Normas de bioseguridad y manejo de microorganismos

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD
Principios Generales
1. La seal internacional de riesgo biolgico debe colocarse en las puertas de los locales en donde se manipulan microorganismos del Grupo de Riesgo 2,3,4. En la zona de trabajo del laboratorio o Aula de Prcticas no se permitir al personal: comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicar cosmticos. No se permitir pipetear con la boca. Habr que mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que no tenga ninguna relacin con el trabajo. Las superficies del trabajo se decontaminarn al terminar la prctica y en caso de derramamiento de sustancias potencialmente peligrosas. El personal de laboratorio y/o alumnos se lavarn las manos despus de haber manipulado material infeccioso, as como al abandonar el laboratorio. Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se reduzca al mnimo la formacin de aerosoles. En el laboratorio se utilizarn: mandiles, batas, uniformes u otras prendas apropiadas, esta ropa no se llevar fuera del laboratorio. Habr que utilizar guantes en todos los trabajos con riesgo de contaminacin directa con la sangre, material infeccioso o materiales infectados.
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10. Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales o potenciales a material infeccioso se notificarn inmediatamente al profesor.
Recomendacin para el Manejo del Microscopio

En Microbiologa el manejo del microscopio es de gran ayuda para el reconocimiento de los microorganismos, por lo que es necesario conocer su correcto manejo. Las preparaciones coloreadas necesitan el uso de objetivos de inmersin, en las cuales se utiliza aceite de cedro en la interfase objetivo-portaobjetos, el condensador prximo a la platilla y el diafragma abierto para pemitir una buena iluminacin. Antes y despus de su uso limpie los objetivos con papel para lentes.
Cmo manipular los Cultivos y el Material Contaminado

Siempre trabajar cerca de la llama de un mechero de gas o alcohol. Nunca dejar tubos ni placas destapadas.
Gua de Prcticas de Microbiologa Mdica 2011
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Colocar las placas Petri en posicin invertida para evitar que caiga el agua de condensacin la cual puede estar contaminada. Mantener los tubos en posicin vertical para evitar que se mojen los tapones. Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y despus de efectuarse el trabajo. No dejar la tapa del tubo sobre la mesa. Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se contaminen. Esterilizar las asas de alambre antes e inmediatamente despus de usarlas. Si se ha empleado para trabajar un material que crepita como el caso del esputo, previamente al flameado introducir el asa en un frasquito de vidrio que contenga arena y alcohol. Nunca dejar las asas sobre la mesa de trabajo sino en frascos especiales y en posicin vertical con el alambre hacia arriba. Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo bacteriolgico stas vienen estriles y envueltas en papel. Manipularlas exclusivamente por su extremo posterior, desenvolvindolas en el momento de usarlas. No quitar el algodn que llevan, por ser un elemento de proteccin para el que la usa. Emplear tetinas para realizar la succin. No pipetear con la boca. Eliminar pipetas, lminas y todo el material contaminado en el bocal con solucin desinfectante. En caso de accidentes como, ruptura de una placa o un tubo con material infectante, contaminacin del mandil o de la mesa, etc., durante el trabajo, avisar inmediatamente al profesor.
Precauciones para realizar la Inoculacin de Animales

1. 2. Preparar el inculo con cuidado. Proteger la aguja con su propio tubo antes de hacer la inoculacin, para que no se disperse el material. Tener cuidado de no lastimarse con la aguja. Eliminar inmediatamente el material de inoculacin al desinfectante. Colocar al animal inoculado, debidamente identificado en una jaula y llevarlo al bioterio con sus respectivos alimentos, observar la evolucin del animal y registrar los datos.
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Precauciones para realizar la Autopsia de los Animales

1. 2. 3. Usar guantes. Colocar sobre la mesa papel Kraft impregnado en desinfectante. Hacer la menor cantidad de manipulaciones posibles, cuidando de no herirse con el material de la autopsia, el cual debe mantenerse en todo momento dentro de un recipiente con desinfectante. Terminado el trabajo, envolver en el papel Kraft al animal autopsiado con todos sus detritus y entregarlo para ser incinerado. Colocar los guantes y material quirrgico en una bandeja con desinfectante.
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Como terminar el Trabajo de Prctica

1. Todos los cultivos que se incuben deben tener las siguientes anotaciones: nombres e iniciales de los estudiantes, nombre del germen y nmero de mesa, sala y fecha de siembra. En caso de las placas, todas deben ser invertidas a menos que sean dadas instrucciones contrarias por el profesor. 2. Los tubos deben estar bien tapados y colocados en canastas con gradillas de metal. 3.- Los alumnos se responsabilizarn de colocar estos cultivos en estufas a 37 C.
Terminada la prctica: al finalizar el trabajo

1. 2. 3. 4. Limpiar la mesa de trabajo con algodn embebido en desinfectante. Comprobar que las llaves del gas estn cerradas. Lavarse prolijamente las manos con jabn carblico. El protocolo de cada prctica deber ser controlado por el profesor al final de ella.
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Bacteriologa General
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BACTERIOLOGA GENERAL
Microbiologa
Es el estudio de los organismos microscpicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeo), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscpica. Los microorganismos son diminutos seres vivos que individualmente son demasiado pequeos como para verlos a simple vista. En este grupo se incluyen las bacterias, hongos (levaduras y hongos filamentosos), virus, protozoos y algas microscpicas. Normalmente tendemos a asociar estos pequeos organismos con infecciones, enfermedades como el SIDA, o con el deterioro de alimentos. Sin embargo, la mayora de los microorganismos contribuyen de una forma crucial en el bienestar de la Tierra ayudando a mantener el equilibrio de los organismos vivos y productos qumicos en nuestro medio ambiente: Los microorganismos de agua dulce y salada son la base de la cadena alimentaria en ocanos, lagos y ros; los microorganismos del suelo destruyen los productos de desecho e incorporan el gas nitrgeno del aire en compuestos orgnicos, as como reciclan los productos qumicos en el suelo, agua y aire; ciertas bacterias y algas juegan un papel importante en la fotosntesis, algunos animales dependen de las bacterias que habitan en sus intestinos para realizar la digestin y sntesis de algunas vitaminas como son la K y algunas del complejo B.
Primeras observaciones de los microorganismos (Leeuwenhoek y sus microscopios)

La existencia de los microorganismos no se conoci hasta la invencin del microscopio. La primera persona en describir los microorganismos en detalle fue el holands Antony Van Leeuwenhoek en 1684, a los cuales denomin animculos. Leeuwenhoek examin el agua de lluvia, de mar, de ro, saliva y otras materias.
La fermentacin como proceso biolgico (Pasteur y el vino francs)

Sin duda desde la Prehistoria los hombres utilizan con provecho las fermentaciones. El pan fermentado se conoce desde hace varios miles de aos. Los jeroglficos egipcios, as como representaciones grficas en todo el Prximo Oriente atestiguan que el hombre recurra a la fermentacin para fabricar bebidas alcohlicas ya varios milenios antes de Jesucristo. Al preparar el pan, vino, cerveza o sake, los egipcios, sumerios y todas las personas hasta mediados del Siglo XIX, empleaban sin saberlo, y de una manera emprica, una familia de agentes biolgicos muy originales: las levaduras. Son ellas las que realizan la fermentacin alcohlica. El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teoras cientficas de esa poca reconocan la presencia de levaduras en la fermentacin alcohlica, pero estas levaduras eran consideradas como compuestos qumicos complejos, sin vida. Esta era la teora mecanstica liderada por los qumicos alemanes von Liebig y Whler. Luis Pasteur, qumico francs, propuso la teora vitalstica y demostr que las clulas viables de levaduras causan fermentacin en condiciones anaerbicas; durante dicha fermentacin el azcar presente en el mosto es convertido principalmente en etanol y CO2. Sus ilustraciones claramente muestran autnticas levaduras vnicas y en sus escritos l las diferenciaba claramente de otros componentes. En 1866, Pasteur public la obra titulada "Estudios sobre el vino, sus enfermedades, causas que las provocan. Nuevos procedimientos para la conservacin y envejecimiento". Entre las mejoras aconsejadas haba un mtodo para aumentar la calidad de la conservacin de los vinos consistente en calentarlos a una temperatura de 68 C durante 10 minutos y despus enfriarlos rpidamente. Esta tcnica ha venido a ser conocida como pasteurizacin y es ahora ampliamente utilizada en el tratamiento de la leche.
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UNFV FMHU Descubrimiento de la funcin de los microorganismos como causantes de enfermedades (Koch y la bacteria del carbunco)
Ya en 1546 Girolano Fracastoro haba sugerido que las enfermedades podan deberse a organismos tan pequeos que no podan verse y que eran transmitidos de una persona a otra. Sin embargo, el descubrimiento de que las bacterias pueden actuar como agentes especficos de las enfermedades infecciosas en los animales fue realizado a travs del estudio del carbunco, infeccin grave de los animales domsticos que es transmisible al hombre. La demostracin concluyente de la causa bacteriana o etiologa del carbunco la proporcion en 1876 Robert Koch, un mdico rural alemn. Koch empez a estudiar el mundo microbiano despus de que su mujer le regalara por su 28 cumpleaos un microscopio. Seis aos despus Koch anunci al mundo que haba encontrado la bacteria del carbunco (Bacillus anthracis). Posteriormente l y sus colaboradores descubrieron las bacterias que causan la tuberculosis y el clera. Esta serie de experimentos se ajustaban a los criterios necesarios para poder establecer la relacin causal entre un organismo especfico y una enfermedad especfica. Estos criterios se conocen como los postulados de Koch: El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad. El microorganismo debe ser aislado del hospedador enfermo y obtenerse en cultivo puro en el laboratorio. La enfermedad especfica debe reproducirse cuando un cultivo puro del microorganismo se inocula a un hospedador susceptible sano. El microorganismo debe ser recuperable de nuevo a partir del hospedador inyectado experimentalmente. El descubrimiento posterior de los virus (Dimitri Ivanovski en 1892; el virus del mosaico del tabaco pasaba los filtros que retenan a las bacterias), agentes que no crecen en medios artificiales en el laboratorio como lo hacen las bacterias, han permitido realizar algunas modificaciones en los postulados de Koch. Este trabajo sobre el carbunco condujo rpidamente a la edad de oro de la bacteriologa. En 25 aos la mayora de los agentes bacterianos de las principales enfermedades humanas haban sido descubiertos y descritos.
Bacterias
Las bacterias o eubacterias son microorganismos unicelulares que pertenecen al dominio Bacteria. Los miembros de este dominio tienen diferencias con aquellos pertenecientes a los otros dos dominios, Archaea y Eukarya. En la Tierra, existen slo dos tipos bsicos de clulas que son estructuralmente muy diferentes: las procariontes y las eucariontes. Las bacterias son clulas procariontes. Estas clulas poseen un nico cromosoma desnudo, es decir, que este cromosoma no se halla envuelto por una membrana nuclear sino que se halla en el citoplasma. Algunos investigadores se refieren a este cromosoma desnudo como nucleoide o ncleo primitivo. Otra de las caractersticas principales de las clulas procariontes es que no poseen organelas rodeadas por membranas como retculos endoplsmicos, mitocondrias, aparato de Golgi o lisosomas.
Clasificacin de las bacterias
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Bacterias gram negativas de importancia en medicina Forma de la clula Familia Gnero Cocos Neisseriaceae Neisseria Branhamella Acinetobacter Kingella Moraxella Veillonellaceae Veillonella (an) Bacilos Enterobacteriaceae Escherichia Edwardsiella Citrobacter Salmonella Shigella Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Providencia Morganella Yersinia Vibrio Aeromonas Plesiomonas Campylobacter Pseudomonas Xanthomonas Pasteurella Haemophilus Actinobacillus Brucella Bordetella Francisella Cardiobacterium Streptobacillus Spririllum Bacilo del araazo de gato Legionella Bacteroides (an) Fusobacterium (an)
Vibronaceae
Spirillaceae Pseudomonadaceae Pasteurellaceae
Otros
Legionellaceae Bacteroidaceae
(an)
Anaerobio
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Bacterias gram positivas de importancia en medicina

Forma de la clula Coco Familia Micrococcaceae Streptococcaceae Otros Gnero Staphylococcus () Micrococcus () Streptococcus () Enterococcus () Peptostreptococcus (an) Peptococcus Aerococcus () Bacillus () Clostridium (an) Propionibacterium (an) Eubacterium (an) Corynebacterium () Lactobacillus (an) Listeria Eryspelothrix Actinomyces (an) Bifidobacterium (an) Nocardia () Micobacteria ()
Bacilos
Bacillaceae Propionibacteriaceae
Lactobacillaceae Afiliacin incierta Actinomycetaceae Nocardiaceae Micobacteriaceae
(an) ( ) () ( )
Anaerobio Catalasa-positivos. Catalasa-negativos. Con cidos micolicos en pared celular.
Otras bacterias de inters em medicina

Familia u orden Espiroquetas Gnero Treponema Borrelia Leptospira Chlamydia Mycoplasma Ureaplasma Rickettsia Coxiella Rochalimaea Ehrlichia
Chlamydiaceae Mycoplasmataceae Rickettsiaceae
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PRCTICA
Reconocimiento de los tres ambientes del laboratorio de Microbiologa y Parasitologa. Uso del microscopio. Bioseguridad
I. USO DEL MICROSCOPIO
Objetivo: Familiarizar al estudiante con el uso del microscopio. 1. Material 2 lminas portaobjetos 2 lminas cubreobjetos 1 asa de Kolle 1 mechero de Bunsen Solucin salina Microscopio ptico
2. Procedimiento Con el asa de Kolle esterilizada a la llama, tome una muestra de trtaro dentario. Deposite sobre una lmina portaobjeto una gota de solucin salina y coloque sobre ella la muestra obtenida. Cubrir con una laminilla cubreobjetos. Observar al microscopio a menor, mediano y mayor aumento. Observar al microscopio de campo oscuro. Dibuje y anote en su cuaderno de trabajo lo observado.
II. MATERIAL QUE SE USA EN MICROBIOLOGA

Objetivo: Conocer el material de uso comn en el laboratorio microbiolgico.
1. Medios de Cultivo e Insumo Qumicos: Frascos de medios de cultivo, especficos para diferentes organismos. Insumos qumicos: H2SO4, HCI, KOH, HCI, etc. 2. Material de Vidrio, Plstico y Porcelana: Vidrio: Pipetas graduadas y volumtricas Pipetas Pasteur Tubos de ensayo de diversos tamaos y marcas. Tubos de centrifugadora. Placas Petri de 9 x 12 cm. de dimetro (Pyrex) Campanas de Durhan para demostracin de gas en cultivos lquidos. Frascos, matraces, Kitasatos, Erlenmeyer, viales, gotero, embudos. Buretas. Probetas de diferentes graduaciones. Fiolas. Porta objeto y cubre objetos. Porcelana: Morteros Plstico: Embudos 3. Aparatos de Uso Microbiolgico:
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Autoclave Horno elctrico Incubadoras Centrifugadoras Bao Mara Refrigeradora Microscopios monoculares y binoculares Destiladores Balanzas de Precisin
4. Otros Aparatos: Gradillas de madera o aluminio Soporte y trpodes Portapipetas y portaplacas de metal Filtro de diversos tipos Mecheros de Bunsen Rejillas de amianto Asa de Kolle, esptula de Digralsky, pinzas de madera y metal Papel indicador de pH Algodn, alcohol, lpiz de cera, soluciones coloreadas y qumicas Medios de cultivo, reactivos, colorantes, indicadores. 5. Uso de Indicadores y Amortiguadores: Los cambios de los nutrientes durante el metabolismo bacteriano producen metabolitos que alteran el pH del medio del cultivo. Existen sustancias que evidencian dichos cambios con el viraje de su color: indicadores (rojo fenol, rojo neutro, etc.) Durante la preparacin de los medio de cultivos es importante observar el pH final pues es requerimiento esencial es obtener un pH indicando para el crecimiento bacteriano. Esto se logra utilizando las sustancias buffer. HCl o KOH (Amortiguadores).
III. CUESTIONARIO
1.-Con qu finalidad se utiliza la solucin salina o suero fisiolgico? 2.-Qu es agar? 3.-Diga en que momento se requiere el uso de los indicadores y amortiguadores?
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UNFV FMHU Partes del Microscopio
Morfologa esquemtica de las bacterias
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PRCTICA
Presencia de microorganismos en el medio ambiente. Tcnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las tcnicas aspticamente. Cultivo de organismos anaerobios.
Objetivos: Familiarizar al alumno con el uso adecuado del material microbiolgico y adiestrarlo en la prctica de las tcnicas de cultivo y aislamiento bacteriano. Reconocimiento de la diversidad de microorganismos existentes en el medio ambiente.
I. EXPERIMENTO N 1:
Presencia de microorganismos en el medio ambiente 1. Material : 1 Placa Petri con Agar Nutritivo 1 Placa Petri con Agar Sangre Suero salino Asa de Kolle, lpiz de vidrio, mechero de Bunsen, lmina portaobjetos. Procedimiento: Tome la placa con agar nutritivo y con el lpiz de vidrio trace sobre su superficie posterior dos lneas perpendiculares que lo dividen en cuatro cuadrantes. Numrelos del 1 al 4. Con el Asa de Kolle estril(llameado) tome una muestra de agua de cao y con ella dibuje estras sobre la superficie de medio de cultivo en el sector 1. Cierre la placa y flamee el asa de Kolle. Repita el procedimiento tomando muestra de saliva, agua procedente del piso del laboratorio de la piel del alumno sembrando en los sectores 2, 3 y 4 respectivamente. Tome la placa de Agar Sangre y tosa sobre l. Incube ambas placas en la estufa a 37 C por 24 h.
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II. EXPERIMENTO N2:

Tcnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las tcnicas spticamente. 1. Material: 1 Placa Petri Estril con Agar Nutritivo 1 Placa Petri No Estril con Agar Nutritivo. 2 Tubos de prueba con caldo Nutritivo 1 Pipeta estril de 1 ml. 1 Tubo con caldo de cultivo mixto de bacterias
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2. 1 Asa de Kolle Procedimiento: Aislamiento por mtodo de sembrado de estras. a) Estra Simple b) Estra por Agotamiento Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con el asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo mixto y dibuje, estras sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estril con agar nutritivo, como en el esquema. Esquemas:
Estra Simple
Estra por Agotamiento
Marque la placa con lpiz de vidrio y lleve a la estufa a 37C por 24 h. Tome la placa Petri no estril y mrquela en su parte posterior colocando No estril, llvela a la estufa a 37C por 24h. Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estril transfiera 1 ml de caldo de un tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos y llvelos a la estufa a 37C por 24 a 48 h.
III. EXPERIMENTO N 3:
Cultivo de Organismos Anaerobios. 1. Material : 2 Tubos con Agar Nutritivos vertical 2 Tubos con Agar Nutritivos inclinado 2 Tubos con Caldo de Tioglicolato o caldo carne Campaa de Durham o Jarra Gaspack Cepas de Clostridium sporgenos y Bacillus subtilis Procedimiento: Siembre cada cepa en uno de cada par de tubos, por puntura en el agar vertical, por estra en el inclinado y asada en el caldo. Tapone los tubos y lleve a la Campaa de Durham. Incube a 37C por 24 h.
2.
IV. CUESTIONARIO
1.- Interprete los resultados obtenidos en cada uno de los medios de cultivo utilizados.
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Inoculacin de placas de cultivo para el aislamiento de colonias bacterianas
Tcnica de inoculacin de medios para recuentos semicuantitativos de colonias bacterianas.
Inoculacin de un tubo con caldo. A. Inclinar el tubo e inocular en el sitio indicado. De este modo el sitio de inoculacin queda sumergido bajo la superficie.
La inoculacin de un pico de agar se realiza mediante un alambre recto. A. Atravesar con el alambre el agar en profundidad. B. Retirar el alambre y estriar la superficie del agar con un movimiento en S.
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UNFV FMHU Algunas caractersticas de las colonias bacterianas
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Clasificacin de los Medios de Cultivo

1. Segn su estado fsico 2. Lquidos: Llamado caldo, libre de agar que contiene productos orgnicos. Slidos: Derivan de los lquidos, aadiendo un coloide en estado de gel y este le da la solidez. Es usado en Placa Petri. Semislidos: Contiene menos del 1% del agar.
Segn su composicin Empricos: Son aquellos preparados a partir de sustancias naturales, cuya naturaleza qumica se desconoce. Sintticos: Sus preparados son disoluciones de diversas sustancias qumicas conocidas. Semisintticas: Es una mezcla de los anteriores.
3.
Por su composicin Comunes: Su finalidad es el crecimiento de microorganismos poco exigentes. Ejm: Caldo comn, agar simple. Enriquecidos: Son los medios comunes a los que aade un suplemento nutritivo, para el crecimiento y desarrollo de bacterias exigentes. Ejm: Agar sangre, agar pata glucosa. Selectivos: Permiten seleccionar un tipo y este se consigue alterando las condiciones fsicas y qumicas del medio. Pueden ser: o Por cambio de ph. Favorece a los lactobacillus. o Por cambios de temperatura. Favorece S. Faecalis. o Por altas [ ] osmticas. Como el staphylococus. o Con antispticos. Ejm: el medio Salmonella Shigella. Con antibiticos. Ejm: Candida albicans. Diferenciales: Permiten distinguir a simple vista dos o mas tipos de bacteria en funcin a su comportamiento sobre el medio. A su vez pueden ser simples o combinados. De transporte: Utilizado para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento de la toma hasta su siembra en el laboratorio. Ejm. El medio de transporte de Amies.
Medio de Cultivo
Un medio de cultivo es una solucin acuosa (como tal o incorporado a un gel) en la que estn incorporados todas las sustancias necesarias para el crecimiento y multiplicacin de microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas u hongos, para luego proceder a su identificacin y llevar a cabo una serie de estudios complementarios.
Siembra, aislamiento y transplante de bacterias

Siembra es el procedimiento por el cual se acondiciona al microorganismo a un medio de cultivo frtil para que este pueda desarrollarse. Aislamiento es la tcnica que separa microorganismos al estado de pureza y para ello se requiere un medio slido. Transplante significa la separacin de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, logrndose conocer las propiedades bioqumicas y su identificacin.
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PRCTICA
Metabolismo Bacteriano. Enzimas de los microorganismos. Fermentacin bacteriana.

I. EXPERIMENTO N 1:
Hidrlisis del Almidn
Objetivo: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen exoenzimas y que atacan substratos importantes como Carbohidratos y Protenas. El almidn es un polmero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. Tambin puede ser hidrolizado por los Acidos Minerales. ALFA AMILASA + ALMIDON = DEXTRINA + ALFA MALTOSA BETA AMILASA + ALMIDON = ALFA MALTOSA Las Amilasas son enzimas extracelulares 1. Materiales: Solucin de Yodo (Lugol) Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli. 1 Placa de Agar Almidn Procedimiento: Dividir en dos sectores la placa de Agar almidn Inocular en estras cada sector con las capas de B. subtilis y E. coli. Incubarlo a 37C por 24 h.
2.
Se comprueba la Hidrlisis aadiendo unas gotas de Lugol. La ausencia de color azul indica Hidrlisis total del Almidn. El color pardo puede indicar Hidrlisis Parcial del Almidn. Nota: Este experimento tambin se puede realizar el tubo de Agar-Almidn.
II. EXPERIMENTO N 2:
Hidrlisis de la Gelatina La gelatina es una protena dotada de la propiedad de tomar GEL cuando se disuelve en agua caliente Por tratarse de una protena puede ser atacada por alguna bacterias que la priven de su propiedad gelitificante. La hidrlisis de la gelatina es una reaccin enzimtica y se conoce por GELATINASA la enzima causante de esta transformacin. 1. Materiales: Cepas de S. Aureus, B. subtilis y E. coli. Tres tubos de Gelatina Nutriente estril Asa de Kolle en aguja
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2.
Procedimiento: Inocule cada uno de los organismos en un tubo de Gelatina Nutriente por puntura hasta el fondo del tubo, una sola vez. Incube a temperatura ambiente por 2 a 7 das, no en incubadora porque derrite la gelatina.
Lectura: Observar los tubos donde la gelatina no est gelificada.
Produccin de Hemolisinas Objetivo: Conocer y estudiar las exoenzimas que tienen efectos destructivos sobre los glbulos rojos. 1. Hemolisina Beta: Destruye y decolora la Hemoglobina. Esto se observa como reas claras alrededor de la colonia. Hemolisina Alfa: No decolora la Hemoglobina, pero la cambia a un color verdoso. (Biliverdina) Materiales: Cepa de Staphylococcus aureus (o B. subtilis) y Streptococcus pneumonias o Streptococo Lact. Agar sangre (1 2) Procedimiento: Dividir en dos placas petri. Inocular en estras las cepas en cada uno de los lados. Incubar a 37 C por 24-48 h. Observar si ha habido hemlisis
2.
IV. EXPERIMENTO N 4:
Demostracin de la Produccin de Coagulasa N. La Coagulasa es una exoenzima elaborada por el Staphylococcus aureus y que coagula el plasma humano o de cobayo. 1. Materiales: Cepa de S. Aureus Plasma humano o de cobayo citratados en tubo. Procedimiento: Tomar una azada de la cepa e inocular en el tubo que contiene el plasma citratado. Incubar por 2-3 horas. Revisar cada 30 el tubo para ver si han empezado a formar cogulos. Para esto incline el tubo para ver que tan lquido est el plasma.
2.
V. EXPERIMENTO N 5:
Fermentacin de Carbohidratos
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Fermentacin se refiere a la degradacin anaerbica de los carbohidratos. La capacidad para fermentar los carbohidratos depende de las enzimas que contenga cada bacteria. La degradacin de los carbohidratos conduce a la formacin de productos lcteos, por lo tanto se utilizar un indicador de ph: Rojo Fenol. En la prctica se utilizar el medio TSI en tubo. Si la bacteria no tiene las enzimas necesarias para atacar los carbohidratos, no cambiar el ph. La prueba contendr lo siguiente: Agar TSI (3 azcares y hierro) favorece el desarrollo de la mayora de bacterias. Azcares qumicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa. Un indicador de ph. NC A AG b no cambio de ph cido cido y gas bsico
Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energa necesaria la obtiene la bacteria de protenas y su producto final es gas amoniaco. 1. Materiales: Cultivo de Escherichia coli , Alcaligenes faecalis y Staphylococcus aureus 3 tubos con TSI en plano inclinado Procedimiento: Sembrar por estra y puntura: a) E. Coli TSI b) Alcaligenes TSI c) Staphylococcus TSI Incubar por 24 h. A 37C
2.
VI. EXPERIMENTO N 6:
Reduccin de Nitratos a Nitritos En la respiracin anaerbica, las bacterias utilizan al nitrato como aceptor final de H +, este fenmeno lo pueden realizar algunos grmenes aerobios, anaerobios, y anaerobios facultativos. Se observa al final de la reaccin la presencia de gas nitrgeno libre.
Nitrato de Potasio KNO3 2H + NO3 1. Materiales: Cultivo de E. coli, Pseudomona areuginosa Caldo nutritivo con nitrato 6cc. Sol. Dimetil - alfa - naftilamina Sol. de cido sulfanlico Tubos de pruebas estriles (3) Procedimiento: Tubo 1 2cc caldo de nitrato + E. coli Tubo 2 2cc caldo de nitrato + Pseudomona
Nitrato de Potasio H2O + NO2
2.
Tubo 3 2cc de caldo nitrato + Bacillus
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Incubar por 24 hrs. a 37C. Agregar a cada tubo 3 gotas de cido Sulfanilico y 2 gotas de alfanaftilamina Observa cambio de color, color rosado o rojo: Prueba positiva.
VII. EXPERIMIENTO N 7:
Reduccin de cido Sulfhdrico Cuando se realiza la fermentacin de las protenas se obtiene como producto el cido Sulfhdrico, ya que las protenas contienen aminocidos sulfurados. Algunas bacterias tienen enzimas que desprenden al cido de azufre de estos aminocidos, el cual es reducido con hidrgeno del substrato para formar cido sulfhdrico. Por lo tanto el azufre funciona como aceptor de H +. H2S + FeSO4 FeS (negro) + H2SO4
1.
Materiales: Cultivo de E. coli y Proteus vulgaris Tubos con TSI, con superficie inclinada (2) Procedimiento: Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. coli y Proteus respectivamente, por estra y puntura. Incubar a 37C por 24 hrs. Observar la formacin de FeS color negro.
2.
VIII. EXPERIMENTO N 8:
Demostracin de la produccin de Indol Algunas bacterias degradan el aminocido triptfano formando INDOL. 1. Materiales: Cultivo de E. coli y Bucillus subtilis Caldo Triptona 2 tubos con 3cc cada uno) Solucin de Kovacs Pipetas de 1cc Procedimiento: Inocular un tubo de caldo Triptona con E. coli y otro con Bacillus, Incubar a 37C por 24 horas. Agregar a cada tubo y en zona el reactivo de Kovacs. Si el Indol est presente, al agregar el reactivo de Kovac aparecer un color rojo cereza.
2.
IX. EXPERIMENTO N 9:
Deteccin de la Catalasa La Catalasa es una enzima que est relacionada con la capacidad de una bacteria para utilizar el oxgeno. La falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la causa de que el O2 les sea perjudicial. Cuando hay Oxgeno estos organismos lo emplean como aceptor final de Hidrgeno para formar Agua Oxigenada, pero sta no puede desdoblarse en H2O y O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria. Catalasa 2H2O2 Agua Oxigenada 2H2O + O2 (gas)
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1. Materiales: Cultivo de E. coli y Stafilococo aureus. Tubos con Triptosa Caldo (2) Agua Oxigenada 3.0% Procedimiento: Inocular en cada tubo una de las cepas Incubar a 37C por 24 hrs. Cubrir la superficie del caldo con Agua Oxigenada y observar la presencia de burbujas en el tubo donde hay catalasa.
2.
X. EXPERIMENTO N 10:
Reduccin de Azul de Metileno Se trata de demostrar la oxidacin en los procesos fermentativos, realizada por los grmenes anaerbicos, llamada oxidacin anaerbica, donde el sustrato cede un H +, para lo cual se necesitan aceptores de H +, el azul de metileno acta como aceptor. Azul de Metileno + 2H (azul) Reduccin del azul de Metileno. 1. Materiales: Cultivo de E. coli 7.5cc. Tubo de Prueba (3) Pipetas estriles Azul de Metileno de Loeffer Caldo nutritivo 7.5cc Procedimiento: Rotular los tubos con 1,2,3. Tubo 1 4cc cultivo 1cc de caldo Tubo 2 2.5 cultivo 2.5 caldo Tubo3 1cc. cultivo 4cc de caldo Azul de etileno - 2 H (Incoloro)
2.
Mezclar y agregar 1 gota de azul de Metileno a cada tubo. Incubar a 37C. Observar cada 10 minutos hasta los 20 minutos y anotar los cambios de color.
XI. CUESTIONARIO
1.- Fundamente los resultados obtenidos en cada experimento.
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Esquema general del metabolismo bacteriano
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PRCTICA
Determinacin de los requerimientos mnimos para el crecimiento bacteriano. Medios de cultivos selectivos y diferenciales.
I. EXPERIMENTO N 1
Objetivo: Conocer los diferentes nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano. 1. Materiales: Ingredientes necesarios para la preparacin de diferentes medios de cultivo. a) Unicamente Agar (lavado y purificado antes de disolverlo) b) Agar + Minerales (NH4 H2 PO4; Mg SO4; KCl) c) Agar + Minerales + Glucosa d) Agar + Minerales + Glucosa + Fuente de Nitrgeno Orgnico (Peptona) 4 placas Petri estriles.conteniendo los medios de cultivo de a,b,c,y d. Cultivo Escherichia coli. Stafilococcus aureus y candida albicans.
2.
Procedimiento: Con un lpiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placa petri para dividirlo en cuatro sectores y enumera cada sector. Inocule los sectores correspondientes de cada placa con uno de los tres organismos. Deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Vierta las placas, incbelas a 38C por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores inoculados.
Pregunta: Qu interpretaciones puede hacer respecto a la habilidad de los distintos organismos para proliferar en los distintos medios usados? Recomendacin: Es de esperarse que el estudiante examine las frmulas de los distintos medios y analice el contenido de cada medio con respecto a las fuentes de Nitrgeno, energa y factores necesarios para crecimiento bacteriano.
II. EXPERIMIENTO N 2:
Medios selectivos y diferenciales Objetivo: Conocer los diferentes medios de cultivo, que permitan el aislamiento e identificacin de bacterias. 1. Materiales: Agar nutriente Porcin de Agar-Cloruro de sodio Porcin de rojo fenol-Agar Cultivo de Staphylococcus epidermidis y Alcaligenes
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2. Procedimiento: Con el lpiz de cera dividida cada placa en tres sectores: el primero etiqutelo Alcaligenes faecalis el segundo S. Epidermidis y el tercero djelo sin rotular. Use el asa de kolle para sembrar en estras cada sector de la placa con el cultivo correspondiente. Invierta las placas Petri e incbelas por 24 horas a 37C.
Considerando los resultado obtenido Cul de los tres medios empleados es selectivo y cual es diferencial? Fundamente su respuesta.
Ciclo de crecimiento
1. 2. 3. 4.
Fase de Latencia: Es la fase de adaptacin al medio, existe aumento de la masa celular pero no hay aumento en el nmero de clulas. Fase de Crecimiento Exponencial: Es la fase donde se produce un incremento exponencial del nmero de microorganismos. Fase Estacionaria: Es la fase a la que se llega cuando se ha agotado la fuente de energa. Fase de Muerte: Es la fase que se caracteriza por una disminucin exponencial del nmero de microorganismos.
PLACA PETRI La placa petri es un instrumento muy usado en microbiologa, compuesta de dos cristalizadores y se emplea para el cultivo y aislamiento de microorganismos. La tapa puede ser remplazada por porcelana para evitar cmulo de agua de condensacin.
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PRCTICA
Citologa de los microorganismos. Preparacin del frotis y fijado. Tincin simple. Tincin diferencial: coloracin gram, cido alcohol resistentes. Tincin negativa. Demostracin de los grnulos metacromticos.
Objetivos: Estudio de las caractersticas morfolgicas y estructurales de los microorganismos mediante el microscopio y utilizando las diferentes tcnicas de tincin.
I. PREPARACIN DE FROTIS Y FIJADO

