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Universit Joseph Fourier / Universit Pierre Mends France /

Universit Stendhal / Universit de Savoie / Grenoble INP


THSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE LUNIVERSIT DE GRENOBLE
Spcialit : BIOTECHNOLOGIES, INSTRUMENTATION, SIGNAL
Arrt ministriel : 7 aot 2006

Prsente par
Affif ZACCARIA

Thse dirige par Franois BERGER

prpare au sein du Grenoble Institut des Neurosciences
dans l'cole Doctorale Ingnierie pour la Sant, la Cognition et
lEnvironnement.

Nouvelles stratgies pour
lanalyse protomique du
tissu crbral et des fluides
biologiques dans la maladie
de Parkinson.

Thse soutenue publiquement le 15 Mars 2013 ,
devant le jury compos de :
M, Pierre, BURKHARD
Professeur, Universit de Genve, Rapporteur
M, Bernard, MONSARRAT
Docteur, Universit de Toulouse, Rapporteur
M, Sylvain, LEHMANN
Professeur, Universit de Montpellier, Examinateur
M, Pascal, MOSSUZ
Professeur, Universit de Grenoble, Examinateur
M, Stphan, CHABARDS
Professeur, Universit de Grenoble, Examinateur
M, Franois, BERGER
Professeur, universit de Grenoble, Directeur de Thse
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Sommaire


Sommaire _________________________________________________________________ 1
INTRODUCTION __________________________________________________________ 1
I. La maladie de Parkinson ________________________________________________ 1
1. Contexte de la maladie de Parkinson. __________________________________________ 1
2. Neuropathologie de la maladie de Parkinson ____________________________________ 2
1) La dgnrescence des neurones dopaminergiques de la SNc. _____________________________ 2
2) La dgnrescence des autres rgions crbrales ________________________________________ 3
3) Les corps de Lewy. _______________________________________________________________ 3
3. Etiologie de la MP __________________________________________________________ 4
1) Les formes gntiques hrditaires ___________________________________________________ 4
2) Les formes sporadiques ____________________________________________________________ 5
4. Diagnostic de la MP _________________________________________________________ 6
1) Un diagnostic diffrentiel difficile ___________________________________________________ 6
2) Un diagnostic tardif _______________________________________________________________ 7
5. Conclusions _______________________________________________________________ 8
II. Lanalyse protomique par spectromtrie de masse ___________________________ 9
1. La protomique ____________________________________________________________ 9
2. La spectromtrie de masse. ___________________________________________________ 9
1) Les sources dionisation __________________________________________________________ 10
2) Les analyseurs __________________________________________________________________ 12
3. Les diffrentes tapes de lanalyse protomique en spectromtrie de masse. _________ 17
1) Limiter la dgradation de lchantillon _______________________________________________ 17
2) Sparer les protines _____________________________________________________________ 17
3) Identifier les protines ____________________________________________________________ 20
4) Quantifier les protines. __________________________________________________________ 22
RESULTATS _____________________________________________________________ 24
Partie I __________________________________________________________________ 24
Dveloppement dune stratgie pour lanalyse protomique du tissu crbral in vivo. ___ 24
I. La stimulation crbrale profonde : une opportunit pour lanalyse protomique du
cerveau in vivo. ___________________________________________________________ 24
1. Introduction ______________________________________________________________ 24
1) Lanalyse protomique du tissu crbral post-mortem dans la MP. _________________________ 24
2) La stimulation crbrale haute frquence du noyau sous-thalamique dans la MP. ____________ 26
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Sommaire


2. Article 1 _________________________________________________________________ 28
3. Conclusions et Perspectives. _________________________________________________ 29
II. Validation de lefficacit et de leffet non lsionnel dun nouvel outil pour la capture
in vivo de tissu crbral. ____________________________________________________ 31
1. Introduction ______________________________________________________________ 31
1) Prsentation de loutil ____________________________________________________________ 31
2. Article 2 _________________________________________________________________ 33
3. Conclusions et Perspectives. _________________________________________________ 34
RESULTATS _____________________________________________________________ 36
Partie II _________________________________________________________________ 36
Dveloppement dune stratgie pour lanalyse protomique des fluides biologiques en
clinique. _________________________________________________________________ 36
I. Lutilisation de nanoparticules pour lanalyse protomique du LCR. ____________ 37
1. Introduction ______________________________________________________________ 37
1) Du tissu pathologique aux fluides biologiques _________________________________________ 37
2) Le liquide cphalo-rachidien. ______________________________________________________ 37
3) Lanalyse protomique du LCR ____________________________________________________ 38
4) Lutilisation de micro/nanoparticules pour lanalyse protomique haut dbit du LCR. __________ 39
2. Article 3 _________________________________________________________________ 41
3. Conclusions et Perspectives. _________________________________________________ 42
II. Lutilisation de NPs pour lanalyse protomique du globule rouge (GR). ________ 44
1. Introduction ______________________________________________________________ 44
1) Lrythrocyte ou globule rouge. ____________________________________________________ 44
2) Lanalyse protomique du GR _____________________________________________________ 44
2. Article 4 : ________________________________________________________________ 45
3. Conclusions et Perspectives. _________________________________________________ 46
III. Lutilisation de NPs pour lanalyse protomique du plasma sanguin. ___________ 48
1. Introduction ______________________________________________________________ 48
1) Le plasma sanguin _______________________________________________________________ 48
2) Lanalyse protomique du plasma sanguin ____________________________________________ 48
2. Matriels et Mthodes ______________________________________________________ 49
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Sommaire


1) Collecte du plasma ______________________________________________________________ 49
2) Traitement avec les NPs __________________________________________________________ 49
3) Analyse du plasma par SDS-PAGE _________________________________________________ 50
4) Identification des protines par nano-LC-MS/MS ______________________________________ 50
3. Rsultats prliminaires _____________________________________________________ 51
1) Limpact des NPs sur le profil SDS-PAGE du plasma sanguin ____________________________ 51
2) Lidentification des protines captes par les NPs par nano-LC-MS/MS ____________________ 52
IV. Vers lutilisation in vivo de NPs pour la capture de protines dans le sang. _______ 54
1. Introduction gnrale ______________________________________________________ 54
2. Lencapsulation des NPs dans un biopolymre dalginate. ________________________ 56
1) Introduction ____________________________________________________________________ 56
2) Matriels et Mthodes : ___________________________________________________________ 57
3) Rsultats prliminaires ___________________________________________________________ 60
3. Dveloppement de micro-aimants implantables pour la recapture de NPs dans la
circulation sanguine. ___________________________________________________________ 63
1) Introduction ____________________________________________________________________ 63
2) Rsultats prliminaires ___________________________________________________________ 63
Conclusion gnrale. _______________________________________________________ 66
I. Dveloppement dune stratgie pour lanalyse protomique du cerveau in vivo. ___ 66
II. Dveloppement dune stratgie pour lanalyse protomique des fluides biologiques en
clinique. _________________________________________________________________ 68
Rfrences _______________________________________________________________ 70
Annexe __________________________________________________________________ 66
1. Informations concernant loutil dempreinte tissulaire ___________________________ 78
2. Fiches techniques des NPs utilises au cours de ce travail ________________________ 78
3. Brevet concernant lencapsulation de NPs dans un polymre biocompatible _________ 78
4. Brevet concernant le dveloppement de micro-aimants autonomes et implantables ___ 78
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Index des Illustrations



llgure 1 : AugmenLaLlon du nombre de cas de la M prevue pour 2030 d'apres uorsey eL al. 1
llgure 2 : Coupes anaLomlques revelanL la perLe de neurones dopamlnerglques eL
represenLaLlon de la dlmlnuLlon de dopamlne dellvree au puLamen eL noyau caude chez le
paLlenL parklnsonlen. ................................................................................................................ 2
llgure 3: lmmunomarquage de l'o synuclelne eL de l'ublqulLlne meLLanL en evldence un
corps de Lewy dans un neurone dopamlnerglque de la Snc. ................................................... 3
1ableau 1: Cenes assocles aux formes famlllales de la M. ..................................................... 4
llgure 4: Les dlfferenLes phases de la M. ................................................................................ 8
llgure 6: Schema slmpllfle de l'lonlsaLlon elecLrospray d'apres (kebarle 2000) .................... 11
llgure 7: Schema slmpllfle de l'lonlsaLlon MALul. .................................................................. 11
llgure 8: Schema d'une barreLLe SLLul eL des dlfferenLes surfaces d'afflnlLe. ....................... 12
llgure 9: 1ra[eL d'un lon dans l'analyseur a Lemps de vol en mode llnealre. ......................... 13
llgure 10: 1ra[eL d'un lon dans l'analyseur a Lemps de vol en mode reflecLron. ................... 14
llgure 11: hoLo eL schema slmpllfle du L1C-CrblLrap par 1hermo SclenLlflc. .................... 14
llgure 12: hoLo d'un CrblLrap eL schema de la Lra[ecLolre des lons auLour de l'elecLrode
cenLrale. .................................................................................................................................. 13
llgure 13: Schema d'un plege lonlque llnealre a e[ecLlon radlale par 1hermo SclenLlflc. ...... 16
1ableau 2: CaracLerlsLlques des meLhodes de coloraLlon des gels d'elecLrophorese
bldlmenslonnelle. ................................................................................................................... 18
llgure 14: rlnclpe de l'elecLrophorese bldlmenslonnelle assoclee a la specLromeLrle de
masse. ..................................................................................................................................... 19
llgure 13: rlnclpe du SuS-ACL 1u couple a la nano-chromaLographle llqulde. .................. 20
llgure 16: L'emprelnLe pepLldlque masslque. ........................................................................ 21
llgure 17: Le sequenage pepLldlque par MS/MS. ................................................................. 22
llgure 18: LocallsaLlon du S1n par venLrlculographle, l8M eL elecLrophyslologle d'apres
8enabld eL al. .......................................................................................................................... 26
llgure 19: lmplanLaLlon des elecLrodes deflnlLlves dans le S1n eL du sLlmulaLeur en sous-
clavlculalre. ............................................................................................................................. 27
llgure 20: uce en slllclum modlflee chlmlquemenL eL mlcro-sLrucLuree. (A) 8epresenLaLlon
schemaLlque de la puce. (8) rlnclpe de la foncLlonnallsaLlon chlmlque. (C) Mlcroscople
elecLronlque a balayage des mlcro-plcoLs. ............................................................................. 31
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Index des Illustrations


llgure 21 : CbservaLlon du Llssu Lumoral recupere sur une puce en slllclum, par mlcroscople
elecLronlque a balayage (gauche) eL bl phoLonlque (drolLe). Les flbres blanches (drolLe) sonL
des flbres de collagene de la MLC. ......................................................................................... 32
llgure 22: L'ouLll d'emprelnLe Llssulalre. (A) Schema eL (8) phoLo de l'ouLll d'emprelnLe
Llssulalre. (C) 8adlographle reallsee duranL la reallsaLlon d'une emprelnLe ln vlvo chez le
prlmaLe. .................................................................................................................................. 33
llgure 23: l8M d'un ouLll d'emprelnLe en LLk dans un klwl ................................................. 33
llgure 24: rlnclpe de l'egallsaLlon des concenLraLlons proLelques par le roLeomlner ...... 39
llgure 23: rlnclpales eLapes de l'uLlllsaLlon de ns magneLlques pour la capLure proLelque
dans les fluldes blologlques d'apres vlllanueva eL al. ............................................................. 41
llgure 26: roflls SuS-ACL d'un plasma non LralLe ou LralLe avec ns. 2 Lypes eL 2 Lallles
dlfferenLs de ns onL eLe uLlllses. ........................................................................................... 31
llgure 27: PlsLogramme recaplLulanL le nombre de proLelnes dlfferenLes ldenLlflees par
nano-lc-ms/ms. ....................................................................................................................... 32
llgure 28: ulagramme de venn schemaLlsanL le nombre de proLelnes dlfferenLes eL slmllalres
enLre les echanLlllons. ............................................................................................................. 33
llgure 29: SLrucLure chlmlque de l'alglnaLe. ........................................................................... 36
llgure 30: rlnclpe de la gellflcaLlon. ...................................................................................... 37
llgure 31: hoLo du dlsposlLlf (gauche) permeLLanL la producLlon de capsules d'alglnaLe
conLenanL des ns (drolLe). .................................................................................................... 38
llgure 33: rofll MALul des proLelnes de bas polds moleculalre capLees par les ns
encapsulees (specLre du hauL) eL non encapsulees (specLre du bas). .................................... 61
llgure 34:hoLo du dlsposlLlf mlmanL la clrculaLlon (gauche) eL slLe d'lnLroducLlon du mlcro-
almanL (drolLe) ........................................................................................................................ 64
llgure 33 : (A) LocallsaLlon des pleges magneLlques avanL la capLure de ns vla l'uLlllsaLlon
d'un masque. (8) CbservaLlon de ce mme almanL sans masque apres la capLure de ns. .. 64
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L|ste des abrv|at|ons
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Liste des abrviations


M : Maladle de arklnson
SNc : SubsLance nolre compacLa
M1 :

1-meLhyl 4-phenyl-1,2,3,6-LeLrahydropyrldlne
1L : 1omographle a emlsslon de poslLons
IkM : lmagerle par resonance magneLlque
MS : SpecLromeLrle de masse
MS]MS : SpecLromeLrle de masse en Landem
I1-ICk : 8esonance cycloLronlque d'lons a Lransformee de lourler
LSI : LlecLrospray lonlsaLlon
MALDI : MaLrlx AsslsLed Laser uesorpLlon lonlsaLlon
Nano-LC : ChromaLographle llqulde sur nano-colonne
UV : ulLra-vloleL
SLLDI: Surface Lnhanced Laser uesorpLlon lonlsaLlon
1CI: 1lme of fllghL
2-DL: LlecLrophorese bldlmenslonnelle
DIGL: ulfference Cel LlecLrophoresls
SDS-AGL: Sodlum dodecyl sulphaLe polyacrylamlde gel elecLrophoresls
ICA1: lsoLope Coded AfflnlLy 1ag
|1kA: lsobarlc 1ag for relaLlve and AbsoluLe CuanLlLaLlon
SILAC: SLable lsoLope Labelllng by Amlno acld ln Cell culLure
AUA : AbsoluLe CuanLlflcaLlon
kIC : LxLracLed lon ChromaLogram
CND2 : CyLosollc non speclflc dlpepLldase 2
S1N : noyau sous-Lhalamlque
1CC : 1roubles obsesslonnels compulslfs
G| : Clobus allldus lnLerne
MLC : MaLrlce LxLra Cellulalre
LLk : polyeLhereLherceLone
LCk : Llqulde cephalo-rachldlen
Ns : nanoparLlcules
Gk : Clobule rouge
SA : rosLaLe speclflc anLlgen
kMN : 8esonance magneLlque nuclealre

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IN1kCDUC1ICN
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Introduction I : La maladie de Parkinson.
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I. La ma|ad|e de ark|nson
1. Contexte de |a ma|ad|e de ark|nson.
Avec le vlellllssemenL de la populaLlon eL l'augmenLaLlon de l'esperance de vle dans les pays
lndusLrlallses, les maladles neurodegeneraLlves llees a l'ge consLlLuenL un verlLable
probleme de sanLe publlc. arml les plus frequenLes, la maladle de arklnson (M)
(arklnson 2002), (Lang and Lozano 1998, Lang and Lozano 1998) affecLe 7 mllllons de
personnes dans le monde. C'esL une maladle rare avanL 30 ans avec une prevalence de 0,3
de la populaLlon globale, de 1 a 2 chez les personnes de plus de 63 ans eL de 3 a 3 chez
les personnes de plus de 80 ans (de Lau and 8reLeler 2006). ues prevlslons pour 2030
annoncenL une augmenLaLlon de 30 du nombre de cas dans les 3 prlnclpaux pays d'Lurope
eL de 130 dans les 10 pays les plus peuples du monde (uorsey, ConsLanLlnescu eL al. 2007)
(llgure 1).

I|gure 1 : Augmentat|on du nombre de cas de |a M prvue pour 2030 d'aprs Dorsey et a|.
Avec les efforLs eL les decouverLes reallses depuls une vlngLalne d'annees, la M beneflcle
au[ourd'hul de nombreux LralLemenLs sympLomaLlques de la L-uopa a la neurosLlmulaLlon
en passanL par la Lheraple genlque (Slngh, lllay eL al. 2007), mals demeure sans LralLemenL
eLlologlque. ueux ralsons prlnclpales expllquenL ceL echec LherapeuLlque :
-L'lncomprehenslon des causes eL des mecanlsmes moleculalres a l'orlglne de la
neurodegenerescence. CeLLe meconnalssance de l'eLlologle moleculalre esL le prlnclpal
obsLacle au developpemenL de Lheraples curaLlves bloquanL le processus degeneraLlf.
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Introduction I : La maladie de Parkinson.
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- L'lncapaclLe a dlagnosLlquer la maladle de arklnson avanL l'apparlLlon des
sympLmes moLeurs, eL donc l'admlnlsLraLlon Lardlve de LralLemenLs sympLomaLlques qul
pourralenL se reveler neuroproLecLeurs a un sLade plus precoce de la maladle.
2. Neuropatho|og|e de |a ma|ad|e de ark|nson
1) La dgnrescence des neurones dopam|nerg|ques de |a substance no|re compacta.
La M se caracLerlse prlnclpalemenL par la degenerescence progresslve eL masslve des
neurones dopamlnerglques de la subsLance nolre pars compacLa (Snc).
CeLLe perLe de neurones enLraine une dlmlnuLlon drasLlque de la quanLlLe de dopamlne
dellvree au nlveau du puLamen eL du noyau caude (klsh, Shannak eL al. 1988), les prlnclpaux
slLes de pro[ecLlon des neurones de la Snc (llgure 2).
!"#$%&'() *+%,-#."#)
!

I|gure 2 : Coupes anatom|ques rv|ant |a perte de neurones dopam|nerg|ques et reprsentat|on de |a d|m|nut|on de
dopam|ne d||vre au putamen et noyau caud chez |e pat|ent park|nson|en.
CeLLe depleLlon en dopamlne enLraine une cascade de modlflcaLlons foncLlonnelles,
lmpllquanL Lous les noyaux de la boucle moLrlce du clrculL des gangllons de la base (8landlnl,
nappl eL al. 2000), eL responsable des sympLmes moLeurs caracLerlsLlques: le LremblemenL
de repos, l'aklnesle eL la rlgldlLe musculalre donL la severlLe esL correlee a la perLe de
dopamlne (8lederer and WukeLlch 1976), (8ernhelmer, 8lrkmayer eL al. 1973). La
manlfesLaLlon de ces sympLmes necesslLe 60 a 80 de depleLlon dopamlnerglque au
nlveau du puLamen, eL la degenerescence d'envlron 60 des neurones dopamlnerglques de
la Snc (8ernhelmer, 8lrkmayer eL al. 1973), (8ezard, uovero eL al. 2001). La degenerescence
neuronale esL un processus physlologlque du vlellllssemenL , mals alors que le vlellllssemenL
physlologlque affecLe prlnclpalemenL eL moderemenL la parLle dorso-medlale de la Snc, la
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Introduction I : La maladie de Parkinson.
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M revele une degenerescence acceleree eL ma[orlLalre de la parLle venLro-laLerale de la Snc
(klsh, Shannak eL al. 1992), (learnley and Lees 1991). Aussl le processus de degenerescence
des neurones dopamlnerglques dans la paLhologle esL probablemenL dlfferenL de celul lle au
vlellllssemenL.
2) La dgnrescence des autres rg|ons crbra|es
8len que la M solL prlnclpalemenL decrlLe comme une desLrucLlon du sysLeme
dopamlnerglque, une degenerescence neuronale esL aussl observee dans les noyaux
caLecholamlnerglques eL seroLonlnerglques du Lronc cerebral, le noyau basal de MeynerL
chollnerglque, le locus ceruleus, les neurones hypoLhalamlques, le corLex cerebral mals aussl
dans le bulbe olfacLlf eL le sysLeme nerveux auLonome (Pornyklewlcz and klsh 1987), (lorno
1996), (!elllnger 1990). La degenerescence de ces sLrucLures pourralL expllquer les Lroubles
cognlLlfs parfols presenLs chez cerLalns paLlenLs: demence (Aarsland, 1andberg eL al. 1996),
depresslon (Cummlngs 1992), anxleLe (Shlba, 8ower eL al. 2000), mals aussl les sympLmes
precoces eL non moLeurs, non speclflques presenLs chez les paLlenLs, plusleurs annees avanL
la manlfesLaLlon moLrlce de la maladle (LangsLon 2006).
3) Les corps de Lewy.
une auLre caracLerlsLlque neuropaLhologlque de la M esL la presence d'lncluslons
cyLoplasmlques eoslnophlles nommes corps de Lewy (Clbb and Lees 1988), en reference a
lrederlch Lewy qul fuL le premler a les decrlre en 1912 (Poldorff 2002) (llgure 3).

I|gure 3: Immunomarquage de |'o synuc||ne et de |'ub|qu|t|ne mettant en v|dence un corps de Lewy dans un neurone
dopam|nerg|que de |a SNc.
u'un dlameLre de 3 a 23 m, les corps de Lewy sonL consLlLues de neurofllamenLs
(1ro[anowskl and Lee 1998), d'ublqulLlne (SplllanLlnl, SchmldL eL al. 1997), d'o-Synuclelne
(SplllanLlnl, CrowLher eL al. 1998), de arklne (Schlossmacher, lrosch eL al. 2002) eL onL eLe
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mls en evldence dans LouLes les zones cerebrales affecLees par la M. !usqu'a presenL, le
mecanlsme de formaLlon des corps de Lewy, eL leur rle dans le processus neurodegeneraLlf
demeurenL lnconnus. L'eLude du conLenu moleculalre de ces corps de Lewy (Leverenz, umar
eL al. 2007) apporLeralL des lnformaLlons precleuses sur les processus blologlques assocles a
leur presence dans la M.
3. Lt|o|og|e de |a M
endanL longLemps la M a eLe decrlLe comme n'ayanL aucune composanLe geneLlque. Ce
concepL a radlcalemenL change ces 10 dernleres annees avec l'ldenLlflcaLlon de nombreuses
muLaLlons geneLlques assoclees a des formes famlllales de la M.
1) Les formes gnt|ques hrd|ta|res
Au[ourd'hul, 3 genes onL eLe deflnlLlvemenL lmpllques dans la Lransmlsslon heredlLalre de la
maladle (1ableau 1), SnCA eL L88k2 a Lransmlsslon auLosomlque domlnanLe, A8k2, lnk1
eL u!-1 a Lransmlsslon auLosomlque recesslve (Wood-kaczmar, Candhl eL al. 2006), (larrer
2006). Ces 3 genes codenL respecLlvemenL pour l'o-Synuclelne, la Leuclne 8lch 8epeaL
proLeln klnase 2 (L88k2), la arklne, la 1Ln-lnduced klnase-1 (lnk1) eL u!-1. Selon le gene
muLe, le phenoLype de la maladle esL dlfferenL avec un debuL de paLhologle plus ou molns
precoce eL une evoluLlon plus ou molns lenLe.
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1ab|eau 1: Gnes assoc|s aux formes fam|||a|es de |a M.
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L'eLude des proLelnes codees par ces genes muLes dans les formes famlllales de la M a
permls d'assocler cerLalnes alLeraLlons foncLlonnelles a l'eLlologle de la M. Alnsl,
l'accumulaLlon de proLelnes agregees eL mal repllees, le dysfoncLlonnemenL des complexes
mlLochondrlaux, l'augmenLaLlon du sLress oxydaLlf eL/ou la defalllance du sysLeme
ublqulLlne-proLeasome sonL lmpllques dans la degenerescence dopamlnerglque (Moore,
WesL eL al. 2003). 8len que ces formes famlllales represenLenL unlquemenL 3 des cas de la
M, leurs eLudes onL revele que dlfferenLs mecanlsmes moleculalres eLalenL capables
d'lndulre une degenerescence dopamlnerglque.
2) Les formes sporad|ques
Les formes sporadlques represenLenL 93 des cas de la M. Alors que leur eLlologle
demeure lnconnue, lcl aussl le sLress oxydaLlf (!enner and Clanow 1996), le
dysfoncLlonnemenL mlLochondrlal (Schaplra, Cooper eL al. 1990) eL l'alLeraLlon du sysLeme
ublqulLlne-proLeasome (McnaughL, MyLlllneou eL al. 2002) sonL conslderes comme
poLenLlellemenL lmpllques dans la paLhogenese.
ues eLudes posL-morLem des formes sporadlques de la maladle onL mls en evldence la
presence d'un sLress oxydaLlf accru dans la Snc de paLlenLs parklnsonlens (!enner and
Clanow 1996). La source de ce sLress n'esL pas connue , elle pourralL provenlr du
meLabollsme de la dopamlne qul produlL des especes radlcalalres de l'oxygene comme le
peroxyde d'hydrogene, mals aussl d'un dysfoncLlonnemenL du complexe l de la chaine
resplraLolre mlLochondrlale, observe dans la Snc de paLlenLs parklnsonlens (Schaplra,
Cooper eL al. 1990). lcl aussl, la cause de ce dysfoncLlonnemenL mlLochondrlal dans les
formes sporadlques n'a Lou[ours pas eLe elucldee. Llle pourralL Lre la consequence d'une
exposlLlon envlronnemenLale aux pesLlcldes (Sherer, 8eLarbeL eL al. 2002) ou aux oploides
de synLhese (LangsLon, 8allard eL al. 1983) comme le 1-meLhyl 4-phenyl-1,2,3,6
LeLrahydropyrldlne (M1), qul vonL lnhlber le complexe l de la chaine mlLochondrlale. Sl
l'alLeraLlon de la foncLlon mlLochondrlale peuL lndulre une augmenLaLlon du sLress oxydaLlf,
l'lnverse esL aussl posslble. CeLLe observaLlon refleLe les dlfflculLes a deLermlner
l'enchainemenL chronologlque des mecanlsmes moleculalres alLeres dans la M, eL donc de
dlsLlnguer les causes precoces de la degenerescence dopamlnerglque, des consequences
Lardlves.
Au[ourd'hul, la M esL conslderee dans ses formes sporadlques comme une maladle
mulLlfacLorlelle ou l'ge, l'exposlLlon envlronnemenLale (Llbaz, Clavel eL al. 2009) mals aussl
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une suscepLlblllLe geneLlque (1an, kha[avl eL al. 2000), (Puang, Chen eL al. 2004), (Pealy,
Abou-Slelman eL al. 2004) vonL enLrainer la perLurbaLlon de dlfferenLs mecanlsmes
moleculalres, responsables de la degenerescence dopamlnerglque. uans ce conLexLe
complexe eL mulLlfacLorlel, l'ldenLlflcaLlon des mecanlsmes moleculalres declencheurs de la
degenerescence passe par l'eLude de la maladle a des sLades plus precoces. Llle apporLeralL
de precleuses lnformaLlons pour le developpemenL de nouvelles Lheraples clblanL l'eLlologle
eL pas unlquemenL les sympLmes, eL orlenLeralL la recherche de marqueurs moleculalres
precleux pour un dlagnosLlc precls eL precoce de la M.
4. D|agnost|c de |a M
1) Un d|agnost|c d|ffrent|e| d|ff|c||e
!usqu'a presenL, ll n'exlsLe pas de LesL speclflque ou de blomarqueur permeLLanL le
dlagnosLlc precls de la M. Ce dernler repose essenLlellemenL sur l'examen cllnlque des
sympLmes moLeurs caracLerlsLlques : l'aklnesle, le LremblemenL de repos eL la rlgldlLe
musculalre (Calne, Snow eL al. 1992), (Celb, Cllver eL al. 1999). La presence asymeLrlque d'un
ou plusleurs sympLmes, donL la severlLe esL dlmlnuee par l'admlnlsLraLlon de L-uopa esL le
crlLere d'lncluslon prlnclpal pour le dlagnosLlc de la M. CependanL, les varlaLlons de
reponse a la L-uopa chez des paLlenLs parklnsonlens mals aussl l'exlsLence d'auLres
syndromes parklnsonlens :
- degeneraLlfs ou arklnson+, regroupanL la demence a corps de Lewy, l'amyoLrophle
mulLlsysLemaLlsee eL la paralysle supranuclealre progresslve
- secondalres d'orlglne vasculalre, Lumorale, lnfecLleuse ou Loxlque,
presenLanL les mmes sympLmes que la M, compllquenL le dlagnosLlc (Calvln, Lee eL al.
2001), (Samll, nuLL eL al. 2004). Ln effeL, des eLudes hlsLopaLhologlques posL-morLem onL
revele un dlagnosLlc errone dans 23 des cas (Pughes, uanlel eL al. 1992) eL acLuellemenL,
l'auLopsle cerebrale demeure lndlspensable pour un dlagnosLlc deflnlLlf. Mme dans les
cenLres speclallses dans les Lroubles du mouvemenL, la senslblllLe du dlagnosLlc esL
seulemenL de 90 (Pughes, uanlel eL al. 2002).
ComplemenLalre de l'examen cllnlque en cas d'lncerLlLude, l'uLlllsaLlon de la neurolmagerle
de Lype 1omographle par emlsslon de poslLons (1L) (8rooks 2004) eL de l'l8M (Zl[lmans,
1hl[ssen eL al. 1993) vonL permeLLre de conflrmer/lnflrmer une depleLlon dopamlnerglque eL
d'exclure/reLenlr un syndrome parklnsonlen secondalre d'orlglne vasculalre ou Lumorale.
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Ces Lechnlques peuvenL aussl se reveler uLlle pour dlsLlnguer la M d'auLres syndromes
arklnson+ (Schocke, Seppl eL al. 2002), cependanL elles demeurenL relaLlvemenL cheres eL
peu dlsponlble pour une uLlllsaLlon dlagnosLlque en rouLlne cllnlque.
2) Un d|agnost|c tard|f
Ln plus de la dlfflculLe a dlscrlmlner la M d'auLres syndromes parklnsonlens, ce dlagnosLlc
base sur les sympLmes moLeurs n'esL posslble qu'a leur apparlLlon, solL apres une
degenerescence d'au molns 60 des neurones dopamlnerglques de la Snc. Ln effeL, avanL
ce sLade, le paLlenL esL dans une phase asympLomaLlque pouvanL durer enLre 3 eL 10 ans,
mals duranL laquelle la degenerescence dopamlnerglque a blen commence (learnley and
Lees 1991), (Morrlsh, 8akshl eL al. 1998) (llgure 4). uuranL ceLLe large fenLre Lemporelle, le
paLlenL va parfols developper des sympLmes pre eL non moLeurs Lels que la dysarLhrle
(1sanas, LlLLle eL al. 2012), l'hyposmle, les Lroubles du sommell, la consLlpaLlon ou encore la
perLe de l'lnnervaLlon sympaLhlque au nlveau cardlaque (LangsLon 2006), (Ansarl and
!ohnson 1973). ue nombreux groupes s'lnLeressenL a ces sympLmes afln d'ldenLlfler les
paLlenLs a rlsques (WolLers, lrancoL eL al. 2000), (1olosa, CompLa eL al. 2007), (lwanaga,
Wakabayashl eL al. 1999). Mals la non-speclflclLe de ces sympLmes eL les dlfferenLes
speclallLes medlcales que requlerL leur prlse en charge, rendenL dlfflclles le rapprochemenL
avec une maladle neurodegeneraLlve.
!usqu'a presenL, le dlagnosLlc de la M ne peuL Lre pose que LardlvemenL, apres une
degenerescence d'au molns 60 des neurones dopamlnerglques eL la manlfesLaLlon
cllnlque de sympLmes moLeurs caracLerlsLlques mals non speclflques. CeLLe non speclflclLe
des sympLmes va Lre a l'orlglne d'un mauvals dlagnosLlc dans 10 a 23 des cas eL d'une
prlse en charge du paLlenL lnadapLee. 1anL qu'll reposera sur ces sympLmes moLeurs, le
dlagnosLlc de la M ne pourra en aucun cas Lre precoce , eL [usqu'a presenL les sympLmes
premoLeurs observes chez des paLlenLs parklnsonlens plusleurs annees avanL l'apparlLlon
des sympLmes moLeurs sonL Lrop peu speclflques pour Lre uLlllses en LanL que
blomarqueurs dlagnosLlques de la M. C'esL pourquol ll esL prlmordlal de comprendre les
mecanlsmes moleculalres declencheurs de la degenerescence afln d'ldenLlfler des
blomarqueurs lnLlmemenL assocles aux causes eL deLecLables au debuL de la maladle.
L'ldenLlflcaLlon de Lels blomarqueurs permeLLralL une prlse en charge precoce des paLlenLs
mals aussl le developpemenL de nouvelles LherapeuLlques, aglssanL dlrecLemenL sur
l'eLlologle moleculalre de la maladle, eL donc capables de sLopper le processus de
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degenerescence sur lequel les LralLemenLs sympLomaLlques acLuellemenL proposes sonL
lnefflcaces (Slngh, lllay eL al. 2007).

I|gure 4: Les d|ffrentes phases de |a M.
S. Conc|us|ons
La recherche sur les mecanlsmes moleculalres, a l'orlglne des formes sporadlques de la M
suggere l'lmpllcaLlon d'un sLress oxydaLlf accru, d'un dysfoncLlonnemenL mlLochondrlal ou
d'une alLeraLlon du sysLeme de degradaLlon des proLelnes dans la degenerescence
dopamlnerglque. L'alLeraLlon de ces foncLlons cellulalres va enLralner l'oxydaLlon eL
l'accumulaLlon de cerLalnes proLelnes au seln des neurones de la Snc, falsanL de la M une
maladle assoclee a une modlflcaLlon de l'expresslon eL de l'eLaL foncLlonnel des proLelnes.
!usqu'a presenL les eLudes se sonL prlnclpalemenL focallsees sur la caracLerlsaLlon clblee
d'un de ces mecanlsmes sans pour auLanL reusslr a decrypLer les evenemenLs moleculalres
responsables de la degenerescence dans les formes sporadlques de la M. Crce au
developpemenL de la specLromeLrle de masse, l'emergence de la proLeomlque (Aebersold
and Mann 2003) ces dlx dernleres annees permeL au[ourd'hul d'enLrevolr l'analyse d'un Llssu
ou d'un flulde blologlque sans clbler un mecanlsme moleculalre parLlculler mals en ayanL
une approche plus generale eL sans a prlorl. Ces approches permeLLralenL alnsl de soullgner
de nouveaux mecanlsmes moleculalres eL/ou de mleux caracLerlser ceux supposes a l'orlglne
de la maladle.
Mon Lravall de Lhese s'esL appuye sur ces Lechnlques de proLeomlque afln de vallder l'lnLerL
de nouvelles sLraLegles, basees sur l'uLlllsaLlon de mlcro/nanoLechnologles pour la
comprehenslon des mecanlsmes moleculalres assocles a la M.
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II. L'ana|yse protom|que par spectromtr|e de masse
1. La protom|que
lnLrodulL par Wllklns eL al (Wllklns, Sanchez eL al. 1996) en 1996, le Lerme proLeomlque
concerne l'eLude globale de l'expresslon des proLelnes d'une cellule ou d'un organlsme.
ComplemenLalre de la genomlque qul concerne l'eLude de l'expresslon des genes,
l'emergence de la proLeomlque provlenL du falL que la proLelne, produlL flnal du gene esL
plus represenLaLlve de la foncLlon d'une cellule que le gene lul-mme. L'analyse
proLeomlque esL dynamlque , un mme genome peuL condulre a dlfferenLs proLeomes selon
le conLexLe cellulalre. ue plus, les modlflcaLlons posL LraducLlonnelles que peuvenL sublr les
proLelnes (phosphorylaLlons, oxydaLlons, ublqulLlnaLlons, glycosylaLlons) eL qul lmpacLenL
forLemenL sur la slgnallsaLlon eL la regulaLlon cellulalre sonL unlquemenL accesslbles par des
approches proLeomlques. CependanL conLralremenL a la genomlque qul permeL au[ourd'hul
d'eLudler l'expresslon de la LoLallLe des 27 000 genes consLlLuanL le genome humaln, la
complexlLe du proLeome esLlmee a plus de 700 000 proLelnes dlfferenLes necesslLenL
dlfferenLes eLapes [usqu'a l'ldenLlflcaLlon eL la quanLlflcaLlon des proLelnes en specLromeLrle
de masse. Afln de repondre a ceL en[eu, dlfferenLs specLromeLres de masse onL eLe
developpes, uLlllsanL dlfferenLes sources d'lonlsaLlon des proLelnes, dlfferenLs analyseurs eL
dlfferenLs deLecLeurs. nous deLalllerons ceux qul onL eLe uLlllses au cours de ce Lravall.
2. La spectromtr|e de masse.
La specLromeLrle de masse esL une Lechnlque physlque d'analyse permeLLanL de deLecLer eL
d'ldenLlfler des molecules d'lnLerL par mesure de leur masse, eL de caracLerlser leur
sLrucLure chlmlque. A l'orlglne elle servalL a deLecLer eL separer les dlfferenLs lsoLopes d'un
elemenL. Le developpemenL de nouvelles Lechnologles auLour de la specLromeLrle de masse
a permls son essor dans le domalne blomedlcal, eL l'emergence de la proLeomlque cllnlque.
Le prlnclpe de la specLromeLrle de masse reslde dans la separaLlon en phase gazeuse de
molecules chargees (lons) en foncLlon de leur rapporL masse/charge (m/z).
Au[ourd'hul les specLromeLres de masse sonL consLlLues de 3 elemenLs ma[eurs (llgure 3) :
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Une source |on|que : vaporlse eL lonlse les molecules. lusleurs Lypes de sources exlsLenL eL
sonL uLlllsees en foncLlon du resulLaL recherche.
Un ana|yseur : separe les lons en foncLlon de leur rapporL m/z. Ces analyseurs peuvenL Lre
couples enLre eux pour reallser des experlences d'ldenLlflcaLlon proLelque en specLromeLrle
de masse en Landem (MS/MS). Ln general, un premler analyseur separe les lons, une cellule
de colllslon permeL de fragmenLer les lons, eL un second analyseur separe les lons
fragmenLs. CerLalns analyseurs, comme les pleges a lons ou le l1-lC8, consLlLuenL plusleurs
analyseurs en un eL permeLLenL de fragmenLer les lons eL d'analyser les fragmenLs
dlrecLemenL.
Le dtecteur : collecLe les lons en foncLlon de leur rapporL m/z eL ampllfle leur slgnal. Le
slgnal esL numerlse eL converLl en specLre de masse ou chaque plc esL represenLe par sa
masse eL son lnLenslLe relaLlve.
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,3'%2-')

llgure 3: rlnclpaux elemenLs d'un specLromeLre de masse
Ln proLeomlque, la pluparL des specLromeLres de masse sonL de Lypes LSl (LlecLroSpray
lonlsaLlon) ou MALul (MaLrlx AsslsLed Laser uesorpLlon lonlsaLlon) en reference a la source
lonlque uLlllsee.
1) Les sources d'|on|sat|on
a. L'|on|sat|on par |ectronbu||sat|on ou L|ectrospray (LSI) (Ienn, Mann et a|. 1989)
SouvenL couplee a la chromaLographle llqulde sur nano-colonne (nanoLC), ceLLe Lechnlque
d'lonlsaLlon esL uLlllsee en specLromeLrle de masse pour produlre des lons a parLlr de
compose en soluLlon. L'elecLrospray esL produlL par appllcaLlon d'un forL champ elecLrlque
sur un llqulde qul va se rompre pour former des gouLLeleLLes forLemenL chargees. un
couranL d'alr chauffe va provoquer l'evaporaLlon du solvanL conLenu dans ces gouLLeleLLes ,
leur denslLe de charge devenanL Lrop lmporLanLe, les gouLLeleLLes explosenL llberanL des
mlcrogouLLeleLLes conLenanL des molecules proLonees de l'analyLe (llgure 6).
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Introduction II : Lanalyse protomique par spectromtrie de masse.
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Chapitre 1

51

alors s`accumuler a son extrmit tandis que les anions vont effectuer un dplacement inverse
en s`accumulant a l`interieur du capillaire jusqu`a s`oxyder a sa surIace.

