IMUNOASAI (PEMERIKSAAN SEROLOGI)

Departemen Patologi Klinik Univ. Wijaya Kusuma Surabaya dr. Febtarini R, Sp.PK

November- 2012

Serologi
Suatu ilmu yang mempelajari cara mendeteksi suatu infeksi di dalam serum pasien, misalnya adanya antibodi (Ab) spesifik terhadap mikroba tertentu
Uji serologi didasarkan atas ikatan spesifik antara antigen (Ag) dan antibodi (Ab) Ag yang telah diketahui akan bereaksi/berikatan dengan Ab yang belum diketahui di dalam serum Sebaliknya Ab yang telah diketahui dapat digunakan untuk mendeteksi Ag dalam serum pasien Reaksi Ag-Ab dapat diamati atas terbentuknya presipitasi, aglutinasi atau dengan bantuan label tertentu, misalnya label radioaktif, label enzims dll

2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu ANTIBODI Fc -S-S-S-S-S-S-

Regio variabel

Fab

L H L H Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi L = Light Chain H = Heavy chain

Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai a. Spesifitas dari Ab

Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya tergantung dari : - profil spesifitas Ab-nya & - kemurnian Ag-nya Ab yang amat spesifik = Ab dengan binding sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan struktur molekul yang unik/tertentu saja.

Antigen I X Y Z Antigen II V W X

Antibodi I x y z Antibodi II v w x

X x Y y Z z

Z Y X x w v

Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi yang mungkin terbentuk

b. Ukuran kuantitas Ab Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam serum.

- Kualitatif pos. /neg. adanya perubahan fisik dari bahan pemeriksaan. (+/-)
- Semi kuantitatif ; ditentukan dengan pengenceran serum secara progresif Titer (1/10, 1/100, 1/640) - Kuantitatif ; ditentukan dengan menggunakan beberapa sera baku kurva baku. Akurasi dicek dengan serum kontrol. (100 pg/mL, 2 L/mL) Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.

OD
X

5 g/dl

Kadar Bahan

Gambar 3. Kurva baku uji ELISA

FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI

1 Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin dll 2 Elektrolit dan pH 3 Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahap a. Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuai b. Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll) 4 Mekanisme Daya Tahan Nonspesifik Bahan yg normal/abnormal terdapat dalam sekret/cairan tubuh. 5 Rasio Ag dan Ab

prozone

postzone

Prozone, Tak ada presipitasi

Equivalent zone, Presipitasi

Post zone, Tak ada presipitasi

Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag Ab dan implikasinya

= ANTIBODI

= ANTIGEN

BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI

MACAM BAHAN : serum , plasma, css Usahakan jangan hemolisis

Inaktivasi C 56C, 30 menit

Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat sendiri dari strain lokal, lebih baik yang multistrains.

IMUNOASAI KADAR BAHAN

RENDAH ( ng/ml, pg/ml )

Hasil reaksi tak tampak
FAKTOR PENGUAT (LABEL)

TINGGI (mg/ml,ug/ml)
Hasil reaksi DAPAT DILIHAT
Presipitasi/RID UJI AGLUTINASI

IF

RIA

EIA

ICA
Heterogen = ELISA

Homogen

JENIS IMUNOASAI
Ada 2 jenis imunoasai.
I. IMUNOASAI TAK BERLABEL II. IMUNOASAI BERLABEL

I. IMUNOASAI TAK BERLABEL

UJI PRESIPTASI UJI AGLUTINASI UJI FIKSASI KOMPLEMEN UJI NETRALISASI TOKSIN

UJI PRESIPITASI

Ag yang larut

Antibodi

Presipitasi adalah bila Ag + Ab dalam bentuk larutan menghasilkan suatu agregasi yang terlihat dengan mata

PRESIPITASI

Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi

Ag.