Preparar una lmina portaobjeto lavndola con agua y jabn, luego secar. Colocar una gota de solucin salina al centro de la lmina portaobjeto y diluir en ella la muestra a observar rotndola hasta obtener una pelcula delgada y homognea (si la muestra es lquida, no necesita diluirse). Dejar secar al aire o suavemente a la llama. Fijado. El medio ms usado para la fijacin es el calor, tambin se puede usar alcohol, ter, formol y otros.
II. TINCIN SIMPLE

Llamada as por la utilizacin de un solo colorante. Ejemplo la coloracin con azul de metileno de Loeftler. 1. Materiales: Lmina portaobjetos. Asa de Kolle. Solucin Salina. Caldo de cultivo, cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli. Colorante azul de metileno. Procedimiento: Frotis y Fijado de la muestra con alcohol Cubrir la muestra con azul de metileno. Deja reaccionar por cinco minutos. Lavar con agua de cao Secar y observar al microscopio.
2.
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UNFV FMHU III. TINCIN DIFERENCIAL

Se denomina Coloracin Diferencial cuando se emplean dos o ms reactivos. La ms empleada en la bacteriologa es la coloracin Gram y la coloracin para bacilos cido alcohol resistentes.
Coloracin Gram La tincin Gram se compone de cuatro reactivos diferentes: El Cristal Violeta que es el colorante bsico inicial que tie todas las bacterias, el segundo reactivo es el lugol que acta como mordiente (sustancia que aumenta la unin del colorante y el substrato). El tercer reactivo es el alcohol-acetona que acta como decolorante. Mucho microorganismos retienen el cristal violeta permaneciendo teidos y tomando el nombre de bacterias Gram positivas; otro grupo de mircroorganismos pierde el color fcilmente por accin del decolorante, al aadirse la safranina que es de color rojo, toman este segundo colorante, denominndose microorganismos Gram negativos. 1. Materiales: Solucin Cristal Violeta de Genciana Solucin de Lugol Alcohol Acetona Fucciana bsica o Safranina Lmina portaobjeto, Asa de Kolle, Solucin salina. Cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli. Procedimiento: Frotis y fijado de la muestra Cubrir la muestra con solucin de cristal violeta durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua de cao Cubrir la muestra con solucin de lugol durante 1 minuto Lavar con agua de cao Decolorar con alcohol-acetona hasta que el alcohol-acetona no arrastre color. Lavar con agua de cao. Colorear con safranina por 30 segundos Lavar, secar y observar
2.
Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersin (aceite). Las bacterias Gram positivas se tien de azul oscuro; las bacterias Gram negativas aparecen rojo rosadas.
Coloracin para bacilos cido-alcohol resistentes o coloracin Ziehl-Neelsen. Tincin cido-resistente se llama as a la naturaleza cida del agente decolorante, el cual es ms fuerte que la mezcla alcohol-acetona usada en el Gram. Estos microorganismos resisten la decoloracin debido a las sustancias lipdicas de su membrana. Ejemplo el M. tuberculosis, el M. leprae. 1. Material: Cultivo o esputo conteniendo m. tuberculosis. Colorante de Ziehl-Neelsen o fucsina fenicada Alcohol cido Azul de metileno de Loeffler Procedimiento: Despus de la fijacin, cubrir la muestra con Ziehl-Neelsen puro por 3 minutos y calentar por tres veces con un mechero del alcohol, hasta la emisin de humo cada vez. Decolorar con alcohol cido al tercio hasta que no arrastre color. Lavar con agua y teir con azul de metileno por 3 minutos. Lavar con agua, secar y observar. Los bacilos aparecen de rojo en un fondo azul.
2.
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UNFV FMHU IV. DEMOSTRACIN DE LOS GRNULOS METACROMTICOS.

Se trata de visualizar los grnulos metacromticos, llamados as debido al hecho de que algunos colorantes cambian de color en su presencia. 1. Material: Cultivo fresco de Corynebacterium. Colorante de Albert. Solucin yodada de Albert o de Gram. Procedimiento: Frotis y fijado de la muestra Cubrir el portaobjetos con el colorante de Albert de 3 a 5 minutos. Eliminar el colorante. Cubrir con lugol por 3 minutos. Lavar con agua corriente, secar.
2.
Se observa un citoplasma verde plido e incoloro y los grnulos metacromticos de color verde oscuro.
V. TINCIN NEGATIVA.
Para demostrar la imagen exacta de los microorganismos. En este caso no son los microorganismos los que tienen sino la superficie de vidrio sobre la cual se encuentran. Esta tcnica permite evaluar el tamao real de microorganismo observado, porque en sta no se aplica el tiempo al calor. 1. Materiales: Suspensin conteniendo Klebsiella neumoniae Tinta china o Nigrosina Procedimiento: Deposite dos asas llenas de la suspensin sobre un objeto limpio. Aadir una asada de tinta china y con movimientos rotatorios mezcla las 2 suspensiones, si la dilucin es correcta esta debe aparecer gris Dejar que la mezcla se seque al aire, no fije a la llama. Observe al microscopio comparando esta preparacin con el frotis de tincin siempre de azul de metileno.
2.
V. CUESTIONARIO
1.- Esquematizar las observaciones 2.- Explique el uso de: Alcohol-cido en la coloracin de Ziehl-Neelsen. Solucin de Lugol y Alcohol-Acetona en la coloracin Gram. 3.- Para qu se emple la Tincin Negativa o de Contraste?
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Etapas de la tincin Gram Resultados Pasos Mtodos Gram (+)

Colorante bsico Violeta de genciana Mordiente Decoloracin Contraste Lugol Alcohol de 95% o alcohol acetona Fucsnia o safranina Se tie de violeta Permanece violeta Permanece violeta Permanece violeta
Gram (-)
Se tie de violeta Permanece violeta Se decolora Se tie de rojo
Etapas de la tincin Zhiel-Neelsen

Resultados Pasos Mtodos Acido alcohol-resistente Se tie de rojo Permanece rojo Permanece rojo Permanece rojo No cido Alcohol-resistente Se tie de rojo Permanece rojo Se decolora Se tie de azul
Colorante bsico Mordiente Decoloracin Contraste
Fucsina Calor Alcohol-clorhdrico Azul de metileno
COLORACIN DE CPSULAS
La cpsula de bacterias no tiene la misma afinidad por los colorantes que los otros componentes celulares. De all que la cpsula se distingue por contraste, pues los dems componentes se tien. Otros producen una coloracin diferencial cuando la cpsula admite un colorante, por ejm. El mtodo de Muir y de Hiss.
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UNFV FMHU Tcnicas de tincin
Fundamentos
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
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Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
Bacteria Gram positiva

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del organismo.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.
Bacteria Gram negativa
Formas bsicas Morfologa bacteriana en una tincin GRAM

Cocos Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao
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forma esfrica: se llama Coco
Divisin a lo largo del mismo plano, formando cadenas cortas
Divisin a lo largo de 2 planos diferentes: Ttradas
Divisin a lo largo de 3 planos
2 cocos juntos: Diplococos
4 - 20 en cadenas: Estreptococos
regularmente: Sarcinas
irregularmente: Estafilococos
Bacilos Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos.
Forma de vara: se llaman Bacilos
Dos bacilos juntos: Diplobacilos
Cadenas de bacilos: Estreptobacilos
Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y
Espirales (Treponemas, Borrelias...)
Forma espiral rgida se llama: Espirilo
Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta
Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie.
Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas
Cocos Gram-positivos Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus
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Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B
Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp
Bacilos Gram-positivos Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum.
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Finos: forma tpica de Listeria sp
Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii
Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas Cocos Gram-negativos Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Grampositivo.
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Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Grampositivo o Gram-negativo, y, a menudo, Gram-variable.
Bacilos Gram-negativos Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli
Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae
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Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni
Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp
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PRCTICA
Evaluacin de antibiticos por el mtodo disco difusin.

I. EXPERIMENTO N1:
Evaluacin de antibiticos por el mtodo disco difusin. 1. Materiales: Cultivo de S. aureus, E. coli. Disco de antibiograma para gram + y gram -. Placas petri con agar nutritivo TSA. 2. Mechero, asa de kolle, hisopo estril.
Procedimiento: Sembrar con hisopo estril en la superficie de las placas cada sp. Aspticamente colocar con pinzas los discos de antibiograma en cada placa. Incubar por 24 hrs. a 37C y dibujar los resultados.
II. CUESTIONARIO
1.- Fundamente los resultados obtenidos.
Los cinco mecanismos bsicos del efecto antibitico

Inhibicin de la sntesis de la pared celular. Alteracin de la membrana celular. Inhibicin de la sntesis de los cidos nucleicos. Inhibicin de la sntesis de protenas. Actividad antimetablica o antagonismo competitivo.
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UNFV FMHU Clasificacin de los antimicrobianos por su mecanismo de accin

I. Antimicrobianos que actuan sobre la sintesis de la pared celular Antimicrobianos -lactmicos: (Penicilinas, Cefalosporinas, Monobactmicos, Carbapenems, Inhibidores de la -lactamasas) Antimicrobianos glucopptidos Bacitracina Fosfomicina
II. Antimicrobianos que actuan sobre la membrana citoplasmtica Polimixinas III. Antimicrobiano que inhiben la sistesis proteica Aminociclitoles: (Espectinomicina, Aminoglicosidos) Macrlidos Lincosamidas Tetraciclinas Anfenicoles Mupirocina Sinergistina
IV. Antimicrobianos que inhiben la sintesis de cidos nucleicos Fluoroquinolonas Rifamicinas Nitroimidazoles
V. Antimicrobianos que interfieren vias metablicas Sulfamidas Trimetoprima PAS Sulfonas
VI. Antimicrobianos inhibidores de cidos micolicos
El Antibiograma
Por qu realizar un antibiograma? El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infeccin a uno o varios antibiticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones teraputicas individuales. El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a escala de un servicio, un centro de atencin mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la antibioterapia emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los antibiticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevencin en los hospitales. Hay pues un doble inters: Teraputico y epidemiolgico. Cundo realizar un antibiograma? Siempre que una toma bacteriolgica de finalidad dagnstica haya permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infeccin. Establecer esta responsabilidad exige una colaboracin entre el bacterilogo y el clnico. En efecto, en ciertas circunstancias, el microbilogo no podr determinar con certeza que el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clnicos que le aporta el mdico. Por ejemplo, una bacteria no patgena puede ser responsable de la infeccin de un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del organismo. La presencia de signos clnicos puede ser tambin determinante para la realizacin de un antibiograma (por ejemplo: la infeccin urinaria con un nmero reducido de grmenes).
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Sensibilidad bacteriana a los antibiticos La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la base de la medida de la sensiblidad de una bacteria a un determinado antibitico. La CIM se define como la menor concentracin de una gama de diluciones de antibitico que provoca una inhibicin de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibitico frente a diferentes especies bacterianas. Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y mtodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes mtodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en funcin de su sensibilidad frente al antibitico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibitco. Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS: Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual. Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posologa).
Ciertas molculas son representativas de un grupo de antibiticos. Los resultados (S, I, R) obtenidos con estas molculas pueden ser ampliados a los antibiticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya y las restantes cefalosporinas de 1 generacin que no es necesario probar, ya que el resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina). Este hecho permite ensayar un nmero reducido de antibiticos, sin limitar por ello las posibilidades teraputicas. Interpretacin de un Antibiograma Certos mecanismos de resistencia se expresan dbilmente in vitro, cuando se inscriben en el DNA bacteriano. Su expresin en el organismo, en donde las condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondra al riesgo de fracaso teraputico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a travs de la comparacin de las respuestas para cada antibitico, un mecanismo de resistencia incluso dbilmente expresado. As, gracias a la interpretacin, una cepa que aparece como falsamente sensible ser categorizada como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella pneumoniae productora de BLSE puede aparecer sensible in vitro a las cefalospornas de 3" generacin. El resultado de Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya que la utilizacin de estos antibiticos correra el riesgo de provocar un fracaso teraputico).
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PRCTICA
Destruccin e inhibicin de microorganismos. Efecto de la concentracin de iones H+, PH. Efecto del calor. Accin oligodinmica de metales pesados.
I. EXPERIMENTO N 1:
Efecto de la Concentracin de iones H+
El pH de una solucin es el valor negativo del logaritmo en base 10 de su concentracin de iones hidrgeno en mol x lt. pH = - log H + Segn Bronsted y Lowry (1923), un cido se caracteriza por su tendencia a perder H+, mientras que una base se caracteriza por su tendencia a asociarse con H+. Por lo tanto, los cidos aportan con una concentracin determinada de H+. Aplicando la frmula encontraremos que a mayor concentracin de H +, menor pH (mayor acidez). El pH puede ejercer una accin bactericida segn la concentracin de hidrgenos y la especie de la bacteria sometida a dicho pH. 1. Materiales: Cepas de E.coli o Estafilococo en suspensin Reactivos: HCL 1.0N y NAOH 1.ON Medio de Cultivo: Caldo Peptonado. Procedimiento: Es tres tubos con caldo de cultivo estriles, realizar la siembra de E. coli en asadas. A cada tubo agregarle gota HCL 1.0N, NAOH 1.0 N hasta que en los tubos se obtengan los siguientes pH: 2 y 9 respectivamente. El tercer tubo servir de control. Volver a taponar los tubos e incubar a 37C por 24 hrs. Despus de este tiempo, leer por turbidez. Lectura: Tubo 1:
2.
Tubo 2:
Tubo 3:
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UNFV FMHU II. EXPERIMENTO 2:

Efecto del calor 1. Materiales: Cepas de E.coli o Estafilococo Equipo: Bao Mara y estufa Medios de cultivo: caldo peptonado Procedimiento: Empleando tres tubos de caldo peptonado, realizar la siembra de E.coli. Someter a dos de los tubos a la accin del calor por bao Mara, graduando en 40C y 100C por 10 minutos respectivamente. El tercer tubo no se somete a la accin del calor para que sirva de control. Retirar los tubos del bao Mara e incubar los tres tubos a 37C por 24 horas. Realizar la lectura por turbidez.
2.
Accin oligodinmica de los metales pesados. Las sales solubles de mercurio, arsnico, plata, cobre y otros metales pesados, alteran la actividad enzimtica formando mercptidos con grupos sulfhidrilo de residuos de cistena. La reaccin inicial es reversible, y si se agregan grupos SH extraos en forma de glutation o tioglicolato de na, muchas de las clulas se recuperan. La capacidad de unin de los mercuriales se extiende en un amplio rango de ligandos a dems de los grupos que contienen SH, por ejemplo carboxilados, fosfatos y aminas. 1. Materiales: Cepas de E. coli Estafilococo Reactivo: Mercurio Cromo. No3Ag al 1% Medios de cultivo: caldo peptonado Equipo: Estufa Procedimiento: Realizar la siembra de una cepa de E. coli en dos tubos de caldo y en dos placas con Agar nutritivo hacer la siembra en toda la superficie del agar. A uno de los tubos, agregarle 5 a 10 gotas de mercurio cromo o nitrato de plata. El otro constituye el control. Incubar a 37C por 24 horas. La lectura se hace por turbidez en la siembra en caldo y por halo de inhibicin en agar.
2.
Principales mtodos de esterilizacin

Agentes fsicos - Calor seco Flameado Incineracin Horno de Pasteur - Calor hmedo Autoclave Tindalizacin - Radiaciones ionizantes - Luz ultravioleta - Filtracin Agentes qumicos
- Oxido de etileno - Formaldehido - Glutaraldehdo
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UNFV FMHU Principales desinfectantes y antispticos

Derivados argnticos Derivados mercuriales Agua oxigenada Permanganato potsico Derivados clorados Derivados yodados Alcoholes Fenoles Clorhexidina Detergentes aninicos Detergentes catinicos Glicoles
Algunos instrumentos de esterilizacin por calor

AUTOCLAVE: Consta de una caldera de cobre batido estaada interiormente protegida por una camisa metlica tambin de cobre. En su base est instalada la fuente calrica (gas o electricidad). Posee adems un manmetro, una vlvula de seguridad, un termmetro y una llave. APARATO DE ARNOLD- KOCH: Aparato para la esterilizacin por el calor hmedo. Consta de un cilindro de doble pared con tapa, una criba como apoyo y agua por debajo de la placa cribosa. HORNO PASTEUR: Muy utilizado en la esterilizacin en calor seco. Consiste en un cilindro de triple pared, revestido de planchas de asbesto.
Pasos para esterilizar al vapor

Paso 1: Descontamine, limpie y seque todo instrumental y dems objetos que se vayan a esterilizar. Paso 2: Abra o desconecte todo instrumento y dems objetos articulados, tales como hemstatos y tijeras, y desmonte los que sean de componentes mltiples o corredizos. Esto permite que el vapor llegue a tocar todas las superficies del objeto las superficies. Paso 3: Si hay que envolver el instrumental y dems objetos antes de esterilizarlos al vapor, utilice dos capas de papel, papel de peridico o tela de algodn o muselina (no use tela de lona). No se debern meter los instrumentos y dems objetos en recipientes encerrados. Si se emplean cilindros, hay que asegurarse de que estn abiertos los agujeros del cilindro. Paso 4: Arregle todos los paquetes, cilindros u objetos sin envolver en la recmara del autoclave de manera que el vapor se circule libremente. Paso 5: Nota: Las unidades de presin indicadas en el manmetro variarn segn el autoclave individual. Las siguientes cantidades de presin (que son equivalentes aproximados) indican la presin correcta para la esterilizacin al autoclave. 15 libras por pulgada cuadrada 106 kPa (106 kilopascales) 1 atm (1 atmosphere) 1 kgf/cm2 (1 kilograma de fuerza por centmetro cuadrado) 776 mm Hg (776 milmetros de mercurio)
Paso 6: En los autoclaves automticos, se apagar la calefaccin y la presin empezar a bajar una vez que se complete el ciclo esterilizante. En los autoclaves que no sean automticos, hay que apagar la calefaccin o quitar el autoclave de la fuente de calor, despus de 30 minutos para los objetos envueltos, y despus de 20 para los objetos sin envolver. Espere hasta que se indique "cero" en el manmetro antes de abrir el autoclave. Abra la puerta o la tapa para dejar que se escape el vapor que quede. Deje los paquetes del instrumental u otros objetos en el autoclave hasta que se sequen completamente, lo cual puede tardar hasta 30 minutos.
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Paso 7: Usando pinzas esterilizadas, saque del autoclave los paquetes, cilindros u objetos sin envolver. Para impedir que se ocurra la condensacin despus de sacar los objetos del autoclave, hay que ponerlos en una superficie acolchada de papel o tela esterilizados y dejar que se enfren. Espere a que los paquetes, cilindros u objetos lleguen a bajar a la temperatura ambiente (lo cual puede tardar varias horas) antes de almacenarlos. Paso 8: Guarde los objetos correctamente. Es tan importante guardar los objetos correctamente como lo es esterilizarlos correctamente: Objetos envueltos. Bajo condiciones ptimas de almacenaje y al tocarlos mnimamente, se considerarn esterilizados los objetos envueltos correctamente con tal de que se mantengan ntegros y secos. Para almacenar los objetos de modo ptimo, encierre los objetos esterilizados en armarios que estn en reas secas o de baja humedad, de temperatura moderada y por las que no pase mucha gente. Si hay cualquier duda de que si un paquete est esterilizado o no, habr que considerarlo contaminado y volver a esterilizarlo.
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PRCTICA
Limpieza de la piel y antisepsia cutnea.

I. EXPERIMENTO N 1:
1. Materiales (Observacin del crecimiento): Placa petri (3) con agar nutritivo o TSA dividido en 2 sectores cada uno Isopos de algodn estril (3) Solucin antisptica, alcohol yodado Un tubo con caldo nutritivo estril
2.
Procedimiento: En el sector 1 toque con sus dedos varias zonas, lavase las manos con agua y jabn squese y toque con sus el sector 2, lavase las manos por segunda vez y toque el sector 3 lavase las manos por tercera vez y toque el sector 4. En otra zona de su piel aplique el desinfectante por 2 minutos sobre esta zona humedezca con caldo nutritivo y siembra esta con el hisopo estril en la zona 5. Aplique el desinfectante por dos minutos ms y repita lo anterior para sembrar en el sector 6. Incube a 37C por 24 hrs. observe y comente los resultados.
II. CUESTIONARIO
1.- Fundamente los resultados obtenidos.
Nociones bsicas
Se considera como medio sptico cuando existen microorganismos patgenos, mientras que el medio ser asptico cuando est exento de ellos. Cuando el medio sptico quiere transformarse en asptico, se precisa realizar una desinfeccin. Si se quiere obtener un determinado medio exento de microorganismos patgenos, se podra conseguir de dos formas diferentes. Una adoptando medidas que impidan la llegada de stos hasta ese medio. La segunda consistir en la eliminacin de los microorganismos patgenos presentes. Estas acciones diferentes han dado origen a dos conceptos diferentes: Asepsia: conjunto de procedimientos que impiden la llegada de microorganismos patgenos a un medio. Entre las medidas generales de asepsia que se pueden utilizar en el hospital, se pueden citar: tcnicas de aislamiento; indumentaria adecuada; cmaras de flujo laminar; desinfeccin; formacin sanitaria del personal
Antisepsia: acciones que conducen a la eliminacin de los microorganismos patgenos presentes en un medio.
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Para conseguir estos fines se utilizan los antispticos, que son sustancias germicidas de baja toxicidad que pueden utilizarse en la piel y tejidos vivos, y los desinfectantes, germicidas de mayor toxicidad que se emplean para objetos, ambiente y superficies. Entre los antispticos ms utilizados en la prctica quirrgica, se encuentran: compuestos yodados, fundamentalmente la Povidona yodada (derivado orgnico); los alcoholes, fundamentalmente el etlico y el isoproplico, de propiedades idnticas; la clorhexidina, como solucin acuosa alcohlica; el hexaclorofeno, fenol que se puede utilizar como los anteriores para la preparacin de piel para ciruga, desinfeccin de manos. Los desinfectantes ms utilizados en la actualidad son: compuestos de cloro (cloro gas; hipoclorito de calcio; clorinato sdico; solucin acuosa de hipoclorito); cidos-lcalis; aldehidos, fundamentalmente dos: glutaraldehido y formaldehido (formalina, solucin acuosa al 40%; glutaraldehido, solucin acuosa al 2%). Se utilizan para esterilizacin de objetos sensibles al calor: citoscopios, laparoscopios, instrumentos manchados de sangre; instrumentos de hemodilisis; fenoles, se utilizan para la desinfeccin de objetos, superficies y ambientes. Se pueden utilizar para paredes y suelos de quirfano, salas de partos, cuidados intensivos.
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I I
Inmunologa
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PRCTICA
Fagocitosis
Casi desde principios de la historia de la bacteriologa mdica, la fagocitosis ocupa un lugar muy importante en la resistencia a las enfermedades infecciosas. Existen clulas capaces de ingerir y digerir muchos tipos de organismos que logran penetrar en el cuerpo, sin necesitar la ayuda inmunitaria especifica del sistema linfoide. Los macrfagos y los fagocitos mononucleares participan fundamentalmente en el fenmeno de Fagocitosis. Ciertas sustancias que facilitan la velocidad con que son fagocitados las bacterias y otros agentes infectantes son las OPSONINAS.
I. FAGOCITOSIS IN VITRO
1. Materiales: Cultivo de Candida albicans 5cc de sangre fresca con anticoagulante Wintrobe 1cc Una jeringa de 5cc. Bao Mara Pipeta Pasteur Colorante de Wright. Agua tamponada Colorante rojo de congo al 1% Lminas portaobjetos y cubreobjetos, microscopio. Aceite de cedro. Procedimiento: Obtener 5ml de sangre fresca, agregar sol. Wintrobe 1cc y agitar Agregar al tubo con sangre 2cc de caldo de Candida albicans Incubar a 37C por 30 , luego centrifugar Con una pipeta Pasteur retirar de la interfase plasma, sangre, la capa leucocitaria. Depositar una gota en una lmina con una gota de rojo congo. Cubrir con laminilla cubreobjetos. Observar microscopio Depositar otra gota en una lmina portaobjeto y extender como para hemograma y colorear con Wright Observar al microscopio
2.
II. FAGOCITOSIS IN VIVO

