Agrobiotecnologa.

Curso 2011
Sistemas de transformacin vegetal
Sistemas de transferencia gentica en plantas Transparencias 3-6 Antes de elegir un sistema de transformacin vegetal, es importante establecer un protocolo de cultivo de tejidos y de regeneracin de las plantas. Este protocolo es parte integral de la mayora de las estrategias de transformacin y es generalmente el aspecto ms exigente de las mismas. La clave para integrar exitosamente las tcnicas de cultivo de tejidos dentro en una estrategia de transformacin es la obtencin de un sistema de regeneracin rpido y eficiente. No todos los protocolos de regeneracin son compatibles con todas las tcnicas de transformacin. Mientras una gran variedad de estrategias de regeneracin y transformacin son aplicables a muchos cultivos, se requieren protocolos muy particulares y especficos para la modificacin de determinadas especies. En trminos generales, algunos protocolos son claramente ms eficientes que otros. Por ejemplo, la regeneracin de embriones maduros a partir de embriones somticos es el mtodo ms adecuado para la regeneracin de especies monocotiledneas. Por lo tanto, establecer una buena estrategia de regeneracin y cultivo de tejidos es primordial antes de implementar una tcnica de transformacin. La transparencia 4 muestra un diagrama de flujo orientativo para establecer un protocolo de transformacin. Primero, hay que identificar el tejido o clulas de las que se puede regenerar una planta, establecer los agentes de seleccin apropiados, las hormonas requeridas, los medios de cultivos adecuados para desarrollar una regeneracin eficiente de plantas enteras y frtiles (recuadro superior de la transparencia 4). Una vez establecidos estos parmetros hay que realizar las construcciones genticas, y recin entonces determinar el sistema de ms apropiado para la introduccin del material gentico y establecer los principales parmetros del procedimiento correspondiente (recuadro inferior). La transformacin de plantas se refiere al evento de introducir e integrar ADN forneo en clulas vegetales y regenerar plantas transgnicas. La transparencia 6 enumera las diferentes tcnicas de transformacin de plantas que se han desarrollado con el objeto de hacer ms fcil y eficiente esta metodologa. Los sistemas de trasferencia pueden dividirse en dos grupos: Sistemas basados en vectores biolgicos: Transferencia mediada por Agrobacterium Transferencia basada en virus vegetales. Sistemas de transferencia directa de ADN, sistemas basados en transferencia fsica, surgidos como alternativa para transformar especies monocotiledneas que no son hospedantes naturales de Agrobacterium: Transferencia por bombardeo de partculas o biobalstica. Transferencia por cationes divalentes y/o electroporacin. Transferencia con whiskers de carburo de silicio. Transferencia por microinyeccin. Los mtodos de transformacin desarrollados permiten la expresin transitoria o la expresin estable del ADN introducido. La expresin transitoria ocurre durante un perodo corto de tiempo (pocos das) o hasta culminar el ciclo de vida de la planta,

pero no es heredable por la progenie. La expresin estable permite la integracin del ADN forneo al genoma vegetal y la consiguiente transmisin a las siguientes generaciones. Biologa de Agrobacterium tumefaciens Transparencias 7-19 Pese al desarrollo de otros mtodos para la transferencia de genes, el mtodo ms difundido es la transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens es una bacteria del suelo gram negativa que ataca a un amplio rango de plantas dicotiledneas. Muchas especies agronmicamente importantes han sido transformadas usando esta bacteria del suelo (micrografa de la transparencia 8) y la lista de especies susceptibles a la transformacin por Agrobacterium se incrementa continuamente. La fotografa del panel inferior de la transparencia 8 muestra un tumor tpico causado por A. tumefaciens, comnmente denominado agalla del tallo. El gnero Agrobacterium ataca a un amplio rango de huspedes, principalmente entre las especies dicotiledneas. Con baja eficiencia puede infectar tambin a varias especies monocotiledneas. La transformacin mediada por Agrobacterium puede lograrse utilizando explantos de tejido muy variados, los que deben seleccionarse de acuerdo con las caractersticas de la especie vegetal o de la variedad con la que se trabaje. En algunos casos (tabaco, papa), es posible utilizar tejidos muy diferentes con este fin. En otros casos, el explanto de eleccin es sumamente especfico. La tabla de la transparencia 5 presenta ejemplos de los explantos ms comnmente utilizados. El gnero Agrobacterium incluye varias especies patognicas que presentan un amplio rango de huspedes y de sintomatologas. La bacteria causa la formacin de tumores en la zona cercana al sitio de infeccin. El desarrollo de estos tumores se debe a que Agrobacterium ha desarrollado la capacidad de transferir parte de su propio material gentico a la planta hospedante. La transparencia 9 muestra el ciclo de la enfermedad de la agalla de corona causada por Agrobacterium tumefaciens. La formacin de tumores ocurre generalmente en el tallo de la planta, inmediatamente sobre el nivel del suelo. La formacin de estos tumores se debe a la transferencia de genes bacterianos que intervienen en la sntesis de fitohormonas. La bacteria transfiere tambin genes que participan de la sntesis de una serie de compuestos de conjugacin denominados opinas, los que son secretados al medio y utilizados como fuente de carbono y nitrgeno en forma exclusiva frente a otros microorganismos del suelo. Debido a que su sistema de patogenia se basa en redirigir genticamente el metabolismo de la planta para su propio beneficio, las distintas especies de Agrobacterium pueden considerarse colonizadores genticos. La transparencia 10 muestra los procesos celulares involucrados en las principales etapas de interaccin entre Agrobacterium tumefaciens y una planta susceptible. Estos procesos son: A: Reconocimiento clula-clula. La colonizacin por Agrobacterium requiere la existencia de heridas en las races de la planta. Agrobacterium se desplaza hacia el tejido herido siguiendo un gradiente de concentracin de seales qumicas establecido por exudados del tejido vegetal. B, C y D: Corresponden a tres etapas consecutivas que involucran el procesamiento del ADN, el empaquetamiento de la hebra T luego de su escisin, y el transporte del complejo T desde la clula bacteriana hacia la clula vegetal. La transparencia

muestra una microscopa electrnica (C) del complejo T maduro, compuesto por el ADN T de simple cadena y las protenas VirE y VirD. Este complejo es probablemente transportado a la clula husped a travs del pilus (sealado por flechas en D). E: Se muestra la importacin del complejo T maduro al interior del ncleo de la clula vegetal. La foto muestra acumulacin de protena VirD fusionada a GFP en el ncleo, la que se observa como fluorescencia verde. F: Luego de la integracin y expresin del ADN bacteriano al genoma vegetal se observa la formacin del tumor de agalla. El tejido indiferenciado prolifera desde el sitio de la herida y secreta distintas opinas que son catabolizadas especficamente por Agrobacterium. La porcin de material gentico transferido desde la bacteria que se integra al genoma de la planta corresponde a una regin de un plsmido residente en la bacteria denominado plsmido Ti (transparencia 11). La regin que es transferida recibe el nombre de ADN o hebra T (indicada en el esquema como regin T) y est flanqueada por dos repeticiones directas denominadas borde derecho (BD) e izquierdo (BI). Los plsmidos Ti tienen un tamao de entre 200 y 800 Kpb. La regin T corresponde a una secuencia de ADN de entre 10 y 30 Kpb y comprende tanto los oncogenes (genes responsables de la sntesis de auxinas y citoquininas) como los genes involucrados en la sntesis y el transporte de opinas. La regin de virulencia ( vir), comprende varios operones bacterianos que participan en la escisin de la hebra T y en la formacin del intermediario de transferencia (complejo T). La regin vir comprende unos 40 Kpb. Otros elementos importantes localizados en los plsmidos Ti son los orgenes de replicacin y de transferencia (oriT, implicado en el proceso de conjugacin bacteriana) y las regiones que contienen genes responsables del catabolismo de las opinas. Todos los plsmidos Ti tienen una estructura similar. Las especies de Agrobacterium sintetizan diferentes tipos de opinas y son referidas de acuerdo con ello. La transparencia 12 muestra las regiones de homologa entre los plsmidos Ti de dos cepas comunes de Agrobacterium, una de octopina (oct) y otra de nopalina (nop). Dichas regiones abarcan principalmente la regin T y la regin vir. Una caracterstica del plsmido Ti de octopina es que contiene tres regiones T cortas de 13, 1,5 y 7,8 Kpb, los cuales son transferidos independientemente unos de los otros, mientras que el de nopalina lleva un nico plsmido Ti de 22 Kpb. Existen muchas otras opinas, tales como manopina, agropina agrocitopina, etc. En los plsmidos representados en esta transparencia se muestran cuatro regiones de homologa que contienen respectivamente a los genes que codifican protenas involucradas en la sntesis de auxinas y citoquininas (regin A), el origen de replicacin (regin B), los genes que codifican protenas involucradas en el catabolismo de octopinas y nopalinas (regin C) y los genes de virulencia (regin D). La transparencia 13 muestra una representacin esquemtica de la regin T. La regin T est definida por dos repeticiones directas de 25 pb altamente homlogas. Tanto el borde derecho como izquierdo son importantes para el reconocimiento de las endonucleasas VirD1/VirD2 que estaran involucradas en la liberacin de la hebra T. Sin embargo, el proceso de escisin tendra caractersticas polares, como lo sugiere el hecho de que la protena VirD2 se une preferentemente al borde derecho (extremo 5 de la hebra T). Tambin se han identificado secuencias prximas al borde derecho que contribuiran a establecer la polaridad del proceso. En los plsmidos de octopina, una de estas secuencias (overdrive) incrementa el transporte del ADN T a la clula vegetal. La protena VirC se une a esta secuencia favoreciendo el clivaje del borde derecho por la endonucleasa VirD1/D2. El borde derecho es requerido en forma absoluta para la patogenicidad de Agrobacterium tumefaciens, mientras que el borde izquierdo es prescindible.

Entre los bordes izquierdo y derecho se encuentran los genes que codifican para la sntesis de auxinas, citoquininas y opinas. En condiciones de alta concentracin de auxinas y baja de citoquininas, el tejido vegetal se diferencia en races. Una situacin inversa corresponde el desarrollo de tallos. La sntesis no regulada de auxinas y citoquininas induce el crecimiento indiferenciado del tejido vegetal y conduce, en el caso de una sntesis elevada de los dos tipos de hormonas, a la formacin de tejido tumoral. Los oncogenes transferidos por Agrobacterium, si bien son controlados por promotores de tipo eucariota, no responden a los mecanismos de regulacin endgenos. Como consecuencia, la integracin del ADN T en el genoma de la planta, induce la desdiferenciacin del tejido y el desarrollo de un tumor de agalla. El esquema de la transparencia 14 indica tambin la ubicacin de la regin overdrive (enhancer de la sntesis de la hebra T). La colonizacin gentica por Agrobacterium requiere la presencia de dos regiones localizadas en el plsmido Ti: 1) el ADN de la regin T, cuya secuencia ser transferida al genoma de la planta y, 2) la regin de virulencia ( vir), compuesta por siete loci principales (virA, virB, virC, virD, virE, virG y virH), que codifican la mayor parte de la maquinaria proteica involucrada en la transferencia del ADN T. Adems de estas regiones, se requiere de un grupo de genes de virulencia localizado en el cromosoma de la bacteria (genes chv) que participan en los estadios tempranos de unin a las clulas de la planta. Las interacciones que tienen lugar durante la transformacin gentica mediada por Agrobacterium conforman un proceso que puede dividirse en ocho pasos distintivos, resumidos en la transparencia 15. 1) Agrobacterium reconoce y se une a la clula husped. Esta unin es mediada por protenas codificadas en el cromosoma de la bacteria y por receptores especficos de la clula husped; 2) El sistema de traduccin de seales de Agrobacterium reconoce seales qumicas especficas de la planta; 3) La protena virG media la transduccin de seales y la activacin transcripcional de los genes vir; 4) La formacin de la copia de ADN T y del complejo T inmaduro; 5) La formacin del complejo de transporte a travs de las membranas de la bacteria y de la pared celular, compuesto principalmente por las protenas de la familia VirB y la protena VirD4, lo que permite la exportacin de la hebra T y de las protenas VirD2 y VirE1 al citoplasma de la clula vegetal; 6) La formacin del complejo T maduro, formado por la hebra T y las protenas VirD2 y VirE2; 7). La importacin del complejo T al ncleo, proceso que es facilitado por protenas de la planta entre las que se ha identificado a AtKAPa y VIP1; 8) El transporte dentro del ncleo y la integracin del ADN T al genoma de la planta, mediado por VirD2/VirE2 y por factores nucleares. Se ha reportado que VirD2 es capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, protenas que actan como chaperonas y contribuira a mantener la conformacin de VirD2. Otra protena vegetal que se une a VirD2 es una fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida para la acumulacin de VirD2 en el ncleo. Finalmente, VirD2 tambin interacciona con AtKApa. Esta protena, participa en la importacin de protenas que contienen sitios NLS al ncleo. A diferencia de VirD2, VirE2 no se une a AtKapa, pero si lo hace a otras dos protenas VIP1 y VIP2. La protena VIP1 es capaz de importar la protena VirE1 al ncleo en un sistema de levaduras. A su vez, VIP2 no slo se une a VirE2, sino tambin VIP1 en ensayos de doble hbrido. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 pueden funcionar como un complejo multiproteico facilitando y participando el transporte hacia el ncleo de la protena VirE2 y contribuir as a la integracin del complejo T. Adems de AtKAPa y VIP1, se ha descripto que el complejo RAN, con actividad GTPasa, es requerido para la importacin al ncleo en otros sistemas, sugiriendo que tambin participara en la importacin del complejo T al ncleo. Los anlogos de GTP no hidrolizables bloquearan la importacin al ncleo de las protenas VirE2 y VirD2 por inhibicin de RAN.

