Universidade Federal de So Paulo Campus Diadema UC: Microbiologia Bsica

ROTEIROS E TCNICAS UTILIZADAS EM AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA BSICA

Docentes Profa. Dra. Cristina Viana Niero Profa. Dra. Karen Spadari Ferreira Profa. Dra. Renata Pascon Prof. Dr. Wagner Luiz Batista Discentes Smia El Hajj

SUMARIO
Normas de segurana para as aulas prticas de microbiologia................................................ 3 Preparo de materiais utilizados em laboratrio de microbiologia............................................. 5 Preparo de vidrarias .................................................................................................................... 5 Esterilizao ............................................................................................................................... 6 Procedimentos asspticos ........................................................................................................... 7 Flambagem de alas de platina ................................................................................................... 7 Flambagem de tubos e frascos.................................................................................................... 8 Manuseio de pipetas ................................................................................................................... 9 Preparao de lminas ............................................................................................................... 10 Esfregaos de culturas a partir de meio lquido ......................................................................... 10 Esfregaos de culturas a partir de meio slido .......................................................................... 11 Manuseio do microscpio ......................................................................................................... 12 Colorao de Gram ..................................................................................................................... 14 Colorao de Ziehl-Neelsen ....................................................................................................... 17 Preparo de meios de cultura ...................................................................................................... 19 Meios de cultura........................................................................................................................ 21 Tcnicas de semeadura.............................................................................................................. 23 Tcnica de contagem de bactrias pelo mtodo das diluies em placa ............................... 26 Teste de hemlise em gar-sangue ........................................................................................... 27 Teste de motilidade .................................................................................................................... 29 Teste da catalase ........................................................................................................................ 30 Teste do tioglicolato ................................................................................................................... 31 Antibiograma............................................................................................................................... 32 Prova do tubo germinativo ......................................................................................................... 34 Microcultivo em lmina .............................................................................................................. 35 Colquios das aulas prticas..................................................................................................... 36 Roteiro n 1 ............................................................................................................................... 36 Roteiro n 2 ............................................................................................................................... 38 Roteiro n 3 ............................................................................................................................... 41 Roteiro n 4 ............................................................................................................................... 45 Roteiro n 5 ............................................................................................................................... 47

NORMAS DE SEGURANA PARA AS AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA

O pequeno tamanho dos microrganismos e a necessidade de trabalhar com culturas que contm muitos milhes de clulas requerem o conhecimento de procedimentos especiais de segurana. Existem quatro nveis de segurana, classificados de acordo com os fatores de risco envolvidos. Muitos so os fatores de risco, e entre eles podemos citar: Tipos de atividade prtica; Tipos e fontes dos microrganismos; Condies do laboratrio; Maturidade do estudante e experincia dos professores e tcnicos (no caso de laboratrios de ensino). Um risco importante a gerao de aerossis, gotculas de gua contendo clulas vegetativas ou esporos de microrganismos, liberadas para o ar. Essas partculas, muito pequenas, podem ser facilmente levadas por correntes de ar e, ao serem inaladas, vo diretamente para os pulmes. Muitas das medidas de segurana adotadas so para minimizar o risco de formao de aerossis. O trabalho com segurana, no laboratrio de Microbiologia, exige o uso apropriado de equipamentos de proteo e de tcnicas microbiolgicas adequadas: Equipamentos de Proteo Individual (EPI): luvas, aventais, gorros, pr-ps, mscaras, culos; Equipamentos de Proteo Coletiva (EPC): cabine de segurana biolgica (localizada em ponto de pouco trfego e distante das portas): existem vrios tipos de cabine, dependendo do grau de segurana necessrio; extintores de incndio, chuveiro de segurana e lava-olhos; Todas as atividades devem ser realizadas de acordo com as condies conhecidas como GMLP (Good Microbiological Laboratory Practice), de forma a evitar a disseminao dos microrganismos, proteger os operadores da possibilidade de infeco e o experimento prtico de contaminaes com microrganismos do exterior. Uma das atividades mais importantes para manter a rea fsica em condies adequadas a limpeza geral do laboratrio, com cuidado especial para as superfcies e com o lixo produzido. Voc que est iniciando seus estudos em Microbiologia deve ler, atentamente, as normas abaixo, tantas vezes quanto necessrio, para segui-las rigorosamente: 1. Todo trabalho no laboratrio de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de EPI: avental de mangas longas, com elstico nas mangas, fechado; culos; touca; mscara facial; luvas; sapatos fechados. 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir culos) e maquiagem. 3

3. No fumar, no comer, no beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele. 4. No deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, etc. na bancada de trabalho eles devem ser colocados em locais onde no haja risco de contaminao. 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen, que dever estar acesa durante a maior parte do tempo. 6. Desinfetar a bancada no comeo e no fim do trabalho com soluo de lcool 70% ou outra similar (verifique se o bico de Bunsen est aceso). 7. Ler atentamente o protocolo da aula prtica e no iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo. 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, mo, todo o material necessrio no pegar mais material que o necessrio nem material indevido. 9. Todo o material deve ser devidamente identificado. 10. Utilizar corretamente as tcnicas de manuseio de culturas microbianas. 11. No falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminao das mesmas. 12. Relatar imediatamente, ao professor ou tcnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto. 13. Colocar materiais contaminados recipientes prprios, existentes nos

laboratrios. NUNCA deix-los nas bancadas ou pias. 14. Deixar as Placas de Petri tampadas sobre a bancada. 15. Deixar as lminas fornecidas para visualizao sobre as bancadas. 16. Deixar os tubos com culturas nas estantes. 17. Depois de usar o microscpio, desligar a luz e limpar a objetiva com leno de papel fino para retirar o leo de imerso. 18. Quando terminar de trabalhar com culturas, esterilizar alas e fios de platina; retirar as luvas e descart-las em lixo infectante, lavar as mos em gua corrente e depois com lcool 70% ou similar; deixar secar ao ar. 19. O lixo dever ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminao antes de ser descartado ou reutilizado. 20. Retirar todo o EPI quando sair do laboratrio.

As tcnicas especiais de manuseio seguro sero explicadas e demonstradas pelo professor no momento apropriado, mas convm lembrar que necessrio um cuidado especial para manipular e/ou transportar materiais contendo microrganismos (em caixas ou bandejas, mantendo o material em p para evitar derramamento ou vazamento acidental). Lembre que voc poder manusear alguns microrganismos potencialmente patognicos.

PREPARO DE MATERIAIS UTILIZADOS EM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

1. Preparo de vidrarias 1.1 Tubos, bales, erlenmeyers e outros Os tubos de ensaio devem ser tamponados com algodo hidrfobo; alternativamente podem ser tampados com roscas que devem resistir autoclavao. Os frascos maiores devem ser tamponados com um tampo mais firme, constitudo de algodo hidrfobo, gaze e papel alumnio.

1.2 Pipetas As pipetas devem ser providas de algodo na extremidade destinada aspirao. Podem ser acondicionadas uma a uma, embrulhadas em papel ou em recipientes metlicos adequados, que comportam vrias pipetas, no caso de laboratrios com uma rotina mais intensa. O volume deve ser anotado no papel quando embaladas individualmente ou no recipiente.

1.3 Placas de Petri Existem no comrcio placas plsticas esterilizadas e descartveis. Entretanto, podem ser utilizadas placas de vidro, que devem ser lavadas e em seguida esterilizadas embrulhadas em papel, a fim de se manterem estreis durante o armazenamento. Se as placas forem utilizadas imediatamente, no h necessidade de embrulhar. 2. Esterilizao No caso de tubos e bales contendo meios de cultura, a esterilizao deve ser feita em autoclave, sob presso (115-120C durante 20-30 minutos ou condies equivalentes; o tempo tambm depende da quantidade e disposio dos frascos dentro da autoclave). O material deve ser coberto com papel impermevel (alumnio, por exemplo) para evitar o umedecimento dos tampes. Componentes termolbeis de meios de cultura (alguns acares, antibiticos, uria, etc.) so esterilizados separadamente, por filtrao e depois adicionados ao meio-base, este esterilizado em autoclave. A vidraria seca pode ser esterilizada em forno de Pasteur, a 170-180C durante 1,5 horas ou 160C por 2 horas (o tempo deve ser contado aps a temperatura ser alcanada). No caso de tubos vazios com rosca, que no suportam altas temperaturas em calor seco, podem ser autoclavados com a tampa semi-rosqueada (para o vapor de gua penetrar dentro do tubo) ou envolvidos em papel grau cirrgico e depois secos em estufa. 5

Em qualquer caso, deve-se, periodicamente, validar o processo de esterilizao. Para isso, existem indicadores, como, por exemplo, tiras de papel impregnadas com esporos bacterianos, que devem ser submetidas ao processo de esterilizao e depois cultivadas para verificar se os esporos foram eliminados.