1. Materiales: Cepa de Candida albicans. Jeringa hipodrmica de 1cc. 1 Pericote. Procedimiento: Inocular 0.5cc de Candida albicans va intraperitoneal al pericote. A las 24 h. autopsiar al pericote y hacer improntas de hgado, corazn, lquido peritoneal: colorear con Wright. Observar al Microscopio.
2.
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Fagocitosis y muerte de una bacteria.
Etapa 3-4: aumento respiratorio. Etapa 5: lesin por accin de intermediarios oxgeno reactivos. Etapa 6-7: lesin por accin de peroxidasas, protenas Catinicas, lisozimas, lactoferrina.
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PRCTICA
Reacciones: Antgeno-Anticuerpo
I. EXPERIMENTO N 1: Reaccin de precipitacin
La reaccin de precipitacin ocurre cuando un anticuerpo IgG divalente reacciona con una antgeno polivalente soluble. La precipitacin es el resultado de la formacin de grandes complejos Insolubles de molculas interconectadas de antgeno y anticuerpo. La precipitacin se forma en la zona ptica de equivalencia entre el antgeno y el anticuerpo. La inmunoprecipitacin es el mtodo mas simple y directo para la demostracin de la reaccin antgenoanticuerpo en el laboratorio. Precipitacin en tubo Capilar: (Determinacin de PCR) La protenas C reactiva no se encuentra normalmente en la sangre, sino que aparece en los estadios iniciales o las enfermedades caracterizadas por cambios inflamatorios. Es serolgicamente diferente de las protenas normales y puede ser detectada prontamente su presencia con un antisuero especifico para la protenas C. 1. Materiales: Tubos capilares 1x80 mm. Suero Suero problema Bases de plastilina Procedimiento: Un tubo capilar es sumergido dentro del suero anti PCR, dejar que el lquido se eleve de 25 a 30 mm dentro del tubo capilar. Es esencial que el tubo capilar sea sumergido en el antisuero primero para evitar contaminacin del mismo con el suero del paciente. Coloque el dedo sobre el extremo superior del capilar y squelo del antisuero Sin remover el dedo del extremo superior del tubo capilar, sumerja el capilar dentro del suero del paciente deje que un volumen igual del suero del paciente penetre al capilar. Es importante que el antisuero y el suero del paciente estn en contacto. Deben ser evitadas las burbujas del aire. Invierta el tubo capilar varias veces para lograr la mezcla de los sueros, coloque el dedo en un extremo dejando un espacio de aire alrededor de 1 cm en el extremo opuesto. Inserte los tubos en la base de la plastilina, estando seguros que el final de la columna de suero est alrededor de 1 cm por encima del bloque. Coloque en la incubadora a 37 durante dos horas. Tambin se permite dejar el tubo a la temperatura ambiente si no hay incubadora disponible. Si la protena C reactiva est presente en el suero del paciente, un precipitado ser percibido al cabo de 3 minutos y un informe cualitativo puede ser hecho en este tiempo. Contine la incubacin por espacio de 2 horas en total, y entonces coloque dentro de la refrigeradora heladera a 0 - 6C durante la noche y a la maana siguiente puede hacer la lectura final.
2.
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UNFV FMHU LECTURA:

Debern ser realizadas examinando los capilares frente a una luz, sin necesidad de usar un fondo de contraste especifico. El colorante presente en el antisuero acenta cualquier precipitado antgenoanticuerpo, permitiendo una lectura fcil. Las lecturas pueden ser clasificadas de la siguiente manera: NO PRECIPITADO NEGATIVO 1mm de precipitado 2mm de precipitado 3mm de precipitado 4mm de precipitado 5mm de precipitado 6mm de precipitado Una cruz Dos cruces Tres cruces Cuatro cruces Cinco cruces Seis cruces o ms
REFERENCIA:
Inmunodifusin Simple (Ouchterlony) Esta prueba actualmente no vigente se basa en una reaccin de Ag-Ac. y como resultado forma precipitados en la zona de equivalencia. Si sobre la superficie quieta de un lquido aplicamos una gota de cualquier colorante, observamos que esta se difundir de manera uniforme en todas las direcciones del seno del lquido, si en vez de utilizar este medio empleamos un gel, esta difusin se har en forma ms lenta y uniforme. Este principio junto con la propiedad que tienen los anticuerpos de formar precipitados con sus respectivos antgeno. Se aplican en el estudio de las protenas del plasma enfrentndolas con antisueros especficos para ellas. Lo que condiciona en el lugar de contacto de los bordes de la difusin es la formacin de bandas de precipitacin, si la concentracin y velocidad de difusin de ambas sustancias son iguales. Los resultados se interpretan como: Identidad total, Identidad Parcial o No Identidad.
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a) Identidad Total: Lnea de confluencia obtenida con do antgenos que no pueden distinguirse por el antisuero utilizado. b) Identidad Parcial: Formacin de espoln por tratarse de antgenos parcialmente relacionados con una determinante comn x pero determinantes individuales y y z q ue reaccionan con una mezcla de anticuerpos dirigida contra x e y. El antgeno con determinantes x y z slo puede precipitar anticuerpos dirigidos contra x. Los anticuerpos remanentes (Ac y ) cruzan la lnea de precipitina para reaccionar con el antgeno de la cubeta adyacente que contiene determinante y, dando origen a un espoln sobre la lnea de precipitina. c) Cruce de lneas formadas por antgenos no relacionados.
II. EXPERIMENTO N 2: Reaccin de Aglutinacin Bacteriana

La aglutinacin es un fenmeno inmunolgico producto de una reaccin ANTIGENO-ANTICUERPO en el que uno de los reactantes, el antgeno, es de naturaleza particulada de tamao grande, que no le permite formar suspensiones coloidales o soluciones en medios acuosos (antgeno insoluble). Estas partculas pueden ser bacterias, eritrocitos partculas de ltex, bentonita, etc. y se encuentran recubiertas en formas natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac, observables a simple vista o con lentes de poco aumento. Aglutinacin bacteriana: Existen muchos mtodos comnmente empleados para demostrar la aglutinacin bacteriana. Uno de los ms simples es la aglutinacin microscpica en lmina de una suspensin de bacterias de salmonella tiphy con suero positivo (con anticuerpos ant-salmonella). A esta prueba se le denomina Prueba de Widal.
1.
Materiales: Una lmina para aglutinacin con espacios marcados. Sueros problemas de pacientes. Un set de antgenos para aglutinacin en lmina: Tifico O, Tifico H, paratifico A, paratifico B. 4 pipetas estriles Palillos mondadientes Procedimiento: A. CUALITATIVAS Con la pipeta coloque una gota de suero problema en cada uno de los espacios marcados (50 mL). Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada uno de las gotas de los sueros problema de un mismo paciente, proceda del mismo modo con los otros sueros. Mezclar uniformemente con un mondadiente distinto para cada gota. Haga rotar suavemente la lmina durante 3 - 5 minutos. La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable, que tienden a agruparse en la periferie de la gota. Anotar el resultado.
2.
ANTGENOS SUERO (50 mL)
Resultado: Cualitativo: 1+, 2+, 3+, ....
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B. SEMICUANTITATIVO Preparar diluciones colocando cantidades decrecientes de suero: 0.04 (40 ml), 0.02 (20 ml), 0.01 (10 ml) y 0.005 (5 ml). Agregar el antgeno que result positivo en el cualitativo. Ejemplo: O somtico: positivo 3+ 40 mL SUERO 20 mL 10 mL
5 mL
DILUCIONES RESULTADOS
1/40
1/80
1/160
1/320
Resultado: Es la mayor dilucin donde an existe aglutinacin. Ejemplo: O 1/160
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PRCTICA
Hemoaglutinacin determinada: Grupo Sanguneo

La superficie de los eritrocitos contiene un gran nmero de determinantes antignicos que son productos directos o indirectos de los genes. Estos determinantes antignicos se clasifican en grupos sanguneos. Dentro de cada grupo sanguneo los antgenos parecen que se heredan como producto de un solo gen o de un grupo de genes ntimamente ligados. Grupo ABO.- En 1900. Landstelner pblico su observacin de un patrn consistente en la aglutinacin de las clulas sanguneas del humano por otro suero humanos. Las clulas de personas A eran aglutinadas por el suero de los individuos del suero B y viceversa. Las clulas de algunas personas (grupo O) no eran aglutinadas por ningn suero. Estas personas tenan anticuerpos contra A y B. Poco despus el cuarto AB fue hallado. El suero de la sangre AB no tiene anticuerpos contra A ni contra B. Isohemaglutinacin: GRUPO SANGUINEO O A P AB ISOANTIGENO Ninguno A B AyB ISOANTICUERPO Anti A y B Anti B Anti A Ninguno
La determinacin de grupos en el sistema ABO es rpida y simple: los tipos son rpidamente determinados con adicin de un suero tipo conocido, por medio del mtodo de aglutinacin en lmina. El suero tipo se prepara en conejo y son cuidadosamente adsorbidos hasta que sean altamente especficos y no den reaccin cruzada con antgeno de otra sangre de diferente grupo. Adems en los eritrocitos aproximadamente el 85% a 90% de la poblacin existe un antgeno Rhesus (Rh) (D) que no tiene normalmente aglutininas pero que es importante su conocimiento en inmunoterapia e inmunopatologa. 1. Materiales: Suero Anti. A. Anti B y Anti D (Rh) Algodn, alcohol yodado, lancetas y portaobjetos Procedimiento: Utilizando la lanceta punzar un dedo limpiando previamente el pulpejo con alcohol presionando el dedo haga caer tres gotas de sangre sobre una lmina portaobjetos. A una de ellas aadirles una gota de suero anti-A, a la otra una gota de suero anti B y a la tercera agregarle una gota de suero anti-D. Mezcle cada muestra con un palillo mondadiente diferente. Continuar mezclando con movimientos giratorios a la lmina durante unos minutos: la aglutinacin se observa generalmente de 2 a 3 minutos, se aprecia fcilmente por la presencia de grumos consistentes en grandes conglomerados de eritrocitos. Su ausencia indica reaccin negativa.
2.
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1. Interpretacin: Sistema ABO
SUERO ANTI-A Positivo Positivo Negativo Negativo
SUERO ANTI-B Positivo Negativo Positivo Negativo
GRUPO SANGUINEO AB A B O
Sistema Rh SUERO Rh (Anti-D) + - (falso) GRUPO Rh Positivo Negativo Variante Du
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Donacin de Sangre
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PRCTICA
Poder bactericida del suero

El suero normal fresco contiene sustancias capaces de destruir a los microorganismos. Se sabe que en parte esta actividad es debida a la presencia de anticuerpos normales, pero est tambin la presencia de factores humorales. Por ejemplo el suero fresco no calentado contiene una sustancia conocida como COMPLEMENTO, el cual bajo ciertas condiciones juega un rol importante en la destruccin de los microorganismos. Esta sustancia puede ser destruida si el suero es primeramente calentado a 56 por 30. El propsito de esta prctica consiste en demostrar los efectos combinados de las sustancias antes mencionadas sobre algunas bacterias patgenas comunes.
1.
Materiales : 4 Tubos 16x150; 6 tubos 13x100 4 Pipetas de 1 ml (1/10); una pipeta de 10ml (1/10) 1 Jeringa de 10ml con agua 20x1 Cultivo en caldo de Escherichia coli Solucin salina estril 100ml (CINa 0.85%) Agar nutritivo licuado; repartido en 9 tubos con 10ml c/u 9 Placas de Petri Bao Mara a 35 Bao Mara a 56 Procedimiento: Valindose de la jeringa extraer 10ml de sangre venosa. Obtener el suero por centrifugacin. La mitad del suero obtenido llevarlo al Bao Mara a 56 por 30. Conservar la otra mitad. Preparar 3 diluciones de caldo de cultivo con el microorganismo en sol. salina estril (1:104, 1:105, 1:106) tal como sigue. A. 1.0ml de 1:10,000 en 9ml de sol, salina.................1:100.000 B. 1.0ml de 1:10,000 en 9ml de sol, salina.................1:1000.000 CUIDADO: Est seguro de usar algodn protector en la pipeta cuando maneja grmenes patgenos. Repartir soluciones obtenidas (A y B) 0.5ml de c/u en 3 juegos de 3 tubos A los tres primeros tubos aadirles 0.5ml de suero normal, a los siguientes tubos aadirles 0.5ml de suero calentado a 56 y a los tres ltimos aadirles 0.5ml de sol. salina (control). Mezclar el contenido de los tubos e incubar a bao mara por una hora a 37 Despus de incubados vertir el contenido de cada tubo en Petris estriles marcndolos con lpiz de cera Aadir 10ml de Agar fundido a 45 en cada Petri y agitar suavemente con el propsito de distribuir en forma pareja los microorganismos en el medio Despus que el agar se halla solidificado, incubar todas las placas en forma invertida por 24 hs.
2.
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UNFV FMHU LECTURA E INTERPRETACIN

Despus de la incubacin marcar cuidadosamente aquellas placas que tengan no menos de 30 ni mas de 300 colonias. Las que no se encuentren dentro de estos lmites deben ser descartadas: Hacer comparaciones. Registrar los resultados y explicarlos.
Nmero de Colonias Escherichia coli 1:104 1:105 1:106 Suero normal Suero calentado Solucin Salina
CUESTIONARIO
1.- Cules son los factores del complemento responsable de la citlisis? 2.- Qu tipo de anticuerpos han actuado en el experimento? 3.- Porqu el agar fundido en el momento de aadirlo a la placa Petri debe estar a una temperatura de 45? 4.- Qu sucedera si el paso N6 del experimento incubamos por 24 hrs? 5.- Si en un animal de experimentacin inoculamos por va endovenosa 0.5ml. de cada una de las diluciones preparadas de Escherichia coli. Cmo podra comportarse en cada caso? 6.- Despus de una Proctosigmoidoscopia, una extraccin dentaria o una debridacin de abscesos, se produce pasaje de bacterias al torrente circulatorio. Porqu no se produce septicemia?
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PRCTICA
Prueba de Fijacin de Complemento

Este procedimiento emplea dos sistema Antgeno-Anticuerpo. La prueba consiste en colocar primero el Antgeno especfico y el Anticuerpo en cuestin, conjuntamente con el complemento y luego, en un segundo paso, aplicar el sistema indicador consistente en Eritrocitos de carnero y suero de conejo antieritrocito de carnero (hemolisina). Si el complemento est presente en el momento de aadir el sistema indicador, quiere decir que el primer sistema no lo utilizo en su reaccin y por tanto los eritrocitos de carnero son hemolisados. Si el primer sistema emple complemento, es decir lo fij, al aadir el segundo sistema, la hemlisis no se producir por la ausencia de complemento libre en la mezcla. 1. Materiales: Suero problema, positivo y negativo: Inactivados a 56C por 30 min. Antgeno: Adenovirus en solucin. Buffer de Mayer Complemento (suero de cobayo) Sistema Hemoltico: mezcla de partes iguales de eritrocitos de carnero al 2% y Hemolisina Tubos de Kahn (8) Pipetas de 1 ml (8) Procedimiento: Diluir 0.2 ml de cada uno de los sueros con 0.8 ml de Buffer de Mayer. Se obtiene as una dilucin de 1/5. Rotular un tubo e Kahn para el suero problema y cuatro (4) tubos ms para control positivo, control negativo control de antgeno y control de sistema hemoltico. Aadir a cada tubo los siguientes reactivos en el orden sealado SP Suero Problema (1/5) Suero Positivo (1/5) Suero Negativo (1/5) Antgeno Complemento Buffer de Mayer 0.2 ml -.-.0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml C+ -.0.2 ml -.0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml C-.-.0.2 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml CAg -.-.-.0.1 ml -.0.4 ml CSH -.-.-.-.-.0.5 ml
2.
Incubar todos los tubos a 37 en Bao Mara por 15 minutos Aadir a cada tubo 0.3 ml del sistema hemoltico Incubar todos los tubos en Bao Mara a 37C por 15
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UNFV FMHU LECTURA

Observa la presencia o ausencia de hemlisis en cada uno de los tubos los controles deben dar la siguiente lectura:
Control positivo Control negativo Control del antgeno: Control del Sistema Hemoltico:
No hemlisis Hemlisis No hemlisis No hemlisis
Anotar el resultado del suero problema: .......................................
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Prueba de Inmunoensayo: Test Elisa para VIH

El Test ELISA para HIV se basa en un inmunoensayo absorbente enzimtico ligado para la deteccin de anticuerpos al virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y 2 en suero humano o plasma. La prueba se realiza en tres tiempos: 1.2.3.Incubacin de la muestra problema Incubacin del conjugado Incubacin del sustrato
En los micropozos se encuentran una combinacin de cuatro antgenos recombinantes de los virus HIV 1 y 2 relacionados a la envoltura y al core del virus HIV.
1.
Materiales: Suero problema del paciente Placas con micropozos ELISA Conjugando: Antgeno-Ig G humano marcado con una enzima Sustrato: TMB (Tetrametilbenzidina) H2SO4 4N Micropipetas de 50 ul.. 100ul Buffer isotnico, bao mara y/o estufa a 37C Lector ELISA Lavadora de placas de ELISA Procedimiento: * Como paso previo debe tratarse todos los reactivos a temperatura ambiente. a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) Aadir 150 ul. de muestra problema y controles a los pocilos correspondientes Cubrir los micropozos con un adhesivo Incubar a 37C durante 1 hr. Aspirar y lavar todos los pocillos cinco veces con tampn de lavado Aadir 200 ul. de conjugado a todos los pocillos Incubar a 37C durante 1 hr. Aspirar y lavar todos los pocillos cinco veces con tampn de lavado Aadir 200 ul. de solucin sustrato a todos los pocillos Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Aadir 50 ul. de cido sulfrico 4N a todos los pocillos para detener la reaccin Realizar la lectura de los micropozos en un lector ELISA
2.
NOTA: Esta prctica se realizara en forma demostrativa.
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PRCTICA
Test Antiestreptolisina O (ASO)

NEUTRALIZACION: DE LA ESTREPTOLISINA O Una de las funciones inmunitarias ms importantes mediadas por anticuerpos especficos es la neutralizacin de toxina. Estos anticuerpos especficos llamados Antitoxinas tienen el papel principal la inmunidad adquirida a enfermedades graves como difteria, ttanos. etc. Casi todas las cepas de estreptococo grupo A producen dos factores hemolticos: estreptolisinas O y S (exotoxinas). Cuando ocurre una infeccin por estreptococos de este grupo, la estreptolisina O, no asi la S, estimula el desarrollo de un anticuerpo especfico: la antiestreptolisina O, dicho anticuerpo bloquea la hemlisis por estreptolisisna O. Este fenmeno proporciona las bases para la determinacin cuantitativa del anticuerpo. La determinacin de los ttulos sricos de antietreptolisina O tiene gran importancia por su valor diagnstico en paciente que tienen o han tenido recientemente una infeccin por estreptococo hemoltico del grupo A, sobre todo por las secuelas que estas infecciones incluyen: fiebre, reumtica, glomerulonefritis, eritema nodoso. Por la frecuencia de infecciones estreptoccicas se encuentran ttulos bajos de Antiestreptolisina O en casi todos los individuos. Se considera ttulos normales de Antiestreptolisina O de 40 a 160 Unidades Todd. La Estreptolisina O en su forma reducida, agregada a Glbulos rojos, producen hemlisis, si el suer o de un paciente posee Antiestreptolisina O al aadirse la Estreptolisina se produce una reaccin Antgeno Anticuerpo y el anticuerpo neutraliza al antgeno total o parcialmente segn el nivel de anticuerpo presente si una cantidad constante de Estreptolisina (Antig..) se agrega a cantidades cada vez menores de suero y si el anticuerpo (ASO) presente es suficiente para neutralizar el antgeno no habr hemlisis cuando se agregue glbulos rojos, cuando el Ag.excede al Ac. de exceso de Estreptolisina causar hemlisis. El Titulo de ASO es reciproca de la mayor dilucin de suero que impide la hemlisis de los glbulos rojos. FUNDAMENTO DEL TEST ANTIESTREPTOLISINA O En el suero del paciente enfermo se encuentran los anticuerpos circulantes de tipo antiestreptollina en el cual al unirse a un antgeno de una fase slida (ltex) va a producir una reaccin complejo Ag-Ab que se va a traducir por la presencia de una aglutinacin del ltex. En caso de un paciente negativo a este anticuerpo no ocurrir la reaccin de aglutinacin. 1. Materiales: Suero problema del paciente Antgeno fase slida absorbida en ltex Suero control positivo Suero control negativo Diluyente Palillos Placas de reaccin
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2. Procedimiento: Colocar 5 ul. de suero problema en un circulo de la placa. Colocar 50 ul. de suero control positivo y negativo en cada uno de los crculos restantes. Agregar a cada uno de ellos 1 gota (50 ul.) del antgeno ltex, mezclar suavemente. Agitar en forma rotativa por 3 min. Leer en busca de una reaccin de aglutinacin.
Nota: Se debe descartar la prueba en caso de observar aglutinacin inapropiada con los controles positivo y negativo.
CUESTIONARIO :
1. Qu funcin tienen los glbulos rojos en esta prueba? 2. Qu otras pruebas de laboratorio se conocen para el diagnstico de fiebre reumtica? 3. Explique por qu se inhibe la hemlisis en la determinacin de la ASO 4. Explique por qu se utilizan glbulos rojos O Rh + en la determ. de ASO.
Significancia Clnica La antiestreptolisina -O- (ASO.) es una exotoxina producida por el estreptococo B-hemoltico (grupo A) la cual tiene la capacidad de hemolizar los glbulos rojos de varias especies. La estreptolisina - O tiene capacidad antignica resultando en la produccin por parte del organismo de anticuerpos antiestreptolisina O. La determinacin de los niveles de ASO es un mtodo universalmente aceptado para el diagnstico de diversas enfermedades por infeccin de estreptococo tales como la fiebre reumtica y glomerulonefritis La concentracin de ASO en individuos normales varia ampliamente. Despus de la fase aguda de una infeccin por estreptococo, el titulo comienza a aumentar en alrededor de dos semanas llegando a sus niveles mximos en cuatro a seis semanas, mantenindose alto por un periodo de tiempo relativamente prolongado. En pacientes con fiebre reumtica. se encuentra un ttulo elevado en ms de 90% de los casos, ttulos mantenidos por sobre las 500 unidades se consideran como evidencia de fiebre reumtica. La determinacin de la concentracin de a ASO en forma aislada es de relativa utilidad. por lo cual se recomienda la repeticin de la prueba a Intervalos de 10 a 15 das. Si se observa un aumento progresivo de los ttulos obtenidos, es posible concluir que se est frente a una infeccin reciente. Por otra parte, la disminucin subsecuente de los ttulos es un ndice claro de recuperacin
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PRCTICA
Prueba de Mantoux (Hipersensibilidad tarda) Reaccin al polvo de casa (Hipersensiblidad inmediata)