Figure 1.7 : Schma si mplifi du fonctionnement d'une source lectrospray (d'aprs [51])
Les cations vont tre attires par l`electrode negative (contre-lectrode) et les anions par
l`electrode positive (capillaire). La separation des charges va induire une deIormation du
liquide a l`extremite du capillaire, deIormation qui met en jeu un equilibre entre les Iorces
lectrostatiques (rpulsives) et la tension de surface (attractive) du liquide. Lorsque les forces
lectrostatiques atteignent la valeur de la tension de surface du liquide, la dformation est
conique et porte le nom de cne de Taylor . Une faible augmentation du champ lectrique
suffit alors pour dstabiliser le cne qui se rompt son extrmit, dispersant la solution en
nombreuses gouttelettes multicharges. Aprs cette tape, les gouttelettes se dplacent sous
l`inIluence du champ electrique.
x Processus d`evaporation du solvant et explosions coulombiennes
Les gouttelettes issues du cne de Taylor vont se deplacer vers l`interIace du
spectromtre de masse, entrer en collision avec le gaz rsiduel et subir une vaporation du
solvant alors que le nombre de charges reste constant. L`evaporation du solvant est Iavorisee
par la temperature souvent elevee du capillaire d`entree (180C). La dimension du rayon R
des gouttelettes possedant une charge constante q conduit a l`augmentation de la repulsion
lectrostatique des charges a sa surIace jusqu`a atteindre la limite de stabilit de Rayleigh
donne par :
q
R
= 8 (
0
R
3
)
1/2
avec la tension superIicielle stabilisant la goutte,
0
la permittivit du vide et R le rayon de
densit de charge.
Cette quation donne les conditions pour lesquelles les forces de rpulsion
lectrostatique deviennent gales celles de la tension de surface. A partir de la limite de

I|gure 6: Schma s|mp||f| de |'|on|sat|on |ectrospray d'aprs (kebar|e 2000)
b. La dsorpt|on-|on|sat|on |aser ass|ste par matr|ce ou MALDI
lnLrodulLe en 1988 par karas eL Plllenkamp (karas and Plllenkamp 1988)!"#$"%&'()*+",-./0"
!"#$%$&'()(*+,-#.'/(,-($01$&-#!'()(-#-,2$'/()(0#'($",0&%"#(3'(4'&%&'$(*",+!0,'$("/.-#%50'$6(
appelee maLrlce. un falsceau laser pulse esL uLlllse pour desorber eL lonlser le melange
maLrlce/echanLlllon cocrlsLalllse sur une surface meLalllque, la clble. Les molecules de
maLrlce absorbenL l'energle Lransmlse par le laser sous forme de phoLons uv, s'exclLenL eL
s'lonlsenL. L'energle absorbee par la maLrlce provoque sa dlssoclaLlon eL son passage en
phase gazeuse. Les molecules de maLrlce lonlsees LransferenL leur charge a l'echanLlllon. Llle
condulL a la formaLlon d'lons mono eL mulLlcharges (llgure 7).

I|gure 7: Schma s|mp||f| de |'|on|sat|on MALDI.
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une varlanLe du MALul decrlLe par PuLchens eL ?lp (PuLchens and ?lp 1993) esL le Surface
Lnhanced Laser uesorpLlon-lonlzaLlon ou SLLul (SelberL, Wlesner eL al. 2004). Le prlnclpe eL
l'orlglnallLe du SLLul resldenL dans les surfaces d'afflnlLe sur barreLLes permeLLanL la capLure
speclflque de clbles proLelques en foncLlon de leur caracLere physlco-chlmlque. Les surfaces
de capLure proposees offrenL des proprleLes mulLlples qul vonL de la chromaLographle
classlque (hydrophobe, hydrophlle, anlonlque, caLlonlque, afflnlLe aux meLaux) aux
lnLeracLlons blochlmlques (anLlcorps, recepLeurs, acldes nuclelques) (llgure 8).

I|gure 8: Schma d'une barrette SLLDI et des d|ffrentes surfaces d'aff|n|t.
Ces surfaces vonL permeLLre un fracLlonnemenL de l'echanLlllon eL la capLure d'un sous
proLeome qul sera analyse par specLromeLrle de masse Lype MALul. L'avanLage ma[eur du
SLLul esL assocle aux eLapes de lavage des surfaces chromaLographlques qul permeLLenL
l'uLlllsaLlon de Lampons normalemenL lncompaLlbles avec les meLhodes classlques de
specLromeLrle de masse. CependanL la quanLlflcaLlon des proLelnes eL la reproducLlblllLe de
ceLLe Lechnologle sonL forLemenL crlLlquees (AlbreLhsen 2007). ue plus, le SLLul ne permeL
pas l'ldenLlflcaLlon des proLelnes d'lnLerL.
2) Les ana|yseurs
1ouL comme ll exlsLe dlfferenLes sources d'lonlsaLlons, ll exlsLe dlfferenLs Lypes d'analyseurs,
classe en 2 caLegorles:
Les ana|yseurs fa|sceaux d'|ons comme les quadrlples eL les analyseurs a Lemps de vol
(1Cl).
Les ana|yseurs p|geage d'|ons comprenanL l'analyseur par resonance cycloLronlque d'lons
a Lransformee de lourler (l1-lC8), l'CrblLrap eL le plege lonlque llnealre.
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Ces analyseurs sonL dlfferenLs dans leurs mecanlsmes de separaLlon des lons eL leur
resoluLlon. La resoluLlon 8 represenLe la capaclLe de l'analyseur a separer deux composes de
m/z proche, eL esL donnee par 8=m/Am ou m correspond au rapporL m/z mesure eL Am a la
largeur du plc a ml-hauLeur. Cn parle de resoluLlon lWPM de l'anglals lull WldLh aL Palf-
Maxlmum peak helghL.
uans ce Lravall de Lhese, l'analyseur a Lemps de vol (1Cl) ou l'CrblLrap assocle en Landem au
plege lonlque llnealre (L1C-CrblLrap) onL prlnclpalemenL eLe uLlllses. lls sonL decrlLs dans la
parLle qul sulL.
a. L'ana|yseur temps de vo| ou 1CI
L'analyseur a Lemps de vol (1Cl) conslsLe a mesurer le Lemps que meL un lon, accelere par
une Lenslon elecLrlque a parcourlr une dlsLance donnee dans un Lube de vol. ll exlsLe deux
modes d'uLlllsaLlon de ceL analyseur. Ln mode llnealre (llgure 9), les lons sonL acceleres vers
le Lube de vol par une dlfference de poLenLlel appllquee enLre une elecLrode eL la grllle
d'exLracLlon. Les parLlcules accelerees ayanL LouLes la mme energle clneLlque passenL
ensulLe dans le Lube de vol, llbre de champ, ou elles sonL separees en foncLlon de leur
vlLesse acqulse. Les lons les plus legers (de rapporL m/z le plus peLlL) arrlvenL au deLecLeur
plus rapldemenL que les lons lourds. Ce mode de deLecLlon llnealre n'esL pas llmlLe en m/z
mals possede une falble resoluLlon (8=3000), ll esL parfalLemenL adapLe au profllage
proLelque d'echanLlllons sur proLelnes enLleres ayanL pour buL la classlflcaLlon hlerarchlque
des proflls en foncLlon de leur slmllarlLe dans un buL dlagnosLlque, prognosLlc ou predlcLlf en
cllnlque (Psleh 2008 classlflcaLlon). C'esL en mode llnealre que le 1Cl a eLe uLlllse dans ce
Lravall de Lhese, afln de vallder que noLre sLraLegle permeLLalL l'enrlchlssemenL des proflls
observes par rapporL a une slLuaLlon conLrle.

I|gure 9: 1ra[et d'un |on dans |'ana|yseur temps de vo| en mode ||na|re.
our des experlences ayanL pour buL l'ldenLlflcaLlon d'une proLelne, a parLlr de ses pepLldes
Lrypslques, ce mode llnealre n'esL pas assez resolu. Le mode reflecLron (llgure 10) permeL
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d'accrolLre la resoluLlon. Ln mode reflecLron, un mlrolr elecLrosLaLlque lmpose un champ
elecLrlque de dlrecLlon opposee a celle du champ acceleraLeur lnlLlal, eL donc du
mouvemenL des lons. ll permeL d'allonger la dlsLance de vol sans pour auLanL augmenLer la
Lallle de l'analyseur : les lons meLLenL plus de Lemps pour aLLelndre le deLecLeur, eL
redulsenL aussl leur dlsperslon en Lemps, la resoluLlon s'en Lrouve donc grandemenL
amelloree. lus resolu (8=20 000), ce mode esL cependanL llmlLe a des m/z allanL [usqu'a 10
000. ll esL donc plus adapLe a l'analyse de pepLldes.

I|gure 10: 1ra[et d'un |on dans |'ana|yseur temps de vo| en mode rf|ectron.
b. Le L1-Crb|trap
L'assoclaLlon en Landem du plege lonlque llnealre eL de l'orblLrap (Makarov, uenlsov eL al.
2006) esL commerclallsee par la socleLe 1hermo SclenLlflc sous le nom de L1C-CrblLrap
(llgure 11). CeL lnsLrumenL a eLe uLlllse pour LouLes les analyses MS/MS dans ce Lravall de
Lhese.
2
!"##$%&'()*
LTQ Orbitrap
LTQ FT Ultra
!"#$%&
&'"()*"+%&
,+-".+*/&
!"#$%&'(&')*+,-.&*)'/&*-'
)*+""&'01,2+1*&'
34,1-+#4,5'(2-40/+)+#4,'
64,7&,)*+#4,'(&-'14,-'
(+,-'0+'689*+"'

I|gure 11: hoto et schma s|mp||f| du L1-Crb|trap par 1hermo Sc|ent|f|c.
Au cours d'une analyse MS/MS, l'CrblLrap fournlL un specLre MS hauLe resoluLlon (8= 60
000), permeLLanL de deLermlner avec preclslon la masse des pepLldes qul seronL fragmenLes
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en MS/MS au nlveau du plege lonlque llnealre. endanL l'acqulslLlon de ce specLre MS hauLe
resoluLlon, 3 MS/MS consecuLlves de basse resoluLlon onL lleu dans le plege lonlque llnealre.
La preclslon en masse fournle par l'excellenLe resoluLlon de l'CrblLrap eL la rapldlLe du plege
lonlque a reallser des MS/MS, fonL du L1C-CrblLrap le specLromeLre de masse ldeal pour
l'ldenLlflcaLlon raplde eL exhausLlve des proLelnes conLenues dans un echanLlllon complexe.
lnLrodulL par Alexander Makarov (Makarov 2000), (Pu, noll eL al. 2003), l'CrblLrap esL
consLlLue d'une elecLrode exLerne creuse en forme de Lonneau coupe en deux, a l'lnLerleur
de laquelle esL placee une elecLrode en forme de fuseau (llgure 12). un champ elecLrlque
quadrl-logarlLhmlque esL malnLenu enLre les elecLrodes. Les lons sonL ln[ecLes de manlere
LangenLlelle par l'lnLersLlce separanL les deux molLles de l'elecLrode exLerne. Les lons se
meLLenL alors a osclller en orblLe de l'elecLrode cenLrale eL a chaque passage devanL
l'elecLrode exLerne, lls generenL des couranLs lndulLs sur lesquels esL appllquee une
Lransformee de lourler permeLLanL d'acceder aux m/z.

I|gure 12: hoto d'un Crb|trap et schma de |a tra[ecto|re des |ons autour de |'|ectrode centra|e.
Le plege lonlque llnealre (llgure 13) esL un analyseur consLlLue de quaLre barres comme
pour un quadrlple, ferme par une elecLrode d'enLree eL une elecLrode de sorLle,
permeLLanL de conserver les lons a l'lnLerleur du quadrlple en appllquanL des Lenslons
conLlnues poslLlves pour pleger les lons poslLlfs, eL negaLlves pour pleger les lons negaLlfs.
Les lons effecLuenL des allers reLours enLre les elecLrodes Lermlnales sulvanL z, eL
slmulLanemenL osclllenL dans le plan xy par appllcaLlon d'une Lenslon radlofrequence sur les
barres du quadrlple, ce qul a pour effeL de creer un champ quadrlpolalre. uans un plege
lonlque, les lons de dlfferenLes masses sonL presenLs slmulLanemenL, eL on cherche a les
expulser en foncLlon de leur masse en falsanL appel a des frequences de resonance. Le plege
lonlque llnealre uLlllse dans ce Lravall de Lhese expulse de manlere radlale les lons, a Lravers
des fenLes creusees dans deux barres opposees du quadrlple, en appllquanL une Lenslon
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alLernaLlve adapLee sur ces deux barres. un deLecLeur esL place a la sorLle de ces fenLes
permeLLanL d'acquerlr le specLre MS.
uans le cas d'un plege lonlque, l'analyse par MS/MS ne repose pas sur des reglons dlsLlncLes
de l'apparell mals sur des sequences successlves au seln de la mme encelnLe. La selecLlon
des Lenslons alLernaLlves appllquees aux elecLrodes permeL de conserver dans le plege que
les lons d'une masse cholsle eL d'expulser du plege Lous les auLres. Apres exclLaLlon, les lons
precurseurs selecLlonnes vonL se fragmenLer au cours du Lemps, vla des colllslons mulLlples
avec les aLomes d'hellum presenLs dans le plege. Les lons fragmenLs produlLs sonL ensulLe
expulses eL deLecLes pour donner le specLre MS/MS.


l'introduction des ions dans le quadriple, le long de l'axe des z. Ces facteurs conjugus
augmentent considrablement la sensibilit.
Les deux instruments auxquels nous avons eu recours pour nos
exprimentations oprent avec des modes d'expulsion des ions diffrents :

- L'jection radiaIe des ions : alternativement, les ions sont expulss
radialement travers des fentes creuses dans deux barres opposes du
quadriple, en appliquant une tension alternative adaptes sur ces deux
barres (deux dtecteurs sont utiliss). C'est le cas du LTQ XL
TM
Linear Ion
Trap (Thermo-Finnigan).

- L'jection axiaIe des ions : les ions sont expulss axialement suivant z, en
utilisant les effets de champs l'extrmit du pige, en appliquant une tension
alternative approprie entre les barres du quadriple et l'lectrode de sortie.
C'est le cas du 4000 Q-TRAP
TM
(AppIied Biosystems).

2. Le pige Iinaire jection radiaIe LTQ XL
TM


L'jection radiale travers des fentes (30 x 0.25 mm) creuses dans les deux barres
opposes a t dcrite pour la premire fois par Senko et Schwartz de Thermo Finnigan en
2002 (Schwartz et al., 2002) (figure .21). Les dtecteurs sont placs hors axe la sortie des
fentes comme le montre le schma.


Figure III.21. Pige ionique Iinaire jection radiaIe (www.thermo.com).

L'efficience de la capture des ions l'injection est de 55 70 % contre seulement
5 % pour un pige classique 3D. Le gaz tampon est de l'hlium. A la vitesse de balayage de
27 Th/sec, m est de 0,05 m/z 1520, correspondant une rsolution de 30 000 FWHM. La
capacit en ions est d'environ 20 000, soit 40 fois plus qu'un pige ionique classique. Nous
99
!"
#"
$"

I|gure 13: Schma d'un p|ge |on|que ||na|re [ect|on rad|a|e par 1hermo Sc|ent|f|c.
L'emergence de la proLeomlque cllnlque ces dernleres annees a permls le developpemenL de
nombreux specLromeLres de masse dlfferenLs par leur source d'lonlsaLlon eL/ou leurs
analyseurs. Ces dlfferences vonL lmpacLer sur la gamme de m/z vlslble, la meLhode de
separaLlon des lons, la preclslon des masses eL la resoluLlon des specLres obLenus. Ln
foncLlon des besolns de l'experlmenLaLeur, l'uLlllsaLlon d'un specLromeLre de masse en
parLlculler sera plus adequaLe. uans ce Lravall de Lhese qul avalL pour buL la valldaLlon de
nouveaux ouLlls pour l'analyse proLeomlque du Llssu eL des fluldes blologlques, nous avons
uLlllse un MALul-1Cl-MS pour evaluer l'efflcaclLe de ces ouLlls sur la capLure proLelque eL
leur lnLerL pour le profllage proLelque, eL un L1C-CrblLrap pour vallder leur efflcaclLe eL
reproducLlblllLe de capLure a Lravers l'ldenLlflcaLlon eL la quanLlflcaLlon relaLlve des proLelnes
capLees.

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3. Les d|ffrentes tapes de |'ana|yse protom|que en
spectromtr|e de masse.
AvanL son lnLroducLlon dans le specLromeLre de masse, l'echanLlllon dolL Lre preleve eL
conserve dans de bonnes condlLlons afln d'evlLer la degradaLlon des proLelnes. ues eLapes
supplemenLalres de separaLlon des proLelnes en foncLlon de leurs proprleLes physlco-
chlmlques sonL egalemenL lndlspensables dans des experlences vlsanL a ldenLlfler les
proLelnes. Lnfln, l'analyse des specLres obLenus, vla des loglclels adapLes va permeLLre
l'ldenLlflcaLlon eL la quanLlflcaLlon relaLlve ou absolue des proLelnes presenLes dans noLre
echanLlllon.
our chacune de ces eLapes, dlfferenLes sLraLegles onL eLe developpees. La parLle qul sulL
decrlL les prlnclpales eL celles uLlllsees duranL mon Lravall.
1) L|m|ter |a dgradat|on de |'chant|||on
La flablllLe des resulLaLs obLenus en proLeomlque depend forLemenL des condlLlons de
prelevemenL eL de preparaLlon de l'echanLlllon, lesquelles dolvenL Lre preeLablles pour
assurer le maxlmum de reproducLlblllLe. ues la collecLe de l'echanLlllon, les proLelnes
conLenues dans ce dernler dolvenL Lre proLegees de l'acLlvlLe des proLeases endogenes eL
exogenes , pour cela, une congelaLlon raplde du flulde blologlque ou du Llssu preleve, eL
l'uLlllsaLlon d'anLl-proLeases le [our de l'analyse proLeomlque, sonL essenLlelles. Le respecL
de ces condlLlons, qul necesslLe d'opLlmlser chaque eLape afln d'en assurer eL d'en faclllLer la
reallsaLlon, esL une bonne garanLle de debuLer une eLude sur un echanLlllon pas ou peu
degrade eL de pouvolr alnsl ldenLlfler un plus grand nombre de proLelnes.
2) Sparer |es prot|nes
uans des experlences de profllage proLelque sur proLelne enLlere en MALul-1Cl-MS,
l'echanLlllon va Lre dlrecLemenL lnLrodulL dans le specLromeLre de masse sans reelle eLape
de separaLlon des proLelnes. our des experlences ayanL pour buL l'ldenLlflcaLlon des
proLelnes conLenues dans des echanLlllons complexes comme le Llssu cerebral ou les fluldes
blologlques, une eLape de separaLlon des proLelnes basee sur leurs proprleLes physlco-
chlmlques esL lndlspensable.

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a. L'|ectrophorse b|d|mens|onne||e sur ge| (2-DL)
La 2-uL (C'larrell 1973) esL la meLhode de cholx pour separer les proLelnes pulsqu'elle
permeL la separaLlon de plusleurs mllllers de proLelnes d'un melange complexe en foncLlon
de 2 proprleLes dlfferenLes : le polnL lsoelecLrlque eL la masse moleculalre.
Apres la separaLlon des proLelnes eL leur coloraLlon, leur lnLenslLe revelee par un spoL va
Lre proporLlonnelle a leur quanLlLe relaLlve dans l'echanLlllon. Ln foncLlon du coloranL
uLlllse (8leu de Coomassle, nlLraLe d'argenL ou fluorescence), la senslblllLe de deLecLlon mals
aussl la gamme de llnearlLe quanLlLaLlve sera dlfferenLe (1ableau 2).
!"#$%&'(&'()%*%+,#-%. !%&'(&'(&"#')#-%. /-0-#'(&'(&"#')#-%. 1,00'(&'(*-.",+-#"
8leu de Coomassle ColorlmeLrle 10-100 ng 1-3
nlLraLe d'argenL ColorlmeLrle 1 ng as de llnearlLe
Cyanlnes lluorescence 0,1 ng 3-3

1ab|eau 2: Caractr|st|ques des mthodes de co|orat|on des ge|s d'|ectrophorse b|d|mens|onne||e.
ues avancees onL eLe reallsees avec la ulfference Cel LlecLrophoresls (ulCL) qul conslsLe en
l'uLlllsaLlon de sondes fluorescenLes permeLLanL de marquer les exLralLs proLelques avec des
sondes dlfferenLes eL de les charger sur un mme gel, amelloranL grandemenL la
reproducLlblllLe qul falL souvenL defauL aux Lechnlques classlques sur gels (Marouga, uavld
eL al. 2003).
La 2-uL offre la posslblllLe d'eLudler les varlaLlons d'abondance relaLlve dlrecLemenL sur gel
de chaque proLelne eL ce, sur des cenLalnes de proLelnes slmulLanemenL. Llle permeL aussl
de volr les modlflcaLlons posL-LraducLlonnelles, lesquelles vonL modlfler le polnL
lsoelecLrlque de la proLelne. Llle esL souvenL uLlllsee pour la comparalson d'echanLlllon de
mme naLure mals provenanL de deux groupes dlfferenLs (saln vs paLhologlque) afln de
quanLlfler sur gel des dlfferences d'expresslon proLelque. Apres avolr scanne les gels, un
loglclel va reperer les spoLs eL donc les proLelnes qul presenLenL une dlfference d'lnLenslLe
slgnlflcaLlve enLre les echanLlllons. L'ldenLlflcaLlon de la proLelne se fera par specLromeLrle
de masse : le spoL conLenanL la proLelne sera decoupe, la proLelne sera dlgeree a la Lrypslne
pour generer des pepLldes qul seronL ldenLlfles en MS par emprelnLe pepLldlque masslque,
ou en MS/MS par sequenage pepLldlque (llgure 14). CependanL, malgre une cerLalne
sLandardlsaLlon des proLocoles operaLolres, la 2-uL esL une meLhode lenLe, coLeuse, qul
demande beaucoup de maln d'ouvre. ue plus elle ne permeL pas une bonne separaLlon des
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proLelnes aux proprleLes physlco-chlmlques exLrmes (hauLemenL acldes/baslques,
hydrophobes, de peLlLe <7kua ou grande Lallle> 200kua).

I|gure 14: r|nc|pe de |'|ectrophorse b|d|mens|onne||e assoc|e |a spectromtr|e de masse.
b. Le SDS-AGL 1D coup| |a nanochromatograph|e ||qu|de phase |nverse (nano-LC)
une soluLlon alLernaLlve a la 2-uL pour la separaLlon des proLelnes a eLe le couplage du SuS-
ACL a la nanochromaLographle llqulde phase lnverse (llgure 13). La premlere eLape va
permeLLre la separaLlon des proLelnes sur gel SuS-ACL, en foncLlon de leur masse
moleculalre. Les reglons d'lnLerL sonL alors decoupees sur gel eL dlgerees a la Lrypslne. Les
pepLldes exLralLs de ces dlgesLlons sonL ensulLe separes en foncLlon de leur hydrophoblclLe
par nano-LC sur nano-colonne de phase lnverse de Lype C18. lls sonL enfln lnLrodulLs dans un
specLromeLre de masse pour analyse eL ldenLlflcaLlon par MS/MS. Le couplage reussl de la
nano-LC a la specLromeLrle de masse (Capplello, lamlgllnl eL al. 2003) (MS) en falL une
meLhode de cholx pour l'analyse du proLeome. Ln effeL, la connexlon de ces deux
plaLeformes permeL un LralLemenL auLomaLlse a Lravers l'ln[ecLlon dlrecLe dans le
specLromeLre de masse des pepLldes elues de la nano-colonne. CeLLe sLraLegle a eLe adopLee
pour separer les proLelnes conLenues dans nos echanLlllons.
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!"#$%&'()*+,-%"./$)
proteins from complex biological samples that additionally
requires minute amounts of sample (femtomole to attomole)
(Godovac-Zimmermann & Brown, 2001; Aebersold & Mann,
2003). Its combination with the unique resolving power of 2-
DGEand in-gel trypsin digestion enables quantitative expression
proling of large sets of complex protein mixtures, based on
large-scale gel analysis (Gorg, Weiss, & Dunn, 2004). 2-DGE,
the most popular tool to explore neurodegenerative disorders,
remains an efcient technique that allows not only a screening for
abundant-protein changes in various diseases, but also for
alterations in metabolic pathways. The major advantage of
2-DGElies in its potential to simultaneously resolve thousands of
proteins, at the same time revealing their MW, pI, and reecting
changes in protein expression and isoforms. However, one should
remember that a signicant number of spots on a gel probably
consist of more than one protein. The notable strength of the
system is the capability to identify PTMs and to omit the
limitations of immunochemical detection methods (Castegna
et al., 2002). Approaches that took advantage of 2-DGE proling
and MS analysis were applied to identify oxidized proteins in AD
(Castegna et al., 2002, 2003 Korolainen et al., 2002) and to nd
alterations in the expression of proteins linked to apoptosis and
neuronal death that could contribute to neurodegenerative
disorders (Tilleman et al., 2002). 2-DGE was also applied to
identify alterations in proteins associated with Down syndrome
(Engidawork &Lubec, 2003), Huntingtons disease (HD) (Zabel
FIGURE 6. Consecutive steps during discovery of bioactive sequences.
FIGURE 7. Different strategies for proteomic studies.
&
DRABIK ET AL.
438 Mass Spectrometry Reviews DOI 10.1002/mas
luc.camoin@inserm.fr 11/09
E--G--V--N--D--N--E--E--G--F--F--S--A--R
Analyse structurale par SM/SM Analyse structurale par SM/SM
y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 b13 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 b13
M M+ +
1570,73 1570,73
1600 1600 1000 1000 500 500 100 100
m/z m/z
% %
b2 b2
187,1 187,1 b3 b3
b4 b4 b5 b5 b7 b7
y12 y12
1384,7 1384,7
y11 y11
1285,6 1285,6 y10 y10
1171,5 1171,5
y9 y9
1056,5 1056,5
y8 y8
942,4 942,4
y7 y7
813,4 813,4
y6 y6
684,3 684,3
y5 y5
627,3 627,3
y4 y4
480,2 480,2
y3 y3
333,2 333,2
y2 y2
246,1 246,1
V N D
N
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G
F
F
S
E
01-2+2&'()%/+)#$3)450!056789)
01-2+2&'():$%)-$-&:$%)
-2+)(2('5;<)
01./$(=2#$):$%)-$-&:$%)
-2+)>0?>0)
!1@'/-2#$)
:$%)A2(:$%)
Approche globale : Analyse diffrentielle par comparaison de
listes de protines : Absence/prsence
!"#$%&
'()*+,$-.+,)/0)/
-"11)
2'32'
%$45*5)6/07"#"681)/
"9+$-"+5:9)
gi|4503747 filamin B, beta (actin binding protein
gi|4503745 filamin A, alpha (actin-binding protein
gi|12667788 myosin, heavy polypeptide 9, non-mu
gi|4507907 von Willebrand factor precursor; Coa
gi|14916725 Talin 1
gi|4557597 filamin C, gamma (actin-binding prot
gi|1346640 Cellular myosin heavy chain, type B (N
2'32'
gi|1362789 DNA-activated protein kinase, catalyt
gi|4505877 plectin 1, intermediate filament bindin
gi|16933542 fibronectin 1 isoform1 preproprotein
gi|4507195 spectrin, beta, non-erythrocytic 1 isofo
gi|4758012 clathrin heavy chain; clathrin, heavy p
gi|10834587 fer-1 like protein 3 [Homo sapiens]
gi|4506787 IQ motif containing GTPase activatin
gi|4758294 glutamyl-prolyl tRNA synthetase; glut
gi|1345959 Fatty acid synthase
gi|7512790 hypothetical protein DKFZp564P0562
gi|1170510 Eukaryotic translation initiation facto
gi|2135874 p53-binding protein 1 - human (fragm
gi|1346682 Nestin
gi|6681259 multimerin [Homo sapiens]
gi|10436768 unnamed protein product [Homo sap
gi|18105007 carbamoylphosphate synthetase 2/asp
gi|280833 Myl protein human
i|7304875 l h 2 HS l t i [M l
Echantillon 1
Liste 1
Li t 2
&$-(","51$#/0)1/651+)1
Echantillon 2
Liste 2

I|gure 1S: r|nc|pe du SDS-AGL 1D coup| |a nano-chromatograph|e ||qu|de.
3) Ident|f|er |es prot|nes
L'accumulaLlon des donnees specLrales ne permeL pas a elle seule d'ldenLlfler les proLelnes.
ll fauL ensulLe LralLer ces specLres afln d'ldenLlfler les proLelnes d'ou les pepLldes LrypLlques
sonL lssus en lnLerrogeanL les banques de donnees selon une approche dlLe boLLom-up ,
c'esL a dlre une approche uLlllsanL une serle d'ldenLlflcaLlons de fragmenLs de la proLelne,
qul apporLenL chacun une lnformaLlon speclflque pour l'ldenLlflcaLlon eL la caracLerlsaLlon
globale de la proLelne eLudlee. Sl le genome de l'organlsme eLudle esL dlsponlble dans les
banques de donnees proLelques, l'approche epLlde Mass llngerprlnLlng ou emprelnLe
pepLldlque masslque sera envlsagee , dans le cas d'un organlsme non reference ou ayanL
subl des muLaLlons, une analyse MS/MS permeLLanL d'obLenlr une parLle de la sequence des
pepLldes analyses sera favorlsee.
a. L'empre|nte pept|d|que mass|que (app|n, no[rup et a|. 1993), (Cottre|| 1994)
Le prlnclpe de ceLLe approche peuL Lre decrlL de la faon sulvanLe : les fragmenLs LrypLlques
obLenus experlmenLalemenL sonL analyses par MS afln de generer une llsLe de masse des
pepLldes presenLs dans l'echanLlllon. CeLLe llsLe esL comparee aux llsLes de masses
Lheorlques obLenues par dlgesLlon !"# $!%!&' des proLelnes presenLes dans les banques de
donnees (SwlssroL, nC8l) grce a des loglclels speclflques (MascoL, rospecLor, rofound).
Ln foncLlon du nombre de pepLldes ldenLlfles, de l'ecarL de masse experlmenLale eL
Lheorlque eL du pourcenLage de recouvremenL de la sequence proLelque, la proLelne pourra
Lre ldenLlflee (llgure 16).
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Introduction II : Lanalyse protomique par spectromtrie de masse.
21

I|gure 16: L'empre|nte pept|d|que mass|que.
neanmolns l'ldenLlflcaLlon par ceLLe sLraLegle peuL echouer en cas de modlflcaLlons posL-
LraducLlonnelles, d'un recouvremenL lnsufflsanL de la sequence proLelque ou d'absence de la
proLelne des banques de donnees. La presence de plusleurs proLelnes, dans l'echanLlllon
analyse, va aussl compllquer les ldenLlflcaLlons , d'ou l'lmporLance d'une separaLlon
prealable.
Ln cas d'lmposslblllLe d'ldenLlflcaLlon, un sequenage pepLldlque par specLromeLrle de
masse en Landem (MS/MS) sera lndlspensable afln d'ldenLlfler la proLelne.
b. Le squenage pept|d|que par MS]MS (ates, Lng et a|. 199S)
Lorsque l'approche MS ne permeL pas d'ldenLlfler les proLelnes a parLlr des pepLldes
proLeolyLlques, ll esL posslble de selecLlonner les pepLldes d'lnLerL eL de les sequencer par
une seconde MS. Les pepLldes selecLlonnes enLrenL alors dans une cellule de colllslon ou leur
renconLre avec des molecules de gaz neuLre va permeLLre leur fragmenLaLlon prlnclpalemenL
au nlveau des llalsons pepLldlques, generanL deux Lypes de fragmenLs (ou lons car charges
poslLlvemenL). Les fragmenLs b qul conLlennenL la parLle n-Lermlnale du pepLlde fragmenLe
eL les fragmenLs y qul conLlennenL la parLle C-Lermlnale. La dlfference de masse enLre deux
fragmenLs consecuLlfs de mme Lype (b ou y) sur le specLre MS/MS correspond donc a la
masse d'un aclde amlne. L'lnLerpreLaLlon des specLres MS/MS esL relaLlvemenL alsee grce
aux ouLlls lnformaLlques dlsponlbles (llgure 17). Ln effeL, de la mme manlere qu'll exlsLe
des loglclels de recherche pour comparer les llsLes de masses pepLldlques Lheorlques eL
experlmenLales, ll exlsLe aussl des ouLlls lnformaLlques qul comparenL la llsLe des masses des
fragmenLs pepLldlques obLenus avec les llsLes de masses Lheorlques, ou encore des moLeurs
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Introduction II : Lanalyse protomique par spectromtrie de masse.
22
de recherche capable de foncLlonner avec une lnformaLlon de sequence parLlelle, appelee
pepLlde sequence Lag (Mann and Wllm 1994).

