante el F-test (Zwietering, 1994). Este ltimo test tambin fue utilizado para comparar los modelos. Validacin Para la validacin externa de los modelos se realizaron otros ensayos bajo las mismas condiciones experimentales pero los recuentos se obtuvieron a tiempos distintos a los utilizados en la construccin de los modelos. Los valores observados fueron comparados grficamente con los predichos por los modelos y se determin el coeficiente de correlacin.

DISCUSION DE RESULTADOS

En la Figura 1 (a) y ( b) se muestra el ajuste de los datos de crecimiento de bacterias lcticas sobre el producto a la ecuacin de Gompertz y el modelo Logstico respectivamente. Puede observarse que, en ambos casos se obtuvo un buen ajuste entre los datos experimentales y los valores predichos por los modelos. El coeficiente de determinacin R2 para los dos modelos es superior al 99% lo que demuestra que ambos explican un alto porcentaje de la variabilidad de los datos.

(a)

(b)

Figura 1: Ajuste de los datos experimentales al Modelo de Gompertz (a) y al Modelo Logstico(b)

En la Tabla 1 se muestran los resultados del anlisis de residuos de cada modelo. En ella puede observarse que en ambos casos los residuos estn normalmente distribuidos con varianza homognea (P-valor >0,05) y que no existe autocorrelacin entre los mismos puesto que los resultados del test de Durbin Watson son mayores a 1,4. El cumplimiento de estas hiptesis es de fundamental importancia para la validez estadstica de los modelos. El test de Lack-of-fit fue no significativo en los dos casos, lo que implica que ambos modelos son adecuados para describir los datos experimentales.

Tabla 1: Anlisis de Residuos Anlisis Residual Modelo Normalidad* Gompertz Logstico


*

0,984 0,986

Homogeneidad Autocorrelacin de varianzas* 0,820 1,89 0,821 1,93

Resultados expresados como P-Valor

Comparacin de los Modelos Para comparar estadsticamente los modelos se utiliz el F test. Considerando que ambos modelos tienen el mismo nmero de parmetros la suma de cuadrados del error (SCE) de los ajustes se us para la comparacin. El valor F se calcul como la razn entre los valores de SCE de ambos modelos que fueron de 0,801 y 0,678 para el modelo de Gompertz y Logstico respectivamente, tomando como denominador de la razn al valor ms pequeo. El valor F fue comparado con el F de tabla y se encontr que no existen diferencias significativas entre los ajustes al 95% de confianza. Resultados similares fueron hallados por otros autores. Giannuzzi y col. (1998) ajustaron los datos de crecimiento de bacterias lcticas sobre cortes de carne vacuna envasados la vaco y almacenados en refrigeracin al modelo de Gompertz y al modelo Logstico y no detectaron diferencias entre los ajustes. Validacin La validacin de un modelo provee informacin acerca de la performance de ese modelo en la prctica. En este estudio, los datos para validar consistieron en valores de recuentos obtenidos experimentalmente a tiempos distintos a los utilizados en la construccin de los modelos y stos fueron comparados con las predicciones de los mismos. En la Figura 2 se muestra la correlacin obtenida para el modelo de Gompertz, en ella puede observarse que las diferencias entre observaciones y predicciones son muy pequeas lo que queda demostrado por un alto coeficiente de correlacin.. Resultados similares fueron obtenidos en la validacin del modelo Logstico.

9,4 8,4 7,4 6,4 5,4 4,4 3,4 2,4 2,4 4,4

Predicho

r2 = 0,98

6,4 Observado

8,4

10,4

Figura 2:Correlacin entre observaciones y predicciones para el Modelo de Gompertz

CONCLUSIONES

Puede concluirse que para ajustar los valores experimentales de crecimiento de bacterias lcticas sobre emulsiones crnicas cocidas envasadas al vaco y almacenadas en refrigeracin pueden usarse indistintamente el modelo de Gompertz o el Modelo Logstico puesto que ambos son estadsticamente vlidos y sus ajustes no difieren significativamente. Cualquiera de estos modelos podra ser utilizado en la construccin de un modelo dinmico dado que la validacin externa de los mismos mostr un alto porcentaje de correlacin entre las observaciones y las predicciones, es decir, una buena performance en la prctica.

BIBLIOGRAFIA

Blankenship, L.C., Carven S.E. Leffler, R.G. and Custer, C. (1988) growth of Clostridium perfringens in cooked chili during cooling. Appl. Environ. Mocrobiol. 54: 1104-1110. Dickson, J.S., Siragusa, G.R. and Wray, J.E. Jr. (1992) predicting the growth of Salmonella typhimirium of beef by using the temperature function integration technique. Appl. Environ. Mocrobiol. 58: 3482-3494. Giannuzzi, L., Pinotti, A. and Zaritzky, N. (1998) Mathematical modeling of microbial growth in packaged refrigerated beef stored at different temperatures. Int. J. Food Microbiol. 39: 101-110. Labuza, T.P., Fu, B. And Taoukis, P. (1992) Prediction for shelf life and safety of minimally processed CAP/ MAP chilled foods: a review. J. Food Prot., 55-74. Man, J.C., Rogosa, M. and Sharpe, M. (1960) A medium for the cultivation of Lactobacilli. J. Appl. Bact. 23, 130-135. Ricker, W.E. (1979) Growth rates and models. Fish Physiol. 8: 677-743. Roos, T. and McMeekin, T.A. (1994) Predictive microbiology. Int. J. Food Microbiol. 23: 241-246. Zwietering, M.H., Cuppers, H.G.A.M., de Wit, J.C. and vant Riet, K. (1994). Evaluation of data transformation and validation of the model for effect of temperature on bacterial growth. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1094-1101. Zwietering, M.H., Jongen Burger, I., Rombouts, F.M., vant Riet, K. (1990) Modeling of the bacterial growth curve. Appl. Environ. Microbiol. 56: 1875-1881.