PROCEDIMENTOS ASSPTICOS
Vrias precaues devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratrio de Microbiologia para evitar a contaminao das pessoas, do ambiente e das culturas: Qualquer procedimento s deve se iniciar depois que todos os objetos necessrios estejam o mais prximo possvel do operador, e deve ser realizado o mais rapidamente possvel; Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possvel; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e no so admitidas correntes de ar; Todos os frascos abertos devem ter suas bocas flambadas imediatamente; ele deve ser mantido aberto ao redor do bico de Bunsen, na posio mais horizontal possvel e deve ter sua boca novamente flambada antes de ser fechado. Quando voc flamba o tubo, o calor cria uma corrente de conveco, que fora o ar para fora, impedindo a entrada de contaminantes; Os tampes de algodo ou roscas dos frascos no podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfcie; devem permanecer na mo do operador, entre o dedo mnimo e a palma da mo durante todo o procedimento; Durante as manipulaes, as superfcies internas estreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possvel; As partes estreis de alas ou pipetas que entraro em contato com as culturas ou com frascos estreis no podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfcies no estreis como, por exemplo, panos, superfcie da bancada, paredes externas de placas ou tubos, etc. 1. Flambagem de alas de platina Para transportar o material a ser semeado ou repicado utilizamos, na grande maioria das vezes, um fio de nquel-cromo com a ponta dobrada em ala, capaz de carregar lquidos, a ala de nquel-cromo. Ela deve ser devidamente flambada e esfriada antes de cada operao. Segurase a ala perto de sua parte superior, como se faz com um lpis (dedo polegar, indicador e mdio), num ngulo prximo posio vertical. Essa posio deixa o dedo mnimo livre para segurar os tampes dos tubos. Preferencialmente trabalhar com alas descartveis. Existem alas calibradas, que carregam um volume conhecido do material, podendo ser usadas em determinaes quantitativas. Algumas vezes usamos o fio de nquel-cromo sem dobrar a ponta, o estilete. Chamamos de flambagem o aquecimento gradual da ponta da ala, pois depois do uso em culturas, o aquecimento rpido pode produzir a liberao de pequenas gotculas e formao de aerossis. Deve-se proceder da seguinte maneira: 1) Posicionar a ponta da ala na regio azul claro da chama - essa a regio "fria" da chama; 7

2) Mover lentamente a ala para dentro da regio mais quente da chama, acima do cone azul claro, mantendo-a at que fique completamente vermelha; 3) Mover a ala para que toda a extenso seja aquecida adequadamente ("ao rubro"); 4) Esfriar a ala no ar, mantendo-a na mo, sem coloc-la em nenhum local (para que ela no se contamine outra vez); alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regies estreis); 5) Usar imediatamente; 6) Re-esterilizar a ala imediatamente aps o uso.

Observao: para que a ala carregue o lquido necessrio que o crculo exterior esteja bem fechado; se necessrio, use um alicate.

Figura 1: Tcnica de flambagem de alas.

2. Flambagem de tubos e frascos 1) Afrouxe o tampo do frasco ou tubo, para que ele saia facilmente; 2) Segure o tubo com a mo esquerda e retire o tampo com dedo mnimo da mo direita, mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mo (para retirar o tampo, rode o frasco e no o tampo - o tampo fica fixo); 3) Passe a boca do tubo para frente e para trs, dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso, no se esquea, o tampo fica preso na mo do operador; 4) Depois de usar, antes de fechar, repita a operao acima; 5) Feche o tubo, recolocando o tampo, rodando o tubo e no o tampo. 8

Figura 2: Tcnica de flambagem de tubos e frascos.

3. Manuseio de pipetas 1) As pipetas calibradas ou de Pasteur, com algodo na ponta, previamente esterilizadas, acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen; 2) Segur-las pela regio do bocal, como um lpis, colocando o aspirador e mantendo o dedo mnimo livre para abrir o frasco que contem o lquido a ser transferido; 3) No encostar a ponta da pipeta em regies no estreis dos tubos; 4) A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante, imediatamente aps o uso, para ser transportada. 4. Cadeia assptica Uso Descontaminao (121C/15) Lavagem

Esterilizao

Acondicionamento

Secagem

PREPARAO DE LMINAS
1. Preparao de lminas fixadas 1.1 Esfregaos de culturas a partir de meio lquido 1) Identificar a lmina com lpis dermatogrfico; 2) Acender o bico de Bunsen e se posicionar bem frente dele; 3) Segurar a ala de nquel-cromo entre o polegar e o indicador da mo direita, como um lpis, se voc for destro; 4) Flambar a ala ao rubro; 5) Segurar o tubo com a mo esquerda, retirar o tampo de algodo (ou outro qualquer) do tubo com a cultura, utilizando para isso o dedo mnimo (dedo do bacteriologista); rodar o frasco e no o tampo - o tampo fica fixo, alojado entre o dedo mnimo e a palma da mo direita; 6) Flambar a boca do tubo; 7) Esfriar a ala no ar, ao lado do bico de Bunsen ou nas paredes internas do tubo; 8) Introduzir a ala fria dentro do meio de cultura; 9) Tomar uma alada da cultura, flambar a boca do tubo novamente, recolocar o tampo e descansar o tubo fechado na estante (cuidado para no encostar na boca do tubo, que dever estar quente); 10) Depositar a alada sobre a lmina limpa; esfregar, espalhando bem o material de modo que ele ocupe uma grande rea da lmina. 11) Se necessrio, repetir a operao, para colocar mais aladas na lmina; 12) Deixar a lmina secar ao ar ou sobre a chama do bico de Bunsen, sem encostar nela (para evitar superaquecimento e formao de aerossis); 13) Quando toda gua tiver evaporado, fixar o material lmina, passando-a trs vezes na chama do bico de Bunsen (usar uma pina para segurar a lmina). Um aquecimento excessivo distorce a morfologia das bactrias.

Observao: se for uma cultura pouco turva, no convm espalhar muito, minimizando a probabilidade do nmero de microrganismos ficar menor do que o exigido pela sensibilidade do mtodo.

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Figura 3: Tcnica de esfregaos de culturas a partir de meio lquido.

1.2 Esfregaos de culturas a partir de meio slido 1) Identificar a lmina com lpis dermatogrfico; 2) Depositar uma alada de soluo fisiolgica ou gua destilada na lmina; 3) Acender o bico de Bunsen e se posicionar bem frente dele; 4) Segurar a ala de nquel-cromo entre o polegar e o indicador; 5) Flambar a ala ao rubro; 6) Com um movimento do punho da mo esquerda abrir a placa (a placa est sobre a mesa de trabalho, com a tampa apoiada), levantando a base (onde esto as bactrias, sobre o meio de cultura) at uma altura adequada; deixar aberta o menor tempo possvel; 7) Esfriar a ala na parte interna da tampa da placa de cultura; 8) Tomar uma pequena amostra do crescimento bacteriano, tocando a poro superior de uma colnia, levemente, com a ala estril, de modo a no arrastar o meio de cultura para fazer lminas finas; 9) Tampar novamente a placa (toda esta operao feita ao redor da chama do bico de Bunsen);