I|gure 17: Le squenage pept|d|que par MS]MS.
4) uant|f|er |es prot|nes.
uLlllsee en cllnlque dans le buL de meLLre en evldence des dlfferences d'expresslon
proLelque dans dlfferenLes paLhologles, la specLromeLrle de masse esL devenue un ouLll
pulssanL pour la quanLlflcaLlon des proLelnes grce a sa hauLe senslblllLe, sa rapldlLe
d'execuLlon eL sa speclflclLe. 8len qu'une quanLlflcaLlon relaLlve par denslLomeLrle pulsse
Lre reallsee sur les gels 2u, elle resLe molns senslble eL llmlLee aux proLelnes accesslbles par
ceLLe Lechnlque excluanL par exemple les proLelnes mlnorlLalres, baslques, acldes ou
hydrophobes.

a. La quant|f|cat|on par marquage |sotop|que.
C'esL pourquol des Lechnlques de marquage chlmlque lsoLoplque comme l'lsoLope Coded
AfflnlLy 1ag (lCA1) (Cygl, 8lsL eL al. 1999), (Shllo and Aebersold 2006), l'lsobarlc 1ag for
8elaLlve and AbsoluLe CuanLlLaLlon (l18AC), (Wlese, 8eldegeld eL al. 2007) (Wu eL al 2006),
le SLable lsoLope Labelllng by Amlno acld ln Cell CulLure (SlLAC) (Cng, 8lagoev eL al. 2002)
(Clu eL Wang 2008) ou encore la meLhode AbsoluLe CuanLlflcaLlon (ACuA) (Cygl, 8lsL eL al.
1999), onL eLe developpees en vue de quanLlfler les proLelnes par specLromeLrle de masse.
8len qu'elles solenL performanLes eL preclses, ces approches, uLlllsanL des marquages
lsoLoplques, presenLenL plusleurs lnconvenlenLs Lels qu'un coL relaLlvemenL eleve eL
l'lmposslblllLe de comparer de grandes serles d'echanLlllons.
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Introduction II : Lanalyse protomique par spectromtrie de masse.
23
b. La quant|f|cat|on sans marquage ou |abe| free .
lus recemmenL, une Lechnlque sans marquage dlLe quanLlflcaLlon label free a eLe
lnLrodulLe (Wang, Wu eL al. 2006), (Cno, ShlLashlge eL al. 2006), elle presenLe un grand
lnLerL car elle permeL une quanLlflcaLlon relaLlve flable des proLelnes conLenues dans un
nombre beaucoup plus grand d'echanLlllons LouL en redulsanL conslderablemenL les coLs
d'analyse. CeLLe Lechnlque a eLe prlvlleglee dans ce Lravall de Lhese sulLe a noLre
collaboraLlon eLrolLe avec le laboraLolre du ur 8ernard MonsarraL a 1oulouse.
La quanLlflcaLlon label free se base sur la comparalson des lnLenslLes des slgnaux MS
deLecLes lors de l'analyse lndlvlduelle de chaque echanLlllon. L'analyse des donnees MS
conslsLe a uLlllser comme polnL de deparL les resulLaLs d'ldenLlflcaLlon MS/MS. A parLlr de
ces resulLaLs d'ldenLlflcaLlon valldes, les slgnaux MS des pepLldes sonL exLralLs sous forme
d'un couranL lonlque ou xlC (LxLracLed lon ChromaLogram). L'alre sous la courbe du plc
chromaLographlque esL le xlC eL elle esL proporLlonnelle a l'abondance du pepLlde dans
l'echanLlllon (Cng and Mann 2003). CeLLe meLhode conslsLe donc a exLralre l'lnLenslLe du
slgnal pour chaque pepLlde ldenLlfle, de m/z connu. La quanLlflcaLlon esL reallsee en
comparanL les xlC des pepLldes au seln des dlfferenLs echanLlllons.
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kLSUL1A1S
art|e I
Dve|oppement d'une stratg|e pour |'ana|yse
protom|que du t|ssu crbra|! "#! $"$%&
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Rsultats I : La SCP : une opportunit pour lanalyse protomique du cerveau vivant.
24
I. La st|mu|at|on crbra|e profonde : une opportun|t
pour |'ana|yse protom|que du cerveau "#!$"$%.
1. Introduct|on
1) L'ana|yse protom|que du t|ssu crbra| post-mortem dans |a M.
Crce au developpemenL exponenLlel de la specLromeLrle de masse, la proLeomlque s'esL
revelee Lre un ouLll pulssanL, lndlspensable a l'ldenLlflcaLlon eL a la quanLlflcaLlon des
proLelnes en vue de deLecLer des modlflcaLlons assoclees a un eLaL paLhologlque. Llle a
naLurellemenL susclLe l'lnLerL de nombreux groupes de recherche ayanL pour ob[ecLlf
l'analyse proLeomlque du cerveau humaln (Zhang, keene eL al. 2008), (Shl, Caudle eL al.
2009). Ln effeL, l'analyse proLeomlque du cerveau humaln esL la premlere eLape vers la
comprehenslon de la sLrucLure eL de la foncLlon cerebrale. ConLralremenL a la pluparL des
organes du corps humaln, le cerveau esL hauLemenL organlse sLrucLurellemenL eL chaque
sLrucLure esL assoclee a une foncLlon speclflque. CeLLe speclflclLe foncLlonnelle des
sLrucLures expllque la vulnerablllLe de reglons cerebrales blen dlsLlncLes dans les dlfferenLes
maladles neurodegeneraLlves. L'analyse proLeomlque de ces reglons paLhologlques esL en
en[eu ma[eur a la comprehenslon des mecanlsmes moleculalres assocles a la
degenerescence. CependanL l'acces dlfflclle au Llssu cerebral !"# (!(' eL l'lnvaslvlLe des
blopsles llmlLenL acLuellemenL ces eLudes au sLade posL-morLem.
La premlere eLude a s'Lre lnLeressee a l'analyse proLeomlque posL-morLem de la Snc dans
la M a eLe reallsee en 2004 par 8asso eL al (8asso, Clraudo eL al. 2004). uans ceLLe eLude,
les proLelnes exLralLes de la Snc de paLlenLs parklnsonlens eL de paLlenLs conLrles onL eLe
separees eL quanLlflees par 2-uL, eL ldenLlflees par MALul-1Cl-MS. CeLLe eLude a permls
l'ldenLlflcaLlon de 44 proLelnes donL 9 avec un Laux d'expresslon slgnlflcaLlvemenL dlfferenL
enLre les deux groupes. arml ces proLelnes, la surexpresslon de la peroxlredoxln ll (lang,
nakamura eL al. 2007), du complexe lll (ublqulnol cyLochrome c reducLase) eL v (A1
synLhase) de la mlLochondrle (Mlzuno, ?oshlno eL al. 1998), [ouanL LouLes les Lrols un rle
dans la regulaLlon du sLress oxydaLlf, a eLe observee dans le groupe paLhologlque, conforLanL
alnsl l'exlsLence d'un sLress oxydaLlf accru dans la M (!enner and Clanow 1996), (CrLh and
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Rsultats I : La SCP : une opportunit pour lanalyse protomique du cerveau vivant.
23
Schaplra 2002). SulLe a ceLLe eLude, d'auLres Lravaux s'lnLeressanL a l'analyse proLeomlque
de la Snc (Werner, Peyny-von Paussen eL al. 2008, Llcker, CoLe eL al. 2012) ou d'auLres
reglons cerebrales Lelles que le corLex fronLal (Shl, !ln eL al. 2008) ou le locus ceruleus (van
ul[k, 8erendse eL al. 2012) onL eLe publles. Ces dlfferenLes eLudes onL permls d'ldenLlfler de
nombreuses proLelnes presenLes dans ces reglons cerebrales, lnlLlanL alnsl une carLographle
proLelque de dlfferenLs noyaux du cerveau posL-morLem. Ln effeL, 1263, 1864 eL 2493
proLelnes dlfferenLes onL pu Lre respecLlvemenL ldenLlflees dans la Snc (klLsou, an eL al.
2008), le corLex fronLal (Shl, !ln eL al. 2008), eL le locus ceruleus (van ul[k, 8erendse eL al.
2012). Ln parallele, ces eLudes eL d'auLres onL mls en evldence des dlfferences d'expresslon
proLelque enLre le groupe parklnsonlen eL le groupe conLrle, conforLanL l'exlsLence, d'un
sLress oxydaLlf accru, d'un dysfoncLlonnemenL mlLochondrlal eL d'une alLeraLlon du
proLeasome, eL proposanL aussl de nouvelles proLelnes poLenLlellemenL lmpllquees dans la
paLhogenese de la M. C'esL le cas des eLudes de !ln eL )%*# (!ln, PuleLLe eL al. 2006), eL de
Llcker eL )%* (Llcker, CoLe eL al. 2012) qul onL respecLlvemenL demonLre la sous expresslon de
la morLallne mlLochondrlale, eL la surexpresslon de la Cnu2 (cyLosollc non speclflc
dlpepLldase 2) dans la Snc de paLlenLs parklnsonlens en posL-morLem. La conflrmaLlon de
ces resulLaLs par d'auLres eLudes sera necessalre avanL de s'lnLeresser a la foncLlon preclse
de ces proLelnes eL a leur lmpllcaLlon dans le processus degeneraLlf.
Ln resume, l'analyse proLeomlque du Llssu cerebral posL morLem dans la M a permls
d'lnlLler la carLographle proLelque du cerveau, a Lravers l'ldenLlflcaLlon des proLelnes
conLenues dans les dlfferenLes sLrucLures eLudlees. Llle a aussl permls de meLLre en
evldence des dlfferences d'expresslon proLelque llees a la M par des approches de
proLeomlque quanLlLaLlve. L'ldenLlflcaLlon de proLelnes de[a decrlLes comme
poLenLlellemenL assoclees a la paLhogenese de la maladle mals aussl la mlse en evldence de
nouvelles proLelnes Lelles que la morLallne eL Cnu2 onL conforLe l'lmpllcaLlon de processus
blologlques Lels que le sLress oxydaLlf eL le dysfoncLlonnemenL mlLochondrlal dans la
paLhogenese de la maladle.
Ces resulLaLs conflrmenL le forL poLenLlel de ceLLe approche eL ouvrenL la vole a l'analyse
proLeomlque d'auLres reglons cerebrales dlrecLemenL ou lndlrecLemenL affecLees, dans la
M, par la degenerescence dopamlnerglque de la Snc. Ln effeL, des eLudes
elecLrophyslologlques reallsees chez l'anlmal eL le paLlenL, onL monLre que la
degenerescence de la Snc dans la M enLraine une modlflcaLlon du foncLlonnemenL de la
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boucle moLrlce du clrculL des gangllons de la base, se LradulsanL par l'apparlLlon d'une
acLlvlLe elecLrlque neuronale anormale au seln des sLrucLures de ceLLe boucle (Cbeso,
8odrlguez-Croz eL al. 2008), (8landlnl, nappl eL al. 2000). Aussl, l'analyse proLeomlque de
ces noyaux donL l'acLlvlLe neuronale esL modlflee dans la M consLlLue un lnLerL ma[eur
afln d'eLabllr des proflls proLelques paLhologlques en complemenL des proflls
elecLrophyslologlques observes dans la M. Les lnformaLlons apporLees par la proLeomlque
vlendralenL alnsl compleLer les donnees d'elecLrophyslologle, de[a decrlLes dans la
llLLeraLure (8rown 2003) eL acqulses !"#(!(' chez l'humaln depuls plus de 20 ans, au cours de
la procedure chlrurglcale de sLlmulaLlon cerebrale profonde proposee comme LralLemenL
sympLomaLlque de la M (8enabld 2003).
2) La st|mu|at|on crbra|e haute frquence du noyau sous-tha|am|que dans |a M.
a. La procdure ch|rurg|ca|e
La sLlmulaLlon cerebrale profonde du noyau sous-Lhalamlque (S1n) a 130 Pz s'esL
rapldemenL lmposee comme le LralLemenL chlrurglcal de reference des sympLmes moLeurs
de la M (8enabld, Chabardes eL al. 2009). Llle conslsLe a dellvrer un couranL elecLrlque
conLlnu vla une elecLrode connecLee a un sLlmulaLeur exLerne, eL lmplanLee par chlrurgle
sLereoLaxlque dans le S1n.

I|gure 18: Loca||sat|on du S1N par ventr|cu|ograph|e, IkM et |ectrophys|o|og|e d'aprs 8enab|d et a|.
La Lra[ecLolre opLlmale pour aLLelndre le S1n esL deLermlnee par l8M eL venLrlculographle. 3
mlcroelecLrodes vonL permeLLre l'enreglsLremenL elecLrophyslologlque des reglons
cerebrales Lraversees, permeLLanL de se reperer [usqu'au S1n grce a la slgnaLure elecLrlque
speclflque des noyaux Lraverses (llgure 18). une sLlmulaLlon elecLrlque generee a la polnLe
de chacune des mlcroelecLrodes va deLermlner la zone du S1n la plus proplce a la
sLlmulaLlon, en se basanL sur l'aLLenuaLlon des sympLmes moLeurs eL les sensaLlons du
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paLlenL duranL ces eplsodes de sLlmulaLlon. Lnfln une elecLrode deflnlLlve esL placee dans
ceLLe zone du S1n, eL connecLee au sLlmulaLeur exLerne place sous la clavlcule du paLlenL
(llgure 19).
!

I|gure 19: Imp|antat|on des |ectrodes df|n|t|ves dans |e S1N et du st|mu|ateur en sous-c|av|cu|a|re.
Les parameLres de sLlmulaLlon sonL deLermlnes pour chaque paLlenL , lls peuvenL Lre
modlfles eL la sLlmulaLlon sLoppee a LouL momenL. La reverslblllLe lnsLanLanee eL l'acLlon Lres
locale de la sLlmulaLlon onL mulLlplle son lndlcaLlon eL la valldaLlon de son efflcaclLe dans
d'auLres noyaux, pour d'auLres paLhologles (erlmuLLer and Mlnk 2006). Alnsl, les
LremblemenLs essenLlels (Cndo, !ankovlc eL al. 1998), les dysLonles (vldallheL, vercuell eL al.
2003), les Lroubles obsesslonnels compulslfs (1CC) (MalleL, olosan eL al. 2008), eL cerLalnes
formes d'epllepsles (Chabardes, kahane eL al. 2002) peuvenL Lre aLLenues par la sLlmulaLlon
cerebrale profonde. LL au[ourd'hul plusleurs mllllers de personnes dans le monde
beneflclenL de ce LralLemenL sympLomaLlque donL les mecanlsmes d'acLlon demeurenL non
elucldes (MonLgomery and Cale 2008).
b. L'exp|orat|on |ectrophys|o|og|que du cerveau |n v|vo.
Ln plus des beneflces conslderables apporLes au paLlenL par la sLlmulaLlon cerebrale
profonde, l'exploraLlon elecLrophyslologlque !"# (!(' des gangllons de la base a revele de
precleuses lnformaLlons sur l'acLlvlLe elecLrlque de ces reglons, meLLanL en evldence des
dlfferences d'acLlvlLe des neurones d'une mme reglon selon la paLhologle. Ln effeL,
Sanghera eL )%* (Sanghera, Crossman eL al. 2003) demonLrerenL des dlfferences d'acLlvlLe
neuronale enLre le globus pallldus de paLlenLs dysLonlques eL parklnsonlens. ue la mme
manlere, lallaL eL )%* (lallaL, olosan eL al. 2011) mlrenL en evldence un Laux de decharge
augmenLe des neurones du S1n chez les paLlenLs parklnsonlens, compare aux neurones de
ce mme noyau chez les paLlenLs aLLelnL de 1CC. A l'lnsLar des eLudes elecLrophyslologlques
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Rsultats I : La SCP : une opportunit pour lanalyse protomique du cerveau vivant.
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qul onL soullgne des modlflcaLlons d'acLlvlLe, l'analyse proLeomlque des gangllons de la base
permeLLralL d'ldenLlfler des modlflcaLlons d'expresslon proLelque consecuLlves a la
degenerescence dopamlnerglque, aux dlfferenLs nlveaux de la boucle moLrlce. AcLuellemenL,
l'analyse proLeomlque du Llssu cerebral esL llmlLee au posL-morLem a des sLades Lres
avances de la maladle, rendanL dlfflclle l'ldenLlflcaLlon des premlers acLeurs moleculalres
responsables de la maladle. ue plus, des facLeurs pre eL posL morLem Lels que l'eLaL de
medlcaLlon, l'eLaL hypoxlque du cerveau eL le delal de prelevemenL vonL forLemenL lmpacLer
sur l'eLaL moleculalre du cerveau, augmenLanL eL dlmlnuanL l'expresslon de nombreuses
proLelnes (Pynd, Lewohl eL al. 2003), (Crecellus, CoLz eL al. 2008).
C'esL pourquol la proLeomlque devralL s'lnsplrer de l'elecLrophyslologle pour avolr une place
au bloc operaLolre eL analyser le cerveau vlvanL, a un sLade molns avance de la maladle que
celul observe dans les eLudes posL-morLem. Ln effeL, l'acces Lemporalre a des reglons
profondes du cerveau au cours de procedures chlrurglcales de plusleurs heures esL une
opporLunlLe unlque d'obLenlr une lnformaLlon moleculalre du cerveau !"# (!(',
s'affranchlssanL alnsl des llmlLes des eLudes posL-morLem. CependanL les blopsles Lrop
lnvaslves eL rlsquees dans des noyaux aussl peLlLs que le S1n ne sonL pas envlsageables.
Au cours de mon trava|| de thse, ['a| pu ass|ster de nombreuses |mp|antat|ons
d'|ectrodes dans |e S1N. Iuste avant |'|mp|antat|on de |'|ectrode df|n|t|ve, |e ch|rurg|en
|ntrodu|t un sty|et de gu|dage dont |'extrm|t |nterag|t br|vement avec |e S1N. I'a|
rcupr ces sty|ets au cours de d|ffrentes oprat|ons et va|u s| ce bref contact suff|sa|t
|'obtent|on d'une |nformat|on mo|cu|a|re reprsentat|ve du t|ssu crbra|.
2. Art|c|e 1
Deep bra|n st|mu|at|on |n ark|nson's d|sease: an opportun|ty for proteom|cs exp|orat|on
of subtha|am|c nuc|eus.
Aff|f 2accar|a, All 8ouamranl, ?ohann CouLe, ChrlsLophe 8ruley, !erme Carln, Lrlc
SelgneureL, Allm-Louls 8enabld, SLephan Chabardes, lranols 8erger.

Suppl daLa: hLLps://docs.google.com/folder/d/081ChvL-38pv8vuo4S3h[x08ulu/edlL
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Deep bra|n st|mu|at|on |n ark|nson's
d|sease: an opportun|ty for proteom|cs
exp|orat|on of subtha|am|c nuc|eus.
Afflf Zaccarla
1,
*, All 8ouamranl
1,2,
*, ?ohann CouLe
3,4,3
,
ChrlsLophe 8ruley
3,4,3
!erme Carln
3,4,3
, Lrlc SelgneureL
6
,
Allm-Louls 8enabld
2
, SLephan Chabardes
6
, lranols 8erger
1,2
.
1
Crenoble lnsLlLuLe neurosclences 8raln and nanomedlclne
Croup, lnserm u836, u!l, CPu, Crenoble, lrance.
2
CLA-LL1l CllnaLec, Crenoble, lrance.
3
CLA, l81Sv, 8lologle a Crande Lchelle, Crenoble, lrance.

4
lnSL8M, u1038, Crenoble, lrance.

3
unlverslLe !oseph lourler, Crenoble, lrance.

6
ueparLmenL of neurosurgery, CenLre PosplLaller
unlverslLalre, Crenoble, lrance.

* 1hese auLhors conLrlbuLed equally Lo Lhls work.
Abstract
1he emergence of proteom|cs ho|ds the prom|se of
s|gn|f|cant progress |n neuro|og|ca| d|seases. nowever,
||m|ted access to human bra|n t|ssues and the restr|ct|on to
post-mortem mater|a| |mpeded ear||er mo|ecu|ar
|nvest|gat|ons of d|sease-assoc|ated mechan|sms. L|ectrode
|mp|antat|on |n funct|ona| neurosurgery for deep bra|n
st|mu|at|on (D8S) |s an appropr|ate opportun|ty to have a
temporary access to cerebra| reg|ons |n ear||er stage of
d|sease. 1h|s study reports a un|que and va|uab|e
exp|orat|on of the S1N prote|n content through the
mo|ecu|ar ana|ys|s of t|ssue traces bound to the surg|ca|
sty|et used dur|ng e|ectrode |mp|antat|on |n a ark|nson's
d|sease context. An appropr|ate samp|e preparat|on |n the
surg|ca| room a||owed the |dent|f|cat|on of 13S3 d|fferent
prote|ns by nano-LC-MS]MS. 1he presence of prote|ns
a|ready descr|bed as |mp||cated |n neurodegenerat|ve
d|sorders and representat|ve of bra|n t|ssue under||es the
re|evance of such approach.
It prov|des an opportun|ty to perform mo|ecu|ar
exp|orat|ons on such fresh bra|n t|ssue f|ngerpr|nts from
d|fferent |mp|anted nuc|eus. 1he method, |mpos|ng no
add|t|ona| surg|ca| procedure, |s read||y trans|atab|e |n
rout|ne neurosurgery and may const|tute a s|gn|f|cant
comp|ement to post-mortem bra|n t|ssue bank|ng.

roLeomlcs has revealed lLself as a powerful Lool ln Lhe
ldenLlflcaLlon and quanLlflcaLlon of proLelns, and have
sLlmulaLed a greaL lnLeresL for Lhe analysls of Lhe human
braln proLeome ln healLhy and paLhologlcal sLaLe [1-3]. up
Lo now, Lhe physlcal conflnemenL of braln ln Lhe skull has
llmlLed deep braln nucleus Lo posL-morLem proLeomlc
analysls [4-8]. AlLhough Lhese sLudles permlLLed Lo correlaLe
varlous blologlcal paLhways Lo neurologlcal dlsorders, Lhe
resulLs ofLen derlved from a very laLe sLage of Lhe dlsease
and dldn'L conslder medlcaLlon, posL morLem and agonal
sLaLe of braln [9]. lL has been reporLed LhaL posLmorLem-
relaLed facLors, as well as agonal condlLlons, generaLe
slgnlflcanL changes ln proLelns and m8nA expresslon and
degradaLlon [10,11]. 1hese modlflcaLlons are relaLed Lo
oxldaLlve sLress, mlLochondrlal funcLlons or lnflammaLlon,
hence affecLlng Lhe ma[or molecular paLhways descrlbed ln
several neuropaLhologles. ln addlLlon, posLmorLem samples
generally derlved from advanced dlsease sLages, llmlLlng
mosL flndlngs Lo laLe molecular evenLs of Lhe paLhology.
AvallablllLy of fresh braln Llssues aL Lhe Llme of Lhe dlsease
progresslon would greaLly lmprove Lhe slgnlflcance of poly-
omlcs exploraLlons, provldlng a valuable lnslghL lnLo Lhe
paLhologlcal mechanlsms. 1he lmplanLaLlon of elecLrode for
deep braln sLlmulaLlon (u8S) has become one of Lhe mosL
growlng flelds ln funcLlonal neurosurgery [12,13]. 1he
surglcal procedure LhaL Lakes several hours offers a
Lemporary access Lo deep nucleus ln well-sulLed condlLlons
and has permlLLed Lo beLLer undersLand Lhe elecLro-
physlopaLhologlcal behavlor of basal ganglla, lnvolved ln
neurologlcal and psychlaLrlc dlseases [14-16]. Cnce Lhe
opLlmal locaLlon ls deLermlned, Lhe neurosurgeon uses a
sLyleL Lo prepare Lhe paLh for Lhe deflnlLlve-elecLrode
lmplanLaLlon.
ln Lhls sLudy, we have Laken advanLage of a brlef conLacL
wlLh Lhe lmplanLed subLhalamlc nucleus (S1n) of arklnson's
dlsease (u) paLlenLs Lo exLracL fresh molecular lnformaLlon
from a, usually Lhrown ouL, surglcal sLyleL (llgure 1).
WlLh no addlLlonal lnLervenLlon Lo Lhe surglcal procedure,
an approprlaLe sample preparaLlon ln Lhe surglcal room
allowed (l) Lhe followlng ldenLlflcaLlon of 1333 dlfferenL
proLelns from Lhe S1n reglon by nano-LC-MS/MS. 1he
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ldenLlflcaLlon of proLelns llnked Lo neurodegeneraLlve
processes and represenLaLlve of braln Llssue conflrmed an !"#
$!$% access Lo Lhe braln proLeome.
Proteome
analysis
SEM analysis
The stylet is extracted
and
washed in saline
Lysis buffer
for proteins extraction
The stylet is cut
in a tube to recover
the part wish was
in contact with
the tissue target
2 m

!"#$%&'()'*+,&-./"+'0%"1+"02&'34'/,&'*56'4"1#&%0%"1/'0%3+&7$%&'43%'
0%3/&3-"+8' "19&8/"#./"318:' 5,&' $00&%' "-.#&' %&0%&8&1/8' /,&' 4"9&'
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/,&'+3%%&80317"1#'2<8"8'>$44&%'43%'0%3/&"1'&?/%.+/"31:'
Puman Llssue samples were collecLed from Lwo paLlenLs
sufferlng from severe u and who have been offered
bllaLeral S1n u8S LreaLmenL ln Crenoble PosplLal. aLlenLs
gave clear lnformed consenL Lo parLlclpaLe ln Lhls sLudy and
we followed sLrlcL eLhlcal guldellnes glven by Lhe ComlLe
ConsulLaLlf naLlonal d'LLhlque (1he lrench naLlonal 8evlew
CommlLLee). Cnce removed from braln, Lhe sLyleL was
lmmedlaLely lmmersed ln 100L 9M urea / 2 CPAS buffer
or brlefly rlnsed before ln 8S buffer Lo remove blood
conLamlnaLlon. MS proflllng of Llssue lysaLes were
performed uslng caLlonlc roLelnChlp arrays (CM10, 8lorad)
and proflllng was performed on a MALul mass specLromeLer
(AuLoflex, 8ruker) ln a llnear mode. 1he washlng sLep ls
essenLlal Lo mlnlmlze blood proLelns conLamlnaLlon. ln facL,
mass specLromeLry proflllng of Lhe pre-washed flngerprlnL
revealed a clear dlmlnuLlon of hemoglobln peaks (around 14
kua) and an lncreased number of deLecLed specles,
parLlcularly ln low molecular mass (llgure 2a). ln
comparlson, Lhe unprocessed sample presenLed a proflle
slmllar Lo a blood sample wlLh hlghly abundanL hemoglobln,
lmpedlng Lhe deLecLlon of oLher proLelns.
ln addlLlon Lo Lhe proflllng approach, we performed an
exLenslve proLeome characLerlzaLlon of Lhe pre-washed
flngerprlnLs. roLeln ldenLlflcaLlon of Llssue obLalned from 2
dlfferenL sLyleLs was performed afLer Lwo dlfferenL gel
separaLlon approaches (sLacklng gel or resolvlng gel) and LC
MS/MS. roLelns were separaLed lnLo 12 bands (paLlenL 1)
or sLacked lnLo one band (paLlenL 2). Lach band was cuL and
washed prlor Lo lodoaceLamlde alkylaLlon and ln-gel
dlgesLlon uslng Lrypsln. epLldes were exLracLed from gel
bands and drled ln a Speedvac. epLldes were resuspended
ln 2 AceLonlLrlle/0.2 formlc acld buffer and ln[ecLed lnLo
a nanoLlquld ChromaLography sysLem (ulLlmaLe 3000,
ulonex) coupled Lo an L1C CrblLrap velos (1hermo).
epLldes were separaLed uslng a mlcro-recolumn carLrldge
(C18 epmap 100, LC acklngs) and Lhen separaLed uslng a
90 mln 8 gradlenL on a C18 column (Cemlnl C18 3m 100A
(73m x 130mm)).
uaLa were processed uslng MascoL server 2.3.0 (MaLrlx
Sclence) uslng followlng parameLers: Lnzyme=1rypsln/
wlLh a maxlmum of 2 mlssed cleavages, a mass Lolerance of
10 ppm for MS and 1 ua for MS/MS, wlLh a flxed
modlflcaLlon of CarbamldomeLhyl (C), and 2 varlable
modlflcaLlons of AceLyl (roLeln n-Lerm) and CxldaLlon (M).
valldaLlon and false-poslLlve raLe assessmenL were
performed uslng l8MA and hLlul sofLwares. roLeln groups
ldenLlfled wlLh a mlnlmum of 2 dlfferenL pepLldes were
valldaLed.
uesplLe a remalnlng hemoglobln conLamlnaLlon clearly
observed on Lhe gel proflle (llgure 2b), Lhe ldenLlflcaLlon of
Lhe pepLlde mlxLure exLracLed from Lhe 12 bands revealed a
LoLal of 1187 dlfferenL proLelns. 1he sLacklng approach,
performed on a sample from a dlfferenL paLlenL ldenLlfles
670 dlfferenL proLelns. Among Lhese 670 proLelns, 73

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2000 20000
M/z (Da)
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(
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b
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)

a
683
504
166
Resolving gel

1187
different proteins
Stacking gel

670
different proteins
kDa
188
98
62
49
38
28
17
14
6
3
b c
d
localization
cellular component organization
cellular process
metabolic process
response to stimulus
multicellular organismal process
neurological system process
transmission of nerve impulse
biological regulation
regulation of catalytic activity
signaling
developmental process
nervous system development
proteasomal protein catabolic process
regulation of neuron differentiation
synapse organization

I|gure 2: roteom|c ana|ys|s of the t|ssue f|ngerpr|nt.(a) Mass spectrometry prof||es of b|ood samp|e and prote|ns extracts from the
t|ssue f|ngerpr|nt before and after wash|ng |n sa||ne buffer (from top to bottom). ke|at|ve |ntens|ty (arb|trary un|t) and M]z (Da)
correspond to y-ax|s and x-ax|s respect|ve|y. 1he MS prof|||ng data shows the s|gn|f|cant d|m|nut|on of hemog|ob|n s|gna|s (red arrow)
and the detect|on enr|chment the samp|e pre-washed |n sa||ne. (b) SDS-AGL separat|on of f|ngerpr|nt prote|n extract. (c) Venn d|agram
present|ng the number of prote|ns detected by LC MS]MS after stack|ng ge| and reso|v|ng ge| methods. (d) 8|o|og|ca| processes
repart|t|on of the bra|n t|ssue f|ngerpr|nt proteome |dent|f|ed after ge| separat|on. Lnr|ched bra|n-spec|f|c b|o|og|ca| funct|ons are
co|ored |n red. A|| prote|ns |dent|f|ed by nano-LC- MS]MS were c|ass|f|ed accord|ng to the GC terms us|ng gprof||er annotat|on too|.
were also ldenLlfled ln Lhe oLher sample demonsLraLlng Lhe
good reproduclblllLy of our sLraLegy. 1ogeLher, 1333
dlfferenL proLelns were ldenLlfled from S1n flngerprlnLs
(llgure 2c). 1he deLalled llsLs of proLelns are accesslble on
8luL daLabase. 1he quallLy of Lhe blologlcal lnformaLlon
obLalned from Lhe flngerprlnL samples was comparable Lo
Lhose usually obLalned wlLh sLandard Llssue samples
orlglnaLlng from larger blopsles.
WlLhln Lhls proLeomlc daLaseL, Lhe presence of asLrocyLes,
neurons, or ollgodendrocyLes proLelns such as Cllal llbrlllary
Acldlc roLeln, neuronal enLraxln 1 and Myelln-
CllgodendrocyLe ClycoproLeln conflrmed Lhe cerebral orlgln
of Lhe Llssue flngerprlnL samples. luncLlonal annoLaLlon of
Lhe ldenLlfled proLelns uslng gprofller Lool [17] permlLLed Lo
reveal a wlde range of blologlcal processes lncludlng
meLabollc process and ublqulLln proLeasome sysLem whlch
are known Lo affecL several neurologlcal dlsorders. We also
deLecLed proLelns assoclaLed wlLh CnS speclflc processes
such as synapse organlzaLlon, nervous sysLem developmenL
and synapLlc Lransmlsslon (llgure 2d).
ln order Lo lnvesLlgaLe Lhe blologlcal mechanlsms assoclaLed
Lo Lhe proLelns ldenLlfled from Lhese braln flngerprlnLs,
proLeomlc daLa were analyzed Lhrough Lhe use of lngenulLy
aLhway Analysls sofLware [18] (lA, lngenulLySysLems,
8edwood ClLy, CA). 1he daLaseLs from sLacklng and resolvlng
gels approaches were submlLLed Lo Lhe sofLware. AlLhough
Lhe pre-fracLlonaLlon meLhod ldenLlfled a slgnlflcanLly hlgher
number of proLelns, boLh daLaseLs ldenLlfled Lhe same
prlmary enrlched processes lncludlng neurologlcal dlsorder
and psychlaLrlc dlsorder (llgure 3a). More Lhan 33 of
proLelns ldenLlfled ln boLh samples have already been
descrlbed as lmpllcaLed ln neurologlcal dlseases (llgure 3b).
1hese resulLs lllusLraLed Lhe cerebral orlgln of Lhe samples.
lurLhermore, we deLecLed several molecular acLors
assoclaLed wlLh speclflc neuropaLhologlcal dlseases such as
PunLlngLon's dlsease, arklnson's dlsease, or Alzhelmer's
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dlsease (llgure 3b). 1hese evldences lllusLraLed Lhe poLenLlal
lmpacL of molecular analysls ln a neuropaLhologlcal conLexL.
lor example, proLeomlc exploraLlon of Lhe Llssue flngerprlnL
permlLLed Lo deLecL key molecules lnvolved ln arklnson's
slgnallng paLhway such as o-synucleln, SepL3, p38 MAk,
ark7 and uCPL1. CLher perLlnenL processes such as
CluLamaLe recepLor slgnallng and CA8A recepLor slgnallng
were also slgnlflcanLly enrlched, wlLh Lhe deLecLlon of key
proLelns such as C8M3 and C8lA gluLamaLe recepLors,
posLsynapLlc proLeln Su-93, CA8A LransporLer CA1, or
CA8A recepLor 8.
ln summary, our flngerprlnL approach provldes fresh Llssue
samples from human braln funcLlonal reglons and
consLlLuLes an unprecedenLed source of lnformaLlon ln
neurologlcal dlseases. 1he ablllLy Lo dlg ouL key acLors of
braln molecular processes Laklng place ln Lhe lmmedlaLe
envlronmenL of Lhe paLhology demonsLraLes Lhe ma[or
lnLeresL of our flngerprlnL approach Lo greaLly enhance Lhe
undersLandlng of Lhe complex neLworks and lnLeracLlons
underlylng many psychlaLrlc and neurodegeneraLlve
dlsorders. LxLendlng Lhe deep braln flngerprlnL procedure Lo
Lhe oLher dlfferenL u8S LreaLed dlsorders and Lhe
comparaLlve analysls of Lhe molecular modlflcaLlons
occurrlng ln Lhe same-LargeLed braln nuclel (for example ln
Lhe S1n for u and CCu) wlll permlL Lo ldenLlfy Lhe blologlcal
mechanlsms speclflcally lnvolved ln each paLhologlcal
slLuaLlon.
As a perspecLlve Lo Lhls work, Lhe nexL ob[ecLlve wlll be Lo
lmplemenL an lmproved flngerprlnL Lechnology enabllng a
spaLlally organlzed braln Llssue harvesLlng and poLenLlally
lmprovlng Lhe blocapLure capaclLy uslng surface afflnlLy
developmenL. Clvlng Lhe exLenslon of u8S lndlcaLlons and
sLlmulaLlon locaLlons, Lhe deep braln flngerprlnL wlll provlde
unlque access Lo molecular and cellular lnformaLlon lnvolved
ln a large seL of neurologlcal dlsorders such as arklnson's
dlsease, Alzhelmer's dlsease, dysLonla, essenLlal Lremor,
epllepsy, CCu, and depresslon [19-24]. 1he flngerprlnL
procedure ls slmple, low cosL and readlly LranslaLable ln
rouLlne neurosurgery. lL wlll lmprove Lhe fleld of braln Llssue
blobanklng, complemenLlng Lhe LradlLlonal posLmorLem
Llssue banks wlLh orlglnal braln flngerprlnL banklng. 1he
wldespread appllcaLlon of Lhls deep braln molecular
exploraLlon could provlde a greaL boosL Lo Lhe developmenL
of LargeLed Lheraples ln neurodegeneraLlve dlseases, and
offers perspecLlves for personallzed Lherapy.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Neurological
Disease
Skeletal and
Muscular Disorders
Hereditary
Disorder
Psychological
Disorder
Cancer
Top Diseases
-log (p-value) a
Resolving gel
Stacking gel
1187
439
160
62
108
670
310
117
49
80
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Total protein
identified
Neurological
disease
Huntington's
disease
Parkinson's
disease
Alzheimer's
disease
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Resolving gel
Stacking gel

I|gure 3: Iunct|ona| annotat|on of proteom|c data. (a) 1op f|ve
d|seases |dent|f|ed by the IA software across the proteom|c data
sets. 1he IA software a||owed the |dent|f|cat|on of the b|o|og|ca|
funct|ons and]or d|seases that were enr|ched |n our data sets. It
a|so perm|tted to h|gh||ght the most s|gn|f|cant pathways
accord|ng to the propr|etary know|edge database (1he Ingenu|ty
know|edge 8ase). 1187 and 670 prote|ns IDs were mapped |n the
software database for the reso|v|ng ge| and the stak|ng ge|
methods respect|ve|y. 1he probab|||ty that a b|o|og|ca| funct|on
ass|gned to the dataset |s because of chance a|one |s determ|ned
by the I|sher's exact test -va|ue. 1he dashed ||ne represents the
thresho|d above wh|ch there are stat|st|ca||y more genes]prote|ns
|n a b|o|og|ca| funct|on than expected by chance. (b) 8ar graph
present|ng the number of |dent|f|ed prote|ns assoc|ated w|th
spec|f|c neuropatho|og|ca| d|seases us|ng IA software. 1he
number of mo|ecu|es |nvo|ved |n each |dent|f|ed funct|on |s
presented.
Acknow|edgements: 1he auLhors Lhank Lhe ueparLmenL of
neurosurgery and Lhe 8lologlcal 8esource CenLre aL Lhe
Crenoble unlverslLy PosplLal. 1hls work was supporLed by
granLs from Lhe Llgue naLlonale conLre le Cancer, Lhe 8eglon
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8hne-Alpes, Lhe Lyon Auvergne 8hne-Alpes Canceropole
and Lhe lnnablosanLe loundaLlon.!
"#$%&'(!)&*$'+,#$+&*(
AZ, A8, l8 concelved and deslgned Lhe experlmenLs. AZ, A8
performed Lhe experlmenLs and analyzed Lhe daLa. ?C, C8,
!C performed proLeomlc ldenLlflcaLlons and valldaLlon. LS,
SC, AL8 are Lhe parLlclpaLlng neurosurgeons. AZ, A8, l8
wroLe Lhe manuscrlpL.
)&*-.+/$!&-!+*$0'0($!
1he auLhors declare no compeLlng flnanclal lnLeresLs.
10-0'0*/0(!
1.Zhang, !., keene, C. u., an, C., MonLlne, k. S., MonLlne, 1.
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#$%&'()*+',"-.("#$%&',"23345 /0 (10), 923-32.
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more comprehenslve undersLandlng of neurodegeneraLlve
dlsease. 9&'*$'5:42";,:<"=((,"23345 8 (10-11), 1484-97.
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3.klLsou, L., an, S., Zhang, !., Shl, M. eL al, ldenLlflcaLlon of
proLelns ln human subsLanLla nlgra. 9&'*$'5:42" ;,:<" =((,"
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Cnu2 overexpresslon ln arklnson's dlsease. !" 9&'*$'5:42"
23825 0C (13), 4636-67.
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1halamlc deep braln sLlmulaLlon for LreaLmenL-refracLory
1oureLLe syndrome: Lwo-year ouLcome. #$%&','IE" 233:5 0H
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24.LaxLon, A. W., Lozano, A. M., ueep 8raln SLlmulaLlon for
Lhe 1reaLmenL of Alzhelmer ulsease and uemenLlas. L'&,A"
#$%&'2%&I"2382.