I. EXPERIMENTO N 1:
Hipersensibilidad Tardia Es una intradermorreacin en la que se usa un filtrado de cultivo de bacilos tuberculosos conocido como Derivado Proteico Purificado (PPD). Si existen linfocitos sensibilizados a este antgeno, dan lugar a la aparicin de ppula y eritema en la zona inyectada, en un lapso de 24 horas a 48 horas. 1. Materiales: 1 Jeringa de tuberculina con aguja N 25 PPD 50 U.I x mm Algodn y Alcohol Regla milimetrada Procedimiento:
2.
Limpiar una zona de la piel antebrazo y aplicar con la jeringa 0.1 ml de PPD (5UI) por va intradrmica.
3.
Lectura: Despus de 24 a 48 horas de la aplicacin se efecta la lectura de la respuesta inflamatoria producida la cual estar en relacin con la mayor o menor sensibilidad del organismo a este tipo de antgeno.
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4. Tipo de Respuesta: Positivo ++++ Positivo +++ Positivo ++ Positivo + Dudoso Negativo
Eritema, edema y necrosis central Eritema acentuado y edema de ms de 20 mm Eritema y edema de 10 a 20 mm Eritema y edema de 5 a 10 mm Leve eritema e indicios de edema de 5mm o menos Solo se aprecia el lugar de inoculacin de el agua
DIAGNSTICO DE TUBERCULOSIS POR LA PRUEBA DE MANTOUX
Por qu debe hacerse la prueba de Mantoux? La prueba de la Mantoux puede mostrar si la persona ha sido infectada con las bacterias causantes de la tuberculosis. Quin necesita hacerse la prueba? - Personas que hayan tenido contacto diario muy cercano con alguien que tenga la tuberculosis activa. - Personas que tengan sntomas de tuberculosis tales como cansancio constante, prdida de apetito, fiebre, sudores nocturnos, prdida de peso, tos persistente. - Personas que tienen un sistema inmunolgico dbil o problemas de salud. Qu cuidados se debe tener despus de la prueba? - NO cubrir el lugar del pinchazo con una curita. - NO rascarse el brazo, si pica, ponerse una compresa fra. - Puede lavarse el brazo y secarlo dndose palmaditas, pero NO debe frotrselo. Qu significa un resultado negativo? Esto puede significar que la persona no ha sido infectada con las bacterias que causan la tuberculosis. Puede significar que a la persona le hicieron la prueba muy pronto despus de haber inhalado las bacterias. El cuerpo reacciona a la prueba de la tuberculina unas cuantas semanas despus de haberse infectado con las bacterias. En este caso, la prueba debe repetirse despus de tres meses. Qu significa un resultado positivo? Esto significa que las bacterias que causan la tuberculosis estn en su cuerpo. A pesar de que la persona est infectada con las bacterias de la tuberculosis, esto no significa que tenga la enfermedad PPD Definicin PPD (Derivado Purificado de Protena) es un examen selectivo estndar para la tuberculina, un antgeno que causa tuberculosis. La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa crnica de los pulmones. Razn para el procedimiento Una PPD se da habitualmente a todas las personas admitidas como un enfermo hospitalizado. No requiere una PPD si se ha tenido una reaccin positiva en el pasado o si tiene prueba que se ha tenido una PPD en los ltimos tres meses.
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Procedimiento Una aguja diminuta se usa para inyectar una cantidad pequea de solucin lquida bajo la piel en su brazo. En 2 3 das una enfermera ver si hay alguna reaccin a la prueba. Una reaccin es positiva si un abultamiento cerca del tamao de un borrador de lpiz o ms grande aparece en su brazo. A menudo rojez tambin se desarrolla en el sitio en el que la inyeccin se dio. Estas reacciones significan que usted sido expuesto(a) a la tuberculosis en algn momento en el pasado. No significa que tiene TB. Otras pruebas incluyendo una radiografa del trax (rayos X del pecho) se hacen para ver si usted en realidad tiene TB. Si se tiene una reaccin positiva al PPD, a menudo es tratada(o) con el medicamento INH (Isoniazida) por 6 a 9 meses. El propsito de estas pastillas (tomadas una vez al da) es destruir los grmenes de TB en su cuerpo y prevenir que usted desarrolle TB en realidad.
II. EXPERIMENTO N 2:
Sensibilidad al Polvo de Casa Es una reaccin de hipersensibilidad de tipo inmediata. Es positiva en los pacientes que presentan mastocitos sensibilizados en IgE especifica contra este antgeno. Una vez el sistema inmunitario de un atpico ha comenzado a producir IgE contra alrgenos la nueva IgE producida se va a ir anclando en la superficie de clulas que tengan receptores para IgE en su superficie. Los mastocitos estn presentes en el tejido conectivo de muchos tejidos. Dado que estas clulas tienen receptores para IgE pueden recoger en su superficie la IgE producida por los linfocitos B. Cuando los alrgenos acceden a un tejido como la mucosa respiratoria, los que sean especficos de las IgEs presentes en la superficie de los mastocitos, se unirn y conducirn a la activacin del mastocito. La activacin del mastocito conduce a la liberacin de diferentes mediadores (Histamina, leucotrienos, TNF-a que van a tener diferentes efectos sobre vasos sanguneos, bronquios e intestinos. Todo esto conduce a una reaccin de hipersensibilidad inmediata que puede producir broncoconstriccin, liberacin de mucus y que pone en marcha el mecanismo de una posterior reaccin retardada a las pocas horas. 1. Materiales: 1 Jeringa de tuberculina con aguja N 25 Antgeno: Polvo de casa en solucin Algodn y alcohol Regla milimetrada Procedimiento: Limpiar una zona de la piel antebrazo e inyectar por va intradrmica 0.1. ml de la solucin de polvo de casa. Lectura: Observa la aparicin de mcula y ppula a los 15.30 y 60 minutos despus.
2.
3.
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Reacciones de Hipersensibilidad
TIPO I
TIPO III
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PRCTICA
Shock Anafilctico
La prctica consiste en una anafilaxia generalizada y suele obtenerse en el laboratorio inyectando una pequea dosis de antgeno a un animal (dosis sensibilizante), y algunos das ms tarde, otra dosis intravenosa de antgeno (dosis desencadenante). En el hombre este fenmeno es ms complejo desde el punto de vista fisiopatolgico y recibe el nombre SHOCK ALERGICO. 1. Materiales: 1 Cobayo Jeringa de Tuberculina Suero de caballo 1:100 albmina de huevo 1:10 en sol. salina (Antgeno) Procedimiento: Inocular un cobayo por va intraperitoneal con 1 ml de la solucin del antgeno a eleccin. Despus de 10 a 20 das inyectar por va intracardica 1 ml de dicha solucin de antgeno.
2.
RESULTADOS: Las manifestaciones de la anafilaxia varan segn la especie, pues vara tambin el rgano de choque afecta en el cobayo, a los pocos minutos de la inyeccin del antgeno (dosis desencandenante) en animal empieza ara estornudar, toser, quizs presenta convulsiones, e incluso colapso y muerte.
CUESTIONARIO: 1.2.Qu debe hacerse antes de inyectar por va intravenosa por primera vez cualquier medicamento? Investiga en algn hospital por una Historia Clnica donde un paciente haya presentado Shock anafilctica. presentar un resumen del caso
3.- Qu valor tiene la aplicacin de antihistaminicos despus de producido el shock anafilctico?
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SHOCK ANAFILCTICO Definicin: Sndrome clnico grave, sbito y adverso de etiologa variada con relacin a los agentes desencadenantes, con mecanismos inmunolgicos implicados en su fisiopatologa, que se manifiesta por sntomas y signos aislados o combinados, fatales en muchas ocasiones si no se diagnostican y tratan urgentemente. Fisiopatologa: La anafilaxia proviene tras la exposicin a una protena externa que activa la generacin de un anticuerpo especifico de la clase de Inmunoglobulina IgE. Estas molculas de IgE se unen rpidamente a los mastocitos y basfilos, estimulando la degranulacin de estas clulas para la liberacin masiva de mediadores preformados como la histamina, triptasa, quininas, factor de activacin de plaquetas y metabolismo del cido araquidnico especialmente leucotrienos. Para que se produzca la anafilaxis es necesario que el individuo haya estado expuesto al antgeno antes y que haya sintetizado una gran cantidad de anticuerpos IgE especficos. En una siguiente exposicin puede producirse una reaccin de hipersensibilidad inmediata. Los medicamentos del tipo de las penicilinas, derivados y antibiticos relacionados con esta familia, as como los sueros heterlogos figuran como las causales ms frecuentes de las severas reacciones de anafilaxia. Diagnstico: Se basa en el antecedente de la exposicin a algn alergeno externo y los signos y sntomas clnicos caracterizados por congestin de los tejidos y edema. Los signos y sntomas son derivados de: 1. Shock circulatorio: Hipotensin Alteraciones de la frecuencia cardaca (Bradicardia o taquicardia en dependencia del estadio de la afeccin) Palidez marcada Sncope 2. Obstruccin de las vas areas superiores: Edema de la Epiglotis y laringe Estridor respiratorio Tiraje supraesternal 3. Broncoespasmo: Disnea Polipnea Tiraje supraesternal e infraesternal, intercostal y subcostal Respiracin de Kusmaull Hipersecrecin pulmonar(edema) Sibilancias 4. Sntomas cutneos: Sudoracin Palidez Eritema Urticaria Prurito 5. Sntomas gastrointestinales: Dolor Abdominal Diarreas Nuseas Vmitos 6. Sntomas neurolgicos: Cefalea Mareos Confusin mental Convulsiones
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Alteraciones de la conciencia de diversa severidad (Somnolencia, Estupor, Letargo, Coma)
Diagnstico diferencial: Reaccin anafilactoide: Histaminoliberadores inespecficos, degranulacin de basfilos y mastocitos, no existe reaccin antgeno anticuerpo. Se activa el complemento (C3A, C5A) por inhibicin de la sntesis de Prostaglandinas Coma hipoglicmico (Ayunas, ejercicios violentos, etc) IMA Reaccin Vasovagal Conducta a seguir: Una vez efectuado el diagnstico de anafilaxis se proceder al tratamiento inmediato, cuyo objetivo fundamental ser garantizar la vida del paciente, para lo cual se tomaran las siguientes medidas de urgencia: Posicin de shock: Colocar al paciente en posicin supina con las extremidades inferiores elevadas Mantener vas areas permeables (pudiendo ser necesarias la entubacin pulmonar para la respiracin asistida o mecnica y/o la traqueotoma segn lo merite el caso). Canalizacin una vena profunda para la administracin de los medicamentos necesarios. Mantener estables los parmetros vitales tales como frecuencia cardaca, temperatura, tensin arterial, frecuencia respiratoria, PVC, Monitoreo constante, etc. Realizar una evaluacin del estado de los gases e iones en el organismo por medio de una gasometra e ionograma, corrigiendo las alteraciones que pudieran presentarse. Realizar un balance de los lquidos corporales. Proceder a la extraccin de muestra de sangre adems para conocer el estado de los elementos formes de la sangre, grupo sanguneo y factor Rh.
El tratamiento especfico se realizar simultneamente y consiste en: Adrenalina acuosa (amp. 1ml)-1:1000, administrar:
Edad
Usar 0.5 ml diluido en 10cc de Solucin Nios de 2 a Nios de 6 a Salina Isotnica, 6 aos 12 aos EV lento(2 o 3 min) Adultos 0.3-0.5 ml/10-15, hasta un total de 2 cc
Dosis (cc)
0.15 ml
0.2 ml
Si existiera colapso venoso, pudiera utilizarse la va intramuscular subcutnea Pudiera utilizarse Epinefrina acuosa a 5 mg en 500 ml de Solucin Salina EV a goteo segn la tensin arterial, en los casos de severidad. El Shock Anafilctico debe tratarse en el lugar donde ocurra, de disponerse de los medicamentos indispensables. Slo despus de la recuperacin de los signos vitales debe procederse a su remisin, siempre acompaado de un personal mdico y enfermera. Si es producido por la picadura de insectos se aplicar un torniquete por encima de la picadura; en la zona de esta se administrar la Epinefrina de 0.1 a 0.3 en forma circular cuatro punturas, de ser posible se debe extraer el aguijn sin exprimir. Tratamiento complementario:
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Antihistamnicos: a)Difenhidramina(EV o IM): (amp. 20 mg en 2 ml) Nios: 5 mg/Kg./24 horas Adultos: 25-50 mg c/6 horas. b)Cimetidina: (amp. 300 mg en 2 ml) 4mg/Kg/dosis, sin exceder los 2 g En casos prolongados de anafilaxia pueden utilizarse como terapia los corticoesteroides por va parenteral a razn de: a)Prednisona(EV): (Bbo. 60 mg en 3cc 5cc) Nios: - Menores de 1 ao = 10mg/Kg/dosis c/6 u 8 horas - De 1 a 14 aos = 20mg/Kg/dosis c/ 6 u 8 horas Adultos: 60 mg c/8 horas. b)Hidrocortisona(EV): (Bbo. 100-500 mg en 3cc 5cc) Nios: 15 mg/Kg/dosis c/6 u 8 horas Adultos: 100 mg c/8 horas Si persiste el broncoespasmo administrar: a)Broncodilatadores: Aminofilina(EV): Nios: 5-7 mg/ Kg/24 horas Adultos: 250 mg (1amp.) lento de 10-20 minutos, puede repetirse la dosis cada seis horas. Si la hipotensin persiste puede aadirse a la venoclisis un suplemento de Dopamina o Norepinefrina. Tambin se pueden utilizar expansores de volumen Albmina o Dextrn para el tratamiento de la hipotensin persistente. Prevencin de la Anafilaxis: 1. Efectuar una Historia Clnica Farmacolgica antes de administrar cualquier medicamento. 2. Administrar los medicamentos por va oral siempre que sea posible, reservar la va parenteral para los casos en que sea indispensable. 3. Observar al paciente durante 30 minutos despus de la administracin de un frmaco por va parenteral. 4. Si se descubren antecedentes de hipersensibilidad, se deben efectuar pruebas cutneas, si no se dispone de un medicamento alternativo. 5. El paciente debe conocer y llevar en todo momento una tarjeta de alerta mdica.
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I I I
Bacteriologa Aplicada
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BACTERIOLOGA APLICADA
La Bacteriologa aplicada estudia al microorganismo como agente causal de la enfermedad y el espcimen clnico del paciente. Los especimenes clnicos, son sustancias que son evacuadas o expulsadas por el individuo enfermo. Estos especimenes clnicos contienen a los microorganismos y a partir de ellos se inicia el estudio, observando primeramente sus caractersticas fsicas para luego realizar las pruebas bacteriolgicas y bioqumicas correspondientes, tendientes a identificar al microorganismo causante del mal. Son ejemplo de especimenes clnicos: el esputo, la orina, el pus, secrecin farngea, LCR, etc. Seleccin de medios primarios de aislamiento para muestras de diferentes sitios del organismo Agar sangre ovina al 5% Agar chocolate Agar MacConkey Agar SS* o He,XLD Caldo selenito (GN) Caldo BAGG (SF) x
Fuente de la muestra
Bacterias patgenas potenciales
Garganta Esputo Aspirado transtraqueal
Orina
Heridas y abscesos
Uretra/crvix Liq. Cefaloraquideo
Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Bacterias anaerobias Escherichia coli Klebsiella spp. Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Estreptococos grupo D Staphylococcus aureus Escherichia coli y otros bacilos "entricos" Streptococcus pyogenes Bacteroides fragilis, Clostridium perfringens y otras bacterias anaerobias Estreptococos grupo D Heces Salmonella spp. Shige//a spp. Escherichia coli (enterotoxignica) Staphylococcus aureus Yersinia enterocolitica Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae
x x x
x x
x x
x x
x x x x
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Caldo carne o tioglicolato x x
Leter-Martin (transgrow)
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Agar SS* o He,XLD Agar MacConkey Caldo selenito (GN) Caldo BAGG (SF) Caldo carne o tioglicolato x x - 75 Agar sangre ovina al 5% Agar chocolate Leter-Martin (transgrow) x x x x
Fuente de la muestra
Bacterias patgenas potenciales
Ojos y odos
Liq.de articulaciones
Neisseria gonorrhoeae Hemophilus spp. Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa Moraxella spp. Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus aureus Escherichia coli y otras especies de enterobacterias Moraxella spp.
HE, Hektoen Enteric; XlD, xilosa, lisina, desoxicolato; ss, Salmonella-Shisel/a GN, Gram negativo BAGG, buffer oLida glucosa glicerol; SF, Srreprococcus faecalis
Medios especializados requeridos para aislar agentes infecciosos poco frecuentes

Fuente de la muestra Diagnstico presuntivo Laringitis y epiglotitis obstructiva aguda Faringitis membranosa Hisopado nasofaringeo Tos terina Bacterias Patgenas Medios de aislamiento Agar chocolate o agar de Casman con sangre equina. Colocar disco de bacitracina (10 /Lg) en el rea de inoculacin Medio de loeffler Agar de Tinsdale Telurito de sodio Agar patata de Bordet-Gen- gou Medio de lowenstein-Jensen Medio 7H-11 de Middlebrook Agar infusin de cerebro y corazn con y sin cicloheximida y cloramfenicol (C&C) Agar Brucella (mantener los cultivos durante 3 semanas)
Haemophilus influenzae
Garganta
Corynebacterium diphteriae Bordetella pertussis Mycobacterium tuberculosis Otras micobacterias
Tuberculosis Esputo Micosis pulmonar Sangre, mdula sea o biopsia de tejido Orina Heces
Blastomyces dermatitidis u otros hongos dimorfos
Brucelosis Leptospirosis Clera
Brucella spp. Leptospira spp.
Cualquier fuente de bacterias anaerobias
Abscesos paramucosales o profundos
Medio semislido de Fletcher Vibrio comma Medio de peptona alcalina Agar tiosulfato-citrato sales biliares-sucrosa Vibrio parahaemolyticus (tcbs) Agar sangre Bacteroides fragilis y Agar sangre con otras especies antibiticos: neomicina, vancomicina, anaerobias kanamicina, gentamicina Agar sangre-alcohol feniletlico
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PRCTICA
Estudio del Estafilococo, Estreptococo y Neumococo

Espcimen clnico:
Cepa conservada de:
Materiales de Laboratorio: Medios de Cultivo:
Pus (trada por los estudiantes) Secrecin faringea (obtenida de estudiantes voluntarios) Esputo Stafilococcus Aureus Streptococcus B Hemoltico Neumococos o Streptococcus Neumonae Mechero, asa de kolle, lmina porta, batera de coloracin Gram, microscopio ptico, isopos estriles. Agar manitol salado, Agar sangre, Agar DNA, Agar azida, Caldo biliado
I. PROCEDIMIENTO
Utilizando una asa de Kolle, previamente flameada, realizar la siembra del esputo por agotamiento en estra a las placas con Agar MS, Agar azida y Agar sangre. Con el isopo estril, tomar muestras de secrecin farngea y sembrarlo en la placa de Agar azida y Agar sangre. En una placa con Agar DNA hacer la siembra por puntura o dibujando una Z de la cepa Stafilococo. A partir del pus y la secrecin farngea (muestras del trabajo), efectuar extendidos en lminas porta objetos. Fijar la pelcula de muestra a fuego lento. Colocar la lmina con la materia de coloracin Gram, siguiendo la tcnica. Secar y observar al microscopio ptico, utilizando el objetivo de inmersin y una gota de aceite de cedro. Por sus caractersticas de agrupacin y coloracin identificar los estafilococos, estreptococos y neumococos, que se observan en el campo microscpico. Dibuje y coloree sus observaciones.
Especies ms importantes de Stafilococcus humanos

Especie Coagulasa positivos S. aureus Coagulasa negativos S. epidermidis S. saprophyticus S. haemolyticus S. hominis S. simulans S. capitis S. warneri' S. cohnii Area colonizada Fosas nasales, piel Fosas nasales, piel, axilas, odo externo, conjuntiva Tracto urinario bajo Axilas, piel Piel Piel Cabeza, brazos Piel Piel Capacidad patgena Muy frecuente Habitual Habitual Poco frecuente Poco frecuente Poco frecuente Rara Patgeno rara Rara
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UNFV FMHU Estreptococos y sus enfermedades

Neumona Snustis Otitis media Meningitis Bacteriema Faringitis Pioderma Fiebre reumtica Glomerulonefritis Meningitis neonatal Neumona neonatal Bacteriemia neonatal Sepsis posparto Infeccin urinaria Absceso abdominal Infeccin de heridas Endocarditis Caries dental Bacteriemia Endocarditis Absceso abdominal (*): -Hemolticos. gral. -Hemolticos (#): Algunos -Hemolticos y otros No -Hemolticos (&): No -Hemolticos
S. pneumoniae (&)
S. pyogenes (*) (grupo A)
S. agalactiae (*) (grupo B)
Enterococcus (#) (grupo D)
Grupo virdans (&)
Diferenciacin de las especies de Estafilococos
ESPECIES
S. Aureus
CARACTERSTICAS
S. Epidermidis
S. Saprophyticus
Color de la colonia Hemlisis en agar sangre Crecimiento anaerobio Coagulasa Fermentacin de la glucosa Fermentacin del manitol Novobiocina
amarillo blanco + + + + + sensible
blanco +/+ + sensible
blanco +/+ resistente
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UNFV FMHU Algoritmo de identificacin de cocos Gram positivos
Epidemiologa de la enfermedad neumoccica
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PRCTICA
Lectura a las 24 horas
Observar el crecimiento de colonias en el Agar M.S. Interpretar el viraje de color del medio. En las placas de Agar sangre, observar la presencia o no de hemlisis segn los especmenes clnicos sembrados. Diferenciar los tipos de hemlisis. Para la lectura de la placa con Agar DNA, baar previamente la superficie del Agar con una solucin al 1 N de HCI. Se observar que precipitan ciertas zonas del agar (se torna opaco), mientras que las desarrolladas se rodean de una transparencia tipo aureola. Con su profesor de prcticas interprete sus resultados. Coger 0.5 ml de capa de neumococo y suspender en caldo biliado, a los 15 minutos observar la lisis de las colonias de neumococos, si stas no son lisadas no son neumococos. Inocular 0.5 ml de la suspensin de neumococo en forma intraperitoneal a un pericote y observar su reaccin. Si no muere a las 24 horas sacrificarlo y realizar improntes de hgado, corazn y lquido peritoneal. Colorear con coloracin de Gram y observar al microscopio. Dibuje o esquematice sus observaciones.
NOTA: Se entregar a los estudiantes, medio de transporte Stuart para gonococo.
Fig. Streptococus
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PRCTICA
Siembra de Muestras Biolgicas para el aislamiento de Neisseria

Especmen clnico Materiales : Secrecin uretral (Neisseria gonorroeae o gonococo)
: Mechero de gas, asa de Kolle, lminas porta, batera de coloracin Gram, microscopio ptico y aceite de cedro. : Agar sangre, Agar Thayer Martn.
Medios de Cultivos
I. PROCEDIMIENTO
Con el asa de Kolle esterilizada a la llama y enfriada, realizar la siembra de las cepas y los especmenes clnicos en las placas de Agar Thayer Martn (para el aislamiento de Neisseria). A partir de los especmenes clnicos y las cepas, realizar y colorearlos con el mtodo de Gram. Trabajar con cuidado procurando no contaminarse. Observar las lminas coloreadas con el objetivo de inmersin e identificar los microorganismos en estudio. Esquematice o dibuje sus observaciones macroscpicas y microscpicas.
II. LECTURA
Observar las placas de Agar sangre sembradas y reconocer la presencia de algn tipo de hemlisis en alguna de las dos bacterias en estudio. En las colonias desarrolladas en Agar Thayer Martn, realizar la prueba de la oxidasa agregando para tal efecto una gota de 2,4 paradimetilendofenolamina. Ver el cambio de color de las colonias de Neisseria. Interprete esta prueba. Dibuje o esquematice sus observaciones. Entrega de material para aislamiento de Brucella y Bordetella.
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UNFV FMHU Infecciones asociadas a Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae
N. meningitidis
Meningitis Neumona Artritis Septicemia
N. gonorrhoeae
Uretritis Cervicitis Salpingitis Proctitis Septicemia Artritis Conjuntivitis Faringtis Enfermedad inflamatoria plvica
Principales caractersticas diferenciales del gnero Neisseria

Caractersticas Fermentacin de azcares
Crecimiento a 22 C
Especies N. Meningitidis N. Gonorrhoeae N. Lactmica Moraxella catarrhalis N. Sicca N. Flavescens + + +
glucosa + + +/+ -
maltosa + + + -
sacarosa + -
lactosa + -
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Diagnstico de laboratorio de Neisseria gonorrhoeae

La fiabilidad de la tincin de Gram disminuye cuando las muestras proceden de las crvix, la faringe o el recto, doce existe contaminacin con Neisserias comensales y otros microorganismos de morfologa similar. Otras bacterias de crecimiento rpido puede eclipsar el crecimiento de N. Gonorrhoeae, a menos que se utilicen medios selectivos. 1+: 2+: 3+: 4+:
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PRCTICA
Estudio del Gnero Brucellae
Las Brucelas son las formas ms pequeas de todas las bacterias Gram negativas, se presentan como cocobacilos o bacilos cortos de 0,5 a 2 um de ancho, no mviles, no esporulados, segn Hudleson son capsulados. Son aerobios aunque a menudo su crecimiento mejora con CO 2; parsitos obligados de animales y el hombre, le causa enfermedad, que en el hombre se caracterizan por un cuadro septicmico (cuadro agudo, infeccin generalizada), seguido de una Fase Crnica (de localizacin). Se reconocen 4 especies principales de Brucella: B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. canis, los cuales difieren por sus caracteres metablicos, composicin antignica, requerimientos atmosfricos, formacin de H2O respuesta a los colorantes, susceptibilidad a lisis por Brucella Bacterfagos, resistencia a antibiticos, etc.
DIAGNSTICO DE BRUCELOSIS Se realiza mediante: 1.Cultivo o aislamiento de Brucella: De sangre, lquidos aspticos, orina, heces o material patolgico. 2.Deteccin de anticuerpos contra Brucella: En el suero de pacientes: PRUEBAS SEROLOGICAS.
I. AISLAMIENTO DE BRUCELLA
1. CULTIVO DE SANGRE (HEMOCULTIVO) Es regla importante realizar esta prueba a partir de pacientes en fase aguda de la enfermedad. Las muestras de sangre deben obtenerse antes de comenzar el tratamiento antibitico. Nunca debe confiarse en el resultado de un solo hemocultivo, debe hacerse 3 o 4 en un lapso de 24 horas tratando de tomar las muestras durante el episodio febril. Por la escasez de Brucella en la sangre circulante u otros lquidos corporales, los medios lquidos son adecuados que los slidos como primer paso en el aislamiento de estos organismos.
2.
MEDIO BIFSICO DE RUIZ CASTAEDA Es el medio de cultivo ms adecuado para el aislamiento no solo de Brucella sino tambin en otras bacterias. Consta de un medio slido y lquido dentro de un mismo recipiente.
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UNFV FMHU
COMPOSICIN: AGAR TRIPTOSA: Triptosa D () Glucosa CINa Tiamina Dicloruro Agar Agar pH CALDO TRITOSA: Triptosa 20 g/L CINa 5 g/L Dextrosa 1 g/L H2O esp 1 g/L pH 7,2
20 g/L 1 g/L 5 g/L 0,005 g/L 13 g/L 7,3
Frasco de Castaeda
II. EXPERIMENTO 1
Tcnica de Hemocultivo 1. Materiales: Frasco con medio de Ruiz Castaeda (Preferible 2). Alcohol, tintura de yodo, ligadura, gasa estril. Jeringa de 10cc Procedimiento: Marcar los frascos con el nombre del paciente. Aplicar el torniquete con la ligadura en el brazo elegido, y limpiar vigorosamente la piel de la zona de venopuntura elegida con algodn y alcohol, luego con gasa embebida en tintura de yodo. Dejar secar. Quitar las tapas de los frascos y limpiar con alcohol los diafragmas de jebe. Usando jeringa estril sacar 10cc de sangre del paciente sospechoso. Sin cambiar de aguja distribuir 5cc en cada frasco. Colocar las tapas de los frascos. Mezclar el contenido del frasco inclinndolo suavemente 2 o 3 veces, llevar a incubar a 37C, y 1 de los frascos en atmsfera con 10% de CO 2, manteniendo los frascos en posicin vertical. A intervalos de 48 horas el frasco se inclina para que la mezcla lquida corra sobre el plano inclinado de agar (transferencia), previamente a esta operacin se examina cuidadosamente el plano para observar si han crecido o no colonias sobre l. Los cultivos de sangre para brucelosis deben incubarse 3 semanas como mnimo (preferible 28 das) antes de descartarlos como negativos. Resultados: Las colonias de Brucela aparecen comnmente despus de la 3era transferencia. Si la capa de agar muestra colonias despus de 24 a 48 hrs, es probable que el cultivo se halla contaminado. Las colonias que aparecen a la 72 a 96 hrs. (entre la 1era. y la 2da. Transferencia) son generalmente Salmonellas, Estafilococos, Streptococos, Haemofilus o Coliformes. Observacin microscpica de Brucella: Se entregar a los alumnos lminas preparadas para ser observadas al microscopio a mayor aumento con lente de inmersin. Frotis y Tincin: Con ayuda del asa de kolle tomar una muestra de colonia sospechosa del frasco de Ruiz Castaeda, hacer un extendido sobre un porta objeto y fijar. Teir con tincin de Gram y observar al microscopio.
2.
3.
4.
5.
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UNFV FMHU III. EXPERIMENTO 2

Identificacin de especies de Brucella La identificacin de la especies de Brucella se realiza principalmente en base a la necesidad de CO2, para su crecimiento, produccin de H2S, y efecto de los colorantes sobre su crecimiento. Los medios diferenciales usados son los que contienen Fucsina y Tionina. 1. Materiales: Frasco de R.C. con colonias sospechosas. Placas de Agar con Fucsina y Tionina. Asa de Kolle, mechero. Tres tubos de caldo con cepas de B. melitensis, B. abortus y suis.
2.
Procedimiento: Tomar las placas (2) de agar y con el lpiz de cera dividirla en 4 cuadrantes. Numerarlos del 1 al 4.
1: B.m. 2: B.a. 3: B.s.
Col. Sospechosa
Col. Sospechosa
Sembrar por estra las 3 cepas dadas en las cuadrantes 1, 2 y 3 de cada placa Tome con el asa una muestra de 1 colonia sospechosa del plano inclinado del frasco de Ruiz Castaeda y siembre por estra en el cuadrante N 4 de cada una de las placas. Incube a 37C por 24 hrs.
3.
Resultados : ESPECIE B. melitensis B. abortus B. suis FUCSINA + + TIONINA + +
Positivo: Crecimiento de colonias transparentes, superficie lisa a 5mm de dimetro. Negativo: Inhibicin. Ausencia de colonias Observe el sector 4 de ambas placas e identifique la especie de B. Aislada 4. Referencia: Diagnstico serolgico Despus de ceder los sntomas agudas, los cultivos de sangre son generalmente negativos pero para entonces ya existen en el suero del placiente anticuerpo demostrables. El principal mtodo de diagnstico serolgico es la prueba de aglutinacin Materiales: Suero de paciente sospechosa Antgeno: Brucellas muertas en suspensin
5.
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UNFV FMHU
6. Procedimiento: Sobre una placa de vidrio colocar una gota del suero del paciente y luego agregar sobre ella una gota de antgeno. Mezclar ambas gotas usando un palillo de dientes, por unos minutos.
7.
Resultados: Positivo: Aglutinacin Negativo: No aglutinacin
Caractersticas de la brucelosis humana

Especie Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis Brocella canis Reservorio animal Cabras, ovejas Ganado vacuno Cerdos Perros Sndromes clnicos Enfermedad aguda grave con complicaciones (frecuente) Enfermedad leve con complicaciones supurativas (frecuente) Enfermedad crnica, supurativa y destructiva Enfermedad leve con complicaciones supurativas (rara)
Respuesta de anticuerpos en la brucelosis no tratada
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UNFV FMHU IV. DIAGNSTICO INDIRECTO

Las pruebas serolgcas indican las titulaciones de anticuerpos especficos presentes en cada paciente. Las ms utilizadas se comentan a continuacin.
Aglutinacin
En sus diferentes modalidades, es la prueba ms utilizada debido a su rapidez y sensibilidad. El aumento significativo del ttulo de anticuerpos es la base diagnstica de la enfermedad. Rosa de Bengala: Utiliza como antgeno en una suspensin bacteriana a la que se ha aadido el colorante rosa de bengala, enfrentndola al suero sin diluir del enfermo. Proporciona una aproximacin diagnstica en pocos minutos con una sensibilidad y especificidad muy altas. Presenta elevado grado de correlacin con la seroaglutinacin y, por su simplicidad, es muy til como prueba de despistaje inicial o screening. Serogalutinacin en tubo o placa con pocillos: Enfrenta diluciones crecientes del suero problema a una cantidad constante de B. abortus. Este antgeno reacciona tanto con anticuerpos de esa especie como frente a los de B. melitensis y B. suis, que son las tres especies responsables en la prctica de la totalidad de enfermos con brucelosis. El ttulo positivo de 1/160 se considera, en un pas endmico, el punto de corte en el diagnstico de la enfermedad. Debido a que los anticuerpos responsables de la serogalutinacin son fundamentalmente de la clase IgM, lo habitual es que vayan descendiendo en el transcurso de 3-6 meses, con o sin curacin de la enfermedad. Prueba de Coombs: Es de gran inters para el diagnstico de la brucelosis crnica. Se utiliza para demostrar la presencia de anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes, fundamentalmente IgG. El suero de Coombs (inmunoglobulina humana) se encargara de facilitar la aglutinacin de los anticuerpos no aglutinantes del suero problema, fijados a la suspensin antignica de B. abortus. El ttulo obtenido es, por ello, como mnimo el de la aglutinacin y generalmente es mucho ms elevado, tanto ms cuanto mayor es el tiempo de evolucin de la enfermedad. Pueden persistir en ocasiones de forma prolongada y con titulacin elevada, incluso en pacientes con tratamiento adecuado y buena evolucin clnica. Serogalutinacin tras tratamiento del suero con 2-mercaptoetanol: Es una modificacin de la seroaglutinacin en la que se usa solucin salina al 0,85% con 0,1 M de 2-mercaptoetanol. Este compuesto es capaz de destruir las molculas de IgM, perdiendo stas su capacidad aglutinante, sin interferir con las de IgG que son las que se cuantifican. Se considera la persistencia de anticuerpos resistentes al tratamiento con 2-mercaptoetanol como indicativa de la actividad de la enfermedad. Enzimoinmunoanlisis Con estas tcnicas podemos detectar la presencia de los anticuerpos especficos que seleccionemos (IgG, IgM o IgA), con unos valores excelentes de sensibilidad y especificidad El antgeno absorbido sobre placas de poliestireno es, fundamentalmente, el lipopolisacrido de brucelas en fase lisa. Los anticuerpos IgM, por su rpida desaparicin son valorables, pero no puede olvidarse los anticuerpos IgG pueden persistir en sujetos curados. Aunque permiten conocer una mayor precisin el perfil de las inmunoglobulinas en el curso de la enfermedad, tampoco ofrecen la posibilidad de establecer un criterio para discernir entre curacin y evolucin a cronicidad.
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PRCTICA
Estudio de los Gneros Haemophilus y Bordetella

I. EXPERIMENTO 1 Gnero Haemophilus
Son bacilos gram negativos que requieren para su crecimiento factores presentes en sangre denominados X y V. Existen cepas ms virulentas que son conformados por organismos encapsulados y que son responsables de los cuadros invasivos como meningitis bacteriana aguda en nios, y cepas de organismo no encapsulados que estn asociados a infecciones crnicas del aparato respiratorio; estos organismos cultivados de LCR o esputo en el primer o segundo casos van a dar colonias lisas o rugosas respectivamente. El medio apropiado para su crecimiento es el agar chocolate. En agar sangre el crecimiento es escaso por la presencia en l de inhibidores; sin embargo en este medio puede crecer alrededor de las colonias de estafilococo, ya que este ltimo germen le proporciona el factor V, a estos se llama Fenmeno de Satelitismo.
3.
Materiales: Agar sangre Cepa de estafilococo Cepa de haemophilus Agar chocolate
4.
Procedimiento: Sembrar por estra en toda la superficie de la placa de agar chocolate la cepa de Haemophilus. Incube a 37C por 24 horas con 10% de CO2 Haga lo mismo en la placa de agar sangre, e inmediatamente siempre por puntura en diferentes zonas de la placa el estafilococo.
Haemophilus
ESTAFILOCOCO AGAR CHOCOLATE Incubar A 37C por 24 horas. AGAR SANGRE
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5. Resultados: Observe y anote en su cuaderno de prctica las caractersticas de las colonias de Haemophilus obtenidas en la placa de agar chocolate. En la placa de agar sangre observe el fenmeno de satelitismo
II. EXPERIMENTO 2 Gnero Bordetella

