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AULASPRTICAS

Extraco e anlise de cidos gordos em amostras de plantas medicinais

ExtracoporsoxhleteanliseporGCFID

Amostra liofilizada ter de petrleo

Esterificao

metanol:cido sulfrico: tolueno (2:1:1 v/v/v)

12 h a 50 C e 160 rpm

Filtrado e analisado

FAME recuperado com ter dietlico

GC-FID

Material Placasdeaquecimento Sistemasdesoxlhet Filtros Erlenmeyers Tubosdeevaporao Vials Esptulas Filtrosnylon0,2m Seringas

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Reagentes terdepetrleop.a. Metanol cidosulfricop.a. Toluenop.a. guadesionizada terdietlicop.a. Sulfatodesdioanidro

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Procedimentoexperimental 1Pesaraproximadamente3gdeamostraliofilizadaeregistaramassa. 2ExtrairaamostraliofilizadacomterdepetrleoemsistemadeSoxhlet. 3Evaporarosobrenadante. 4Adicionar5mldemetanol:cidosulfrico:tolueno2:1:1(v/v/v). 5Colocarnumbanhoa50C,comagitaoa160rpm,durante12h. 6Adicionar3mldeguadesionizadae3mldeteretlico;agitaremvortex. 7Retirarosobrenadanteparaumvialcomsulfatodesdioanidro. 8Filtraraamostracomfiltrodenylon0,2m. 9InjectarnoGCFID:Ascondiessoasindicadasnabibliografia.

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Exemplodecromatograma:

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cidos gordos numa amostra de frutos maduros de Rosa micrantha. 1. cido caprico (C6:0); 2. cido caprlico (C8:0); 3. cido cprico (C10:0); 4. cido lurico (C12:0); 5. cido mirstico (C14:0); 6. cido pentadecanico (C15:0); 7. cido palmtico (C16:0); 8. cido palmitoleico (C16:1); 9. cido heptadecanico (C17:0); 10. cido esterico (C18:0); 11. cido oleico (C18:1n9); 12. cido linoleico (C18:2n6c); 13. cido linolnico (C18:3n3); 14. cido araqudico (C20:0); 15. cido eicosanico (C20:1c); 16. cido eicosadienico (C20:2c); 17. cido eicosatrienico + cido heneicosanico (C20:3n3+C21:0); 18. cido behnico (C22:0); 19. cido docosadienico (C22:2); 20. cido tricosanico (C23:0); 21. cidolignocrico(C24:0).

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Bibliografia

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Extraco e anlise de oses em amostras de plantas medicinais

ExtracolquidoslidoeanliseporHPLCRI

Amostra liofilizada Etanol:gua 80:20 (v/v)

Suspenso

Concentrao do sobrenadante a 60 C Centrifugao (15 000g)

Extraco 30 min, 80 C

Concentrao a 40 C Redissolvido e filtrado

HPLC-RI

Material Banhotermostatizado TubosdeFalcon Balesdeevaporao Esptulas Filtrosnylon0,2m Seringas Reagentes Melezitose Glucose Frutose Sacarose Etanol guadestilada

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Procedimentoexperimental 1PesaraamostraliofilizadaparatubodeFalcon(1.0g). 2Preparar10mldesoluodepadrointerno(PI):soluodemelezitose(25mg/ml). 3Adicionaramostra1mldasoluoPI(Conc.Final5mg/ml). 2Extrairaamostracom40mldeetanolaquoso80%a80Cdurante30min. 3Centrifugara15,000gdurante10min. 4Concentrarosobrenadantea60Cnumevaporadorrotativo. 5Lavartrsvezescom10mldeterdietlico 6Evaporara40Cedissolveroresduofinalem5mldeguadestilada. 8Filtraraamostracomfiltrodenylon0,2m. 9InjectarnoHPLCRI:Ascondiessoasindicadasnabibliografia. Elaboraodarectapadro:3nveis 1Prepararumamisturadeglucose(150mg)+frutose(150mg)+sacarose(150mg)em5 mldegua:soluodeconcentraofinal30mg/ml. 2 Preparar a partir da soluome solues de concentrao 6 mg/ml; 12 mg/ml; 24 mg/ml: 24mg/ml:0,8mlmistura+0,2mlPI 12mg/ml:0,4mlmistura+0,2mlPI+0,4mlgua 6mg/ml:0,2mlmistura+0,2mlPI+0,6mlgua 3Filtraraamostracomfiltrodenylon0,2m. 4InjectarnoHPLCRI:Ascondiessoasindicadasnabibliografia.

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Exemplodecromatograma:

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Acares de frutos maduros de Rosa micrantha. 1. frutose; 2. glucose; 3. sacarose; 4. trealose; 5. PI (melezitose).