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Rsultats I : La SCP : une opportunit pour lanalyse protomique du cerveau vivant.
29
3. Conc|us|ons et erspect|ves.
uans ceLLe eLude, nous avons proflLe de l'acces Lemporalre au Llssu cerebral duranL
l'lmplanLaLlon d'elecLrodes de sLlmulaLlon pour obLenlr une lnformaLlon moleculalre du
cerveau chez le paLlenL vlvanL eL evellle. Crce au bref conLacL d'un sLyleL de guldage avec le
noyau lmplanLe, lcl le S1n, eL a la mlse au polnL d'un proLocole d'exLracLlon, des proLelnes
flxees a l'exLremlLe du sLyleL, nous avons pu recuperer envlron 20 g de proLelnes, eL
ldenLlfler plus de 1300 proLelnes dlfferenLes. CeLLe approche esL unlque a ce [our eL a eLe
posslble grce a l'eLrolLe collaboraLlon avec les neurochlrurglens eL neurologues du CenLre
PosplLaller unlverslLalre de Crenoble. arml ces 1333 proLelnes, la presence de proLelnes
speclflques au Llssu cerebral eL de proLelnes precedemmenL decrlLes dans les maladles
neurodegeneraLlves a conflrme l'lnLerL d'une Lelle sLraLegle en vue d'explorer le proLeome
d'auLres noyaux. Ln effeL, l'efflcaclLe de la sLlmulaLlon elecLrlque s'esL eLendue a d'auLres
paLhologles eL/ou d'auLres reglons Lelles que le S1n dans les 1CC (MalleL, olosan eL al.
2008) eL l'epllepsle (Chabardes, kahane eL al. 2002), le noyau venLro-medlan du Lhalamus
(8enabld, ollak eL al. 1993) eL le noyau pedonculo-ponLln (SLefanl, Lozano eL al. 2007) dans
la M, le globus pallldus lnLerne (Cl) dans les dysLonles (vldallheL, vercuell eL al. 2003) eL la
M (ahwa, Wllklnson eL al. 1997)) ou plus recemmenL le fornlx (LaxLon, 1ang-Wal eL al.
2010) dans la maladle d'Alzhelmer. La posslblllLe d'obLenlr une emprelnLe moleculalre de
chacun de ces noyaux permeLLralL d'eLabllr une llsLe exhausLlve des proLelnes presenLes
dans chacun d'enLre eux eL de soullgner la speclflclLe proLelque de ces dernlers. ue plus
l'efflcaclLe de la sLlmulaLlon elecLrlque du S1n a la fols dans la M, les Lroubles obsesslonnels
compulslfs (1CC) eL cerLalnes formes d'epllepsles nous offre l'opporLunlLe d'obLenlr le profll
proLelque d'un mme noyau dans des paLhologles dlfferenLes. Ces proflls proLelques
vlendralenL alnsl compleLer les proflls elecLrophyslologlques obLenus par lallaL eL )%.
(lallaL, olosan eL al. 2011). Les modlflcaLlons d'acLlvlLe elecLrlque pourralenL Lre alnsl
assoclees eL correlees aux modlflcaLlons d'expresslon de cerLalnes proLelnes permeLLanL
alnsl de soullgner les mecanlsmes moleculalres assocles a ces changemenLs d'acLlvlLe
elecLrophyslologlque. Alors que [usqu'a presenL, l'analyse proLeomlque du Llssu cerebral
humaln dans la M eLalL llmlLee a des echanLlllons posL-morLem, nous sommes les premlers
a avolr ldenLlfle des proLelnes du S1n chez le paLlenL parklnsonlen vlvanL. L'avanLage ma[eur
de ceLLe sLraLegle esL de pouvolr dlsposer d'une lnformaLlon moleculalre a un sLade molns
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Rsultats I : La SCP : une opportunit pour lanalyse protomique du cerveau vivant.
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avance de la M eL dans un conLexLe ou les facLeurs pouvanL blalser l'expresslon des
proLelnes, comme l'eLaL de medlcaLlon ou l'lnLervalle posL-morLem sonL conLrles ou
absenLs. Au[ourd'hul nous dlsposons d'une LrenLalne de prelevemenLs reallses au cours
d'lmplanLaLlon d'elecLrodes dans Lrols paLhologles (M, 1CC eL dysLonle) eL deux noyaux
dlfferenLs (S1n eL Cl). nous envlsageons de reallser l'analyse proLeomlque de ces
echanLlllons en collaboraLlon avec le laboraLolre du ur !erme Carln au CLA de Crenoble.
8len enLendu, une mellleure comprehenslon de la M passe par l'analyse proLeomlque de la
Snc a un sLade plus precoce , la locallsaLlon de la Snc sur la Lra[ecLolre clblanL le S1n nous
offre l'opporLunlLe d'obLenlr une lnformaLlon moleculalre de ce noyau a un sLade molns
avance de la maladle. nous reallserons Lres prochalnemenL les premleres emprelnLes !"#(!('
dans la Snc de paLlenLs parklnsonlens. ues emprelnLes dans la Snc non degeneree de
paLlenLs aLLelnLs de 1CC eL lmplanLes dans le S1n consLlLueronL les echanLlllons conLrles,
offranL alnsl la posslblllLe d'ldenLlfler des proLelnes poLenLlellemenL assoclees a la
degenerescence de la Snc dans la M, vla des approches de proLeomlque quanLlLaLlve. un
pro[eL en collaboraLlon avec l'hplLal unlverslLalre de Ceneve en collaboraLlon avec le r
lerre 8urkhard, speclallse dans l'analyse proLeomlque de la Snc, devralL demarrer en Mal
2013. Les resulLaLs prellmlnalres de ces pro[eLs pourralenL abouLlr sur un pro[eL
mulLlcenLrlque au seln duquel la collecLe d'echanLlllons provenanL de dlfferenLs paLlenLs,
dlfferenLs noyaux eL dlfferenLes paLhologles consLlLueralL une banque d'emprelnLe
moleculalre precleuse eL unlque a ce [our, ayanL pour ob[ecLlf la comprehenslon des
mecanlsmes moleculalres dans les maladles neurologlques pour lesquelles la sLlmulaLlon
cerebrale esL appllquee. Lnfln, afln de faclllLer eL de sLandardlser la recuperaLlon de ces
emprelnLes au bloc operaLolre, nous developpons acLuellemenL des sLyleLs de guldage donL
l'exLremlLe sera dlrecLemenL secable, dans des Lubes conLenanL le Lampon d'exLracLlon
proLelque.
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Rsultats II : Validation dun nouvel outil pour la capture in vivo de tissu crbral.
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II. Va||dat|on de |'eff|cac|t et de |'effet non |s|onne| d'un
nouve| out|| pour |a capture "#!$"$% de t|ssu crbra|.
1. Introduct|on
1) rsentat|on de |'out||
Afln d'opLlmlser l'lnformaLlon moleculalre obLenue !"# (!(' pendanL l'lmplanLaLlon
d'elecLrodes de sLlmulaLlon, nous avons developpe eL breveLe, en collaboraLlon avec le CLA-
LL1l de Crenoble un nouvel ouLll, plus adapLe a la mlcro-capLure Llssulalre. Ln effeL, le sLyleL
chlrurglcal, uLlllse a l'orlglne pour faclllLer l'lnLroducLlon de l'elecLrode deflnlLlve dans le Lube
gulde, ne garanLlL pas une capLure reproducLlble eL homogene. ue plus, nous ne pouvons
exclure une conLamlnaLlon par des mlcro-fragmenLs Llssulalres presenLs dans le Lube gulde
eL provenanL des dlfferenLs noyaux Lraverses avanL d'aLLelndre le S1n. nous avlons donc
besoln d'un ouLll dlsposanL d'une surface plus adapLee permeLLanL une emprelnLe Llssulalre
reproducLlble eL speclflque des noyaux clbles. noLre collaboraLlon avec le CLA-LL1l nous a
permls de deLermlner le maLerlau approprle : le slllclum, un maLerlau lnerLe que l'on peuL
mlcro-sLrucLurer a faon eL foncLlonnallser chlmlquemenL. nous avons donc decoupe du
slllclum sous forme de puces (llgure 20A). uans ce Lravall de Lhese, les puces uLlllsees
avalenL une longueur de 7 mm, une largeur de 0,6 mm eL une epalsseur de 0,3 mm. Sur ces
puces, un groupemenL anlonlque carboxylaLe a eLe foncLlonnallse (llgure 208 eL annexe 1).
Afln d'augmenLer la surface de conLacL, des plcoLs ocLogonaux de 80 m de dlameLre eL 30
m de hauLeur separes de 240 m onL eLe reallses par phoLo-llLhogravure (llgure 20C).
!"#$%&'()'(*+,"-*(
.#,"/'0'12(&%#3,45*%2'(
67'12()'(&,"/*%7'(89*%1'(
:9%98,18(&,;%*'12'8(
<'**"*'8('2(0%2#9&'('42#%&'**"*%9#'(
6(
=( <(

I|gure 20: uce en s|||c|um mod|f|e ch|m|quement et m|cro-structure. (A) keprsentat|on schmat|que de |a puce. (8)
r|nc|pe de |a fonct|onna||sat|on ch|m|que. (C) M|croscop|e |ectron|que ba|ayage des m|cro-p|cots.
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Rsultats II : Validation dun nouvel outil pour la capture in vivo de tissu crbral.
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ues LesLs reallses +,# (!(' sur du Llssu Lumoral onL mls en evldence l'adheslon a la puce en
slllclum, d'une mulLlcouche Llssulalre conLenanL les cellules eL la maLrlce exLracellulalre
(MLC)(llgure 21). nous avons aussl monLre +,# (!(' que les modlflcaLlons de surface
lmplemenLees sur le slllclum permeLLalenL une capLure dlfferenLlelle du proLeome
augmenLanL quallLaLlvemenL eL quanLlLaLlvemenL les proLelnes deLecLees en specLromeLrle
de masse, par rapporL a une puce slmllalre en lnox chlrurglcal.
!

I|gure 21 : Cbservat|on du t|ssu tumora| rcupr sur une puce en s|||c|um, par m|croscop|e |ectron|que ba|ayage
(gauche) et b| photon|que (dro|te). Les f|bres b|anches (dro|te) sont des f|bres de co||agne de |a MLC.
Afln d'assurer une capLure Llssulalre speclflque de la reglon clblee, la puce en slllclum a eLe
assoclee a un ouLll chlrurglcal lul empchanL LouLe lnLeracLlon avec les dlfferenLs noyaux
Lraverses [usqu'a la clble. La flgure 22 presenLe l'ouLll dans sa verslon compleLe : la puce en
slllclum a eLe flxee a une Llge meLalllque. CeLLe Llge esL lnseree dans un Lube gulde avec une
fenLre d'exposlLlon laLerale qul va permeLLre l'exposlLlon de la puce en slllclum eL son
conLacL avec le cerveau. ar slmple roLaLlon de 180 de la Llge meLalllque sur laquelle la puce
esL flxee, nous pouvons exposer ou masquer le slllclum eL donc reallser une emprelnLe
Llssulalre a l'endrolL eL au momenL voulu. Au cours de la descenLe [usqu'a la clble, le slllclum
esL masque. Arrlve dans le noyau d'lnLerL, ll esL expose le Lemps de l'emprelnLe Llssulalre.
uls, ll esL de nouveau masque pendanL le reLralL de l'ouLll du cerveau.
un lnLerL de noLre ouLll esL sa capaclLe a conserver la spaLlallLe du noyau sur la puce. ar
chlrurgle sLereoLaxlque, on peuL reallser des emprelnLes Llssulalres sur LouLe la hauLeur d'un
noyau ou mme reallser une emprelnLe chevauchanL deux noyaux blen dlsLlncLs. La puce esL
ensulLe facllemenL deLachee de l'ouLll eL LralLee selon les besolns de l'analyse.
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I|gure 22: L'out|| d'empre|nte t|ssu|a|re. (A) Schma et (8) photo de |'out|| d'empre|nte t|ssu|a|re. (C) kad|ograph|e
ra||se durant |a ra||sat|on d'une empre|nte |n v|vo chez |e pr|mate.
L'uLlllsaLlon d'un Lel ouLll chez l'humaln duranL les lnLervenLlons neurochlrurglcales
necesslLalL avanL LouL une valldaLlon de son efflcaclLe de capLure Llssulalre !"# (!(' chez
l'anlmal. Afln d'evaluer aussl l'effeL leslonnel de noLre ouLll donL les dlmenslons onL eLe
cholsles pour le cerveau humaln, le cholx du prlmaLe s'esL rapldemenL lmpose. ue plus, dans
l'opLlque d'eLudes fuLures sur le prlmaLe ayanL pour ob[ecLlf l'analyse moleculalre du Llssu
cerebral, la posslblllLe de reallser des emprelnLes !"#(!(' dans dlfferenLs noyaux esL un en[eu
ma[eur pour l'ldenLlflcaLlon des mecanlsmes moleculalres assocles a une paLhologle ou aux
effeLs d'un LralLemenL.
Nous avons donc va|u |'eff|cac|t de capture et |'effet |s|onne| de notre out|| chez |e
pr|mate et dmontr |'|ntrt d'une te||e stratg|e dans |es tudes prc||n|ques
s'|ntressant aux mod|f|cat|ons mo|cu|a|res au n|veau crbra|.
2. Art|c|e 2
A m|cro s|||con ch|p for |n v|vo cerebra| |mpr|nt |n monkey.
Aff|f 2accar|a, All 8ouamranl, LaurenL Selek, Mlchelle Ll ALlfl, Anne Marle Pesse, Aurelle
!uhem, uavld 8aLel, Perve MaLhleu, ?ohann CouLe, ChrlsLophe 8ruley, !erome Carln, Allm L
8enabld, SLephan Chabardes, 8rlglLLe lallaL and lranols 8erger. ACS Chem|ca|
Neurosc|ences, 2012.
Supp| data: https:]]docs.goog|e.com]fo|der]d]081GhVL-38pV81D2MU1If38CM0k]ed|t
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A Micro-Silicon Chip for in Vivo Cerebral Imprint in Monkey
Af Zaccaria,*
,
Ali Bouamrani,

Laurent Selek,
,
Michelle El Ati,

Anne Marie Hesse,

Aure lie Juhem,

David Ratel,

Herve Mathieu,
#
Yohann Coute,

Christophe Bruley,

Jerome Garin,

Alim L Benabid,

Stephan Chabardes,
,
Brigitte Piallat,

and Franc ois Berger


,

Institut des Neurosciences Team 7 Brain Nanomedicine, INSERM U836, UJF, CHU, Grenoble, France

Clinatec, CEA-LETI, Grenoble, France

Biologie a Grande Echelle, IRTSV, CEA, Grenoble, France, and INSERM, U1038, Grenoble, France.

Ecrins therapeutics, BIOPOLIS, 38700 La Tronche, France

Institut des Neurosciences Team 11 Brain Function and Modulation, INSERM U836, UJF, CHU, Grenoble, France

Department of Neurosurgery, Centre Hospitalier Universitaire, Grenoble, France


#
Institut des Neurosciences Team 5 Functional and Metabolic Neuroimaging, INSERM U836, UJF, CHU, Grenoble, France
*S Supporting Information
ABSTRACT: Access to cerebral tissue is essential to better
understand the molecular mechanisms associated with neuro-
degenerative diseases. In this study, we present, for the rst
time, a new tool designed to obtain molecular and cellular
cerebral imprints in the striatum of anesthetized monkeys. The
imprint is obtained during a spatially controlled interaction of a
chemically modied micro-silicon chip with the brain tissue.
Scanning electron and immunouorescence microscopies
showed homogeneous capture of cerebral tissue. Nano-liquid
chromatographytandem mass spectrometry (nano-LC-MS/
MS) analysis of proteins harvested on the chip allowed the
identication of 1158 dierent species of proteins. The gene expression proles of mRNA extracted from the imprint tool
showed great similarity to those obtained via the gold standard approach, which is based on post-mortem sections of the same
nucleus. Functional analysis of the harvested molecules conrmed the spatially controlled capture of striatal proteins implicated
in dopaminergic regulation. Finally, the behavioral monitoring and histological results establish the safety of obtaining repeated
cerebral imprints in striatal regions. These results demonstrate the ability of our imprint tool to explore the molecular content of
deep brain regions in vivo. They open the way to the molecular exploration of brain in animal models of neurological diseases and
will provide complementary information to current data mainly restricted to post-mortem samples.
KEYWORDS: Neurodegenerative diseases, cerebral imprints, in vivo, tissue harvesting, proteomics, transcriptomics
With the demographic aging and the augmentation of the life
expectancy, age-related neurodegenerative disorders are an
increasing public health problem. Until now, the exact
pathogenetic mechanisms underlying the degenerative process
in neurological diseases are still not understood.
1
In fact, the
relative inaccessibility of cerebral tissue impedes the molecular
analysis of pathological brain regions in the early postdiagnostic
stage. Although genomic expression studies
25
or proteomic
analyses
68
of human cerebral tissues permit correlation of
some biological pathways, including mitochondrial and
proteasomal dysfunctions or oxidative stress, to neurological
diseases, all of these results have been restricted to post-
mortem samples and are generally derived during advanced
disease stages. With the development of animal models of
neurodegenerative diseases in primates,
9
accessibility to and
analysis of the brain at dierent stages of degeneration is now
conceivable.
10
However, this requires the sacrice of the animal,
rendering impossible brain molecular follow-up in the same
animal.
11
In fact, performing several biopsies in the same brain
regions is unthinkable because of the lesion eects caused by
current biopsy tools.
12
We recently developed a new tool
specically adapted for brain tissue imprints. The harvesting
surface is based on a silicon chip, which harbors chemical and
structural modications. During a surgical approach less
traumatic than biopsy, we demonstrated that this microchemi-
cally modied surface, when exposed to the specic investigated
brain area, provides local cellular capture. As a result of anionic
capture, both cells and extracellular matrices are harvested
providing a unique opportunity for in situ, spatially oriented
bioharvesting. On the basis of this concept, we have developed
a specic device for primate research. In this study, we assessed
Received: August 4, 2012
Accepted: December 8, 2012
Research Article
pubs.acs.org/chemneuro
XXXX American Chemical Society A dx.doi.org/10.1021/cn300116g | ACS Chem. Neurosci. XXXX, XXX, XXXXXX
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(i) the capacity of our tool to harvest brain molecules in the
putamen and caudate nucleus (i.e., striatum) of a healthy
monkey and (ii) the lesional eects induced by repeated
targeting in basal ganglia. Molecular investigations on the tissue
captured by the silicon chip demonstrated the compatibility of
our strategy with large-scale transcriptomic and proteomic
studies. Furthermore, the behavioral monitoring of the animals
following repeated brain tissue imprints did not reveal any
obvious modication. Finally, both the postmortem imaging
and histological analyses conrmed the minimal lesion-eect
induced by our tool.

RESULTS AND DISCUSSION


In this study, we present a new tool developed by our group
and designed to obtain cerebral imprints in the basal ganglia of
monkeys (Figure 1). This tool is based on a silicon chip, which
has been chemically and structurally modied. To prevent the
capture of tissue in nonspecic regions, the silicon chip is
hidden during the insertion and removal of the tool. Once the
tool is inserted into the targeted region, the silicon chip is
exposed via the window of the guide tube, allowing the tissue
imprint to be obtained. The main aims of this study were to
conrm (i) the capacity to perform multimolecular analysis
from in vivo cerebral imprints and (ii) the safety of repeated
cerebral imprints in the basal ganglia. Five dierent cerebral
imprints were performed at dierent times in both caudate
nucleus and putamen of two dierent monkeys. We performed
10 dierent cerebral imprints in two monkeys, and only 8
imprints have been displayed in this study.
After each cerebral imprint, motor and nger-skill tests were
performed to monitor potential behavior modications of each
monkey. Baseline assessment of the distances moved (Figure
2A) and the velocities of movement (Figure 2B) were
signicantly dierent between the two monkeys (Mann
Whitney test; distance moved, p value = 0.0089; velocity, p
value = 0.0091). However, for each monkey, repeated cerebral
imprints in the putamen and caudate nucleus had no signicant
eect on the distances moved and the velocities of movement,
compared with their individual baseline values (Mann
Whitney test; p value > 0.05). From the rst to the fth
imprint, behavior assessments were not progressively worsened,
conrming there is no cumulative eect induced by repeated
tool insertion (Figure 2C). The same results were obtained
with nger-skill tests (Figure 2D); the time required to pick up
rewards in three dierent wells was signicantly dierent
between the two monkeys at baseline (p value = 0.0002), while
for each monkey, no dierence was observed before and after
cerebral imprints (p < 0.05). These results suggest that our tool
may allow repeated cerebral imprints in basal ganglia without
functional lesion-induced eects.
To conrm the in vivo capture of tissue on the silicon chip,
we performed scanning electron micrography (SEM). As
shown in Figure 3A, the cerebral imprint permitted
homogeneous capture of a thin layer of putamen tissue on
the silicon chip (left picture). A focus on the micropillar surface
showed the presence of a variety of cells (middle), including
elongated and adherent cells with extensive processes (right).
To identify the cell subtypes captured on the chip,
immunouorescence labeling was performed using antibodies
against GFAP and NeuN. As shown in Figure 3A, apart from
blood contamination, putamen tissue xed on the chip was
identied as neurons (NeuN positive nuclei) and astrocytes
(GFAP positive cells). These results demonstrate the ability of
the tool to harvest a homogeneous, thin layer of brain tissue.
Thus, a spatial cellular ngerprint is obtained providing a
unique tridimensional spatially oriented biocapture.
To further characterize the molecular content of the freshly
harvested tissue, we used nano-liquid chromatographytandem
mass spectrometry (nano-LC-MS/MS) to identify the captured
proteins.
We rst quantied the total protein amount present on the
chip. Four dierent cerebral imprints performed in putamen
and caudate nucleus of both monkeys revealed an average
capture of 16.3 4.8 g of proteins. The qualitative capture of
dierent proteins by the chip was assessed by both MS proling
and 1D sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electro-
phoresis (SDSPAGE) migration (Figure 4A). Both techni-
ques revealed the harvesting of many dierent mass proteins
despite the presence of hemoglobin around 15 kDa. In addition
to these approaches, we performed an extensive proteomic
characterization of the tissue harvested on the chip. The
amount of recovered material, approximately 16 g of total
proteins, permitted analysis of the sample by nano-LC-MS/MS
and a total of 1158 dierent proteins were identied and
considered for further analysis.
The presence of brain associated proteins such as glial
brillary acidic protein (GFAP), neuronal specic septin 3,
synapsin 1, or neural cell adhesion molecules 1 and 2 (NCAM
1/2) conrmed the harvesting of cerebral parenchyma. The
submission of these 1158 dierent species to Ingenuity Pathway
Analysis
13
for functional characterization highlighted 347 and
91 dierent proteins, which have been described as implicated
in neurological and psychological disorders, respectively
(Figure 4C). These proteins are signicantly implicated in
brain specic signaling pathways such as axonal guidance and
synaptic long-term potentiation or depression but also in
neurological disease associated pathways such as Huntington or
Parkinsons diseases (Table 1).
Figure 1. Tool design and X-ray scan of a cerebral imprint (A)
Schematic representation of the imprint tool. The guide tube prevents
the capture of nonspecic tissue during the descent. The exposure of
the silicon chip by a 180 rotation of the inner tool allows harvesting
of the desired tissue. (B) Picture of the imprint tool. (C) X-ray scan of
the monkey skull during the execution of a cerebral imprint in the
caudate nucleus. The window of exposure (white arrow) is easily seen.
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Figure 2. Motor activities of monkeys after repeated cerebral imprints. Distance moved (A) and velocity of movement (B). Animals were assessed by
the video system for 60 min before the rst cerebral imprint (PRE, n = 5) and after each imprint (POST, n = 5). Evolution of the distance moved
after each cerebral imprint (n = 5) for both monkeys (C). Finger skill tests (D). Animals were assessed by the time required to pick up three peanuts
in 1 cm wells before the rst (PRE, n = 15) and after each cerebral imprint (POST, n = 15). Data are presented as the means SD ** p < 0.01, ***
p < 0.001, MannWhitney test.
Figure 3. Microscopic observation of a cerebral imprint (A) Scanning
electron micrograph showing (left) the homogeneous capture of tissue
on the silicon chip, (middle) a variety of cells on the micropillar, and
(right) an elongated cell with extensive processes. (B) Immunostain-
ing of glial brillary acid protein (GFAP) and neuronal nuclei (NeuN)
on the captured cerebral imprint. Astrocytes were identied as GFAP-
positive and NeuN-negative cells (top) and neurons showed NeuN-
positive nuclei without GFAP labeling (bottom). The chip was stained
for GFAP (red), NeuN (green), and Hoechst (blue).
Figure 4. Proteomic analysis of the cerebral imprint. Analysis of
proteins extracted from a cerebral imprint by 1D SDS-PAGE (A) and
mass spectrometry proling (B). (C) Functional annotation of the
cerebral imprint proteome identied by nano-LC-MS/MS. The bar
graph represents the number of identied proteins in each disease or
disorder signaling pathways classied as the most signicant using the
Ingenuity Pathway Analysis software.
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Moreover, the identication of -synuclein,
14
DJ-1,
15
UCHL-
1,
16
monoamine oxidase B,
17
superoxide dismutase,
18,19
and
tyrosine hydroxylase
20
indicates that the cerebral expression of
relevant proteins for PD studies could be determined by our
approach in a living monkey. Finally, the identication of
tyrosine hydroxylase and the signicant expression of both
dopamine receptor signaling and dopamineDARPP32 feed-
back in cAMP signaling with IPA strongly suggest that the
cerebral imprint had been performed in a brain region with
dopaminergic activity, such as the putamen or caudate
nucleus.
2124
These results demonstrate the capacity of our
tool to harvest and identify relevant proteins in specic brain
regions.
Complementary to proteomics studies, microarray analysis
provides considerable information about molecular pathways
deregulated in neurodegenerative diseases,
25 26
particularly in
PD.
2729
This technology measures the mRNA levels of all
known genes coding for proteins in a given sample
simultaneously.
30
Because RNA is labile and subject to rapid
degradation, extraction and quality control are critical to ensure
a relevant analysis.
31
In general, microarray analyses are
performed from post-mortem extracted RNA; here, we
analyzed expression levels of RNA extracted from the caudate
nucleus of a living primate. Two cerebral imprints were
successively performed in the same caudate nucleus, and total
RNA was extracted. We aimed to compare their similarity with
RNA extracted from post-mortem sections of the same caudate
nucleus, which is the gold standard method, used here as
control samples. First, quality was controlled; the quality of the
RNA extracted from the imprint tool was satisfactory and
similar to the post-mortem sample (rRNA 28S/18S ratio =
1.1). The analysis of the cerebral imprints revealed 27%
detected probe sets in common (i.e., 14691 out of 54675) with
95% reproducibility between the two imprints (Figure 5A) and
a high correlation (Figure 5B) between their expression in
imprint 1 (y) and 2 (x) (y = 1.0002x; r = 0.994). The control
sections showed a detection ratio of 28% and 85%
reproducibility between the two post-mortem sections (data
not shown). The comparison of cerebral imprints and post-
mortem sections revealed 89% detected probe sets in common
(Figure 5A), and the linear regression curve (Figure 5B)
revealed a great correlation between their expressions in
imprints (y) and control samples (x) (y = 1.0032x; r = 0.987).
These results revealed (i) the gene expression reproducibility of
two consecutive cerebral imprints and (ii) similarity with gene
expression of the gold standard post-mortem sections.
Functionally, the capture by our tool of mRNA previously
described by Bossers et al.
28
as dierently expressed in a PD
post-mortem caudate conrmed our ability to reach relevant
transcriptomic information from our cerebral imprints.
The post-mortem MRI of one dissected brain conrmed the
proper trajectories of our imprints (Figure 6B). GFAP staining
was used to visualize astrocytes around the imprint tool tracks,
because insertion of probes into the brain parenchyma induces
a glial reaction. An increase in the density of glial cells and the
length of glial cell processes is seen. Gliosis around imprint tool
tracks was investigated using qualitative analysis at light and
laser scanning microscopic levels of sections stained with the
astroglial marker GFAP and the pan-microglia marker Iba-1. In
the brain examined at 1 month after acute probe implantation,
large, strongly stained reactive astroglial cells were observed
around the probe tracks (Figure 6D). Increased GFAP staining
up to 300 m was observed at the imprint tool implantation
site. In parallel, the Iba-1 staining was used to visualize
microglia composition in the brain tissue around the tools
acutely implanted with the imprint tool 1 month following
implantation. We did not observe any microglia activation
around the tracks; however, some macrophages were visualized
in the tracks, possibly related to localized microbleeding (data
not shown).
Table 1. Functional Analysis by Ingenuity Pathway Analysis
a
Ingenuity canonical
pathways p-value
IPA
DataBase
cerebral
imprint
ratio
(%)
Parkinsons signaling 1.00 10
3
18 5 27.8
Huntingtons disease
signaling
3.16 10
14
238 40 16.8
glioma invasiveness signaling 9.77 10
4
60 9 15.0
synaptic long-term
potentiation
1.74 10
5
114 16 14.0
dopamine receptor
signaling
3.39 10
5
95 13 13.7
amyotrophic lateral sclerosis
signaling
9.12 10
6
119 16 13.4
glutamate receptor
signaling
9.77 10
4
69 9 13.0
axonal guidance signaling 2.00 10
14
433 56 12.9
dopamineDARPP32
feedback in cAMP
signaling
3.24 10
3
187 16 8.6
synaptic long-term
depression
1.29 10
2
147 12 8.1
a
Signaling pathways signicantly represented by the identied proteins
from a putamen-targeted cerebral imprint. Pathways displayed in bold
are associated with Parkinsons disease and putamen signaling. The
ratio is calculated as the number of proteins from the cerebral imprint
that map to the pathway divided by the total number of proteins
described as associated with the pathway (IPA DataBase).
Figure 5. Assessment of RNAs from the cerebral imprint in
comparison with RNAs from the corresponding post-mortem sections.
(A) Venn diagram representing the extent of overlap of probe sets
detected from RNA extracted from cerebral imprint and post-mortem
sections. (B) Linear regression curve representing the intensity of
expression of the common probe sets between cerebral imprints and
post-mortem sections.
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CONCLUSIONS
The ability to access cerebral tissue is mandatory to better
understand molecular mechanisms associated with neuro-
degeneration. The development of animal models such as the
MPTP-monkey for PD provided the possibility to access brain
tissue at dierent stages of neurodegeneration. However, the
absence of an adapted tool for brain tissue harvesting limited
studies to post-mortem samples.
This work introduces a new tool that could inform about in
vivo molecular and cellular content of brain regions in monkey,
through the harvesting of a thin layer of tissue. Repeated
cerebral imprints in deep nucleus did not induce motor
impairments and provided specic proteomic and tran-
scriptomic information. In fact, one technical advance of this
tool resides in its ability to expose the capture surface once in
the targeted nucleus, preventing molecular contamination from
other tissues. The capacity to perform several imprints on the
same monkey at dierent times in dierent brain regions opens
the way to a personalized molecular follow-up of brain.
Dierent nuclei could be simultaneously or successively
explored by proteomic or transcriptomic approaches to map
the living brain and to complete information provided from
post-mortem analyses. As classically observed after the
introduction of microsurgical tools in the human brain, cerebral
imprints also activated astrogliosis and induced microbleeding.
We should be aware about the tissue damages induced by the
tool introduction, which may aect protein and mRNA
expression in targeted nuclei. In a context to understand
molecular modications induced by neurodegenerative dis-
eases, imprint-induced modications should be well charac-
terized and distinguished from those induced by a pathological
process through the use of unilateral model. Our approach
could also be helpful in experiments assessing the molecular
eects of strategies such as high-frequency stimulation
32
or
gene therapy.
33

MATERIAL AND METHODS


Animals. Experiments were conducted on two cynomolgus
monkeys (Macaca fascicularis; CRP Port Louis, Mauritius): age 8
years old, weight 8 kg (monkey 1), and 10 years old, 11 kg (monkey
2). All experiments were carried out in accordance with the
recommendations of the European Community Council Directives
of 1986 (86/609/EEC), the National Institutes of Health Guide for
the Care and Use of Laboratory Animals. The Ethics Committee of
Region Rhone-Alpes approved the experimental protocol. Animals
were kept with other congeners in an air-conditioned room under
standard conditions of temperature (23 1 C), humidity (65%
4%), light (12 h light/dark cycle), and food/water available ad libitum.
Surgical Procedure. After induction under general anesthesia with
ketaminexylazine (10 mg1 mg/kg, im, Imalgene, Centravet,
France), the monkeys head was xed in a Kopf stereotaxic frame
(David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). All operations were
performed under sterile conditions. Ventriculography was performed
by injecting a contrast medium into the anterior horn of the lateral
ventricle at 27 mm anterior to the interaural line and 2 mm lateral to
the midline with an angle of 20 anteroposteriorly. Positions of
anterior (AC) and posterior (PC) commissures were identied on a
sagittal radiograph. Cannulae were xed on the skull bone above the
right putamen at 3 mm posterior to AC and 11 mm lateral to the
midline, and above the right caudate nucleus at 3 mm anterior to AC
and 4.5 mm lateral to the midline, according to the stereotaxic atlas of
Macaca fascicularis (BrainInfo, University of Washington, http://
braininfo.rprc.washington.edu/). Analgesic/anti-inammatory thera-
pies (ketoprofen 2 mg/kg, im) and antibiotics (amoxicillin/clavulinic
acid, 10 mg/kg, im) were administered during the postoperative
period.
The Imprint Tool. The imprint tool is composed of three
independent parts (Figure 1A,B). (1) A guide tube of 1-mm external
diameter with a window of 7-mm. The length of the window has been
chosen in accordance with the height of putamen and caudate nucleus
at the coordinates of the cannula location. (2) A tool of 0.6-mm
diameter with a dedicated space to support the silicon chip. (3) The
silicon chip of 7-mm with an anionic surface and micropillar design to
increase the interaction surface. Once inserted in the guide tube,
rotation of the tool by 180 exposes or hides the chip in the window.
Behavioral Monitoring. To assess the potential lesions induced
by brain imprints, cage activity levels were assessed in 1 h intervals
(each Tuesday 10:00), before the rst cerebral tissue imprint (control
phase; n = 5) and 4 days after each imprint (n = 5). Behavioral
measures, including distance traveled (m) and movement speed (cm/
s) were quantied from videotape recordings using an automated
video-tracking system, Ethovision (Noldus Information Technologies,
The Netherlands).
34
The calibration of the software permitted
determination of the position of the animal based on x and y
coordinates, which were then used to calculate the dierent motor
parameters.
At the end of each session, nger skill was also tested objectively by
measuring the mean time required to pick up peanuts in three 1 cm
diameter wells. The measure was included only if the monkey kept
focus on the wells until all the peanuts had been collected. Mann
Whitney tests were performed using GraphPad InStat version 3.00
(GraphPad software, San Diego, California, USA).
Experimental Protocol. Every 15 days, under the same general
anesthesia and sterile conditions, the monkeys head was xed in a
Kopf stereotaxic apparatus. The imprint tool was xed to the
stereotaxic manipulator. It was slowly inserted via the cannula so the
window was exclusively in the putamen (i.e., 23 mm below the dura)
Figure 6. Brain tissue imprinting in monkey: A combined MRI and histological analysis. (A) A coronal plane of the Rhesus monkey brain atlas with
the imprint tool trajectory. (B) Coronal MRI view of an imprint tool track in monkey caudate nucleus. (C) Photomicrograph showing cresyl violet
staining around an imprint tool track. Calibration bar = 200 m. (D) Photomicrograph showing astrocytes (GFAP staining, green) and
counterstained cells (PI staining, red) around one imprint tool track (asterisk) following acute implantation in monkey caudate nucleus. Calibration
bar = 100 m.
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or the caudate nucleus (i.e., 20 mm below the dura). The silicon chip
remained unexposed to the window during insertion of the cannula to
prevent nonspecic molecular xation. Once the cannula was inserted
into the target, the tool supporting the silicon chip was rotated by 180
to expose the chip for 2 min, thus allowing the cerebral tissue to
imprint. The chip was then hidden by a new rotation of the inner tool
and the imprint tool was slowly removed from brain (Figure 1C).
Overall, 10 tissue imprints (5 in each nucleus) were performed for
both monkeys. Animals were sacried by sodium pentobarbital (150
mg/kg, iv) administration, and the brains were removed quickly after
death. One brain was immediately frozen by immersion in isopentane
(45 C) and then stored at 80 C until molecular analysis. The
other brain was immersion-xed in 4% paraformaldehyde solution in
0.1 M phosphate buer for 1 week and cryoprotected in 30% buered
sucrose until it sank. A post-mortem MRI was performed on the brain
to conrm the trajectory of the cannulae. The brain was imaged in a
Bruker Biospec USR AV III 4.7 T/400 mm scanner with a 600 mT/m
eld gradient interfaced with ParaVision 5.1 software (Bruker Biospec,
Wissembourg, Germany). Images were acquired in the coronal plane.
Histology. The brain, after MR imaging, was then rinsed in 0.9%
NaCl solution and frozen. Horizontal sections (50 m) were collected
from the imprint sites using a cryostat (Leica Microsystems, Nussloch
GmbH). Some sections were processed to detect the implantation
sites using cresyl violet staining. Antibodies used were raised against
GFAP (rabbit polyclonal, diluted 1:1000, Dakocytomation, Glostrup,
Denmark) as a marker for astrocytes, and Iba-1 (rabbit polyclonal,
diluted 1:1000, Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany) was used
as a pan-microglia marker. Incubations for primary antibodies were
maintained overnight at 4 C. After washing, the sections were
incubated in Alexa 488 secondary antibodies (diluted 1:1000,
Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) for 1 h at room
temperature. Counterstaining cells for confocal laser scanning
microscopy was done with propidium iodide (Molecular Probes,
Leiden, The Netherlands). After additional rinsing, the sections were
mounted with Fluorsave (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) and
bound primary antibodies were visualized on a confocal microscope
(Olympus, Hamburg, Germany).
Cerebral Imprint Microscopy. Two dierent chips from
putamen were used for microscopy; one for scanning electron
micrography and one for immunouorescence.
Scanning electron micrography (SEM) was carried out to observe
the distribution of the tissue harvested by the silicon chip.
Immunouorescence was used to conrm the presence of neurons
and astrocytes on the chip in contact with putamen tissue.
To x the tissue, the silicon chip was immersed into 1 mL of 4%
PFA in PBS buer for 30 min.
For SEM, the chip was then dehydrated through an ascending series
of ethanol and critical point dried using CO
2
. The chip was examined
in an FEI Quanta 200 scanning electron microscope (FEI, Eindhoven,
The Netherlands).
Immunouorescence. After three washes in PBS, neurons and
astrocytes were stained using NeuN (mouse antibody clone A60,
Millipore) and GFAP antibodies (rabbit antibody, ab7260, abcam),
respectively, diluted at 1:200 in PBST (PBS buer and 0.5% Triton-X-
100) for 1 h at RT. After three washes in PBST, the silicon chip was
incubated with secondary polyclonal antibodies conjugated to Alexa
488 (anti-mouse) and Alexa 568 (anti-rabbit) (1:1000 dilution,
Molecular Probes), and Hoechst 33258 at 2 g/mL in PBST for 30
min at RT. After washes in PBST, the chip was mounted on glass
slides and observed with a Zeiss Axiovert 200 M inverted microscope.
Images were acquired using CoolSnap HQ (Photometrics) and a plan-
apochromat 63 oil objective (Zeiss) with a black and white camera
driven by the Metamorph software (Universal Imaging).
Proteomic Analysis. Two dierent cerebral imprints performed in
putamen and two performed in caudate nucleus were used for
proteomic analysis. Once the cerebral imprint was performed, the
silicon chip was removed from the tool and rinsed 5 min in saline
buer to minimize blood contamination prior to protein extraction in
8 M urea buer for 30 min under agitation. The total protein amount
recovered from the tissue imprint was quantied by Bradford protein
assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). We performed MS
proling using cationic ProteinChip arrays (CM10, Biorad). The
ProteinChips were equilibrated for 5 min with 150 L of binding
buer (100 mM sodium acetate at pH 4). Two micrograms of total
proteins was applied to each ProteinChip and incubated for 60 min at
room temperature. The arrays were washed three times with the
adequate binding buer then rinsed with deionized water. After air-
drying, 0.8 L of saturated sinapinic acid matrix (50% acetonitrile,
0.5% triuoroacetic acid) was added twice to each array spot. Proling
was performed on a MALDI mass spectrometer (Autoex, Bruker) in
a linear mode;. 5400 laser shots were acquired for each sample with a
laser intensity of 55 and a matrix attenuation of 1000 Da. An extensive
examination of the protein extract was also performed from one
imprint by nano-LC-MS/MS. Fifteen micrograms of proteins was
diluted in Laemli buer and loaded in duplicate on SDSPAGE gel
(BioRad Laboratories) for protein electrophoresis migration. The gel
was stained with Coomassie blue and sliced in 12 bands prior to
iodoacetamide alkylation and in-gel digestion using trypsin. Peptides
were extracted from gel bands and dried in a SpeedVac. Peptides were
resuspended in 2% acetonitrile/0.2% formic acid buer and injected
into a nano-liquid chromatography system (Ultimate 3000, Dionex)
coupled to an LTQ Orbitrap Velos (Thermo). Peptides were
separated using a micro-precolumn cartridge (C18 Pepmap 100, LC
Packings) and then separated using a 90 min RP gradient on a C18
column (Gemini C18 3 m 100A, 75 m 150 mm).
Data were processed using Mascot server 2.3.0 (Matrix Science)
using following parameters: Enzyme=Trypsin/P with a maximum of
two missed cleavages, a mass tolerance of 10 ppm for MS and 1 Da for
MS/MS, with a xed modixation of carbamidomethyl (C), and two
variable modications of acetyl (protein N-term) and oxidation (M).
Validation and false-positive rate assessment were performed using
IRMA and hEIDI softwares. Protein groups identied with a minimum
of two dierent peptides were validated.
Our data set was further submitted to Ingenuity Pathway Analysis
software (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) to perform the
functional characterization of the proteins recovered from the imprint
tool. This automatic annotation tool uses a knowledge database and
assigns proteins to functional classes or specic canonical pathways
(CP) related to various biological processes.
13
Transcriptomic Analysis. Two dierent cerebral imprints from
the same caudate nucleus were used for transcriptomic comparison.
Once the cerebral imprint was performed, the silicon chip was
removed and quickly immersed in 500 L of the lysis buer from the
mirVana isolation kit (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA).
Then, total RNAs were extracted from the cerebral imprint using the
mirVana isolation kit, and their concentration was determined with the
measure of absorbance at 260 nm. Their quality and RNA integrity
were controlled by capillary electrophoresis migration using RNA
Nano 6000 kit and the Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo
Alto, CA). For microarray analysis, 200 ng of total RNA were
amplied with the GeneChip 3 IVT Express Kit. First, total RNA was
reverse-transcribed using primers polydT-T7 promoter sequence;
cDNA was double-stranded synthesized and nally amplied with
biotinylated dNTP by the T7 RNA polymerase. Microarrays
experiments were carried out in accordance with the protocol
GeneChip Expression Wash, Stain and Scan from Aymetrix. Briey,
15 g of labeled cRNA was hybridized for 16 h at 45 C on GeneChip
Human Genome U133 Plus 2.0 (Aymetrix) corresponding to 54675
unique gene probe sets. The arrays were washed and stained with
streptavidinphycoerythrin before scanning. The uorescence values
of each probe set signal, reported in arbitrary units, were processed
with MAS5 statistical algorithm to validate the probe set signal
absent or present, and nally they were normalized between all
the arrays using the Robust Multichip Analysis (RMA) algorithm.
These algorithms are included in Aymetrix expression console.
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ASSOCIATED CONTENT
*S Supporting Information
A complete list of all proteins identied. This material is
available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