Son bacilos gram negativos pequeos, capsulados, aerobios estrictos, que incluye 3 especies de los cuales la ms importante es la B. pertuasis responsable de una enfermedad aguda localizada en vas areas caracterizada por tos paroxstica denominada Tos quintosa. Para el diagnstico de esta enfermedad es fundamental el aislamiento del germen a partir de la secrecin bronquial o nasofaringe. 1. Material: Medio de Bordet Gengou Procedimiento: Abrir placa acercndola a ms o menos 15 cm de la boca de un nio sospechoso de tener la enfermedad (tos ferina), en el momento del acceso. Tapar la placa. Incubar a 37C por 24 hrs Resultados: Observe y grafique en su cuaderno de prctica las caractersticas de las colonias.
2.
3.
Especies Bordetella y sus enfermedades

Gnero Bordetella Especies pertussis parapertussis bronchiseptica Enfermedad Tos ferina Tos ferina Enfermedad broncopulmonar
Presentacin clnica de la tos ferina
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UNFV FMHU Especies de Haemophilus que se asocian con las enfermedades humanas
Especie H. influenzae H. ducreyi H. aphrophilus H. para influenzae H. haemolyticus H.parahaemolyticus H.paraphrophilus H. segnis Enfermedad primaria Neumona, sinusitis, otitis, conjuntivitis, meningitis, epiglotitis, celulitis, bacteriemia Chancroide Endocarditis, infecciones oportunistas Bacteriemia, endocarditis, infecciones oportunistas Infecciones oportunistas Infecciones oportunistas Infecciones oportunistas Infecciones oportunistas Frecuencia Frecuente Infrecuente (en EE.UU.) Infrecuente Raro Raro Raro Raro Raro
Las infecciones por H. influenzae tipo B suelen ser invasivas, la meningitis, epiglotitis, celulitis, artritis y conjuntivitis son las que se declara mas a menudo. Los cultivos de LCR y sangre (en meningitis) son gral. positivos a menos que halla recibido tratamiento antibiotico.
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PRCTICA
Aislamiento de Entero-Patgenos Coprocultivo

1. Materiales: Medio de transporte: Cary y Blair (CB) Isopo Medio Mac Conkey (MC) Medio Desoxicolato citrato (DC) Caldo Selenito (CS) Asa bacteriolgica en argolla
2.
Procedimiento: La muestra en el medio de transporte (CB) se sembrar segn indicaciones del profesor de prcticas en los medios de aislamiento primaria. Para estas prcticas se usar: el (MC) y el (DC). Sembrar el medio de enriquecimiento (CS), siguiendo las indicaciones del profesor Incubar a 37C por 24 hrs. Comentario: Los enteropatgenos actan por invasividad, pudiendo llegar hasta la sangre. Tambin lo hacen por toxigenicidad en ambos casos es posible el aislamiento del agente a partir de las heces. Sin embargo un solo medio de cultivo no es suficiente para aislar todos los agentes de infecciones entricos, siendo necesario el uso de varios medios de cultivo para el aislamiento primario y otros tantos para el aislamiento previo enriquecimiento. En nuestras prcticas se incidir mayormente en ENTEROBACTERIACEAE.
3.
I. DIFERENCIACIN BIOQUIMICA
1. Materiales: Placas con colonias en (MC DC) Tubos de TSI (5) Tubos de LIA (5) Papel para indol (5) Caldo selenito sembrado Placas con SS agar Asa en aguja
Procedimiento: Estudiar las caractersticas de las colonias en los diferentes medios de cultivo Con el asa en aguja picar la colonia escogida y repicar por una sola vez en TSI hasta el fondo y con el mismo inculo repicar por tercera vez en el espesor del medio LIA hasta el fondo. Colocar el papel para indol en el tubo de LIA Sembrar con el asa en argolla el medio SS agar a partir del selenito Incubar a 37 C por 18 - 24 horas. 3. Comentario: La prueba bioqumicas permiten diferenciar a los patgenos de otros inocuos. Estas pruebas son bsicas y previas al estudio o paso siguiente que son las pruebas serolgicas. El medio TSI tiene
2.
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como sustrato: la glucosa (1%), lactosa (10%) y sacarosa (10%) adems se puede leer la produccin de H2S y la produccin de gas a partir de los azcares usados.
Identificacin presuntiva y rpida, de bacterias entricas gramnegativas

Fermentacin rpida de lactosa
Echerichia coli: brillo metlico sobre medio diferencial; dotado de motilidad; colonias no viscosas, aplanadas. Enterobacter aerogenes: colonias elevadas, sin brillo metlico; con frecuencia mtiles; crecimiento ms viscoso. Klebsiella pneumoniae: muy viscoso, crecimiento mocoide, no mtil
Fermentacin lenta de lactosa

Edwardsiella Serratia Ctitrobacter Arizona Providencia Erwinia.
Sin fermentacin de lactosa

Especies de Shigella: carentes de motilidad, no forman gas a partir de la gluscosa. Especies de Salmonella: dotado de motilidad; generalmente forman cido y gas a partir de la glucosa. Especies de Proteus: swarming sobre agar; hidrlisis rpida de la urea (olor amonacal). Especies de Pseudomonas: pigmentos solubles, fluorescencia azul verdosa; olor dulzn.
Familia Enterobacteriaceae TSI

GAS (+) Salmonella Arizona Edwardsiella Citrobacter Proteus Echerichia Enterobacter Klebsiella Providencia serratia Salmonella paratifica GAS (-) Salmonella typhi
H2S (+)
H2S (-)
Shigella Yersinia Proteus Providencia serratia Escherichia enterobacter
El medio LIA tiene como sustrato principal a la Lisina la cual puede ser desaminada, descarboxilada o bien no ser lisada. Como sustrato diferencial este medio tiene glucosa (1%). Segn estas indicaciones se puede observar las siguientes divisiones.
INDOL (+) DESCARBOXILACION Escherichia coli Edwarsiella Proteus vulgaris Providencia Citrobacter Yersinia Shigella Escherichia coli
INDOL (-) Salmonella typhi Arizona Klebsiella serratia Enterobacter Proteus mirabilis Yersinia Serratia Shigella Enterobacter
DESAMINACION
NEGATIVO
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Tabla para identificacin de Enterobacterias
Citrato de Simons
Gas
H2S
Indol
Lisina
Motilidad
Ornitina
Sacarosa
Ureasa
Lactosa
Gelatinasa
Glucosa
Citrobacter Edwardsiella Enterobacter Echerichia Klebsiella Morganella Proteus Providencia Salmonella Serratia Shigella Yersinia
+ + V V V + V + -
+ + + + V V V V V V V
V + V V -
V + + V + V + V V V
+ V + V V V -
+ + + V + + + + + -
V + + V + V V V V V
V + V V V V V V
V V V + + V V
V V + + + V V
-/V + V/+ -/V
+ + + + + + + + + + + +
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UNFV FMHU II. DIFERENCIACIN SEROLGICA

1. Materiales: Cultivo sospechoso de Salmonella typhi Cultivo sospechoso de Salmonella paratyphi B Cultivo sospechoso de Salmonella paratyphi A Cultivo sospechoso de Shigella Lminas de vidrio 1x3 (5) Suero polivalentes y agrupadores de Salmonella y Shigella Suero fisiolgico formolado Asa en argolla Depsito con mezcla sulfocrmica Lpiz de vidrio. Procedimiento: Marcar con el lpiz de vidrio 4 cuadrados por lmina Colocar en la parte superior del cuadrado una gota de suero fisiolgico formolado. Tomar con el asa una pequea porcin del cultivo en TSI o LIA y suspender homogneamente en la gota suero fisiolgico formolada. En el lado opuesto colocar una gota del suero polivalente Mezclar ambas gotas con el asa y leer a contra luz. Registrar los resultados y proseguir con los otro sueros hasta determinar serogrupos. Comentario: UTILIZANDO LOS SUEROS ESPECIFICOS (ANTICUERPOS) se puede determinar hasta serotipos. La reaccin antgenoanticuerpo es de aglutinacin. La determinacin serolgico de las bacterias tienen gran utilidad epidemiolgica serolgica y clnica. Segn la pruebas serolgicas se puede determinar las siguientes reacciones en SALMONELLA. POLV. S. Typhi Salmonella newport Salmonella para tiphy A +++ +++ +++ A ++ SHIGELLA A S. Dysenteriae S. Flexneri S. Boydil S. Sonnei . ++ B ++ C ++ D ++ B C1 C2 ++ D ++ E -
2.
3.
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UNFV FMHU
Familia Enterobacteriaceae
TRIBU
Tribu I Escherichieae
GNEROS
Gnero Escherichia Gnero Shiguella
Tribu II Edwardsielleae Tribu III Salmonelleae Tribu IV Citrobactereae Tribu V Klebsielleae
Gnero Edwardsiella Gnero Salmonella Gnero Citrobacter Gnero Klebsiella Gnero Proteus.
Tribu VI Proeteeae
Gnero Morganella Gnero Providencia
Tribu VII Yersinieae
Gnero Yersinia
Otros gneros de la familia Enterobacteriaceae son Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, K/uyvera, Koserella, Leminore/la, Moellerella, Obesumbacterium, Rhanella, Tatume/la, Xenorhabdus y Yokenella, as como diversos grupos entricos sin denominacin.
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UNFV FMHU Localizacin de las infecciones producidas por las enterobacterias
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PRCTICA
Estudio de Bacilos aerobios esporulados: Bacillus

A este gnero pertenecen microorganismos de forma bacilar, Gram positivo esporulados, que se agrupan en cadenas y que requiere O2 para su metabolismo; son en su mayora saprofitos, ( B. cereus, B. subtilis), excepto B. anthracis que es patgeno para el hombre y animales. En la presente prctica se pondr en evidencia los caracteres microscpicos (forma del bacilo, localizacin de las esporas), culturales, presencia de hemlisis, accin sobre las protenas (gelatina), movilidad, y accin sobre el almidn.
I. OBSERVACIN MICROSCPICA: COLORACIN DE GRAM Y WIRTZ

Tomar una muestra de espcimen o cepa de Bacillus y hacer frotis en 2 lminas. Teir una de ella con Gram y la otra con Verde Malaquita (coloracin de Wirtz). Secar las lminas y observar al microscopio con lente de inmersin.
II. SIEMBRA EN MEDIO DE CULTIVO

Medios de cultivo a usarse: Agar sangre, medio SIM, medio gelatina, agar almidn, 2 de cada uno. 1. Materiales: Cepas de B. anthracis B. subtilis en caldo Mechero, Asa de Kolle. Procedimiento: Sembrar por estra las cepas de B. anthracis y B. subtilis en una de cada placa de Agar sangre y Agar almidn. Sembrar cada cepa, por puntura en el medio SIM, hace los mismo con los tubos del medio gelatina. Incubar a 37C por 24 horas, marcando previamente cada placa y tubo. Resultados : Medio Agar sangre (hemlisis) Agar almidn Gelatina Medio SIM Bacillus anthracis Negativo o Alfa leve No hidroliza el almidn No licua o lo hace lentamente No mvil Pino invertido Bacillus subtilis Beta Hidroliza del Almidn Licua rpidamente Mvil
2.
3.
NOTA: Para observar la hidrlisis del almidn, dejar caer unas gotas de lugol sobre la superficie de la placa de este medio, tratando de que se distribuya regularmente. La zona del medio en la que no ha habido hidrlisis del almidn se teir de azul, mientras que aquellas en que si ha ocurrido la hidrlisis se teir del color marrn propio del lugol.
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UNFV FMHU Las especies de Bacillus y sus enfermedades

Microorganismo B. anthracis* B. cereus* Enfermedades Carbunco (cutneo, gastrointestinal, por inhalacin) Gastroenteritis (emtica, diarreica), infecciones oculares, sepsis relacionadas con el catter, infecciones oportunistas. Gastroenteritis, infecciones oportunistas. Gastroenteritis, infecciones oportunistas. Infecciones oportunistas.
B. mycoides* B. thuringiensis* Otras especies de Bacillus.
Epidemiologa del ntrax en los huspedes animales y humanos:
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UNFV FMHU III. GENERO CORYNEBACTERIUM

Son bacilos Gram (+), no esporulados, inmviles; algunas especies forman parte de la flora normal del sistema respiratorio, piel, etc. La especie patgena representativa de este gnero es el C. Diphtheriae, productora de una poderosa exotoxina causante del cuadro clnico en el hombre. El aspecto morfolgico es caracterstico, presentando forma alargada con dilatacin en uno de sus extremos, en su interior se observan los grnulos Metacromticos que son teidos intensamente por los colorantes bsicos. El cultivo se realiza en el Medio de Suero Coagulado de Loeffer o en Gelosa Sangre cistina-telurito en el cual se puede diferenciar los tres tipos de C. diphtheriae: Mitis, Gravis e Intermedius. 1. Materiales (Observacin del crecimiento): Cepa de C. diphtheriae Placas con medio de cultivo con agar telurito de potasio Asa y mechero
2.
Procedimiento: Coger 2 azadas del caldo que contiene C. d. y sembrar en la placa por estras. Llevar a la incubadora por 24 horas. Hacer la lectura para identificar las diferentes variedades al siguiente da Materiales (Observacin morfolgica y grnulos metacromticos). Coloracin de Gram y Albert: Cepas de C. diphtheriae Lminas Azul de metileno Lugol
3.
4.
Procedimiento : (Col. de Albert para observar grnulos metacromticos) Fijar la muestra Cubrir la lmina con azul de metileno de 1 a 2 min. Lavar con agua corriente Aplicar lugol por 1 min. Lavar con agua Secar y observar a inmersin Haga otro frotis, coloree con tincin de Gram para observar morfologa.
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UNFV FMHU Especies de Corynebacterium asociadas con enfermedades humanas

Microorganismo C. diphtheriae C. jeikeium (grupo jk) Enfermedades Difteria (respiratoria, cutnea); faringitis y endocarditis (cepas no toxignicas). Septicemia, endocarditis, infeccin de heridas, infecciones asociadas a cuerpo extrao (catter, anastomosis, prtesis). Infecciones del tracto urinario, incluyendo pielonefritis y cistitis con litiasis alcalina, endocarditis, infeccin de heridas. Infeccin de heridas, infecciones asociadas a cuerpos extraos, septicemia, infecciones del tracto urinario, infecciones respiratorias. Infecciones del tracto genitourinario (hombres). Infecciones del tracto genitourinario (mujeres). Infecciones oculares. Infecciones de heridas, infecciones del tracto respiratorio. Infecciones del tracto respiratorio, endocarditis. Linfadenitis, linfangitis ulcerativa, formacin de abscesos. Infeccin de heridas, infecciones respiratorias, infecciones asociadas a cuerpo extrao. Difteria respiratoria.
C. urealyticum (grupo D2)
C. amycolatum C. glucuronolyticum C. riegelii C. macginleyi C. minutissimum C. psudodiphtheriticum C. pseudotuberculosis C. striatum C. ulcerans
Agar Telurito Potasio

El telurito inhibe la flora acompaante. Reducen el telurito dando colonias grises a negras. Grises con centro oscuro: Corynebacterium difteriae Grandes mates: Tipo gravis Grandes lustrosas: Tipo mitis Pequeas: Tipo intermendias
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UNFV FMHU
PRCTICA
Gnero Clostridium (Bacilos Anaerobios Esporulados)
Son bacilos Gram (+) producen esporas, son anaerobios, su habitat natural es el suelo, intestino del hombre; existen especies saprofitas y otras patgenas, dentro de estas ltimas tenemos: C. botulinum causa el Botulismo C. tetani causa el ttanos C. perfringens causa la Gangrena gaseosa Estos microorganismos para su crecimiento requieren de condiciones especiales como es la ausencia de O2 (medio anaerobis), el cual puede lograrse utilizando la cmara Brewer o el Gaspack y medio reductores como el caldo carne, o el empleo de agentes reductores como el thioglicolato. Para la observacin de la morfologa se debe tener presente la posicin de las esporas en las diferentes especies antes mencionadas.
3.
Materiales (Observacin del crecimiento): Cepa de Clostridium Tubos con caldo de carne o thioglicolato Asa y mechero Procedimiento: Sembrar por azadas (2) en el medio indicado Incubar por 24 hrs Observar las caractersticas del cambio ocurrido en el medio Materiales (Observacin de la morfologa y esporas): Cepas de clostridium Colorante de verde de malaquita y safranina Asa y mechero Procedimiento: Coloracin Wirtz Fijar la muestra tomndola de la parte ms turbia del tubo. Agregar verde de malaquita y realizar 3 flameadas en 5 min. Lavar a chorro lento. Agregar colorante de contraste Lavar y secar Observar las esporas
4.
5.
6.
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UNFV FMHU Clostridios patgenos y sus enfermedades humanas asociadas *

Especies Enfermeded humana Frecuencia
C. difficile C. perfringens Diarrea asociada a antibiticos, colitis seudomembranosa. Infecciones de los tejidos blandos (p. ej., celulitis, miositis supurativa, mionecrosis o gangrena gaseosa), intoxicacin alimentaria, enteritis necrotizante, septicemia. Gangrena gaseosa, septicemia. Infecciones oportunistas. Botulismo. Ttanos. Botulismo. Botulismo. Gangrena gaseosa. Gangrena gaseosa. Gangrena gaseosa.
Frecuente
Frecuente
C. septicum C. tertium C. botulinum C. tetani C. barati C. butyricum C. bystolyticum C. novyi C. sordellii
Infrecuente Infrecuente Infrecuente Infrecuente Raro Raro Raro Raro Raro
*Otras especies de clostridio se han asociado con enfermedad humana, pero lo han hecho fundamentalmente como patgenos oportunistas. Adems, algunas especies (p. ej., C. clostridioforme, C. innocuum, C. ramosum), se aslan con frecuencia pero rara vez se asocian con enfermedad.
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UNFV FMHU
PRCTICA
Familia Pseudomonadaceae
La Pseudomona es un bacilo gram negativo mvil, que pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Es relativamente ubicua y comnmente se la encuentra en el polvo, el agua, las plantas y verduras, medio ambiente marino y animales. Puede crecer bien en diferentes medios y soporta gran variedad de condiciones fsicas. Si bien su predileccin son los ambientes hmedos la P. aeruginosa es primariamente un patgeno hospitalario y causa enfermedad en forma frecuente a huspedes normales. La adherencia de la Pseudomona al epitelio celular, se ve favorecida por la injuria celular conocida como adherencia oportunista- procesos tales como la intubacin, cateterizacin urinaria, y trauma que crea injuria celular, pueden facilitar la adherencia de la Pseudomona.
Infecciones que produce Las infecciones comunes producidas por Pseudomonas incluyen bacteriemias particularmente importantes en huspedes inmunocomprometidos- otitis externa y media, infecciones respiratorias, infecciones del tracto urinario, e infecciones de herida en pacientes quemados. Tambin puede causar infecciones del sitio quirrgico y han sido responsables de epidemias del sitio quirrgico. Otras infecciones como osteomielitis, artritis, infecciones de piel, infecciones gastrointestinales, del sistema nervioso central generalmente seguidas de una ciruga- endocarditis, abscesos han implicado a la Pseudomonas.
Epidemiologia De acuerdo a distintas fuentes bibliogrficas, la Pseudomonas es responsable del 17% de las neumonas asociadas a asistencia respiratoria mecnica, 11% de infecciones del tracto urinario, y 3.8% de bacteriemias primarias en las unidades de cuidados intensivos de adultos. Sin embargo en las unidades de pacientes quemados la P. aeruginosa, es causa del 21.5% de las neumonas; 20% de las infecciones urinarias y 9% de las bacteriemias primarias. Otros estudios muestran que la P. aeruginosa es el gram negativo mas frecuentemente aislado (27%) y el mas comnmente encontrado en los cultivos de traqueostomas.
1.
Materiales: Cepa de Pseudomona Aeruginosa Agar Cetrimida (*)
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UNFV FMHU
*AGAR CETRIMIDA Medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del gnero. Fundamento La frmula de este medio est desarrollada para favorecer la seleccin de P. aeruginosa y estimular la formacin de pigmentos el cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formacin de piocianina, pioverdina y piomelanina de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catinico que acta como agente inhibidor, libera el nitrgeno y el fsforo de las clulas de casi toda la flora acompaante, aunque inhibe tambin algunas especies de Pseudomonas.
Frmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina Cloruro de magnesio Sulfato de potasio Agar Cetrimida 20.0 1.4 10.0 13.6 0.3
Instrucciones Suspender 45,3 g del polvo por litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerina. Dejar reposar 5 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Distribuir en tubos o frascos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121C.
pH final: 7.2 0.2
Siembra En superficie, por inoculacin directa de la muestra o a partir de un caldo de enriquecimiento (Cerebro Corazn Infusin o Triptena Soya Caldo).
Incubacin De 24
48
horas
35-37
C,
en
aerobiosis.
Resultados
Microorganismos Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923
Crecimiento Bueno - excelente Inhibido Inhibido
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UNFV FMHU
PRCTICA
Familia Spirochaetaceae
10
Las espiroquetas son abundantes en la flora bacteriana y facilitan al alumno para la observacin morfolgica mediante las tinciones simples.
1.
Materiales: Obtencin de sarro dentario Lminas porta objetos Colorantes de Gram y Azul de metileno Lminas colocadas en espirilos Procedimiento: Obtener sarro dentario de los alumnos, escoger con infecciones frecuentes en la boca, hacer un extendido en una lmina porta objetos, fijar con alcohol y hacer una coloracin de Gram, otra con violeta de genciana sola durante 1 minuto y una tercera lmina con azul de metileno. Secar la lmina y observar al microscopio. Se observarn las lminas que se presentan en la prctica.
2.
La observacin de leptospiras y borrelia, se realiza en la prctica de lminas preparadas que se presentan para sus observaciones. Tratar de ubicar las caractersticas propias de cada gnero.
Pruebas serolgicas para sfilis

Antgeno Reagina no treponmica Fuente del antgeno Pruebas Fijacin de complemento: Wasserman, Kolmer Floculacin: VDRL, Kahn, Hinton
Extractos de tejidos (Cardiolipina Lecitina - Colesterol)
T. Pallidum Cepa Reiter T. Pallidum Treponmico
FCPR (Fij. de complemento con prot. de Reiter) TPI (Inmovilizacin de T. Pallidum) FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibody Absortion) IgM FTA ABS (Inmunoglobulina M Fluorescent Treponemal Absortion)
- 105 -
UNFV FMHU Orden de Spirochaetales

Spirochaetales Fam. Spirochaetaceae Gnero Borrelia Enfermedad humana Fiebre recurrente epidmica Fiebre recurrente epidmica Borreliosis de Lyme Agente etiolgico Borrelia recurrentis Muchas especies de Borrelia Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii
Gnero Cristispira Gnero Serpulina Gnero Spirochaeta Gnero Treponema
Ninguna Ninguna Ninguna Sfilis Bejel Frambesia Pinta Ninguna Leptospirosis Ninguna
T. pallidum subespecie pallidum T. pallidum subespecie endemicum T. pallidum subespecie pertenue Treponema carateum Leptospira interrogans -
Fam. Leptospiraceae Gnero Leptosnema Gnero Leptospira Gnero Turneria
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UNFV FMHU
PRCTICA
Gnero Micobacterium
11
FAMILIA: GENERO: ESPECIES:
MICOBACTERIACEAE MYCOBACTERIUM M. Tuberculosis (Bacilo de Koch) M. Leprae (Bacilo de Hansen)
Mycobacterium Tuberculosis: V. hominis Micobacterias tpicas: Bovis Avium Microtii Grupo I (Fotocromgenos) Grupo II (Escotocromgenos) Grupo III (No cromgenos) Grupo IV (de crecimiento rpido)
Bacilos Atpicos segn Runyon:
I. DIAGNOSTICO BACTERIOLGICO DE M. TUBERCULOSIS

A) Por examen directo B) Por cultivo C) Por inoculacin
II. OBTENCION DE LA MUESTRA

El M. Tuberculosis se puede aislar de diversos productos patolgicos: esputo, lavado gstrico, orina, LCR, lquido asctico, secrecin de fstulas, heces, lesiones de pie, huesos, etc. La forma correcta de obtencin de muestras y su procedimiento forma todo un captulo especial.
III. EXAMEN DIRECTO

Tratndose de esputo, ste adquiere gran valor, pues nos permite adems de hacer el diagnstico, detectar aquellos pacientes bacilferos (de gran importancia desde el punto de vista epidemiolgico). Es un proceso sencillo, barato al alcance de cualquier centro de salud del pas. Se necesita solamente un personal entrenado, un microscopio, colorantes y lminas. Otra ventaja del examen directo, sigue ciertas normas estandarizadas, es el de poder detectar bacilos con resistencia primaria o secundaria y vigilar la eficacia de la droga antituberculosa. Colorantes: La coloracin indicada es la de Zhiel Neelsen Reactivos: A) Sol. de fucsina fenicada B) Sol. de alcohol cido C) Sol. de Azul de metileno o sol. Saturada de cido pcrico
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UNFV FMHU IV. METODOLOGA

Usando lpiz para vidrio dividir la lmina en tres tercios El primer tercio sirve para la rotulacin Hacer el frotis lo ms homogneo posible en los restantes dos tercios
V. TCNICAS DE COLORACIN
Preparar el frotis y fijar a la llama. Cubrir con el colorante (fucsina fenicada). Calentar a la llama hasta la produccin de tres humos. Lavar con agua de cao. Decolorar con alcohol cido. Lavar con agua de cao. Colorear con Azul de metileno. Lavar con agua de cao, secar y observar con lente de inmersin usando aceite de cedro. Los grmenes que retienen el calor rojo a pesar de la decoloracin son los llamados alcohol cido resistentes y destacando en un fondo de color azul.
VI. TCNICA DE LECTURA

Se debe colocar la lente de inmersin en la mitad del primer tercio y leer siguiendo el sentido de la flecha hacia la derecha como indica el grabado. Cuando se ha hecho esta operacin, significa que se ha ledo 100 campos. En caso de negatividad leer otros 100 campos siguiendo el sentido inverso de la flecha.
VII. MODO DE INFORMAR

No se encuentra bacilos en 200 campos: BK negativo Menos de 1, a un bacilos por campo en 100 campos: BK Positivo 1 De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos: BK Positivo 2 Ms de 10 bacilos por campos, por 20 campos: BK Positivo 3
VIII. OTROS TIPOS DE EXAMEN DIRECTO

Examen directo previa homogenizacin: usando hidrxido de Na al 4% y luego centrifugando el homogerizado. Del sedimento se hace frotis y coloracin. Se usa en aquellos esputos negativos al examen directo comn. Diagnstico Directo por fluorescencia: Se usa como colorante la Aureamina. Se necesita microscopio de fluorescencia. Se utiliza para el diagnstico en masa de centros de referencia.
IX. CULTIVOS
Se utiliza en aquellos casos en que pese a la negatividad del examen directo se sospecha de cuadro de TBC. Tambin se utiliza para el aislamiento de germen y poder realizar posteriormente pruebas de sensibilidad, virulencia y tipificacin de micobacterias. Hay especimenes que se pueden sembrar directamente: Ejemplo: LCR o las que proceden de cavidades cerradas, es decir, que no estn contaminadas. Otras en cambio, como el esputo, necesitan previamente de un proceso de DESCONTAMINACION. En general estos procesos descontaminacin tienen por objeto eliminar los grmenes comunes y poder recuperar el BK, mientras ms enrgico es el mtodo, hay menos peligro de contaminar el medio de cultivo y menos poder de recuperacin del Bacilo
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Tuberculoso, y al revs, mientras menos enrgico es el mtodo, hay mayor poder de recuperacin de BK pero mayor riesgo de contaminar el medio de cultivo. En los mtodos usados en la actualidad, el riesgo de contaminacin hasta un 4% se considera aceptable, por eso se deben inocular por los menos 2 tubos con medio Lowenstein Jensen.
X. MTODOS DE DESCONTAMINACIN
Mtodo en el que se usa NaOH y HCl, usando rojo de fenol como indicador. Otro mtodo recomendado es el de CORPER y STORNER en la que se emplea Trifosfato de Sodio.
XI. METODO DE SCHMIEDEL

Se usan dos soluciones: Solucin A NaOH Na2HPO4 12 H2O a.d. Solucin B CaCl2 6H2O BaCl2 2H2O a.d.
5grs 3grs 1000 ml.
3grs 2grs 1000 ml.
Procedimiento: A 2 ml. de esputo en un tubo estril con tapn de goma, se aade 8 ml de sol. A y 2 gotas de sol. B. Agitar fuertemente y dejar reposar 18 - 24 horas en la oscuridad temperatura ambiente; el sedimento se usa para la siembra utilizando pipeta de Pasteur. Se incuba en forma vertical los tubos inooculados.
XII. MEDIOS DE CULTIVO