Bibliografia

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Exerccios

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1 Explique a importncia da realizao de um processo de seleco, recolha e armazenamento antes da extraco e anlise dos compostosalvo que fazem parte de determinadamatrizemestudo. 2Quaisasprincipaisvariveisqueafectamorendimentodeextraco? 3Nogeral,qualseriaomelhorsolventeparaextrair: a) cidosfenlicossimples b) Lpidos c) Polissacridos d) Flavonidesglicosilados e) Saponinas f) Carotenides g) Protenas h) cidosgordos i) Esterides j) Clorofilas k) Taninos 4 Enumere as tcnicas de extraco que utilizam preferencialmente gua como extractor. 5 Descreva a tcnica de extraco por soxhlet, enumerando as vantagens e as desvantagens? 6Sugiraumametodologiadeextracoparaasseguintessituaes: a) Licopenoapartirdotomate b) Alcalides c) Limonenoapartirdacascadecitrinos d) Flavonidesapartirdamaa e) Polifenisapartirdaberingela

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7Pretendeseisolaracafena,umalcalide,apartirdasfolhasdech.
O H 3C N CH3 N

N CH 3

Fig1.EstruturadaCafena

Alm de cafena, existem outros compostos no ch, que podem ser extrados com a cafena, sendo interferentes. Esses compostos so: celulose (insolvel em gua), taninos (solveis em gua), pigmentos/flavonides glicosilados (solveis em gua), clorofilas. A cafena (solvel em diclorometano), vai ser isolada por reaco com o cido saliclico (derivatizao). Faa o delineamento do processo de extraco tendo em vista a eliminaodoscompostosinterferentesexistentesnamatriz. 8Descrevaumprocedimentogeral,deanlisedeumdeterminadocompostoapartirde umamatriz,comvistaaoseuisolamento. 9Quaisasfasesestacionriasmaisutilizadasnascolunasdecromatografiapreparativa. 10Definafaseestacionriaefasemvel. 11Qualadiferenaentrecromatografialquidolquido,lquidoslido,gslquido? 12 Enumere um exemplo de famlia de compostos que pode ser analisada por cada tipo decromatografiaabaixocitado: a) Gslquido b) Partio c) Trocainica d) Cromatografiagel e) Cromatografiaemfasereversa f) Cromatografiaemfasenormal

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13 Indique a ordem pela qual os compostos seriam eludos numa coluna de HPLC em fasereversa: a) Benzeno,terdietlico,nhexano b) Acetona,diclorometano,acetamida 14 Indique a ordem pela qual os compostos seriam eluidos numa coluna de HPLC em fasenormal: a) Acetatodeetilo,cidoactico,dimetilamina b) Hexano,benzeno,diclorobenzeno 15 Os compostos fenlicos ocorrem como metabolitos secundrios nas plantas. Os flavonis constituem uma das maiores subclasses dos flavonides, apresentando a seguinteestruturabase:
H HO O H OH OH O

Fig.2Estruturadagalangina(flavonol)

Nas plantas esto ligados a aucares. Quando no esto ligados chamamse agliconas. Os flavonides livres no esto presentes nas plantas, mas podem surgir em resultado do processamentodaamostra. Segundo o trabalho de Henera (Henera, MC; Luque de Castro, MD; Ultrasound assisted extraction for the analysis of phenolic compounds in strawberries; Anal Bioanal Chem, 2004, 379: 11061112), uma determinada quantidade de morangos foi liofilizada e extradaporultrasons. a) Qualavantagemdaamostraestarliofilizada? b) Diga em que consiste a extraco por ultrasons e enumere algumas vantagens destatcnicarelativamentesmetodologiastradicionais. c) Alm dos compostos glicosilados, quer fazerse um estudo das agliconas. Qual seriaoprocedimentoaseguir? d) Aps a extraco, para efectuar a limpeza e prconcentrao da amostra que tcnicadevemosutilizar?

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e) Efectuouse uma anlise do extracto por cromatografia em fase reversa, sendo a fase mvel constituda por metanol/gua. Na fig 3 esto representados os cromatogramasreferentesamostra(a)eaospadres(b)

Fig.3Cromatogramas

Esto presentes os seguintes compostos: Naringenina, quercetina, naringina, rutina, c. elgico,campferolecatequina. Faa corresponder os compostos aos picos no cromatograma, justificando a escolha efectuada.

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Exerccios de espectrometria de massa

1 Explique porque os espectrmetros de massa separam os ies de acordo com a razo m/z. 2 De que maneira diferem os espectros obtidos por impacto electrnico e por ionizao qumica. 3 Um io molecular tem massa equivalente a 59,97. Sugira a identidade da molcula parente. 4Umcompostoapresentaumpicocomm/z145 a) Comosechamaopicocomm/z145? b) Qualseriaopicoresultantedeumaperdadeumgrupometilo. 5 Identifique os picos maioritrios dos espectros de massa do 1buteno, etilbenzeno, ciclohexano

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6 Um hidrocarboneto desconhecido possui um pico de io molecular em m/z 84 com uma intensidade relativa de 31,3. O pico M+1 possui uma intensidade relativa de 0,08. Proponha uma frmula molecular para esta substncia.

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7Interpreteosseguintesespectrosdemassas. Alcoolbenzlico

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m/z108

Bpineno(m/z136)

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8 Faa corresponder as estruturas (noctano e isooctano) apresentadas aos respectivos espectros.

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9Faacorresponder,justificando,osespectrosabaixoindicadoscomasestruturasden propilbenzenoeissopropilbenzeno.

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Exerccios de RMN

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1InterpreteerelacioneaestruturacomosseguintesespectrosdemassaeRMN.

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2Deacordocomosdadosespectroscpicosfornecidos,deduzaaestruturado composto(pentanona).Justifiquedevidamenteasuaresposta.

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3Deduzaoespectrodosseguintescompostos: a) Cloretodeacetilo;b)anidridoactico;c)Acetatodemetilo;d)acetamida. 4InterpreteoespectrodeRMNdeaminas

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4UmcompostodefrmulamolecularC8H9NO2apresentaosseguintesespectros:

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5Esboeoespectro1HRMNdosseguintescompostos.

6InterpreteerelacioneasestruturascomosrespectivosespectrosdeRMN1Habaixo indicados.

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