El reconocimiento y la unin de las clulas de Agrobacterium a la clula vegetal es esencial para el proceso de infeccin. Luego de un primer paso de unin, la bacteria sintetiza filamentos de celulosa que permiten el anclaje de sta a la pared celular de la planta. Se han identificado varios genes cromosmicos ( ChvA, chvB, pscA, att) que participaran del proceso de unin a la pared de la clula vegetal. Sin embargo, este proceso est poco caracterizado y la funcionalidad de estos genes en el proceso de anclaje no ha sido completamente dilucidada. Agrobacterium ha desarrollado un sistema regulatorio de dos componentes para reconocer la presencia de clulas huspedes susceptibles, compuesto por una protena de membrana (VirA) y una protena citoplasmtica (VirG). Estas protenas actan como un par receptor/transductor frente a molculas provenientes de las heridas en la planta y promueven la transcripcin de los genes vir (transparencia 16). El inductor mejor estudiado es la acetosiringona, un compuesto fenlico. Algunos monosacridos, tales como glucosa y galactosa tambin contribuyen a la expresin de los genes vir. La sealizacin se inicia a travs de compuestos fenlicos secretados por la planta los que se unen a la protena VirA. Dos protenas codificadas por genes cromosmicos de Agrobacterium, p10 y p21, contribuyen en este reconocimiento. La primera se unira a los compuestos fenlicos y mediara directa o indirectamente la unin a VirA. En cambio, la induccin de los genes vir por azcares es mediada por otra protena de origen cromosmico (ChvE) que une glucosa/galactosa e interacta con VirA. VirA funciona como una proten quinasa y como fosfotransferasa. En el primer caso, ocurre una autofosforilacin en un residuo de histidina situado dentro de su regin C-terminal, la que tambin contiene el dominio quinasa. La protena VirA fosforilada se une a la protena VirG que es a su vez fosforilada en un residuo aspartato. La forma fosforilada de VirG es mucho ms estable y posiblemente permita maximizar los niveles de induccin de los restantes genes vir. La induccin de los genes vir ocurre cuando VirG fosforilado se une especficamente a los dominios vir, una secuencia conservada de 12 pb localizada en la regin promotora de los genes vir. Una vez inducidos los genes vir, se produce la escisin de la hebra T libre. Este evento se inicia en el borde derecho, contina en direccin 5-3, y termina en el borde izquierdo de la hebra antisentido. Un complejo de protenas denominadas VirD1/D2, que funcionan como endonucleasas especficas, se une a la forma supercoiled del plsmido Ti, relajan el plsmido, hace un corte entre la tercera y cuarta base de los bordes derecho e izquierdo en la hebra antisentido de la regin T y liberan dicha hebra. La reaccin de corte comprende la unin covalente de la protena VirD2 al extremo 5 del borde derecho. Luego, la maquinaria de sntesis de ADN repara la brecha entre los bordes derecho e izquierdo de la hebra antisentido. La protena VirD2 permanece unida al ADN-T durante todo el trayecto hasta la clula husped. Las protenas VirD2 y VirE2 (una protena de unin a ADN de simple cadena) junto con la hebra T constituyen el complejo T maduro. La unin de VirE2 ocurre antes de que la hebra T sea transportada a travs del canal de pasaje a travs de las membranas de la bacteria. Otra protena recientemente identificada, la protena VirE1, se une a VirE2, facilitando la unin de VirE2 al ADN, pero no interviene en la exportacin de la hebra T a la clula de la planta. Una vez formado el complejo T maduro, ste interacta con distintos complejos proteicos involucrados en su exportacin al citoplasma de la clula vegetal. El dispositivo de transporte del complejo T contiene alrededor de 12 protenas que forman dos componentes funcionales: un complejo secretorio que transporta sustratos a travs de la membrana celular y un pilus filamentoso. La transparencia 18 muestra un modelo que da cuenta de la estructura de estos complejos, elaborado sobre la base de evidencia indirecta. El complejo secretorio est compuesto por la protena codificada por el gen virD4 y por un conjunto de protenas codificado por el opern virB, el que contiene once marcos abiertos de lectura. El pilus est compuesto

mayoritariamente por la protena VirB2 y, en menor proporcin, por la protena VirB5. El pilus censara el contacto con la clula vegetal y traducira la informacin al complejo secretorio para iniciar la exportacin del complejo T. Se piensa que la protena VirB1 tiene actividad transglucosilasa e interviene en la degradacin de los peptidoglicanos bacterianos. Las protenas VirB3 y VirB4 promoveran el ensamblado del pilus. Adems de VirD4, VirB4 y VirB11 poseen tambin actividad ATPasa. Se asume que el transporte del complejo T implica la hidrlisis de ATP y que por lo tanto se trata de un proceso de transporte activo. La protena VirB6 participara en la formacin del poro del complejo secretorio de transporte. Se desconocen an las funciones de las protenas VirB7, 8, 9 y 10. Luego de pasar al citoplasma de la clula vegetal el complejo T es transportado al ncleo de la misma. A diferencia de los elementos genticos transponibles, el ADN-T no codifica protenas necesarias para su transporte e integracin. Por lo tanto, el ADNT no contiene secuencias especficas y cualquier fragmento de ADN insertado entre los bordes de la regin T ser transferido e integrado al genoma vegetal. Las protenas VirD2 y VirE2, que componen el complejo T, estn directamente implicadas en el proceso de importacin al ncleo vegetal. VirD2 contiene dos seales de localizacin nuclear (NLS) y VirE2 contiene una. VirD2 y VirE2 se uniran a protenas de la planta involucradas con la importacin e integracin del ADN-T. Se ha reportado que VirD2 es capaz de unirse a las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA, protenas que actan como chaperonas y contribuira a mantener la conformacin de VirD2. Otra protena vegetal que se une a VirD2 es la ya mencionada fosfatasa tipo 2C (PP2C) es requerida para la acumulacin de VirD2 en el ncleo. Finalmente, VirD2 tambin interacciona con AtKApa. Esta protena, de la familia de carioferinas, participa en la importacin de protenas que contienen sitios NLS al ncleo. A diferencia de VirD2, VirE2 no se une a AtKapa, pero si lo hace a otras dos protenas VIP1 y VIP2. La protena VIP1, como ya se dijo, es capaz de importar la protena VirE1 al ncleo en un sistema de levaduras, e interactuar con VIP2. Por lo tanto, VIP1, VIP2 y VirE2 conformaran un complejo de protenas que posibilita el transporte hacia el ncleo de VirE2 y contribuye as a la integracin del complejo T. Una vez en el ncleo, el complejo T participa de la integracin de la hebra T al genoma de la planta. Se asume que tanto las protenas VirD2 y VirE2 como otros factores nucleares proveen actividades que posibilitan este proceso. La transparencia 19 ilustra un posible modelo del mecanismo involucrado. La protena VirD2 tiene actividad ligasa in vitro, lo que sugiere que podra participar en la ligacin del extremo 5 del ADN T al ADN de la planta. A este paso seguira un paso de sntesis reparativa de la hebra complementaria en que intervendra la maquinaria nuclear de la planta. Sin embargo, otros estudios sugieren que la doble cadena se sintetizara previamente a la integracin al genoma vegetal. La protena VirD2 tiene en su extremo C-terminal motivos presentes en la familia de las recombinasas. La protena VirE2 se requerira para la integracin del extremo 3 del ADN T. Tambin se ha sugerido una participacin de la histona H2A en el proceso de integracin. En resumen, podemos dividir el proceso de transformacin mediada por Agrobacterium en cuatro tipos de interacciones diferentes: a) interacciones extracelulares, b) interacciones dentro de Agrobacterium, c) interacciones dentro de la clula vegetal, y d) interacciones en el ncleo de la clula vegetal (ver Anexo, transparencias 104-106). Interacciones extracelulares (transparencia 104): Las protenas bacterianas ChvA, ChvB, PscA y Att reconocen los receptores (protenas tipo vitronectina) de la pared celular de la clula vegetal, resultando en la unin de las agrobacterias a la clula husped. ChvE interacciona con azcares y transfiere la seal a VirA, o VirA

interacciona con compuestos fenlicos, en forma directa o va p10 y p21. Ambas vas de sealizacin resultan en la autofosforilacin de VirA. La transferencia del grupo fosfato de VirA a VirG transmite las seales de la planta a la clula bacteriana, donde VirG activa la expresin de los genes vir. Interacciones dentro de Agrobacterium (transparencia 105): Esta etapa comienza con la activacin de los genes vir. Las protenas VirB1, VirB3, VirB4, VirB6, VirB7, VirB8, VirB9, VirB10, VirB11 y VirD4 se ensamblan formando un complejo secretorio transmembrana, que junto con el pilus formado por VirB2/VirB5, funcionan como un canal que conecta la clula vegetal con la clula bacteriana. VirD1 y VirD2 forman un complejo de endonucleasas que con la ayuda de VirC1, cortan la cadena antisentido en los bordes del ADN T. Durante este proceso, VirD2 se une covalentemente al extremo 5 de la hebra T generando un complejo T inmaduro. Este complejo T puede madurar por dos mecanismos diferentes: a) el complejo T inmaduro y VirE2 unida a VirE1 se exportaran a travs del canal de manera separada. En la clula husped, VirE2 y VirE1 se desunen y VirE2 se une a la cadena T, formando el complejo T maduro (ADN T, VirD2 y VirE2); b) VirE2 se une al ADN T en el citoplasma bacteriano, y el complejo T maduro es luego exportado. Interacciones dentro de la clula vegetal (transparencia 106, panel superior): Dentro del citoplasma de la clula vegetal, VirD2 interacciona con las ciclofilinas RocA, Roc4 y CypA para mantener su conformacin, con la protena AtKAPa para importar el complejo T dentro del ncleo y, posiblemente, con PP2C para regular esta importacin. VirE2 interacciona con VIP1 para favorecer su importacin al ncleo. Las interacciones VirD2-AtKAPa y VirE2-VIP1 resultan en una eficiente importacin del complejo T al ncleo. Interacciones en el ncleo de la clula vegetal (transparencia 106, panel inferior): Una vez en el ncleo, VIP1 y VIP2 podran participar en el transporte intranuclear del complejo T, guindolo al sitio de integracin en el cromosoma de la planta. Finalmente, factores nucleares actan en forma concertada con VirD2 y VirE2 para integrar la cadena T en el ADN cromosmico, resultando en una transformacin gentica estable. Vectores basados en plsmidos Ti Transparencias 20-31 La capacidad natural de Agrobacterium de introducir ADN en el genoma nuclear de la planta permiti desarrollar vectores basados en las secuencias del plsmido Ti de Agrobacterium. Se constat que, si se remueven todos los genes comprendidos dentro de la regin T (oncogenes y genes de sntesis de opinas), no se afecta la transferencia e integracin del ADN T. Sobre esta base, se desarrollaron vectores de expresin que permiten clonar genes de inters dentro de la regin T. Existen dos tipos diferentes de vectores de transformacin. Las partes A y B de la transparencia 21 muestran los fundamentos de un vector de tipo cointegrativo. El gen de inters es introducido dentro de un plsmido Ti mediante un paso de recombinacin simple a partir del llamado vector intermediario (un plsmido comn de trabajo para Escherichia coli). En este plsmido Ti, las secuencias comprendidas entre los bordes de la regin T han sido reemplazadas por secuencias que permiten la cointegracin del vector intermediario. Este plsmido Ti conserva tambin todos los genes comprendidos en la regin v ir. La parte C de la transparencia ilustra un sistema basado en un vector binario. En ste, el gen de inters y los genes vir residen en dos replicones separados capaces de coexistir y replicarse autnomamente en Agrobacterium. El replicn que contiene el gen de inters (en general de tamao pequeo) se denomina vector binario. El