El ms comnmente usado es el medio de Lowenstein Jensen que contiene todos los elementos necesarios para el crecimiento de BK e inhibidores para posibles contaminantes. La frmula contiene KH2PO4 anhidro, MgSO7 H2O, Citrato Magnsico, Asparagina, Glicerina q.p., agua destilada, harina de papas, huevos frescos, verde de Malaquita (sol. acuosa al 2%). Es un medio slido. Existen tambin medios lquidos como el medio de DUBOIS que contiene Tween 80. Otros sintticos como el de SULA. En medios slidos, el germen requiere no menos de 15 das para presentar desarrollo visible. Las colonias son de colorante, seca y rugosas.
XIII. METODOS DE SENSIBILIDAD A LAS DROGAS ANTITUBERCULOSAS

Se realiza incorporando las drogas a los medios de cultivo. Dos principalmente: El mtodo de las concentraciones Absolutas y el Mtodo de las Proporciones. Tambin se estn ensayando mtodos engorrosos y costosos, slo se realizan en laboratorios muy especializados.
XIV. PRUEBAS DE VIRULENCIA

Se utiliza las pruebas de Crecimiento en Cuerda (Factor Cord .); la prueba de la Niacina, la del rojo neutro, etc.
- 109 -
UNFV FMHU XV. INOCULACIONES

Se utiliza el cobayo; tiene el mismo valor que el cultivo. Se inocula para ciertos especmenes clnicos como LCR para evitar el riesgo de su contaminacin.
XVI. PRUEBAS INMUNOLGICAS

Prueba de la Cutirreaccin a la tuberculina (Sensibilidad Retardada). Otros tipos de pruebas de inmunidad humoral.
Pruebas usadas para diferenciar Mycobacterias

TIPICAS (No se toma en cuenta el microtil) ATIPICAS
Tuberculosis
Grupo III
Cordn Pigmento Catalasa Rojo Neutro Niacina Patogenicidad para el cobayo Patogenicidad para el conejo Patogenicidad para aves
+ Ante + Rojo + +++ +/No crece a 45C Debajo de 25C
+ Blanco + Rojo +++ +++ -
+ Blanco + Rojo + +++ Crece a 45C No a 25C
+/Amarillo o Rojo (a la Luz) +++ Brick-duat Polvo de ladrillo En 1 - 2 semana crece bien a 25C
Anaranjado (Luz oscura) +++ Brick-dust -
Blanco + Amarillo -
Blanco, anaranjado o Rojo + Amarillo Crece en menos de 1 semana y bien a 25C
Temperatura de desarrolla
Igual al anterior
Crece lentamente a 25C
Semejante al humano
XVII. OBSERVACIN DE CULTIVO ATPICOS

1. Materiales: Cultivo atpicos de M. Tuberculoso. Lminas coloreadas con M. leprae Procedimiento: El alumno observar al microscopio, las lminas con M. leprae tratando de fijar sus caractersticas propias de estos bacilos.
2.
Grupo IV -
Grupo II
Grupo I
avium
bovis
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UNFV FMHU Clasificacin de una seleccin de micobacterias patgenas para los humanos
Microorganismo Complejo de M. tuberculosis M. tuberculosis M. leproe M. africanum M. bovis M. ulcerans Grupo I de Runyon (fotocromgenos de crecimiento lento) M. kansasii M. marinum M. simiae Grupo II de Runyon (escotocromgenos de crecimiento lento) M. szulgai M. scrofulaceum M. xenopi Grupo III de Runyon (no cromgenos de crecimiento lento) Complejo M. Avium M. genavense M. haemophilium M. malmoense Grupo IV de Runyon (crecimiento rpido) M. fortuitum M. chelonae M. abscessus M. mucogenicum Patogenicidad Frecuencia
Patgeno estricto Patgeno estricto Patgeno estricto Patgeno estricto Patgeno estricto
Frecuente Infrecuente Raro Raro Raro
Gral. patgeno Gral. patgeno Gral. patgeno
Frecuente Infrecuente Infrecuente
Gral. patgeno A veces patgeno A veces patgeno
Infrecuente Infrecuente Infrecuente
Patgeno estricto Patgeno estricto Gral. patgeno Gral. patgeno
Frecuente Infrecuente Infrecuente Infrecuente
A veces patgeno A veces patgeno A veces patgeno A veces patgeno
Frecuente Frecuente Infrecuente Infrecuente
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PRCTICA
Observacin de lminas coloreadas con Rickettsia. Coloracin de Machiavello
12
1.
Materiales: Lminas coloreadas con Rickettsias Colorante de Machiavello Procedimiento : Observar al microscopio 45x las lminas coloreadas que ha sido entregadas. Las Rickettsias se observan en el citoplasma de la clula como pequeos cocobacilos rojo brillantes. La identificacin se establece solamente si los organismos se encuentran intracelularmente. Coloracin de Machiavello: Sol. A: Fucsina bsica al 0.25% en agua destilada Sol. B: Acido ctrico fresco al 0.4% en agua destilada Sol. C: Azul de metileno al 1% en agua destilada Proceso: Colocar la lmina fijada por 5 en sol. A. Decantar el colorante y sumergir la lmina en la sol B. Sacarla inmediatamente y colocarla en un recipiente con agua corriente. Sumergir la lmina en la sol C por 10. Lavar con agua corriente y secar con papel de filtro. Observar al microscopio. Dibujar en su hoja de informe.
2.
3.
4.
Rickettsias de inters mdico ORDEN: Rickettsiales
Familia Tribu I Gnero 1 Gnero 2 Tribu II Gnero 1
Rickettsiaceae Rickettsieae Rickettsia Coxiella Ehrlichieae Ehrlichia
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UNFV FMHU Epidemiologa de las rickettsiosis

Microorganismo R. conorii Enfermedad Fiebre botonosa mediterrnea Fiebre manchada de las Montaas Rocosas Viruela rickettsisica Fiebre de Queensland Rickettsiosis del Norte de Asia Tifus exantemtico epidmico Tifus exantemtico endmico Tifus de las malezas Vector Garrapata Reservorio Perro Roedores salvajes Roedores salvajes Perro Roedores salvajes Ratas Roedores Marsupiales Roedores salvajes Hombre Ardilla voladora Ratas Roedores Bueyes, ovejas, cabras, gatos, roedores salvajes Desconocido Distribucin geogrfica Pases Mediterrneos Africa, India
R. rickettsii
Garrapata
Amrica
R. akari R. australis R. sibirica R. prowazekii R. typhi R. tsutsugamushi
Acaro Garrapata Garrapata Piojo Pulga de la rata Acaro
Amrica del Norte Rusia, Corea, Africa Australia Siberia, Mongolia Africa, Asia, Centro y Sudamrica Mundial Asia, Australia, Islas del Pacfico
C. burnetii
Fiebre Q
Garrapata (*)
Mundial
E. senetsu
Sndrome mononuclesico Sndrome febril y leucopenia (Ehrlichiosis monoctica) Sndrome febril y leucopenia (Ehrlichiosis granuloctica)
Garrapata
Japn, Sudeste Asitico
E. chaffeensis
Garrapata
Caballos, perros, ciervos
Estados Unidos Europa, Africa
Erhlichia spp.
Garrapata
Caballos, perros, ciervos, rumiantes
Estados Unidos
(*) En el hombre la transmisin es normalmente por va directa (inhalacin).
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PRCTICA
Observacin de cultivo y lminas coloreadas con Bartonella
13
1.
Materiales : Lmina coloreadas con Bartonella Colorante de Leishman Procedimiento: Observar al microscopio 45.x lminas coloreadas que han sido entregadas. Examinarlas minuciosamente, poniendo especial atencin a la morfologa bacilar o cocoide y a la situacin de la Bartonella en relacin a los hemates. Dibujar en su hoja de informes.
2.
Especies de Bartonella asociadas con enfermedades humanas

Especie Enfermedades
B. bacillifomis B. quintana B. benselae
B. clarridgeiae B. elizabethae
Fiebre de Oroya (bartonelosis, enfermedad de Carrin). Fiebre de las trincheras; manifestaciones cutneas, subcutneas y seas de la angiomatosis bacilar; endocarditis. Enfermedad del araazo de gato; bacteriemia; manifestaciones cutneas, linfticas y hepatoesplnicas (peliosis heptica) de la angiomatosis bacilar; endocarditis. Endocarditis, enfermedad del araazo de gato. Endocarditis (raro).
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UNFV FMHU
PRCTICA
Observacin de colonias en medios especiales
14
1.
Materiales: Placas con medios de cultivo especiales conteniendo colonias de Mycoplasma. Procedimiento: Los Mycoplasma son elementos muy pequeos miden de 0.2 a 0.3 de micras. Son reconocidos por su formacin de colonias en medios slidos y la tpica formacin de colonias en huevo frito, estas colonias son visibles con aumento por ser muy pequeas y miden de 1 a 300 micras de dimetro. Los medios de cultivo especiales son: Caldo Mycoplasma base, Agar Mycoplasma base, que contienen peptona, extracto de carne y suero animal al 10 o 20%.
2.
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UNFV FMHU
A T L A S
Bacteriologa Aplicada
Staphylococcus. Streptococcus Spp. Neumococo. Neisseria Gonorrohoeae. Brucela Sp. Haemophilus Influenzae. Bordetella Pertusis. Enterobacterias. Bacillus Sp. Clostridium Sp. Corynebacterium diphtheriae. Spirilos. Mycobacterium Tuberculosis. Rickettssia. Bartonella.
Pseudomona.
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UNFV FMHU
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UNFV FMHU
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UNFV FMHU
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UNFV FMHU
I V
Virologa
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PRCTICA
Estudio de Bacterifagos. Mtodo de aislamiento de virus bacteriano.

El descubrimiento de los bacterifagos se hizo en 1915 por Twot, quien aporto mucho en el estudio de organizacin y replicacin del material gentico. Existe un bacterifago para cada especie bacteriana, esta especificidad es debida a receptores especficos existentes en las bacterias, la accin de los bacterifagos en ellas puede ser: A) Interaccin ltica.- Donde se multiplica el virus causando lisis de la bacteria. B) Interaccin transformadoras.- Donde el genoma viral se integra al genoma del husped El ciclo de multiplicacin viral se divide en: - Adsorcin (atraccin crnica y receptores especficos) - Penetracin (ingreso del citoplasma viral al husped) - Multiplicacin (en la bacteria receptora)
I. EXPERIMENTO 1
1. Materiales: Caldo de cultivo de 4 horas de Escherichia coli. Cloruro de calcio al 1.5% Filtrado de fago Agar nutritivo Agar blanco Placas Petri estriles Pipetas estriles de 1cc graduada al 0.1 Tubos estriles Procedimiento: Colocar en un tubo de prueba: 0.5cc de fago, agregar 0.2 de cepa de E.coli, agregar cloruro de calcio 2 gotas. Preparar placas Petri con agar slido En los tubos con agar semislido agregar la mezcla de fago. Mezclar bien los contenidos del tubo y agregar sobre la superficie de la placa de agar slido. Mover la placa suavemente de tal manera que el agar forme una capa uniforme sobre el agar slido. Marcar las placas, incubar a 37C y examinar a las 24 horas.
2.
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UNFV FMHU Clasificacin de Virus

Familia VIRUS ADN Parvoviridae Hepadnaviridae Papovaviridae Adenoviridae Herpesviridae Poxviridae ADNmc, lineal (+) o (-) ADNbc, circular ADNbc, circular ADNbc, lineal ADNbc, lineal ADNbc, lineal Icosadrica Icosadrica Icosadrica Icosadrica Icosadrica Compleja No Si No No Si Si Parvovirus humano B-19, verruga Virus de la hepatitis B Virus de los papilomas Adenovirus humanos Herpes simple, citomegalovirus Virus de la viruela Estructura del cido nucleico Estructura de la cpside Envoltura Ejemplo
VIRUS ARN Picornaviridae Caliciviridae Filoviridae Flaviviridae Togaviridae Coronaviridae Rhabdoviridae Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae ARNmc, lineal (+) ARNmc, lineal (+) ARNmc, lineal (+) ARNmc, lineal (+) ARNmc, lineal (+) ARNmc, lineal (+) ARNmc, lineal (-) ARNmc, lineal (-) ARNmc, lineal (-) ARNmc, lineal (-) Segmentado ARNmc, lineal (-) Segmentado ARNmc, lineal (+) Diploide ARNmc, lineal Segmentado Icosadrica Icosadrica Helicoidal Desconocida Icosadrica Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal Helicoidal No No Si Si Si Si Si Si Si Si
Poliovirus Virus de la hepatitis E Virus de Marburg y Ebola Virus de hepatitis C Virus de rubola Coronavirus Virus de la Rabia Virus del sarampin Virus de la gripe Virus de la encefalitis de California Virus de Lassa VIH
Arenaviridae Retroviridae Reoviridae
Helicoidal Icosadrica Icosadrica
Si Si Rotavirus No
mc, monocadena; bc, bicadena; (+), (-), polaridad.
Esquema general de la replicacin de los virus

(Esquema de la replicacin de un virus en un bacterifago).
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UNFV FMHU Virus de DNA
Virus de RNA
Formas y tamaos relativos de familias de virus animales que infectan vertebrados DS: Cadena doble SS: Cadena simple (+) o (-): Polaridades
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UNFV FMHU Ciclo del bacterifago
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PRCTICA
Lectura de las Placas con Bacterifago. Inoculacin de Huevos Embrionados.

Los virus respiratorios son los principales responsables de las afecciones respiratorias. Producen cuadros respiratorios altos, el virus de la influenza y el adenovirus. Producen resfriado comn y gripe: Rhinovirus Afecciones de vas respiratorias bajas, bronquitis: virus respiratorio sincisial. Producen traqueitis y neumonitis: virus de parainfluenza. Algunos de estos virus son ADN o ARN, y tiene afinidad por la mucina. Inoculacin en huevos embrionados de 7 a 9 das, por va alantoidea y amnitica.
I. PROCEDIMIENTO
1. VIA ALANTOIDEA Visualizar al embrin en el ovoscopio, marcar al embrin y la cmara de aire. Perforar la cscara en el borde de la cmara de aire. Usando una jeringa de 1cc con agua calibre 22 inocular a travs de la perforacin de la cscara y en un ngulo de 45 en relacin al eje longitudinal del huevo y alejado del embrin, en zona libre de vascularizacin, inyecta 0.1 de la muestra. VIA AMNIOTICA Visualizar en la anterior. Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire. Sostener el huevo en el ovoscopio y con jeringa de 1cc de aguja calibre 22 de 1 y pulgada inocular direccin del embrin 0.1 del inoculo en la cmara amnitica. En ambos casos sellar con parafina la perforacin
2.
II. COSECHA CON LOS HUEVOS EMBRIONADOS E INOCULADOS

1. Cosecha por va alantoidea: Limpiar la mitad superior de la cscara del huevo con alcohol. Cortar la cscara por encima de la cmara de aire. Retirar la membrana corioalantoidea que cubre la cavidad alantoidea. Con un baja lengua estril empujar el contenido del huevo hacia abajo separndolo de la cscara, para que el lquido alantoideo se deposite en este espacio. Retire el lquido alantoideo con pipeta de 5cc y depostelo en un tubo 13X100. Guardar en refrigeracin. Cosecha por va amnitica: Retirar aspticamente la cscara y la membrana. Tirar hacia atrs la membrana alantoidea y sacar el lquido de esta cavidad con pepita de 5cc. Retirar el lquido amnitico con una pipeta Pasteur en un tubo 13X100. Guardar en refrigeracin.
2.
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UNFV FMHU
Escherichia Coli
E. Coli en AGAR nutritivo
Procedimiento de una inoculacin por huevos embrionados

1 2 3 4 5 6 7 8 8.1 8.2 Cdigo: Vacuna contra la bronquitis infecciosa Tipo de producto: Antgeno vacunal Subtipo de producto: Vacuna a virus vivo Nombre: Vacuna contra la bronquitis infecciosa Modo de obtencin: Preparada a partir de cultivo de celulares o fluidos obtenidos de huevos embrionados de gallina SPF Referencias internacionales o de origen: CFR 9 (1992) 113.327 Descripcin Control de calidad: Tipo de cepa: Debe ser hecha por serologa con suero mono - especfico. Pureza: REFERENCIA CFR 9 (1992) 113.331- 113.300 113.37 113.36 A) Semillas: Solamente debe contener virus especifico de BRONQUITIS INFECCIOSA. Cepas comnmente utilizadas: Masachusets, Connecticut, Holandesas (modificaciones por pasajes en Cultivo de la Massachusets-H52-H120). Resulta conveniente limitar el uso de cepas como la Arkansas y otras agresivas Las cepas deben ser controladas por serologa especfica por la Tcnica autorizada (ELISA especfico) y en semilla podra utilizarse PCR. B) La vacuna debe estar libre de Mycoplasma, Salmonella, Leucosis linfoide aviar, virus extraos y virus hemoaglutinantes; siguiendo las tcnicas descritas por el CFR.
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UNFV FMHU
9 Procedimiento: DETECCION DE AGENTES PATOGENOS POR INOCULACION EN HUEVOS EMBRIONADOS: En el caso de vacunas a "virus vivo", o de semillas de cultivo, previo a esta prueba, debe ser utilizado suero neutralizante para eliminar la accin de virus activo. En esos casos debe practicarse una dilucin del virus para que 0,2 ml contengan, el equivalente a 10 dosis de vacuna. a) Inocular con el producto a investigar a tres grupos de 9 huevos embrionados cada uno. Grupo I: 0,2 ml en la cavidad alantoidea de cada huevo con 9 a 10 das de edad. Grupo II : 0,2 ml en la membrana corioalantoidea (CAM) de cada huevo de 9 a 10 das de edad. Grupo III : 0,2 ml en el saco de la yema del huevo de 5 a 6 das de edad.
b) Hacer ovoscopa de los huevos de los Grupos I y II diariamente por 7 das y del Grupo III por 14 das. c) Eliminar los embriones que se mueren en las primeras 24 horas, por muerte no especifica. La prueba es valida si por lo menos 6 embriones de cada grupo, sobrevive despus de las primeras 24 horas, luego de la inoculacin. Examinar las anormalidades de todos los embriones que se murieron durante las 24 horas post - inoculacin. Examinar tambin posibles anormalidades de las membranas corioalantideas de estos huevos y controlar los fluidos alantideos, para presencia de agente hemoaglutinantes. Adems de esto centrifugar a baja velocidad los fluidos alantideos de los huevos embrionados, inoculados va saco alantideo, para depositar las clulas. Estas sern examinadas por prueba de anticuerpo fluorescente para virus de la Bronquitis Infecciosa d) Si ocurren muertes por efecto atribuibles al producto se efectuara un posterior pasaje por embriones, haciendo respectivos "pool" de los materiales de embriones vivos y muertos. Inocular cada "pool" en 10 huevos embrionados por cada una de las vas descriptas en el punto a. e) Materiales de membrana corioalantidea debe ser inoculados en la membrana corioalantidea, fluidos alantideos en la cavidad alantidea y de la yema en el saco de la yema.
SPF, patgeno especfico libre.
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UNFV FMHU Produccin de vacunas

Una vacuna es una suspensin de microorganismos (o alguna parte o producto de ellos) que produce inmunidad al ser inoculada en un husped. Una vacuna oral o parenteral induce en el husped la formacin de anticuerpos frente al organismo causante de la enfermedad; por lo que, durante exposiciones futuras de este microorganismo, el agente infeccioso es inactivado (neutralizado o matado), se previene su proliferacin y por lo tanto no se establece el estado de enfermedad. El primero en utilizar el trmino vacuna fue Pasteur en 1880 y proviene del latn vacca. Usando este trmino Pasteur reconoci el trabajo de Edward Jenner que en 1796 vacun con xito a un nio de 8 aos (James Phipps) de viruela, vacuna que obtuvo de los exudados de las pstulas de una vaca con viruela. A partir de este momento se desarrollaron numerosas vacunas lo que ha llevado a erradicar enfermedades como la viruela y en otros casos a una reduccin dramtica en la incidencia de numerosas enfermedades graves como la poliomielitis. TIPOS DE VACUNAS TRADICIONALES Las vacunas tradicionales se pueden clasificar dentro de tres tipos: vacunas atenuadas, vacunas inactivadas y vacunas toxoides. 1.- Vacunas atenuadas Son preparaciones de bacterias o virus vivos que estn tan debilitados o alterados que ya no son virulentos, siendo todava capaces de provocar una respuesta inmune. Algunos ejemplos de vacunas vivas son la Sabin para la polio, fiebre amarilla, sarampin, rubola, parotiditis y la BCG para la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis). La mayora de las vacunas de virus atenuados provocan inmunidad para toda la vida sin necesidad de inmunizaciones de recuerdo. 2.- Vacunas inactivadas Son suspensiones de bacterias o virus muertos por la accin de desinfectantes como el fenol o formaldehdo. En este tipo de vacunas es necesario dividir la cantidad total que se necesita para inducir la proteccin en varias dosis con intervalos de das o semanas debido a la alta concentracin de microorganismos muertos que se deben administrar ya que no se replican como ocurre con las vacunas atenuadas. Algunos ejemplos de vacunas muertas son la Salk para la polio, rabia, gripe y la tos ferina (Bordetella pertussis). 3.- Vacunas toxoides Son preparaciones obtenidas a partir de toxinas bacterianas inactivadas. Generalmente se utiliza el formol (c.a. 38% de formaldehdo en H2O). Los toxoides son muy efectivos en la prevencin de la difteria (Corynebacterium diphtheriae) y el ttanos (Clostridium tetani). A pesar de los logros obtenidos con este tipo de vacunas, existen una serie de limitaciones en la produccin de vacunas segn el modelo tradicional: a.- No todos los agentes infecciosos pueden crecerse en cultivo, por lo que todava no se han desarrollado vacunas para estas enfermedades. b.- La produccin de virus animales y humanos requiere cultivos celulares, los cuales son caros, obtenindose adems bajos rendimientos. c.- Son necesarias grandes medidas de seguridad para asegurar que tanto el personal de laboratorio como de produccin no van a estar expuestos al agente patgeno. d.- Se corre el riesgo de que los lotes de vacunas no estn completamente muertos o atenuados durante el proceso de produccin por lo que se pueden introducir organismos virulentos en las vacunas y dispersar la enfermedad inadvertidamente. e.- Las cepas atenuadas pueden revertir, una posibilidad que requiere continuos ensayos para asegurar que no ha ocurrido una readquisicin de la virulencia. f.- No todas las enfermedades (p.ej. SIDA) se pueden prevenir a travs del uso de vacunas tradicionales. g.- La mayor parte de las vacunas actuales tienen una vida media limitada y a menudo requieren refrigeracin para mantener su potencia. Estos requerimientos originan problemas de almacenamiento en aquellos pases con grandes reas rurales sin electrificar.
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En la ltima dcada, la tecnologa del DNA recombinante ha supuesto la creacin de una nueva generacin de vacunas que permiten obviar las limitaciones de las clsicas. La disponibilidad de clonacin de genes ha permitido a los investigadores contemplar nuevas estrategias en el desarrollo de vacunas: 1.- Se pueden eliminar (curar) los genes de virulencia de un agente infeccioso y que mantenga la habilidad de estimular una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genticamente puede usarse como una vacuna viva sin las preocupaciones acerca de la reversin a la virulencia, ya que es imposible que un gen completo pueda ser readquirido espontneamente durante el crecimiento en cultivo puro. 2.- Se pueden crear sistemas vivos no patgenos que transporten determinantes antignicos de un agente patgeno con el que no estn relacionados. De esta forma el sistema transportador facilita la induccin de una fuerte respuesta inmunolgica dirigida contra el agente patgeno. 3.- Para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, los genes que codifican para las protenas que tienen determinantes antignicos se pueden aislar, clonar y expresar en un husped alternativo tal como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae o lneas celulares de mamferos. Estas protenas pueden ser formuladas en vacunas de subunidades. Las vacunas de subunidades utilizan solamente aquellos fragmentos antignicos ms adecuados para estimular una respuesta inmunitaria potente. Los genes de estas subunidades proteicas pueden ser introducidos en el genoma de una bacteria o levadura mediante las tcnicas de ingeniera gentica. La bacteria o levadura produce estas subunidades en cantidad y son despus recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas. PRODUCCIN DE VACUNAS 1.- Produccin de toxoides bacterianos Las toxinas bacterianas se inactivan para producir toxoides de tal manera que pierdan su toxicidad pero que retengan su antigenicidad. La vacunacin a gran escala no comenz hasta que Ramon hall en 1924 una forma segura y reproducible de inactivacin de las toxinas y los microorganismos patgenos mediante su tratamiento con formaldehido y despus de conseguir la atenuacin de los patgenos mediante pasos sucesivos en medios de cultivo in vitro. A. Cepas: La vacunacin con toxoides se utiliza en humanos para enfermedades causadas por Clostridium tetani y Corynebacterium diphtheriae. Cada productor ha llevado a cabo a lo largo del tiempo una seleccin de aquellas cepas que producen un mximo de produccin de toxina en el medio de cultivo que l mismo ha desarrollado. La mayora de las cepas son estables en lifilos. B. Medio de cultivo: Generalmente las toxinas bacterianas no se producen en grandes cantidades en medios sintticos, por lo que es necesario aadir una fuente de protenas como la carne, casena y como alternativa soja. La carne se digiere con papana o tripsina y la casena se digiere con cido o tripsina. Este medio debe ser suplementado con varios aminocidos y vitaminas por lo que se aade extracto de levadura. La fuente de carbono es glucosa aunque tambin se puede utilizar sacarosa y maltosa. C. Condiciones de cultivo: La mayora de las vacunas toxoides se producen a partir de Clostridium (anaerobio) por lo que no hay ningn requerimiento especial para la introduccin de gases en el cultivo. Puesto que tambin son sacarolticos, son organismos que producen cidos a partir del azcar por lo que se debe controlar el pH. El tiempo de incubacin se debe determinar en funcin de la cantidad de toxina que se produce, para lo cual existen diversas tcnicas tanto enzimticas (lecitinasa, hemlisis, proteolisis) como ensayos en animales (cobayas, ratones, conejos) usando como indicadores la muerte o lesiones en la piel. D. Inactivacin: Las toxinas bacterianas se inactivan siempre con formaldehido. E. Aislamiento: El toxoide de Clostridium tetani se purifica por ultrafiltracin utilizando membranas con un tamao de poro de 0,001-0,05 m. La purificacin en Corynebacterium diphtheriae difiere en que la toxina se purifica primero y despus se convierte en toxoide. Para la purificacin primero se elimina la mayor parte de las protenas por precipitacin con 25% de sulfato amnico en presencia de carbn activo y en condiciones alcalinas. Despus de filtrar, la toxina presente en el filtrado se precipita por adicin de sulfato amnico al 20%, se recoge por filtracin, se redisuelve y se elimina el sulfato amnico por dilisis. 2.- Produccin de vacunas virales El primer paso esencial en la produccin de vacunas vricas, sean vivas o inactivadas, es la obtencin de una gran cantidad de material rico en antgenos virales. Debido a que las clulas vivas son esenciales para
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la replicacin de los virus, las fuentes de tales materiales estn limitadas a tejidos de animales infectados, embriones de pollos y cultivos celulares. Independientemente del sustrato utilizado, es de vital importancia para la produccin el mantener un lote de virus como inoculante. Estos lotes se suelen conservar bien liofilizados o congelados en Nitrgeno lquido. Los microbilogos cultivan los virus para aislar y producir cantidades suficientes tanto para su estudio como para la produccin de vacunas. En general, existen 3 mtodos para cultivar virus animales: animales vivos, huevos embrionados de pollo (o pato) y cultivos celulares. A.- Animales vivos: En la actualidad, el uso de animales vivos para la produccin de vacunas vricas est prcticamente abandonado. Sin embargo, se ha utilizado para la obtencin de vacunas contra la viruela, rabia y fiebre amarilla. B.- Huevos embrionados: Uno de los mtodos ms econmico y prctico para cultivar una gran variedad de virus animales es el uso de huevos de pollo embrionados. El descubrimiento de que los virus se podan cultivar por esta sencilla tcnica fue hecho en 1931. Los huevos embrionados pueden ser inoculados aspticamente con virus, usando una aguja y jeringa, a travs de un agujero que se realiza en la cscara. Este agujero se sella con parafina y los huevos se incuban a 36C durante 2 a 3 das para permitir que los virus se multipliquen. Los embriones de pollo contienen diferentes tipos de clulas y tejidos en los que varios virus pueden replicarse. Por ejemplo, la membrana corioalantoidea permite el crecimiento de herpesvirus y varicela. La cavidad amnitica permite el crecimiento del virus de la gripe y de la parotiditis. El virus de la gripe tambin tiene afinidad por la cavidad alantoidea. C.- Cultivo de tejidos: Es el mtodo ms usado para el cultivo de virus animales. Una vez que el cultivo celular ha crecido, es posible usarlo como un hospedador in vitro para un virus. Los virus invaden las clulas causando normalmente algn tipo de cambio visible en el crecimiento de las clulas de la monocapa cercanas al sitio de la infeccin inicial. Este cambio localizado, denominado efecto citoptico (CPE), es un deterioro de las clulas del cultivo de tejidos causado por el virus. La CPE puede tener diferentes apariencias dependiendo de un virus particular y del tipo de clulas en el cultivo. La eleccin del sustrato celular para la produccin de una vacuna vrica depende de varios factores siendo el ms importante la habilidad del virus para multiplicarse en el cultivo de tejidos. Adems las clulas seleccionadas deben estar disponibles en suficiente cantidad, deben provenir de una fuente bacteriolgicamente estril y debe estar libre de otros virus. Los cultivos celulares ms utilizados para la produccin de vacunas vricas son los preparados a partir de rin de mono aunque ltimamente se estn utilizando bastantes clulas diploides humanas. Una vez que se han multiplicado los virus, se recoge el lquido que se clarifica por filtracin para eliminar los restos celulares. Si lo que se pretende obtener es una vacuna vrica inactivada, se tratan con formaldehdo cuyo exceso se neutraliza con metabisulfito sdico. En el caso de las vacunas vricas vivas normalmente se liofilizan despus de filtrar el cultivo de tejidos. D.- Control de calidad: El propsito de los controles de calidad es asegurar tanto la seguridad como la eficacia de estas vacunas. En el caso de las vacunas vricas inactivadas los peligros potenciales son debidos a la incompleta inactivacin de los virus. El ensayo utilizado para detectar virus vivos consiste en la inoculacin de estas vacunas en cultivos de tejidos y animales susceptibles. Los cultivos se examinan para detectar efectos citopticos y los animales para sntomas de la enfermedad y evidencias histolgicas de infeccin en la autopsia. Con vacunas vricas atenuadas el peligro potencial son aquellos asociados con la reversin del virus a un grado de virulencia capaz de causar enfermedad con las vacunas. Esta posibilidad se reduce usando lotes estables de cultivos en stock aunque siempre son necesarios ensayos de virulencia en el producto final; por ejemplo, en la produccin de la vacuna atenuada de la poliomielitis se compara la neurovirulencia de cada lote con el de una vacuna control por inoculacin intraespinal en monos. La mayora de los problemas asociados con la produccin de las vacunas virales, particularmente los relacionados con la seguridad, pueden desaparecer mediante el uso de la tecnologa del DNA recombinante ya que permite producir subunidades vricas en bacterias o levaduras. 3.- Produccin de vacunas recombinantes (Hepatitis B) La hepatitis B es una enfermedad vrica que mata cada ao a dos millones de personas. En 1976 un equipo de investigacin de los laboratorios Merck (Dr. Hilleman) demostr experimentalmente la
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viabilidad de una vacuna contra el virus de esa forma de hepatitis (VHB); la inyeccin de antgeno particulado purificado, procedente del plasma de personas infectadas, protega a los animales de la infeccin por el VHB. La vacuna era eficaz, pero no poda producirse en grandes cantidades dada la limitacin de donantes. La solucin vino de la mano de la clonacin del genoma del VHB y la expresin de las partculas del VHB en Saccharomyces cerevisiae. La manipulacin gentica de la levadura permiti producir elevadas cantidades del antgeno de superficie con la misma conformacin que las partculas derivadas de los donantes de plasma. En la actualidad la vacuna se administra a varios millones de personas en todo el mundo, la enfermedad est desapareciendo y cabe esperar que la insuficiencia heptica y el cncer causados por esta infeccin pasen pronto a la historia. Dentro de la estructura del virus de la hepatitis B, se saba que la glicoprotena de la superficie del virus era una vacuna efectiva, por lo que el primer paso en producir esta vacuna era clonar el gen que codifica para esta protena del genoma viral. El genoma del virus de la hepatitis B consiste en un DNA de doble cadena parcial, una de las cadenas est incompleta aunque mantiene su forma circular por puentes de hidrgeno. A pesar de su pequeo tamao (una media de 3200 pares de bases) el genoma codifica para varias protenas: P, X, C y S (con PreS2 y PreS1). La protena P es una DNA polimerasa que sintetiza una cadena de DNA por transcripcin inversa a partir del mayor mRNA (preC/C). La funcin precisa de la protena X, la cual se presenta en pequeas cantidades, es desconocida. La protena C es el mayor componente de la cpsida interna (HBc) y la protena S es la protena mayoritaria de la envuelta. Algunos transcritos traducen slamente la regin S, produciendo el antgeno de superficie que en la figura se denomina SHBs, otros traducen tambin preS2 (MHBs) o ambos preS1 y preS2 (LHBs) originando protenas mayores aunque minoritarias en la superficie del virin. Una vez conocidas estas circunstancias se construy un plsmido que expresara el antgeno de superficie del virus de la hepatitis B en levaduras. Se escogi este hospedador para que la levadura pudiera glicosilar la protena de superficie tal como ocurre en el virus. A partir del plsmido pHVB-3200 que contena tanto el gen que codifica para el antgeno de superficie (sAg) como el gen que codifica para el antgeno del ncleo (cAg) del virus de la hepatitis B se construy un clon que contena slo el gen sAg, pHBS-5. El gen SAg se insert entre un promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1) en el plsmido pMA-56 para producir el plsmido pHBS-16. Este plsmido final contiene el origen de replicacin funcional en Escherichia coli que proviene del plsmido pBR322 y adems el origen del plsmido 2 que le permite replicarse en levaduras. Tambin contiene TRP1 que es un gen de levadura que codifica para un enzima de la ruta biosinttica del triptfano y que sirve como marcador selectivo en levaduras. A pesar de elegir como husped las levaduras para as glicosilar la protena de superficie, esta protena expresada en levadura no se glicosilaba. A pesar de ello estas protenas se autoensamblaban en una forma que asemejaba a la cubierta del virus con un dimetro de c.a. 22 nm que no se distingua de la que se encuentra en el plasma de los pacientes. La manipulacin gentica de Saccharomyces cerevisiae permiti producir elevadas cantidades del antgeno de superficie con la misma conformacin que las partculas derivadas de los donantes de plasma. Esta vacuna producida en levaduras, a la que le faltaban los oligosacridos, era tan efectiva como la vacuna derivada del plasma humano, y en 1986 se convirti en la primera vacuna recombinante apta para su uso en Estados Unidos. Antes de esto se necesitaban 40 litros de suero humano para producir una nica dosis de la vacuna de la hepatitis B; actualmente se obtienen muchas dosis de la vacuna recombinante a partir del mismo volumen de cultivo de levaduras. En la actualidad, la vacuna se administra a varios millones de personas en todo el mundo, la enfermedad est desapareciendo y cabe esperar que la insuficiencia heptica y el cncer causados por esta infeccin pasen pronto a la historia.
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PRCTICA
Observacin de lminas con Efecto Citoptico