AUTHOR INFORMATION
Corresponding Author
*Mailing address: Grenoble Institut des Neurosciences,
INSERM U836, Batiment Edmond J. Safra, Universite Joseph
Fourier, 38042 Grenoble cedex 9, France. E-mail: zaccaria.
af@gmail.com. Phone number: +33 (0)4 56 52 06 43.
Author Contributions
A.Z. designed and performed experiments, analyzed data, and
wrote the paper. A.B. designed proteomic experiments and
wrote the paper. L.S. performed experiments on animals.
M.E.A. performed transcriptomic analysis. A.M.H., Y.C., C.B.,
and J.G. performed proteomic analysis. A.J. performed
microscopy and wrote the paper. H.M. performed post-mortem
MRI. D.R. performed histology and wrote the paper. A.L.B.
contibuted to the study design. S.C. performed surgical
procedures and supervised in vivo experiments. B.P. supervised
and performed in vivo experiments. F.B. supervised the study
and wrote the paper.
Funding
The Region Rhone Alpes and the Foundation InnabioSante
supported this work.
Notes
The authors declare no competing nancial interest.

ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Vincente Di Calogero and Michallat
Sandrine for their assistance with the preoperative and
postoperative care of the primates. We thank DRT/DTBS
from CEA-LETI Grenoble, particularly Marie-Line Cosnier, for
the manufacturing and the chemical functionalization of the
silicon chips. We are also grateful to Dr Darle ne Lobel for
discussion and manuscript revisions.

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3. Conc|us|ons et erspect|ves.
Crce au developpemenL de ce nouvel ouLll chlrurglcal, nous avons pu reallser plusleurs
emprelnLes Llssulalres dans le noyau caude eL le puLamen, a dlfferenLs Lemps chez le prlmaLe
saln, sans engendrer de leslons foncLlonnelles. Les analyses proLeomlques eL
LranscrlpLomlques du Llssu recupere sur le slllclum onL clalremenL monLre la posslblllLe
d'obLenlr des lnformaLlons moleculalres represenLaLlves des noyaux clbles. Ln effeL, la
posslblllLe d'exposer eL de masquer le slllclum permeL une capLure speclflque de nos clbles,
ellmlnanL alnsl les rlsques de conLamlnaLlon par les dlfferenLs noyaux Lraverses au cours de
la Lra[ecLolre. CeLLe valldaLlon d'efflcaclLe de capLure !"# (!(' chez le prlmaLe eLalL
lndlspensable avanL d'envlsager l'uLlllsaLlon de noLre ouLll en cllnlque en lleu eL place du
sLyleL chlrurglcal uLlllse au cours de l'lmplanLaLlon d'elecLrodes de sLlmulaLlon. Ln parallele,
dlfferenLs LesLs, de LoxlclLe, de senslblllsaLlon eL d'lrrlLaLlon onL eLe reallses par un
laboraLolre exLerleur afln d'evaluer les rlsques d'un conLacL algu ou chronlque du cerveau
avec le slllclum modlfle , les resulLaLs de ces LesLs sonL fournls en annexe eL conflrmenL la
non LoxlclLe de noLre ouLll. L'uLlllsaLlon de noLre ouLll en cllnlque ouvrlralL la porLe a d'auLres
paLhologles cerebrales qul requlerenL une lnLervenLlon neurochlrurglcale. Ln plus de
l'lnLerL cerLaln de dlsposer de maLerlel blologlque analysable provenanL de Llssus cerebraux
lmpllques dans les paLhologles neurodegeneraLlves, l'ouLll d'emprelnLe Llssulalre peuL avolr
des appllcaLlons poLenLlelles ma[eures dans l'eLude des paLhologles cancereuses. La blologle
moleculalre des Lumeurs se falL acLuellemenL sur des Llssus obLenus lors d'exereses ou de
blopsles. CependanL, dans la ma[orlLe des cas, la recldlve Lumorale survlenL dans les zones
perl-Lumorales, ou les cellules Lumorales envahlssenL le Llssu saln. noLre ouLll permeLLralL de
reallser des emprelnLes au nlveau des dlfferenLes sLrucLures abordees au cours de
l'lnLervenLlon chlrurglcale permeLLanL alnsl d'effecLuer un prelevemenL moleculalre non
desLrucLlf dans l'envlronnemenL saln eL perl-Lumoral lnfllLre, eL fournlssanL un complemenL a
l'analyse anaLomopaLhologlque. Avec la conservaLlon de la spaLlallLe Llssulalre sur le slllclum,
nous pourrlons dlsLlnguer hlsLologlquemenL mals aussl moleculalremenL la Lumeur, la zone
perl-Lumorale eL le Llssu saln. Ces donnees vlendralenL compleLer les lnformaLlons fournles
par l'l8M afln de dellmlLer les berges Lumorales. ue plus avec l'emergence de l'l8M per-
operaLolre eL des sysLemes de neuro-navlgaLlon, l'uLlllsaLlon de noLre ouLll dans ce nouvel
envlronnemenL chlrurglcal seralL la condlLlon ldeale pour l'obLenLlon d'une lnformaLlon
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moleculalre speclflque d'une reglon cerebrale parLlcullere. nous avons donc elabore un
proLoLype de noLre ouLll d'emprelnLe a parLlr d'un maLerlau l8M compaLlble : le
polyeLhereLherceLone (LLk). ues premlers LesLs reallses en l8M sur un klwl (llgure 23) ne
monLrenL pas de dlsLorslons du slgnal eL permeLLenL de dlsLlnguer clalremenL les dlfferenLs
consLlLuanLs du frulL (cour, graln eL chalr). u'auLres LesLs n'onL revele aucun echauffemenL
du maLerlau nl de mlcro-mouvemenLs duranL les acqulslLlons de sequences.

I|gure 23: IkM d'un out|| d'empre|nte en LLk dans un k|w|
Afln de conserver la spaLlallLe de l'lnformaLlon moleculalre presenLe sur les emprelnLes,
nous developpons acLuellemenL une approche d'lmagerle proLelque dlrecLemenL sur les
puces en slllclum. La superposlLlon des proflls proLelques obLenus, avec l'lmagerle
anaLomlque du slLe d'emprelnLe permeLLralL une carLographle proLelque !"#(!(', unlque a ce
[our, de la sLrucLure clblee. Ln parallele, nous Lravalllons aussl au developpemenL de surfaces
en slllclum nano-poreux qul permeLLralL l'eLude du pepLldome eL du meLabolome cerebral.
Lnfln, blen que noLre eLude chez le prlmaLe eL pour ob[ecLlf de vallder !"#(!(' l'efflcaclLe de
la capLure Llssulalre eL le caracLere peu leslonnel de noLre ouLll, la reallsaLlon d'emprelnLe
Llssulalre auralL un lnLerL dans les modeles anlmaux exposes au M1 ou aux pesLlcldes eL
reprodulsanL la degenerescence dopamlnerglque de la Snc observee dans la M (Lmborg
2007). Ln effeL, l'analyse proLeomlque de la Snc eL d'auLres noyaux cerebraux, vla des
emprelnLes reallsees a dlfferenLs Lemps de la neurodegenerescence permeLLralL de
decrypLer les modlflcaLlons moleculalres lndulLes par une exposlLlon au M1 ou aux
pesLlcldes. Afln de mleux comprendre les mecanlsmes moleculalres de la sLlmulaLlon
cerebrale profonde, on peuL aussl uLlllser noLre ouLll pour comparer le conLenu proLelque
d'un S1n sLlmule eL d'un S1n conLrle. Ces dlfferenLes eLudes seronL cerLalnemenL lnlLlees a
CllnaLec duranL l'annee 2013.
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kLSUL1A1S
art|e II
Dve|oppement d'une stratg|e pour |'ana|yse
protom|que des f|u|des b|o|og|ques en c||n|que.
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Rsultats I : Lutilisation de NPs pour lanalyse protomique du LCR.
37
I. L'ut|||sat|on de nanopart|cu|es pour |'ana|yse
protom|que du LCk.
1. Introduct|on
1) Du t|ssu patho|og|que aux f|u|des b|o|og|ques
8len que le Llssu paLhologlque solL la mellleure source d'echanLlllon pour le dlagnosLlc eL la
comprehenslon des mecanlsmes moleculalres assocles a la M, la dlfflculLe d'acces au
cerveau, couplee a l'lnvaslvlLe leslonnelle des blopsles a naLurellemenL ouverL la vole a
l'analyse proLeomlque des fluldes blologlques (Lller and Wllllams 2009) dans le buL d'eLabllr
des marqueurs moleculalres plus accesslbles, molns coLeux eL molns lnvaslfs pour une
uLlllsaLlon en rouLlne cllnlque. ue plus avec l'arrlvee du SLLul-1Cl-MS eL du profllage hauL
deblL, l'espolr de meLLre en evldence des proflls proLelques speclflques d'une paLhologle a
encourage l'analyse de ces fluldes (ConsLanLlnescu, Andreasson eL al. 2010). CeLLe quLe de
marqueurs moleculalres clrculanLs emane du paradlgme que chaque Llssu lnforme de son
eLaL physlopaLhologlque au Lravers des proLelnes que ce Llssu llbere dans les fluldes
blologlques les plus proches (Ahn and Slmpson 2007). Alnsl, ce qul pouvalL Lre consldere
comme de slmples decheLs moleculalres, consLlLueralL en reallLe une verlLable mlne d'or
dlagnosLlque. uans la premlere phase de decouverLe d'un marqueur proLelque clrculanL, la
selecLlon du flulde blologlque le plus approprle, ou ces proLelnes Llssulalres seralenL
sufflsammenL concenLrees, esL une eLape cruclale.
2) Le ||qu|de cpha|o-rach|d|en.
uans le conLexLe des maladles neurodegeneraLlves, le llqulde cephalo-rachldlen (LC8) qul
balgne le cerveau eL la moelle eplnlere pourralL alnsl refleLer l'eLaL physlopaLhologlque du
Llssu cerebral eL represenLeralL donc un reservolr poLenLlel de marqueurs proLelques
perLlnenLs (Puhmer, 8lrlnger eL al. 2006). Le LC8 (!ohanson, uuncan eL al. 2008) esL un
llqulde blologlque LransparenL. Sa concenLraLlon en proLelnes esL de l'ordre de 0,2 a 0,3
mg/ml. 80 de ceLLe concenLraLlon esL represenLee par des proLelnes en provenance du
sang, eL seulemenL 20 par des proLelnes en provenance du Llssu cerebral (8elber 2001). ll
esL produlL essenLlellemenL par les plexus choroides eL clrcule dans les venLrlcules cerebraux
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eL l'espace sous arachnoidlen. Son volume chez l'adulLe esL d'envlron 130 ml eL sa
producLlon de l'ordre de 300 a 730 ml par [our, solL un renouvellemenL LouLes les 6 a 8
heures. Le LC8 assure plusleurs foncLlons donL la proLecLlon mecanlque eL lmmunologlque
du cerveau, la regulaLlon de la presslon lnLracrnlenne, le LransporL des nuLrlmenLs eL
l'excreLlon des subsLances Loxlques (Zhang 2007). ll esL accesslble vla la poncLlon lombalre
qul esL un gesLe chlrurglcal relaLlvemenL sr eL peu lnvaslf, eL qul conslsLe a lnLrodulre une
algullle dans l'espace sous arachnoidlen enLre les verLebres L4 eL L3 eL a recuellllr le llqulde
qul gouLLe a la sorLle de l'algullle.
3) L'ana|yse protom|que du LCk
uepuls plusleurs annees, de nombreux essals cllnlques onL clble l'expresslon de proLelnes
candldaLes dans le LC8 pour le dlagnosLlc de cerLalnes maladles neurodegeneraLlves
(Sunderland, Llnker eL al. 2003), (Shl, 8radner eL al. 2011), (Zerr, 8odemer eL al. 1998). Ces
eLudes prlnclpalemenL basees sur des approches proLelne-anLlcorps onL revele des
marqueurs dlagnosLlcs poLenLlels qu'll faudralL conflrmer a plus grande echelle eL dans
dlfferenLs cenLres. A Lravers la quanLlflcaLlon de ces proLelnes clbles, ces eLudes onL aussl
souleve le probleme de la gamme de concenLraLlon des proLelnes du LC8. Ln effeL, a l'lnsLar
du plasma sanguln, la gamme de concenLraLlon des proLelnes dans le LC8 esL Lres
lmporLanLe : l'albumlne ma[orlLalre dans ce flulde esL presenLe a hauLeur de 0,1 a 0,3 mg/ml
alors que les proLelnes mlnorlLalres comme la proLelne Lau a hauLeur du pg/ml (Shl, 8radner
eL al. 2011). CeL ecarL de concenLraLlon de 8 a 9 ordres de grandeur esL l'obsLacle ma[eur a
l'ldenLlflcaLlon eL a la quanLlflcaLlon des proLelnes les molns concenLrees par les approches
nano-LC-MS/MS ou 2uL-MS/MS, donL la gamme de deLecLlon esL seulemenL de 4-3 ordres
de grandeur.
8len que de nombreuses eLudes alenL conLrlbue lndlvlduellemenL a l'ldenLlflcaLlon de
plusleurs cenLalnes de proLelnes dans le LC8 par nano-LC-MS/MS (MouLon-8arbosa, 8oux-
ualval eL al. 2010), (an, Zhu eL al. 2007), eL revele, par des approches de proLeomlque
quanLlLaLlve, des dlfferences d'expresslon proLelque dans les maladles neurodegeneraLlves
(Abdl, Culnn eL al. 2006), elles onL necesslLe de larges volumes d'echanLlllons eL/ ou de
longues eLapes de fracLlonnemenL eL de separaLlon, a la fols sur gel SuS-ACL au nlveau
proLelque, mals aussl sur colonne chromaLographlque au nlveau pepLldlque. u'un polnL de
vue quallLaLlf, ces eLudes sonL lndlspensables a l'ldenLlflcaLlon du proLeome mlnorlLalre du
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LC8. Mals elles sonL clalremenL lncompaLlbles avec des eLudes quanLlLaLlves, sur un grand
nombre d'echanLlllons lndlvlduels, en vue d'ldenLlfler eL vallder des marqueurs moleculalres
en proLeomlque cllnlque. Avec le developpemenL des approches de quanLlflcaLlon sans
marquage (ou label free ), basees sur la comparalson dlrecLe des slgnaux MS des pepLldes
elues des colonnes de nano-LC, ll esL posslble d'envlsager des eLudes de profllage quanLlLaLlf
sur un grand nombre de paLlenLs. CependanL, ll demeure lndlspensable de redulre la gamme
de concenLraLlon dans l'echanLlllon en amonL, avanL l'analyse par specLromeLrle de masse.
CeLLe eLape dolL Lre reproducLlble, raplde eL auLomaLlsee afln de permeLLre le pre-
LralLemenL de cenLalnes d'echanLlllons slmulLanemenL. Llle dolL aussl Lre efflcace sur de
falbles volumes d'echanLlllons (lnferleur a 1 ml) afln de LralLer le LC8 de chaque paLlenL
lndlvlduellemenL en LrlpllcaLs, eL de conflrmer les resulLaLs par d'auLres approches.
4) L'ut|||sat|on de m|cro]nanopart|cu|es pour |'ana|yse protom|que haut db|t du LCk.
a. Le roteom|ner.
Ln 2008, une nouvelle Lechnologle developpee par 8lorad a lnLrodulL le concepL
d'egallsaLlon des concenLraLlons proLelques d'un echanLlllon. CeLLe Lechnologle nommee
roLeomlner esL basee sur l'uLlllsaLlon de mlcrobllles, chacune porLeuse d'un hexapepLlde
dlfferenL obLenu par comblnalson aleaLolre (Cuerrler, 8lgheLLl eL al. 2008,8lgheLLl and
8oscheLLl 2008). lncubees avec ces mlcrobllles, les proLelnes de l'echanLlllon se reLrouvenL
en conLacL avec des mllllons d'hexapepLldes dlfferenLs permeLLanL LheorlquemenL a chaque
proLelne de Lrouver un slLe de flxaLlon. une fols leurs slLes saLures, les proLelnes en exces
sonL ellmlnees avec le surnageanL, permeLLanL alnsl de redulre les dlfferences de
concenLraLlon dans l'echanLlllon (llgure 24).

I|gure 24: r|nc|pe de |'ga||sat|on des concentrat|ons prot|ques par |e roteom|ner
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L'uLlllsaLlon de roLeomlner a revele son efflcaclLe dans de nombreux Lypes d'echanLlllons
(CasLagna, Cecconl eL al. 2003), (Sennels, Salek eL al. 2007), (8oux-ualval, Conzalez de
eredo eL al. 2008) donL le LC8 (MouLon-8arbosa, 8oux-ualval eL al. 2010). Ln 2010,
MouLon-8arbosa eL )%* onL ldenLlfle plus de 1200 proLelnes dlfferenLes par analyse nano-LC-
MS/MS a parLlr d'un pool d'un llLre d'echanLlllon eL au prlx d'un fracLlonnemenL exLenslf.
L'uLlllsaLlon du roLeomlner dans des condlLlons plus compaLlbles avec les condlLlons
cllnlques a permls d'ldenLlfler par nano-LC-MS/MS, eL de quanLlfler par une approche label
free , envlron 230 proLelnes a parLlr de 2 ml de LC8. Ces premlers resulLaLs lalssenL
envlsager l'uLlllsaLlon de ceLLe sLraLegle dans des eLudes cllnlques d'auLanL plus que la
preparaLlon des echanLlllons esL auLomaLlsable sur plaque 96 pulLs. ll faudralL neanmolns
conflrmer l'efflcaclLe du roLeomlner sur des volumes plus falbles eLanL donne les
dlfflculLes a dlsposer de 2 ml de LC8 pour chaque paLlenL dans un conLexLe de maladles
neurodegeneraLlves.
b. Les nanopart|cu|es magnt|ques fonct|onna||ses.
Avec l'assoclaLlon des nanoLechnologles a la proLeomlque (!ohnson, Zhukovsky eL al. 2008),
(8ay, 8eddy eL al. 2011), l'uLlllsaLlon en specLromeLrle de masse de nanoparLlcules (ns)
magneLlques eL foncLlonnallsees chlmlquemenL s'esL rapldemenL revelee lnLeressanLe. Leur
lncubaLlon avec des fluldes blologlques a permls un enrlchlssemenL conslderable des proflls
proLelques en MS (lledler, 8aumann eL al. 2007), (8aumann, Ceglarek eL al. 2003),
(vlllanueva, hlllp eL al. 2004). lnsplrees des surfaces SLLul, les dlfferenLes chlmles greffees
sur les ns vonL permeLLre la capLure d'un sous proLeome parLlculler. La forme spherlque eL
la Lallle nanomeLrlque des parLlcules leur conferenL un rapporL surface de conLacL-volume
occupe Lres lmporLanL permeLLanL une concenLraLlon des proLelnes a leur surface. Leur
proprleLe magneLlque faclllLe leur manlpulaLlon pour les dlfferenLes eLapes de lavage eL
d'eluLlon, permeLLanL d'ellmlner les sels eL d'eluer les proLelnes dans des Lampons
compaLlbles avec la specLromeLrle de masse. CeLLe proprleLe a aussl permls de developper
une plaLe forme comme celle decrlLe par vlllanueva eL al (vlllanueva, Lawlor eL al. 2006) qul
permeL d'auLomaLlser lnLegralemenL les experlences.
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I|gure 2S: r|nc|pa|es tapes de |'ut|||sat|on de Ns magnt|ques pour |a capture prot|que dans |es f|u|des b|o|og|ques
d'aprs V|||anueva et a|.
!usqu'a presenL, la pluparL des eLudes uLlllsanL des ns se sonL llmlLees au profllage
proLelque du flulde eLudle sans reellemenL caracLerlser l'ldenLlLe des proLelnes, nl mme
vallder la reproducLlblllLe de capLure des ns. ConcernanL le LC8, l'unlque reference LralLe
de l'uLlllsaLlon de ns foncLlonnallsees avec un anLlcorps dlrlge conLre les llgands dlffuslbles
derlves de l'amyloide beLa (Ceorganopoulou, Chang eL al. 2003).
Ln co||aborat|on avec |e |aborato|re du Dr 8ernard Monsarrat 1ou|ouse, qu| a pub||
|'tude du LCk avec roteom|ner (Mouton-8arbosa, koux-Da|va| et a|. 2010) et qu| fut
trs |ntress par nos prem|ers rsu|tats, nous avons dc|d de caractr|ser en dta|| |es
capac|ts de ces Ns, travers |'|dent|f|cat|on par nano-LC-MS]MS des prot|nes captes,
et |'va|uat|on de |eur reproduct|b|||t de capture par une quant|f|cat|on sans marquage
des prot|nes |dent|f|es. Nous avons cho|s| emp|r|quement |es 2 types de Ns |es p|us
comp|menta|res d'aprs |es prof||s MS obtenus par MALDI-1CI af|n d'extra|re |e
max|mum d'|nformat|on du protome du LCk.
2. Art|c|e 3
A nanopart|c|e-ass|sted strategy for CSI b|omarker research |n c||n|ca| proteom|cs.
Aff|f 2accar|a, llorence 8oux-ualval, All 8ouamranl, 8ernard MonsarraL, lranols 8erger.
Iourna| of roteome kesearch.
Supp| data : https:]]docs.goog|e.com]fo|der]d]081GhVL-38pV8VkVIVLk2MG|xUk]ed|t
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Afflf Zaccarla
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, llorence 8oux-ualval
2
, All 8ouamranl
3
,
8ernard MonsarraL
2
, lranols 8erger
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',.,$'*9")#"*+)#)*$+"*%#(,E(:
F#('%/<*()%#"
ldenLlflcaLlon of new molecular markers ls a prlorlLy ln
cllnlcal proLeomlcs and a key lssue for nanomedlclne and
personallzed dlsease monlLorlng. Ahead of Lhe relaLlve
lnaccesslblllLy of paLhologlcal Llssue and lnvaslve blopsles
ln neurologlcal dlsorders, many research groups focus on
proLeomlc analysls of blologlcal flulds for esLabllshmenL
of perlpheral blomarkers
1,2,3
. uue Lo lLs proxlmlLy Lo Lhe
braln Llssue, Lhe cerebrosplnal fluld (CSl), cllnlcally
accesslble Lhrough sLandard, relaLlvely safe and
uncompllcaLed lumbar puncLure could reflecL Lhe
meLabollLe sLaLe of Lhe cenLral nervous sysLem under
physlologlcal and paLhologlcal sLaLes
4
, and represenLs an
ldeal source of poLenLlal cllnlcally relevanL blomarkers for
neurologlcal dlseases
3,6,7,8,9.
neverLheless, Lhe hlgh
dynamlc range of proLeln concenLraLlon ls Lhe ma[or
barrler Lo a global vlew of CSl proLeome. ln facL, albumln
Lhe mosL abundanL proLeln ln CSl ls concenLraLed aL 130-
330 mg/ llLer and represenLs 43 of LoLal proLeln
quanLlLy whlle cyLoklnes are concenLraLed around ng/
llLer. Moreover, dlsposlng of more Lhan 1 ml of CSl for
each paLlenL ln proLeomlc sLudles ls dlfflculL. ln LhaL
conLexL, ldenLlflcaLlon of low abundanL proLelns for
research of neurologlcal-dlsease blomarkers ls a ma[or
challenge. SLudles based on Lwo-dlmenslonal gel were
Lhe flrsL Lo provlde CSl maps buL Lhe low dynamlc range
of Lhe Lechnlque llmlLed Lhe number of proLelns
ldenLlfled Lo Lhe 30 more abundanL specles
10,11,12
. More
recenLly, developmenL of nano-LC-MS/MS Lechnology
lncreased Lo several hundreds Lhe number of proLelns
ldenLlfled ln CSl
13,14,13
buL requlred hlgh volume samples
and exLenslve fracLlonaLlons, lncompaLlble wlLh hlgh
LhroughpuL cllnlcal sLudles. WlLh Lhe emergence of
nanoLechnologles, magneLlc nanoparLlcles (ns) could
provlde adequaLe soluLlon for sample fracLlonaLlon prlor
Lo ldenLlflcaLlon by nano-LC-MS/MS. ln facL, Lhe
comblnaLlon of dlfferenL chemlcal funcLlons wlLh a hlgh
surface Lo volume raLlo would glve access Lo varlous and
more concenLraLed sub-proLeomes. Moreover Lhe
comparable slze Lo blomolecules endows ns wlLh
unlque physlcochemlcal properLles LhaL are noL observed
ln Lhelr bulk forms, maklng Lhem very aLLracLlve for low
abundanL blomarker harvesLlng. WlLh Lhe developmenL
of MS-assoclaLed label-free approaches
16
, proLelns
harvesLed by ns and ldenLlfled by nano-LC-MS/MS
could accuraLely be quanLlfled by Lhe dlrecL comparlson
of Lhelr MS pepLlde slgnals.
ln Lhls sLudy, we assessed Lhe capaclLy and Lhe
reproduclblllLy of ns for proLeln harvesLlng ln low
volume of CSl. SuS-ACL and MS approaches revealed
enrlched proLeln proflles and a clear dlmlnuLlon of
albumln proporLlon ln n-LreaLed CSl. 1he exhausLlve
ldenLlflcaLlon by nano-LC-MS/MS revealed 409 dlfferenL
proLelns, and label-free quanLlflcaLlon of repllcaLes
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I|gure 1: rote|n prof||es of non-treated and N-treated CSI. A) 1D SDS-AGL - the wh|te arrow shows the pos|t|on of the a|bum|n
prote|n and (8) MALDI-1CI-MS show|ng eff|c|ency of the N-treatment for enr|ched prote|n detect|on compared to non-treated
CSI extract. 1he same quant|ty of prote|ns was |oaded on ge| and on ch|p for the d|fferent samp|es.