replicn que contiene los genes vir se denomina plsmido Ti desarmado (obsrvese que la regin T ha sido completamente eliminada de ste elemento). El desarrollo de vectores binarios y la disponibilidad de un amplio rango de cepas de Agrobacterium que contienen plsmidos Ti desarmados convirtieron a la transformacin basada en esta bacteria en un mtodo preferencial de transformacin vegetal. Inicialmente, el mtodo para introducir ADN forneo en un plsmido Ti cointegrado, como el que se muestra en la transparencia 22, requera introducir un replicn de tipo ColE1, como pBR322, dentro de la regin T del plsmido Ti. El ADN que se integrable en la regin T se clonaba en un derivado de pBR322 que portaba un gen de resistencia a un antibitico. Este plsmido se introduca en la cepa de Agrobacterium y la cepa se seleccionada por resistencia a dicho antibitico. Como el ColE1 no puede replicarse en Agrobacterium, el plsmido pBR322 deber cointegrarse al segmento pBR322 homlogo de la regin T para acceder a una expresin estable. La desventaja principal de esta tcnica es que resulta engorrosa y poco accesible para laboratorios con poca experiencia en microbiologa. La ventaja principal es que este sistema permite mantener al gen forneo en un bajo nmero de copias dentro de un plsmido Ti de Agrobacterium. La transparencia muestra un ejemplo basado en un vector cointegrativo tradicional. Los vectores binarios surgen como una alternativa al uso de los vectores cointegrativos debido a la fcil implementacin de su uso en todo tipo de laboratorios. Estos vectores se basan en que la regin T y los genes vir se encuentran en dos replicones separados. Cuando estos replicones son introducidos en Agrobacterium, los productos de los genes vir pueden actuar en trans sobre la regin T procesando y transfiriendo el ADN T a la clula vegetal. El plsmido que contiene la regin T es denominado vector binario, mientras que el replicn que lleva los genes vir se denomina plsmido helper o plsmido Ti desarmado. En general, el plsmido helper contiene deleciones de la regin T y es incapaz de generar tumores. En la transparencia 23 se muestran cuatro tipos de plsmidos binarios, todos los cuales contienen genes con secuencias no homlogas que confieren resistencia a kanamicina. Los plsmidos binarios son pequeos y fciles de manipular tanto en Escherichia coli como en Agrobacterium. Generalmente, contienen sitios mltiples para enzimas de restriccin dentro de la regin T donde puede clonarse fcilmente el gen de inters. Muchos de los primeros plsmidos binarios tienen los genes de seleccin para plantas cerca del borde derecho (por ejemplo, pBIN19). Ms recientemente, los nuevos vectores binarios se desarrollaron con el gen marcador de seleccin para plantas ms cerca del borde izquierdo, lo que asegura que el gen de inters sea transferido antes que el gen selector (por ejemplo, pGreen0029). Debe recordarse que el borde derecho precede borde izquierdo en la transferencia del ADNT. Muchos vectores fueron diseados con propsitos especficos y contienen diferentes genes selectores, promotores y seales de poliadenilacin. La tabla de la transparencia 24 refleja la optimizacin gradual experimentada desde la introduccin de los primeros vectores. Ello ha permitido incrementar la flexibilidad de los sistemas de vectores para distintos usos en un amplio rango especies vegetales. Los genes selectores ms comnmente usados en bacterias son los de resistencia a kanamicina, gentamicina, tetraciclina y estreptomicina y/o espectinomicina. Tambin ha ocurrido una progresiva reduccin del tamao de los plsmidos binarios. Los plsmidos pPZP poseen un origen de replicacin pVS1 cuya secuencia es considerablemente ms corta que las de otros orgenes de replicacin, como pRK2 o Ri. Por ello, los vectores con orgenes de replicacin tipo pVS1 tienen un tamao menor comparado con los que poseen los orgenes de replicacin pRK2 o Ri. El pGreen usa un locus de replicacin

pSa ms pequeo, subdividido en el origen de replicacin pSa ori y el gen de la replicasa pSa (rep A). El gen de rep A proviene de un plsmido (psoup) de Agrobacterium y permite la replicacin de pGreen en trans. Los vectores binarios que hoy se utilizan proveen un amplio nmero de genes selectores para plantas. Esta gama de genes permite as responder a requerimientos de las tcnicas de cultivo de tejidos y expandir el rango de especies transformables. De esta forma, se han desarrollado en muchos casos diversas versiones de un mismo vector binario. El vector pGreen, por ejemplo, permite realizar distintas combinaciones de genes selectores con el propsito de desarrollar protocolos de seleccin con uno o ms marcadores. Este grado de flexibilidad permitir tambin la incorporacin de nuevos genes selectores en el futuro. En la mayora de los casos, la seleccin se basa en el agregado de una sustancia txica para el tejido no transformado al medio de cultivo (seleccin negativa). Al expresarse en las clulas transformadas, el gen selector permite su supervivencia y la regeneracin de plantas a partir de las mismas. Los genes de resistencia a antibiticos han sido frecuentemente utilizados como selectores. El ms utilizado de ellos es el gen nptII que confiere resistencia al antibitico kanamicina. Otros genes ampliamente utilizados son los que confieren resistencia a espectinomicina e higromicina y los que confieren resistencia a herbicidas, como glufosinato y glifosato. El uso de un determinado selector est vinculado con la susceptibilidad especfica de cada especie vegetal, por lo que la transformacin de una especie nueva implica generalmente ensayos con distintos selectores. Es conveniente disponer de ms de un gen selector si se prev la necesidad de retransformar una especie con varios transgenes de inters. El debate sobre el uso de genes de resistencia a antibiticos en plantas transgnicas comerciales promovi la bsqueda de selectores ms aceptables para la percepcin pblica que no poseen propiedades txicas para el tejido (seleccin positiva). Asimismo, se han desarrollado diferentes estrategias para eliminar los genes selectores en el cultivo transgnico. Una opcin para evitar el uso de genes de resistencia a antibiticos u herbicidas es el uso de genes de seleccin positiva, llamados as, porque permiten la proliferacin del tejido transformado e inhiben la del tejido no transformado, el que sin embargo no muere. Una de las estrategias ms interesantes de seleccin positiva se basa en la utilizacin de las fuentes de carbono, para las cuales se han usado genes de origen bacteriano que permiten la modificacin de manosa o xilosa (monosacridos que no pueden ser directamente utilizados por las plantas) como genes de seleccin en la transformacin de plantas. El ejemplo descrito en la transparencia 27 corresponde a la seleccin mediada por el gen de la manosa-6P isomerasa ( man A), el que interviene en el pasaje de manosa-6P a fructosa 6P. Se compara la eficiencia de transformacin de la remolacha utilizando el gen nptII y el gen man A. La parte A de la figura muestra la eficiencia (en porcentaje) de brotes transformados usando mtodos de seleccin positiva (manosa-6P isomerasa) o negativa ( nptII). En la parte B se observa el porcentaje de brotes capaces de enraizar usando uno y otro mtodo. Este mtodo de seleccin positiva se ha utilizado en otros cultivos como cebada, tomate y girasol. Para evitar la presencia de marcadores resistentes a antibiticos se han desarrollado varios mtodos que permiten su remocin del tejido transgnico. La estrategia ms sencilla es la co-transformacin de una misma clula con dos cepas de Agrobacterium portando construcciones diferentes, una conteniendo el transgn de inters y otra el gen selector. La base de esta estrategia consiste en que, de producirse la cotransformacin, ambos transgenes se insertarn en diferentes regiones del genoma en forma no ligada, por lo cual ser factible su segregacin posterior en la progenie de la planta transgnica. Como una alternativa a la co-transformacin, se han desarrollado varios sistemas que utilizan elementos transponibles y/o sistemas de recombinacin

sitio-especfico. Estos sistemas requieren la expresin simultnea de transposasas o recombinasas que promueven la delecin especfica de la regin que debe ser eliminada. La eliminacin del gen selector y de la transposasa/recombinasa se realiza posteriormente por segregacin gentica. La transparencia 28 muestra el diseo de los dos principales tipos de vectores utilizados con este propsito. Los de Tipo 1 contienen al gen de la transposasa y al gen selector en el mismo cassette de expresin, mientras que, en los de Tipo 2, la transposasa es aportada en trans por un vector helper. En los vectores de Tipo 1, las secuencias Ds, sobre las cuales acta la transposasa, flanquean al gen de inters; en los de Tipo 2, las secuencias Ds flanquean al marcador de seleccin. El gen de la transposasa se muestra como un componente integrante de los vectores de Tipo 1, mientras que en el caso de los de Tipo 2 debe ser introducido por cruzamiento a partir de plantas transformadas con una construccin independiente. Una desventaja de estos sistemas es que la eliminacin y seleccin posterior de las secuencias indeseables en la descendencia consumen tiempos considerables. Estas estrategias no son viables en plantas de propagacin vegetativa, para las cuales se han desarrollado mtodos alternativos. Un sistema menos complicado, como el que se muestra en la transparencia 29, implica la delecin de ADN mediante recombinacin de regiones intracromosmicas (ICR) entre dos secuencias homlogas. Dado que la frecuencia de ICR es baja, esto permite una eficiente aplicacin de este sistema. El vector de transformacin diseado (OattO-ICR, contiene dos regiones de 352 pb de la secuencia de unin (attP) del bacterifago l que rodean al gen de resistencia nptII, al gen GFP y al gen tms2. A la izquierda del sitio attP, se encuentra la secuencia booster de transformacin (TBS), que favorecera el apareamiento de las secuencias attP evitando la recombinacin ilegtima; tambin se encuentra el gen efector que ser integrado al genoma por el sistema attP (esquema superior). La recombinacin homloga entre las dos regiones attP permite delecionar un fragmento de 5.9 Kpb y produce un transgn que contiene el gen efector y la secuencia TBS (esquema inferior). El gen tms2 , usado como selector, codifica una enzima que convierte NAM (naftaleno acetamida) a la auxina ANA (cido naftalen actico). Las plantas que expresan el gen tms2 producen altos niveles de auxina que evitan el desarrollo de races e inducen la produccin de callos. Por lo tanto, cuando se elimina la regin entre las secuencias attP, se habilita el desarrollo de races y se pueden identificar las plantas positivas. En la transparencia 30 se muestran resultados obtenidos utilizando el sistema descrito. Una construccin similar a la detallada previamente se introdujo en de explantos de hojas de tabaco y se seleccionaron callos resistentes a kanamicina. Despus de tres a cinco meses se observ que varios brotes que se haban desarrollado mostraban una coloracin blanca. Cuando se analizaron estos brotes por PCR se observ que haban perdido el gen de resistencia a nptII y el gen tms2. Para seleccionar plantas de tabaco transgnicas libres de marcador (panel A, se desarrollaron brotes verdes y blancos en medio conteniendo kanamicina). En el tejido blanco, que potencialmente ha perdido el marcador nptII, se ensay la actividad del gen tms2 (panel B). En medio conteniendo NAM, las races con actividad tms2 produjeron abundantes callos en lugar de races (izquierda), mientras que las races regeneradas a partir de tejido blanco que han perdido el gen nptII, debido a que tambin perdieron el gen tms2, producen races normales (derecha). El sistema que se muestra en la transparencia 31 se basa en un sistema inducible por estradiol, que permite la remocin de ADN en un sitio especfico en plantas transgnicas de Arabidopsis, denominado CLX (por sistema de remocin de ADN Cre/loxP). Este sistema es controlado por otro sistema denominado XVE. Comparado con otros sistemas, el sistema CLX puede ser finamente controlado y es altamente eficiente. Este sistema puede usarse en todo tipo de regeneracin de explantos, tanto

por organognesis como por embriognesis somtica. El sistema de expresin inducible XVE se eligi para el sistema CLX. La recombinasa Cre del bacterifago P1, que reconoce especficamente los sitios loxP, se ubic bajo el control del sistema XVE. Dado que el promotor OlexA-46 tiene una expresin basal en clulas bacterianas, la secuencia que codifica Cre se interrumpi con un intrn para evitar su expresin en las mismas. El marcador de seleccin (gen nptII) se ubic entre las unidades de transcripcin XVE y cre. En este ejemplo, el gen reportero GFP es utilizado como gen de inters. Las tres unidades de transcripcin estn flanqueadas por los dos sitios loxP, de tal forma que la recombinacin inducida por estradiol permite la remocin de todos estos componentes y la activacin del gen GFP por el promotor G10-90. Protocolos de transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens Transparencias 32-37 Los protocolos de transformacin por Agrobacterium tumefaciens son, en rasgos generales, muy similares. La base de la tcnica radica en poner en contacto el explanto que se va a utilizar para transformar con la cepa de Agrobacterium crecida en condiciones apropiadas. De acuerdo con la cepa utilizada, el requerimiento de antibiticos puede ser diferente. En general, las cepas de Agrobacterium se cultivan en medio LB suplementado con MgSO4 en presencia de los antibiticos requeridos. El Agrobacterium se cultiva toda la noche a 27-28 C. En el caso de la transformacin de hojas de tabaco, se cortan discos de hoja (explantos) de aproximadamente 1 cm de dimetro. El explanto se coloca en una caja de Petri que contiene medio MS lquido y el cultivo de Agrobacterium. Se incuba unos minutos en presencia de la bacteria y luego se pasa a un medio MS slido en presencia de las hormonas ANA y BAP para inducir la formacin de brotes. Luego, los explantos se traspasan a un medio MS slido suplementado con los antibiticos requeridos para seleccionar slo aquellos brotes que hayan incorporado el ADN-T y cefotaxime, un bacteriosttico que inhibe el crecimiento de Agrobacterium. Los explantos se repican cada 3 semanas durante 2 meses. Cuando se obtienen los brotes, estos se pasan a medio MS slido suplementado con los agentes de seleccin, pero en ausencia de hormonas para favorecer el desarrollo de races y tallos. Las plantas que enrazan en medio con seleccin se pasan a tierra en invernadero. La transparencia 33 ilustra este proceso. Panel A: control de seleccin: explantos que no fueron incubados con Agrobacterium para confirmar que el agente selector est actuando. Panel B: control de regeneracin: para confirmar que las hormonas estn actuando dado que en ausencia de agente selector se observa regeneracin de brotes. Paneles C, D, E y F: transformantes en medio suplementado con hormonas y agente selector. En el panel F se observa que el brote es capaz de enraizar en medio suplementado con el agente selector. La transparencia 34 ilustra la transformacin de soja a partir de cotiledones mediante Agrobacterium y usando higromicina como agente selector. El uso de higromicina como agente selector disminuy el nmero de escapes (plantas no transformadas). A: explantos obtenidos a partir de plantas de soja de 5 das de edad. B: cotiledones incubados en un medio conteniendo Agrobacterium. C: explantos incubados en medio de induccin de tallos durante 28 das, los primeros 14 das en ausencia de higromicina, y los segundos 14 das en presencia de higromicina. E, F, G: evolucin de los explantos en medio selectivo conteniendo higromicina durante 4 meses. H: plantas seleccionadas in vitro de una altura de 4 cm. I: plantas transferidas a tierra en condiciones de invernculo. El protocolo de transformacin de Arabidopsis thaliana por Agrobacterium es extremadamente simple y la eficiencia de transformacin radica fundamentalmente en