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10) Se a cultura estiver em tubo, desenroscar a tampa do tubo ou retirar o tampo de algodo do tubo com a cultura, utilizando para isso o dedo mnimo (dedo do bacteriologista); a tampa ou o tampo ficam alojados entre o dedo mnimo e a palma da mo; resfriar a ala nas paredes do tubo; introduzir a ala estril no tubo e tomar uma pequena amostra do crescimento bacteriano, tocando levemente o crescimento bacteriano, de modo a no arrastar o meio de cultura; flambar a boca do tubo novamente, recolocar o tampo e descansar o tubo fechado na estante; 11) Emulsionar o material na gua, espalhando muito bem, usando toda a superfcie da lmina, de modo a fazer um esfregao fino; 12) Flambar a ala antes de deposit-la sobre a bancada; 13) Deixar a lmina secar ao ar ou sobre a chama do bico de Bunsen, sem encostar na chama, para evitar a formao de aerossis; 14) Fixar o material lmina seca, passando-a trs vezes na chama do bico de Bunsen. O excesso de aquecimento pode distorcer a morfologia das bactrias Observaes: importante fazer lminas finas, para que se tenha uma boa visualizao. No preparo de lminas de material biolgico de consistncia slida, por exemplo, material interdental, utilizar algumas aladas de gua de torneira para obter um esfregao homogneo. Quando so preparadas lminas para algumas coloraes especiais, a fixao no pode ser feita pelo calor. 2. Manuseio do microscpio 1) Manuseie o microscpio com cuidado; 2) Limpe as lentes com leno de papel - o papel toalha no deve ser usado, pois pode riscar as lentes; 3) Acenda a luz; 4) Ajuste a distncia interocular - isso muito importante, pois se ela no estiver correta voc ver uma imagem dupla; 5) Coloque a lmina; em geral, o seu centro deve ficar no meio do foco luminoso; 6) Coloque 01 gota de leo de imerso; 7) Ajuste a iluminao. A observao com objetiva de imerso feita com muita luz, o que conseguido com o diafragma totalmente aberto e o condensador o mais alto possvel; 8) No caso de observao de bactrias, o ajuste do foco feito, na maioria das vezes, diretamente com a objetiva de Imerso. Nesse caso, coloque a objetiva de imerso dentro do leo, encostando-a cuidadosamente na lmina; rode o parafuso macromtrico vagarosamente, at que passe o foco; em seguida, volte com o parafuso micromtrico at o ajuste fino do foco. Se a objetiva sair do leo, volte tudo e recomece; 12

9) Alternativamente, voc poder encontrar o foco em aumentos menores e, s depois, colocar o leo e encaixar a objetiva de imerso; 10) Desa um pouco o condensador, para aumentar o contraste; 11) Ao final dos trabalhos, tire todo o leo da objetiva com um leno de papel.

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COLORAO DE GRAM
Em 1884, o dinamarqus Christian Gram desenvolveu um mtodo de colorao que, at hoje, fundamental na Bacteriologia. No mtodo desenvolvido por Gram, o esfregao bacteriano tratado pelas seguintes solues, na ordem: 1 violeta de genciana (ou cristal violeta); 2 lugol (ou soluo de iodo-iodetada); 3 lcool ou lcool-acetona (agente descorante); 4 fucsina ou safranina (corante de contraste); A importncia do mtodo de Gram reside no fato dele ser um mtodo diferencial, o que permite distinguir as bactrias em dois grupos: - GRAM-POSITIVAS, que retm o complexo violeta de genciana - lugol e aparecem coradas em azul (ou azul-arroxeado); - GRAM-NEGATIVAS, que so descoradas pela lavagem com lcool, e se coram posteriormente em vermelho, pelo corante de contraste. Tal diviso ocorre graas a colorao diferenciada que cada grupo apresenta de acordo com a composio qumica de sua parede celular. As Gram positivas retm o complexo cristal violeta - lugol na sua grande camada de peptideoglicanos, aparecendo assim coradas em azularroxeado. J as Gram negativas no retm o complexo mencionado por possuirem uma camada menor de peptideoglicanos, sendo assim descoradas pela lavagem com lcool. Com isso, elas posteriormente so coradas em vermelho pelo corante de contraste (fucsina). 1. Mtodo 1.1 Preparo do esfregao 1) Colocar uma gota de salina sobre uma lmina de vidro; 2) Espalhar sobre a lmina uma pequena quantidade da cultura bacteriana com o auxlio de uma ala de platina ou descartvel de forma a obter uma camada homognea e pouco densa; 3) Secar o material ao ar e fixar pelo calor (50C) ou com metanol absoluto durante 1 minuto. 1.2 Colorao 1) Cobrir toda a lmina com a soluo de cristal violeta; 2) Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia; 3) Cobrir a lmina com lugol; 4) Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia; 5) Inclinar a lmina e gotejar lcool etlico a 95% (ou lcool acetona); 6) Lavar a lmina rapidamente com gua corrente; 7) Cobrir com fucsina de Gram; 14

8) Aguardar 30 segundos; 9) Lavar a lmina e secar (sem esfregar). 2. Controle de qualidade - Gram positivos: Staphylococcus, Streptococcus e Enterococcus. - Gram negativos: Escherichia coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, entre outros. 3. Reagentes 3.1 Violeta de genciana - Violeta de genciana 10g; - cido fnico 20g; - lcool absoluto 100mL; - gua destilada 900mL. 3.2 lcool 95% Em gua destilada, ou lcool comercial. Obs: pode-se usar mistura lcool-acetona em vrias propores.

3.3 Lugol - Iodeto de potssio 2g; - Iodo 1g; - gua destilada 300mL. 3.4 Fucsina de gram (Para uso, diluir 1/10 em gua destilada) - Fucsina bsica 1g; - lcool 95% 10g; - cido fnico 5g; - gua destilada 100 mL.

3.5 Safranina - Safranina 1g; - lcool 1mL; - gua destilada 100mL. 4. Funes dos reagentes O calor funciona como agente fixador. O cido fnico (presente na soluo de violeta de genciana) o mordente (que facilita a penetrao do corante). 15

 O complexo violeta de genciana-lugol funciona como corante essencial e cora protoplasma bacteriano. O lcool o agente diferenciador e auxilia na retirada da camada lipdica em Gram negativas). A fucsina (ou a safranina) o corante de contraste e cora Gram negativa.

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COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN
Existem bactrias que, devido composio qumica de suas paredes, no se coram bem pelo mtodo de Gram, necessitando de condies mais drsticas para que o corante penetre em seu interior. O mtodo de Ziehl baseado no fato de que certas bactrias, como os bacilos da tuberculose e da lepra (micobactrias), quando tratadas pela fucsina fenicada a quente resistem ao descoramento subsequente por lcool acidificado. Assim sendo, permanecem coradas em vermelho, enquanto outras bactrias no resistem e tomam a colorao de contraste. Esta propriedade, chamada de lcool-cido-resistncia, est relacionada a existncia de certos lipdeos (em grande quantidade) na parede celular, os quais no permitem a extrao do corante pelo agente diferenciador. Este mtodo permite, portanto a classificao das bactrias em dois grupos: lcool-cido resistentes (resistem a descolorao e ficam vermelhas) e no lcool-cido resistentes (descoram e ficam azuis graas a posterior colorao com azul de metileno). 1. Mtodo 1.1 Preparo do esfregao 1) Colocar uma gota de salina sobre uma lmina de vidro; 2) Espalhar sobre a lmina uma pequena quantidade da cultura bacteriana com o auxlio de uma ala de platina ou descartvel de forma a obter uma camada homognea e pouco densa; 3) Secar o material ao ar e fixar pelo calor (50C) ou com metanol absoluto durante 1 minuto. 1.2 Colorao 1) Cobrir o esfregao com fucsina fenicada; 2) Aquecer em chama at produzir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de 5 minutos; 3) Lavar a lmina em gua corrente, suavemente; 4) Colocar lcool-cido clordrico 3% at que no se desprenda mais corante; 5) Lavar a lmina com gua; 6) Cobrir o esfregao com azul de metileno por 30 segundos; 7) Lavar a lmina com gua; 8) Deixar secar e observar ao microscpio com objetiva de imerso. 2. Controle de Qualidade - lcool-cido resistentes: micobactrias. - No lcool-cido resistentes: Escherichia coli.

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3. Reagentes 3.1 Fucsina de Ziehl - Fucsina bsica 1g; - lcool 95% 10mL; - cido fnico 5g; - gua destilada 100 mL. 3.2 lcool-cido - lcool 95% 990 mL; - cido clordrico concentrado 10 mL.

3.3 Azul de metileno - Azul de metileno 33,5 mL; - gua destilada 1000 mL.

4. Funes dos reagentes A fucsina fenicada o corante especfico para micobactrias. O calor funciona como agente fixador. A lavagem com lcool-cido clordrico 3% responsvel por descolorir todas as bactrias, exceto as micobatrias, pois o corante (fucsina fenicada) tem preferncia por sua grande camada lipdica. O corante azul de metileno responsvel por colorir as outras bactrias.