conflrmed Lhe reproduclblllLy of ns. Such sLraLegy only
requlred 400 l of CSl and could be applled Lo cllnlcal
sLudles for Lhe rapld and ln-depLh proflllng of large serles
of samples, whlch ls mandaLory for CSl blomarker
dlscovery ln neurologlcal dlseases.
Mater|a|s and Methods
!"#$%&"'()
MagneLlc nanoparLlcles of 100 nm ln aqueous suspenslon
were obLalned from Chemlcell CmbP (8erlln, Cermany).
1helr magneLlLe core glves Lhem a superparamagneLlc
behavlor, and Lhey are grafLed wlLh dlfferenL maLrlces
and funcLlonal groups. 1hey have a mulLl-domaln core
allowlng a fasL and easy magneLlc lsolaLlon by an exLernal
magneL (MagneLou8L, Chemlcell CmbP, 8erlln,
Cermany).
1wo dlfferenL klnds of nanoparLlcles were used ln our
sLudy, fluldMAC-CS and fluldMAC-C. ueLalled feaLures
are avallable on hLLp://www.chemlcell.com/.
Sequenclng grade Lrypsln was from romega (Madlson,
Wl). AceLonlLrlle and LrlfluoroaceLlc acld were from
Slgma-Aldrlch. LqulpmenL and reagenLs for 1u-SuS ACL
were from 8lo-8ad.
*+,)-.''$-#&./)"/0)#%$"#1$/#).2)*+,)3&#4)56)(#%"#$78
Puman CSl used ln Lhls sLudy was obLalned from varlous
pooled samples collecLed ln unlverslLy PosplLal of
Crenoble followlng lumbar puncLure of paLlenLs wlLh
headache and/ or susplclon of neurologlcal dlsease. 1hls
collecLlon followed Lhe lrench regulaLlon and was
approved aL Lhe naLlonal level.
200 l of CSl was added Lo 300 g of C or CS-ns ln
LrlpllcaLe condlLlons and sllghLly aglLaLed for 43 mln aL
room LemperaLure. ns were aLLracLed Lo one slde of Lhe
sample Lube by an exLernal magneL and CSl was
removed. ns were washed 3 Llmes ln 8S and Lhe
proLelns capLured by ns were eluLed wlLh aceLonlLrlle /
1lA 1 (30 / 20 ) ln dlsLllled waLer. 1he proLeln
concenLraLlon of each eluLed soluLlon and crude CSl was
deLermlned by a 8radford proLeln assay from 8lo-8ad.
9/"'8(&().2)*+,):8);<)+<+=69>?!
10 g of proLelns from n-LreaLed CSl, and crude CSl
were mlxed wlLh Laemll buffer (4 SuS, 20 glycerol,
10 2-mercapLoeLhanol, 0.004 bromophenol blue,
0.123 M 1rls PCl). 1he mlxLure was heaLed and loaded on
a precasL 4 Lo 13 polyacrylamlde gel for 1u-
mlgraLlon. SLalnlng and desLalnlng were performed wlLh
Coomassle blue and 30 eLhanol/ 7 aceLlc acld ln
waLer respecLlvely.
9/"'8(&().2)*+,):8)!9@<A=BC,=!+!
epLlde and proLeln proflles were analyzed wlLh a
Mlcroflex MALul-1Cl mass specLromeLer (8ruker
ualLonlk, 8remen, Cermany). 2 l of crude CSl or n-
eluaLe (l.e 0.3 g/l) were mlxed wlLh 2 l of premade !-
cyano-4-hydroxy-clnnamlc acld (PCCA) or slnaplnlc acld
(SA), and 1 l was deposlLed for MALul-1Cl-MS.
SeparaLe specLra were obLalned for Lwo dlfferenL mass-
Lo-charge (m/z) ranges correspondlng Lo proLelns wlLh
molecular mass of 0.8-13 kua and 13-100 kua (assumlng
z=1). SpecLra were recorded ln Lhe poslLlve llnear mode
(laser frequency 200 Pz, lon source volLage, 20 kv). lor
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each specLrum, 200 shoLs ln 30-shoL sLeps from dlfferenL
poslLlons on Lhe LargeL spoL (auLomaLlc mode) were
collecLed uslng llexConLrol sofLware (verslon 3.0, 8ruker
ualLonlk).
!"#$%&'%()*()+ "#",-./.+ $0+ ')1+ 23$45/#.+ 6"375.458+ 9-+
!:%.43"45;-!!
10 g of each eluaLe and crude CSl were dlluLed ln
Laemll buffer and sLacked ln one band afLer a shorL and
low volLage elecLrophoreLlc mlgraLlon on SuS ACL gel.
AfLer Lrypslc dlgesLlon, Lhe resulLlng pepLldes were
exLracLed from Lhe gel and analyzed by nano-LC-MS/MS
uslng an ulLlmaLe3000 sysLem (ulonex, AmsLerdam, 1he
neLherlands) coupled Lo an L1C-CrblLrap velos mass
specLromeLer (1hermo SclenLlflc, 8remen, Cermany). 1he
L1C-CrblLrap was operaLed ln daLa-dependenL
acqulslLlon mode wlLh Lhe xcallbur sofLware. Survey scan
MS specLra were acqulred ln Lhe CrblLrap on Lhe 300-
2000 m/z range wlLh Lhe resoluLlon seL Lo a value of
60,000. 1he flve mosL lnLense lons per survey were
selecLed for Clu fragmenLaLlon, and Lhe resulLlng
fragmenLs were analyzed ln Lhe llnear Lrap (L1C).
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I|gure 2: Venn d|agrams represent|ng the extent of over|ap of
prote|ns |dent|f|ed by LC-MS]MS ana|ys|s. A, compar|son
made between the crude CSI (1S6 prote|ns) CS-Ns treated
CSI (321 prote|ns) and -NS treated CSI (291 prote|ns). 8,
compar|son among the two N-treated samp|es (-N, 291
prote|ns, CS-N, 321 prote|ns). C, compar|son between crude
CSI (1S6 prote|ns) and a|| N-treated samp|es (409 prote|ns).
<"4"9".5+)5"3=6+"#8+<"4"+>#",-./.+
1he MascoL uaemon sofLware (verslon 2.3.0, MaLrlx
Sclence, London, uk) was used Lo perform daLabase
searches agalnsL homo saplens enLrles ln unlproL proLeln
daLabase (release 2010_09 - Sep 21, 2010, 1213333
sequences). MascoL resulLs were parsed wlLh Lhe ln-
house developed sofLware MascoL llle parslng and
CuanLlflcaLlon (MlaC) verslon 4.0.0
(hLLp://mfpaq.sourceforge.neL/), and proLeln hlLs were
auLomaLlcally valldaLed.
&"95,%0355+?@"#4/0/="4/$#+
CuanLlflcaLlon of proLelns was performed uslng Lhe label-
free module lmplemenLed ln Lhe MlaC v4.0.0 sofLware
(hLLp://mfpaq.sourceforge.neL/). lor each sample, Lhe
sofLware uses Lhe valldaLed ldenLlflcaLlon resulLs and
exLracLed lon chromaLogram (xlC) of Lhe ldenLlfled
pepLldes ln Lhe correspondlng raw nano-LC-MS flles
based on Lhelr experlmenLally measured reLenLlon Llme
(81) and monolsoLoplc m/z values. CuanLlflcaLlon of
pepLlde lons was performed based on calculaLed xlC
areas values. 1o compare abundance of dlfferenL
proLelns or Lo represenL Lhe abundance proflle of one
proLeln ln dlfferenL samples, a proLeln abundance lndex
(Al) was calculaLed deflned as Lhe average of xlC area
values for Lhree lnLense reference LrypLlc pepLldes
ldenLlfled for Lhls proLeln.
kesu|ts and D|scuss|on
ln Lhls sLudy, 200 l of CSl conLalnlng around 130 g of
proLelns were separaLely lncubaLed wlLh 2 dlfferenL
Lypes of chemlcally modlfled magneLlc ns, and ns
were eluLed wlLh aceLonlLrlle/1lA soluLlon Lo collecL Lhe
harvesLed proLelns. Lach n-eluLed soluLlon conLalned
around 20 g of proLelns, represenLlng 13 of Lhe lnlLlal
proLeln lnpuL.
:3$45/#+23$0/,5.+$0+!:%435"458+')1++
10 g of n-LreaLed samples were loaded ln Lhe same
way LhaL 10 g of crude CSl on 1u SuS-ACL gel. n-
LreaLed CSl revealed dlfferenL proLeln paLLerns Lhan
crude CSl. As shown ln llg 1 A, a very lnLense band of
albumln ls observed ln crude CSl lane. lL was
conslderably dlmlnlshed ln Lhe Lwo LreaLed samples
allowlng dlsLlncLlon of many new proLeln bands on a
mass lnLerval from 10 Lo 200 kua. MALul-1Cl-MS
analysls conflrmed Lhese observaLlons. roLeln proflle of
n-LreaLed sample showed Lhe presence of a large
number of m/z peaks LhaL were absenL from Lhe proflle
of crude CSl (llg 1 8). 1hls enrlchmenL lmpacLs more on
small masses beLween 2 Lo 10 kua wlLh appearance of
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I|gure 3: ua||tat|ve and quant|tat|ve reproduc|b|||ty |n prote|n harvest|ng by Ns. A. |e chart represent|ng the proport|on of
prote|ns |dent|f|ed |n 3 (dark grey), 2 (||ght grey) or 1 (wh|te) rep||cates from CS-Ns. Labe|-free quant|f|cat|on of CSI prote|ns
harvested by Ns us|ng MIa. keproduc|b|||ty and accuracy of pept|de quant|f|cat|on over tr|p||cate LC-MS]MS ana|yses of N
treated CSI. 8, corre|at|on of |og (AI) va|ues |n pa|rw|se LC-MS run compar|sons for Ns. C, d|str|but|on of quant|f|ed prote|ns
from Ns accord|ng to the|r coeff|c|ent of var|at|on (CV) for the three rep||cate measurements.
new m/z peaks and lncreased lnLenslLy deLecLlon for
peaks presenL ln boLh condlLlons. Slmllarly Lo SuS-ACL
gel, albumln m/z peak lnLenslLy aL 66 kua was
conslderably decreased on specLrum of n-LreaLed CSl,
conflrmlng Lhe reducLlon of albumln concenLraLlon ln n-
eluLed soluLlon (daLa noL shown).
!"#$%&'()*%'$&+&,-$&#'(./(0-'#123145645(
1o assess Lhe enrlchmenL of proLeln harvesLlng by n
sLraLegy, a deeper characLerlzaLlon of Lhe CSl proLeome
was performed by one nano-LC-MS/MS run afLer
concenLraLlon of proLelns lnLo a unlque gel band on SuS-
ACL gel. Lach sample was analyzed separaLely Lo
maxlmlze Lhe number of proLelns ldenLlfled and Lo
esLlmaLe Lhe complemenLary feaLure of each klnd of ns
ln proLeln capLure. 1o valldaLe LhaL n-LreaLmenL of CSl
lncreased Lhe number of ldenLlfled proLelns, analysls of
unLreaLed CSl was also performed.
1he analysls of unLreaLed CSl only revealed 136 dlfferenL
proLelns. Cn Lhe oLher hand, Lhe ldenLlflcaLlon of
proLelns harvesLed, from 200 l of CSl, by C and CS ns
respecLlvely revealed 291 and 321 dlfferenL specles
(llgure 2A). 1ogeLher, Lhese 2 Lypes of ns revealed 409
dlfferenL ldenLlfled proLelns from a LoLal volume of 400
l of CSl, only 30 l.e. 203 proLelns were ldenLlfled ln
boLh samples whereas 118 and 88 were selecLlvely
ldenLlfled on CS and C sample respecLlvely (flgure 28).
Among Lhese 409 proLelns, 147 of Lhe 136 proLelns
ldenLlfled ln crude CSl were presenL (flgure 2C). 1hese
resulLs demonsLraLed Lhe efflclency of ns Lo
concenLraLe enough a large number of dlfferenL proLelns
on lLs surface, Lhus allowlng Lhelr ldenLlflcaLlon by nano-
LC-MS/MS. 1hey also revealed Lhe selecLlve capLure of
proLelns accordlng Lo Lhe chemlcal groups grafLed on n-
surfaces.
1o valldaLe Lhe quallLaLlve reproduclblllLy of each Lype of
ns ln proLeln harvesLlng, we conLrolled Lhe presence of
Lhe MS slgnals of each proLeln ln all LrlpllcaLes. lor each
Lype of ns, Lhe MS slgnal of each proLeln was presenL ln
around 90 of cases ln all LrlpllcaLes (llgure 3A and
suppl daLa).
!"#$%&'(78-'$&+&,-$&#'(./(9-.%9(+"%%(-::"#-,;(
1o evaluaLe Lhe quanLlLaLlve reproduclblllLy of n
LreaLmenL, we used Lhe MlaC sofLware, whlch was
deslgned Lo parse and valldaLe proLeln ldenLlflcaLlons
from MascoL resulL flles and quanLlfy Lhe ldenLlfled
proLelns. 1he quanLlflcaLlon module of MlaC verslon
4.0 was upgraded so LhaL lL could handle label-free
quanLlflcaLlon as descrlbed by MouLon 8arbosa !"# $%
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AlLhough noL all of Lhese proLelns were ldenLlfled by
MS/MS ln every run, MS slgnal could be exLracLed for all
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of Lhem ln Lhe LrlpllcaLes for boLh condlLlons. As shown ln
llg. 38, Lhe Al proflles for all Lhe proLelns quanLlfled
from n-LreaLed CSl were consLanL over Lhe Lhree
repllcaLes wlLh a mean log (Al) raLlo close Lo Lhe
expecLed value of 1 beLween repllcaLe. Moreover, Lhe
medlan of Lhe coefflclenL of varlaLlon for all pepLlde
lnLenslLy values over Lhree repllcaLes was around 8 ,
showlng a good reproduclblllLy of Lhe n LreaLmenL
(llgure 3C). 1hese daLa conflrm ns' quallLaLlve and
quanLlLaLlve reproduclblllLy ln proLeln harvesLlng and
lndlcaLe LhaL several hundred of proLelns can be
accuraLely quanLlfled by uslng our sLraLegy.
!"#$%&'#()* (#()+,&,* '-* &./#%&-&/.* 01'%/&#,* 2+* 3#4/#"&%+*
5(%67(+**
1o deLermlne Lhe funcLlonal role of proLelns ldenLlfled ln
CSl by ns, we submlLLed our compleLe llsL Lo lngenulLy
aLhway Analysls sofLware
17
. 1he slgnlflcance of Lhe
assoclaLlon beLween ldenLlfled proLelns and Lhelr
funcLlonal role was glven by a llscher's exacL LesL LhaL
calculaLe a p-value deLermlnlng Lhe probablllLy LhaL Lhe
assoclaLlon beLween Lhe proLeln llsL and Lhe funcLlonal
role ls explalned by chance alone. Submlsslon of
unLreaLed and LreaLed CSl proLeln llsLs Lo funcLlonal
analysls hlghllghLed 3 slmllar Lop funcLlons (llgure 4A).
neverLheless, each one was more slgnlflcanLly
represenLed ln n-LreaLed samples, accordlng Lo Lhe p-
values and Lo Lhe number of proLelns ln our samples
relaLed Lo Lhese funcLlons. ln facL, unLreaLed CSl llsL
ldenLlfled 68, 79 and 71 dlfferenL proLelns respecLlvely
relaLed Lo lnflammaLory response, cancer and
neurologlcal dlseases. lor Lhe 3 same funcLlons, LreaLed
CSl llsL asslgned respecLlvely 134, 179 and 131 dlfferenL
proLelns. locuslng on neurologlcal dlseases, n-
LreaLmenL enabled Lo ldenLlfy aL leasL 30 more
proLelns assoclaLed Lo Alzhelmer's dlsease, PunLlngLon's
dlsease, demenLla and movemenL dlsorders Lhan
unLreaLed sample (llgure 48).
1hese resulLs conflrm Lhe greaL poLenLlal of chemlcally
modlfled ns Lo provlde a wlder access Lo Lhe CSl
proLeome, Lhus openlng Lhe way Lo Lhe research of
relevanL molecular markers ln neurologlcal dlseases. ln
facL, n LreaLmenL permlLs Lhe deLecLlon of proLelns
prevlously descrlbed as lmpllcaLed ln neurologlcal
dlsorders and cruclal slgnalllng paLhways LhaL could noL
be deLecLed ln non-LreaLed CSl. lor example, neuropllln-
1 and -2, whlch play a role ln cell mlgraLlon and axonal
guldance
18,19
, S100 proLeln and neuron-speclflc enolase
lncreased ln CSl afLer LraumaLlc braln damage
20,21,22,
enLraxln-1 a secreLed proLeln lnvolved ln synapLlc
acLlvlLy and synapse remodelllng
23,24
and neuroserplns
descrlbed ln Alzhelmer's dlsease and Lewy body
demenLla
23
were ldenLlfled from CSl only afLer n
LreaLmenL. ueLecLlon of Lhese proLelns may be of
parLlcular lnLeresL when sLudylng braln paLhologles.
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A|zhe|mer's
d|sease
nunnngton's
d|sease
Demenna Movement
d|sorders
N-treated
Non-treated
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79
131
71
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N-treated
Non-treated
A
8

I|gure 4: Iunct|ona| annotat|on by Ingenu|ty athway Ana|ys|s
(IA) of prote|ns |dent|f|ed by nano-LC-MS]MS. A. 3 more
s|gn|f|cant|y represented patho|og|ca| processes accord|ng to
prote|ns |dent|f|ed from N-treated (b|ack bar) and crude CSI
(grey bar). Lach bar represents the |og (p-va|ue) for each
cond|t|on and the numbers |n bo|d corresponds to the
d|fferent prote|ns |dent|f|ed |n each cond|t|on and assoc|ated
to these patho|og|ca| processes. 8. Number of d|fferent
prote|ns assoc|ated to A|zhe|mer's d|sease, nunt|ngton's
d|sease, dement|a and movement d|sorders |n N-treated
(b|ack bar) and crude CSI (grey bar).
Conc|us|on
8y Lhls sLudy, we provlde a new sLraLegy based on
chemlcally modlfled ns Lo explore Lhe CSl proLeome. ln
order Lo be close Lo condlLlons frequenLly encounLered ln
CSl cllnlcal proLeomlcs sLudles, we evaluaLed Lhe
efflclency of our approach ln less Lhan 0.3 ml of sample.
lrom 400 l of CSl and Lhrough Lhe use of Lwo klnds of
chemlcally modlfled ns, we have lncreased by 162
Lhe number of dlfferenL ldenLlfled proLelns. 1hls greaL
resulL can malnly be explalned by Lhe relaLlve weak
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capLure of albumln on n-surface, Lhus decreaslng Lhe
range of proLeln concenLraLlon ln n-eluLed samples.
Moreover, Lhe afflnlLy of each klnd of ns for speclflc CSl
proLelns has enabled Lhe capLure of dlfferenL sub-
proLeomes, Lhus exLendlng Lhe LoLal number of ldenLlfled
proLelns. llnally, Lhe demonsLraLed quallLaLlve and
quanLlLaLlve reproduclblllLy of proLeln harvesLlng for
boLh klnds of ns has conflrmed Lhe lnLeresL of our
sLraLegy ln quanLlLaLlve proLeomlc sLudles.
ln concluslon, n sLraLegy assoclaLed Lo nano-LC-MS
proflllng of proLelns uslng label-free quanLlflcaLlon on
hlgh-resoluLlon mass specLromeLers ls a well-sulLed
analyLlcal meLhod for blomarker research ln cllnlcal
proLeomlc sLudles. lL allows Lhe deLecLlon of a large
number of proLelns, Lhelr quanLlflcaLlon wlLh a good
accuracy and Lhe analysls of a large number of paLlenL
samples Lhrough Lhe use of auLomaLed plaLform uslng
ns
26,27
. lL could represenL a useful approach for cllnlcal
sLudles ln order Lo hlghllghL new neurodegeneraLlve-
assoclaLed blomarkers from CSl.
!"#$%&'()"$)*#(+,+-().&-'%"-/,+)
1he auLhors declare no compeLlng flnanclal lnLeresL
0+$+,+#'+-)
1. Lller, M., Wllllams, u. 8., 8lologlcal fluld blomarkers ln
neurodegeneraLlve parklnsonlsm. !"#$%&'$!&()*+$2009, ,
(10), 361-70.
2. Cood, u. M., 1hongboonkerd, v., novak, !., 8ascands,
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3. Conc|us|ons et erspect|ves.
L'acces au proLeome mlnorlLalre du LC8 esL un en[eu ma[eur pour la decouverLe de
marqueurs moleculalres des maladles neurodegeneraLlves en proLeomlque cllnlque.
AcLuellemenL, les llmlLes Lechnologlques des specLromeLres de masse, donL la gamme de
deLecLlon esL llmlLee a 3 ordres de grandeur, requlerenL de redulre les dlfferences de
concenLraLlon des proLelnes de l'echanLlllon dans l'espolr de deLecLer ces marqueurs. uans
ceLLe eLude, nous avons demonLre les capaclLes de ns magneLlques foncLlonnallsees a
redulre la gamme de concenLraLlon des proLelnes du LC8. Les proflls MALul eL SuS-ACL des
proLelnes eluees de la surface des ns onL clalremenL mls en evldence
-la dlmlnuLlon conslderable de la proporLlon d'albumlne
-l'augmenLaLlon de la proporLlon de nombreuses auLres proLelnes,
par rapporL au profll de LC8 non LralLe avec les ns. CeLLe modlflcaLlon de la gamme de
concenLraLlon a permls d'ldenLlfler 409 proLelnes dlfferenLes a parLlr de 400 l de LC8 LoLal
lncube sur 2 Lypes dlfferenLs de ns. Les comparalsons quallLaLlve des proLelnes ldenLlflees
dans les repllcaLs, eL quanLlLaLlve deLermlnee par une approche label free onL conflrme
la reproducLlblllLe de capLure des ns. L'ldenLlflcaLlon de nombreuses proLelnes cerebrales
eL/ou connues pour Lre lmpllquees dans des paLhologles du sysLeme nerveux onL
flnalemenL vallde les capaclLes de noLre sLraLegle a acceder a un proLeome represenLaLlf du
cerveau.
CeLLe eLude esL la premlere a demonLrer l'lnLerL des ns pour l'analyse proLeomlque du
LC8. Llle esL aussl la premlere a permeLLre l'ldenLlflcaLlon de plus de 400 proLelnes a parLlr
de 400 l d'echanLlllon. LLanL donne les falbles volumes de LC8 dlsponlble par paLlenL dans
les eLudes de proLeomlque, noLre sLraLegle propose alnsl une soluLlon adapLee aux
condlLlons cllnlques. La posslblllLe d'auLomaLlser la preparaLlon de l'echanLlllon avec la mlse
en place d'une plaLeforme comme celle decrlLe par vlllanueva eL al (vlllanueva, Lawlor eL al.
2006) ouvrlralL la vole au profllage proLelque hauL deblL du LC8 pour la recherche de
blomarqueurs dans les maladles neurodegeneraLlves. nous Lravalllons acLuellemenL a la
mlse en place de ceLLe plaLeforme afln de pouvolr collaborer avec des equlpes dlsposanL de
nombreux echanLlllons de LC8 dans dlfferenLes paLhologles eL souhalLanL meLLre en place
une sLraLegle de profllage quanLlLaLlf a des flns dlagnosLlques. nous conLlnuons aussl noLre
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collaboraLlon avec le ur 8ernard MonsarraL eL comparerons prochalnemenL noLre sLraLegle a
roLeomlner sur un mme pool de LC8 dans des condlLlons sLrlcLemenL ldenLlques.
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II. L'ut|||sat|on de Ns pour |'ana|yse protom|que du
g|obu|e rouge (Gk).
1. Introduct|on
A l'lnsLar du roLeomlner, donL l'efflcaclLe a eLe demonLree pour dlfferenLs Lypes
d'echanLlllons (CasLagna, Cecconl eL al. 2003), (Sennels, Salek eL al. 2007), (8oux-ualval,
Conzalez de eredo eL al. 2008), nous eLlons curleux d'evaluer le comporLemenL des ns
dans un auLre envlronnemenL que le LC8. nous recherchlons un Lype d'echanLlllon pour
lequel l'acces a son proLeome mlnorlLalre eLalL dlfflclle en ralson de l'hyper abondance de
cerLalnes proLelnes. L'eryLhrocyLe, plus communemenL appele globule rouge rempllssalL
ceLLe condlLlon.
1) L'rythrocyte ou g|obu|e rouge.
La dlfferenLlaLlon du reLlculocyLe en eryLhrocyLe esL la dernlere eLape de l'eryLhropoiese. Au
cours de ce processus, debuLanL dans la moelle osseuse eL se LermlnanL dans la clrculaLlon
sangulne, les cellules vonL redulre leur Lallle, se charger en hemogloblne pour flnalemenL
donner un C8 maLure depourvu de noyau eL d'organelles. La perLe de ces organlLes,
comblne a l'elasLlclLe de sa membrane plasmlque (Coodman and Shlffer 1983) permeL au C8
de se deformer pour se frayer un chemln dans les caplllalres les plus eLrolLs eL alnsl exercer
sa foncLlon prlnclpale : le LransporL de l'oxygene.
2) L'ana|yse protom|que du Gk
CeLLe perLe de noyau slgnlfle aussl que le C8 esL lncapable de reguler son conLenu
proLelque , un dysfoncLlonnemenL de l'expresslon de cerLalnes proLelnes n'esL donc pas
compense eL peuL Lre responsable d'hemopaLhles severes (WeaLherall and rovan 2000),
(rovan and WeaLherall 2000),(uelaunay 2007). C'esL pourquol l'acces au proLeome
eryLhrocyLalre esL un en[eu ma[eur pour l'eLude de ces paLhologles. MalheureusemenL la
presence ma[orlLalre de l'hemogloblne donL la quanLlLe represenLe 98 des proLelnes
solubles du C8 rend dlfflclle l'ldenLlflcaLlon des 2 resLanL, represenLees par les proLelnes
mlnorlLalres. uepuls plusleurs annees dlfferenLes sLraLegles onL eLe developpees afln
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Rsultats II : Lutilisation de NPs pour lanalyse protomique du GR
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d'ldenLlfler ces proLelnes (kakhnlashvlll, 8ulla eL al. 2004), (aslnl, klrkegaard eL al. 2006). Ln
2008, 8lngrose eL al (8lngrose, van Sollnge eL al. 2008) a proflLe de l'afflnlLe de
l'hemogloblne pour le nlckel, pour la depleLer sur colonne eL ldenLlfler 700 proLelnes
dlfferenLes dans la fracLlon non reLenue. La mme annee, 8oux ualval eL al (8oux-ualval,
Conzalez de eredo eL al. 2008) du laboraLolre du ur 8ernard MonsarraL a uLlllse
roLeomlner eL ldenLlfle 1378 proLelnes. AcLuellemenL pres de 2000 proLelnes dlfferenLes
onL pu Lre ldenLlflees dans le C8 (u'Alessandro, 8lgheLLl eL al. 2010). 8len qu'efflcaces pour
ldenLlfler un grand nombre de proLelnes, ces sLraLegles onL necesslLe une separaLlon
lnLenslve des proLelnes sur gel SuS-ACL eL une grande quanLlLe d'echanLlllon. Llles sonL
lncompaLlbles avec du profllage proLelque hauL deblL pour la recherche de marqueurs
moleculalres assoclees aux paLhologles du C8. !usqu'a presenL aucune eLude ne s'esL
lnLeressee a l'uLlllsaLlon de ns pour l'analyse proLeomlque du C8.
Ln co||aborat|on avec |e r asca| Mossuz, hmato|ogue au CnU de Grenob|e, nous avons
va|u |es capac|ts des Ns accder au protome m|nor|ta|re rythrocyta|re. Comme
pour |'tude sur |e LCk, |'ana|yse nano-LC-MS]MS a t ra||se par |a Dr I|orence koux-
Da|va| au |aborato|re du Dr 8ernard Monsarrat.
2. Art|c|e 4 :
A nanopart|c|e-ass|sted strategy to exp|ore the human red b|ood ce|| deep proteome.
Aff|f 2accar|a, llorence 8oux-ualval, All 8ouamranl, ascal Mossuz, 8ernard MonsarraL,
lranols 8erger. '#()*+",()!-./0"1+2*!3456!
Supp| data : https:]]docs.goog|e.com]fo|der]d]081GhVL-38pV8228temIpa|cxN2c]ed|t
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',.,$'*3")#"*+)#)*$+".(4/),.7
P#('%/4*()%#"
LryLhrocyLe or red blood cell (88C) has a llfe span of
approxlmaLely 4 monLhs and lLs maln funcLlon ls oxygen
LransporL. Slnce 88Cs are Lhe maln oxygen LransporLer,
geneLlcs and acqulred defecLs can be parLlcularly severe,
leadlng Lo hemaLologlcal dlsorders frequenLly assoclaLed
Lo Lhe lack or alLered expresslon of an 88C proLeln (1-3).
1o lmprove our undersLandlng of such dlsorders, lL ls
lmporLanL Lo explore Lhe 88C proLeome Lo deLermlne
proLelns poLenLlally lmpllcaLed ln hemaLologlcal dlseases.
Mass specLromeLry Lechnology currenLly allows proLeln
conLenL comparlson of hundred of samples and has
become a powerful Lool Lo correlaLe a dlsease wlLh
speclflc changes ln Lhe proLeome (4-6). 8uL Lhls
exploraLlon ls a challenglng analyLlcal Lask because of Lhe
presence of hlghly abundanL hemoglobln (Pb). lL
represenLs 98 of Lhe LoLal 88C soluble proLeln conLenL
and masks Lhe 2 of blologlcally lnLeresLlng low
abundanL proLelns. uurlng Lhe lasL decade, Lechnlcal
advances ln proLeomlc fleld greaLly conLrlbuLed Lo new
88C proLeln ldenLlflcaLlons. ln 2004, kakhnlashvlll #+( 2'D
(7) ldenLlfled 181 unlque proLelns separaLed by reverse
phase PLC and analyzed by Landem mass specLromeLry.
ln 2006, aslnl #+( 2'D (8) ldenLlfled 366 proLelns by
comblnlng quadrupole Llme of fllghL mass specLromeLry
wlLh selecLed blochemlcal procedures for sample
preparaLlon. More recenLly, 8lngrose #+( 2'D( (9) ldenLlfled
700 unlque proLelns afLer selecLlve depleLlon of Pb and
carbonlc anhydrase-1. 8oux-ualval #+( 2'D (10), Lhrough
Lhe reflnemenL of Lhe roLeomlner
1M
equallzaLlon
Lechnology and Lhe uLlllzaLlon of Lhe fasL and hlgh-
LhroughpuL CrblLrap MS analysls revealed 1,378 88C
cyLosollc proLelns, clearly demonsLraLlng LhaL Lhe 2 88C
proLeome ls consLlLuLed by an exLraordlnary array of
unlque gene producLs (11). AlLhough Lhese approaches
allowed Lhe ldenLlflcaLlon of new proLelns, Lhey are Llme
consumlng and Lhey requlre large volumes of sample Lo
be really efflclenL, Lhus llmlLlng Lhe cllnlcal LranslaLlon of
such Lechnologles for large-scale sLudles.
WlLh Lhe emergence of nanoLechnology over Lhe pasL
decade, englneerlng and lnLroducLlon of magneLlc
nanoparLlcules (ns) ln blomedlcal research has offered
exclLlng opporLunlLles (12-13).
1helr magneLlc feaLure enables an easler plloLlng and
manlpulaLlon, faclllLaLlng sample preparaLlon and
handllng for ex vlvo experlmenLal seLLlngs (16).
Moreover, Lhelr Lunable surface funcLlonallzaLlon plus
Lhelr comparable slze Lo blomolecules endow Lhem wlLh
unlque physlcochemlcal properLles LhaL are noL observed
t
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3

M
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ln Lhelr bulk forms (17), maklng Lhem parLlcularly
aLLracLlve for low abundanL proLeln harvesLlng. llnally,
ns have a very large surface-Lo-volume raLlo, so LhaL
even small amounLs of parLlcles presenL exLremely large
surface areas avallable for proLeln blndlng. 1hls should
decrease Lhe amounL of paLhologlcal flulds lndlspensable
for proLeomlc lnvesLlgaLlons LhaL ls mandaLory for
LranslaLlon aL Lhe bedslde of proLeomlc Lechnologles.
ln Lhe presenL sLudy, we applled magneLlc n Lechnology
Lo Lhe mlnlng of Lhe mlnorlLy 88C proLeome and
demonsLraLed LhaL lncubaLlon of low volume
hemolysaLes wlLh dlfferenL ns unmasked numerous
proLelns and greaLly reduced Lhe concenLraLlon of Pb.
1he L1C-CrblLrap analysls of capLured proLelns revealed
909 dlfferenL proLeln specles ln cllnlcal sLudy sulLable
condlLlons. luncLlonal analysls of Lhe proLelns ldenLlfled
hlghllghLed lmporLanL slgnallng paLhways LhaL could be
helpful ln Lhe undersLandlng of 88C dlsorders. Moreover
Lhe synerglsLlc feaLures of Lhe dlfferenL ns and Lhe
quallLaLlve and quanLlLaLlve reproduclblllLy lndlcaLed LhaL
n Lechnology could be used ln cllnlcal blomarker
research.
!"#$%&"'()"*+)!$#,-+()
!"#$%&"'()
MagneLlc nanoparLlcles of 100 nm ln aqueous suspenslon
were obLalned from Chemlcell CmbP (8erlln, Cermany).
1helr magneLlLe core glves Lhem a superparamagneLlc
behavlor, and Lhey are grafLed wlLh dlfferenL maLrlces
and funcLlonal groups. 1hey have a mulLl-domaln core
allowlng a fasL and easy magneLlc lsolaLlon by an exLernal
magneL (MagneLou8L, Chemlcell CmbP, 8erlln,
Cermany).
1hree dlfferenL klnds of nanoparLlcles were used ln our
sLudy. fluldMAC-CS, fluldMAC-AA and fluldMAC-C.
ueLalled feaLures are avallable on
hLLp://www.chemlcell.com/
*+,)-%$-"%"#&./)"/0)'1(&()
8lood samples were collecLed from healLhy consenLlng
donors by venlpuncLure ln Lu1A vacuLalner Lubes.
Samples were cenLrlfuged aL 1000! aL +4C for 10
mlnuLes Lo ellmlnaLe plasma and buffy coaL. 1o furLher
ellmlnaLe leucocyLes a gradlenL separaLlon uslng flccol
was performed. AfLer removal of mononuclear cells and
Lop 88C layer, eryLhrocyLes were carefully collecLed,
avoldlng polynuclear cells collecLed ln Lhe pelleL.
LryLhrocyLes were Lhen washed 3 Llmes wlLh 8S + MSl
(134 mM naCl, 10 mM phosphaLe buffer, pP 7.4
conLalnlng 0.1 mM MSl). AL each sLep supernaLanL was
removed.
1he lysls of 88C was operaLed by hypoLonlc shock. 8ed
cells were dlluLed Lo a 1:3 raLlo wlLh lysls buffer (3mM
phosphaLe buffer, pP 7.4 conLalnlng 1 mM Lu1A and 0.3
mM MSl) conLalnlng proLease lnhlblLor and lefL ln lce
for 30 mlnuLes. AfLer freezlng red cells were Lhawed aL
37C. 1he procedure of freezlng/Lhawlng was repeaLed
Lwlce for each sample. AL Lhe end of Lhe lysls sLep, afLer a
cenLrlfugaLlon aL 36000 x" ! for 10 mlnuLes aL +4C, Lhe
clear supernaLanL was collecLed and sLored aL -80C unLll
use.
*+,)-%.#$&/(2/"/.-"%#&3'$()&/345"#&./)
200 l of hemolysaLe conLalnlng 1 mg of proLelns were
sllghLly aglLaLed for 43 mln wlLh 300 g of ns ln naCl
130 mM/lmldazole 10mM. ns were aLLracLed Lo Lhe
boLLom of Lhe sample Lube by an exLernal magneL and
supernaLanL was removed. ns were washed 3 Llmes ln
naCl 130 mM/lmldazole 10 mM. llnally, Lhe proLelns
were desorbed uslng a soluLlon of 8 M urea-2 CPAS
and Lhe concenLraLlon of eluLed soluLlon from each klnd
of n was deLermlned by a 8radford proLeln assay (8lo-
8ad LaboraLorles, Percules, CA, uSA).
6/"'1(&().7)*+,)'1("#$)7%"3#&./()51)8982:6;<)
10 g of each sample were mlxed wlLh Laemll buffer (4
SuS, 20 glycerol, 10 2-mercapLoeLhanol, 0.004
bromophenol blue, 0.123 M 1rls PCl) from 8lo-8ad. 1he
mlxLure was heaLed ln bolllng waLer for 3 mln and loaded
on a precasL 4 Lo 13 polyacrylamlde gel from 8lo-
8ad. 1he elecLrophoreLlc run was performed by seLLlng a
volLage of 130 v unLll Lhe dye fronL reached Lhe boLLom
of Lhe gel. SLalnlng and desLalnlng were performed wlLh
Coomassle blue and 30 eLhanol/ 7 aceLlc acld ln
waLer respecLlvely.
6/"'1(&().7)*+,)'1("#$)7%"3#&./()51)-%.#$.=&3)-%.7&'&/>)
roLeln fracLlons aL approprlaLe concenLraLlon l.e 0.02
g/l were deposlLed on a CM10 roLelnChlp! array
(weak caLlon exchange surface). AfLer applylng Lhe
samples, Lhe chlp surfaces were washed Lo remove
unbounded proLelns. AfLer drylng, 1 l of energy-
adsorblng maLrlx soluLlon (composed of a saLuraLed
soluLlon of slnaplnlc acld ln 30 aceLonlLrlle and 0.3
LrlfluoroaceLlc acld) was deposlLed on Lhe spoL surface.
roLeomlc proflllng was performed on a MALul mass
specLromeLer (AuLoflex, 8ruker) ln a llnear mode. 3400
laser shoLs were acqulred for each sample wlLh a laser
lnLenslLy of 33 and a maLrlx aLLenuaLlon of 1000 ua. 1he
mass range lnvesLlgaLed was from 3 Lo 100 kua.
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B
MM kDa
170
130
95
72
55
43
34
26
17
10
A
4000 6000 8000
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A el uat OS post Ni 50ul
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A el uat Q pos t Ni 50ul
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A el uat DP post Ni50ul
4000 6000 8000
Crude extract
OS-NP
Q-NP
PAA-NP
4000 6000 8000
13000 14000 15000 16000 17000
15115,45
15857,51
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A GR
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15863,50
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A el uat Q pos t Ni 50ul
15872,45 0
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A el uat OS post Ni 50ul
15125,82
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A el uat DP post Ni50ul
13000 14000 15000 16000 17000
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A GR
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13000 14000 15000 16000 17000
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A el uat DP post Ni50ul
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A el uat Q pos t Ni 50ul
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u
A el uat DP post Ni50ul
13000 14000 15000 16000 17000
NP-treated
Crude extract
Hb
Hb depletion

I|gure 1: rote|n prof||es of non-treated and N-treated k8C |ysates. (A) 1D SDS-AGL - the wh|te arrow shows the pos|t|on of the
hemog|ob|n prote|n and (8) SLLDI-1CI-MS show|ng eff|c|ency of 3 d|fferent N-treatments for enr|ched prote|n detect|on and
hemog|ob|n dep|et|on compared to non-treated k8C extract. 1he same quant|ty of prote|ns was |oaded on ge| and on ch|p for the
d|fferent samp|es.