Inkubasi

Serum dengan Ab

Presipitasi

Gambar 6. Uji presipitasi tabung

Tes serum

1 2

Sera baku

8 Antisera dalam agar

7
Tes serum

6
Tes serum

Tes serum

5
Tes serum

GAMBAR 10. R.I.D

APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI

Uji Tabung Uji Slide : VDRL - Makro : VDRL - Mikro

Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP

RID

: Penentuan kelas Ig

Imunoelektroforesis
Migrasi protein serum di dalam gel dan apabila bertemu dengan antigen yang sesuai akan terjadi presipitasi

UJI AGLUTINASI
Ag. pada permukaan sel

Aglutinasi Ab.

Tak larut
Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi

Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide

Susp. Ag

Inkubasi Aglutinasi

Serum ( Ab )
Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung

AGLUTINASI TAK LANGSUNG

A. AGLUTINASI PASIF B. Ab TAK LENGKAP

a. Ab Monovalen
b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )

+
Ag Larut

+
Partikel
Partikel disalut Ag

Ab dalam serum

Partikel:
Seldarah merah Lateks

Carbo adsorben
(Ko-aglutinasi)

Gambar 14. Uji aglutinasi pasif

Aglutinasi

APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI

Uji Slide (lempeng): uji Widal slide

Uji Tabung : uji Widal tabung

Aglutinasi Tak Langsung: uji Rose-Waaler
III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh

IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN Hampir sama dengan uji aglut. tak langsung,
Hanya Anti Ig diganti C Lisis Imun

UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN

Komplemen di dalam plasma sebanyak 3 mg/ml dalam bentuk inaktif
Jika bertemu dengan kompleks Ag-Ab komplemen menjadi aktif (melalui jalur klasik), dan menghasilkan berbagai kaskade aktivasi, misalnya lisis dari sel target

Prinsip Uji Komplemen

Uji Lisis Imun

Komplemen

Ab
Ag pada permukaan sel

Sensitized cell

= Komplemen

Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun

A.
Komplemen Komplemen

C
Serum dgn. Ab

C
Terikat
Sensitized SDM

Tak ada Lisis Uji Positif

B.
Komplemen Komplemen

Serum tanpa Ab

C
Bebas

Lisis
Uji Negatif

Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen

An example of the complement fixation test.

Fig. 17.14 Complement fixation test.

II. IMUNOASAI BERLABEL 1. CAT FLUORESENS: IF 2. RADIOISOTOP: RIA 3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA )
A. EIA HOMOGEN

B. EIA HETEROGEN (ELISA) C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE

4. EMAS KOLOIDAL:
ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)

1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF)

Mikroskop Fluoresens

CUCI
Ag tak diket. Fiksasi pada slide
Ab diket berlabel cat fluoresens

Kompleks Ag-Ab Berfluoresensi

Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens langsung (direct).

Cuci

AHG dilabel Fluorescein

Ag diket.

Ab tak diket

Kompleks Ag Ab tak tampak

Cuci

Mikroskop Fluoresens

Kompleks Ag Ab AHG berfluoresensi

Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens tak langsung (indirect).

An example of direct and indirect immunofluorescence testing.

Fig. 17.15 Immunofluorescence testing

KELEMAHAN UJI IF
Peralatan canggih dan mahal

Perlu tenaga terlatih

Per hari maks 25 slide / analis

Sukar dibuat otomatis

Pelaksanaan agak kompleks & membosankan

2. Uji RIA

R R R
R R RR

R R

Radioisotop : 3H Thymidin, 131 I

Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA R = label radioisotop

Radiation Counter

R R R

R R

R R
Cuci

RADIATION COUNTER

Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif

KELEMAHAN UJI RIA

Butuh alat mahal & tenaga terlatih Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 2 bln ) Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.

Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus

ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Prinsip dasar Elisa adalah pemakaian enzim untuk mendeteksi adanya ikatan AntigenAntibodi (Ag:Ab)
Enzim akan merubah (mengkonversi) substrate yang tidak berwarna (kromogen) menjadi produk berwarna yang mengindikasikan adanya ikatan Ag:Ab

Ab

Ag pada Fase padat

Anti Ig berlabel enzim

SUBSTRAT berkromogen

PRODUK berwarna

Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA langsung

Direct ELISA
Untuk mendeteksi Ab

Enzim: AK (Alkalin fosfatase) atau HRPO (Horse Raddish Peroxidase)

Substrate : TMB (Tetra methyl benzidine) atau NPP (pnitrophenyl phosphate)

Ag

Ab II berlabel enzim

Ab I pada Fase padat

SUBSTRAT berkromogen

PRODUK berwarna
Gambar 23. Prinsip dasar (tak langsung) double antibody sandwich ELISA

Indirect ELISA (Sandwich ELISA)

Untuk mendeteksi adanya antigen (Ag)

ELISA Antibodi dilapiskan pada dasar sumuran

Bahan yg diperiksa ditambahkan terjadi reaksi Ag-Ab

Ditambahkan anti-antibodi ( Mo anti-Ab) berlabel BIOTIN (biotinylated)

Ditambahkan streptavidin berlabel enzim

Ditambah kromogen Warna, diukur secara kolorimetri memakai Elisa-reader

Uji ELISA
Ag dlm serum

SUBSTRAT BERKROMOGEN

Ab pada Fase padat

Ag berlabel enzim

PRODUK berwarna

Gambar 22. Prinsip dasar uji ELISA kompetitif

An example of the indirect and capture ELISA methods.

Fig. 17.16 Methods of ELISA testing.

CONTOH APLIKASI KLINIS SEROLOGI TEST

1. Sifilis 2. Demam tifoid 3. Tuberkulosis

SIFILIS
Paling Ideal ; Ig. M- ELISA ( Dx, keaktivan, mengikuti hasil Rx ) Di Indonesia ; TPHA Dx VDRL Aktivitas & mengikuti hasil Rx
Keaktivan & mengikuti hasil Rx

Neurosyphilis : VDRL Dx Jumlah sel Protein Total

UJI SEROLOGI DEMAM TIFOID

1. 2. 3. 4. TES WIDAL TES IgM Salmonella ELISA BIAKAN / KULTUR DARAH

UJI WIDAL (AGLUTINASI)

Dari hasil 1X tes belum dapat ditarik kesimpulan yang berarti. Perlu ulangan setelah 5-7 hari

Harga normal tes Widal tabung.

Aglutinin O : 1/160 Aglutinin H : 1/160 Aglutinin PA : 1/80 Aglutinin PB : 1/320

Vaksinasi; aglutinin H dapat dipertahankan beberapa tahun, Antibiotika ; dapat memperlambat kenaikan titer

INDIKASI SEROLOGI TB
1. 2. 3. 4.

INDIKASI: BTA DAHAK NEGATIF TB EKSTRAPULMONUM TB ANAK SPESIFISITAS:

TGT JENIS ANTIGEN (REAKSI SILANG) Kurang pemahaman patogenesis Bersikukuh pada Postulat Koch

5. KONTROVERSI KARENA:

Lateral flow immuno assay LATERAL FLOW IMMUNOASSAY

62

CONTOH PARAMETER PEMERIKSAAN SEROLOGI

CRP = Protein C reaktif - Suatu alfa globulin yg ada di serum pd inflamasi - Suatu reaktan fase akut, indikator non spesifik inflamasi yg berhbgn dg imunologi - Tidak dipengaruhi oleh anemia, kehamilan, hiperglobulinemia - serial, utk indeks aktivitas penyakit dan monitoring terapi

FAKTOR Antibodi REMATOID

Rheumatoid factor

Poliklonal antibodi Antibodi IgG dalam kelas IgM Kadar IgM terbesar, bisa dideteksi oleh alat Antibodi terhadap determinan antigenik pada fragmen Fc immunoglobulin
Sumber: PKB PK,2002 64