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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

1. Preparo, distribuio e armazenamento dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser preparados a partir da pesagem de cada um dos componentes separadamente (exemplo: peptona, glicose, cloreto de sdio, etc.); existem no comrcio os meios de cultura nos quais os nutrientes j esto previamente misturados na proporo adequada; em alguns casos se parte da matria prima bruta, por exemplo: carne, batata, etc. Aps a pesagem dos componentes (os fabricantes ou os manuais indicam a proporo adequada), o meio deve ser dissolvido em gua destilada, geralmente a quente (principalmente se forem meios slidos, pois o gar s se dissolve a quente). Devem, ento, ser esterilizados, na maioria das vezes em autoclave, sob presso (115-120 C, por 20-30 minutos ou equivalente), sendo que a maneira de acondicionar o meio vai depender de como ele vai ser utilizado (em placas ou em tubos). 1.1 Meios de cultura em tubos Os meios de cultura que vo ser utilizados em tubos, quer sejam slidos, semi-slidos ou lquidos so, aps a dissoluo dos componentes, distribudos diretamente nos tubos; so, a seguir, tamponados o e o conjunto vai ser esterilizado em autoclave, sob presso. Depois de autoclavados, os tubos contendo meios slidos so deixados esfriar em p ou inclinados, para que o meio solidifique na condio adequada ao uso que se destinam, em cada caso. 1.2 Meios de cultura em placas de Petri Os meios de cultura que vo ser usados em placas de Petri (sempre meios slidos) costumam ser preparados em grande quantidade (de acordo com o necessrio a ser usado em alguns dias - 15 a 20 mL por placa), em Erlenmayers ou similares; o meio autoclavado e, ainda lquido, vertido nas placas estreis, ao redor da chama do bico de Bunsen, preferencialmente dentro de uma capela de fluxo laminar, com todo o cuidado para evitar contaminaes: 1) Limpar e desinfetar muito bem a bancada, que deve estar completamente livre de objetos estranhos operao; 2) Segurar o frasco com a mo esquerda; remover o tampo com o dedo mnimo da mo direita e mant-lo at terminar a operao; se achar melhor, pode segurar o frasco com a mo direita e manter o tampo com a esquerda; 3) Flambar a boca do frasco; 4) Com a mo que estiver segurando o tampo, abrir ligeiramente a tampa da placa de Petri e verter vagarosamente (evitar bolhas) o meio de cultura estril at cobrir totalmente o fundo, 19

mas no encher muito, pois o gar no deve tocar a tampa da placa (o volume de meio varia entre 15 e 20 mL); fechar a placa; 5) Empurrar, cuidadosamente, a placa com meio de cultura, fechada, para o lado, trazendo uma placa vazia para perto do bico de Bunsen; 6) Flambar a boca do frasco e repetir a operao at a ltima placa ou o final do meio de cultura; 7) Esperar solidificar, antes de mexer nas placas; 8) Armazenar em posio invertida (a tampa da placa apoiada na superfcie).

1.3 Teste de esterilidade Os meios prontos devem ser incubados por 24h em estufa a 35C para confirmar sua esterilidade. 1.4 Armazenamento O armazenamento dos meios de cultura feito, geralmente, em geladeira. Entretanto, se o material for guardado por muito tempo nessas condies (mais do que 05 dias) ocorre evaporao da gua do meio de cultura e a superfcie seca, prejudica o crescimento dos microrganismos (principalmente os meios em placa). Por isso, prefere-se os tubos com rosca, ao invs dos fechados com tampes de algodo; tambm por isso, costuma-se manter as placas em sacos plsticos selados. Uma alternativa para o armazenamento prolongado dos meios de cultura em geladeira, autoclav-los em pores de 20 mL, em frascos com rolha de borracha e selo de alumnio (chamados "frascos de penicilina"). Dessa maneira, os meios podem permanecer por longos perodos, inclusive temperatura ambiente. Quando houver necessidade de uso, os meios lquidos so simplesmente distribudos em condies asspticas, para tubos previamente esterilizados em forno de Pasteur; os meios slidos so fundidos em banho-maria fervente e distribudos em tubos estreis ou vertidos diretamente em placas de Petri previamente esterilizadas (a quantidade contida num frasco a adequada para uma placa). Existem procedimentos especiais, no caso, por exemplo, de um dos componentes do meio de cultura no poder ser esterilizado por autoclavao, por no suportar altas temperaturas, decompondo-se. o caso da uria, que deve ser esterilizada por filtrao e depois misturada ao meio de cultura bsico, que contem os outros nutrientes e que foi preparado da maneira convencional; o caso tambm do sangue, que colhido do carneiro (ou de outro animal) em condies de assepsia e misturado a um meio-base, j estril, para o preparo do gar-sangue.

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2. Controle de qualidade Alm do teste de esterilidade, deve-se retirar algumas unidades de cada partida de meio de cultura e seme-las com bactrias de comportamento conhecido para verificar se o meio est funcionando adequadamente. 3. Meios de cultura Chama-se de meio de cultura a um conjunto de substratos ou nutrientes, nos quais os microrganismos so cultivados em laboratrio. D-se o nome de cultura a qualquer crescimento ou cultivo de microrganismos. Quanto ao estado fsico, os meios de cultura podem ser lquidos, slidos ou semi-slidos: Nos slidos, o agente endurecedor o gar-gar, polissacardeo extrado de algas marinhas, que utilizado em menores concentraes nos meios semi-slidos. Os meios lquidos permitem um crescimento mais abundante das bactrias, devido sua fluidez (culturas para enriquecimento), porm no permitem o isolamento (separao) das bactrias. Este s obtido em meio slido, em placas, utilizando tcnica adequada de semeadura (tcnica de obteno de colnias isoladas). Quanto composio, os meios de cultura podem ser ricos ou pobres: Os primeiros contm substncias orgnicas complexas (triptona, vitaminas, etc.) e devem ser utilizados para o cultivo de bactrias exigentes nutricionalmente, ou seja, com menor capacidade de sntese. Exemplo: gar-sangue, gar-chocolate, BHI (brainheart-infusion) etc. Os meios pobres so utilizados para microrganismos menos exigentes, com maior capacidade de sntese, como, por exemplo, as enterobactrias e os fungos. A maioria dos meios de cultura contm ingredientes cuja composio qumica no bem definida. Exemplo: peptona (protena de carne ou de soja parcialmente digerida); triptona (maior grau de digesto); extrato de levedura, etc, so os meios complexos. Entretanto, existem meios cuja composio qumica definida, chamados de meios sintticos, que contm aminocidos, vitaminas, acares e sais purificados e em quantidades conhecidas. A maioria dos meios sintticos muito cara e sua utilizao restrita a ensaios de doseamento de aminocidos e vitaminas atravs do crescimento de bactrias. Existem meios de cultura seletivos, que so utilizados quando se privilegia cultivar um determinado grupo de microrganismos, a partir de um material contaminado com vrios. A seletividade obtida pela adio de substncias que inibem o crescimento dos microrganismos no desejados.

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Exemplos: EMB = eosine - methylene - blue - os corantes inibem o crescimento de bactrias que no as enterobactrias, pseudomonas e outros bacilos aparentados com estas ltimas. Mac Conkey = contm corantes e sais biliares e tem utilizao similar ao EMB. Thayer-Martin = gar-chocolate adicionado de vancomicina, colistina e nistatina, utilizado para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae a partir de secrees vaginais ou uretrais. gar-batata-dextrose = meio pobre que utilizado acidificado (pH < 3,5) para o crescimento exclusivo de bolores e leveduras. Existem meios que so diferenciais, ou seja, permitem distinguir uma determinada caracterstica dos microrganismos. Exemplo: os meios EMB e Mac Conkey, alm de serem seletivos, so diferenciais, permitindo distinguir as bactrias lac+ (fermentadoras de lactose) das lac- (no fermentam lactose), que apresentam colnias com cores diferentes. H ainda os meios para provas bioqumicas, cuja composio permite testar alguma caracterstica metablica da bactria. Esses meios so utilizados na identificao de bactrias. Convm ressaltar que, dependendo do microrganismo que visamos cultivar, devemos escolher adequadamente os meios de cultura, bem como as condies de cultivo, no que diz respeito temperatura, tempo e atmosfera de incubao.