!"#$%&$%'()(*+,-,'./'01"'23.45-),'
1he supplemenLal daLa provldes a deLalled descrlpLlon of
LC-MS/MS ldenLlflcaLlon.
8rlefly, 10 g of each eluaLe and crude 88C lysaLes were
dlluLed ln Laemll buffer and sLacked ln one band afLer a
shorL and low volLage elecLrophoreLlc mlgraLlon on SuS
ACL gel. AfLer Lrypslc dlgesLlon, Lhe resulLlng pepLldes
were exLracLed from Lhe gel and analyzed by nano-LC-
MS/MS uslng an ulLlmaLe3000 sysLem (ulonex,
AmsLerdam, 1he neLherlands) coupled Lo an L1C-
CrblLrap velos mass specLromeLer (1hermo SclenLlflc,
8remen, Cermany). 1he L1C-CrblLrap was operaLed ln
daLa-dependenL acqulslLlon mode wlLh Lhe xcallbur
sofLware. Survey scan MS specLra were acqulred ln Lhe
CrblLrap on Lhe 300-2000 m/z range wlLh Lhe resoluLlon
seL Lo a value of 60,000. 1he flve mosL lnLense lons per
survey were selecLed for Clu fragmenLaLlon, and Lhe
resulLlng fragmenLs were analyzed ln Lhe llnear Lrap
(L1C).
6(4(7(,5'%5(389'():'6(4(';)(*+,-,'
1he MascoL uaemon sofLware (verslon 2.3.0, MaLrlx
Sclence, London, uk) was used Lo perform daLabase
searches agalnsL homo saplens enLrles ln unlproL proLeln
daLabase (release 2010_09 - Sep 21, 2010, 1213333
sequences). MascoL resulLs were parsed wlLh Lhe ln-
house developed sofLware MascoL llle parslng and
CuanLlflcaLlon (MlaC) verslon 4.0.0
(hLLp://mfpaq.sourceforge.neL/), and proLeln hlLs were
auLomaLlcally valldaLed.
!(75*#/355'<=()4-/-8(4-.)'
CuanLlflcaLlon of proLelns was performed uslng Lhe label-
free module lmplemenLed ln Lhe MlaC v4.0.0 sofLware
(hLLp://mfpaq.sourceforge.neL/). lor each sample, Lhe
sofLware uses Lhe valldaLed ldenLlflcaLlon resulLs and
exLracLed lon chromaLogram (xlC) of Lhe ldenLlfled
pepLldes ln Lhe correspondlng raw nano-LC-MS flles
based on Lhelr experlmenLally measured reLenLlon Llme
(81) and monolsoLoplc m/z values. CuanLlflcaLlon of
pepLlde lons was performed based on calculaLed xlC
areas values. 1o compare abundance of dlfferenL
proLelns or Lo represenL Lhe abundance proflle of one
proLeln ln dlfferenL samples, a proLeln abundance lndex
(Al) was calculaLed deflned as Lhe average of xlC area
values for Lhree lnLense reference LrypLlc pepLldes
ldenLlfled for Lhls proLeln. 1o compare Lhe relaLlve
selecLlvlLy ln proLeln harvesLlng, of each klnd of ns, Lhe
Al obLalned ln each n-sample for each proLeln were
sLandardlzed by lLs hlghesL value. SLandardlzed Al were
submlLLed Lo sofLware 8 for proLeln hlerarchlcal
clusLerlng (20).
kesu|ts
%6%'>;?@'()(*+,-,''
200 l of 88C lysaLes conLalnlng 1 mg of proLelns were
lncubaLed wlLh 300 g of magneLlc ns, and ns were
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Q-nanoparticles
525 protein groups

OS-nanoparticles
525 protein groups
PAA-nanoparticles
576 protein groups 193
224
219
193
51
64
90
16 92 802
Non treated RBC
108 protein groups
Treated RBC
3 eluates
894 protein groups
A
B

I|gure 2: Venn d|agrams represent|ng the extent of over|ap of prote|ns |dent|f|ed by LC-MS]MS ana|ys|s. A, compar|son made
between the crude k8C extract (108 prote|ns) and a|| N-treated samp|es (894 prote|ns). 8, compar|son among the three N-treated
samp|es (AA-N, S76 prote|ns, CS-N, S2S prote|ns, -N, S2S prote|ns)
eluLed wlLh urea 8 M-CPAS 2 Lo collecL Lhe proLelns
harvesLed. lrom each of Lhe Lhree n eluaLes (each one
correspondlng Lo one klnd of ns), approxlmaLely 30 g
of proLelns were collecLed, represenLlng 3 of Lhe lnlLlal
proLeln lnpuL.
lor Lhe Lhree eluaLes and Lhe crude 88C lysaLe, 10 g of
proLelns were loaded on Lhe SuS-ACL gel. SuS-ACL
analysls of Lhe eluaLe revealed a paLLern of proLelns
obvlously dlfferenL of non-LreaLed sample. lndeed, Lhe
proLeln proflle of Lhe n-LreaLed samples showed a
dlmlnuLlon of Pb-band lnLenslLy and Lhe appearance of
many oLhers bands ranglng from 10 Lo 230 kua whlch
were noL deLecLed ln Lhe conLrol condlLlon (llg 1A).!
"#$%&'('!)*!+,-!./)01(#'!2&!34!./)*(%(#5!
1hls flrsL observaLlon was conflrmed by MS proflllng
analysls of 3g of proLelns from each eluaLe and crude
88C on CM10 roLelnChlp array (llg 18). Compared Lo
crude exLracL specLrum, specLra of Lhe n-eluaLes were
greaLly enrlched ln m/z peaks from 2.3 Lo 10 kua. lndeed,
m/z peaks LhaL probably correspond Lo hemoglobln
subunlLs (around 13 kua) were obvlously decreased for
all LreaLed samples, conflrmlng SuS-ACL observaLlon.
uslng Lhe same deLecLlon parameLers and compared Lo
unLreaLed sample, Lhe number of dlfferenL deLecLed m/z
beLween 2.3 and 10 kua was lncreased Lwlce on LreaLed
sample and 3 Llmes when we comblned all Lhe dlfferenL
m/z peaks deLecLed on Lhe 3 LreaLed samples (daLa noL
shown). 1hls observaLlon suggesLed Lhe complemenLary
properLles and Lhus Lhe relaLlve selecLlvlLy of each klnd
of ns for proLeln capLure, each surface chemlsLry
provldlng Lhe bloharvesLlng of dlfferenL subproLeomes.
6/)01(#!(71#0(*(8$0()#!2&!9$#):;-:34<34!
1o assess Lhls enrlchmenL, a deeper characLerlzaLlon of
Lhe 88C proLeome was performed by one nano-LC-
MS/MS run on boLh n-LreaLed and crude 88C lysaLes
afLer concenLraLlon of proLelns lnLo a unlque gel band on
SuS ACL gel. llgure 2 sums up Lhe resulLs obLalned for
each sample and glves an lnslghL of Lhe harvesLlng
capaclLy for each condlLlon. ldenLlflcaLlon on Lhe crude
88C lysaLe revealed 108 proLelns whereas analysls of Lhe
3 dlfferenL ns eluaLes ldenLlfled 894 dlfferenL proLelns
(flgure 2A). Among Lhese 894 proLelns, 802 were
excluslvely ldenLlfled on n-eluaLes and 92 were shared
wlLh crude 88C lysaLe. 1he llsL of Lhe 909 dlfferenL
proLelns ldenLlfled ln Lhe sLudy ls deLalled ln
supplemenLary daLa. A focus on Lhe 3 n-eluaLes
revealed a slmllar number of ldenLlfled proLelns varylng
from 323 for CS and C-ns Lo 376 for AA-n, only 193
proLelns were shared by Lhe Lhree Lypes of ns (flgure
28). 1he comparlson of Lhe proLelns ldenLlfled from
repllcaLed samples revealed on average 92 of slmllar
proLelns, hlghllghLlng Lhe quallLaLlve reproduclblllLy of
each Lype of ns ln proLeln harvesLlng. 1o evaluaLe Lhe
quanLlLaLlve reproduclblllLy of ns LreaLmenL, we used
Lhe MlaC sofLware, whlch was deslgned Lo parse and
valldaLe proLeln ldenLlflcaLlons from MascoL resulL flles
and quanLlfy Lhe ldenLlfled proLelns. 1he quanLlflcaLlon
module of MlaC verslon 4.0 was upgraded so LhaL lL
could handle label-free quanLlflcaLlon as descrlbed by
MouLon 8arbosa !"#$% (18). 1he analyses of dupllcaLes for
each n-sample were performed and ldenLlfled proLelns
were quanLlfled uslng Lhls Lool. As shown ln flgure 3A
quanLlLaLlve reproduclblllLy of ns was found Lo be good
beLween Lhe dupllcaLes. ln facL, Lhe ma[orlLy of
quanLlfled proLelns on each klnd of ns revealed a Al
raLlo close Lo Lhe expecLed value of 1 (llgure 3). 8ased on
Lhese quanLlflcaLlon resulLs, we normallzed Lhe Al
obLalned for each proLeln ln each sample and submlLLed
Lhem Lo hlerarchlcal clusLerlng wlLh Lhe sofLware 8. 1he
alm was Lo deLermlne lf each klnd of ns has a selecLlve
proLeln harvesLlng. 1he clusLerlng revealed 10 groups of
dlfferenLlally quanLlfled proLelns, accordlng Lo Lhe klnd of
ns (suppl daLa). Among Lhem, 3 groups revealed
proLelns malnly quanLlfled by only one klnd of ns
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C
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136 proteins
100 proteins
68 proteins
Pearson coefficient:0.988
Pearson coefficient:0.995
Pearson coefficient:0.979

I|gure 3: keproduc|b|||ty and Se|ect|v|ty of Ns for prote|n harvest|ng eva|uated by LC-MS]MS |dent|f|cat|on and |abe| free
quant|f|cat|on. A-C, reproduc|b|||ty of prote|n quant|f|cat|on over dup||cates for CS (A), (8) and AA-Ns (C): corre|at|on of |og
(AI) va|ues for a|| quant|f|ed prote|n. D, se|ect|v|ty of Ns-surface for prote|n harvest|ng: mean AI rat|o of 3 d|fferent groups of
prote|ns (obta|ned by h|erarch|ca| c|uster|ng software k) for each N-treated samp|e.
(llgure 3u). ln facL, group 4, 3 and 8 hlghllghLed 68, 136
and 100 dlfferenL proLelns prlnclpally and abundanLly
quanLlfled from C, AA and CS-ns respecLlvely. 1hese
resulLs showed LhaL Lhe chemlcally modlfled surfaces of
ns lmpacL on Lhe ldenLlLy of capLured proLelns.
!"#$%&'#()*(#()+,&,*'-*./0*12'%3&#,**
We furLher submlLLed our daLa seL Lo lngenulLy aLhway
Analysls sofLware (lngenulLy SysLems, 8edwood ClLy, CA)
Lo perform Lhe funcLlonal characLerlzaLlon of Lhe 88C
proLeome and ldenLlfy Lhe maln molecular paLhways and
neLworks. 1hls auLomaLlc annoLaLlon Lool uses a
knowledge daLabase and asslgns proLelns Lo funcLlonal
classes or speclflc canonlcal paLhways (Cs) relaLed Lo
varlous blologlcal processes (21). Accordlng Lo Lhe
funcLlonal analysls, Lhe 894 proLelns ldenLlfled ln n-
LreaLed samples had been assoclaLed Lo 140 dlfferenL
Cs and revealed 98 specles relaLed Lo hemaLologlcal
dlseases, Lhe 109 proLelns from Lhe crude exLracL only
hlghllghLed 40 dlfferenL Cs and 31 proLelns prevlously
descrlbed ln hemaLologlcal dlseases. 1he 10 more
slgnlflcanL Cs for crude 88C lysaL were relaLed Lo Lhe
cellular orlgln and known funcLlons of 88C. MosL of Lhem
lnvolved proLeln and nuclelc acld degradaLlon (proLeln
ublqulLlnaLlon paLhway, purlne and pyrlmldlne
meLabollsms), anaeroblc glycolysls (glycolysls and
penLose phosphaLe paLhways), and response Lo oxldaLlve
sLress (n8l2-medlaLed oxldaLlve sLress paLhway).
AlLhough Lhese 10 Cs were noL Lhe mosL slgnlflcanL ln
n-LreaLed lysaLes, Lhey were more represenLed ln Lhese
samples Lhan crude exLracL. llgure 4A shows Lhe raLlo of
proLelns ldenLlfled ln Lhese 10 Cs for crude and n-
LreaLed 88C exLracLs. 1hls raLlo maLches Lo Lhe number
of proLelns from our daLa seL LhaL map Lo Lhe paLhway
dlvlded by Lhe LoLal number of proLelns referenced ln
Lhls paLhway by Lhe sofLware. We noLlced ln all Cs LhaL
Lhese raLlos were hlgher for Lhe n-LreaLed samples,
lnLendlng LhaL n lncreased Lhe number of ldenLlfled
proLelns relaLed Lo Lhese Cs. Cn Lhe oLher hand, Lhe 10
more slgnlflcanL Cs hlghllghLed by n-LreaLed samples
were relaLed Lo cellular assembly and organlzaLlon of
cyLoskeleLon, whlch play an lmporLanL role ln 88C (llgure
48). 1hese paLhways relaLed Lo lmporLanL 88C funcLlons
were almosL absenL from Lhe seL of proLelns ldenLlfled ln
Lhe crude 88C sample, lllusLraLlng Lhe lmpacL of Lhe
enrlchmenL followlng proLelns harvesLlng uslng n
Lechnology.
4&,$",,&'#*
ln Lhls sLudy, we used chemlcally modlfled magneLlc ns
Lo analyze Lhe proLeome of hlghly purlfled 88Cs. 1he
ob[ecLlve was Lo valldaLe a new Lechnology compaLlble
wlLh large LranslaLlonal blomarker sLudles and provldlng
access Lo Lhe deep 88C proLeome. 1hls klnd of ns
provldes greaL advanLages for ex vlvo experlmenLs, Lhelr
funcLlonallzed surfaces, Lhelr nanomeLer slze and Lhelr
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Ingenuity Pathways Analysis

I|gure 4: Iunct|ona| annotat|on of k8C prote|ns |dent|f|ed by nano-LC-MS]MS. 1op 10 out of 40 and 140 s|gn|f|cant canon|ca|
pathways (Cs) for untreated (A) and treated (8) k8C extract respect|ve|y. Ior each C, the bars show the rat|o between the number
of |dent|f|ed prote|ns c|ass|f|ed |n that pathway and the tota| number of prote|ns referenced |n th|s pathway by the software for
untreated (b|ack bar) and treated k8C extract (grey bar).
greaL surface Lo volume raLlo endow Lhem wlLh unlque
physlcochemlcal properLles LhaL are noL observed on
mlcromeLer surfaces (17, 22, 23), maklng Lhem very
aLLracLlve for low abundanL proLeln harvesLlng.
1he Lhree dlfferenL klnds of ns evaluaLed ln our sLudy
allowed Lhe ldenLlflcaLlon of 894 unlque proLelns by
nano-LC-MS/MS on an L1C-CrblLrap mass specLromeLer
conflrmlng Lhe capaclLy Lo decrease Pb ln n-LreaLed
samples and Lhus Lo access Lhe 88C low concenLraLed
proLeome. Lach Lype of ns enabled Lhe ldenLlflcaLlon of
more Lhan 300 proLelns, lncreaslng by 400 Lhe number
of ldenLlfled specles compared Lo an unLreaLed proLelns
exLracL of 88C (108 proLelns). Among Lhe enrlched
proLelns, someone have been prevlously ldenLlfled ln
oLhers sLudles and are known Lo be poorly expressed ln
88C. lor lnsLance Lhe globln chaln deLecLed by Coh !"#$%#
&24)' aL a level of 0.1 compared Lo ! globln and
ldenLlfled by aslnl !"#$% (7).#and 8oux-ualval !"#$% (10)' ls
also presenL ln our llsL. 1ransferrln recepLor, a key
proLeln ln reLlculocyLes (23) buL noL found ln maLure
88Cs ls also deLecLed by our sLraLegy. 8ecause
reLlculocyLes represenL less Lhan 1 of Lhe LoLal red cell
populaLlon, Lhe ldenLlflcaLlon of such proLelns valldaLes
Lhe capaclLy Lo concenLraLe mlnor proLelns on ns. 1o
assess wheLher Lhls Lechnology could be applled Lo
dlfferenLlal proLeomlc sLudles, lL was lmporLanL Lo
conflrm quallLaLlve and quanLlLaLlve reproduclblllLy of
Lhe repllcaLes. 8eproduclblllLy of Lhe proLeln llsLs
obLalned was abouL 92 , a percenLage relaLlvely hlgher
Lhan Lyplcal values found for analysls of complex
proLeomes by nano-LC-MS/MS. Label free quanLlflcaLlon
of Lhe global populaLlon of pepLldes and proLelns
ldenLlfled ln dupllcaLe samples shows here LhaL Lhe n-
LreaLmenL of 88C ls very reproduclble as lndlcaLed by Lhe
Al measuremenLs (26). ns chosen for Lhe sLudy
possess complemenLary funcLlons (caLlonlc, anlonlc and
hydrophoblc surfaces) Lo lncrease Lhe probablllLy Lo
capLure dlfferenL seLs of proLelns, Lhe label free
quanLlflcaLlon clearly demonsLraLed Lhe selecLlve proLeln
capLure of Lhe n surfaces.
Compared Lo crude 88C exLracL, Lhe use of ns allowed
Lhe ldenLlflcaLlon of a hlgher number of proLelns
lmpllcaLed ln maln 88C funcLlons such as oxygen
LransporL, glycolysls and proLecLlon agalnsL oxldaLlve
sLress. 1hls access Lo a larger proLeome could be helpful
Lo beLLer undersLand mechanlsms responslble for
dysfuncLlons of Lhese key funcLlonal paLhways. 1he
number of slgnlflcanLly represenLed Cs was 3 fold
hlgher Lhan ln funcLlonal analysls of Lhe crude exLracL.
n-LreaLed samples speclflcally hlghllghLed Cs llke
8hoA, 8ac (27) and cdc 42 (28) slgnallng LhaL have
essenLlal funcLlons ln morphology and deformablllLy
regulaLlons of Lhe eryLhrocyLe cyLoskeleLon. 1he
malnLenance of normal deformablllLy ls cruclal Lo permlL
88C Lo enLer ln narrow caplllarles. uysfuncLlons of Lhese
paLhways have been assoclaLed wlLh hemolyLlc anemla
(27). Access Lo such mandaLory paLhways for eryLhrocyLe
funcLlons, obLalned wlLh very low quanLlLy of lnlLlal
proLelns wlll greaLly lmprove lnvesLlgaLlons on
eryLhrocyLe dlsorders.
n Lechnology also ldenLlfled Cs lmpllcaLed ln
hemaLologlcal dlsorder LhaL may noL sLlll be presenL ln
maLure 88Cs. lor lnsLance, !Ak/S1A1 slgnallng paLhway
has been shown Lo be lnvolved ln polycyLhemla vera due
Lo a muLaLlon ln !Ak2 gene of hemaLopoleLlc sLem cell
(29), leadlng Lo alLered phosphorylaLlon acLlvlLy of Lhe
correspondlng klnase. MAk has been reporLed
phosphorylaLed ln 40 of acuLe myelold leukemla (AML)
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phosphorylaLed ln prlmary cells from paLlenL wlLh AML
(31). All Lhese slgnallng paLhways could be explored
uslng our n approach. 1herefore, Lhese resulLs suggesL
LhaL eryLhrocyLe proLeome could reflecL oncogenlc
evenLs of commune hemaLopoleLlc sLem cells, provldlng
a new fleld of research for mallgnanL hemopaLhles,
compleLlng unA/8nA analysls on nucleaLed progenlLors
(32, 33).
1he greaL advanLage of Lhe n sLraLegy ls lLs capaclLy Lo
work wlLh low volumes, whlch are more compaLlble wlLh
auLomaLed hlgh-LhroughpuL cllnlcal sLudles. lndeed,
vlllanueva !"# $%& (34, 33) demonsLraLed Lhe
reproduclblllLy of n uslng an auLomaLed plaLform,
suggesLlng Lhe ablllLy of n Lechnology Lo slmulLaneously
process hundreds of dlfferenL samples ln reproduclble
and cllnlcally adapLed condlLlons.
ln concluslon, magneLlc ns coupled Lo nano-LC-MS/MS
Lechnology have been used Lo explore Lhe 88C
proLeome. 1he n reproduclblllLy and Lhe use of low
volume sample were conflrmed, provldlng a new sLraLegy
Lo concenLraLe low abundanL proLelns and pavlng Lhe
way Lo hlgh-LhroughpuL cllnlcal Lrlals for blomarker
research ln hemaLologlcal dlsorders. 1he efflclency of n
sLraLegy should be evaluaLe on oLher flulds conLalnlng
poLenLlal blomarkers and for whlch non-harvesLlng of
hlgh abundanL proLelns and Lhe llmlLed sample avallable
consLlLuLe Lhe ma[or lssues for cllnlcal proLeomlc (36-39).
!"#$%&'()*+($,-.//
1hls sLudy was supporLed by research fundlng from Lhe
8eglon 8hone-Alpes and lnnablosanLe loundaLlon.
!0,1%2-134/"%$,2350,3%$-.//
* 8oLh auLhors conLrlbuLe equally Lo Lhls work
Afflf.Zaccarla deslgned and performed experlmenLs,
analyzed daLa and wroLe Lhe paper. llorence.8oux-ualval
deslgned nano LC-MS/MS experlmenLs and analyzed
daLa. All 8ouamranl deslgned experlmenLs and wroLe Lhe
paper. ascal Mossuz provlded red blood cell lysaLes and
wroLe Lhe paper. 8ernard MonsarraL supervlsed Lhe
sLudy. lranols 8erger supervlsed Lhe sLudy and wroLe
Lhe paper.
6%$7'3",/%7/8$,(2(-,/93-"'%-02(-/
1he auLhors declare LhaL Lhey have no compeLlng
flnanclal lnLeresL
:(7(2($"(-.//
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3. Conc|us|ons et erspect|ves.
uans ceL arLlcle, nous demonLrons pour la premlere fols l'lnLerL de l'uLlllsaLlon de ns
modlflees chlmlquemenL pour l'eLude du proLeome eryLhrocyLalre. ConLralremenL aux
sLraLegles de[a decrlLes dans la llLLeraLure, noLre approche necesslLe peu de fracLlonnemenL
eL peu de volume d'echanLlllon rendanL posslble l'eLude de nombreuses serles de paLlenLs
en proLeomlque cllnlque. L'augmenLaLlon du nombre de proLelnes deLecLees sur les specLres
MS, puls ldenLlflees eL quanLlflees en MS/MS conflrme noLre capaclLe a acceder au
proLeome mlnorlLalre dans un echanLlllon ou la proLelne ma[orlLalre represenLe 98 de la
masse proLelque LoLale. Ces resulLaLs ouvrenL naLurellemenL la vole au profllage proLelque
du C8 dans des paLhologles qul affecLenL dlrecLemenL les foncLlons eryLhrocyLalres Lelles
que les anemles ou les polycyLhemles (WeaLherall and rovan 2000)
,
(rovan and WeaLherall
2000). Crce aux approches de proLeomlque quanLlLaLlve, nous pourrlons alnsl meLLre en
evldence des dlfferences d'expresslon afln d'ldenLlfler les proLelnes assoclees a ces
hemopaLhles.
ue manlere plus surprenanLe, l'analyse foncLlonnelle des proLelnes ldenLlflees dans le C8 a
mls en evldence des voles de slgnallsaLlon normalemenL lnacLlves dans les C8 maLures
anuclees, Lelles que les voles !Ak/S1A1, m1C8 ou l3k/Ak1. La phosphorylaLlon revelee de
cerLalnes proLelnes de ces voles, dans les cellules souches hemaLopoieLlques, esL
responsable de polycyLhemles (!ames, ugo eL al. 2003) ou de leucemles myeloldes algues
(1owaLarl, llda eL al. 1997)
,
(xu, Slmpson eL al. 2003). ll sembleralL donc qu'au sLade flnal de
l'eryLhropoiese, le C8 accesslble par une slmple prlse de sang conLlenne encore les proLelnes
de ses progenlLeurs presenLs eux dans la moelle osseuse. ll esL donc envlsageable
d'ldenLlfler des dysfoncLlonnemenLs proLelques assocles aux cellules souches
hemaLopoieLlques eL/ou auLres progenlLeurs a Lravers l'analyse proLeomlque du C8. CeLLe
approche orlglnale eL molns lnvaslve qu'une poncLlon de moelle osseuse vlendralL alnsl
compleLer les analyses reallsees sur les progenlLeurs nuclees dans ces paLhologles (!ames,
ugo eL al. 2003)
,
(Coh, !osleyn eL al. 2007)
,
(ugo, Marzac eL al. 2004).
Lnfln l'analyse proLeomlque du C8 peuL s'averer uLlle dans la maladle de arklnson (M),
pour laquelle le sLress oxydaLlf au nlveau de la Snc lnLervlendralL dans la paLhogenese eL/ou
la progresslon de la maladle (!enner 2003). La mlse en evldence d'une defalllance generale
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du sysLeme de regulaLlon du sLress oxydaLlf pourralL consLlLuer un facLeur de rlsque de la
M. ue par sa foncLlon de LransporL de l'oxygene, le C8 esL soumls a un sLress oxydaLlf
lmporLanL , eL une dlmlnuLlon d'expresslon des enzymes anLl-oxydanLes (la superoxyde
dlsmuLase, la caLalase eL la gluLaLhlon peroxydase) a eLe mlse en evldence dans les C8s de
paLlenLs aLLelnLs de la M (Abraham, Soundarara[an eL al. 2003). L'analyse proLeomlque
quanLlLaLlve permeLLralL la conflrmaLlon de ces resulLaLs mals aussl l'ldenLlflcaLlon d'auLres
proLelnes modlflees dans les C8s de paLlenLs parklnsonlens. Ln plus d'un sLress oxydaLlf
lmporLanL, la presence dans le cyLosol eryLhrocyLalre de l'alpha synuclelne eL u!-1 (8arbour,
kllng eL al. 2008)
,
(nakal, lu[lLa eL al. 2007), deux proLelnes presenLes aussl dans la Snc eL
assoclees aux formes famlllales de la M, lalsse envlsager que des eLudes sur le C8, plus
accesslble que les neurones dopamlnerglques de la Snc, alderalenL a comprendre le rle
exacL de ces proLelnes dans un envlronnemenL ou regne un forL sLress oxydaLlf.
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III. L'ut|||sat|on de Ns pour |'ana|yse protom|que du
p|asma sangu|n.
1. Introduct|on
1) Le p|asma sangu|n
Au[ourd'hul, le flulde blologlque le plus eLudle en proLeomlque, pour la mlse en evldence de
marqueurs moleculalres, esL le sang, ou plus preclsemenL sa fracLlon proLelque : le plasma
(Anderson and Anderson 2002). Le plasma sanguln esL consldere comme un reservolr
unlversel de marqueurs moleculalres , en effeL, la pluparL des cellules du corps humaln
llbereralenL, en permanence dans le sang, des proLelnes lnformanL de leur eLaL
physlopaLhologlque a un lnsLanL donne (LloLLa, lerrarl eL al. 2003). Ce paradlgme slgnlfle
qu'en Lheorle le plasma conLlendralL les marqueurs moleculalres de LouLes les maladles , ce
qul expllque l'engouemenL de la proLeomlque pour ce flulde blologlque en vue de prevenlr,
dlagnosLlquer ou evaluer l'effeL d'un LralLemenL sur une paLhologle. L'ldenLlflcaLlon de
proLelnes d'orlglne Llssulalre eL reLrouvees exprlmees dlfferemmenL dans le sang dans un
conLexLe paLhologlque a conforLe ce paradlgme : l'augmenLaLlon de la Lroponlne l eL 1
(AnLman, 1anasl[evlc eL al. 1996) dans l'lnfarcLus du myocarde ou encore celle de la
prosLaLe speclflc anLlgen (SA) dans les paLhologles de la prosLaLe (Wang, apsldero eL
al. 1981) en sonL des exemples.
2) L'ana|yse protom|que du p|asma sangu|n
MalheureusemenL, face a l'lmporLanLe quanLlLe d'lnformaLlon generee par les nombreuses
eLudes d'un coLe, eL l'absence de resulLaLs concreLs dans la decouverLe de nouveaux
marqueurs moleculalres plasmaLlques de l'auLre, on ne peuL que consLaLer l'echec acLuel de
la proLeomlque dans ce champ de recherche. CeL echec s'expllque par l'enorme complexlLe
du proLeome sanguln (Anderson and Anderson 2002). ConLralremenL au LC8 qul dralne
unlquemenL le sysLeme nerveux cenLral, le sang dralne Lous les organes du corps humaln eL
va conLenlr le proLeome de chacun d'enLre eux. La recherche de proLelnes dans le sang,
speclflques d'un Llssu paLhologlque, va Lre compllquee par la presence des proLelnes
provenanL de Lous les auLres Llssus salns . ue plus la presence d'une vlngLalne de
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proLelnes resldenLes, hyper-ma[orlLalres (albumlne, lgC, lgA, Lransferrlne, hapLogloblne, o1-
anLlLrypslne.) represenLanL 99 de la masse proLelque LoLale rend quaslmenL lndeLecLable,
par les specLromeLres de masse acLuels, le 1 resLanL au seln duquel resldenL, a des
concenLraLlons Lres falbles les poLenLlels marqueurs moleculalres. Ln effeL, la gamme de
concenLraLlon dans le plasma esL de 10 ordres de grandeur avec l'albumlne concenLree a 30
mg/mL eL les lnLerleuklnes auLour du pg/mL , les specLromeLres de masse les plus recenLs
onL une gamme dynamlque de 3 ordres de grandeur seulemenL. uans l'aLLenLe du
developpemenL de specLromeLres de masse plus performanLs, la seule alLernaLlve a
l'ldenLlflcaLlon des proLelnes mlnorlLalres esL de redulre la gamme de concenLraLlon
proLelque dans le plasma. our cela, des colonnes de depleLlon des proLelnes ma[orlLalres
plasmaLlques onL eLe developpees. ulfferenLes eLudes onL demonLre l'efflcaclLe de ces
colonnes a depleLer les proLelnes ma[orlLalres (8[orhall, MllloLls eL al. 2003), (SLempfer,
kublcek eL al. 2008). CependanL ceLLe depleLlon se LradulL aussl par la perLe de nombreuses
auLres proLelnes, llees aux proLelnes ma[orlLalres qul leur servenL de cargo pour clrculer
dans le sang (Shen, klm eL al. 2003).
Ltant donn |a capac|t des Ns magnt|ques mod|f|es ch|m|quement
cons|drab|ement augmenter |e nombre de prot|nes |dent|f|es dans |e LCk ou |e |ysat de
Gk, en rdu|sant |a concentrat|on de prot|nes ma[or|ta|res comme |'a|bum|ne et
|'hmog|ob|ne, nous avons va|u |e potent|e| de ces Ns dans |e p|asma. Ces rsu|tats
sont pr||m|na|res et une ana|yse p|us dta|||e est en cours.
2. Matr|e|s et Mthodes
1) Co||ecte du p|asma
Les echanLlllons sangulns provlennenL de donneurs salns du CPu de Crenoble. Le sang a eLe
recupere dans des Lubes Lu1A eL cenLrlfuge 10 mln a 2000g. Le surnageanL consLlLue du
plasma sanguln a eLe recupere eL conserve a -80C [usqu'au momenL de l'analyse.
2) 1ra|tement avec |es Ns
lcl, 2 Lypes dlfferenLs de ns onL eLe uLlllses : fluldMAC-CS eL fluldMAC-AA. Leurs
caracLerlsLlques plus deLalllees sonL dlsponlbles en annexe. nous avons aussl LesLe 2 Lallles
de ns: 100 eL 200 nm. Les quanLlLes de ns a lncuber avec le plasma onL eLe calculees de
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Lelle sorLe que la surface de conLacL LoLale developpee par les ns solL ldenLlque quelque
solL la Lallle des ns.
300 l de plasma onL eLe lncubes avec les ns pendanL 43 mln sous aglLaLlon a LemperaLure
amblanLe. Les ns onL eLe lavees 3 fols au 8S. Les proLelnes a leur surface onL ensulLe eLe
eluees dans un Lampon aceLonlLrlle / 1lA 1 (30 / 20). La concenLraLlon proLelque des
eluaLs eL du plasma non LralLe a eLe deLermlnee par la meLhode de 8radford.
3) Ana|yse du p|asma par SDS-AGL
10 g de proLelnes eluees des ns alnsl que 10 g de plasma non LralLe onL eLe reprls dans
du Lampon Laemll (4 SuS, 20 glycerol, 10 2-mercapLoeLhanol, 0.004 bromophenol
blue, 0.123 M 1rls PCl), chauffes eL charges sur un gel de polyacrylamlde (4 a 13 ) pour une
separaLlon des proLelnes en foncLlon de leur polds moleculalre. Le gel a eLe colore au bleu
de Coomassle eL decolore a l'eLhanol 30 / aclde aceLlque 7 .
4) Ident|f|cat|on des prot|nes par nano-LC-MS]MS
L'ldenLlflcaLlon des proLelnes a eLe reallsee par la ur 8oxana MarLlnez-lnna du laboraLolre
du ur 8ernard MonsarraL a 1oulouse, selon le mme proLocole que celul uLlllse pour
l'analyse du LC8 eL du C8.
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3. ksu|tats pr||m|na|res
1) L'|mpact des Ns sur |e prof|| SDS-AGL du p|asma sangu|n
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I|gure 26: rof||s SDS-AGL d'un p|asma non tra|t ou tra|t avec Ns. 2 types et 2 ta|||es d|ffrents de Ns ont t
ut|||ss.
Comme on peuL le consLaLer sur ces proflls de mlgraLlon SuS-ACL (llgure 26), les
echanLlllons plasmaLlques LralLes avec les ns revelenL des proflls proLelques dlfferenLs du
plasma bruL, non LralLe. Ln effeL, le profll proLelque du plasma bruL revele une bande
ma[orlLalre (fleche bleue) qul correspond a la masse moleculalre de l'albumlne , Lres peu
d'auLres bandes sonL vlslbles. Ln revanche, les 4 echanLlllons LralLes par les ns revelenL des
proflls proLelques blen plus rlches avec l'apparlLlon de nombreuses bandes sur LouL
l'lnLervalle de masse (10 a 170 kua). ue plus la bande correspondanL a l'albumlne esL
neLLemenL dlmlnuee pour Lous les echanLlllons LralLes, par rapporL a l'echanLlllon conLrle.
CeLLe premlere observaLlon semble conflrmer la capaclLe des ns a redulre la concenLraLlon
d'albumlne a leur surface, permeLLanL alnsl la deLecLlon d'auLres proLelnes plasmaLlques. Sl
on compare les 2 Lypes de ns uLlllsees, on observe une legere dlfference dans leurs proflls
proLelques , on peuL volr que cerLalnes bandes sonL plus lnLenses ou unlquemenL presenLes
(fleche nolre) pour un Lype de ns. Ce resulLaL suggere la complemenLarlLe de capLure des
dlfferenLes chlmles presenLes a la surface des ns. L'uLlllsaLlon de dlfferenLs Lypes de ns
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permeLLralL une exploraLlon plus eLendue du proLeome plasmaLlque. Ln revanche, aucune
dlfference concernanL la Lallle des ns n'esL clalremenL vlslble sur ces proflls SuS-ACL.
2) L'|dent|f|cat|on des prot|nes captes par |es Ns par nano-LC-MS]MS
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I|gure 27: n|stogramme rcap|tu|ant |e nombre de prot|nes d|ffrentes |dent|f|es par nano-|c-ms]ms.
Afln de mleux evaluer la capaclLe des ns a acceder plus largemenL au proLeome
plasmaLlque, nous avons ldenLlfle les proLelnes eluees de la surface des ns par nano-lc-
ms/ms. Les 4 echanLlllons LralLes avec les ns eL un echanLlllon de plasma non LralLe onL eLe
analyses. Les resulLaLs sonL presenLes dans la flgure 27.
L'analyse du plasma non LralLe a permls l'ldenLlflcaLlon de 183 proLelnes dlfferenLes , plus de
330 proLelnes dlfferenLes onL eLe revelees a parLlr des echanLlllons LralLes avec les ns. Ce
nombre varle enLre 332 eL 379 proLelnes dlfferenLes, selon le Lype eL la Lallle de ns uLlllses.
CeLLe augmenLaLlon de 100 du nombre de proLelnes dlfferenLes ldenLlflees a parLlr de 300
l de plasma conflrme l'lnLerL de l'uLlllsaLlon des ns, en amonL de l'analyse proLeomlque.
u'apres ces premlers resulLaLs d'ldenLlflcaLlon, la chlmle eL la Lallle des ns ne semblenL pas
avolr une lnfluence sur le nombre de proLelnes dlfferenLes capLees. Ln revanche, sl on
regarde l'ldenLlLe des proLelnes, on observe de nombreuses dlfferences parml les
echanLlllons, en foncLlon de la chlmle eL de la Lallle des ns (llgure 28)
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I|gure 28: D|agramme de Venn schmat|sant |e nombre de prot|nes d|ffrentes et s|m||a|res entre |es chant|||ons.
Alnsl, en comblnanL 2 Lypes dlfferenLs de ns, nous avons pu ldenLlfler [usqu'a 488 proLelnes
a parLlr d'un ml de plasma. Ln regroupanL LouLes les proLelnes dlfferenLes ldenLlflees dans
les 4 echanLlllons, l'uLlllsaLlon de ns a mls en evldence une llsLe de 684 proLelnes
dlfferenLes, a parLlr d'un volume LoLal de plasma de 2 ml , 90 des 183 proLelnes ldenLlflees
dans le plasma bruL sonL reLrouvees dans ceLLe llsLe. Ces resulLaLs devronL Lre conflrmes
par des repllcaLs , lls meLLralenL alnsl en evldence la complemenLarlLe de capLure des ns, eL
l'lnLerL de comblner dlfferenLes surfaces nanoparLlculalres afln d'ldenLlfler des sous
proLeomes plasmaLlques. CeLLe approche pourralL Lre uLlllsee en vue d'ldenLlfler des
marqueurs moleculalres paLhologlques clrculanL dans le sang.
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IV. Vers |'ut|||sat|on "#! v|vo de Ns pour |a capture de
prot|nes dans |e sang.
1. Introduct|on gnra|e
A l'lnsLar de l'analyse posL-morLem du Llssu cerebral, l'analyse +,# (!(' du plasma esL
confronLee a la degradaLlon proLelque eL a la llberaLlon de facLeurs solubles par les cellules
du sang, lesquelles onL lleu enLre le prelevemenL eL la conservaLlon de l'echanLlllon a -80C
(Ayache, anelll eL al. 2006). uuranL ce laps de Lemps (en moyenne 1 a 2 h), prlnclpalemenL
lle a la dlsLance enLre le lleu de prelevemenL eL celul de LralLemenL de l'echanLlllon, les
proLelnes du sang sonL su[eLLes a une degradaLlon, due a l'acLlvlLe des dlfferenLes proLeases
endogenes presenLes. Ln plus de la degradaLlon proLelque, la llberaLlon d'lnLerleuklnes ou
de facLeurs de crolssance par les monocyLes, les lymphocyLes ou les plaqueLLes va aussl
modlfler le conLenu moleculalre du plasma (8oyanLon and 8llck 2002). une eLude menee par
Ayache +-#)%* (Ayache, anelll eL al. 2006) a demonLre l'augmenLaLlon de 37 facLeurs solubles
dans des echanLlllons sangulns resLes 2 h a LemperaLure amblanLe. Ces phenomenes vonL
conslderablemenL blalser l'analyse quallLaLlve eL quanLlLaLlve des proLelnes conLenues dans
l'echanLlllon, compromeLLanL serleusemenL l'ldenLlflcaLlon de marqueurs moleculalres
flables. Sl la degradaLlon proLelque peuL Lre en parLle conLrlee par des lnhlblLeurs de
proLeases (endogenes eL exogenes), la llberaLlon de facLeurs solubles dans le plasma ne peuL
Lre evlLee que par la cenLrlfugaLlon lmmedlaLe de l'echanLlllon afln de separer le plasma
des auLres consLlLuanLs sangulns : ceLLe soluLlon resLe peu envlsageable en rouLlne cllnlque.
une auLre soluLlon pour s'affranchlr des llmlLes acLuelles de l'analyse +,# (!(' seralL le
developpemenL d'une sLraLegle permeLLanL la capLure des proLelnes plasmaLlques !"# (!('# a
l'alde de ns adapLees, ln[ecLees dans la clrculaLlon sangulne. Avec l'emergence des
nanoLechnologles ces dernleres annees, l'uLlllsaLlon de ns !"# (!(' pour l'lmagerle opLlque
ou a resonance magneLlque (Lee, Puh eL al. 2007), (?oo, Lee eL al. 2011), la dellvrance clblee
de medlcamenLs (Cradlshar, 1[ulandln eL al. 2003) ou encore des approches de Lheraple par
hyperLhermle (1hlesen and !ordan 2008) esL en en[eu ma[eur en LheranosLlque, noLammenL
dans les cancers (Ma, Zhao eL al. 2011), (xle, Puang eL al. 2009). CependanL Lres peu de
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groupes s'lnLeressenL a leur uLlllsaLlon !"#(!(' pour la capLure de marqueurs moleculalres. La
posslblllLe pour ces ns d'avolr acces a la LoLallLe du volume sanguln eL de clrculer a
proxlmlLe des mlcroenvlronnemenLs paLhologlques esL une opporLunlLe unlque de
concenLrer des marqueurs moleculalres a leur surface. CependanL une Lelle approche
requlerL
- la blocompaLlblllLe de ces ns afln d'evlLer une LoxlclLe poLenLlellemenL
dangereuse, eL leur ellmlnaLlon raplde de la clrculaLlon par le sysLeme lmmunlLalre
(uobrovolskala, Aggarwal eL al. 2008), (llscher and Chan 2007)
-un sysLeme de recapLure des ns afln d'analyser les proLelnes presenLes a leur
surface.
Au cours de mon trava|| de thse, ['a| |n|t| un pro[et tentant de rpondre ces deux
cond|t|ons. Une co||aborat|on avec |e CLA-LL1I et avec |'Inst|tut Lou|s Ne| a perm|s |e
dpt de deux brevets (cf annexe) dcr|vant notre stratg|e.
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2. L'encapsu|at|on des Ns dans un b|opo|ymre d'a|g|nate.
1) Introduct|on
8rlevemenL, afln d'evlLer une reacLlon lmmunlLalre mals aussl une LoxlclLe poLenLlelle sulLe a
l'ln[ecLlon !"#(!(' de ns magneLlques eL chlmlquemenL modlflees (llscher and Chan 2007),
nous avons opLe pour l'encapsulaLlon des ns dans un polymere blocompaLlble : l'alglnaLe.
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7