LATIHAN SOAL
HIPERSENSITIVITAS
1. Anak M, 13 bulan, datang ke poliklinik UWKS bersama ibunya. Keluhan utama anak muntah dan diare setelah minum susu formula dua jam lalu. Pemeriksaan laboratorium membantu menegakkan diagnosis reaksi hipersensitivitas anak tersebut : A. Kadar immunoglobulin M, tes provokasi saluran cerna, netrofilia B. Kadar immunoglobulin G, tes provokasi saluran cerna, basofilia C. Kadar immunoglobulin D, tes provokasi saluran cerna, sel mast D. Kadar immunoglobulin E, tes provokasi saluran cerna, eosinofilia E. Kadar immunoglobulin A, tes provokasi saluran cerna, urtikaria

2. Defisiensi imunologi secara fisiologis, terjadi pada : A. Diabetes melitus B. Bronkitis kronis C. SLE D. Kehamilan E. Perokok

3. Persyaratan antigen sebagai zat asing yang dapat merangsang pembentukan antibodi, yakni : A. Asam amino asing, berat molekul kecil, bentuk variasi, jumlah tertentu B. Hapten, berat molekul rendah, bergabung dengan protein, jumlah tetap C. Protein asing, berat molekul besar, bentuk tetap, jumlah optimal D. Epitope asing, berat molekul sedang, terikat di reseptor Fc, bentuk variatif E. Alergen, berat molekul besar, bentuk variatif, jumlah tergantung reaksi imun

4. Tn X, 35 tahun, sedang dilakukan operasi appendisitis oleh ahli bedah di suatu rumah sakit swasta. Pada saat dokter membuka kolon dekstra distal, didapatkan bentukan tuberkel di mukosa kolon. Hal tersebut menunjukkan adanya proses granulomata di usus karena Mycobacterium Spp., termasuk : A. Dependent reagin reaction B. Cell mediated immune reaction C. Sitotoxic reaction D. Immediate hypersensitivity reaction E. Antigen-antibody complex reaction

5. Ny U, 45 tahun, datang ke poliklinik UWKS dengan keluhan sesak napas, terdengar suara mengi. Sesak kambuh bila pasien terkena debu saat membersihkan rumah. Immediate hypersensitivity reaction yang terjadi bukan dikarenakan oleh proses dibawah ini : A. Ikatan sel mast-basofil dengan Ig E, mengeluarkan vasoaktif amin B. Antigen terikat Fab dari Ig E sehingga degranulasinya melepaskan vasoaktif amin dan meningkatkan permeabilitas. C. Pengeluaran mediator mengakibatkan kontraksi otot polos, eksudasi dan vasodilatasi D. Antigen terikat Fd dari Ig G dan pengeluaran mediasi yang menyebabkan dilatasi otot polos E. Degranulasi granul-granul sel mast, basofil menghasilkan mediator histamine yang menyebabkan edema

6.Tn M, 46 tahun, dengan gejala demam tinggi, nyeri kepala, muntah dan nyeri ulu hati. Pasien baru selesai dari tugas dinasnya di Nusa tenggara timur. Hasil pemeriksaan ICT malaria positif. Tn M mengalami : A. Immediate hypersensitivity reaction, Ig E B. Cell mediated immune reaction, limfosit T C. Sitotoxic reaction, Ig M, Ig G D. Antigen-antibody complex reaction, Ig G E. Dependent regain reaction, Ig E

7. Berikut ini adalah ciri-ciri Imunoglobulin M :

A. Pentamer, BM 900.000, tidak menembus plasenta B. Dimer, BM 150.000, menembus plasenta, berikatan dengan makrofag C. Dimer, BM 160.000, tidak menembus plasenta, berikatan dengan komplemen D. Dimer, BM 160.000, sekresi seromukus E. Pentamer, BM 200.000, respons alergi dan parasit

(Yoes Prijatna Dachlan, 2010)

(Kuby, 2006)

8. Ny P, 45 tahun, mengeluh badan lemas, sariawan yang sulit sembuh, tidak tahan panas matahari. Hasil pemeriksaan darah didapatkan leukopenia, trombositopenia dan sel LE. Pemeriksaan penyaring/skrining ANA/antinuclear antibody positif. Pemeriksaan konfirmasi didapatkan positif DS DNA. Ny P menderita : A. Organ spesific autoimmune disease B. Non organ specific autoimmune disease C. Cell mediated immune reaction D. Citotoxic reaction E. Immediate hypersensitivity reaction