el buen estado fisiolgico de las plantas durante el proceso de transformacin y fecundacin. La transparencia 35 muestra pasos de este protocolo. Una vez que las plantas florecen (panel A), se prepara la cepa de Agrobacterium tumefaciens que lleva el gen de inters en un vector binario. El cultivo de Agrobacterium se resuspende en una solucin de sacarosa al 5% y la planta se sumerge en la solucin de bacterias dejando en contacto las flores durante unos segundos con agitacin suave (panel B). Luego, las plantas se cultivan normalmente hasta la obtencin de semillas (panel C). Una vez obtenidas, las semillas se recolectan, se secan y se esterilizan usando cido clorhdrico. Las semillas transformadas se seleccionan durante 7 a 10 das en medio MS slido en presencia del agente selector. El panel D muestra las plantas potencialmente transformadas que crecieron en el medio selectivo. La transparencia 36 resume los tiempos estimados para cada uno de los pasos de un protocolo de una transformacin estndar mediado por Agrobacterium tumefaciens. Estos tiempos son variables y dependen de la especie a ser transformada, la variedad elegida, el explanto utilizado y el protocolo elegido para la seleccin. Otro de los usos posibles de los sistemas basados en A. tumefaciens, es la mutagnesis por insercin con ADN-T, insertndose ste tericamente al azar en cualquier sitio de la eucromatina, y representando un marcador molecular de secuencia conocida (tag) en el sitio de insercin. Pueden generarse as colecciones de mutantes estables, para estudios de gentica inversa. Protocolo de transformacin mediante Agrobacterium rhizogenes Transparencias 38-42 Agrobacterium rhizogenes induce la formacin de races en forma de cabellera ( hairy roots, ver transparencia 39) en plantas dicotiledneas debido a la incorporacin del ADN-T contenido en el plsmido Ri al genoma de la planta husped. Se muestra el sobre crecimiento de races en discos de remolacha transformadas con el plsmido Ri de A. rhizogenes. Inicialmente, se pens que la transformacin va Agrobacterium rhizogenes era un mtodo de eleccin, dado la facilidad para rescatar plantas transformadas a partir de races inoculadas con esta bacteria, en comparacin con las dificultades que implica el rescate a partir de tumores de Agrobacterium tumefaciens. Sin embargo, una vez que el plsmido Ti fue exitosamente desarmado y estuvieron disponibles vectores no oncognicos, la transformacin con Agrobacterium tumefaciens pas a ser rutina y la utilizacin de Agrobacterium rhizogenes se vio restringida a usos especficos. Las plantas transformadas con Agrobacterium rhizogenes pueden rescatarse a partir de pelos de explantos transformados (cada pelo representa un evento individual de transformacin), mediante el uso de medios hormonales adecuados. Sin embargo, las plantas transformadas y sus progenies son morfolgicamente anormales (panel inferior de la transparencia 40) y presentan el denominado fenotipo Ri (entrenudos cortos, hojas retorcidas, etc.). La transformacin de races por Agrobacterium rhizogenes ha encontrado una importante aplicacin alternativa. Las races de las plantas en su estado natural son capaces de sintetizar una extraordinaria diversidad de metabolitos secundarios y las races transformadas tienen el potencial de capitalizar esta habilidad. Debido a que las races son capaces de proliferar indefinidamente in vitro con altas tasas de crecimiento, esta habilidad podra ser usada para la produccin de altos niveles de metabolitos secundarios en cultivos en gran escala.

La transparencia 41 resume el procedimiento utilizado para la transformacin mediada por Agrobacterium rhizogenes. Inicialmente, se clona el gen de inters en un vector intermediario que contenga el ADN-T del plsmido Ri. Luego, se transforma Agrobacterium rhizogenes con este vector intermediario, el que slo se va a poder replicar como un cointegrado con el plsmido pRi. El cultivo de Agrobacterium rhizogenes se co-cultiva con los explantos (en este caso, tallos decapitados) y stos se transfieren a un medio donde se induce la formacin de races transformadas. Luego las races se transfieren a un medio apropiado para inducir la formacin de tallos a partir de los cuales se regeneran plantas enteras. Las plantas genticamente transformadas se transfieren a invernadero. Genes reporteros Transparencias 43-52 Los genes reporteros son ampliamente usados en muchos vectores de expresin para medir la actividad de distintas regiones reguladoras. Idealmente, un gen reportero debe ser fcil de ensayar, si es posible en condiciones no destructivas del tejido. Se requiere tambin que la actividad endgena asociada al gen reportero sea muy baja o inexistente en las plantas a transformar. Actualmente, se cuenta con un pequeo nmero de genes reporteros de uso frecuente, siendo los ms utilizados el de la glucuronidasa, la protena de fluorescencia verde, los de luciferasa y, en menor grado, el de cloranfenicol acetiltransferasa. La transparencia 44 enumera los orgenes y tipos de ensayos que se utilizan para detectar las actividades asociadas con estos genes. Los genes reporteros han utilizados desde muy temprano como indicadores de que la transformacin vegetal realmente ha ocurrido. En general, los genes reporteros son codificados por enzimas que actan sobre sustratos que normalmente no estn presentes en la clula husped. Uno de los genes reporteros ms comnmente utilizado en plantas es el gen de la -glucuronidasa (uidA) de Escherichia coli. La protena GUS es bastante estable y conserva su actividad an cuando est fusionada a otras protenas. La actividad GUS puede detectarse a travs de una sencilla reaccin histoqumica usando una variedad de sustratos que estn disponibles comercialmente. Desafortunadamente, la mayora de los sustratos son caros y la reaccin histoqumica es destructiva, por lo que este ensayo no puede realizarse en tejido vivo. Sin embargo, la deteccin de la actividad GUS es muy sensible, pudindose detectar a nivel de unas pocas clulas. La transparencia 45 muestra la tincin de vulos, sacos embrionarios y lculos enteros de Arabidopsis thaliana mediante la reaccin histoqumica de la enzima -glucuronidasa luego de la infiltracin con Agrobacterium tumefaciens. En este caso, el gen uidA est regulado por un promotor constitutivo y lo que se visualiza son los tejidos inicialmente transformados por este mtodo. A: fotografa de una flor completa donde se observan varios vulos teidos. B: Fotografa ampliada de un segmento floral donde se pueden ver vulos completamente teidos y vulos no teidos. C: Tincin del embrin o saco embrionario, en vez del vulo entero. D: Cavidad del lculo completamente teido. Los genes reporteros son comnmente usados para explorar la localizacin espaciotemporal de la expresin gnica. Para ello, las regiones reguladoras de los genes que se desea estudiar son ligadas al gen reportero y las construcciones as obtenidas son transferidas al genoma de la planta. El panel de la parte superior de la transparencia 46 muestra la expresin del gen reportero uidA mediada por el promotor tejido especfico AtpT2 en flores y frutos de Arabidopsis thaliana. 1) Expresin del gen uidA en flores, 2) La expresin del gen uidA es confinada a la porcin entre la silicua y el

pecolo. 3 y 4). Cortes histolgicos del fruto donde se observa la expresin del gen uidA en clulas del estrato superior (3) y en algunas clulas del tejido vacuolar (4). El panel de la parte inferior de la transparencia muestra la expresin del gen reportero uidA bajo la regulacin de un promotor tejido especfico AtpT2 en races de Nicotiana tabacum. (5) y (6): Fotografas de las races completamente teidas debido a la expresin del gen uidA. (7): Corte transversal de raz mostrando la expresin del gen uidA. Los genes reporteros se utilizan tambin para la puesta a punto y seguimiento de un sistema de transformacin. La transparencia 47 muestra embriones cigticos inmaduros de Zea mays co-cultivados con agrobacterias que portan una construccin en que el gen uidA es dirigido por un promotor constitutivo. En el panel A se observa la distribucin de puntos azules (expresin transitoria del gen uidA) en embriones cigticos de maz. En el panel B se observa la expresin estable del gen uidA en callos que emergieron de un nico embrin. El callo de la derecha no muestra actividad GUS porque proviene de un embrin no transformado. El panel C muestra un segmento de hoja aislada de una planta transgnica que expresa el gen uidA. La hoja de la derecha proviene de una planta no transgnica (control negativo). El panel D muestra plantas transgnicas de maz en invernadero expresando el gen uidA. Aequorea victoria es una medusa con puntos luminiscentes en sus bordes (transparencia 48, panel inferior izquierdo). La luz proviene de una masa de tejido amarillo que contiene entre 6.000 a 7.000 clulas fotognicas. El citoplasma de estas clulas contiene los componentes necesarios para generar bioluminiscencia. Estos componentes son una fotoprotena que se activa por Ca2+ (aequorina) que emite luz azul y verde, y una protena accesoria, la green fluorescent protein (GFP), que acepta energa de la aequorina y re-emite esta energa como luz verde. La fluorescencia intrnseca de la protena GFP se debe a una unin covalente a un cromforo que se forma por modificaciones postranscripcionales de la protena y que involucran el ciclado y la oxidacin de los residuos, 65-67 (Ser-Tyr-Gly). El ADNc de GFP fue clonado y expresado en varios organismos procariotas y eucariotas, como bacterias, levaduras, nematodos, Drosophila y mamferos. La protena GFP tiene las caractersticas de un gen reportero deseable. Su expresin es autnoma e independiente de la localizacin celular y se requiere solamente la presencia de luz UV o azul y de oxgeno para la emisin de la fluorescencia verde. Adems, GFP permanece activa cuando otras protenas se fusionan a su extremo C- y N- terminal, sin afectar tampoco la distribucin o compartimentalizacin de la protena fusionada. Sin embargo, la expresin de GFP en plantas presenta ciertos problemas que deben ser tenidos en cuenta: a) la fluorescencia endgena que puede presentar las plantas puede confundir la interpretacin de los resultados; b) la presencia de secuencias que codifican intrones crpticos puede llevar a la sntesis de una protena inactiva; c) la obtencin de radicales libres debido a la fuerte expresin de GFP puede resultar en muerte celular. Para evitar estos problemas, se han realizado varias modificaciones a la secuencia codificante de GFP: a) el uso de codones fue modificado para evitar el reconocimiento de intrones crpticos por la maquinaria de splicing de la planta; b) la serina 65 se reemplaz por una treonina para aumentar la luminiscencia de la protena original y c) se adicionaron seales de transporte que permitieron la expresin de GFP en organelas donde los efectos txicos pueden tolerarse mejor. La transparencia 49 muestra la expresin de GFP bajo microscopio de epifluorescencia usando excitacin de luz azul. En los paneles A y B se muestra la expresin del gen de GFP utilizando un promotor especfico de polen ( LAT59 de tomate). El polen expresando GFP se desarroll como una herramienta para rastrear el movimiento del polen transgnico en el ambiente. Las fotos muestran polen de Nicotiana tabacum cv Xanthi que exhibe una segregacin mendeliana 1:1 (A; 400x de