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TCNICAS DE SEMEADURA
Dependendo do objetivo do nosso trabalho, utilizamos diferentes procedimentos para a semeadura ou inoculao de nosso material no meio de cultura. Podemos semear diferentes materiais: urina, fezes, sangue, pus, etc. nos laboratrios clnicos; gua, medicamentos, alimentos, etc., nos laboratrios de controle de qualidade microbiolgica nas indstrias e laboratrios de Sade Pblica. Os mesmos procedimentos so usados para transferir um microrganismo de uma cultura para um novo meio de cultura; esta operao costuma ser chamada de repique (o verbo repicar). Para transportar o material a ser semeado ou repicado, utilizamos: - ala de nquel-cromo: deve ser devidamente flambada e esfriada (na parte interna do tubo ou frasco, ou na parte interna da tampa da placa). Existem alas calibradas, que carregam um volume conhecido do material, podendo ser usadas em determinaes quantitativas. Segurase a ala como se faz com um lpis (dedo polegar, indicador e mdio). - pipetas esterilizadas: utilizadas para determinaes quantitativas (contagens de microrganismos). Essas operaes devem ser feitas em ambiente de esterilidade, o qual pode ser obtido com um bico de Bunsen com a chama alta, ao redor da qual existe uma esfera livre de microrganismos, ou em cmaras de fluxo laminar, preferencialmente. Existem procedimentos bsicos que visam: Evitar contaminao das culturas com microrganismos do ambiente; Evitar contaminao cruzada entre culturas; Evitar contaminao do operador; Evitar que o operador contamine as culturas.

1. Manuseio de tubos Quando se manuseia um tubo ou outro frasco similar num laboratrio de microbiologia, ele sempre tem algum tipo de tampo. Este deve ser removido (se for pequeno, com o dedo mnimo) e a boca do tubo deve ser flambada na ocasio da abertura (operao que faz com que microrganismos do ambiente, que porventura cheguem, morram) e na operao de fechamento (podemos esbarrar a ala contaminada na boca, contaminando-a, o que traz risco de contaminao do tampo e conseqentemente do operador). Observaes: Durante todo o procedimento, o tampo deve permanecer no dedo mnimo, no na bancada. 23

Segurar o tubo somente quando estritamente necessrio. Utilize a estante para apoio, seno, s vezes, vai faltar mo. 2. Manuseio de placas de Petri Quando se est utilizando ala de nquel-cromo, posicionamos a placa com a tampa apoiada na bancada, de modo que possamos abri-la, examin-la e fech-la com apenas uma das mos (a outra est segurando a ala). Esse procedimento permite que a placa fique aberta o menor tempo possvel, minimizando o risco de contaminao por microrganismos do ambiente. De preferncia, manusear a placa em posio inclinada, na direo da chama e no na horizontal. Quando utilizamos pipetas para a semeadura de materiais lquidos, temos que utilizar a placa na posio normal na bancada, para que o lquido no escorra. Tambm se utiliza essa posio em alguns procedimentos com fungos. Aps as placas serem semeadas, elas devem ser colocadas na estufa, para o crescimento dos microrganismos, em posio invertida, ou seja, a tampa apoiada. Se fizermos o contrrio, parte da gua do meio de cultura que sofre vaporizao condensa na tampa, e cai sobre a cultura, prejudicando a tcnica de semeadura utilizada. 3. Tcnicas de obteno de colnias isoladas (mtodo de esgotamento) O isolamento de colnias necessrio para separar os diferentes tipos bacterianos existentes num material; freqentemente, cada bactria vai apresentar um aspecto diferente de colnia no que diz respeito a tamanho, cor, brilho, bordas (regulares ou irregulares). Tal procedimento permite que se estude separadamente cada bactria, verificando sua forma, propriedade tintorial, caractersticas bioqumicas e antignicas, permitindo sua identificao. O mesmo procedimento utilizado para isolar bactrias de culturas mistas. Para que se obtenha um bom isolamento, utilizam-se placas comuns (cerca de 10 cm de dimetro) contendo meio de cultura apropriado. Placas pequenas no devem ser utilizadas, por no apresentarem a superfcie necessria.

3.1 Procedimento a) Tomar uma alada do material e fazer estrias, bem prximas umas das outras, at a metade da placa; flambar e esfriar a ala; b) A partir de a), fazer outras estrias, ocupando da superfcie da placa, em direo perpendicular; flambar e esfriar a ala; c) Repetir a operao, a partir de b); d) Incubar as placas em temperatura, atmosfera e por tempo adequado; e) Observar os tipos de colnias obtidos. Observao: eventualmente pode ser utilizado um nmero maior de operaes.

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Figura 4: Mtodo de esgotamento.

4. Semeadura com ala de Drigalski A ala de Drigalski original era um basto de vidro retorcido (de modo a formar um tringulo na sua extremidade), mas pode-se utilizar um fio grosso de nquel-cromo. utilizada na tcnica clssica de contagem de bactrias, realizadas nos laboratrio clnicos e de controle de qualidade de alimentos, medicamentos e cosmticos. A semeadura com essa ala visa uma homogeneizao do inculo sobre a superfcie do meio de cultura.

4.1 Procedimento 1) Com a placa em posio normal (tampa para cima), pipetar 0,1 ml do material a ser semeado; 2) Flambar a ala, esfriar na parte interna da tampa, e espalhar o inculo por toda a superfcie da placa (manuseando a ala em todas direes); 3) Incubar as placas na posio invertida (tampa para baixo), nas condies de tempo, temperatura e atmosfera adequadas; 4) Proceder a leitura (contagem de colnias). 5. Semeadura com swab uma tcnica utilizada para se obter uma semeadura homognea do inculo nos antibiogramas. 5.1 Procedimento 1) Molhar o swab na suspenso bacteriana; 2) Pressionar o swab contra a parede do tubo, para retirar o excesso de lquido; 3) Fazer estrias bem prximas, umas das outras, por toda a superfcie da placa, em 3 direes. 25

TCNICA DE CONTAGEM DE BACTRIAS PELO MTODO DAS DILUIES EM PLACA

1. Procedimento 1) A partir de suspenso bacteriana de E. coli a ser contada, realizar as diluies sucessivas, de 10-1 at 10-5, da seguinte maneira: transferir 1 mL da suspenso original para o tubo contendo 9 mL de salina estril. Homogeneizar. Esta a diluio 10-1. A partir deste tubo repetir o procedimento para obter os tubos com as diluies 10-2, 10-3, e assim sucessivamente at 10-5. 2) A partir de cada diluio, proceder inoculao de 0,1 mL em cada placa contendo meio de Agar simples. 3) Espalhar o inculo com o auxlio de uma ala de Drigalsky. 4) Incubar as placas a 37C durante 24h.

Posteriormente, selecione uma das placas incubadas e conte o nmero de colnias. Para efeito de clculo, considerar as placas que tenham entre 25 e 250 colnias. Essa escolha feita para se obter um resultado o mais seguro possvel: a contagem em placas com muitas colnias no confivel, pois as colnias, muitas vezes, esto juntas. Em placas com contagem baixa, verificou-se que a flutuao estatstica muito grande, s vezes, da ordem de 10 vezes na mesma diluio.

Calcule a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte frmula: UFC = (n de colnias) x 10** x (diluio utilizada para contagem)

UFC significa Unidade Formadora de Colnia, uma vez que a contagem feita referente s colnias e no s clulas presentes. 10** um fator de correo.

Exemplo: Caso contadas 105 colnias em uma placa onde foi feita diluio de 10-2, o clculo final ser: UFC = 105 x 10 x 10-2 = 1,05 x 105 UFC/mL

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TESTE DE HEMLISE EM GAR-SANGUE

As bactrias podem ser diferenciadas e assim classificadas atravs da macro-morfologia de suas colnias. Uma dessas caractersticas fenotpicas a hemlise em gar-sangue. A hemlise pode ser classificada em trs tipos: - Beta-hemlise: lise total dos eritrcitos - presena de halo transparente ao redor das colnias semeadas; - Alfa hemlise: lise parcial dos eritrcitos - presena de halo esverdeado ao redor das colnias semeadas; - Gama hemlise: sem hemlise - ausncia de halo ao redor das colnias (eritrcitos permanecem ntegros).