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levrler !ullleL 2011
composlLe eL le sang dolL Lre sufflsammenL long, sans exceder 10 a 13 mlnuLes, pour que les
proLelnes pulssenL se concenLrer en assez grand nombre sur les nanoparLlcules.
Les nanoparLlcules sonL ensulLe recuperees par almanLaLlon apres degellflcaLlon du
composlLe. Ln effeL, les nanoparLlcules, , sonL magneLlsables. Cn
peuL alors les recuperer pour reallser les analyses blologlques
proLelnes capLurees.
||) 8ut du stage
D lnLegre dans le cadre de ce pro[eL. ll a pour buL le
developpemenL eL la caracLerlsaLlon du composlLe alglnaLe/nanoparLlcules uLlllse pour capLer les
proLelnes. uans un premler Lemps, un proLocole de preparaLlon efflcace du composlLe a d Lre
deflnl. uls, caracLerlser le composlLe eL de
pouvolr selecLlonner la formulaLlon la plus adapLee aux besolns du pro[eL.
des eLudes complemenLalres, comme sur la sLablllLe des nanoparLlcules eL
du composlLe, eL sur son comporLemenL en soluLlon. Lnfln, une eLude a eLe falLe sur la quallLe de

b) A|g|nate et nanopart|cu|es : descr|pt|on
>forme
de sodlum) dans laquelle des nanoparLlcules magneLlques sonL dlspersees.
|) A|g|nate de sod|um
L de la famllle des
/
possedanL deux unlLes monomeres : le
manuronaLe eL le guluronaLe (llgure 2). ll esL
: les lamlnalres.
>
aLlon, comme addlLlf epalsslssanL par exemple, mals aussl en medeclne, ou ll serL pour
ou de cellules
[2]
.
>lnaLe vonL dependre de la proporLlon eL de la
dlsLrlbuLlon des deux monomeres (que
D '
pour manuronaLe eL guluronaLe) dans la
chalne polymere. Ln effeL, la sLrucLure
de la chalne va Lre llee a
s groupemenLs M eL
C (llgure 3).
I|gure 2 - Structure ch|m|que de |'a|g|nate
[1]

I|gure 3 - Success|on de mot|fs M et G
[3]

CuluronaLe
ManuronaLe

I|gure 29: Structure ch|m|que de |'a|g|nate.
L'alglnaLe falL parLle de la famllle des polysaccharldes , c'esL un blopolymere naLurel
provenanL des algues brunes, Lres uLlllse dans les appllcaLlons medlcales. ll se compose de
chaines llnealres polysaccharldlques donL les 2 monomeres sonL l'aclde !-u mannuronlque
eL l'aclde "-L guluronlque (llgure 29). Les proprleLes physlco-chlmlques de l'alglnaLe
dependenL de la proporLlon eL de la dlsLrlbuLlon de ces monomeres(Wee and ComboLz
1998).
Ln presence d'lons dlvalenLs comme le calclum, l'alglnaLe va former un gel , les chalnes
polysaccharldlques vonL s'assocler auLour des lons calclum, enLralnanL alnsl une reLlculaLlon
eL la formaLlon d'un reseau Lrldlmenslonnel nanoporeux, lmpermeable aux cellules du
sysLeme lmmunlLalre eL aux lmmunoglobullnes (llgure 30) (kulseng, 1hu eL al. 1997). Ce
reseau peuL facllemenL Lre renverse par l'uLlllsaLlon de chelaLeurs du calclum, lesquels vonL
enLralner la depolymerlsaLlon du gel.
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levrler !ullleL 2011
> un grand nombre de groupemenLs carboxylaLes eL alcools, a la

de moLlf guluronaLe (C), favorlsanL la formaLlon de llalsons physlques avec le calclum (llgure 4).

ine
polymere, Lres elecLronegaLlfs,
2+

des llalsons physlques falbles.


nombre de chaines, on va observer un phenomene de
dlmerlsaLlon des chaines lon calclum.
Cn obLlenL alors des enLre

une reLlculaLlon : LouLes les chalnes
sonL llees enLre elles par slmples

des lons calclum. Cn parle alors de gel
physlque . Ce Lype de gel possede
une cerLalne souplesse eL esL reverslble,
c'esL a dlre qu'une degellflcaLlon esL
posslble (llgure 3).




caracLerlses par leurs masses molalres, leurs rapporLs moLlfs C/moLlfs M eL leurs Laux de pureLe :
#$%" &$'()*++,'("
-.//$(0"
123"
3.++,"%$4.*(," 5*+6$+*07" 8'(,07"
8CnCvA
SLC 100
9:;

novaMaLrlx >1,3
LnLre 200 000 eL
300 000 g/mol
20-99
ma.s
ur eL sLerlle. Sous forme
de flbres blanches.
roLanal Ll
200 uL
9<;

lMC
8loolymer
LnLre 1,44
eL 1,37
-
200-400
ma.s
ConLlenL des lmpureLes.
oudre [aunLre

>W^>'
(vlscoslLe, poroslLe), eL en peLlLes quanLlLes. Au conLralre, le roLanal Ll 200 uL esL pluLL uLlllse
pour les eLudes prellmlnalres, ou des essals de dlsperslon, par exemple.
&*='(,":">"?)0,(.60*$)+"@4=*).0,2A.46*'%"
9B;
"
&*='(,"<">"8(*)6*/,"C,"4."=74*D*6.0*$)"
9B;
"
I|gure 30: r|nc|pe de |a g||f|cat|on.
!usqu'a presenL, l'alglnaLe a prlnclpalemenL eLe uLlllse comme sysLeme de dellvrance de
medlcamenLs ou dans les xenogreffes pour evlLer le re[eL lmmunologlque par l'organe hLe
(1onnesen and karlsen 2002), (uufrane, Coebbels eL al. 2006).
nous sommes les premlers a proposer l'uLlllsaLlon de ns encapsulees dans l'alglnaLe afln de
recuellllr une lnformaLlon moleculalre !"#(!('. nous avons depose un breveL en collaboraLlon
avec le CLA-LeLl decrlvanL ceLLe approche. CependanL l'encapsulaLlon des ns, afln de les
rendre lndeLecLables par le sysLeme lmmunlLalre, ne dolL en aucun cas alLerer leur capaclLe
de capLure proLelque. Afln de le verlfler, nous avons lncube des capsules d'alglnaLe
conLenanL des ns, avec du plasma eL reallse l'analyse des proLelnes presenLes a la surface
des ns, apres depolymerlsaLlon des capsules. nous avons compare les resulLaLs avec ceux
obLenus sur des ns non encapsulees.
2) Matr|e|s et Mthodes :
a. Nanopart|cu|es et A|g|nate
ues ns fluldMAC-CS de 100 nm de dlameLre onL eLe uLlllsees. Leurs caracLerlsLlques plus
deLalllees sonL dlsponlbles en annexe.
L'alglnaLe 8CnCvA SLC100 provlenL de chez novamaLrlx. ll s'aglL d'alglnaLe de sodlum,
sLerlle, donL le raLlo en compose aclde Culuronlque/Mannuronlque esL de 1,3. un Lampon
de chlorure de calclum a 100 mM esL uLlllse pour la polymerlsaLlon de l'alglnaLe Landls que
du clLraLe de sodlum a 0,3 M esL uLlllse pour le depolymerlser. lus de deLalls sonL
dlsponlbles en annexe.
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b. Lncapsu|at|on des N dans |'a|g|nate
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levrler !ullleL 2011
uans ce proLocole, on solublllse l'alglnaLe de sodlum (poudre) dans un Lampon a pP = 7,4.
uls on a[ouLe les nanoparLlcules en suspenslon dans l'eau. Cn obLlenL apres aglLaLlon un melange
alglnaLe/nanoparLlcules. un sysLeme pousse-serlngue/caplllalre permeL de former des bllles en
gellflanL au gouLLe-a-gouLLe la soluLlon d'alglnaLe. Ce proLocole permeL de preparer des bllles de
1,3mm de dlameLre, homogenes en Lallle, avec des concenLraLlons en alglnaLe de l'ordre de 1 en
masse. Au dela, la vlscoslLe de l'alglnaLe esL Lrop lmporLanLe eL bouche le caplllalre.
ll a eLe LesLe eL quelques essals onL eLe reallses avec les parLlcules lluldMAC-S de 100nm.
Ln peuL pas avolr une concenLraLlon en
nanoparLlcules superleure a 10, car ll y a da puls sedlmenLaLlon
des nanoparLlcules. Cuelques essals avec les parLlcules lluldMAC-CS onL monLre des resulLaLs
saLlsfalsanLs. Lnfln, mme a falble concenLraLlon, les lluldMAC-S de 200nm semblenL lnadapLees,
car srapldemenL.
##$ %&'()*'"+,&-&.&/)"0)"+,1+*,*-#&2"0)3"4#//)3"0)"5)/"
Ce proLocole lnlLlal, monLre rapldemenL ses llmlLe
soluLlons plus concenLrees. ueux polnLs posenL problemes :
- > un caplllalre Lres fln (dlameLre lnLerne de 230m) lorsque la
soluLlon esL Lres vlsqueuse (concenLraLlon e de 3 m/m)
- La dlsperslon des nanoparLlcules esL dlfflclle, volre lmposslble pour des soluLlons Lres
vlsqueuses.
Afln de paller a ces problemes, un nouveau proLocole a eLe developpe :

"
"
"
"
"
"


remplace lcl par une algullle (dlameLre lnLerne de 600m. Cn obLlenL des bllles homogenes en
6#5',)"7"8"%&'()*'"+,&.101"0)"+,1+*,*-#&2"
ulsperslon des nanoparLlcules dans un
1ampon pP = 7.4 ([naCl] = 134mM)
ousse-serlngue
^
nanoparLlcules
SoluLlon de gellflanL :
CaCl2 ([Ca
2+
] = 20mM)
!"#$$%&$%'()*#%+
,"-#.")+/01-*()12%+
3")2%)1)2+/%$+4!$+
5167")+/%+7"-869'($1.")+
:1:-
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I|gure 31: hoto du d|spos|t|f (gauche) permettant |a product|on de capsu|es d'a|g|nate contenant des Ns (dro|te).
ar chuLe de gouLLes dans le Lampon de polymerlsaLlon (CaCl
2
100mM), a l'alde d'un pousse
serlngue, des capsules d'envlron 2 mm de dlameLre sonL formees a parLlr d'une soluLlon
aqueuse conLenanL 1,3 m/v d'alglnaLe eL 10 v/v de n-CS. Les capsules formees eL
renfermanL les ns sonL lalssees 48h dans le Lampon de polymerlsaLlon afln que la
polymerlsaLlon solL compleLe (llgure 31)
c. Incubat|on des Ns encapsu|es avec |e p|asma
300 l de plasma onL eLe lncubes avec 300 g de ns, encapsulees. Les capsules onL ensulLe
eLe lavees 3 fols au 8S puls lncubees pendanL 13 mln sous aglLaLlon avec 130 l de clLraLe
de sodlum 0,3 M afln de depolymerlser l'alglnaLe. une fols llberees de l'alglnaLe, les ns onL
eLe lavees 2 fols au 8S eL une fols a l'eau. Les proLelnes a leur surface onL eLe eluees dans
un Lampon aceLonlLrlle / 1lA 1 (30 / 20). our comparalson, des ns non encapsulees
onL eLe lncubees en parallele avec 300 l de plasma. La concenLraLlon en proLelnes des
eluaLs a eLe deLermlnee par la Lechnlque de 8radford.
d. Ana|yse SDS AGL des prot|nes p|asmat|ques captes par |es Ns
10 g de proLelnes eluees respecLlvemenL des ns non encapsulees eL des ns encapsulees,
onL eLe reprls dans du Lampon Laemll (4 SuS, 20 glycerol, 10 2-mercapLoeLhanol,
0,004 bleu de bromophenol, 0,123 M 1rls PCl), chauffes eL charges sur un gel de
polyacrylamlde pour une separaLlon des proLelnes en foncLlon de leur polds moleculalre. Le
gel a eLe colore au bleu de Coomassle eL decolore a l'eLhanol 30 / aclde aceLlque 7 .
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e. Ana|yse par spectromtr|e de masse des prot|nes captes par |es Ns.
Afln d'avolr un profll proLelque des bas polds moleculalres (lnferleur a 10 kua) 0,3 g de
proLelnes de chaque eluaL onL eLe reprls dans de la maLrlce CPCA, depose sur une clble
maldl eL analyse sur un specLromeLre de masse Lype MALul-1Cl (Mlcroflex, 8ruker,
Cermany). Chaque specLre a eLe acquls en mode llnealre grce au loglclel llexConLrol, puls
analyse sur llexAnalysls (8ruker, Cermany).
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3) ksu|tats pr||m|na|res
Ces resulLaLs sonL prellmlnalres eL les lnLerpreLaLlons falLes lcl devronL
Lre conflrmees.
Le dosage proLelque, par la meLhode de 8radford, de l'eluaL des ns
encapsulees dans l'alglnaLe a revele une concenLraLlon de 0,23 g/l. Le
dosage des mme ns non encapsulees a revele une concenLraLlon
proLelque 4 fols plus elevee, auLour de 1 g/l. Ce premler resulLaL
demonLre que l'encapsulaLlon des ns modlfle leur comporLemenL de
capLure proLelque. Afln de mleux comprendre ceLLe premlere
dlfference, nous avons reallse l'analyse SuS-ACL des proLelnes eluees
des ns encapsulees eL non encapsulees (llgure 32). L'observaLlon des
proflls proLelques revele la dlmlnuLlon de la proporLlon d'albumlne dans
les 2 echanLlllons. Ln effeL, nous pouvons noLer l'absence d'une bande
ma[orlLalre a 66 kua qul correspond a la masse moleculalre de
l'albumlne. CeLLe observaLlon avalL de[a eLe falLe dans les resulLaLs
precedenLs concernanL l'analyse proLeomlque du plasma sur les ns non encapsulees. lcl, on
demonLre que l'encapsulaLlon n'alLere pas la capaclLe des ns a redulre la concenLraLlon
d'albumlne a leur surface. CependanL, on peuL noLer une cerLalne dlfference enLre ces 2
proflls proLelques : en effeL, alors que le profll des ns non-encapsulees revelenL des bandes
au dela de 170 kua, la dernlere bande vlslble sur le profll des ns encapsulees se slLue
auLour de 130 kua. Ce resulLaL conflrme que le reseau nanoporeux Lrldlmenslonnel
d'alglnaLe forme un fllLre de masse qul empche les grosses proLelnes de peneLrer dans
la capsule eL de se flxer sur les ns. Ln empchanL les grosses proLelnes de renLrer, le reseau
d'alglnaLe offrlralL alnsl la posslblllLe a d'auLres proLelnes de plus peLlLes masses de se flxer a
la surface des ns. Afln de conflrmer ceLLe supposlLlon, nous avons analyse le profll
proLelque de nos echanLlllons a des masses lnferleures a 10 kua, par MALul-1Cl-MS.
I|gure 32: rof||s SDS-
AGL des prot|nes
|ues de Ns non
encapsu|es ou
encapsu|es
!
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,-.#
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,-.#
/0#121#31456789:37#
/0#31456789:37#

I|gure 33: rof|| MALDI des prot|nes de bas po|ds mo|cu|a|re captes par |es Ns encapsu|es (spectre du haut) et non
encapsu|es (spectre du bas).
La flgure 33 meL clalremenL en evldence un enrlchlssemenL quallLaLlf eL quanLlLaLlf des plcs
deLecLes sur le specLre proLelque des ns encapsulees, pour un lnLervalle de masse de 1 a 10
kua. Ln effeL, pour une mme quanLlLe de proLelnes deposee sur les spoLs MALul, le
nombre de plcs deLecLes eL leur lnLenslLe sonL superleurs pour les ns encapsulees. Ce
resulLaL revele alnsl que l'encapsulaLlon des ns augmenLe la concenLraLlon de proLelnes de
bas polds moleculalres a leur surface.
Ln resume, l'encapsulaLlon des ns dans un reseau d'alglnaLe va conslderablemenL modlfler
les capaclLes de capLure proLelque des ns. Ln effeL, le reseau nanoporeux, cree par la
reLlculaLlon de l'alglnaLe, empche les proLelnes superleures a 130 kua de peneLrer dans les
capsules. Aussl, pour un mme plasma, les ns a l'lnLerleur des capsules vonL se reLrouver
dans un envlronnemenL proLelque dlfferenL de celul ou se LrouvenL des ns non
encapsulees , ce qul expllque un comporLemenL dlfferenL. 8len que les ns encapsulees se
comporLenL dlfferemmenL des ns nues , elles onL conserve la capaclLe a redulre a leur
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surface la concenLraLlon d'albumlne eL semblenL efflcaces dans la capLure des bas polds
moleculalres. Ce dernler parameLre renforce l'lnLerL de les uLlllser !"#(!(' dans le sang pour
la capLure de marqueurs moleculalres provenanL du Llssu, eL qul sonL souvenL decrlLs comme
des proLelnes de bas polds moleculalres (LloLLa, lerrarl eL al. 2003). Lnfln, blen que
developpees pour une poLenLlelle uLlllsaLlon !"# (!('. les proprleLes des ns encapsulees
peuvenL aussl servlr a l'analyse proLeomlque +,#(!(' des fluldes blologlques. A l'lnsLar de la
complemenLarlLe offerLe par les dlfferenLes chlmles greffees a la surface des ns,
l'encapsulaLlon offrlralL aussl l'acces a d'auLres sous proLeomes plasmaLlques.
ll fauL cependanL conflrmer ces resulLaLs sur un plus grand nombre d'echanLlllons mals aussl
ldenLlfler par nano-lc-ms/ms les proLelnes capLees par ces ns encapsulees afln de mleux
evaluer leurs dlfferences par rapporL aux ns nues.
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3. Dve|oppement de m|cro-a|mants |mp|antab|es pour |a
recapture de Ns dans |a c|rcu|at|on sangu|ne.
1) Introduct|on
une condlLlon lndlspensable a l'uLlllsaLlon de ns pour la recherche de blomarqueurs !"#(!('#
esL le developpemenL d'un sysLeme de recapLure d'une parLle des ns ln[ecLees afln
d'analyser leur conLenu proLelque. Ln collaboraLlon avec l'lnsLlLuL Louls neel a Crenoble,
nous avons Llre proflL des proprleLes magneLlques des ns pour developper des mlcro-
almanLs lmplanLables eL capables d'aLLlrer des ns falblemenL concenLrees dans le sang.
CeLLe collaboraLlon a falL l'ob[eL d'un breveL [olnL en annexe. A l'heure acLuelle, les mlcro-
dlsposlLlfs prlnclpalemenL developpes pour le conLrle eL/ou la manlpulaLlon de parLlcules
magneLlques uLlllsenL des mlcro-boblnes ou des maLerlaux doux respecLlvemenL couples a
un couranL ou a un champ magneLlque exLerne. uans les deux cas, ces mlcro-dlsposlLlfs ne
sonL pas auLonomes eL requlerenL une allmenLaLlon exLerne qul compllqueralL leur
lmplanLaLlon !"#(!('. Ln collaboraLlon avec l'lnsLlLuL neel, nous avons developpe des mlcro-
almanLs blocompaLlbles eL LoLalemenL auLonomes. Ces almanLs presenLenL une surface
magneLlquemenL sLrucLuree donL le procede de fabrlcaLlon esL deLallle dans le breveL en
annexe. lls possedenL de remarquables proprleLes magneLlques (uempsey, WalLher eL al.
2007) proches de celles des mellleurs almanLs macroscoplques du marche.
2) ksu|tats pr||m|na|res
nous avons enLreprls des experlences +,# (!(' afln d'evaluer les capaclLes de ces mlcro-
almanLs a capLer des ns presenLes dans du sang en clrculaLlon. our cela, nous avons mlme
une clrculaLlon sangulne a l'alde d'un clrculL de Lubulures connecLe a une pompe
perlsLalLlque (llgure 34). uans un becher conLenanL un volume LoLal de 200 ml de sang Lu1A
provenanL de donneurs salns du CPu de Crenoble, nous avons ln[ecLe 20 l d'une soluLlon
de ns fluldMAC-CS de 100 nm, solL un rapporL volume sang / volume soluLlon ns egal a
10 000. ulx mlnuLes apres avolr demarre la pompe perlsLalLlque (a un deblL de 40 ml/ mln),
un mlcro-almanL dlspose sur une Llge en lnox a eLe lnLrodulL dans la clrculaLlon sangulne
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(llgure 34 drolLe) pendanL 3 mlnuLes. Le mlcro-almanL a ensulLe eLe reLlre, rlnce au 8S eL
observe au mlcroscope opLlque.
!"#$%&$'()*+,-./0%&
1)(20)+&*,340)3&
5'*%(6")(&&*,34&
7)2("8,)#,3+&
9,3*&2)(20-,."3&
:)4%&)3";&

I|gure 34:hoto du d|spos|t|f m|mant |a c|rcu|at|on (gauche) et s|te d'|ntroduct|on du m|cro-a|mant (dro|te)
Le mlcro-almanL uLlllse conLenalL des pleges magneLlques sous forme de bandes
Lransversales plus ou molns espacees. L'uLlllsaLlon d'un masque permeL de les locallser avanL
l'lnLroducLlon de l'almanL dans la clrculaLlon (llgure 33 A). Afln de vallder l'efflcaclLe eL la
speclflclLe de capLure de noLre mlcro-almanL, l'observaLlon au mlcroscope opLlque de ce
dernler, apres son lnLroducLlon dans le clrculL sanguln, eL sans uLlllser de masque dolL falre
apparalLre ces mmes bandes Lransversales. Ln effeL, ceLLe observaLlon slgnlfleralL que des
ns se sonL deposees speclflquemenL a l'endrolL ou sonL presenLs les pleges magneLlques. La
flgure 338 correspond a l'observaLlon du mlcro-almanL au mlcroscope opLlque apres la
capLure de ns. La slmllarlLe avec la flgure 33A conflrme la capLure de ns sulvanL le profll
magneLlque presenL sur le subsLraL. Ces resulLaLs demonLrenL noLre capaclLe a recuperer des
ns en Lres falble concenLraLlon dans une clrculaLlon sangulne.
!"
#"
$%%"&'""
$%%"&'""

I|gure 3S : (A) Loca||sat|on des p|ges magnt|ques avant |a capture de Ns v|a |'ut|||sat|on d'un masque. (8) Cbservat|on
de ce mme a|mant sans masque aprs |a capture de Ns.
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L'lnLerL ma[eur de recuperer ces ns ln[ecLees dans la clrculaLlon esL d'obLenlr un profll
proLelque !"#(!(' du plasma sanguln. neanmolns afln d'en Llrer une lnformaLlon perLlnenLe,
la quanLlLe de proLelnes dlsponlble, laquelle depend du nombre de ns recuperees par les
mlcro-almanLs, dolL Lre sufflsanLe pour une analyse par specLromeLrle de masse. Apres
avolr developpe des mlcro-almanLs conLenanL un maxlmum de pleges magneLlques sur un
subsLraL de 20 mm de longueur eL a 0,6 mm de largeur, nous avons souhalLe connaiLre le
nombre de ns recuperees par ce Lype de mlcro-almanL. Ln collaboraLlon avec le ur ascal
lrles du CLA de Crenoble, nous avons debuLe des experlences en 8esonance MagneLlque
nuclealre (8Mn) hauL champ afln de repondre a ceLLe quesLlon. 8rlevemenL, l'ob[ecLlf eLalL
de mesurer le Lemps de relaxaLlon 11 rho d'une soluLlon aqueuse conLenanL des ns avanL
eL apres l'lmmerslon d'un mlcro-almanL dans ceLLe soluLlon. Ln effeL, la varlaLlon du Lemps
de relaxaLlon 11 rho esL lnversemenL proporLlonnelle a celle de la concenLraLlon en ns dans
la soluLlon. noLre premlere experlence reallsee dans une soluLlon aqueuse forLemenL
concenLree en ns a mls en evldence une saLuraLlon de l'almanL apres avolr capLe 2,3.10
11

parLlcules. Ln nous basanL sur la quanLlLe de proLelnes plasmaLlques eluees des ns dans les
experlences +,#(!(', 2,3.10
11
parLlcules capLeralenL envlron 3 g de proLelnes , une quanLlLe
compaLlble avec une approche nano-LC-MS/MS. Ln resume nous dlsposons de mlcro-
almanLs, capables de recuperer des ns falblemenL concenLrees dans un large volume de
sang en clrculaLlon, eL avec une capaclLe de capLure de ns sufflsanLe pour l'analyse en
specLromeLrle de masse des proLelnes presenLes a la surface de ces dernleres. Ces resulLaLs
sonL Lres prellmlnalres , lls sonL LouL de mme Lres promeLLeurs. Leur conflrmaLlon
permeLLralL l'lnlLlaLlon d'un pro[eL !"# (!(' unlque a ce [our, vlsanL a l'obLenLlon du premler
profll proLelque sanguln#sans reallser de prlse de sang.
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Conc|us|on gnra|e.
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I. Dve|oppement d'une stratg|e pour |'ana|yse
protom|que du cerveau "#!$"$%.
L'ldenLlflcaLlon des mecanlsmes moleculalres a l'orlglne de la degenerescence dans la M
passe necessalremenL par l'analyse du Llssu paLhologlque, eL consLlLue un en[eu ma[eur au
developpemenL de Lheraples curaLlves. Avec la valldaLlon de Lechnlques d'ldenLlflcaLlon eL
de quanLlflcaLlon en specLromeLrle de masse, ll esL au[ourd'hul posslble de comparer
slmulLanemenL l'expresslon de cenLalnes de proLelnes dlfferenLes dans les reglons
cerebrales affecLees par une paLhologle. uans la M, la dlfflculLe a acceder au Llssu cerebral
!"# (!('# llmlLe acLuellemenL l'analyse proLeomlque au Llssu posL-morLem, Lrop souvenL
represenLaLlf d'un sLade Lres avance de la maladle eL poLenLlellemenL alLere par dlfferenLs
facLeurs pre eL posL-morLem. uans ce conLexLe, les quelques eLudes de proLeomlque
publlees [usqu'a presenL onL mls en evldence des dlfferences d'expresslon de proLelnes
assoclees au sLress oxydaLlf, a la foncLlon mlLochondrlale eL au sysLeme proLeasomal, sans
pour auLanL reusslr a dlsLlnguer la cause precoce, des consequences moleculalres Lardlves de
la neurodegenerescence. ue plus, les conLradlcLlons observees lnLer-eLudes (8asso, Clraudo
eL al. 2004), (Werner, Peyny-von Paussen eL al. 2008), (Llcker, CoLe eL al. 2012),
probablemenL llees au delal posL-morLem de prelevemenL du Llssu cerebral soullgnenL les
blals poLenLlellemenL lnLrodulLs par ce Lype d'approche. C'esL pourquol ll nous semblalL
lndlspensable d'analyser le Llssu paLhologlque !"# (!('# eL a un sLade molns avance de la
maladle. La sLlmulaLlon cerebrale profonde, proposee comme LralLemenL sympLomaLlque de
la M esL une opporLunlLe unlque d'acceder au cerveau parklnsonlen dans ces condlLlons.
CeLLe procedure neurochlrurglcale de plusleurs heures qul conslsLe a lmplanLer une
elecLrode de sLlmulaLlon dans le S1n esL au[ourd'hul appllquee a d'auLres paLhologles eL/ou
a d'auLres reglons cerebrales. Llle consLlLue un conLexLe ldeal a l'exploraLlon du cerveau, que
les elecLrophyslologlsLes onL su explolLer pour eLudler l'acLlvlLe elecLrlque neuronale dans
dlfferenLes paLhologles cerebrales (lallaL, olosan eL al. 2011), (Sanghera, Crossman eL al.
2003).
uans la premlere parLle de ce Lravall de Lhese, nous avons aussl explolLe ceL acces
Lemporalre au cerveau parklnsonlen pour obLenlr une lnformaLlon moleculalre du S1n chez
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le paLlenL !"# (!('. Sans a[ouLer le molndre gesLe a la procedure chlrurglcale eL a parLlr d'un
sLyleL de guldage hablLuellemenL uLlllse en fln d'operaLlon, eL donL l'exLremlLe enLre en
conLacL avec le S1n, nous avons pu exLralre des mlcro-fragmenLs Llssulalres donL l'analyse
proLeomlque par nano-LC-MS/MS a permls l'ldenLlflcaLlon de 1333 proLelnes dlfferenLes.
CeLLe approche esL unlque a ce [our eL ouvre la vole a la mlse en place d'une banque
d'emprelnLe moleculalre pour Lous les noyaux eL LouLes les paLhologles pour lesquels la
sLlmulaLlon cerebrale elecLrlque esL appllquee en cllnlque. Llle lalsse aussl envlsager la
posslblllLe de reallser des emprelnLes dans la Snc degeneree dans la M eL accesslble sur la
mme Lra[ecLolre, en aval du S1n. L'analyse proLeomlque de ces emprelnLes moleculalres
vlendralL alnsl compleLer les resulLaLs obLenus sur le Llssu posL-morLem, qul demeure la
reference en neuroproLeomlque dans la M.
une crlLlque posslble de ceLLe approche !"# (!('# reslde dans l'orlglne des mlcro-fragmenLs
Llssulalres recuperes. Ln effeL, ll n'esL pas exclu que du Llssu, provenanL des dlfferenLs
noyaux slLues sur la Lra[ecLolre en amonL du slLe d'lmplanLaLlon, se reLrouve dans le Lube
gulde a l'lnLerleur duquel esL lnLrodulL le sLyleL de guldage. L'exLremlLe du sLyleL seralL alnsl
conLamlnee par le Llssu d'auLres noyaux que celul clble eL les resulLaLs de l'analyse
proLeomlque resulLanLe seralenL dlfflcllemenL lnLerpreLables.
Afln d'assurer une capLure speclflque du noyau clble, nous avons developpe eL breveLe avec
le CLA-LL1l un nouvel ouLll d'emprelnLe adapLe au Llssu cerebral. 8ase sur la Lechnologle du
slllclum mlcrosLrucLure eL foncLlonnallse chlmlquemenL, l'ouLll dlspose de caracLerlsLlques
qul garanLlssenL l'obLenLlon d'une lnformaLlon speclflque de la reglon d'lnLerL, par une
exposlLlon conLrlee de la surface de capLure. La capLure Llssulalre sur puce permeL aussl de
conserver l'anaLomle des noyaux clbles. uans une eLude reallsee chez le prlmaLe saln, nous
avons vallde les capaclLes de noLre ouLll a fournlr une lnformaLlon moleculalre
represenLaLlve des noyaux clbles, a Lravers la reallsaLlon de plusleurs emprelnLes a dlfferenLs
Lemps, dans le mme noyau, eL chez le mme anlmal, sans engendrer de leslons
foncLlonnelles. une Lelle approche presenLe un lnLerL cerLaln dans des eLudes precllnlques
chez l'anlmal, vlsanL a decrypLer la chronologle d'evenemenLs moleculalres assocles a un
processus degeneraLlf progresslf, comme celul observe chez le prlmaLe expose de manlere
chronlque a de falbles doses de M1 (8ezard, lmberL eL al. 1997).
Ln parallele de noLre eLude, eL afln de vallder l'uLlllsaLlon en cllnlque de noLre ouLll, la
LoxlclLe du slllclum pour le Llssu cerebral a eLe evaluee. Les resulLaLs obLenus [usqu'a presenL
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lalssenL enLrevolr la valldaLlon prochalne de noLre ouLll chez l'humaln. Son uLlllsaLlon
presenLeralL un lnLerL dans LouLes les paLhologles cerebrales necesslLanL une lnLervenLlon
neurochlrurglcale, permeLLanL alnsl d'eLabllr une banque d'emprelnLe Llssulalre sur puce.
8len enLendu, l'uLlllsaLlon de noLre ouLll, en lleu eL place du sLyleL chlrurglcal dans la Snc de
paLlenLs parklnsonlens, auralL un lnLerL ma[eur pour la comprehenslon de l'eLlologle
moleculalre de la neurodegenerescence dopamlnerglque. La reallsaLlon d'emprelnLes
Llssulalres conLrles, dans la Snc non degeneree de paLlenLs aLLelnLs de 1CC ou d'epllepsle
eL operes pour l'lmplanLaLlon d'elecLrode dans le S1n permeLLralL, vla des approches de
proLeomlque quanLlLaLlve, d'ldenLlfler les proLelnes donL l'expresslon esL speclflquemenL
modlflee dans la M. ues eLudes foncLlonnelles sur ces proLelnes candldaLes eL l'uLlllsaLlon
d'agenLs pharmacologlques clblanL les mecanlsmes moleculalres dans lesquels elles sonL
lmpllquees permeLLralenL d'evaluer le rle de ces mecanlsmes dans le processus degeneraLlf
eL orlenLeralL le developpemenL de nouvelles Lheraples curaLlves.
II. Dve|oppement d'une stratg|e pour |'ana|yse
protom|que des f|u|des b|o|og|ques en c||n|que.
un auLre en[eu ma[eur de la M reslde dans l'ldenLlflcaLlon de marqueurs moleculalres
dlagnosLlques dans les fluldes blologlques. AcLuellemenL, le dlagnosLlc de la M repose
essenLlellemenL sur l'examen cllnlque des sympLmes moLeurs. ll se revele errone dans 10 a
23 des cas en ralson de la slmllarlLe des sympLmes de la M avec d'auLres paLhologles,
mals aussl Lardlf pulsque les premlers sympLmes moLeurs n'apparalssenL qu'apres la
degenerescence d'au molns 60 des neurones dopamlnerglques de la Snc.
L'analyse proLeomlque des fluldes blologlques, noLammenL du LC8 qul refleLe l'eLaL
physlopaLhologlque du cerveau, esL une opporLunlLe d'ldenLlfler en perlpherle, des
proLelnes donL l'expresslon seralL speclflquemenL modlflee dans la M. CependanL, en
ralson de la presence ma[orlLalre de l'albumlne eL d'une gamme de concenLraLlon de 8
ordres de grandeur dans le LC8, l'acces au proLeome mlnorlLalre, au seln duquel se
LrouveralenL de poLenLlels marqueurs moleculalres, requlerL de longues eLapes de
fracLlonnemenL, efflcaces mals lncompaLlbles avec des eLudes cllnlques sur un grand nombre
d'echanLlllons lndlvlduels. un compromls enLre l'lnLenslLe eL la duree du fracLlonnemenL, eL
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le nombre d'echanLlllons analyses dolL Lre Lrouve afln d'obLenlr une lnformaLlon
proLeomlque perLlnenLe sur un nombre d'echanLlllons sLaLlsLlquemenL slgnlflcaLlf.
our repondre aux besolns de la proLeomlque cllnlque, nous avons developpe une sLraLegle
de fracLlonnemenL sur ns magneLlques modlflees chlmlquemenL. Le LralLemenL de falbles
volumes de LC8 avec ces ns a conslderablemenL dlmlnue la proporLlon d'albumlne dans
l'echanLlllon, eL revele un enrlchlssemenL conslderable des proflls proLelques obLenus en
MS. Ce fracLlonnemenL par ns a permls d'augmenLer de 160 le nombre de proLelnes
ldenLlflees par nano-LC-MS/MS, eL la quanLlflcaLlon relaLlve sans marquage des proLelnes
dans les repllcas a permls de conflrmer la reproducLlblllLe de capLure des ns. nous
dlsposons donc d'une sLraLegle de fracLlonnemenL raplde, efflcace eL reproducLlble pour le
LralLemenL du LC8. nous meLLons acLuellemenL au polnL une plaLeforme auLomaLlsee
permeLLanL de LralLer sur plaque, 96 echanLlllons slmulLanemenL. Ln redulsanL
conslderablemenL l'eLape de fracLlonnemenL, nous pourrlons alnsl envlsager des eLudes de
profllage quanLlLaLlf vla des approches sans marquage, sur un grand nombre d'echanLlllon
afln d'ldenLlfler des marqueurs dlagnosLlques dans le LC8 de paLlenLs parklnsonlens.
Afln d'eLendre le champ d'appllcaLlon des ns, nous avons aussl demonLre l'lnLerL de leur
uLlllsaLlon pour l'analyse proLeomlque du C8 eL du plasma. Ces resulLaLs ouvrenL la vole a la
recherche de marqueurs dlagnosLlques de la M dans ce Lype d'echanLlllons. lls ouvrenL
aussl la vole a l'uLlllsaLlon de noLre sLraLegle en amonL de LouLe analyse proLeomlque sur les
fluldes blologlques, peu lmporLe la paLhologle eLudlee. Lnfln, nous Lravalllons aussl sur une
sLraLegle vlsanL a uLlllser ces ns !"# (!(', dans le sang pour la capLure dlrecLe de proLelnes.
our cela, nous avons lnlLle une sLraLegle d'encapsulaLlon des ns dans un polymere
blocompaLlble eL developpons acLuellemenL, en collaboraLlon avec l'lnsLlLuL Louls neel, des
mlcro-almanLs lmplanLables dans les valsseaux sangulns, eL capables de recuperer des ns
falblemenL concenLrees dans le sang.
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Annexe en ligne
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1. Informat|ons concernant |'out|| d'empre|nte t|ssu|a|re
hLLps://docs.google.com/folder/d/081ChvL-38pv8WLl4aln?MmZxZuL/edlL
2. I|ches techn|ques des Ns ut|||ses au cours de ce trava||
hLLps://docs.google.com/folder/d/081ChvL-38pv8v1Zvvu9h?WlxaLu/edlL
3. 8revet concernant |'encapsu|at|on de Ns dans un po|ymre
b|ocompat|b|e
hLLps://docs.google.com/folder/d/081ChvL-38pv81ulu8l82nlMxCug/edlL
4. 8revet concernant |e dve|oppement de m|cro-a|mants
autonomes et |mp|antab|es
hLLps://docs.google.com/flle/d/081ChvL-38pv88u1wvu8qCulwczg/edlL

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