aumento) y polen segregante transgnico y no transgnico sobre los pelos de la pata de una abeja (B; 100x de aumento). Los paneles C y D muestran expresin de GFP en plantas transgnicas de Arabidopsis thaliana. El panel C muestra cuerpos fusiformes dentro del retculo endoplsmico en clulas corticales del tallo. La protena GFP ha sido dirigida al retculo por adicin de una secuencia de anclaje HDEL. El panel D muestra clulas epidermales de hoja que exhiben fluorescencia en los tonoplastos y sub-poblaciones de vacuolas dentro de una vacuola central. El panel E muestra un cultivo de clulas en suspensin de la lnea BY2 de tabaco transformadas con el gen GFP, en las que se observa acumulacin de la protena GFP dentro del retculo endoplsmico. La transparencia 50 muestra plantas de tabaco transgnicas que expresan el gen gfp bajo el promotor AtSUC2 de la protena de transporte de sacarosa en clulas del floema de Arabidopsis thaliana. Las plantas AtSUC2-GFP se examinaron usando un microscopio confocal para localizar la expresin de GFP e identificar los patrones de desarrollo del floema en diferentes estadios del desarrollo. La parte superior de la transparencia muestra el desarrollo basiptalo del floema (desde la base hacia la punta de la hoja) de la vena mayor en los cotiledones. GFP se expresa inicialmente en la vena central (vena clase I; A y B) y luego se extiende hacia la punta de la hoja (vena clase II; C). Finalmente, se expresa alrededor de la base de la hoja (D, E y F). La parte inferior de la figura muestra el desarrollo acroptalo de la vena central en hojas inmaduras. La descarga de GFP dentro de las hojas inmaduras en desarrollo ocurre inicialmente desde la vena clase I (A y B), sigue por la parte basal de las venas clase II (C y D) y finaliza en la parte apical de las venas clase II (E y F). Los genes reporteros no destructivos pueden usarse para observar el desarrollo de ciertos fenmenos biolgicos en tiempo real. La transparencia 51 muestra la expresin de GFP en tabacos transgnicos de Nicotiana benthamiana. El gen gfp esta dirigido por un promotor constitutivo que permite su expresin en todos los tejidos. El propsito del ensayo es mostrar el desencadenamiento del fenmeno de silenciamiento gnico postranscripcional en plantas transgnicas en las que este fenmeno ha sido inducido artificialmente. La presencia de la protena GFP se revela por la aparicin de color verde o amarillo bajo iluminacin ultravioleta. En ausencia de GFP, el tejido se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila. A: Hoja de una planta de Nicotiana benthamiana no transgnica que emite fluorescencia roja debido a la presencia de clorofila. B: Hoja de una planta transgnica de Nicotiana benthamiana que emite una fuerte fluorescencia verde debido a la expresin del transgen gfp. C: Planta transgnica para gfp infiltrada 18 d antes con Agrobacterium tumefaciens portador del gen reportero gfp en que se puede observar la progresin del silenciamiento de GFP en una hoja inferior (flecha). Un gen reportero no destructivo menos utilizado (bsicamente por el costo de los sustratos y por los tiempos implicados en el ensayo) es el de la luciferasa. La transparencia 52 muestra una planta de Nicotiana tabacum expresando el gen Luc de Photinus pyralis bajo el promotor constitutivo 35S de Cauliflower mosaic virus. La deteccin de fluorescencia se realiz sobre una pelcula fotogrfica expuesta por varios das a la emisin de la planta. El ensayo se basa en la medicin de los niveles de luz producidas en una reaccin catalizada por la enzima luciferasa: ATP + luciferina + O2
luciferasa

oxiluciferina + ampicilina + PPi + CO2 + luz

La intensidad de luz emitida es proporcional a la actividad de la enzima luciferasa, la que a su vez es dependiente de la temperatura. La temperatura ptima para la actividad de la luciferasa es de entre 20 y 25 C.

Sistemas de transferencia directa de ADN Transparencias 53-99 Los diferentes mtodos desarrollados para la transformacin gentica de plantas pueden agruparse en dos clases principales de acuerdo con el mecanismo utilizado para la transferencia de ADN. Como muestra la transparencia 4, en una clase se encuentran aquellos mtodos basados en la utilizacin de vectores biolgicos, como el Agrobacterium o los virus vegetales, y en otra clase, aquellos que consisten en la transferencia directa del ADN. El rango natural de hospedantes de Agrobacterium se constituy en un importante factor limitante en los primeros intentos por transformar monocotiledneas y algunas dicotiledneas que no eran susceptibles a la bacteria. En consecuencia, se desarrollaron mtodos alternativos de transferencia de ADN basados en procedimientos de naturaleza qumica, fisicoqumica, o mecnica. Estos nuevos mtodos, conocidos como de transferencia directa, permiten transferir ADN desnudo sin la mediacin de vectores biolgicos. Entre estos ltimos, se incluyen mtodos tales como el bombardeo con micropartculas (biobalstica), la permeabilizacin de membranas celulares inducida por corrientes elctricas (electroporacin) y/o por tratamientos qumicos con policationes (PEG, PVP) o fusgenos lipdicos, la abrasin con fibras de carburo de silicio y la microinyeccin. El bombardeo de micropartculas es el ms ampliamente utilizado. Los mtodos de transferencia directa presentan diversas ventajas y desventajas al ser comparados con los mtodos mediados por vectores biolgicos. Entre las ventajas: a) son considerados universales porque, al no incluir organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie, independientemente de su susceptibilidad a la infeccin por parte de los mismos. Es decir, que su expresin no ser dependiente de la interaccin vector-hospedador; b) no requieren la eliminacin de las clulas del organismo vector de los tejidos o plantas transgnicas, como sucede en la transformacin mediada por Agrobacterium; c) las construcciones son ms simples y pequeas, ya que no son necesarias secuencias particulares, como las de la regin vir o los bordes del plsmido Ti; d) es ms fcil la co-transformacin con dos o ms genes; e) son tiles para estudiar funcin y regulacin gnica, como as tambin actividad de promotores, ya que en este tipo de mtodos la expresin transitoria suele ocurrir en forma muy temprana. El transgn puede ser transcripto en el ncleo y traducido en el citoplasma independientemente de su integracin al genoma nuclear. Entre sus desventajas: a) pueden conducir a una alta frecuencia de re-arreglos del transgn; las clulas transformadas generalmente contienen secuencias fragmentadas del transgn y del vector en varios sitios del genoma; b) la insercin de mltiples copias del transgn es ms frecuente que en el caso de los sistemas basados en vectores biolgicos. Estas dos cuestiones implican que en la transformacin directa existe una mayor probabilidad de ocurrencia del silenciamiento gnico, tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. Por regla general, con el fin de atenuar su incidencia de este fenmeno, se recomienda tomar ciertas precauciones: a) reducir el nmero de transgenes a transferir, b) evitar el uso de mltiples copias del mismo promotor o terminador y c) evitar el uso de promotores y transgenes con un alto grado de similitud a promotores o genes endgenos.

Transformacin por biobalstica o bombardeo de micropartculas Transparencias 55-82 El trmino biobalstica deriva de la conjuncin de biolgico y balstica o dicho de otro modo balstica biolgica. Es comn referirse a este mtodo como bombardeo de partculas, bombardeo de micropartculas, aceleracin de partculas, mtodo del can gnico, etc. La biobalstica fue ideada y refinada por John Sanford, Theodore Klein, Edward Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell en los aos 80. Este procedimiento consiste en la utilizacin de partculas microscpicas (microproyectiles) cubiertas con molculas de ADN o de ARN que son acelerados a alta velocidad para atravesar la pared y las membranas celulares. Una vez que las partculas son atrapadas en las clulas, el ARN puede ser traducido directamente o el ADN puede ser transcripto y traducido, lo que permite observar expresin transitoria entre 24 y 72 horas despus del bombardeo. Si las partculas bombardeadas son atrapadas en el ncleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinacin al azar, lo que se considera como un evento de transformacin estable. La transformacin estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de seleccin in vitro que permita distinguir clulas transformadas y no transformadas. El primer can gnico era similar a una pistola de calibre 22 en la que un percutor generaba una explosin de plvora impulsando una bala de plstico (macroproyectil) con las partculas de metal (microproyectiles) y ADN o ARN, hacia el tejido blanco. En 1987, Klein et al. reportaron que era posible introducir ADN plasmdico en clulas epidrmicas de Allium cepa mediante bombardeo con partculas de tungsteno, y que el gen marcador cat de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa era expresado en niveles muy altos. Poco despus, numerosos investigadores pusieron a prueba este mtodo en diferentes organismos obteniendo resultados positivos. Desde entonces, el bombardeo de micropartculas se constituy en el segundo mtodo de transformacin gentica de plantas ms empleado, luego del de Agrobacterium. El bombardeo de micropartculas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su naturaleza, permite introducir ADN desnudo virtualmente en cualquier tipo de tejido o clula. Ha sido utilizado para introducir y expresar material gentico no slo en el genoma de plantas superiores sino tambin en bacterias, protozoarios, algas, hongos, clulas y tejidos animales (insectos, peces, aves y mamferos) y an animales y plantas in vivo. Hasta el presente, constituye el nico medio que permite transformar organelas celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible. Se han identificado varios parmetros fsicos, qumicos y biolgicos que interactan entre s y que condicionan la eficiencia del bombardeo de micropartculas y la integracin del material gentico transferido. En consecuencia, al establecer un protocolo de transformacin, es necesario optimizar cada parmetro en forma independiente, priorizndolos por la magnitud de sus efectos, y luego determinar sus interacciones en una escala ms limitada. En la transparencia 58 se enumeran los factores que influyen en la transferencia del ADN y los relacionados con las construcciones genticas utilizadas. La transparencia 59 enumera los factores biolgicos que condicionan la eficiencia de un ensayo biobalstico en relacin con el tejido blanco a ser utilizado en la transformacin. Desde la aparicin del primer dispositivo para bombardeo de micropartculas en los aos 80, se han desarrollado diferentes caones gnicos con el objetivo de refinar la tcnica, incrementando su seguridad, simplicidad y eficiencia. Adems, se procur daar menos el tejido, aplicar una mayor aceleracin a las micropartculas y bajar los

costos de operacin. Los nuevos diseos incluyen en su mayora: a) el uso de una fuerza impulsora reproducible y precisamente regulada; b) el uso de un macroproyectil que permite acelerar a las micropartculas depositadas sobre su superficie. Adems, en general, estos dispositivos incorporaron una cmara de vaco en la que se realiza el disparo, lo que permite disminuir la desaceleracin de las micropartculas por el rozamiento con el aire. La transparencia 60 enumera distintos sistemas de impulsin basados en: a) explosin qumica de plvora seca; b) descarga de helio a alta presin; c) descarga de aire, CO2 o N2 comprimido; d) descarga elctrica de alto voltaje y baja capacitancia o de bajo voltaje y alta capacitancia; e) flujo de partculas o flujo de helio a baja presin por aspersin; f) flujo de helio con can de precisin. La eleccin del sistema de impulsin influye considerablemente en el nmero de partculas que impacta por unidad de rea bombardeada. La figura de la transparencia 60 muestra el can gnico original ideado por Sandford y colaboradores. El can gnico desarrollado inicialmente en la Universidad de Cornell (transparencia 56) operaba de forma similar a una pistola, en la que un macroproyectil acelerado por explosin de plvora liberaba una salva de microproyectiles metlicos revestidos de ADN en el interior de las clulas blanco. Los primeros bombardeos se efectuaron con microproyectiles de tungsteno de 4 m de dimetro suspendidos en H2O, depositados sobre un macroproyectil de Tefln. El macroproyectil era acelerado por explosin de plvora a una velocidad de unos 800 m/seg hacia las clulas blanco situadas a 10-15 cm de la salida del can. Como se muestra en el esquema, luego del impacto, el macroproyectil quedaba retenido en una placa de retencin ubicada en la extremidad del tubo de aceleracin. Los microproyectiles eran impulsados hacia el tejido blanco a travs de un orificio existente en la placa. Aunque el modelo de plvora permiti la transferencia de ADN a diferentes especies, las dificultades para controlar la potencia del disparo en forma reproducible y el dao fsico provocado a las clulas limit el nmero de transformaciones estables. Entre las modificaciones ms notables introducidas al diseo de los caones gnicos figura el reemplazo de la carga de plvora por presin de gas para generar el impulso de las micropartculas. El primer dispositivo que utiliz esta forma de impulsin fue el can PDS-1000 de Dupont, basado en una descarga de helio o nitrgeno comprimido. El modelo ms utilizado en la actualidad es el can de alta presin de helio PDS-1000/He, el que fue patentado por Dupont y es comercializado por la compaa BioRad (transparencias 61 y 62). El mismo consta de los componentes necesarios para la transferencia de alta presin de helio (regulador del helio, vlvula solenoide, tubos conectores, membrana de ruptura), de un componente portador del macroproyectil y de una cmara principal en donde se bombardea el tejido blanco en condiciones de vaco parcial. Al accionar el sistema, se establece vaco dentro de la cmara de disparo y el helio es liberado hacia la misma luego que la membrana de ruptura se rompe por exceso de presin. El movimiento del helio a alta velocidad impulsa el macroproyectil que porta las micropartculas recubiertas de ADN, las que son as aceleradas hacia el tejido blanco. Este dispositivo asegura una aceleracin reproducible de las micropartculas y los tejidos resultan menos daados que en el caso de los caones impulsados por plvora. Las transparencias 63-64 ilustran los distintos pasos del procedimiento de bombardeo. El primer paso involucra la preparacin de las micropartculas, la precipitacin del ADN sobre las mismas y el ensamblaje de las distintas partes del can que comprenden el sistema de impulsin de los microproyectiles. Para ello, se desenrosca el soporte de la membrana de ruptura, se escoge una membrana de ruptura del espesor apropiado y se la coloca en el soporte correspondiente. A continuacin, se ajusta el soporte al extremo del tubo de salid de gas. El espesor de la membrana de ruptura vara segn la presin de helio con la que se quiera trabajar (existen membranas que van de los 300