1. Mtodo 1.1 Preparo do meio 1) Pesar e hidratar o meio base conforme instrues do fabricante. Podem ser utilizados como meio base: trptico de soja gar (TSA), Columbia gar, BHI gar, Mueller Hinton gar; 2) Esterilizar em autoclave; 3) Esfriar a base +/- 50C; 4) Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de carneiro ou coelho para cada 100 mL de base; 5) Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas; 6) Distribuir em placas de Petri. Observao: o pH deve se manter em torno de 7.

1.2 Inoculao 1) Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura por esgotamento; 2) No final da semeadura, picar o meio com a ala introduzindo-a verticalmente ao gar para verificar hemlise em profundidade; 3) Incubar 36C (+ ou - 1C) por 24 horas. 2. Controle de qualidade - Hemlise beta: Streptococcus pyogenes ou Staphylococcus aureus; - Hemlise alfa: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae; - Hemlise gama: Enterococcus faecalis ou Staphylococcus epidermidis. 3. Recomendaes No adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemcias rompem-se, dificultando o estudo de hemlise. 27

Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante. Sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de se trabalhar com cepas misturadas.

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TESTE DE MOTILIDADE
As bactrias mveis podem conter um ou mais flagelos, sendo assim classificados em: - Monotrquias: nico flagelo em uma das extremidades; - Lofotrquias: tufo de flagelos em uma ou ambas as extremidades; - Anfitrquias: nico flagelo em cada extremidade; - Peritrquias: cercada de flagelos.

O movimento pode ento ser classificado em: - Positivo e polar: as bactrias apresentam movimento em flecha; - Positivo e peritrquio: as bactrias apresentam movimentos circulares; - Negativo: apenas movimento browniano.

1. Mtodo 1) Tocar uma colnia isolada com agulha bacteriolgica ou ala estreis; 2) Inocular a bactria at dissolv-la na parede do tubo contendo o meio lquido; 3) Incubar por duas horas a 35C; 4) Adicionar uma gota da suspenso com pipeta Pasteur em lmina e cobrir com lamnula; 5) Examinar ao microscpio com aumento de 400X.

2. Controle de qualidade - Pseudomonas aeruginosa apresenta movimento positivo e polar, enquanto Klebsiella sp apresenta movimento negativo.

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TESTE DA CATALASE
O desdobramento do perxido de hidrognio em oxignio e gua mediado pela enzima catalase. Quando uma pequena quantidade de um microrganismo que produz a catalase introduzido em perxido de hidrognio, rapidamente bolhas de oxignio, o produto gasoso da atividade da enzima, so produzidas. 1. Mtodo 1) Com auxlio de uma ala ou vara de madeira estreis, transferir uma pequena quantidade do crescimento bacteriano puro para superfcie de uma lmina de vidro limpa e seca. 2) Colocar uma gota de gua oxigenada a 3% em uma poro da colnia na lmina. 3) Observar a formao das bolhas de gs, indicando um teste positivo. 2. Controle de qualidade Os estafilococos e os estreptococos so respectivamente controles positivo e negativo.

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TESTE DO TIOGLICOLATO
As bactrias podem ser classificadas de acordo com sua necessidade ou no de oxignio para crescerem em: - Aerbias estritas: crescem somente na presena do oxignio; - Anaerbias estritas: crescem somente na ausncia do oxignio (o gs letal a essas bactrias); - Anaerbias facultativas: o oxignio no essencial para o seu crescimento, porm crescem melhor na presena do mesmo; - Microaerfilas: necessitam do oxignio para crescerem, porm em nveis menores; - Anaerbias aerotolerantes: oxignio no letal, porm crescem melhor na ausncia do mesmo. Para o teste, os tubos de tioglicolato apresentam um indicador de oxignio, a rezazurina, presente somente na regio superior do meio (+/- 2 cm), a qual possui colorao rsea. Sendo assim, a partir da anlise da concentrao das bactrias nas diferentes regies do tubo possvel classific-las com sua necessidade ou no do oxignio para crescerem, como pode ser visualizado na figura abaixo:

1. Controle de qualidade - Aerbias estritas: bactrias do gnero Pseudomonas; -Anaerbias estritas: Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Porphiromonas gengivallis, Prevotella intermedia; - Anaerbias facultativas: Escherichia coli, espcies de Staphylococcus e Streptococcus e todas as bactrias da famlia Enterobacteriaceae; - Microaerfilas: bactrias do gnero Campylobacter; - Anaerbias aerotolerantes: Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophillus. 31

ANTIBIOGRAMA
Antibiogramas so bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactrias aos antimicrobianos. Estes testes so utilizados para avaliar in vitro a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergncia de bactrias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensvel, intermedirio ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (Minimun Inhibitory Concentration) ou MBC (Minimun Bactericidal Concentration). 1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Mtodo de diluio: consiste em preparar sucessivas diluies dos antibiticos em meio slido ou lquido e em seguida semear a bactria em estudo. Aps incubao determina-se MIC e/ou MBC. 2- Mtodo de difuso de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibitico so colocados na superfcie do gar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no gar e produz inibio do agente sensvel, formando um halo de inibio que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta tcnica, alguns fatores so essenciais: - Meio de Cultura: normalmente utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausncia de substncias antagnicas; - Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactrias, devendo-se realizar a colorao de Gram. A densidade do inculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padro de turbidez (Escala de Mac-Farland). Atravs desse mtodo possvel analisar pelo mtodo de difuso a resistncia de E. coli a alguns antibiticos. 1. Materiais - Swab estril; - cultura lquida fresca de Eschirichia coli; - placas de Petri, com meio Mueller-Hinton slido; - discos de papel com antibiticos; - pinas; - rgua. 2. Procedimento 1. Introduzir nas culturas um swab estril, retirar o excesso de lquido comprimindo a ponta do swab nas paredes do tubo; 2. Espalhar o contedo do swab sobre o meio de cultura slido distribudo numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Espalhar bem, de modo a obter um tapete de bactrias em toda a superfcie do meio slido; 3. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos); 32

4. Colocar os discos de papel contendo os antibiticos sobre a cultura seca (usar pinas); 5. Incubar em estufa a 37C, por 16 a 24 horas; 6. Medir os halos formados (em mm), registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo:
Bactria Oxacilina OX (1g/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padres R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 Carbemicilina CB (100g/mL) Discos com antibiticos Kanamicina K (30g/mL) Rifampicina RIF (30g/mL) Sulfonamida SUL (300g/mL) Estreptomicina EST (10g/mL)

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PROVA DO TUBO GERMINATIVO

Cepas de Candida albicans produzem tubos germinativos a partir de sua clula levedurifome quando adicionadas a um meio nutriente lquido e incubadas a 35C por 3 horas (similar ao estado in vivo). 1. Mtodo 1) Suspender um pequeno inculo das clulas levedurifomes de uma colnia isolada em 0,5 mL de soro; 2) Incubar entre 35 e 37C por no mais que 3 horas; 3) Aps a incubao, adicionar uma gota da suspenso com pipeta Pauster em lmina e cobrir com lamnula; 4) Examinar ao microscpio a presena dos tubos germinativos. Um tubo germinativo definido como um apndice que metade da largura e trs a quatro vezes o comprimento da clula de levedura da qual tem origem. Na maioria dos casos, no h nenhum ponto de constrio na origem do tubo nas clulas. 2. Controle de qualidade Candida albicans e Candida tropicalis so usadas como controle positivo e negativo respectivamente.

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MICROCULTIVO EM LMINA
1. Mtodo 1) Cortar um pequeno bloco de gar apropriado que tenha sido previamente vertido em uma placa a uma profundidade de cerca de 2 mm. O bloco deve ser cortado com uma lmina de bisturi estril. 2) Colocar uma lmina estril na superfcie de uma placa contendo soluo gar 2%. Como alternativa, colocar um pedao redondo de papel de filtro ou papel toalha na placa estril, adicionar duas zaragatoas, e posicionar a lmina de microscpio por cima. 3) Adicionar o bloco de gar na superfcie da lmina de microscpio esterilizada. 4) Com um ngulo direito da ala em L, inocular os quatro quadrantes do gar com o organismo. Aplicar uma lamnula estril sobre a superfcie do gar. 5) Se o filtro de papel utilizado, adicionar uma pequena quantidade de gua estril para o fundo do prato de cultura. Colocar a tampa da cultura e incubar a 30C. 6) Aps um perodo de incubao apropriado, remover a lamnula (trabalhando dentro de um gabinete de segurana biolgica) e fixar o organismo na lamnula com 1 a 2 gotas de lcool (esperar secar). 7) Colocar em uma lmina contendo uma gota de lactofenol azul algodo ou anilina. 8) Observar ao microscpio a forma caracterstica e o arranjo dos esporos.