En cultivo de clulas el virus ingresa y prolifera en las clulas y en muchos sistemas clula virus, las clulas llegan a granular y a desintegrarse despus de una hora das. Este efecto destructivo producido por el virus es conocido como efecto citoptico. Una lnea de clulas no es susceptible a todos los virus, por lo que es necesario emplear diferentes clulas para los distintos virus.
1.
Materiales: Lminas coloreadas con H-E (Hematoxilina Eosina) de la lnea de clulas establecidas Hep-2 (Carcinoma epidermoide de laringe) Lmina coloreada con H-E Hep-2 infectada con poliovirus. Lmina coloreada con H-E Hep-2 infectada con adenovirus Microscopio Lectura de las Lminas: Lmina Hep-2 normales se observa una capa de clula poligonales unidas una con otras, formando una alfombrilla. Lmina infectada con poliovirus (heces positivas de poliomielitis), se apreciar un efecto citopatognico, con clulas redondeadas, refringentes y desprendimiento celular (lisis celular). Lmina infectada con adenovirus (exudado amigdalino positivo), se observa retraccin celular, las clulas pierden su forma normal, el efecto citoptico es caracterizado por la agrupacin de clulas formando racimos.
2.
AGENTE CITOPATOGENICOS Se deber teir con colorante citolgico apropiado y examinar el rea total de la monocapa celular teida, para evidenciar cuerpos de inclusin, numero total de clulas Gigantes u otra indicacin de anormalidad celular, atribuible a agentes extraos.
EFECTO CITOPATICO: Las alteraciones morfolgicas que pueden ser visualizadas en microscopio ptico cuando clulas en cultivo son infectadas por virus, hasta cierto punto caractersticas para cada grupo de virus y que reciben el nombre de efecto citoptico. El efecto citoptico nos permite identificar a los virus, nos forma una base para el agrupamiento de este virus. Las alteraciones patolgicas mas detalladas pueden ser estudiadas a travs de cultivos celulares en monocamada, cultivadas sobre laminillas, en tubos de Leihgton (Son tubos de fondo chato, conteniendo una laminilla donde las clulas en cultivo crecen en la laminilla). Despus de aparecer el efecto citoptico, causado por la infeccin de virus, las laminillas son fijadas, coloreadas a travs de mtodos citolgicos de coloracin como el mtodo de Hematoxilina-Eosina, y montadas en laminas de microscopio LAMINILLA
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Prueba de Hemoaglutinacin como diagnostico de virus

Una variedad de virus animales han demostrado aglutinar glbulos rojos como una particularidad de la partcula viral o uno de sus componentes, formando puentes entre los receptores virales y los glbulos adyacentes. La heterogeneidad en la capacidad viral para hemaglutinar se puede clasificar de acuerdo a: La naturaleza de las hemaglutininas (separables o inseparables de la partcula viral) La naturaleza de la unin formada con los eritrocitos. La potencia de las hemaglutinina para destruir los receptores.
Estos aspectos diferenciales en la hemoaglutinacin tienen aplicacin diagnstica. El virus de la influenza es un modelo interesante para esta demostracin y se distinguen por que el antgeno aglutinante o antgeno V ubicado en las proyecciones de la envoltura del virus produce una hemoaglutinacin que pasando unas horas se disocia o diluye por accin de la neuranimidasa del virus, que rompe los receptores permitiendo la recuperacin del virus. El antgeno aglutinante est asociado a la produccin de inmunidad.
1.
Reactivos: Virus: antgeno hemaglutinante Glbulos rojos de cobayo o humanos grupo = al 4% en sol. Salina. Solucin tampn 7.2 como diluente Procedimiento: En una gradilla con tubos de 13X100 colocados en una bandeja con hielo, hacer diluciones del virus de 1/10 hasta 1/120. Aadir la solucin de glbulos rojos en cantidad de 0.5 a cada tubo de la dilucin. Tubo control de hemates con 0.5 de hemates ms 0.5 de sol. Salina. Agitar fuertemente e incubar a temperatura ambiente por 60. Lectura: El punto final de la titulaciones la dilucin ms alta de virus que causa hemoaglutinacin completa y esta representa una unidad hemaglutinante. El titulo de la hemoaglutinacin se expresa como la dilucin ms alta hemaglutinante. El control de hemates debe contener un botn de hemates.
2.
3.
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UNFV FMHU Ejemplo de un procedimiento por hemoaglutinacin para enfermedad de Newcastle
VIRUS HEMOAGLUTINANTES
Muestras de frascos de 0,2 ml del producto final son extradas e inoculadas a 10 huevos embrionados de 9 a 10 das de edad, provenientes de lotes susceptibles a la ENFERMEDAD DE NEWCASTLE, va cavidad alantoidea. Cinco embriones de la misma edad y lote, no inoculados servirn de control negativo. Se deber testar una muestra de fluido alantoideo del virus de Newcastle como control positivo. Tres a cinco das despus de la inoculacin, la muestra del fluido alantoideo de cada huevo deber ser controlada separadamente por la prueba rpida en placa, para constatar actividad aglutinante, usando una suspensin de hemates frescos de gallina al 0,5 %. Si los resultados son inconclusos debern efectuarse 1 o 2 pasajes usando el fluido alantoideo. Fluidos de embriones vivos o muertos deben ser usados para confirmacin por medio de estos pasajes. Si se observase actividad hemoaglutinante significara que existe virus activo residual hemoaglutinante o de Enfermedad de Newcastle.
Virus de la polio
Adenovirus
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PRCTICA
Observacin de Corpsculos de Negri en lminas coloreadas

En la rabia, el virus tiende a concentrarse en ciertas reas del Sistema Nervioso Central, donde estn presentes los cuerpos de inclusin tambin llamados Corpsculo de Negri, las reas afectadas corresponden al tlamo, hipotlamo y ncleos de nervios craneales en el Asta de Ammon del hipocampo con menos frecuencia en la corteza cerebral, ganglios basal y en el ncleo de la neurona craneal.
1.
Materiales: Lminas coloreadas con colorante de sller. Microscopio Procedimiento: Las lminas sern observadas con lente de inmersin y tratar de enfocar los Corpsculos de Negri como inclusiones de 2 a 10 micras de dimetro son acidofilas y generalmente contienen grnulos basfilos. Tomas de Muestra: Las muestras se pueden tomar de cerebro de perro (Asta de Ammon) y realizar improntas en lminas porta objetos. Tambin la muestra se obtiene del cerebro humano y se inocula en ratones lactantes. Colorante de Sller: Preparacin de soluciones madre: A) Azul de Metileno 1gr. Metanol absoluto 1000 cc. B) Fucsina bsica 5 g. Metanol 1000 cc. Se conservan ambas soluciones en frasco con tapa rosca o vidrio esmerilado. Soluciones colorante: Sol. A Sol. B
2.
3.
4.
2 partes 1 parte
Se mezcla sin filtrar y se guarda en frasco de tapa rosca o vidrio esmerilado. Reposo 24 horas.
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AGENTE CITOPATOGENICOS
Se deber teir con colorante citolgico apropiado y examinar el rea total de la monocapa celular teida, para evidenciar cuerpos de inclusin, numero total de clulas Gigantes u otra indicacin de anormalidad celular, atribuible a agentes extraos. En lminas coloreadas de cultivos celulares infectados por virus pueden ser visualizados los corpsculos de inclusin, que en su citoplasma o en su ncleo, coloreadas mas intensamente en general circundadas por un halo. Los corpsculos de inclusin pueden ser acidfilos(coloreados por eosina-rosa) o basfilos(coloreados por hematoxilina-rojo o azul). En general, si se localizan coloraciones de corpsculos de inclusin son caractersticos de determinados tipos de virus. Los corpsculos de inclusin que pueden ser visualizados en cortes histolgicos de tejidos infectados por virus provenientes de necropsias o biopsias. A) Corpsculo de inclusin de Citomegalovirus. B) Corpsculo de inclusin de virus de la Rabia (Corpsculos de Negri): Descubiertos por Negri, Aldeschi (1876-1912) el cual fue un mdico italiano, que fue conocido por los corpsculos que llevan su nombre, los cuales son caractersticos en los animales que mueren por la enfermedad de la Rabia, estos corpsculos son inclusiones en el protoplasma de clulas nerviosas de la corteza, cuerno de Ammon y de los ncleos de los animales muertos de hidrofobia. Se consideran caractersticos de esta enfermedad.
Corpsculo de Negri
Rabia
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Vectores de Enfermedades Virales

Garrapata Piojo
Garrapata
Zancudo
Liendre
(Gatos, perros, murcielagos, y otros transmiten el virus de la rabia generalmente)
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Mtodo de Elisa como mtodo para diagnostico de Enfermedades Virales

ELISA
Enzimoinmunoanlisis con inmunoadsorbentes
Prueba heterognea de unin con protenas que puede utilizar un ligando marcado con enzima que compite el ligando de la muestra por el anticuerpo inmovilizado en fase slida. En la prueba de ELISA, se emplea un anticuerpo inmovilizado a una fase slida que tiene afinidad por un ligando (molculas pequea con unin no covalente) y que est marcado con la enzima. Las enzimas utilizadas deben cumplir ciertos requisitos como: a) Poseer elevada actividad especifica. b) Las marcas son estables durante el ensayo y si conservan en refrigeracin c) No deben estar presentes en lquido biolgico que se analiza. d) La enzima retiene gran parte de su actividad cuando se fija al ligando o anticuerpo y deben dar sustrato cromgeno susceptible de ser medido. El mtodo ELISA puede estar basada en reacciones competitivas o en ensayos inmunomtricos (sndwich) directos. Utiliza como sustratos sustancias cromgenas o fluorgenas susceptibles de ser medidos.
ESQUEMA DE ETAPAS
Leyenda:
L
Anticuerpo Ligando marcado con enzima Ligando
S
Sustrato Producto
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UNFV FMHU ESQUEMA DE ETAPAS

Etapa 1: Inmovilizacin del anticuerpo en fase slida
Lavar
Lavar
Fijacin del anticuerpo en fase slida
Recubrir en superficie slida expuesta con otro material proteico
Etapa 2: Reaccin del antgeno del anticuerpo movilizado
Etapa 3: Medicin de color con desarrollado
Lavar
Aadir anticuerpo marcado con enzima
Lavar
Aadir sustrato
Enzima convierte sustrato en producto producto medido como cambio de color Ensayo inmunomtrico (Sandwich)
Lavar 1) L 2) o-L S
Ensayo competitivo
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Infecciones Micticas Superficiales y Profundas
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INFECCIONES MICTICAS SUPERFICIALES Y PROFUNDAS

Las micosis son infecciones producidas por hongos. Las micosis superficiales son aquellas infecciones micticas que estn localizadas en la epidermis, pelos uas, mucosas. Las micosis profundas afectan la dermis y las vsceras. Ciertas infecciones tales como la Candidiasis pueden ser superficiales y profundas.
Todo ser vivo lleva una doble designacin (terminologa binaria o binaminal), la del GENERO y ESPECIE: Ejemplo: Trchophyton rubrum. El nombre del gnero se escribe siempre con mayscula y funciona como sustantivo, en tanto que el de la especie se escribe con minscula y funciona como adjetivo. En el ejemplo, rubrum indica la calidad (roja) del micelio en los cultivos. Escribir correctamente y subrayados por separados el gnero y la especie, es obligatorio en la presentacin de los trabajos cientficos. Los hongos son aerobios y se nutren como las bacterias, por smosis. La nutricin se asegura mediante fuentes nitrogenadas, hidrocarbonadas y minerales adecuados, disueltas en el agua. Fuente nitrogenada: el nitrato de potasio, el sulfato de amonio, cidos aminados como la asparragina o fuentes complejas como la peptona y prtidos son las utilizadas en los medios de cultivo. Fuentes hidrocarbonadas: glucosa, sacarosa, maltosa, almidn y ciertos alcoholes como el glicerol. Las sales minerales: sulfato de magnesio, fosfato monopotsico, cloruro de potasio y sulfato ferroso, el manganeso y cobre como microelementos. La nutricin y respiracin se opera por sistema enzimticos o menos complejos.
MORFOLOGA Y BIOLOGA DE LOS HONGOS Estos seres vivos son vegetales inferiores carentes de la propiedad de formar tejidos diferenciados (hojas, semillas, races, etc.) y se los clasifican dentro de las Thallophytas. Los hongos no poseen clorofila, son hetertrofos al no poder operar la fotosntesis y son eucariticos, es decir presentan un ncleo completo con membrana nuclear que los diferencia de las bacterias. Los hongos tienen una amplia distribucin en la naturaleza, viven en el agua, tierra, parasitando a las plantas, a los animales y al hombre, presentan inters en la realizacin de procesos industriales de fermentacin, produccin de cidos orgnicos, elaboracin de productos alimenticios, en la fitopatologa, en la medicina veterinaria humana. La MICOLOGA MDICA representa por lo tanto una parte relativamente pequea de la MICOLOGIA GENERAL. Los agentes productores de micosis humanas son hongos microscpicos que pueden pertenecer a los hongos verdaderos EUMYCETES o a los SCHIZOMYCETAS, del orden ACTINOMYCETALES. Estos ltimos, an cuando son bacterias, su estudio es realizado por los miclogos, pues presentan un cuerpo o tallo filamentoso y ramificado semejante a los hongos. Las clulas de los EUMYCETOS presentan una pared celular gruesa formada por polisacridos, polmero de glucosa y manosa (glucanos o mananes), semejantes a la quitina, que cubre a los insectos o a la hemicelulosa. Por dentro de la pared celular se encuentra la membrana citoplasmtica, habitualmente fina,
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que contiene esterol y enva hacia el citoplasma invaginaciones llamadas mesosomas. En el citoplasma se observan vacuolas, grnulos de reserva con glucgeno o lpidos, ribosomas, mitocondrias, retculo endoplsmico y un ncleo verdadero con membrana nuclear. El cuerpo de los hongos se denomina thallo o micelio. El micelio vegetativo es la parte del hongo destinado a cumplir funciones de nutricin y crecimiento de la especie y el micelio de fructificacin es la porcin especializada para la propagacin y reproduccin a distancia. El micelio vegetativo puede ser unicelular, filamentoso o seudofilamentoso. En el primero todas las clulas encuentran separadas entre s; son esfricas, ovoides o cilndricas y se reproducen vegetativamente por brotacin, tabicamiento o un proceso intermedio en donde el brote se separa de la misma por un septo. En el micelio filamentoso las clulas se agrupan en tubos cilndricos que se ramifican hasta formar una trama macroscpicamente visible. Las ramificaciones de este micelio se llaman hifas y presentan tabiques o son continuas (micelio cenoctico). Cuando se examina una colonia de hongo filamentoso se percibe que ste est compuesto por una parte area que se dirige hacia la luz del tubo, un micelio rampante en la superficie del medio de cultivo e hifas sumergidas que penetran en la profundidad del mismo.
CLASIFICACIN GENERAL La clasificacin de los hongos se hace en base a todos los elementos morfolgicos que presentan, tanto por aspecto macroscpico como por sus caracteres microscpicos. Los EUMYCETES son divididos en cuatro clases principales: A) PHYCOMYCETES Son hongos de micelio filamentoso continuo (cenoctico), su fructificacin asexuada est generalmente constituida por esporangios o conidias y la sexuada por zigotes u oosporos. B) ASCOMYCETES Hongos de micelio unicelular brotante, seudomicelio filamentoso, o micelio filamentoso ramificado y tabicado. Como fructificacin asexuada presentan conidias y esporforos con diversos grados de complejidad y como fructificacin sexuada ascos con ascosporos, libres o dentro de ascocarpos. C) BASIDIOMYCETES Hongos de micelio filamentoso, ramificado y tabicado o de micelio unicelular brotante. Poseen fructificaciones asexuadas muy diversas, conidias o picnidios con picnosporos y como fructificacin sexuada esporos externos formados en una baside: basidiosporos. D) DEUTEROMYCETES O FUNGI IMPERFECTI En esta clase se agrupan aquellos hongos cuya fructificacin sexuada, si existe, es desconocida. La clasificacin de los hongos patgenos es un tema an incierto, pues se encuentra en plena evolucin, como lo demuestra el reciente descubrimiento de la fase sexuada de varios hongos productores de micosis pulmonares y algunos dermatofitos. ACTINOMYCETALES Existe un grupo de bacterias grampositivas con tendencia a formar filamentos ramificados, con toda una gama micromorfolgica que va desde aquellas semejantes a Corynebacterium y Micobacterium, hasta aquellas con micelio filamentoso bien desarrollado, con micelio areo y de fructificacin comparables a los de los Eumycetes. Se los clasifica, sin embargo, dentro de los Schizomycetes o bacterias, por los caracteres siguientes: a) su dimetro reducido, alrededor de 1 u; b) carecen de pared celular y de ncleos diferenciados; c) son sensibles a los phagos y antibiticos antibacterianos. Dentro de este orden existen tres gneros de importancia mdica: 1) Actinomyces; 2) Nocardia; 3) Streptomyces: 4) Actinomadure
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UNFV FMHU Morfologa de los hongos
Hifas en espiral
Hifas en cuerno de anto
Candelero fvico
Hifa pectinada
Hifa clavada
Hifa raqueta
Cuerpo Nodular
Gmulas
Vacuolas
Saccharomyces sp
Hifas Septadas
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Hifa no septada
Rhizopus sp.
Conidios Esterigma Vescula Conidforo Hifa vegetativa
Hifa Septada
Blastosporas gemando de un pseudomicelio
Reproduccin sexual
Pileo Basidiospora Anillo x1000 Basidio Himenio
Reproduccin sexual por Oosporas unin de los gametos masculino y femenino
Reproduccin sexual por Basidiosporas en Basidiomycetes
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REPRODUCCIN ASEXUAL
Hongo dimorfo levaduriforme (Candida albicans) mostrando varios tipos de clulas: filamentos fungiformes, unas pocas clulas levaduriformes; blastosforas en racimos como uvas cerca de las septas hifales y clamidosporas mayores, circulares, de paredes gruesas
Conidiosporas terminal
Artrosporas
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CLASIFICACION DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Los hongos productores de enfermedades en el hombre, se clasifican segn su ETIOPATOGENIA en dos grandes grupos: 1.2.MICOSIS SUPERFICIALES MICOSIS PROFUNDAS PIEDRA BLANCA Trichosporum baigell Trich. giganteum Trich. granulosum Piedra NEGRA Piedraia hortai I.- PILONODOSIS: Forman ndulos TRICOMICOSIS AXILAR FLAVA Nocardia tenuis TRICHOMICOSIS AXILAR RUBRA Noc. Tenuis mas Micrococcus nigrescens TRICOMICOSIS AXILAR NIGRA Noc. Tenuis mas Micrococcus nigrescens
ERITRASMA Nocardia minutissima (no cultivable) 1.- QUERATOMICOSIS NO DERMATOFITICAS PITRIASIS VERSICOLOR Malassezia furtur TINEA NEGRA PALMARIS (Cladosporiosis Exophiala Werneckil epidrmica) TIEAS II.- QUERATOMICOSIS MICROSPORIAS: Sus agentes Microspum canis M. gypseum M. audouini y otros 2.- QUERATOMICOSIS DERMATOFITICAS TRICOFITIAS: Sus agentes Thichophyton mentagrophytes T. rubrum, T. Tonsurans y otros EPIDERMOFITIA: (eccema marginado de hebra) Epidermophyton Floccosum
LAS DERMATOMICOSIS son enfermedades superficiales causadas por diferentes hongos. Por lo tanto, una DERMATOFITOSIS ser siempre una dermatomicosis, pero no siempre una dermatomicosis es dermatofitosis. LEVADURAS: que se localizan en la piel, mucosas, uas, (perionixis) (onixis) Corloretinitis (ojos) CANDIDIASIS: Sus agentes Candida albicans C. Trobicalis C. Paradrusel Rhodotorula sp.
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PRCTICA
Infecciones de la Piel producidas por Dermatofitos

Las infecciones de la piel, tambin pueden ser causadas por hongos patgenas, produciendo lesiones superficiales conocidas como: DERMATOMICOSIS, los grupos de hongos ms frecuentes corresponden a Dermatofitos y Levaduras. Las principales especies de Dermatofitos estan agrupadas en los generos: Trichoplyton, Microsporum y Epidermophyton, los que tienen tropismo por el tegumento cutneo en donde proliferan a expensas de la queratina, cistina y metionina; circunscritas a la piel y anexos caracterizadas por maculas eritomatosas, prurigionosas, que luego se torna descamativas, en la mayora de los casos tienen formas irregulares y bordes definidos localizados en cualquier zona de la superficie corporal. Cuando estan comprometidas las uas, estn cambian de coloracin, se torna Hiperquerticas son friables, fragmentndose espontneamente; en los cabellos hay destruccin del folculo y cada de pelo. Las levaduras patgenas del genero CANDIDA, producen infecciones agudas o crnicas de piel y/o mucosas (vulvovaginitis, muguet, y omnicomicosis). Muchos de los Dermatofitos se encuentran en el suelo y/o infectando animales domsticos, estos pueden transmitir la infeccin al hombre: (ZOONOSIS). Ciertos hongos como Malasezzia furfur parasitan el estrato ms superficial de la piel, dando manchas grisceas violaceas con descamacin fina (tia versicolor o pitiriasis versicolor).
I. CONDICIONES Y TOMA DE MUESTRA DE PIEL

Se debe tomar la muestra antes de iniciar la terapia antimictica en caso contrario, suspender el tratamiento 5 das del estudio micolgico. Si existe infeccin bacteriana asociada, someter al paciente a un tratamiento de antibiticos, antes del estudio micolgico. La recoleccin del material patolgico, se hace en condiciones de asepsia en pacientes estriles y en cantidad suficiente. Si se trata de lesiones del cuero cabelludo, retirar los pelos de la zona infectada con una pinza estril, luego con una tijera corta ms o menos a un cm. del bulbo piloso, depositando esta parte en el perfil estril, desechando la parte distal del pelo. Si se trata de lesin de ua obtener fragmento con tijeras o practicar el raspado con bistur, recogiendo los detritus de la ua enferma en una placa Petri estril.
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UNFV FMHU II. PROCEDIMIENTOS