psi hasta los 2.200 psi). La presin de ruptura determina el poder de la onda de choque que impacta en la cmara. Si se incrementa la presin de helio, se incrementa la aceleracin de las micropartculas y, en consecuencia, su penetracin en el tejido blanco. La transparencia 64 ilustra los pasos siguientes en la preparacin del can para el bombardeo. Una vez que se ha colocado el macroproyectil sobre su respectivo retn, se toma una alcuota de las micropartculas recubiertas de ADN y suspendidas en H 2O o etanol y se la deposita sobre el mismo. Cuando la alcuota se seca, el retn es invertido (de manera tal que los microproyectiles queden enfrentados con las clulas blanco) y colocado en el lanzador. En el mismo dispositivo, se agrega una malla de retencin que frenar al macroproyectil luego de completar su desplazamiento. En principio, cualquier material puede ser empleado como micropartcula transportadora de ADN, siempre que sea de alta densidad, qumicamente inerte y de tamao y formato adecuados. Las micropartculas metlicas de oro o tungsteno son las ms utilizadas. Las de tungsteno son de formato irregular, de tamao de 0,2 a 3 m. Su costo es bastante reducido, por lo que son comnmente elegidas. Sin embargo, son potencialmente txicas para algunos tipos de clulas y estn sujetas a oxidacin rpida, con la consecuente degradacin del ADN. Las micropartculas de oro son biolgicamente inertes, de formato redondeado y de tamao ms uniforme de entre 0,6 a 3 m. Su principal desventaja es su alto costo. Las caractersticas mencionadas deben ser evaluadas en distintos tipos de clulas blanco de modo de optimizar el proceso de bombardeo. La transparencia 66 muestra un esquema de los parmetros que pueden variarse en el dispositivo de un can gnico y de las relaciones existentes entre las principales variables y la velocidad de los microproyectiles. En cada bombardeo realizado con el can PDS1000/He, la velocidad que alcanzan los microproyectiles es condicionada por: a) la presin de helio elegida; b) la presin negativa alcanzada en la cmara de disparo; c) la distancia (A) entre la membrana de ruptura y el macroproyectil; d) la distancia (B) de desplazamiento del macroproyectil desde su posicin original hasta el impacto contra la malla de retencin; e) la distancia (C) de desplazamiento de los microproyectiles desde la malla de retencin hasta el tejido. Variando la presin y las distancias (A, B y C), se puede modificar la velocidad de los microproyectiles, lo que permite optimizar los protocolos segn el objetivo de transformacin y tejido blanco. Existen modelos alternativos al can PDS 1000/He que permiten regular la presin del gas a la cual se desea producir el bombardeo. La regulacin se efecta por medio de una vlvula elctrica, dentro de un rango de presiones de 200 a 1500 psi. Al accionar un control elctrico, la fuerza electromagntica generada por un solenoide produce el desplazamiento de una aguja que perfora las membranas de ruptura permitiendo la salida del helio (en contraste con el can PDS1000/He en que la membrana de ruptura se rompe pasivamente por exceso de presin). El dispositivo que se muestra en la transparencia 67 fue desarrollado en EMBRAPA-CENARGEN (Brasil) y ha sido utilizado exitosamente en la transformacin de Glycine max, Phaseolus vulgaris, Gossypium hirsutum, entre otros. El Genebooster (transparencia 68) es otro tipo de can gnico, producido por ELAK (Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnologa Agrcola del Instituto de Ciencias Vegetales de Hungra. Mediante este dispositivo, las partculas son impulsadas hacia el tejido blanco por liberacin de nitrgeno comprimido a alta presin. En este caso, los controles de presin y vaco se encuentran en una unidad separada de la cmara de disparo. El proceso de disparo es controlado por un sistema electrnico automtico. La energa del disparo es ajustada segn el espesor de la pared celular del tejido blanco. Los ajustes de los parmetros de cada disparo pueden

ser archivados por una computadora conectada al dispositivo. Este can ha sido usado con xito en la transformacin de Oryza sativa y tambin para obtener expresin transitoria en estudios de promotores especficos para diferentes tejidos (hoja, hipoctilo, embrin, escutelo, callo, cotiledn) de varias especies vegetales. Entre sus ventajas, pueden mencionarse: a) control automtico de los disparos; b) registro computarizado de los ajustes de cada disparo; c) control continuo de la energa de disparo; d) alta penetracin a travs de paredes celulares; e) alta frecuencia de transformacin en especies recalcitrantes; f) bajo costo (gas barato, placas de retencin reciclables). En 1996 hizo su aparicin la pistola gnica de mano como una alternativa al can PDS 1000/He. En contraste con los caones gnicos convencionales, en que el tamao del tejido blanco est limitado por el tamao de la cmara y el explanto es sujeto a vaco durante el bombardeo, este nuevo diseo no requiere vaco, permite trabajar con virtualmente cualquier tipo de clulas o tejido blanco y provee una herramienta para transformar organismos in vitro o in vivo. El instrumento que se muestra en la transparencia 69 es comercializado por la compaa BioRad. La pistola trabaja con microproyectiles de oro recubiertos de ADN o ARN que son precipitados en la pared interna de un cartucho de plstico y acelerados por un flujo de helio a presin. Es posible preparar 50 cartuchos a la vez conteniendo cantidades conocidas de microproyectiles, los cuales pueden conservarse hasta dos meses previos a su utilizacin. Los cartuchos se colocan en un soporte (figura C), el cual se ensambla en la pistola y se dispara. El sistema es rpido, verstil y permite la co-transformacin con ms de un transgn. En la prctica los dos sistemas de helio, el can PDS1000/He y la pistola Helios, se complementan, dado que en el primero el vaco provee condiciones ambientales ms controladas en su cmara de disparo, mientras que el ltimo permite trabajar con una amplia variedad de tejidos o clulas blanco, incluidos organismos vivos. La transparencia muestra la pistola gnica (figura A), el porta cartuchos (figura C), y un dispositivo (figura B) utilizado para preparar hasta 50 cartuchos por vez. El esquema inferior muestra el diseo interno de la pistola gnica. La pistola gnica constituye una valiosa herramienta para transferir ADN o ARN en organismos vivos sin utilizar cmara de vaco. Debido a que la pistola puede ser dispuesta muy cerca del tejido a ser bombardeado, la trayectoria de las partculas es reducida y la desaceleracin por friccin es muy baja. Estos cambios reducen el trauma en tejidos frgiles y facilitan las manipulaciones. Sin embargo, los parmetros de bombardeo deben ser ajustados de acuerdo con el tipo de tejido blanco. Algunos reportes mencionan que una desventaja del sistema es la poca reproducibilidad entre experimentos. Sin embargo, este problema es frecuente en todos los sistemas de bombardeo de partculas. Algunos autores recomiendan tomar recaudos especiales para controlar mejor este problema, tales como trabajar con material vegetal crecido en las mismas condiciones o utilizar explantos de misma edad fisiolgica. La expresin transitoria temprana de genes reporteros es extremadamente til en el monitoreo de la eficiencia de transferencia gnica y en el ajuste de los parmetros de bombardeo. Asimismo, la expresin transitoria es sumamente utilizada para estudios de regulacin y funcin gnica, especificidad de promotores, etc. Las figuras de la parte superior de la transparencia 71 muestran la expresin transitoria del gen uid A en embriones inmaduros de centeno. Las diferencias en la expresin del gen se relacionan con el uso de diferentes cantidades de microproyectiles para el bombardeo: (figura A) 200 g; (figura B) 100 g; (figura C) 30 g. Las figuras de la parte inferior muestran la diferencia de expresin transitoria del gen uid A observada en hojas de Arabidopsis thaliana bombardeadas con una pistola gnica Helios (presin de disparo,

75 psi) usando 125 g de micropartculas de oro y 1 g de ADN por disparo; con o sin malla difusora de micropartculas (A y B respectivamente). El Geneboy es una pistola de mano ELAK (Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnologa Agrcola del Instituto de Ciencias Vegetales de Hungra. Mediante este dispositivo las micropartculas son impulsadas hacia el tejido blanco por liberacin de CO2 a presin. Pueden utilizarse contenedores manuales de gas de diferente capacidad para mltiples disparos. Esta pistola se ha utilizado con xito en la produccin de plantas transgnicas de maz. Este sistema permiti la transferencia de ADN in vivo en tejidos meristemticos de especies leosas como durazno, manzana, etc. Entre sus ventajas ms importantes, caben mencionar: a) bajo costo; b) no requiere uso de cmara de vaco; c) alta eficiencia de penetracin a travs de paredes celulares; d) alta frecuencia de transformacin en especies recalcitrantes; e) fcil manejo en condiciones de campo. Otro sistema biobalstico alternativo se basa en la tecnologa ACCELL, desarrollada por la compaa Agracetus para permitir el mximo de flexibilidad de ajuste, blanco y penetracin celular. Esta tecnologa involucra el uso de una descarga elctrica a alto voltaje para evaporar una gota de H2O. Los microproyectiles recubiertos de ADN son dispuestos sobre un disco de metal (macroproyectil) y posicionados en una cmara de vaco (transparencia 72). Una expansin explosiva generada por la descarga elctrica (aproximadamente 14 kV desde un capacitor de 2 F) en una gota de agua acelera el complejo macroproyectil-microproyectiles hacia las clulas blanco. La penetracin del tejido blanco puede ser finamente regulada variando la intensidad de la descarga elctrica. Mediante este procedimiento, las partculas pueden ser dirigidas a una capa especfica del tejido. Esta capacidad es un atributo importante del sistema, an cuando explantos idnticos de diferentes genotipos de la misma especie pueden requerir diferentes condiciones de aceleracin para una ptima penetracin de las partculas. La aceleracin provocada por la descarga elctrica reduce el impacto provocado en las clulas blanco, en comparacin con los sistemas basados en propulsin por gases. Sin embargo, a pesar de haber sido usado con xito en la transformacin de numerosas especies y de las ventajas operativas del sistema, este sistema no ha sido adoptado en forma generalizada para la transformacin de plantas. Un dispositivo de bajo costo, que puede usarse como alternativa a los instrumentos ms sofisticados, es el can de chorro de partculas (PIG; Particle Inflow Gun). El mismo puede ser fcilmente construido en el laboratorio con medios relativamente econmicos. Este can hace uso de una vlvula elctrica para generar un chorro de helio a baja presin, el cual acelera las micropartculas dentro de una cmara de vaco (28-30 pulgadas de Hg) y las proyecta hacia las clulas blanco. La micropartculas recubiertas de ADN son dispuestas en una jeringa con filtro que se acopla a un adaptador conectado a la vlvula solenoide. Este instrumento ha sido exitosamente usado para transformar Glycine max, Zea mays, Manihot esculenta y Musa spp. Existe una versin del PIG en el cual se ha eliminado la cmara de vaco y que se ha usado para transformar Oryza sativa. A pesar del bajo costo del sistema, su uso no ha sido tan difundido como el de los caones mencionados anteriormente. Sautter et al. desarrollaron un diseo alternativo de can gnico que combina caractersticas del mtodo de microinyeccin con la biobalstica. Fue ideado para el bombardeo de meristemas apicales y permite apuntar el disparo en reas de 100 a 200 m de dimetro. El tejido blanco es montado sobre una capa de agarosa en una gota de alginato. No utiliza macroproyectiles y el ADN no es precipitado con los microproyectiles sino mezclado con los mismos y transferido en conjunto con los mismos en una pequea gota de lquido desde un tubo capilar conectado a un tubo

Pitot. Para romper la gota, se usa un flujo de CO 2 o de N2 a alta presin que forma un aerosol y fuerza a las partculas a travs de una pequea apertura (aspersin de gotas microscpicas). A partir de all, las partculas son aceleradas a travs de un capilar a una cmara con vaco parcial en que se encuentra el tejido blanco. La longitud de este ltimo capilar determina la velocidad de las partculas y su dimetro determina el rea de impacto en determinadas condiciones de vaco, presin y distancia de trabajo. Los parmetros de disparo pueden adaptarse dentro de un amplio rango. Un dispositivo de enfoque permite dirigir las partculas a un meristema individual. Como se muestra en el esquema de la derecha, el rea del blanco es determinada con una mira. En el mismo, se observa el meristema apical de una plntula de cereal luego del bombardeo y la distribucin de las partculas bajo la mira utilizada para apuntar el can. El rea apuntada tiene un dimetro de 150 m. La segunda capa celular, que dar origen a las clulas germinativas, se seala con el dibujo de los ncleos. Este sistema ha sido utilizado en diferentes plantas como Triticum aestivum, Sorghum bicolor y otras gramneas, aunque los resultados obtenidos no satisficieron las expectativas para lo cual fue diseado. La transparencia 73 muestra ejemplos de especies de monocotiledneas transformadas por biobalstica, junto con el tipo de tejido blanco, genes reporteros y genes marcadores de seleccin usados.
uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli. cat: gen de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa de Escherichia coli luc: gen de la enzima luciferasa de Photinus pyralis bar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus csr-1/als: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del cido acetohidroxil, tambin conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana. hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli. npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli.

A diferencia de la transformacin va Agrobacterium, los procedimientos de transformacin por biobalstica no requieren el uso de vectores especiales. Como fuente de ADN para el bombardeo, es posible utilizar los plsmidos comnmente usados en las manipulaciones de ingeniera gentica conteniendo las construcciones genticas de inters. En algunos casos, se ha obtenido mayor eficiencia de transformacin cuando los plsmidos son linealizados. El promotor ms ampliamente utilizado para inducir la expresin de genes en plantas es el promotor constitutivo 35S del virus del Mosaico de Coliflor (CaMV; Cauliflower mosaic virus). Generalmente, este promotor brinda altos niveles de expresin en dicotiledneas. Sin embargo, no ocurre lo mismo en monocotiledneas, en las que se utilizan en forma alternativa promotores como el del gen ubi1 (ubiquitina) de maz y el del gen act1 (actina) de arroz. La tabla de la transparencia 74 muestra ejemplos de promotores utilizados en la transformacin de cereales y de sus actividades relativas.
Emu: Promotor modificado de alcohol deshidrogenasa de maz Act1-Act1 intrn1: Promotor e intrn de actina de arroz Ubi1-Ubi1 intrn: Promotor e intrn de ubiquitina de maz 35S: Promotor de 35S de CaMV 35S-Adh1 intron 1: Promotor de 35S de CaMV e intrn de alcohol deshidrogenasa de maz

La transparencia 75 muestra ejemplos de especies de dicotiledneas transformadas por biobalstica junto con los tejidos blanco, genes reporteros y genes marcadores de seleccin que demostraron ser eficientes.
uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli gfp: gen de la protena de fluorescencia verde de Aequorea victoria

bar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli. csr-1: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del cido acetohidroxil, tambin conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.