Figura 6: Disposio da lmina.

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COLQUIOS DE AULAS PRTICAS

Roteiro n 1 1.1 Preparo de meios de cultura e vidrarias 1) Desinfeco do local de trabalho com lcool 70%; 2) Preparar o meio de cultura LB slido: - 10g de peptona casena; - 5g de extrato de levedura; - 10g de NaCl; - 15g de gar bacteriolgico; - H2O qsp 1000mL. (ajustar o volume para 15mL)

3) Acondicionar duas placas de Petri para autoclavao (seguir orientao do instrutor); 4) Demonstrao (em grupo de 10 alunos) da tcnica de esterilizao pelo calor mido sob presso (autoclavao) a partir do meio de cultura preparado e o material de acondcionamento; 5) Demonstrao da tcnica de esterilizao pelo calor seco (forno de Pasteur); 6) Treinamento individual da tcnica de flambagem de alas e agulhas de semeadura bacteriolgica, tubos de ensaio e bales de fundo chato (seguir orientao do instrutor).

2. Manipulao assptica 7) Manipulao de placas de Petri: treinar repetidas vezes a tcnica de abrir e fechar uma placa de Petri (100 x 15mm), utilizando-se apenas uma das mos, conforme demonstrao do instrutor. 8) Enumerar 5 tubos de ensaio (13 x 100mm) previamente esterilizados, com os nmeros de 1 a 5. Identificar com o nmero do grupo, turma e data. A partir de um tubo de ensaio (16 x 150mm) (Tubo A) contendo 10mL de caldo nutritivo previamente esterilizado transferir, assepticamente com o auxlio de uma pipeta de 5mL, volumes de 5mL, no tubo n 1, em seguida transferir 4mL do tubo n 1 para o tubo n 2 (com auxlio de uma pipeta de 5mL), repetir este procedimento segundo esquema 1. Incubar o material (tubos de n 1 a 5 e o tubo A) na estufa a 36C. Realizar a leitura aps 48-72 horas de incubao e registrar os resultados na tabela 1.

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Esquema 1: Diluies.

9) Distribuio assptica do meio LB gar em placas de Petri;

10) Desinfeco da bancada de trabalho com lcool a 70%.

Tabela 1: Aspecto dos tubos aps 48-72h horas.

Interpretao dos resultados ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________

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Roteiro n 2 1.1 Experimento 1: a) Fazer esfregao de colnias bacterianas, corar pelo mtodo de Gram, observar ao microscpio e discutir resultados com professor.

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b) Com auxlio de um swab, remover clulas da mucosa oral e fazer um esfregao, deixar secar e fixar. Em seguida corar pelo mtodo de Gram, observar ao microscpio e discutir resultados com professor. 1.2 Experimento 2: Voc recebeu uma lmina contendo dois esfregaos para colorao de Ziehl-Neelsen, aps a colorao observe ao microscpio e discuta com professor. obs: A classificao dever ser quanto resistncia ou no descolorao com lcool cido, sendo assim, teremos: Bactrias lcool cido resistentes (BAAR) = vermelhas e Bactrias no lcool cido resistentes = azul. 1.3 Experimento 3: Observe a placa de agar sangue e descreva as caractersticas fenotpicas de cada bactria. Notase alguma diferena? Se sim, qual?

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1.4 Experimento 4: As bactrias podem ser classificadas de acordo com sua necessidade ou no de oxignio para crescerem em: aerbias estritas, anaerbias facultativas, anaerbias aerotolerantes, anaerbias estritas e microaerfilas. Voc recebeu tubos de tioglicolato contendo cada um, um tipo de cultura bacteriana. O meio de cultura, no caso, possui um indicador de oxignio, a rezazurina que est presente somente na regio superior do meio ( 2 cm) e tem colorao rsea. Responda, com relao exigncia de O2 para seu metabolismo:

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Como possvel classificar as bactrias de cada tubo de acordo com a necessidade de oxignio? Por qu? 1.5 Experimento 5: Teste da catalase A catalase uma enzima produzida por certas bactrias e que desdobra o perxido de hidrognio em gua e oxignio livre (2 H2O2 2 H2O + O2). Voc recebeu uma placa contendo:

a) Staphylococcus b) Streptococcus Com auxilio de uma ala remova uma poro da colnia bacteriana e transfira para uma lmina de vidro. Em seguida, adicionar uma gota de H2O2 10 V sobre a bactria e observar o aparecimento de bolhas (indica reao positiva).

H2O2 + Bactria a

H2O2 + Bactria b

1. Descreva o que voc observou. 2. Qual a finalidade da prova da catalase? Obs.: Quando a colnia obtida de uma placa de gar-sangue, essencial que o meio de cultura no seja removido da superfcie, pois hemcias contm catalase.

1.6 Experimento 6: Motilidade As bactrias mveis podem conter um ou mais flagelos e so classificadas em: A - monotrquias (nico flagelo em uma das extremidades); B - lofotrquias (dois ou mais flagelos em uma das extremidades); C - anfitrquias (tufo de flagelos em cada extremidade); D - peritrquias (cercadas de flagelos).

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Para verificar esta caracterstica pode-se realizar experimento em meio lquido ou semi-slido. Procedimento em meio lquido: - tocar uma colnia isolada com agulha bacteriolgica estril ou ala - inocular a bactria at dissolv-la na parede do tubo contendo o meio lquido - incubar por duas horas a 35oC - montar gotas da suspenso bacteriana entre lmina e lamnula - observar em microscopia de campo claro, em aumento de 400X, com diafragma semi-fechado. Interpretao: (+) POLAR (monotrquia ou lofotrquia com flagelos em uma das extremidades) bactrias apresentam movimento de flecha. (+) PETRITRIQUIO bactrias apresentam movimentos circulares. (-) apenas movimento browniano.

Procedimento em meio semi-slido. - tocar uma colnia bacteriana com agulha bacteriolgica estril e inocular o tubo contendo o meio - incubar 24h a 35oC - realizar a leitura Interpretao: (+) quando h crescimento ao redor do local inoculado (-) crescimento bacteriano apenas no local inoculado Voc recebeu dois tubos, A e B com bactrias distintas, observe e responda: a) Qual bactria apresenta movimento? b) Por esta tcnica possvel classificar o tipo de movimento?

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Roteiro n 3 1.1 Experimento 1: Voc recebeu uma placa de gar sangue (AS) e uma de gar MacConkey (MC), devidamente identificadas. As bactrias, como qualquer clula viva, precisam de substncias e nutrientes para viver e se multiplicarem. Quando os nutrientes so obtidos de um meio artificial, este denominado MEIO DE CULTURA. a) Observar e descrever a caractersticas fenotpicas de cada bactria. b) Analisar as placas quanto presena ou ausncia de crescimento. c) Responda qual dos meios de cultura pode ser classificado como: Meio enriquecido, Meio seletivo, Meio diferencial. Por qu? d) Faa a colorao de Gram e identifique as bactrias quanto morfologia, arranjo e colorao.

a
AS

b
MC

1.2 Experimento 2: a) Observe os dois tubos A e B contendo meio lquido. possvel identificar em qual deles houve crescimento bacteriano? Por qu? b) possvel identificar se esta cultura bacteriana uma cultura pura? Por qu? c) Observe esta mesma cultura semeada em uma placa contendo meio de cultura slido. possvel responder a questo anterior? Por qu?

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1.3 Experimento 3: Voc recebeu um tubo com meio lquido contendo duas bactrias diferentes. Para obter colnias isoladas, voc dever: a) Semear as bactrias em meio gar LB (Luria-Bertani: triptona,extrato de levedura, NaCl e Agar bacteriolgico) pela tcnica de esgotamento de acordo com a figura abaixo:

1.4 Experimento 4 Anlise quantitativa de bactrias em uma contaminao 1) Passar o swab sobre diversos locais (cho, mo, banheiro, etc); 2) Mergulhar o swab em 10mL de caldo nutritivo estril (trabalhe prximo chama do bico de Bunsen); 3) Incubar por 30 minutos; 4) Retire o swab; 5) Faa a diluio seriada, retirando, com auxlio de uma pipeta esterilizada, 1mL da soluo 1 e transfira para o tubo contendo 9mL de soluo salina e assim por diante, como demonstrado no esquema 1. 6) Retire 0,1mL, utilizando uma pipeta esterilizada, da soluo com diluio de 10-1; 7) Espalhe por toda a superfcie da placa de gar, utilizando a ala de Drigalski (de vidro). 8) Repita os procedimentos para as diluies de 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5 no esquecendo de identificar as placas com as diluies correspondentes a cada uma. 9) Leve as placas para incubar.