1. Examen directo de la muestras: Con el asa de siembra en ngulo y humedecida, depositar una pequea cantidad de la muestra de escamas, pelos y uas sobre una gota de KOH, al 20% que previamente ha sido colocado en una lmina porta objeto. Cubrir el preparado con una lmina y calentar suavemente a la llama de un mechero, con el fin de facilitar su aclaracin (digestiva de querantina y otras sustancias). Observar al microscpico con menor y mediano aumento: si se trata de hongos dermatofitos se observar la presencia de hifas refrigeradas, tabicadas. Si se trata de MALASEZZIA FURFUR se observar hifas cortas de extremos romos, irregulares, cilndricas, curvas, al lado de elementos redondeados agrupados en racimos (Microconidias). El diagnstico se hace por examen directo de la muestra por su morfologa, caractersticas. Cultivo: El estudio de la colonia se hace en cultivos en medio AGAR SABOURAUD, Glucosado (ASG) que se puede observar a partir del 5to. da al 8vo. das de incubacin tanto por las caractersticas microscpicas (pigmentacin, aspecto de la colonia, esporas, modificaciones de filamentos, etc.) Para la microscopia se toma un fragmento de la colonia depositndolo sobre una gota de colorante azul de lastofenol en lmina porta-objeto, cubrir el preparado con una laminilla. Observar al microscopio, con objetivos de mayor y menor aumento. El estudio microscpico se puede observar tambin en microcultivos.
2.
Tricophyton tonsurans.- Desarrolla colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia dura, con pigmentacin amarillo castaa; al microscopio se observan microconidas piriformes, otras filiformes dispuestas a los dados que en conjunto se parecen al gusano de Cien pies, adems hay abundancia de clamidosporas, hifas en raqueta y puede desarrollar Macroconidias. Tricophyton mentagrophytes.- Desarrolla colonias blanquecinas pulverulentas a veces con micelio areo elevado, con produccin de pigmenta amarillo parduzco en el reverso de la colonia. Al microscopio se observan hifas septadas, con abundantes microconidias esfricas, formando pequeas agrupaciones, tambin presentan hifas en espiral, ocasionalmente se pueden observar macroconidias. Tricophyton rubrum.- Presente colonias de micelio areo blanco, elevado de aspecto algodonoso y en el reverso pigmento de color rojo prpura, al microscopio se observan hifas septadas, con microconidias ssiles piriformes, algunas veces puede observarse macroconidias en forma de salchicha, cuerpo nodulares, y clamidosporas. Microsporum gypseum.- Presente colonias filamentosas, poco elevadas pulverulentas con produccin de pigmento de color canela. Al microscopio se observan hifas septadas macroconidas, con tabiques transversales, constituyendo 4 a 6 clulas, de pared delgada de superficie lisa agrupadas en racimo, se encuentran escasas microconidias. Microsporum canis.- Desarrolla colonias de micelio areo velloso, de color blanquecino, poco elevado, con pigmento amarillo naranja ms notable en el reverso de la colonia. Al microscopio se observan tpicas Macroconidias fusiformes o elipsoidales, hasta con 8 tabicaciones trasversales y con granulaciones en la superficie, tambin se puede observar microconidias y clamidosporas. Epidermophyton flocosum.- Desarrolla colonias de aspecto pulverulenta de color amarillo azufre con pliegues que se forman en el centro de la colonia, al centro se observa al microscopio macroconidias de pared celular delgada, con extremo distal romo y una base de implantacin angosta, con 3 a 4 tabiques transversales que se encuentran aisladamente dispuesta en racimo. El hongo presenta clamidosporas y carece de microconidias.
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UNFV FMHU III. RESUMEN DE CASOS CLNICOS

Caso N 1 Paciente con lesiones descamativas, eritematosas pruriginosas, localizadas en la regin inguino-crural, en forma bilateral con dos aos de evolucin. Caso N 2 Paciente que presenta uas con cambios de coloracin perdida de brillo, estras transversales en uas de los dedos pulgar y anular de la mano derecha, con 8 meses de evolucin, acompaado de un gran componente inflamatorio peri-ungueal. Caso N 3 Paciente que presenta numerosas placas pequeas hipocrmicas de forma redondeada, poco descamativas con prurito discreto, localizadas en el tronco anterior y cuello con 3 aos de evolucin. Tratamiento: Diagnstico presuntivo: KETOCONAZOL Tab. 10 mg. Caso N 1 Caso N 2 Caso N 3 Caso N 1 Caso N 2 Caso N 3 Dermatomicosis Ominicomicosis Pitiriasis Versicolor Escamas de regin inguino - crural Fragmentos de uas Escamas de regin del tronco
Tipo de muestra:
DERMATOFITOS: Estructuras Microscpicas Diferenciales
Microsporum gypseum
Microsporum canis
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Tricophytum rubrum
Tricophytum tonsurans
Tricophytum mentagrophytes
Epidermophyton flocosum
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UNFV FMHU
PRCTICA
Infecciones cutneo-mucosa producidas por Candida Albicans y por Sporothix Schenkii

Las CANDIDISIS, es causada especialmente por Candida albicans, es una infeccin aguda, o subaguda en el cual el hongo puede producir lesiones en la boca, piel y uas bronquios y pulmones, vagina, cuello uterino. Estas levaduras pueden encontrarse normalmente en cantidades moderadas en la piel, mucosa oral y material fecal. Sporothrix schenkii es un hongo cosmopolita, que vive en el suelo de las plantas, madera, ambientes cerrados y hmedos; produce la Esporotricosis en el hombre y en algunos animales. El hongo se implanta en la piel, generalmente mediante un traumatismo con restos punzantes de vegetales y otros objetos contaminados. La infeccin prevalente est localizada en los linfticos cutneos, pueden estar en las mucosas, raramente en las visceras, la forma linftico-cutnea es la mas frecuente, se presenta de inicio en el lufar de inculo porsteriormente aparecen varios ndulos satlites siguiendo el trayecto de los linfticos subcutneos NDULOS EN CORDN que pueden abrirse y dar ulceras indoloras llamadas Chancro Esporotrictico en ROSARIO. Si se trata de secrecin vaginal, recoger la muestra con una torunda estril, del fondo del saco vaginal y conservarlos en suero fisiolgico con antibiticos. Los abscesos o ganglios infectados se punzan con jeringa hipodrmica y aguja estriles, luego depositar en recipientes estriles. Las biopsias o necropsias se separan en dos fragmentos uno para el cultivo y otro para incluir en solucin fijadora (formol 10%) para el estudio histopatolgico.
I. PROCEDIMIENTO
1. Examen directo: Las secreciones, pus, etc. son preparadas en frotis sobre lminas limpias, para la coloracin GRAM y ZIHEL NEELSEN. Al microscopio si se trata de C. albicans, se observar clulas redondeadas u ovaladas con yemas Gram positivas, S. shenckii no capta ningn colorante de uso comn de ah que el examen directo se utiliza tan solo para descartar otros microorganismos.
Cultivo: Si se sospecha de C.albicans, sembrar la muestra de secrecin vaginal en un tubo de ASG, Agar Mycobiotic a los dos o tres das de incubacin a temperatura ambiente 37 grados C, se observa la presencia de colonias de aspecto cremoso y consistencia de color perlados; para la identificacin final es necesario cultivar una de las colonias en Agar Almidn Arroz, donde por se un medio bastante empobrecido se forman las tpicas CLAMIDOSPORAS, Pseudomicelio y Blastosporas, que identifican a CANDIDA ALBICANS. Si se sospecha de Sporothix schenkii por ser un hongo dimrtico, la muestra se cultiva en ASG a 26 C y medio AGAR sangre a 37 C . En el primer caso desarrolla colonias en un comienzo pequeas blanquecinas hmedas, carecen de micelio areo algodonosos a medida que aumenta el crecimiento, la superficie de la colonia adquiere aspecto
2.
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rugoso y membranosos, el color puede variar de crema a negro segn el tiempo medio de cultivo y cepa. Al microscopio se aprecia hifas finas tabicadas, portadora de conidiforos cortos en cuyo extremo se encuentran las conidias agrupadas dando al aspecto de una FLOR DE MARGARITA. En agar sangre, desarrollan formas levaduriformes; al microscopio se observan clulas en gemacin, forma de un cigarrillo, GRAM positivas, en forma similar se observan en frotices procedentes de animales inoculados.
II. RESUMEN DE CASOS CLINICOS

Caso N 1 Paciente en estado de gestacin, que desde hace 4 meses presenta prurito intenso vulvo vaginal y abundante secrecin blanquecina grumosa. Tratamiento: vulos de NISTATINA Diagnostico de presuncin: Vulvo vaginal candidisica Tipo de muestra: Secrecin vaginal
Caso N 2 Paciente que en el dorso de la mano, con inicio en el dedo ndice derecho presenta lesiones UlceroCostrosas y gomosas, de bordes elevados con secrecin sero purulenta, rodeada de un Halo Violceo, no dolorosa y sin infiltracin profunda. Las lesiones se inician hace 2 meses con la presencia un grano pruriginosos + - de 0.5 cm. de dimetro con necrosis central de color parduzco y componente inflamatorio localizados en la regin pulpar del dedo como consecuencia de traumatismo con astilla vegetal, una semana despus el ndulo se reblandeci dejando de salir material purulento, la lesin se fue extendindose progresivamente en forma ascendente produciendo una lesin de ndulos dispuestos en cadena de Rosario. Tratamiento: Tintura de lodo ITRACONAZOL Diagnostico de presuncin: Esporotricosis Tipo de muestra: Secrecin de ndulo cutneo
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GENERO CANDIDA Examen directo de muestra: a) Cultivos: 1) En ADS
b)
2) En AGAR EXTRACTO DE ARROZ b)
d)
b)
a) Levaduras gemantes b) Yemas blastosporas c) Pseudomicelio d) Clamidosporas
Candida sp.
Candida albicans
SPOROTHRIX SCHENCKII
EN TEJIDO (Inoculacin experimental)
EN CULTIVO AGAR BHI (37 C)
EN CULTIVO ADS Conidias en racimo
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UNFV FMHU Manifestaciones clnicas de infeccin por Candida albicans en pacientes con VIH
Las especies de Candida pueden ocasionar cualquier tipo de patologa en el paciente VIH+, si bien con fines didcticos se suelen establecer dos grandes grupos de infecciones: las de las mucosas y las de los rganos profundos. Infecciones de las mucosas: Incluyen el muguet, esofagitis y vaginitis entre las principales; pero tambin tienen entidad propia la afectacin de la mucosa del tubo digestivo no esofgica, balanitis, candidiasis cutnea, foliculitis, intertrigo, onicomicosis, candidiasis perianal, etc. Infecciones de rganos profundos: Incluye la candidiasis del sistema nervioso central (SNC), la cardaca, la urinaria, la respiratoria, la osteoarticular, la ocular, la candidiasis diseminada ... La afectacin del SNC por CA se suele producir en el contexto de una candidiasis diseminada: puede existir afectacin del parnquima cerebral y de las meninges. Las lesiones suelen ser microabscesos y la sintomatologa es variable pudiendo manifestarse inicialmente como un coma. En el corazn CA puede causar endocarditis, miocarditis y pericarditis. Por lo general la candidiasis diseminada y su repercusin sobre otros rganos es infrecuente en los pacientes VIH+. Muguet o aftas bucales La infeccin de la cavidad bucal por CA es frecuente. El muguet es el trmino que se aplica a la aparicin de placas blanquecinas, a modo de leche cuajada, que se observan en la lengua y otras partes de la boca y que pueden desprenderse con raspado dejando un lecho sangrante. Puede ser asintomtico pero es usual la deglucin dolorosa, la alteracin del sabor de los alimentos y, como consecuencia, la inapetencia y malnutricin. Esofagitis Aunque no siempre es as, la invasin por CA del esfago se considera como la extensin de una candidiasis oral. En las paredes del esfago se forman pseudomembranas similares a las del muguet. Las lesiones producen denervacin del esfago por lo que en algunos casos pueden ser asintomticas. Se suele presentar dificultad para la deglucin, dolor retroesternal, nuseas, vmitos; puede ocasionarse hemorragias por ulceracin y perforaciones. Vaginitis La infeccin por CA es causa frecuente de vaginitis en mujeres, sean o no inmunodeficientes. Suele existir un flujo vaginal abundante y sobre todo predomina el picor; la vagina y los labios presentan eritema que se puede extender al perin.
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PRCTICA
Hongos que afectan el tracto respiratorio: Paracoccidioides, Histoplasmas y Aspergillus

Las infecciones respiratorias de etiologa mictica son ocasionadas generalmente por hongos dimrficos: Histoplasmas Capsulatum, y Paracoccidioides Brasilensis, normalmente se encuentran distribuidos en la naturaleza en su forma micelial, sobre los excrementos de las aves, excremento murcilagos, (Histoplasma) bien sobre el suelo, en las plantas, maderas etc. (Paracoccidioides). Estos microorganismos se localizan en los pulmones mediante la aspiracin de material contaminado o implantndose por inoculacin (astilla, espinas y vegetales) pasando de forma micelial a la forma Levaduriforme. El histoplasma capsulatum: Inicialmente produce una infeccin primaria que muchos casos puede ser asintomticas. Las lesiones pulmonares se caracterizan por se diseminadas en ambos campos pulmonares. Paracoccidiodes brasilensis: Generalmente infecta a los pulmones por propagacin secundaria a partir de otro foco (por ejemplo, mucosa oral). Algunos hongos saprofitos como ASPERGILLUS FUMIGATUS, poseen patogenicidad condicionada causando infecciones pulmonares generalmente secundarias a otros procesos crnicos como infecciones bacterianas pulmonares, enfermedades consuntivas, o enfermedades metablicas; tambin pueden ser consecutivas en algunos casos al uso indiscriminado de drogas inmunosupresoras y antibiticos de amplio espectro.
I. CONDICIONES Y TOMA DE MUESTRA

Cuando se trata de muestras de esputo, esta se tomara por la maana previo enjuagado de la boca, con solucin de lugol, a fin de eliminar bacterias comensales y hongos saprfiticos de la cavidad oral, procurando que muestra sea por expectoracin y se sospecha de una ASPERGILIOSIS se recomienda un aspirado bronquial. Cuando se trata de una biopsia, esta ser dividida en 2 fragmentos siendo depositada una de ellas en frascos con suero fisiolgico estril, con antibiticos, servir para los cultivos, inoculaciones y examen directo: en fresco y coloraciones. El otro fragmento se colocar en un frasco con fijador para el estudio histopatolgico.
II. EXAMEN DIRECTO

1. Esputo o aspirado bronquial En una lmina porta objetos limpia, depositar uno o dos gotas de la muestra y en igual cantidad agregar KOH al 20% cubrir con una laminilla y observar al microscopio, tambin preparar frotices para su coloracin con LEISHMAN, GRAM y ZIEHL-NEELSEN. H. Capsulatum En frotis coloreados, como en cortes histopatolgicos, se observan como levaduras pequeas, ovales y redondas, cubiertas con un discreto halo capsular, contenidas en interior de histiocitos y en ocasiones polimorfonucleares.
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Paracoccidiodes brasilensis En fresco o en frotis coloreados, presenta clulas esfricas u ovaladas de gran tamao, con doble membrana y multigemantes. Aspergillus fumigatus Se caracteriza por presentar micelios cortos de pared gruesa, color amarillo verdoso, que en su extremo distal se ensanchan para dar lugar a la cabeza aspergilar que contiene en su superficie estructuras celulares denominadas ESTERIGMAS que se continan con cortas cadenas de conidas.
III. CULTIVO
Para el caso de los hongos dimrficos, la muestra patolgica se siembra en ASG con antibiticos y placas de Agar BHI o Agar sangre incubndose a temperatura de laboratorio y 37 C respectivamente. Si se sospecha de una Aspergiliosis el cultivo se hace en medios como ASG o agar Papa-Dextrosa, es importante el cultivo de muestra seriada de dar diagnstico en todos los cultivos debe desarrollar el mismo hongo, a fin de considerar como muestra prctica positiva. Histoplasma capsulatum En AGS a temperatura del laboratorio, produce colonias algodonosas de desarrollo exuberante. Microscpicamente se observan hifas tabicadas y ramificadas con produccin de Microconidias piriformes y gran cantidad de Macroconidias esfricas tuberculadas (Clamidisporas tuberculadas) clulas esfricas de pared gruesa con mltiples excreciones superficiales. En agar BHI a 37 C desarrolla colonias pequeas de aspecto membranoso, rugosos de color beig (marrn claro) al microscopio se observan levaduras pequeas, clulas ovaladas y gemantes. Paracocidioides brasilensis En ASG produce colonias de micelio algodonoso de desarrollo superficial, escaso de crecimiento lento. Macroscpicamente se observan hifas tabicadas y ramificadas con microconidias periformes. En Agar BHI o Agar sangre a 37C, produce colonias cremosas, generalmente cerebriformes, de color beiges . Microscpicamente se observan clulas esfricas de doble pared multigemadas que a la visin del observador se asemeja a un: Timn de Barco. Aspergillus sp Desarrolla colonias filamentosas de crecimiento rpido de color verde oliva, al microscopio se observa micelios gruesos reptados con coniforos que se ensanchan en su extremo distal la cual esta dispuestos radialmente a los Esterigmas que se continan en cortas cadenas de conidias.
IV. RESULTADOS DE CASOS CLINICOS

CASO N 1 Paciente adulto, joven Espelelogo procedente de Tingo Mara. Hace 30 das presento resfriado comn y dolor de garganta, actualmente sensacin de alza trmica, dolor osteo muscular, tos con expectoracin mucosanguinolenta y agrandamiento de abdomen. Tratamiento: Tipo de muestra: ANFOTERICINA B LIPOSOMAL ESPUTO Y BIOPSIA
CASO N2 Paciente de sexo masculino, agricultor, en mal estado general, procedente de Satipo (Chanchamayo), presenta disnea de refuerzo, tos persistente con expectoracin mucopurulenta y dolor torxico bilateral en las regiones basales, hace un ao se constata una lesin tumoral ulcerada en la regin Orofarngea y en
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las mucosas de las encinas superior derecha de apariencia granulomatosa y movilizacin espontnea de las piezas dentarias en dicha zona. Como antecedente destaca el hbito de hacer utilizado astilla vegetales en su limpieza dentaria. Tratamiento: Tipo de muestra: ANFOTERICINA B LIPOSOMAL ESPUTO Y BIOPSIA
CASO N 3 Paciente de sexo femenino, en aparente estado general, presenta tos, expectoracin hemoptoica y hemoptisis, seguida de cuadro febril, dolor en el hemitorax izquierdo. Molestia con un periodo de evolucin de 2 aos. La Baciloscopia para descartar tuberculosis en 6 ocasiones fueron negativas, al examen tomogrfico muestra una imagen cavitaria en el vrtice izquierdo con opacidad central. Tratamiento: Diagnostico de presuncin: Tipo de muestra: TUBERCULOSTATICOS MICOSIS PULMONAR ASPIRADOS BRONQUIAL
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PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
EN TEJIDO
EN CULTIVO AGAR BHI (37 C) HISTOPLASMA CAPSULATUM
EN CULTIVO ADS (25 C)
1. CLULAS LEVADURIFORMES EN MACROFAGOS
2. EN CULTIVO AGAR BHI (37 C)
3. EN CULTIVO ADS (25 C)
MICRSCOPIA DE LUZ VISIBLE
MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO
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PRCTICA
Infecciones neurolgicas: Cryptococus Neoformans

Comprende cepas patgenas y no patgenas producidas en pacientes inmunodeficientes (Ejemplo SIDA), infecciones en el S.N.C. El hongo se desarrolla sobre sustancias orgnicas ricas en derivados nitrogenados como la creatinina y otros (excreta de aves como la palomas, etc.) de donde se dispersa el ambiente natural. La va de ingreso del hongo generalmente es por va respiratoria, por inhalacin justamente con partculas de polvo de los pulmones, por va hemtica pasa al S.N.C donde se localiza produciendo tumoraciones (CRIPTOCOCOMA) produciendo sintomatologa, de acuerdo a su ubicacin en el cerebro.
I. CONDICIONES Y TOMA DE MUESTRA

Tomas la muestra del L.C.R. por puncin del canal raqudeo y en lo posible de iniciar la terapia antibitica. Colectar el L.C.R. en tres tubos estriles, para el examen microbiolgico, citolgico y qumico.
II. PROCEDIMIENTO
1. Examen directo: Observar el aspecto macroscpico del L.C.R. (transparente) Preparacin de la muestra patolgica Hacer preparaciones en fresco, con tinta china del centrifugado del L.C.R. colocando una gota de sedimento sobre una lmina porta objeto, aadir luego igual cantidad de tinta china, emulsionarla y luego cubrir la laminilla. Tanto en los preparados en fresco, frotis coloreados y cortes histolgicos de cerebro, el C. NEOFORMANS, se observa como clulas redondas u ovaladas (del tamao de un linfocito) gemantes delgadas y redondeadas , de una amplia cpsula de mucopolisacridos refringente, la cual se observa mas ntidamente en preparados de tinta china.
III. CULTIVO
C. Neoformans En ASG desarrolla colonias mucoides viscosas y brillantes de color blanquecino con el tiempo cambia a color ocre y con deslizamiento al fondo del tubo de cultivo. C. Neoformans En agar urea, hidroliza la urea por producir ureasa.
IV. RESUMEN DEL CASO CLINICO

Paciente de sexo masculino, de 35 aos de edad, TEST de ELISA (Positivo) para infeccin de VHI, presenta sensacin de fiebre, acompaado de cansancio, nauseas explosivas, vmitos, cefales frontal
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intermitente, que va aumentando de intensidad y se hace permanente, adems presenta compromiso del estado mental desorientado, dolor en el cuello y expectoracin blanquecina. Destaca que existe un palmar junto a su casa. Impresin diagnostica: Tipo de muestra: MENINGOENCEFALITIS L.C.R
ASPERGILLUS
Conidios
Conidioforo
V e s c u l a
Esterigma de dos series
CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS 1. EN TEJIDO 2. EN CULTIVO ADS (37 C)
Clulas gemantes y cpsula gigante
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PRCTICA
Agentes de Micetomas
Micetoma, es una infeccin caracterizada por tender a deformar por aumento de volumen el rgano afectado que ocurre por necrosis tanto de tejido blando como de estructuras seas, piel, mediante mltiples causales (canales) o fstulas por donde drena secrecin de exudado serohemtico o purulento que contiene acumulados pequeos del microorganismo causante, en forma de Granos o Granulos. Segn el agente causal pueden encontrarse: 1. 2. 3. Micetomas Eumicoticos, cuando el agente es un hongo verdadero: Madurella mycetomi, M. grisea, Allescheria boydii, Pyrenochaeta, etc., hongos saprofiticos que se desarrollan sobre restos de vegetales en descomposicin. Micetomas Actinomicticos, causados por Actinomycetos que comprenden especies patgenas anaerobias y aerobias: Anaerobias: Actinomyces isrrael, A. bovis, saprofitos que pueden encontrarse normalmente en los diente con caries, criptas amigdalianas apendica etc. Aerobias: Nocardia asteroide, N. brasilensis, Actinomadura madurae, Streptomyces somalienses, etc. Que viven en el suelo y sobre todo en el tallo de algunos cereales almacenados de donde contaminan al hombre por inoculacin a travs de pequeas heridas.
I. CONDICIONES DE LA TOMA DE MUESTRA

El hongo (granos o grnulos) se pueden recoger en una gasa aplicando en la abertura de la fstula o mediante incisin de un absceso o por respiracin de secrecin de la fstula aplicando directamente una pipeta pasteur. La muestra tambin se obtiene por biopsia de tejido afectado.
II. PROCEDIMIENTO
1. Examen directo: Examinar el material patolgico obtenido (pus, exudado) con KOH 20% con objetivo seco, identificado los granos, diferenciarlos en cuanto a su color, consistencias y tamao. M. mycetomi, se observa granos gruesos de forma irregular y consistencia dura. Actinomyces isrrael, se observa los tpicos granos amarillentos con finas ramificaciones perifricas los granos Azufrados, o pequeas masas de filamentos ramificados del mismo color. En frotis coloreados son gram positivos. En cortes histopatolgicos se observa el grano con las tpicas Clavas Perifricas. Nocardias: se observa como una filamentacin fina ramificada que al fragmentarse se observa de formas Bacilares parcialmente acido-alcohol resistente. A su coloracin son Gram Positivos.
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UNFV FMHU III. CULTIVOS

Madurella mycetomi.- En medio ASG a 37 el desarrollo es ptimo la colonia es filamentosa de aspecto velloso, de color ocre o marron amarillento, ocasionalmente puede ser cerebriformes. Es caractersticos la produccin y difusin en el medio de cultivo de un pigmento marrn oscuro intenso, que cambia de color el medio de cultivo. A la microscopia se observa micelios, estriles tabicados y clamidosporas abundantes intercalares o terminales semejndose a un rosario. En el medio Agar Czapeck se forman esclerosis oscuros que se aprecian a simple vista. 1. Actinomyces.- En caldo thioglicolato a 37 o Agar BHI semislido producen colonias suspendidas de color ligeramente amarillas. Nocardia.- En medio ASG incubados a 37C en aerobiosis o a la temperatura del laboratorio se desarrolla. N. asteroides.- Colonias secas, de aspecto pulvurento de color blanquecino rosado. N. brasilensis.- Colonias membranosas de superficie corrugada y color amarillento naranja, tanto en cortes histopatolgicos coloreados con Zihel -Neelssen, as como de cultivos, se observan filamentos finos ramificados sin tabique (cenocticos) que al fragmentarse se observan de formas parcialmente cido-alcohol resistentes.
2.
III. RESUMEN DE CASOS CLINICOS

CASO N 1 Paciente de sexo masculino de 50 aos, agricultor, procedente de Huaraz, con enfermedad de 6 aos caracterizada por aumento progresivo de volumen de pie izquierdo el cual presenta mltiples abscesos, necrosis de tejido, fistulizacin en el dorso de pie, por donde drena material purulento con granos oscuros. Impresin diagnostica: Micetoma Maduromictico Tipo de muestra: Secrecin de Fstula CASO N 2 Paciente de sexo masculino de 45 aos de edad, agricultor, procedente de Abancay, que hace dos aos presenta en el pie derecho lesiones verrucosas ulcero-vegetantes fistulizados y sanguineolientas que ltimamente va deformndose con aumento de volumen. Impresin diagnostica: Micetoma Maduromictico Tipo de muestra: Secrecin de Fstula CASO N 3 Paciente de sexo femenino, procedente de Huancayo, en buen estado general, que presenta lesiones ulceradas y fistulizadas a nivel del ngulo de la mandbula inferior, la lesin es indolora y de consistencia dura a partir de una de las fstulas drena material purulento como grnulos amarillentos, con grnulos pequeos menor de 1mm de dimetro. Impresin diagnostica: Actinomicosis Cervico Facial Tipo de muestra: Secrecin de Fstula
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MADURELLA MYCETOMII 1. EN TEJIDO 2. EN CULTIVO ADS (37 C)
ACTINOMYCES ISRRAELII 1) EXAMEN DIRECTO DE MUESTRAS (Grampositivo) 2. CULTIVO EN AGAR BHI (Anaerobiosis a 37 C)
STREPTOMYCES MICROCULTIVO EN ADS (25 C)
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PRCTICA
Principales agentes de Cromomicosis

La cromomicosis es una infeccin crnica, producida por algunos hongos saprofitos: PHIALOPHORA Verrucosa, Hormodendrum Pedresi, etc., que viven comnmente sobre vegetales, ingresan al organismo mediante traumatismos en la piel por dichos fragmentos vegetales punzantes contaminados. La infeccin se caracteriza por la presencia de Ndulos cutneos tipo Verrucoso costroso Dermatitis Verrucosa localizados generalmente en los miembros inferiores, afectando la piel y tejido celular subcutneo.
I. CONDICIONES DE LA TOMA DE MUESTRA

El material Patolgico se toma por raspado profundo de preferencia en el tejido entre la lesin y tejido sano, obtenindose fragmentos de tejido necrtico y costras. Tambin puede ser til el material de biopsia.
II. PROCEDIMIENTO
1. Examen directo: Haga preparaciones con KOH 20% entre lmina y lmina luego calentar suavemente el preparado. Se busca y se examina clulas redondeadas de color pardo, tabicadas de pared gruesa.
III. CULTIVO
1. P.H. Verrucosa En agar para dextrosa (APD) a temperaturas del laboratorio desarrolla colonia de aspecto filamentoso compacto de color verde olivo. Microscpicamente se observa hifas septadas, ramificadas dispuestas lateralmente esporangioforos en forma de una botella o de una jarra en cuyo extremo se agrupan microconidios esfrica en racimo. H. Pedrosoi En APD a la temperatura del laboratorio desarrolla colonia filamentosa pulvurulenta de color pardo oscuro microscpicamente se observan filamentos tabicados ramificados, conidiforos, cortos de la que emergen microconidias tpicas dispuestas en cadenas cortas.
2.
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CROMOMICOSIS
1. Phialophora verrucosa 3. Ambas especies en tejido
EN CULTIVO ADS (25 C)
2. Cladosporium (Hormodendrum)
En los exudados y en los tejidos, esto hongos producen clulas redondas, pardas, de paredes muy gruesas, que estan divididas por tabiques, esta tabicacin, con separacin retardada da racimos de 4 a 8 clulas. EN APD CLULAS OVOIDES CON CICATRICES DE UNIN (a)
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A T L A S
Micologa
Aspergillus Flavus Aspergillus Fumicatus Aspergillus Niger Aspergillus Niger Candida Cladosporium Sp. Epydermophiton Floccosum Fusarium Sp Hifas cenocticas Hifas tabicadas Histoplasma Capsulatum Malassezia Furfur Microsporum Cannis Microsporum Gypseum Mucor Sp Paracoccidioides Brasillensis Penicillium Piedraia Hortae Rhizopus Sp Sporothrix Schenkii Trichophyton Mentagrophytes Trichophyton Rubrum Trichophyton Tonsurans
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Gua de Prcticas de Microbiologa Mdica 2011

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II. EXPERIMENTO N2:

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Estra por Agotamiento

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Inoculacin de placas de cultivo para el aislamiento de colonias bacterianas

Tcnica de inoculacin de medios para recuentos semicuantitativos de colonias bacterianas.

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UNFV FMHU Algunas caractersticas de las colonias bacterianas

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Clasificacin de los Medios de Cultivo

Siembra, aislamiento y transplante de bacterias

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Metabolismo Bacteriano. Enzimas de los microorganismos. Fermentacin bacteriana.

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Lectura: Observar los tubos donde la gelatina no est gelificada.

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Nitrato de Potasio H2O + NO2

Tubo 3 2cc de caldo nitrato + Bacillus

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Esquema general del metabolismo bacteriano

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I. PREPARACIN DE FROTIS Y FIJADO

II. TINCIN SIMPLE

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UNFV FMHU III. TINCIN DIFERENCIAL

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UNFV FMHU IV. DEMOSTRACIN DE LOS GRNULOS METACROMTICOS.