Al elegir un tejido blanco para la transformacin por biobalstica, nuevamente debe tenerse en cuenta la capacidad de la especie de inters para regenerar in vitro. Entre los explantos vegetales utilizados con mayor xito, se encuentran las suspensiones celulares, meristemas, embriones en desarrollo, embriones maduros, embriones somticos, primordios foliares, cotiledones y callos. En la transparencia 76 se muestran algunos explantos comnmente usados en protocolos de biobalstica. Una de las estrategias ampliamente utilizadas para favorecer la recuperacin de los tejidos luego del bombardeo es la aplicacin de baos en antioxidantes para prevenir la oxidacin de los explantos. Para facilitar el ingreso de los microproyectiles en el ncleo celular, los explantos suelen ser cultivados en medios conteniendo sustancias osmticas (como manitol) que provocan plasmlisis reversible de las clulas. As, la menor turgencia de las clulas, hace que las mismas resulten menos daadas por el impacto de los microproyectiles. Por otro lado, el pasaje de los explantos a medio fresco previo al bombardeo aumenta la tasa mittica, favoreciendo as la integracin del ADN forneo al genoma vegetal. El bombardeo de micropartculas ofrece una alternativa altamente eficiente e independiente del genotipo para la transformacin de Oryza sativa. A la fecha, han sido transformadas ms de 40 variedades de arroz por esta tcnica. Los explantos ms utilizados son embriones inmaduros y callos derivados de semillas. El antibitico preferentemente usado como selector es higromicina. El procedimiento se basa en el bombardeo de embriones inmaduros a partir de los cuales se obtienen callos en medio selectivo. Estos callos puede dar lugar a la regeneracin de plantas transgnicas en medios conteniendo los reguladores de crecimiento adecuados. La transparencia 77 muestra resultados de transformacin de Oryza sativa utilizando el sistema de bombardeo con micropartculas. En este caso, los explantos bombardeados son callos embriognicos de 6 variedades de lite que expresaron actividad GUS positiva 24 hs despus del bombardeo. Se les transfiri simultneamente el gen bar y el gen hpt. Se obtuvieron plantas completas a partir de callos cultivados en seleccin con higromicina y glufosinato de amonio. En las figuras, se observan los callos embriognicos transformados, la expresin transitoria del gen uid A en los mismos, y la regeneracin de brotes a partir de los callos en seleccin con glufosinato de amonio. La transformacin por biobalstica puede implementarse eficientemente no slo en el caso del arroz, sino tambin en otras especies de monocotiledneas como Festuca arundinacea. La transparencia 78 ilustra el procedimiento de transformacin de esta especie basado en la induccin de callos embriognicos y en el establecimiento posterior de suspensiones celulares embriognicas. Estas suspensiones celulares son utilizadas como tejido blanco para la transformacin por biobalstica. Luego del bombardeo, stas son puestas en seleccin con higromicina. En la transparencia se diferencian las suspensiones celulares transgnicas (resistentes a la seleccin y de color amarillento) de las suspensiones susceptibles a higromicina, de color marrn. La biobalstica es una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas en la transformacin gentica de Glycine max (soja). Desde hace ms de 10 aos, se han documentado numerosos eventos de transformacin por bombardeo de micropartculas que incluyen el uso de distintos dispositivos de aceleracin como los caones PDS 1000/He, PIG, o

Accell, mencionados anteriormente. Las variedades transgnicas comerciales tolerantes al herbicida glifosato han sido obtenidas por biobalstica. Los tejidos o suspensiones embriognicas de soja, as como tambin los meristemas apicales son los explantos ms utilizados en esta especie. En cuanto a los agentes de seleccin, el antibitico higromicina y el herbicida imazapyr han sido reportados como los ms eficientes. La transparencia 79 muestra diferentes etapas en el proceso de transformacin de soja. Los cultivos embriognicos, derivados de cotiledones inmaduros, fueron bombardeados con un can gnico PDS 1000/He y puestos en medio de seleccin con higromicina. Aquellos explantos que sobrevivieron a la seleccin, continuaron siendo cultivados a travs de diferentes estadios embrionarios hasta su conversin en plantas completas. En la foto B puede observarse la expresin transitoria del gen uidA en un ensayo histoqumico. La biobalstica tambin ha sido un instrumento eficiente para la transformacin de Manihot esculenta Crantz (mandioca) a partir de cotiledones. En la transparencia 80 se observan cotiledones bombardeados (figura A) con un can gnico de chorro de partculas (PIG), que expresan transitoriamente el gen uidA. A partir de los cotiledones se obtuvieron brotes en seleccin con higromicina (figuras B y C), los cuales regeneraron plantas completas (figuras D y E). Se constat la expresin estable del gen uidA en hojas (figura F). Las figuras de la transparencia 81 muestran la expresin transitoria del gen que codifica la Protena de Fluorescencia Verde (GFP) en embriones somticos de Glycine max (figuras A y B) y Triticum aestivum (figuras C, D y E) y la expresin estable del mismo gen en hojas de Petunia hybrida (figura F). Todos los explantos fueron bombardeados con un can gnico de chorro de partculas (PIG). Junto con los mtodos basados en Agrobacterium tumefaciens, el bombardeo de micropartculas es una de las tcnicas ms usadas para la transformacin gentica de plantas. Asimismo, el bombardeo con micropartculas se ha usado con xito para transformar animales, microorganismos y organelas como cloroplastos y mitocondrias. El mtodo es sumamente til para analizar la funcin y regulacin gnica, encarar problemas que requieren expresin transitoria o integrativa, transferir ARN viral y estudiar vas metablicas. Tradicionalmente se ha adherido el ADN a microproyectiles de oro o tungsteno para ser transferido, pero tambin se ha hecho lo mismo con bacterias, levaduras o fagos. Asimismo, se ha utilizado el sistema de bombardeo como estrategia complementaria en la transformacin mediada por Agrobacterium para provocar orificios en los tejidos blanco y facilitar as la entrada de la bacteria. Sin embargo, las tcnicas de bombardeo presentan limitaciones tal como se discutir ms adelante. Algunas especies oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas, dada por cutculas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. La principal limitacin del mtodo contina siendo la baja relacin entre el total de clulas sometidas al bombardeo y el nmero de clulas que logran incorporar de manera permanente el transgen. Transferencia de ADN mediada por electroporacin y/o mtodos qumicos Transparencias 83-93 Otro sistema de transferencia directa de ADN se basa en la permeabilizacin de las membranas plasmticas de los protoplastos para favorecer el ingreso del material gentico. Las paredes celulares representan barreras fsicas significativas para la transferencia de ADN, mientras que los protoplastos, por tratarse de clulas desprovistas de paredes celulares, constituyen un tipo de explanto blanco ms

apropiado. La obtencin de protoplastos requiere la incubacin de tejido vegetal en un medio suplementado con enzimas fngicas pectocelulolticas para digerir las paredes celulares, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en tanto que las pectinasas digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las clulas. El uso de enzimas disponibles comercialmente posibilit el aislamiento de protoplastos de prcticamente cualquier tejido vegetal, siempre que el mismo no est lignificado. Luego de la digestin, los protoplastos deben ser aislados y lavados. Por otro lado, con el objetivo de optimizar la transferencia de ADN a protoplastos, se utilizan distintas tcnicas que incrementan la permeabilidad de las membranas plasmticas. Es comn el uso de policationes tales como polietilenglicol (PEG), polivinil alcohol (PVA) y DEAdextrano que actan como fusgenos e incrementan la endocitosis del ADN debido a que sus cargas positivas interaccionan con las cargas negativas del ADN y de la membrana plasmtica. Adems del uso de fusgenos, los tratamientos con Ca 2+ y calor pueden incrementar la precipitacin del ADN. La obtencin de la primera planta transgnica viable derivada de protoplastos de Nicotiana sp. se report en 1984. La transformacin de protoplastos en soluciones que contienen PEG provee frecuencias relativamente bajas de plantas transgnicas. Sin embargo, debido al gran nmero de clulas disponibles en estos sistemas, si se dispone de buenos mtodos de seleccin y de protocolos de regeneracin eficientes, es siempre posible obtener plantas transgnicas. Una contribucin a la transformacin mediada por PEG fue la fusin con liposomas. En este caso, el ADN es previamente incorporado a liposomas, a partir de las cuales es transferido a las clulas. Los liposomas estn constituidos por lpidos de carga neutra similares a los que componen la membrana plasmtica y pueden ser producidos en diversos tamaos. El ADN es empaquetado in vitro y luego transferido a los protoplastos. Para hacer ms eficiente la fusin se utilizan tratamientos con PEG u otros policationes. Aunque el sistema es muy laborioso y la eficiencia de transformacin es baja, se ha reportado la obtencin de plantas transgnicas de tabaco y trigo por esta tcnica. La transparencia 84 muestra un esquema representativo del aislamiento y purificacin de protoplastos de hojas de Nicotiana tabacum. Las hojas cosechadas son puestas en contacto con la solucin enzimtica durante 16 h, al cabo de las cuales se procede a separar los protoplastos del tejido no digerido. Un mtodo alternativo para permeabilizar las membranas celulares y facilitar el ingreso del ADN es la electroporacin, la que consiste en exponer a las clulas vegetales a intensos campos elctricos para provocar la apertura de poros y promover la captura del ADN. Los protoplastos se obtienen siguiendo los pasos mencionados en la transparencia anterior, se incuban luego en una solucin buffer conteniendo el ADN (plsmido con el gen de inters y el gen de seleccin) y son expuestos a pulsos elctricos de alto voltaje y de duracin variable. El campo elctrico causa la formacin de poros reversibles en la membrana plasmtica, permitiendo as el pasaje de ADN a la clula. Se han determinado las condiciones ptimas para la transformacin de clulas de distintas especies, incluyendo la intensidad del campo elctrico, la densidad de protoplastos y la composicin del buffer de cultivo. La electroporacin sola no produce altas tasas de transformacin, pero la eficiencia puede incrementarse acoplndola al uso de policationes como el polietilenglicol (PEG). La transformacin por electroporacin ha sido documentada en una amplia variedad de especies y tipos de tejidos, pero la disponibilidad de protocolos de regeneracin de plantas enteras a partir de protoplastos resulta una limitante en la mayor parte de los casos. La transparencia 85 muestra los pasos a seguir para la transformacin de protoplastos de tabaco por electroporacin. Se muestran tambin distintas tipos de cubetas y electroporadores comerciales.

La transparencia 86 muestra distintas fases del cultivo de protoplastos electroporados con un gen que confiere resistencia a kanamicina y de la regeneracin de plantas de Nicotiana tabacum a partir de los mismos. A: protoplastos luego de la electroporacin; B: protoplastos cultivados en divisin; C: protoplastos formando callos en medio con kanamicina (izquierda) y sin kanamicina (derecha); D: plantas en medio de enraizamiento con kanamicina (planta resistente a la izquierda y planta no resistente a la derecha); E: plantas floreciendo; F: germinacin en medio selectivo. Las plantas transgnicas continan desarrollndose mientras que las no transgnicas se tornan clorticas. La transparencia 87 muestra un esquema de la transformacin de protoplastos de Oryza sativa por electroporacin. En este protocolo, la formacin de callos de los cuales se obtienen los protoplastos se induce a partir de semillas. Luego de la electroporacin, los protoplastos son cultivados en medio lquido junto a clulas nodrizas de tabaco, las que han sido elegidas por su alta tasa mittica. Los factores mitognicos secretados por las mismas inducen la divisin de los protoplastos. Como se muestra en el panel inferior, los protoplastos pueden cultivarse mezclados con las clulas nodrizas o separados de las mismas por membranas de tipo Millicell (filtro de nylon, papel de filtro Millipore u hoja de celofn). Uno de los agentes selectores que mejor actan en arroz es el antibitico higromicina. En este caso, se realiz una doble seleccin con higromicina de los callos obtenidos a partir de protoplastos electroporados antes de inducir la regeneracin de plantas completas. Es tambin posible co-transformar protoplastos por electroporacin. En la transparencia 88 se muestra una etapa del protocolo de transformacin de protoplastos de arroz con dos plsmidos diferentes. Uno de los plsmidos porta el gen hmr de resistencia a higromicina y el otro, el gen de inters no seleccionable ms el gen reportero uidA. Luego de la electroporacin, los protoplastos son cultivados en medio suplementado con higromicina. Los protoplastos que resisten la seleccin son cultivados en un medio con reguladores de crecimiento para estimular la regeneracin de la pared celular y la divisin celular. Las clulas se dividen formando colonias y tras sucesivos subcultivos en diferentes medios regeneran plantas completas por organognesis o embriognesis. Un porcentaje considerable de los protoplastos electroporados incorpora simultneamente el gen de resistencia a higromicina, el gen de inters y el reportero y, en consecuencia, las plantas derivadas de stos poseen los dos genes. Para diferenciar estas plantas de aquellas derivadas de protoplastos que slo incorporaron el gen de seleccin, es necesario determinar la presencia de los genes de inters en un anlisis posterior. Generalmente, esto se realiza utilizando la tcnica de PCR e iniciadores especficos. La transparencia 89 muestra fotografas del aislamiento, cultivo y electroporacin de protoplastos de Citrus sinensis (naranjo dulce) obtenidos a partir de callos embriognicos y del proceso posterior de regeneracin de plantas completas. Los explantos expresan de forma transitoria y estable el gen de la Protena de Fluorescencia Verde (gen gfp), el que ha sido utilizado como gen reportero. La tabla de la transparencia 90 muestra ejemplos de especies vegetales transformadas por mtodos qumicos (fusin mediante policationes, tratamiento con liposomas) y/o por mtodos de electroporacin de protoplastos. Se informan los genes de seleccin y los agentes selectores usados. Aunque la transformacin de protoplastos resulta un mtodo relativamente simple y efectivo, no se utiliza con mucha frecuencia, especialmente por la escasa disponibilidad de protocolos optimizados para regenerar plantas a partir de protoplastos.

