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Protocole exprimental

Chaque binme a reu deux chantillons de sang purifier : celui de Lisa et celui provenant de ses frre et sur (Bart ou Maggie). Vous allez purifier ces chantillons afin den extraire lhmoglobine et de supprimer les autres protines contaminantes. Vous comparerez ensuite les hmoglobines des diffrents chantillons en les sparant sur un gel dagarose. Vous pourrez alors confirmer le diagnostic de Lisa et dcouvrir si Bart ou Maggie sont porteurs de la maladie. I/ Purification de lHmoglobine

I/ Purification de lHmoglobine
a. Lavage des billes de purification
- laide de la P200, ajoutez 180L de Tampon dans les tubes Purif-Lisa et Purif-Bart/Maggie et mlangez en les tapotant. - Centrifugez les deux tubes Purif-Lisa et Purif-Bart/Maggie pendant 10 secondes laide la microcentrifugeuse. Info-scurit: Ne jamais dmarrer la microcentrifugeuse sans mettre en face dun tube un autre tube rempli du mme volume !! Fermez le couvercle de la microcentrifugeuse pour dmarrer. Attendez imprativement larrt avant douvrir le couvercle ! - Aprs centrifugation, les billes forment un culot au fond du tube et le tampon se trouve sur la phase suprieure. On appelle cette phase le surnageant. - Avec votre P200 rgle sur 200L, aspirez le surnageant sans faire de tourbillon dans les billes et transfrez-le dans le tube dchets . Ralisez cette tape pour les deux tubes Purif-Lisa et Purif-Bart/Maggie . Attention ne pas prlever les billes lorsque vous retirez le surnageant ! Si vous avez provoqu un tourbillon, nhsitez pas centrifuger nouveau pour culoter les billes.

b. Fixation de lhmoglobine sur les billes de purification


- laide de la P200, prlevez 40L de lchantillon du tube Lisa et transfrez-le sur les billes de purification dans le tube Purif-Lisa . - Faites de mme pour lchantillon du tube Bart/Maggie , que vous transfrez sur les billes de purification dans le tube Purif Bart/Maggie . - Laissez incuber pendant 2 minutes en tapotant dlicatement et rgulirement les tubes. Attention ne pas trop secouer les tubes pour viter que les billes ne se collent la paroi : elles seraient perdues - Centrifugez les deux tubes pendant 10 secondes laide de la microcentrifugeuse. Quelle est la couleur des billes et du surnageant aprs fixation ? - Aspirez 40L de surnageant avec la P200 et transfrez-les dans le tube dchets .

Hb Autres protines

c. Lavage des billes de purification


- Avec la P200, ajoutez 180L de tampon dans chacun des tubes et mlangez en les tapotant. - Centrifugez les deux tubes pendant 10 secondes laide de la microcentrifugeuse.

Hb

x2

- Avec la P200, prlevez 180L de surnageant et transfrez-le dans le tube dchets .

Evitez absolument les tourbillons susceptibles de remettre les billes en solution.

- Rptez ltape de lavage une seconde fois. Vrifiez labsence de tout surnageant sur les billes. Si ncessaire, re-centrifugez et prlevez le liquide restant.

d. Elution de lhmoglobine purifie


- Avec la P20, ajoutez 20L de solution dimidazole (= lluant) dans les deux tubes Purif-Lisa et Purif-Bart/Maggie . - Tapotez les tubes pour mlanger. - Centrifugez les deux tubes pendant 10 secondes laide de la micro-centrifugeuse. Quelle est la couleur des billes et du surnageant aprs lution ? - Avec la P20, transfrez les 20L de surnageant du tube Purif-Lisa dans le tube vide annot Eluat-Lisa ; faites de mme pour le surnageant Purif-Bart/Maggie dans le tube annot Eluat-Bart/Maggie .

Hb

Imidazole = luant

II/ Migration sur gel dagarose


Maintenant purifis, vous allez faire migrer les chantillons dhmoglobine sur un gel dagarose. Le but est de mettre en vidence les diffrentes formes dhmoglobine prsentes dans les chantillons des membres de la famille : lhmoglobine A, saine ; et lhmoglobine S, portant la mutation. La charge globale de lhmoglobine est lgrement ngative lorsquelle est se trouve en condition basique (pH > 7). Soumise un champ lectrique, lhmoglobine se dplacera vers le ple positif. Pour comparer les diffrentes formes dhmoglobines (Hb-A et Hb-S), vous utiliserez un gel dagarose. Il sagit dun milieu glos qui, en se solidifiant, forme un tamis. Vous dposerez les chantillons sur une extrmit du gel que lon soumet au champ lectrique. Les deux formes dhmoglobines ont un poids molculaire quasiment identique, mais la forme A possde plus de charges ngatives que la forme S. Quelle forme dhmoglobine migrera le plus loin travers les mailles dagarose ? Pour alourdir les chantillons ainsi que pour suivre lavance de la migration, les chantillons dhmoglobines purifis sont mlangs du bleu de charge.

1/ Prparation des chantillons


- Avec la P20, ajoutez 4L de bleu de charge dans les deux tubes Eluats ainsi que dans les deux tubes dchantillons de dpart (non purifis). - Bien homogniser en tapotant. Avez-vous Lchantillon de Bart ou Maggie ???

2/ Chargement du gel dagarose

- Rglez la P200 sur 24L et dposer les 4 chantillons dans 4 puits du gel dagarose. Remplissez le plan de dpt, et notez lordre dans lequel vous avez dpos vos chantillons !

3/ Electrophorse
- Vrifiez que les dpts se situent du cot du ple ngatif, puis rglez le gnrateur sur 200V et dmarrez la migration. - Vrifiez que le courant passe en observant la prsence de bulles au niveau des lectrodes. - Lorsque la migration est termine, arrtez le gnrateur et visualisez les diffrentes bandes.