9. Bukan termasuk kriteria ACR (American College of Rheumatology) dari Systemic Lupus Erythematosus (SLE) adalah : A. Artritis B. Keratokonjungtivitis sicca C. Photosensitivity D. Butterfly face E. Renal disorder

10. Tn D, 68 tahun, datang ke klinik imunologi dengan keluhan utama pembesaran kelenjar ludah, lidah kering, mata kering. Pemeriksaan skrining/penyaring penyakit autoimun untuk Tn D adalah : A. Molecular mimicry B. Immunoblotting C. Antinuclear antibody D. ELISA E. Immunodiffusion

SOAL SEROLOGI
11. Faktor faktor yang tidak mempengaruhi proses Imunoasai (pemeriksaan serologi) adalah : A. Kelarutan B. Elektrolit dan pH C. Sifat antigen D. Waktu dan suhu E. Mekanisme daya tahan non spesifik

12. Proses presipitasi pada pemeriksaan serologi terjadi pada keadaan : A. Post zone B. Free antibody C. Antigen excess D. Equivalent zone E. Pre zone

13. Bahan pemeriksaan untuk Imunoasai/ pemeriksaan serologi : A. Serum B. Blood lisis C. Endapan eritrosit D. Buffy coat E. Whole blood

14. Pemeriksaan serologi (imunoasai) dibawah ini bukan imunoasai tidak berlabel :
A. Uji netralisasi toksin B. Uji fiksasi komplemen C. Uji aglutinasi D. Uji presipitasi E. EIA (Enzim imunoasai)

15. Aplikasi klinis uji presipitasi pada pemeriksaan imunoasai/serologi adalah :

A. Alkali fosfatase B. Glukosa C. CRP D. Bilirubin E. Hemoglobin

16. Aplikasi klinis uji aglutinasi adalah A. Sifilis B. Uji widal C. Uji komplemen D. Imunokromatografi E. EIA (Enzim imunoasai)

17. Berikut ini adalah pemeriksaan serologi (imunoasai) berlabel :

A. Uji aglutinasi B. Uji netralisasi toksin C. Uji presipitasi D. Uji ELISA E. Uji fiksasi komplemen

18. Berikut ini bukan indikasi uji serologi tuberculosis :

A. BTA dahak negatif B. TB ekstrapulmonum C. TB anak D. Kontroversi pathogenesis E. Non spesifik

19. Suatu reaktan fase akut alfa globulin dalam serum, sebagai indicator non spesifik inflamasi yang berhubungan dengan imunologi dan diproduksi di hepar :
A. Faktor rematoid B. Protein C reaktif C. Imunoglobulin D. Antigen determinan E. Fraksi Ab antibody

20. Salah satu pemeriksaan serologi/ imunoasai berlabel adalah ICA (imunokromatografi asai), yaitu suatu :
A. Absorbance flow imunoasai B. Vertikal flow imunoasai C. Medial flow imunoasai D. Lateral flow imunoasai E. Turbulensi flow imunoasai

21. Pengukuran kadar bahan uji serologi yang rendah dalam tubuh, dapat diberi bantuan label tertentu untuk mudah dideteksi alat. Label tersebut berupa :
A. Label radioaktif B. Label enzim C. Label fluorosens D. A dan C E. A, B dan C

22. Berikut ini adalah bukan sifat antibody pada uji serologi : A. Spesifik terhadap antigen tertentu B. Suatu benda asing yang melemahkan C. Mempunyai fraksi ab untuk berikatan dengan antigen D. Konsentrasi tertentu di dalam serum E. Dipengaruhi oleh waktu dan suhu

23. Pernyataan dibawah ini benar untuk faktor rematoid :

A. Antibodi terhadap epitope di Fab immunoglobulin B. Antibodi monoklonal C. Antibodi IgG dalam kelas IgM D. Antibodi IgE dengan IgG E.Antibodi spesifik tuberkulosis