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Esquema 1: Diluio seriada.

Anlise quantitativa dos resultados O objetivo desta anlise determinar o nmero de bactrias/mL, para isso: 1) Selecione uma das placas incubadas, que contenha entre 30 e 300 colnias; 2) Conte o nmero de colnias; 3) Calcule a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte frmula: UFC = (n de colnias) x 10** x (diluio utilizada para contagem)

UFC significa Unidade Formadora de Colnia, uma vez que a contagem feita referente s colnias e no s clulas presentes. 10** um fator de correo.

Exemplo: Caso contadas 105 colnias em uma placa onde foi feita diluio de 10-2, o clculo final ser: UFC = 105 x 10 x 10-2 = 1,05 x 105 UFC/mL

1.5 Experimento : Antibiograma

1. Imergir um swab estril na suspenso preparada, retirando o excesso do lquido na parede do tubo; 2. Realizar a semeadura padro at a metade da placa de Agar Mueller Hinton, girando-a em 6 direes, com o cuidado de que toda a superfcie do Agar seja semeada; 3. Deix-la secar por aproximadamente 10 minutos sobre a bancada; 4. Com o auxlio de uma pina esterilizada, selecionar os discos a serem utilizados, dispondo-os e pressionando-os, cuidadosamente, na placa de Agar Mueller Hinton; 5. Deixar a placa por 5 10 minutos sobre a bancada, antes de incub-la a 35C, durante 16-18 horas em aerobiose. 6. Anotar os discos de antibiticos testados; 7. Medir o tamanho dos halos de inibio com auxlio de uma rgua, anotando em milmetros; 8. Com ajuda de tabelas, interpretar os valores e resultados obtidos.

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Bactria Ampicilina AMP Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padres R 13 S17 R19 S 23 Carbenicilina CAR

Discos com antibiticos Gentamicina GEN Cefalotina CFL Ciprofloxacino CIP Estreptomicina EST

R 12 S 15

R 14 S 18

R 15 S 21

R11 S 15

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Roteiro n4 Estruturas fngicas Nosso primeiro grande objetivo ser diferenciar colnias leveduriformes e filamentosas. 1.1 Experimento 1 Observe e descreva as principais caractersticas macroscpicas das diversas colnias fngicas a serem analisadas: a) Colnias leveduriformes b) Colnias filamentosas

Observao das microestruturas fngicas 1.2 Tcnica de esgaramento: Utilizada como primeira (mais rpida) para identificao de colnias filamentosas. As estruturas fngicas so quebradas, tornando-se mais difcil a identificao. Tcnica: 1) Com a ala de platina em L, retirar um pedao da colnia de bolor crescida em gar. 2) Colocar 1 a 2 gotas de Lactofenol azul-algodo. Cobrir com lamnula, comprimindo levemente. 3) Observar em microscpio no aumento de 400X e desenhar e identificar as estruturas observadas. 1.3 Laminrio Observar as seguintes estruturas: a) esporngios e esporangiforo (Mucor ou Rhizopus); b) hifas cenocticas (Mucor ou Rhizopus); c) hifas hialinas septadas; d) hifas demceas; e) conidiforo; f) macrocondeos. 1.4 Microcultivo de leveduras Essa tcnica baseia-se no princpio de que leveduras, quando incubadas num meio com Tween-80 apresentam a capacidade de filamentar, formando pseudo-hifas e/ou hifas verdadeiras. Assim, pelas caractersticas morfolgicas diferenciadas das estruturas filamentosas, pode-se sugerir a espcie de levedura implicada na identificao. Observar a preparao, da forma como est, em microscpio com aumento de 400X.

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Objetivo: Verificar a presena de clamidocondeos de Candida albicans.

1.5 Prova do tubo germinativo Esta uma prova presuntiva para Candida albicans. O tubo germinativo formado dentro de 2 horas. O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por no ser septado, apresentar paredes paralelas e no possuir constrio na sua extremidade abaulada. Tcnica: 1) A partir de cultura de C.albicans semeadas previamente (24 48 horas), adicionar com auxlio da ala de platina uma colnia em um tubo contendo 0,5mL de soro. 2) Incubar a 37C durante 2 horas. 3) Adicionar uma gota da suspenso com pipeta Pasteur em lmina e cobrir com lamnula. 4) Examinar ao microscpio com aumento de 100X e 400X e desenhar as estruturas observadas.

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Roteiro n 5 Isolamento de microrganismos do ambiente Materiais - 5 placas de gar Nutriente (AN); - 1 placa de gar Sabouraud (AS); - tubos de ensaio contendo 5mL de salina (0,9%NaCl estril) sobre estante; - esptula de metal; - ponteiras amarelas estreis; - ala de Drigalwski; - bquer contendo lcool 70% para flambagem; - placas de Petri vazias e estreis; - pina; - ala de inoculao; - swab; - 5 recortes de papel alumnio; - 1 recipiente de pesagem (pode ser um pedao de papel alumnio); - fsforos. Equipamentos - vrtex; - micropipeta P200; - bico de Bunsen; - balana de preciso; - incubadora a 30C. Procedimentos 1. Isolamento de microrganismos de solo a) Colocar um recipiente de pesagem sobre a balana de preciso; b) Zerar a balana; c) Acender o bico de Bunsen; d) Flambar a esptula de pesagem, mergulhando-a no etanol 70%, tendo o cuidado de resfri-la antes de tocar o material e mant-la estril; e) Com a esptula estril, pesar 1g de solo; f) Transferir o material para tubo de ensaio contendo 5mL de salina tomando o cuidado de abrir o tubo prximo a chama, flambar a boca do mesmo antes e depois da transferncia do material; g) Agitar o tubo em vrtex por 2 minutos; h) Deixar a suspenso descansar por 1 hora para que o particulado precipite no fundo do tubo de ensaio; 47

i) Aps este perodo, transferir 100L para a placa NA; j) Flambar a ala de Drigawlski com etanol 70%; k) Resfriar a ala na tampa da placa ou no ar; l) Espalhar a alquota de 100L sobre a placa at que o lquido tenha secado completamente. m) Recolocar a tampa sobre a placa e incubar a 30C por 48 horas de forma invertida (tampa para baixo e gar para cima); n) Repetir o procedimento de inoculao por espalhamento (itens i ao m) na placa contendo AS.

2. Isolamento de microrganismos endofticos a) Lavar as folhas; b) Com um pina flambada, mergulhar as folhas que se encontram dentro do papel alumnio em etanol 70%; c) Colocar as folhas sobre a placa de Petri vazia que se encontra na bandeja, deixando a tampa ligeiramente aberta para que o etanol evapore; d) Com auxlio da pina rasgue um pedao da folha expondo a nervura central; e) Deposite um dos fragmentos da folha sobre uma placa contendo NA deixando um espao ao lado para colocar uma folha intacta.

Obs: importante que a superfcie da folha faa o mximo possvel de contato com o meio de cultura, principalmente a parte exposta da nervura central. 3. Isolamento de microrganismos da mucosa a) Remova o swab estril da embalagem tendo o cuidado de no tocar em nada para que no contamine; b) Esfregar a ponta do swab na mucosa oral e na superfcie do dente do colega; c) Inocular a placa NA por esgotamento com o mesmo swab; d) Recolocar a tampa sobre a placa e incubar a 30C por 48 horas de forma invertida (tampa para baixo e gar para cima). 4. Isolamento de microrganismos saprfitas de fruta a) Remover a ala de inoculao da embalagem tendo o cuidado de no tocar em nada para que no contamine; b) Raspar a casca da fruta com a ala e inocular por esgotamento na superfcie da placa contendo AN; c) Recolocar a tampa sobre a placa e incubar a 30C por 48 horas de forma invertida (tampa para baixo a gar para cima). 48