Si bien la electroporacin se utiliza como tcnica de transformacin de bacterias y protoplastos, tambin ha sido empleada para transferir ADN a clulas o tejidos intactos, es decir que presentan paredes celulares. Los explantos vegetales utilizados en este caso pueden ser microesporas, polen, fragmentos de hoja, embriones, callos, semillas o yemas. En algunos casos, los explantos son pre-tratados con soluciones enzimticas (degradacin parcial de las paredes celulares) o heridos en forma mecnica para facilitar la entrada del ADN. Se han reportado resultados positivos de la transformacin de clulas o tejidos intactos por electroporacin de Oryza sativa, Nicotiana tabacum, Triticum aestivum, Zea mays, Citrus sp, etc. La transparencia 91 muestra un dispositivo (figura A) usado para transformar embriones de Triticum aestivum. La electroporacin se realiza en una cmara especial en la que los embriones son montados en gotas de alginato sobre discos de agarosa (figuras B, C, y D). Durante la electroporacin los embriones quedan en contacto con el buffer de electroporacin enfrentados con el ctodo de la cmara de electroporacin (figura D). La transparencia 92 muestra diferentes tejidos de Coffea arabiga (cafeto) electroporados sin pretratamiento enzimtico (figuras A y B) y con pretratamiento enzimtico (figuras C-F) en los que se observa expresin transitoria del gen uidA. Los embriones somticos en estado de torpedo resultaron ser los explantos ms apropiados para la transformacin por electroporacin. Este hecho se manifiesta en el incremento de la frecuencia de expresin transitoria del gen uidA y en un aumento de la capacidad regenerativa de los embriones. El autor de este trabajo concluye que el pretratamiento con enzimas facilita el ingreso del ADN. La transparencia 93 muestra los resultados de la transformacin de pro-embriones de Nicotiana tabacum mediante electroporacin sin previa permeabilizacin de las membranas. Los pro-embriones expresan transitoriamente los genes reporteros uid A y gfp. Transformacin con whiskers de carburo de silicio Transparencias 94-95 En 1990 se report una nueva tcnica de transferencia de ADN que utiliza fibras muy finas, conocidas como whiskers, para generar orificios en las paredes celulares. Las fibras ms utilizadas en este mtodo son cristales de carburo de silicio de 0,3-0,6 m de dimetro y 10-100 m de longitud. Las fibras de silicio se agregan a una suspensin conteniendo el tejido vegetal (por ejemplo suspensiones celulares, embriones o callos) y ADN plasmdico, y luego se mezclan con un agitador tipo Vortex. Como resultado de la agitacin, los whiskers penetran la pared celular y la membrana plasmtica, permitiendo el ingreso del ADN. La eficiencia de la tcnica depende del tamao de la fibra, los parmetros de mezcla (agitacin), la forma de los recipientes utilizados, el material vegetal y las caractersticas de las clulas vegetales, especialmente el espesor de la pared celular. Las principales ventajas de este mtodo residen en su bajo costo y en la rapidez y sencillez con que pueden realizarse los ensayos. Sus principales desventajas son la baja eficiencia de transformacin, la disminucin de la capacidad regenerativa de los tejidos daados por el proceso y la necesidad de trabajar con extrema precaucin debido a la toxicidad del carburo de silicio para la salud humana. Aunque el proceso ha sido utilizado con callos friables, este tipo de callo est limitado a unos pocos genotipos de maz y avena. Muchos cereales producen callos embriognicos muy compactos y duros que no son fcilmente transformables por este mtodo. Sin embargo, se han introducido mejoras a la tcnica que permitieron la transformacin transitoria y estable de Oryza sativa, Triticum sp., Hordeum vulgare, Zea mays, Nicotiana tabacum, Lolium multiflorum,

Lolium perenne, Festuca arundinacea y Agrostis stolonifera, sin necesidad de iniciar suspensiones celulares. La transparencia 95 muestra la transformacin de suspensiones celulares de maz con whiskers de carburo de silicio. Las suspensiones celulares fueron puestas en una solucin conteniendo los whiskers y el ADN plasmdico portando los genes uidA y bar. La mezcla fue agitada con la ayuda de un dispositivo de tipo Vortex (figura A). La incorporacin del ADN fue corroborada por la expresin transitoria del gen uidA (figura B). Las clulas transformadas formaron callos en seleccin con fosfinotricina (figura C) y regeneraron plantas transgnicas (figuras D, E y F). El tratamiento con herbicida revel que las plantas han heredado el gen bar en forma mendeliana (figura F). Este trabajo fue el primero en que se report la produccin de plantas transgnicas mediante whiskers de carburo de silicio. Transferencia de ADN por microinyeccin Transparencias 96-99 La microinyeccin es un mtodo de transferencia directa, mediante el cual se inyecta ADN en las clulas utilizando pipetas microcapilares de vidrio bajo control microscpico. Esta tcnica se utiliz por primera vez en clulas animales durante los aos 40, cuando se hizo posible la generacin y manipulacin de microagujas, y su uso se extendi posteriormente a las clulas vegetales. La tcnica requiere de un micromanipulador y se realiza bajo microscopio. Durante la transferencia de ADN, cada clula es inmovilizada con una pipeta succionadora. Las clulas microinyectadas se dejan recuperar en una gota de medio suspendida en una cmara hmeda y, posteriormente, son cultivadas in vitro para regenerar plantas. La microinyeccin fue ideada principalmente para la transformacin de grandes clulas animales, como las huevas de los peces. Sin embargo, se han desarrollado protocolos para microinyectar ADN en protoplastos, cultivos embriognicos, clulas en suspensin y estructuras multicelulares vegetales. La microinyeccin de protoplastos requiere inmovilizar a los mismos en gotas de alginato, polilisina o agarosa. La microinyeccin presenta varias ventajas: a) requiere pequeas cantidades de ADN; b) puede aplicarse virtualmente a cualquier tipo de clula; c) permite la inyeccin conjunta de ADN con otras molculas biolgicamente activas; d) permite regular el nmero de molculas a transferir; e) puede monitorearse a las clulas blanco durante y despus de la transferencia de ADN; f) permite la introduccin no slo de ADN sino tambin de cromosomas dentro de las clulas. Por todas estas caractersticas, constituye un mtodo muy aplicable al estudio de funciones celulares y de la fisiologa de plstidos. Sin embargo, su aplicacin a la transformacin de plantas ha sido muy limitada hasta el presente debido a las dificultades para penetrar la pared celular mediante micropipetas e inyectar el ncleo celular (generalmente la vacuola celular ocupa un volumen preponderante). La presin de turgencia de las clulas vegetales suele dificultar tambin el procedimiento de inyeccin. Utilizando este mtodo, se han obtenido plantas transgnicas de Nicotiana tabacum, Petunia sp., Brassica napus y Hordeum vulgare. La microinyeccin de fluorocromos, anticuerpos, protenas y material gentico es ampliamente utilizada por los bilogos a pesar de sus desventajas relacionadas con la insercin de microcapilares. En clulas pequeas, el sellado de la membrana plasmtica alrededor de la herida provocada por la punta de la pipeta (alrededor de 0,7 m de dimetro) es a menudo incompleto. Adems, en la mayora de las clulas vegetales y en algunos casos de animales la alta presin celular exacerba los problemas de sellado, despus de la penetracin de la pipeta la presin celular se distiende porque los lquidos celulares son forzados a entrar al capilar. Desafortunadamente en clulas vegetales muy turgentes como elementos de plantas

superiores, la prdida de presin celular es acompaada por un drstico cambio en la ultraestructura celular. Sin embargo, la prdida de ultraestructura no ocurre cuando las clulas son tratadas con capilares de 0,1 m. En comparacin con los capilares convencionales, esta minscula punta de pipeta reduce el dao celular y la prdida de turgencia. Aparentemente, las fuerzas fsicas en esta punta extremadamente fina amortiguan la turgencia celular previniendo cambios bruscos de solutos. Sin embargo, la inyeccin de material a travs de capilares de alrededor de 0,1 m de dimetro requiere de alta presin para superar la resistencia al penetrar la clula. En tal sentido, las formas convencionales de ejercer presin resultan insuficientes debido a que no producen la presin adecuada o no permiten un control preciso sobre la extrusin de la muestra. En la transparencia 98 se muestra el diagrama de una femtojeringa (figura C) que permite introducir muestras del orden de femtolitros en clulas y organelas con un mnimo dao. El mtodo de microinyeccin que utiliza esta microjeringa se basa en la expansin inducida por calor de un metal lquido (galistn: galio, indio y estao) dentro de la pipeta para forzar la muestra desde la punta microcapilar y es adecuado para la transferencia de fluorocromos y construcciones de ADN en cianobacterias y organelas subcelulares. En la figura D se observa el sostn y calentador con la bomba y la resistencia que genera la energa necesaria para expandir el metal. Tambin se observan dos fotos (figura A y B) donde se compara una punta de pipeta convencional con la punta de la femtojeringa. Finalmente, y a modo de ejemplo de su uso y resultados, se presentan fotos con imgenes de microscopa confocal de Lucifer yellow inyectada en una cianobacteria, en cloroplastos de Vicia faba y en el ncleo de clulas de Xenopus distal. Biobalstica versus Agrobacterium tumefaciens? Transparencia 100 La transformacin gentica de plantas se remonta a principios de los aos 80, dcada en que se demostr la capacidad del Agrobacterium para transferir ADN a clulas vegetales. Durante las dcadas siguientes, se realizaron avances significativos en mejorar los sistemas basados en Agrobacterium, as como en desarrollar nuevos mtodos que permitieron la transferencia directa de ADN. Entre estos ltimos, se incluyen mtodos como el bombardeo de micropartculas (biobalstica), la permeabilizacin de membranas celulares por corrientes elctricas (electroporacin) y/o por tratamientos qumicos con policationes (PEG, PVP) o fusgenos lipdicos, la abrasin con fibras de carburo de silicio y la microinyeccin. Si bien varios de los sistemas de transferencia directa han resultado en aplicaciones exitosas, el bombardeo de micropartculas es actualmente el ms ampliamente utilizado. Por otra parte, aunque existen muchos reportes sobre el uso de virus como vectores, Agrobacterium resulta el vector biolgico ms usado para la transformacin vegetal. La biobalstica fue desarrollada como una alternativa para resolver la ausencia de interaccin entre muchas especies vegetales y las distintas cepas de Agrobacterium. Sin embargo, desde la dcada del 90, el uso de cepas supervirulentas de la bacteria ha permitido la obtencin de plantas transgnicas en especies que hasta ese momento no eran susceptibles a Agrobacterium y que, por el contrario, haban podido ser transformadas por biobalstica. Por su parte, el uso de los caones gnicos est limitado por la capacidad regenerativa de las clulas bombardeadas y por la integracin estable del ADN. Adems, la biobalstica ha evidenciado una alta frecuencia de integracin de secuencias re-arregladas y/o truncadas, como tambin la insercin de mltiples copias del transgn, lo que redunda en una alta probabilidad de ocurrencia de silenciamiento gnico. Por el contrario, el Agrobacterium produce

generalmente integraciones que involucran a una o a pocas copias del transgn. Este aspecto ha determinado que, siempre que sea posible, la mayora de los investigadores prefieran la tcnica basada en Agrobacterium. Sin embargo, deben considerarse tambin las crecientes evidencias que muestran que la insercin del ADN por la bacteria no es tan definida como se crea anteriormente. En este sentido, se ha hallado que secuencias de ADN ubicadas fuera de los bordes de la regin T de Agrobacterium pueden integrarse tambin en el genoma de la planta receptora. Adems, la persistencia de Agrobacterium en los tejidos de las plantas regeneradas es otro problema que an resta resolver y que tiene implicancias sobre aspectos de bioseguridad. Por estas razones, aunque existe una tendencia a elegir el mtodo de Agrobacterium para transformar plantas, tanto ste como la biobalstica seguirn constituyendo sistemas complementarios durante muchos aos.